KR20220138828A - 암환자의 예후 및 항암 치료에 대한 반응성 예측 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측 방법 등에 관한 것으로서, 특정 CD8+ T 세포 아형 (subset)의 비율을 측정함으로써 정확한 예후 예측 및 항암 치료에 대한 반응성 예측이 가능하다. 특히, 본 발명은 상기 예측 방법에 머신러닝을 적용하여 환자가 항암 치료에 대해 반응성을 보일 확률을 신속하고 간편하게 계산할 수 있는 시스템을 제공하는 바, 보다 효율적으로 암환자의 항암 치료-반응성 등을 예측할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 예측 방법은 비침습적인 시료를 이용하므로, 암 조직 분석 등을 수반하지 않고 신속하고 정확한 예후 예측이 가능하다.
Description
본 발명은 암환자의 예후 및 항암 치료에 대한 반응성 예측 방법 등에 관한 것이다.
면역항암요법 (cancer immunotherapy)이란 인체의 면역체계를 활성화시켜서 암세포와 싸우게 하는 암 치료법으로, 면역항암제는 면역체계의 특이성 (specificity), 기억능력 (memory), 적응력 (adaptiveness)을 증강시킴으로써 항암효과를 나타낸다. 즉 인체의 면역시스템을 이용하여 정확하게 암세포만 공격해 부작용이 적고 면역시스템의 기억능력과 적응력을 이용하기 때문에 면역항암제에 반응성을 보이는 환자는 지속적인 항암효과를 볼 수 있다. 면역항암제의 종류로는 면역체크포인트 억제제, 면역세포 치료제, 항암백신, 항체-약물 접합체 등이 있다.
일부 암세포는 면역세포의 면역체크포인트를 활용하면서 면역을 회피하는데, 면역체크포인트 억제제가 암세포와 T 세포의 결합 부위에 결합하여 면역회피 신호를 차단함으로써 면역학적 시냅스가 형성되지 못하게 하고 이에 따라 면역회피 방해를 받지 않는 T 세포가 암세포를 파괴하는 기전을 가지고 있다. 면역체크포인트 억제제에는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIM3, 및 BTLA 차단 항체 등이 있다.
특히, 인터루킨-2 (Interleukin-2, IL-2)는 Treg (Foxp3+ CD4+ 조절 T) 세포 등 IL-2 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 다양한 림프구의 생존, 확장 및 기능에 필수적인 역할을 하는 다변발현 (pleiotropic) 사이토카인이다. IL-2는 항종양 활성(anti-tumor activity)을 가진 CD8+ T 세포와 NK 세포를 자극하기 때문에 1990년대 미국과 유럽에서 전이성 흑색종과 전이성 신장암 치료를 위해 임상적으로 사용되었다(Rosenberg, S.A., J Immunol, 2014. 192(12): p. 5451-8). 그러나 IL-2 치료는 치료받는 암환자의 10% 미만에서만 효과적일 뿐이었으며, 심각한 부작용을 동반하였다. 또한, IL-2 투여가 고친화성 IL-2 수용체를 발현하고 CD8+ T 세포 및 NK 세포에 의해 매개되는 항종양 면역을 억제하는 Treg 세포의 강력한 확장을 유도한다는 문제도 존재한다 (Brandenburg, S., et al., Eur J Immunol, 2008. 38(6): p. 1643-53; Facciabene, A., et al., Cancer Res, 2012. 72(9): p. 2162-71).
따라서, IL-2 치료의 상기와 같은 단점을 해결하기 위해 IL-2의 부자연스러운 변형을 유발하지 않으면서, IL-2의 생체 내 반감기를 연장시키고, 저친화성 IL-2 수용체를 발현하는 CD8+ T 세포 및 NK 세포를 선택적으로 활성화 시키기 위한 연구가 이루어져 왔다. 그 결과, 최근 IL-2 및 IL-2에 대한 특이성을 갖는 모노클로날 항체 (monoclonal Ab)를 결합시킨 융합체가 개발되었으며 (대한민국 등록특허 제10-2099593호), 이의 우수한 생체 내 면역자극 효과 및 강력한 항종양 효과가 확인되었다.
다만, 이와 같이 우수한 항암제가 다수 개발되고 있음에도, 항암제에 대한 내성 혹은 환자의 개인적 특성으로 인해 암환자 별로 항암 치료에 대한 반응성에 차이가 존재하며, 따라서 치료 효과 역시 달라지는 문제가 생기고 있다. 따라서 암환자의 특성을 판단함으로써 특정 항암제에 대한 치료 반응성과 효과를 예측하는 것은 암환자의 치료방침을 결정하는데 매우 중요하다. 그러나 아직까지 항암 치료에 대한 환자의 반응성을 정확히 예측할 수 있는 방법 내지 예측 모델은 없는 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 특정 CD8+ T 세포 아형 (subset)의 비율이 암환자의 예후 및 항암 치료에 대한 반응성과 관련이 있음을 확인하여 완성된 것이다.
따라서 본 발명의 목적은 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측용 키트를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CD8+ T 세포 아형의 비율을 측정하는 단계를 포함하는 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측 방법, 또는 이를 위한 정보제공방법으로서, 상기 CD8+ T 세포 아형의 비율은 전체 CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (Temra) 대비 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (DP Temra)의 비율인, 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측 방법, 또는 이를 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 정보제공방법은 피트니스 인자 (Fitness factor)를 측정하는 단계를 더 포함하고, 상기 피트니스 인자는 하기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
(a) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (DP Tem)의 비율;
(b) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 CD27- CD28- CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (DN Tem)의 비율;
(c) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 Perforin+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Perforin 발현 Tem)의 비율;
(d) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 Granzyme B+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Granzyme B 발현 Tem)의 비율; 및
(e) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 IL-2+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (IL-2 발현 Tem)의 비율.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 항암 치료는 면역항암요법, 화학항암요법, 방사선치료요법, 및 화학치료-방사선치료 병용요법으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 면역항암요법은 면역체크포인트 억제제 또는 면역세포 활성제에 의한 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 면역항암요법은 항-PD-L1 치료, 항-PD-1 치료, 항-CTLA-4 치료, 항-LAG3 치료, 항-TIM3 치료, 항-BTLA 치료, 항-4-1BB 치료, 항-OX40 치료, 사이토카인 치료, IL-2 치료, 및 사이토카인 수용체 치료로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 항암 치료는 면역체크포인트 억제제에 의한 치료이고, 상기 정보제공방법이 상기 전체 CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (Temra) 대비 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (DP Temra)의 비율이 대조군과 비교하여 낮은 경우, 피검체의 예후가 더 좋을 것으로 판정하거나, 항암 치료에 대한 반응성이 더 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 항암 치료는 면역체크포인트 억제제에 의한 치료이고, 상기 정보제공방법이 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 만족하는 경우, 피검체의 예후가 더 좋을 것으로 판정하거나, 항암 치료에 대한 반응성이 더 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
(a) 상기 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (DP Tem)의 비율이 대조군과 비교하여 높음; 및
(b) 상기 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 CD27- CD28- CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (DN Tem)의 비율이 대조군과 비교하여 낮음.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 항암 치료는 면역체크포인트 억제제에 의한 치료이고, 상기 피검체는 항암 치료를 받기 전의 피검체이며, 상기 정보제공방법이 하기 특징 중 어느 하나 이상을 만족하는 경우 대조군에 비해 피검체의 예후가 더 좋을 것으로 판정하거나, 항암 치료에 대한 반응성이 더 높을 것으로 예측하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
(c) 상기 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 Perforin+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Perforin 발현 Tem)의 비율이 대조군과 비교하여 낮음;
(d) 상기 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 Granzyme B+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Granzyme B 발현 Tem)의 비율이 대조군과 비교하여 낮음; 및
(e) 상기 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 IL-2+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (IL-2 발현 Tem) 의 비율이 대조군과 비교하여 높음.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 항암 치료는 IL-2 치료이고, 상기 피검체는 항암 치료를 받기 전의 피검체이며, 상기 정보제공방법이 전체 CD8+ T 세포 대비 CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (Temra)의 비율이 대조군과 비교하여 높은 경우, 피검체의 예후가 더 좋을 것으로 판정하거나, 항암 치료에 대한 반응성이 더 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 항암 치료는 IL-2 치료이고, 상기 정보제공방법이 상기 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (DP Tem)의 비율이 대조군과 비교하여 낮은 경우, 피검체의 예후가 더 좋을 것으로 판정하거나, 항암 치료에 대한 반응성이 더 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 IL-치료는 IL-2; 및 항-IL-2 항체 또는 이의 단편의 컨쥬게이트에 의한 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 대조군은 정상인 또는 항암 치료 후 완전 관해 또는 부분 관해를 보인 암환자로부터 분리된 생물학적 시료일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 시료는 혈액, 말초혈액, 전혈, 혈장, 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 CD8+ T 세포 아형은 말초혈액 내의 CD8+ T 세포 아형일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 암은 흑색종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신경교종, 간암, 갑상선 종양, 위암, 전립선암, 난소암, 방광암, 폐암, 대장암, 유방암, 호지킨림프종, 요로상피세포암, 교모세포종, 자궁내막암, 자궁경부암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도암종, 두경부암, 중피종, 육종, 담관암, 소장 선암, 소아 악성암, 표피암, 고환암, 혈액암, 및 뇌암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (Temra) 및 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (DP Temra) 검출용 제제를 유효성분으로 포함하는, 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 조성물은 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 CD8+ T 세포 아형 검출용 제제를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem);
CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (DP Tem);
CD27- CD28- CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (DN Tem);
Perforin+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Perforin 발현 Tem);
Granzyme B+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Granzyme B 발현 Tem); 및
IL-2+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (IL-2 발현 Tem).
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 제제는 항체 또는 앱타머일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는, 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 키트는 전체 CD8+ T 세포 검출용 제제를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 키트는 본 발명에 따른 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측방법 또는 이를 위한 정보제공방법이 기재된 설명서를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물의 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측용 제제의 제조를 위한 상기 조성물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암의 치료 방법을 제공한다:
(S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 전체 CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (Temra) 대비 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (DP Temra)의 비율을 측정하는 단계;
(S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 전체 Temra 대비 DP Temra의 비율을 대조군과 비교하여 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성을 예측하는 단계; 및
(S3) 상기 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성이 예측된 피검체를 항암 치료하는 단계.
본 발명은 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측 방법 등에 관한 것으로서, 특정 CD8+ T 세포 아형 (subset)의 비율을 측정함으로써 정확한 예후 예측 및 항암 치료에 대한 반응성 예측이 가능하다. 특히, 본 발명은 상기 예측 방법에 머신러닝을 적용하여 환자가 항암 치료에 대해 반응성을 보일 확률을 신속하고 간편하게 계산할 수 있는 시스템을 제공하는 바, 보다 효율적으로 암환자의 항암 치료-반응성 등을 예측할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 예측 방법은 비침습적인 시료를 이용하므로, 암 조직 분석 등을 수반하지 않고 신속하고 정확한 예후 예측이 가능하다.
도 1a 내지 1h는 암환자의 CD8 + TIL의 특성을 나타낸 도면이다.
도 1a CCR7 및 CD45RA를 사용하여 CD8+ T 세포 아형 (Tn, Tcm, Tem 및 Temra)을 PBMC (좌측) 및 TIL (우측)과 구별한 유세포분석 결과이다.
도 1b는 TIL 내 CD8+ T 세포 아형의 비율을 나타낸 도면이다
도 1c는 tilTem 및 tilTemra의 상대적 텔로미어 길이를 나타낸 도면이다. 텔로미어 길이는 텔로미어 및 36B4의 비율로 측정했다. 상대적 텔로미어 길이는 동일한 종양에서 얻은 tilTem의 텔로미어 길이로 나누어 계산했다.
도 1d 내지 1g는 TIL을 4시간 동안 재자극한 후, 퍼포린 (도 1d), 그랜자임 B (도 1e), IFN-γ (도 1f), 및 IL-2 (도 1g)을 생성하는 tilTem 또는 tilTemra의 비율을 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 1h는 tilTem 및 tilTemra를 정제하고 CTV로 표지한 후, anti-CD3 (5 μg/ml), anti-CD28 (2 μg/ml), 및 IL-2 (10 ng/ml)로 7일 동안 자극한 결과를 나타낸다. CTV 희석 (CTV dilution)은 유세포 분석으로 평가했으며, 희석된 CTV를 가진 세포는 증식된 세포로 간주했다 (n=6). 통계적 유의성은 Student's T test로 평가했다.
도 2a 내지 도 2d는 tilTemra와 pTemra(peripheral Temra) 간의 전사체 프로파일을 비교한 도면이다.
도 2a는 tilTemra 및 pTemra의 주성분 분석 (PCA) 결과를 나타낸다.
도 2b는 계층적 클러스터링 분석 결과를 나타낸다.
도 2c는 차별 발현 유전자 (DEGs, differentially expressed genes) 분석 결과를 나타낸다. 유의미한 발현수준 (FPKM>0)을 갖는 15,299개 유전자를 기반으로 볼케이노 플랏을 생성했다. P 값은 먼저 t-test 검정으로 분석한 것을 Benjamini-Hochberg procedure로 조정된 P 값으로 나타냈다. 배수 변화는 tilTemra의 평균 발현량에서 pTemra 평균 발현량을 나누어 계산했다. 빨간색 점은 tilTemra에서 상향-조절된 유전자를 나타내며 (배수 변화>2, 조정된 P 값<0.05), 파란색 점은 pTemra에서 상향-조절된 유전자를 나타낸다 (배수 변화>0.5, 조정된 P 값<0.05).
도 2d는 Broad Institute 및 Gene Ontology에서 얻은 유전자 세트를 사용한 GSEA 결과의 요약을 보여준다. 풍부 스코어 (enrichment score)는 최고 또는 최저 실행 풍부 스코어 (running enrichment score)의 절대값을 나타낸다.
도 3a 내지 3e는 tilTemra 및 pTemra의 기능적 표현형을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3a 내지 3d는 TIL 및 PBMC를 4시간 동안 재자극한 후, 퍼포린 (도 3a), 그랜자임 B (도 3b), IFN-γ (도 3c), 및 IL-2 (도 3d)을 생성하는 tilTemra 또는 pTemra의 비율을 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 3e는 tilTemra 및 pTemra를 정제하고 CTV로 표지한 후, anti-CD3 (5 μg/ml), anti-CD28 (2 μg/ml), 및 IL-2 (10 ng/ml)로 7일 동안 자극한 결과를 나타낸다. 증식된 세포는 유세포 분석으로 분석했다.
도 3f는 tilTemra (좌측) 및 pTemra (우측)의 CD27 및 CD28 발현 수준에 대한 유세포 분석 데이터이다.
도 3g는 tilTemra 및 pTemra의 DP (좌측) 및 DN (우측) 표현형의 비율을 보여주는 도면이다.
도 3h는 TILs 중 DP 표현형 비율 (tilDP %)로부터 PBMC 중 DP 표현형 비율 (pDP %)을 빼서 계산한 DP 표현형 비율 차이를 보여주는 도면이다. 도면에서 알 수 있듯이, 차이 값(tilDP % - pDP %)은 Temra에서는 항상 0보다 높은 수치였으나, Tem에서는 그렇지 않았다.
도 3i 및 3j는 TIL 및 PBMC를 4시간 동안 재자극한 후 퍼포린 (도 3i) 및 IL-2 (도 3j)를 생성하는 세포의 비율을 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 4a 내지 4e는 CD8 + TIL의 Temra로의 분화 궤적 (differentiation trajectory)을 나타낸 도면이다.
도 4a 및 4b는 CD8+ TIL의 tSNE 분석 결과를 나타낸다. TIL은 tSNE 분석 전에 CD3+CD8+ 세포에 게이팅되었다. 다음의 파라미터들이 tSNE 분석에 사용됐다: CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD8, CD3, CD5, CCR7, Perforin, 및 CD57.
도 4a 좌측 패널의 빨간색 점은 CD45RA+CD45RO-CCR7- Temra를 나타내며, 2가지 tilTemra 클러스터링 (1 및 2로 표기함)이 관찰됐다. 표시된 분자의 상대적인 발현 수준은 검정색 (낮음)에서 노랑색 (높음)까지의 색상 스케일로 표시됐다. 도 4b에서, 상기 2가지 tilTemra 클러스터링 (각각 빨간색 및 파란색으로 표기함)이 3명의 환자에서 관찰됐다. 표시된 분자의 발현을 히스토그램으로 나타냈다. 회색 히스토그램은 tilTem을 나타낸다.
도 4c는 CD3+CD8+ TIL을 사용하여 FLOW MAP로 단일세포 궤적분석 (single cell trajectory analysis)을 수행한 결과를 나타낸다. 다음의 클러스터링 변수가 FLOW MAP에 사용됐다: CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD8, CD3, CD5, 및 CCR7. 각 노드의 CD27, CD28, CD45RA, 및 CD45RO의 상대적인 발현은 Gephi 소프트웨어로 분석했으며, 다음과 같이 표시했다: 분홍색, DP Tem; 노랑색, SP Tem; 연한 파란색, DN Tem; 빨간색, DP Temra; 초록색, SP Temra; 및 어두운 파란색, DN Temra. 표시된 분자의 상대적인 발현 수준은 검정색 (낮음)에서 노랑색 (높음)까지의 색상 스케일로 표시됐다.
도 4d는 2개 화살표 (빨간색 및 파란색)로 표시된, 분기된 분화 궤적을 나타낸다.
도 4e는 DP tilTem 및 DP tilTemra간의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 5a 내지 5h는 Temra 분화 과정에서의 CD27, CD28, 및 CD45RA의 발현 조절을 나타낸 도면이다.
도 5a 및 5b는 tilTem을 anti-CD3 (0~10 μg/ml) 및 anti-CD28 (0~4 μg/ml)로 7일 동안 자극하거나; IL-2 (0~10 ng/ml)로 7일 동안 자극한 후 CD28 (도 5a) 및 CD27 (도 5b)의 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5c는 TIL을 재자극한 후 IL-2 생성 CD3+ 세포의 빈도를 유세포분석으로 확인한 결과를 나타낸다. CD3+ 세포 중 IL-2+ 세포의 비율을 tilTem 중 CD27+ 세포의 비율과 함께 플롯팅 (plotting) 하였다.
도 5d 및 5e는 tilTemra를 CTV로 표지한 후, 도면에 표시한 자극원들로 7일 동안 자극한 후, CD45RA 발현 (도 5d) 및 증식된 세포의 비율 (도 5e; 유세포분석으로 확인함)을 확인한 결과를 나타낸다. 상대적 CD45RA MFI는 비자극된 세포의 평균 CD45RA MFI로 나누어 계산했다.
도 5f는 tilTemra를 CTV로 표지한 후, TCR (anti-CD3 (5 μg/ml) 및 anti-CD28 (2 μg/ml)), IL-2 (10 ng/ml), 또는 이들의 조합으로 7일 동안 자극한 후 세포 증식을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5g는 tilTem 내 CD45RA 재발현을 보여주는 대표적인 유세포분석 그림이다. TIL로부터 CD45RAloCCR7- tilTem를 게이팅 했으며, CD27 또는 CD28과 함께 CD45RA의 발현을 측정했다.
도 5h는 DP, SP, 및 DN tilTem의 CD45RA 발현을 확인한 결과이다. 상대적 CD45RA MFI는 동일한 종양 유래의 DP 세포의 MFI 값으로 나누어 계산했다.
도 6a 내지 도 6i는 DP Temra; 및 CD8 + TIL 개수 및 TMB 간의 상관관계를 보여주는 도면이다.
도 6a 내지 6d는 각각 CD8+ TIL 개수 및 DP tilTem의 상관관계 (도 6a); CD8+ TIL 개수 및 DP tilTemra의 상관관계 (도 6b); DP pTemra의 비율 및 DP tilTemra의 비율의 상관관계 (도 6c); 및 CD8+ TIL 개수 및 DP pTemra의 비율의 상관관계 (도 6d)를 나타내는 그래프이다.
도 6e는 저비율의 DP pTemra (<6%; “DP pTemra low”) 또는 고비율의 DP pTemra (>6%; “DP pTemra high”)를 갖는 환자의 CD8+ TIL 수를 비교한 결과를 나타낸다.
도 6f 내지 6h는 유세포분석으로 NSCLC 환자의 혈액에서 DP pTemra의 비율을 분석한 후, 편평세포암 (SCC)(TMB: 9 (MB당 9개 코딩 체세포 돌연변이가 존재)) 및 비-편평세포암 (non-SCC)(TMB: 6) 환자 그룹 각각에서 고-DP pTemra 환자의 비율을 확인한 결과 (도 6f), 및 흡연자 (TMB: 11); 비-흡연자 (TMB: 0.6) 환자 그룹 각각에서 고-DP pTemra 환자의 비율을 확인한 결과 (도 6g), 및 면역체크포인트 저해제에 대한 반응성을 기준으로 나눈 PR, SD, 및 PD 환자 그룹 각각에서 고-DP pTemra 환자의 비율을 확인한 결과 (도 6h)를 나타낸다.
도 6i는 종양 항원이 CD8+ TIL의 분화 궤적을 형성하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 7a 내지 도 7f는 말초 CD8+ T 세포 아형의 특성을 나타낸 도면이다.
도 7a는 CD8+ T 세포 아형을 PBMC 및 TIL과 구별하기 위한 게이팅 전략 (gating strategy)을 나타낸 것이다.
도 7b는 PBMC 유래 CD8+ T 세포 중 CD8+ T 세포 아형의 비율을 나타낸다.
도 7c 내지 7f는 PBMC를 4시간 동안 재자극한 후, 퍼포린 (도 7c), 그랜자임 B (도 7d), IFN-γ (도 7e), 및 IL-2 (도 7f)을 생성하는 pTem 또는 pTemra의 비율을 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸다. 통계적 유의성은 Wilcoxon matched-pairs signed rank test로 평가했다.
도 8a 내지 8g는 tilTemra와 pTemra 간 차별 발현 유전자(DEGs, differentially expressed genes)를 분석한 결과를 보여주는 도면이다.
도 8a 내지 8d는 분화 관련 유전자 (TBX21, EOMES, PRF1, GZMB, GZMH) (도 8a); 보조자극 분자 (ICOS, CD28) (도 8b); 노화 또는 탈진 관련 유전자 (B3GAT1, TOX) (도 8c); 및 증식 및 기억 관련 유전자 (MYC, TCF7) (도 8d)들의 RNA seq 데이터를 나타낸다.
도 8e 내지 8g는 탈진 (도 8e); 세포독성 (도 8f); 및 증식 (도 8g)과 관련된 유전자 세트의 GSEA 결과를 나타낸다. 통계적 유의성은 Mann-Whitney test로 확인했다.
도 9a 내지 9b는 tilTem 및 pTem의 기능적 표현형을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9a는 anti-CD3 (5 μg/ml), anti-CD28 (2 μg/ml), 및 IL-2 (10 ng/ml)로 7일 동안 자극된 세포들의 CTV 희석을 나타낸 히스토그램이다.
도 9b 내지 9e는 퍼포린 (도 9b), 그랜자임 B (도 9c), IFN-γ (도 9d), 및 IL-2 (도 9e)을 생성하는 tilTem 또는 pTem의 비율을 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 9f는 tilTem 및 pTem의 DP (좌측) 및 DN (우측) 표현형의 비율을 보여주는 도면이다.
도 9g 내지 9h는 PBMC 유래 Temra 세포 (pTemra), TIL (tilTemra), 및 NAT (nTemra)의 DP 비율 (도 9g), IL-2 생성 정도 (도 9h), 및 퍼포린 생성정도 (도 9i)를 분석한 결과를 나타낸다.
도 10a 내지 10c는 tSNE 및 FLOW MAP에서 CD8 + TIL의 주요 분자 발현 수준을 나타낸 도면이다.
도 10a는 CD8+ TIL에서 tSNE 분석을 통해 각 분자들의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸다. 표시된 분자의 상대적인 발현 수준은 검정색 (낮음)에서 노랑색 (높음)까지의 색상 스케일로 표시됐다.
도 10b는 tilTem의 각 분자들의 상대적 발현 수준 및 tilTemra의 2가지 클러스터링을 나타낸다.
도 10c는 FLOW MAP으로 확인한 각 분자들의 상대적 발현 수준을 나타낸다. 표시된 분자의 상대적인 발현 수준은 검정색 (낮음)에서 노랑색 (높음)까지의 색상 스케일로 표시됐다.
도 11a 내지 11i는 CD27, CD28, 및 CD45RA의 발현 조절을 나타낸 도면이다.
도 11a는 Tn 및 tilTem을 정제한 후 7일 동안 무자극 (no stimulation, NS), anti-CD3 (5 μg/ml) 및 anti-CD28 (2 μg/ml) 자극 처리한 후 유세포분석으로 CD28 및 CD27 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 11b 및 11c는 tilTem을 도면에 표시된 각각의 사이토카인 (각각 20 ng/ml)으로 7일 동안 자극한 후 유세포분석으로 CD28 (도 11b) 및 CD27 발현 (도 11c)을 확인한 결과를 나타낸다.
도 11d는 TIL을 anti-CD3 및 anti-CD28로 5시간 동안 재자극한 후 IL-2 생성 tilTem을 유세포분석으로 확인한 결과를 나타낸다. 1시간 후 GolgiPlug를 첨가하였다.
도 11e는 Tn, pTemra, 및 tilTemra를 7일 동안 무자극 (회색) 또는 anti-CD3 (5 μg/ml) 및 anti-CD28 (2 μg/ml) 자극 처리한 후 CD45RA 발현을 유세포분석으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 11f 및 11g는 Tn, pTem, 및 tilTem을 CTV로 표지하고, anti-CD3 (5 μg/ml) 및 anti-CD28 (2 μg/ml) (도 11f); 또는 IL-2 (10ng/ml) (도 11g)로 7일 동안 자극한 후 세포 증식을 유세포분석으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 11h는 pTem에서 CD45RA의 재발현을 보여주는 대표적인 유세포분석 그림이다. PBMC로부터 CD45RAloCCR7- pTem을 게이팅하였으며, CD45RA 발현을 CD27 또는 CD28로 확인했다.
도 11i는 DP, SP, 및 DN pTem의 상대적 CD45RA 발현을 보여준다. 상대적 CD45RA MFI는 동일한 PBMC로부터 유래한 DP 세포의 MFI 값으로 나누어 계산했다.
도 12a 내지 12i는 DP pTemra의 비율 및 종양 면역원성 간의 상관관계를 나타낸 도면이다.
도 12a는 CTV로 표지된 Tn을 약한 TCR 자극 (anti-CD3 (1 μg/ml) 및 anti-CD28 (0.4 μg/ml)) 또는 강한 TCR 자극 (anti-CD3 (5 μg/ml) 및 anti-CD28 (2 μg/ml))을 7일 동안 가한 후, 유세포분석으로 증식된 세포를 확인한 결과를 나타낸다.
도 12b 내지 12e는 말초 또는 종양 침윤 CD27+/- Tem 및 CD27+/- Temra 세포에서 TCR α/β 사용을 분석한 결과를 나타낸다 (도 12b, Vα7.2 사용을 확인한 결과; 도 12c, Vβ8 사용을 확인한 결과; 및 도 12d, Vβ12 사용을 확인한 결과).
도 12e는 8가지 TCR α/β 사용 (Va2, Vα7.2, Vα12.1, Vβ3, Vβ5b, Vβ8, Vβ12, 및 Vβ13.1)을 이용하여 생성한 샘플 거리 매트릭스를 보여준다. 각 매트릭스 단일한 개체에서 유래한 T cell 아형을 포함한다. 파란색일수록 거리가 가깝고, 흰색일수록 거리가 먼 것을 나타낸다. 각 매트릭스 상단의 계층적 클러스터링에서, 붉은색 선은 CD27+ tilTemra 및 CD27+ pTemra 간의 거리를 나타내고, 파란색 선은 CD27- tilTemra 및 CD27+ tilTemra/CD27+ pTemra 간의 거리를 나타낸다.
도 12f 및 12g는 NSCLC 환자의 혈액 샘플에서 Ki-67-발현 CD8+ T 세포 (도 12f) 및 PD-1-발현 CD8+ T 세포 (도 12g)를 확인한 결과를 나타낸다.
도 12h 및 12i는 SCC 및 non-SCC 환자의 DP pTemra 비율 (도 12h), 및 흡연 또는 비흡연 환자의 DP pTemra 비율 (도 12i)을 나타낸다. 점선은 DP pTemra %=6%인 경우의 기준선을 나타낸다.
도 13은 정상인과 NSCLC 암환자의 CD8 T 세포에서 각 아형 (Tn, Tcm, Tem, 및 Temra)의 비율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 14는 NSCLC 암환자의 PBMC를 PMA/ionomycin으로 재자극한 후, CD8 T 세포의 각 아형에서 퍼포린, 그랜자임 B, IFN-γ, 또는 IL-2를 분비하는 세포의 비율을 유세포분석으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 15는 정상인 또는 NSCLC 암환자의 PBMC를 PMA/ionomycin으로 재자극한 후, Tem 세포 중 퍼포린, 그랜자임 B, IFN-γ, 또는 IL-2를 분비하는 세포의 비율을 유세포분석으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 16은 NSCLC 암환자가 면역항암요법 (PD-1 요법 또는 PD-L1 요법, 이하 동일)을 받기 전 (“Before”)과 후 (“After”)의 PBMC를 PMA/ionomycin으로 재자극한 후, Tem 세포 중 퍼포린, 그랜자임 B, IFN-γ, 또는 IL-2를 분비하는 세포의 비율을 유세포분석으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 17은 면역항암요법 후 퍼포린 및 그랜자임 B 수준이 증가한 환자 그룹 (“Perforin changed” 및 “Granzyme B changed”)과 그렇지 않은 환자 그룹 (“Perforin NOT changed” 및 “Granzyme B NOT changed”) 각각에서 면역항암요법에 대한 부분 관해 (PR)을 보인 환자들의 비율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 18은 면역항암요법 후 퍼포린 및 그랜자임 B 수준이 증가한 환자 그룹 (“Perforin increased” 및 “Granzyme B increased”)과 그렇지 않은 환자 그룹 (“Perforin NOT increased” 및 “Granzyme B NOT increased”) 각각에서 면역항암요법을 진행하기 전 혈액의 퍼포린 수준 (“Initial perforin”) 및 그랜자임 B 수준 (“Initial Granzyme B”)을 측정한 결과를 나타낸다.
도 19a 내지 19b는 암환자의 Tem 세포의 각 아형 (DP, SP, 및 DN)에서 퍼포린, 그랜자임 B, IFN-γ, 또는 IL-2를 분비하는 세포의 비율을 유세포분석으로 확인한 결과 (도 19a), 및 각 세포에서 발현되는 분자의 MFI를 측정한 결과 (도 19b)를 나타낸다.
도 20a 내지 20b는 암환자의 전체 Tem 중 DP 또는 DN 아형의 비율과 퍼포린 및 그랜자임 B의 발현 수준의 상관관계를 나타낸 그래프이다. 도 20a는 전체 Tem 중 DP Tem의 비율; 및 퍼포린 또는 그랜자임 B의 상관관계를 나타낸 그래프, 도 20b는 전체 Tem 중 DN Tem의 비율; 및 퍼포린 또는 그랜자임 B의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 21a는 암환자를 전체 Tem 중 DP Tem 비율이 높은 환자 (High DP Tem%) 및 DP Tem 비율이 낮은 환자 (Low DP Tem%)로 나누고, 면역항암요법 (PD-1 요법) 전후의 퍼포린 및 그랜자임 B의 발현 수준을 비교한 결과를 나타낸다.
도 21b는 암환자를 전체 Tem 중 DN Tem 비율이 높은 환자 (High DN Tem%) 및 DN Tem 비율이 낮은 환자 (Low DN Tem%)로 나누고, 면역항암요법 (PD-1 요법) 전후의 퍼포린 및 그랜자임 B의 발현 수준을 비교한 결과를 나타낸다.
도 22a 및 22b는 암환자를 전체 Tem 중 DP Tem 및 DN Tem의 비율을 기준으로 4개 그룹으로 나눈 후 (High DP Tem%; Low DP Tem%; High DN Tem%; 및 Low DN Tem%), 각 그룹에서 면역항암요법 (PD-1 요법) 전후의 Ki-67 발현 수준 (도 22a) 및 면역항암요법에 대해 부분 관해 (PR)을 보인 환자의 비율 (도 22b)을 비교한 결과를 나타낸다.
도 23a은 NSCLC 3기 및 4기 환자를 연령대 별로 그룹화하고 (40s/50s; 60s; 및 70s/80s), 각 그룹별로 전체 Tem 중 DP Tem 및 DN Tem의 비율을 확인한 결과이다.
도 23b는 40대/50대에 해당하는 정상인 및 NSCLC 3기/4기 환자 그룹 간에 전체 Tem 중 DP Tem 및 DN Tem의 비율을 비교한 결과이다.
도 24는 종양 진행정도에 따른 DP Tem 및 DN Tem 분포 양상을 확인하기 위해 정상인 및 NSCLC 환자 (Stage I/II, Stage III, 및 Stage IV) 그룹별로 전체 Tem 중 DP Tem 및 DN Tem의 비율을 확인한 결과이다.
도 25a는 x축을 DP Temra, y축을 DP Tem (좌측 그래프) 또는 DN Tem (우측 그래프)으로 하여 NSCLC 환자의 2차원 그래프를 그리고, 면역항암치료 (P1 치료)에 대해 반응성을 보인 환자 (PR)와 그렇지 않은 환자 (no PR)를 각각 플롯팅한 후, DP Temra 및 DP/DN Tem 수준을 기준으로 Q1 내지 Q4 그룹으로 분류한 것을 나타낸다.
도 25b는 DP Temra; 및 DP Tem (좌측 그래프) 또는 DN Tem (우측 그래프)의 이중 마커 기초하여 분류된 Q1 내지 Q4 그룹 간에 면역항암치료에 대해 부분 관해를 보인 환자의 비율을 비교한 결과를 나타낸다.
도 25c는 DP Temra 및 DP/DN Tem의 이중 마커의 면역치료 반응성 예측 능력을 단일 마커의 예측 능력과 비교하기 위해, 각 마커별로 PR-환자 비율을 확인한 결과를 나타낸다.
도 26은 DP Temra/DP Tem 그래프 (좌측) 및 DP Temra/DN Tem 그래프 (우측)에 대해 K-NN 머신러닝을 사용하여 (K=7) 각 플롯별 PR 빈도를 나타낸 pGRAPH이다. PR 빈도가 높을수록 붉은색으로 표시하였다.
도 27a는 120명의 NSCLC 환자 각각의 DP Temra 및 DN Tem 수준을 pGRAPH에 적용하여 예측 PR% (Predicted PR%) 값을 얻은 후, 예측 PR%가 실제 예후 인자 (실제 PR%, 실제 DCB%, mPFS, 및 mOS)와 일치하는지 확인한 결과를 나타낸다.
도 27b는 도 27a의 예측 PR%에 따른 무진행 생존기간 및 전체 생존기간을 확인한 그래프이다.
도 28a는 72명의 암환자 데이터 기반으로 제작된 pGRAPH를 이용하여 다른 30명의 환자의 예측 PR% 값을 얻은 후, 예측 PR%가 실제 예후 인자 (실제 PR%, 실제 DCB%, mPFS, 및 mOS)와 일치하는지 확인한 결과를 나타낸다.
도 28b는 도 28a의 예측 PR%에 따른 무진행 생존기간 (좌측) 및 전체 생존기간 (우측)을 확인한 그래프이다.
도 29a는 정상인 및 NSCLC 환자 (Stage I/II, Stage III, 및 Stage IV) 그룹별로 전체 Tem 중 SP Tem의 비율을 확인한 결과이다.
도 29b는 NSCLC 환자의 SP Temra 및 SP Tem 데이터 기반으로 제작된 pGRAPH이다.
도 29c는 72명의 암환자의 SP Temra 및 SP Tem 데이터 기반으로 제작된 pGRAPH로 다른 30명의 환자의 예측 PR% 값을 얻은 후, 예측 PR%가 실제 예후 인자 (실제 PR%, 실제 DCB%, 실제 mPFS, 및 실제 mOS)와 일치하는지 확인한 결과를 나타낸다.
도 30a는 정상인의 PBMC에서 분류한 Tn, DP Tem, DN Tem, 및 Temra 세포를 IL-2로 7일간 자극한 후 IFN-γ-발현 세포의 비율 (좌측), 퍼포린-발현 세포의 비율 (중간), 및 CTV 희석정도에 근거한 분열 인덱스 (우측)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 30b는 정상인의 PBMC에서 분류한 Tn, DP Tem, DN Tem, 및 Temra 세포를 IL-2 또는 항-CD3/CD28로 7일간 자극한 후 세포 분열 정도를 비교한 결과를 나타낸다.
도 31a는 초기 Terma 비율 및 IL-2 치료 (IL-2 또는 TCB2-IL-2)에 대한 반응성 간의 관련성을 확인하기 위한 실험 흐름도를 나타낸다.
도 31b는 정상인의 초기 Temra 비율에 따른, IL-2 자극 이후의 퍼포린 수준, IFN-γ 수준, 및 분열 인덱스를 확인한 결과를 나타낸다.
도 31c는 정상인의 초기 Temra 비율에 따른, TCB2-IL2 복합체 자극 이후의 퍼포린 수준, IFN-γ 수준, 및 분열 인덱스를 확인한 결과를 나타낸다.
도 31d는 tilCD8+ (tilTemra)세포 비율에 따른, IL-2 자극 이후의 IFN-γ 수준, 퍼포린 수준, 및 분열 인덱스를 확인한 결과를 나타낸다.
도 32a는 암환자의 DP Temra % 및 DP Tem % 데이터로 2차원 그래프를 그리고, Q1 내지 Q4 그룹으로 환자를 분류한 후, 각 환자의 tilTemra %를 나타낸 그림이다.
도 32b는 상기 도 32a의 Q1, Q2, 및 Q3/Q4 그룹의 tilTemra %를 비교한 결과를 나타낸다.
도 33은 DP Tem 및 DN Tem을 간접적으로 정의할 수 있는 분자 마커를 발굴하기위해, DP Tem, SP Tem, 및 DN Tem의 각 마커들의 발현 수준을 비교한 히트맵이다.
도 34는 본 발명에 따른 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측 방법의 전체적인 원리를 나타낸 그림이다.
도 1a CCR7 및 CD45RA를 사용하여 CD8+ T 세포 아형 (Tn, Tcm, Tem 및 Temra)을 PBMC (좌측) 및 TIL (우측)과 구별한 유세포분석 결과이다.
도 1b는 TIL 내 CD8+ T 세포 아형의 비율을 나타낸 도면이다
도 1c는 tilTem 및 tilTemra의 상대적 텔로미어 길이를 나타낸 도면이다. 텔로미어 길이는 텔로미어 및 36B4의 비율로 측정했다. 상대적 텔로미어 길이는 동일한 종양에서 얻은 tilTem의 텔로미어 길이로 나누어 계산했다.
도 1d 내지 1g는 TIL을 4시간 동안 재자극한 후, 퍼포린 (도 1d), 그랜자임 B (도 1e), IFN-γ (도 1f), 및 IL-2 (도 1g)을 생성하는 tilTem 또는 tilTemra의 비율을 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 1h는 tilTem 및 tilTemra를 정제하고 CTV로 표지한 후, anti-CD3 (5 μg/ml), anti-CD28 (2 μg/ml), 및 IL-2 (10 ng/ml)로 7일 동안 자극한 결과를 나타낸다. CTV 희석 (CTV dilution)은 유세포 분석으로 평가했으며, 희석된 CTV를 가진 세포는 증식된 세포로 간주했다 (n=6). 통계적 유의성은 Student's T test로 평가했다.
도 2a 내지 도 2d는 tilTemra와 pTemra(peripheral Temra) 간의 전사체 프로파일을 비교한 도면이다.
도 2a는 tilTemra 및 pTemra의 주성분 분석 (PCA) 결과를 나타낸다.
도 2b는 계층적 클러스터링 분석 결과를 나타낸다.
도 2c는 차별 발현 유전자 (DEGs, differentially expressed genes) 분석 결과를 나타낸다. 유의미한 발현수준 (FPKM>0)을 갖는 15,299개 유전자를 기반으로 볼케이노 플랏을 생성했다. P 값은 먼저 t-test 검정으로 분석한 것을 Benjamini-Hochberg procedure로 조정된 P 값으로 나타냈다. 배수 변화는 tilTemra의 평균 발현량에서 pTemra 평균 발현량을 나누어 계산했다. 빨간색 점은 tilTemra에서 상향-조절된 유전자를 나타내며 (배수 변화>2, 조정된 P 값<0.05), 파란색 점은 pTemra에서 상향-조절된 유전자를 나타낸다 (배수 변화>0.5, 조정된 P 값<0.05).
도 2d는 Broad Institute 및 Gene Ontology에서 얻은 유전자 세트를 사용한 GSEA 결과의 요약을 보여준다. 풍부 스코어 (enrichment score)는 최고 또는 최저 실행 풍부 스코어 (running enrichment score)의 절대값을 나타낸다.
도 3a 내지 3e는 tilTemra 및 pTemra의 기능적 표현형을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3a 내지 3d는 TIL 및 PBMC를 4시간 동안 재자극한 후, 퍼포린 (도 3a), 그랜자임 B (도 3b), IFN-γ (도 3c), 및 IL-2 (도 3d)을 생성하는 tilTemra 또는 pTemra의 비율을 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 3e는 tilTemra 및 pTemra를 정제하고 CTV로 표지한 후, anti-CD3 (5 μg/ml), anti-CD28 (2 μg/ml), 및 IL-2 (10 ng/ml)로 7일 동안 자극한 결과를 나타낸다. 증식된 세포는 유세포 분석으로 분석했다.
도 3f는 tilTemra (좌측) 및 pTemra (우측)의 CD27 및 CD28 발현 수준에 대한 유세포 분석 데이터이다.
도 3g는 tilTemra 및 pTemra의 DP (좌측) 및 DN (우측) 표현형의 비율을 보여주는 도면이다.
도 3h는 TILs 중 DP 표현형 비율 (tilDP %)로부터 PBMC 중 DP 표현형 비율 (pDP %)을 빼서 계산한 DP 표현형 비율 차이를 보여주는 도면이다. 도면에서 알 수 있듯이, 차이 값(tilDP % - pDP %)은 Temra에서는 항상 0보다 높은 수치였으나, Tem에서는 그렇지 않았다.
도 3i 및 3j는 TIL 및 PBMC를 4시간 동안 재자극한 후 퍼포린 (도 3i) 및 IL-2 (도 3j)를 생성하는 세포의 비율을 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 4a 내지 4e는 CD8 + TIL의 Temra로의 분화 궤적 (differentiation trajectory)을 나타낸 도면이다.
도 4a 및 4b는 CD8+ TIL의 tSNE 분석 결과를 나타낸다. TIL은 tSNE 분석 전에 CD3+CD8+ 세포에 게이팅되었다. 다음의 파라미터들이 tSNE 분석에 사용됐다: CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD8, CD3, CD5, CCR7, Perforin, 및 CD57.
도 4a 좌측 패널의 빨간색 점은 CD45RA+CD45RO-CCR7- Temra를 나타내며, 2가지 tilTemra 클러스터링 (1 및 2로 표기함)이 관찰됐다. 표시된 분자의 상대적인 발현 수준은 검정색 (낮음)에서 노랑색 (높음)까지의 색상 스케일로 표시됐다. 도 4b에서, 상기 2가지 tilTemra 클러스터링 (각각 빨간색 및 파란색으로 표기함)이 3명의 환자에서 관찰됐다. 표시된 분자의 발현을 히스토그램으로 나타냈다. 회색 히스토그램은 tilTem을 나타낸다.
도 4c는 CD3+CD8+ TIL을 사용하여 FLOW MAP로 단일세포 궤적분석 (single cell trajectory analysis)을 수행한 결과를 나타낸다. 다음의 클러스터링 변수가 FLOW MAP에 사용됐다: CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD8, CD3, CD5, 및 CCR7. 각 노드의 CD27, CD28, CD45RA, 및 CD45RO의 상대적인 발현은 Gephi 소프트웨어로 분석했으며, 다음과 같이 표시했다: 분홍색, DP Tem; 노랑색, SP Tem; 연한 파란색, DN Tem; 빨간색, DP Temra; 초록색, SP Temra; 및 어두운 파란색, DN Temra. 표시된 분자의 상대적인 발현 수준은 검정색 (낮음)에서 노랑색 (높음)까지의 색상 스케일로 표시됐다.
도 4d는 2개 화살표 (빨간색 및 파란색)로 표시된, 분기된 분화 궤적을 나타낸다.
도 4e는 DP tilTem 및 DP tilTemra간의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 5a 내지 5h는 Temra 분화 과정에서의 CD27, CD28, 및 CD45RA의 발현 조절을 나타낸 도면이다.
도 5a 및 5b는 tilTem을 anti-CD3 (0~10 μg/ml) 및 anti-CD28 (0~4 μg/ml)로 7일 동안 자극하거나; IL-2 (0~10 ng/ml)로 7일 동안 자극한 후 CD28 (도 5a) 및 CD27 (도 5b)의 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5c는 TIL을 재자극한 후 IL-2 생성 CD3+ 세포의 빈도를 유세포분석으로 확인한 결과를 나타낸다. CD3+ 세포 중 IL-2+ 세포의 비율을 tilTem 중 CD27+ 세포의 비율과 함께 플롯팅 (plotting) 하였다.
도 5d 및 5e는 tilTemra를 CTV로 표지한 후, 도면에 표시한 자극원들로 7일 동안 자극한 후, CD45RA 발현 (도 5d) 및 증식된 세포의 비율 (도 5e; 유세포분석으로 확인함)을 확인한 결과를 나타낸다. 상대적 CD45RA MFI는 비자극된 세포의 평균 CD45RA MFI로 나누어 계산했다.
도 5f는 tilTemra를 CTV로 표지한 후, TCR (anti-CD3 (5 μg/ml) 및 anti-CD28 (2 μg/ml)), IL-2 (10 ng/ml), 또는 이들의 조합으로 7일 동안 자극한 후 세포 증식을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5g는 tilTem 내 CD45RA 재발현을 보여주는 대표적인 유세포분석 그림이다. TIL로부터 CD45RAloCCR7- tilTem를 게이팅 했으며, CD27 또는 CD28과 함께 CD45RA의 발현을 측정했다.
도 5h는 DP, SP, 및 DN tilTem의 CD45RA 발현을 확인한 결과이다. 상대적 CD45RA MFI는 동일한 종양 유래의 DP 세포의 MFI 값으로 나누어 계산했다.
도 6a 내지 도 6i는 DP Temra; 및 CD8 + TIL 개수 및 TMB 간의 상관관계를 보여주는 도면이다.
도 6a 내지 6d는 각각 CD8+ TIL 개수 및 DP tilTem의 상관관계 (도 6a); CD8+ TIL 개수 및 DP tilTemra의 상관관계 (도 6b); DP pTemra의 비율 및 DP tilTemra의 비율의 상관관계 (도 6c); 및 CD8+ TIL 개수 및 DP pTemra의 비율의 상관관계 (도 6d)를 나타내는 그래프이다.
도 6e는 저비율의 DP pTemra (<6%; “DP pTemra low”) 또는 고비율의 DP pTemra (>6%; “DP pTemra high”)를 갖는 환자의 CD8+ TIL 수를 비교한 결과를 나타낸다.
도 6f 내지 6h는 유세포분석으로 NSCLC 환자의 혈액에서 DP pTemra의 비율을 분석한 후, 편평세포암 (SCC)(TMB: 9 (MB당 9개 코딩 체세포 돌연변이가 존재)) 및 비-편평세포암 (non-SCC)(TMB: 6) 환자 그룹 각각에서 고-DP pTemra 환자의 비율을 확인한 결과 (도 6f), 및 흡연자 (TMB: 11); 비-흡연자 (TMB: 0.6) 환자 그룹 각각에서 고-DP pTemra 환자의 비율을 확인한 결과 (도 6g), 및 면역체크포인트 저해제에 대한 반응성을 기준으로 나눈 PR, SD, 및 PD 환자 그룹 각각에서 고-DP pTemra 환자의 비율을 확인한 결과 (도 6h)를 나타낸다.
도 6i는 종양 항원이 CD8+ TIL의 분화 궤적을 형성하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 7a 내지 도 7f는 말초 CD8+ T 세포 아형의 특성을 나타낸 도면이다.
도 7a는 CD8+ T 세포 아형을 PBMC 및 TIL과 구별하기 위한 게이팅 전략 (gating strategy)을 나타낸 것이다.
도 7b는 PBMC 유래 CD8+ T 세포 중 CD8+ T 세포 아형의 비율을 나타낸다.
도 7c 내지 7f는 PBMC를 4시간 동안 재자극한 후, 퍼포린 (도 7c), 그랜자임 B (도 7d), IFN-γ (도 7e), 및 IL-2 (도 7f)을 생성하는 pTem 또는 pTemra의 비율을 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸다. 통계적 유의성은 Wilcoxon matched-pairs signed rank test로 평가했다.
도 8a 내지 8g는 tilTemra와 pTemra 간 차별 발현 유전자(DEGs, differentially expressed genes)를 분석한 결과를 보여주는 도면이다.
도 8a 내지 8d는 분화 관련 유전자 (TBX21, EOMES, PRF1, GZMB, GZMH) (도 8a); 보조자극 분자 (ICOS, CD28) (도 8b); 노화 또는 탈진 관련 유전자 (B3GAT1, TOX) (도 8c); 및 증식 및 기억 관련 유전자 (MYC, TCF7) (도 8d)들의 RNA seq 데이터를 나타낸다.
도 8e 내지 8g는 탈진 (도 8e); 세포독성 (도 8f); 및 증식 (도 8g)과 관련된 유전자 세트의 GSEA 결과를 나타낸다. 통계적 유의성은 Mann-Whitney test로 확인했다.
도 9a 내지 9b는 tilTem 및 pTem의 기능적 표현형을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9a는 anti-CD3 (5 μg/ml), anti-CD28 (2 μg/ml), 및 IL-2 (10 ng/ml)로 7일 동안 자극된 세포들의 CTV 희석을 나타낸 히스토그램이다.
도 9b 내지 9e는 퍼포린 (도 9b), 그랜자임 B (도 9c), IFN-γ (도 9d), 및 IL-2 (도 9e)을 생성하는 tilTem 또는 pTem의 비율을 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 9f는 tilTem 및 pTem의 DP (좌측) 및 DN (우측) 표현형의 비율을 보여주는 도면이다.
도 9g 내지 9h는 PBMC 유래 Temra 세포 (pTemra), TIL (tilTemra), 및 NAT (nTemra)의 DP 비율 (도 9g), IL-2 생성 정도 (도 9h), 및 퍼포린 생성정도 (도 9i)를 분석한 결과를 나타낸다.
도 10a 내지 10c는 tSNE 및 FLOW MAP에서 CD8 + TIL의 주요 분자 발현 수준을 나타낸 도면이다.
도 10a는 CD8+ TIL에서 tSNE 분석을 통해 각 분자들의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸다. 표시된 분자의 상대적인 발현 수준은 검정색 (낮음)에서 노랑색 (높음)까지의 색상 스케일로 표시됐다.
도 10b는 tilTem의 각 분자들의 상대적 발현 수준 및 tilTemra의 2가지 클러스터링을 나타낸다.
도 10c는 FLOW MAP으로 확인한 각 분자들의 상대적 발현 수준을 나타낸다. 표시된 분자의 상대적인 발현 수준은 검정색 (낮음)에서 노랑색 (높음)까지의 색상 스케일로 표시됐다.
도 11a 내지 11i는 CD27, CD28, 및 CD45RA의 발현 조절을 나타낸 도면이다.
도 11a는 Tn 및 tilTem을 정제한 후 7일 동안 무자극 (no stimulation, NS), anti-CD3 (5 μg/ml) 및 anti-CD28 (2 μg/ml) 자극 처리한 후 유세포분석으로 CD28 및 CD27 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 11b 및 11c는 tilTem을 도면에 표시된 각각의 사이토카인 (각각 20 ng/ml)으로 7일 동안 자극한 후 유세포분석으로 CD28 (도 11b) 및 CD27 발현 (도 11c)을 확인한 결과를 나타낸다.
도 11d는 TIL을 anti-CD3 및 anti-CD28로 5시간 동안 재자극한 후 IL-2 생성 tilTem을 유세포분석으로 확인한 결과를 나타낸다. 1시간 후 GolgiPlug를 첨가하였다.
도 11e는 Tn, pTemra, 및 tilTemra를 7일 동안 무자극 (회색) 또는 anti-CD3 (5 μg/ml) 및 anti-CD28 (2 μg/ml) 자극 처리한 후 CD45RA 발현을 유세포분석으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 11f 및 11g는 Tn, pTem, 및 tilTem을 CTV로 표지하고, anti-CD3 (5 μg/ml) 및 anti-CD28 (2 μg/ml) (도 11f); 또는 IL-2 (10ng/ml) (도 11g)로 7일 동안 자극한 후 세포 증식을 유세포분석으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 11h는 pTem에서 CD45RA의 재발현을 보여주는 대표적인 유세포분석 그림이다. PBMC로부터 CD45RAloCCR7- pTem을 게이팅하였으며, CD45RA 발현을 CD27 또는 CD28로 확인했다.
도 11i는 DP, SP, 및 DN pTem의 상대적 CD45RA 발현을 보여준다. 상대적 CD45RA MFI는 동일한 PBMC로부터 유래한 DP 세포의 MFI 값으로 나누어 계산했다.
도 12a 내지 12i는 DP pTemra의 비율 및 종양 면역원성 간의 상관관계를 나타낸 도면이다.
도 12a는 CTV로 표지된 Tn을 약한 TCR 자극 (anti-CD3 (1 μg/ml) 및 anti-CD28 (0.4 μg/ml)) 또는 강한 TCR 자극 (anti-CD3 (5 μg/ml) 및 anti-CD28 (2 μg/ml))을 7일 동안 가한 후, 유세포분석으로 증식된 세포를 확인한 결과를 나타낸다.
도 12b 내지 12e는 말초 또는 종양 침윤 CD27+/- Tem 및 CD27+/- Temra 세포에서 TCR α/β 사용을 분석한 결과를 나타낸다 (도 12b, Vα7.2 사용을 확인한 결과; 도 12c, Vβ8 사용을 확인한 결과; 및 도 12d, Vβ12 사용을 확인한 결과).
도 12e는 8가지 TCR α/β 사용 (Va2, Vα7.2, Vα12.1, Vβ3, Vβ5b, Vβ8, Vβ12, 및 Vβ13.1)을 이용하여 생성한 샘플 거리 매트릭스를 보여준다. 각 매트릭스 단일한 개체에서 유래한 T cell 아형을 포함한다. 파란색일수록 거리가 가깝고, 흰색일수록 거리가 먼 것을 나타낸다. 각 매트릭스 상단의 계층적 클러스터링에서, 붉은색 선은 CD27+ tilTemra 및 CD27+ pTemra 간의 거리를 나타내고, 파란색 선은 CD27- tilTemra 및 CD27+ tilTemra/CD27+ pTemra 간의 거리를 나타낸다.
도 12f 및 12g는 NSCLC 환자의 혈액 샘플에서 Ki-67-발현 CD8+ T 세포 (도 12f) 및 PD-1-발현 CD8+ T 세포 (도 12g)를 확인한 결과를 나타낸다.
도 12h 및 12i는 SCC 및 non-SCC 환자의 DP pTemra 비율 (도 12h), 및 흡연 또는 비흡연 환자의 DP pTemra 비율 (도 12i)을 나타낸다. 점선은 DP pTemra %=6%인 경우의 기준선을 나타낸다.
도 13은 정상인과 NSCLC 암환자의 CD8 T 세포에서 각 아형 (Tn, Tcm, Tem, 및 Temra)의 비율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 14는 NSCLC 암환자의 PBMC를 PMA/ionomycin으로 재자극한 후, CD8 T 세포의 각 아형에서 퍼포린, 그랜자임 B, IFN-γ, 또는 IL-2를 분비하는 세포의 비율을 유세포분석으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 15는 정상인 또는 NSCLC 암환자의 PBMC를 PMA/ionomycin으로 재자극한 후, Tem 세포 중 퍼포린, 그랜자임 B, IFN-γ, 또는 IL-2를 분비하는 세포의 비율을 유세포분석으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 16은 NSCLC 암환자가 면역항암요법 (PD-1 요법 또는 PD-L1 요법, 이하 동일)을 받기 전 (“Before”)과 후 (“After”)의 PBMC를 PMA/ionomycin으로 재자극한 후, Tem 세포 중 퍼포린, 그랜자임 B, IFN-γ, 또는 IL-2를 분비하는 세포의 비율을 유세포분석으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 17은 면역항암요법 후 퍼포린 및 그랜자임 B 수준이 증가한 환자 그룹 (“Perforin changed” 및 “Granzyme B changed”)과 그렇지 않은 환자 그룹 (“Perforin NOT changed” 및 “Granzyme B NOT changed”) 각각에서 면역항암요법에 대한 부분 관해 (PR)을 보인 환자들의 비율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 18은 면역항암요법 후 퍼포린 및 그랜자임 B 수준이 증가한 환자 그룹 (“Perforin increased” 및 “Granzyme B increased”)과 그렇지 않은 환자 그룹 (“Perforin NOT increased” 및 “Granzyme B NOT increased”) 각각에서 면역항암요법을 진행하기 전 혈액의 퍼포린 수준 (“Initial perforin”) 및 그랜자임 B 수준 (“Initial Granzyme B”)을 측정한 결과를 나타낸다.
도 19a 내지 19b는 암환자의 Tem 세포의 각 아형 (DP, SP, 및 DN)에서 퍼포린, 그랜자임 B, IFN-γ, 또는 IL-2를 분비하는 세포의 비율을 유세포분석으로 확인한 결과 (도 19a), 및 각 세포에서 발현되는 분자의 MFI를 측정한 결과 (도 19b)를 나타낸다.
도 20a 내지 20b는 암환자의 전체 Tem 중 DP 또는 DN 아형의 비율과 퍼포린 및 그랜자임 B의 발현 수준의 상관관계를 나타낸 그래프이다. 도 20a는 전체 Tem 중 DP Tem의 비율; 및 퍼포린 또는 그랜자임 B의 상관관계를 나타낸 그래프, 도 20b는 전체 Tem 중 DN Tem의 비율; 및 퍼포린 또는 그랜자임 B의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 21a는 암환자를 전체 Tem 중 DP Tem 비율이 높은 환자 (High DP Tem%) 및 DP Tem 비율이 낮은 환자 (Low DP Tem%)로 나누고, 면역항암요법 (PD-1 요법) 전후의 퍼포린 및 그랜자임 B의 발현 수준을 비교한 결과를 나타낸다.
도 21b는 암환자를 전체 Tem 중 DN Tem 비율이 높은 환자 (High DN Tem%) 및 DN Tem 비율이 낮은 환자 (Low DN Tem%)로 나누고, 면역항암요법 (PD-1 요법) 전후의 퍼포린 및 그랜자임 B의 발현 수준을 비교한 결과를 나타낸다.
도 22a 및 22b는 암환자를 전체 Tem 중 DP Tem 및 DN Tem의 비율을 기준으로 4개 그룹으로 나눈 후 (High DP Tem%; Low DP Tem%; High DN Tem%; 및 Low DN Tem%), 각 그룹에서 면역항암요법 (PD-1 요법) 전후의 Ki-67 발현 수준 (도 22a) 및 면역항암요법에 대해 부분 관해 (PR)을 보인 환자의 비율 (도 22b)을 비교한 결과를 나타낸다.
도 23a은 NSCLC 3기 및 4기 환자를 연령대 별로 그룹화하고 (40s/50s; 60s; 및 70s/80s), 각 그룹별로 전체 Tem 중 DP Tem 및 DN Tem의 비율을 확인한 결과이다.
도 23b는 40대/50대에 해당하는 정상인 및 NSCLC 3기/4기 환자 그룹 간에 전체 Tem 중 DP Tem 및 DN Tem의 비율을 비교한 결과이다.
도 24는 종양 진행정도에 따른 DP Tem 및 DN Tem 분포 양상을 확인하기 위해 정상인 및 NSCLC 환자 (Stage I/II, Stage III, 및 Stage IV) 그룹별로 전체 Tem 중 DP Tem 및 DN Tem의 비율을 확인한 결과이다.
도 25a는 x축을 DP Temra, y축을 DP Tem (좌측 그래프) 또는 DN Tem (우측 그래프)으로 하여 NSCLC 환자의 2차원 그래프를 그리고, 면역항암치료 (P1 치료)에 대해 반응성을 보인 환자 (PR)와 그렇지 않은 환자 (no PR)를 각각 플롯팅한 후, DP Temra 및 DP/DN Tem 수준을 기준으로 Q1 내지 Q4 그룹으로 분류한 것을 나타낸다.
도 25b는 DP Temra; 및 DP Tem (좌측 그래프) 또는 DN Tem (우측 그래프)의 이중 마커 기초하여 분류된 Q1 내지 Q4 그룹 간에 면역항암치료에 대해 부분 관해를 보인 환자의 비율을 비교한 결과를 나타낸다.
도 25c는 DP Temra 및 DP/DN Tem의 이중 마커의 면역치료 반응성 예측 능력을 단일 마커의 예측 능력과 비교하기 위해, 각 마커별로 PR-환자 비율을 확인한 결과를 나타낸다.
도 26은 DP Temra/DP Tem 그래프 (좌측) 및 DP Temra/DN Tem 그래프 (우측)에 대해 K-NN 머신러닝을 사용하여 (K=7) 각 플롯별 PR 빈도를 나타낸 pGRAPH이다. PR 빈도가 높을수록 붉은색으로 표시하였다.
도 27a는 120명의 NSCLC 환자 각각의 DP Temra 및 DN Tem 수준을 pGRAPH에 적용하여 예측 PR% (Predicted PR%) 값을 얻은 후, 예측 PR%가 실제 예후 인자 (실제 PR%, 실제 DCB%, mPFS, 및 mOS)와 일치하는지 확인한 결과를 나타낸다.
도 27b는 도 27a의 예측 PR%에 따른 무진행 생존기간 및 전체 생존기간을 확인한 그래프이다.
도 28a는 72명의 암환자 데이터 기반으로 제작된 pGRAPH를 이용하여 다른 30명의 환자의 예측 PR% 값을 얻은 후, 예측 PR%가 실제 예후 인자 (실제 PR%, 실제 DCB%, mPFS, 및 mOS)와 일치하는지 확인한 결과를 나타낸다.
도 28b는 도 28a의 예측 PR%에 따른 무진행 생존기간 (좌측) 및 전체 생존기간 (우측)을 확인한 그래프이다.
도 29a는 정상인 및 NSCLC 환자 (Stage I/II, Stage III, 및 Stage IV) 그룹별로 전체 Tem 중 SP Tem의 비율을 확인한 결과이다.
도 29b는 NSCLC 환자의 SP Temra 및 SP Tem 데이터 기반으로 제작된 pGRAPH이다.
도 29c는 72명의 암환자의 SP Temra 및 SP Tem 데이터 기반으로 제작된 pGRAPH로 다른 30명의 환자의 예측 PR% 값을 얻은 후, 예측 PR%가 실제 예후 인자 (실제 PR%, 실제 DCB%, 실제 mPFS, 및 실제 mOS)와 일치하는지 확인한 결과를 나타낸다.
도 30a는 정상인의 PBMC에서 분류한 Tn, DP Tem, DN Tem, 및 Temra 세포를 IL-2로 7일간 자극한 후 IFN-γ-발현 세포의 비율 (좌측), 퍼포린-발현 세포의 비율 (중간), 및 CTV 희석정도에 근거한 분열 인덱스 (우측)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 30b는 정상인의 PBMC에서 분류한 Tn, DP Tem, DN Tem, 및 Temra 세포를 IL-2 또는 항-CD3/CD28로 7일간 자극한 후 세포 분열 정도를 비교한 결과를 나타낸다.
도 31a는 초기 Terma 비율 및 IL-2 치료 (IL-2 또는 TCB2-IL-2)에 대한 반응성 간의 관련성을 확인하기 위한 실험 흐름도를 나타낸다.
도 31b는 정상인의 초기 Temra 비율에 따른, IL-2 자극 이후의 퍼포린 수준, IFN-γ 수준, 및 분열 인덱스를 확인한 결과를 나타낸다.
도 31c는 정상인의 초기 Temra 비율에 따른, TCB2-IL2 복합체 자극 이후의 퍼포린 수준, IFN-γ 수준, 및 분열 인덱스를 확인한 결과를 나타낸다.
도 31d는 tilCD8+ (tilTemra)세포 비율에 따른, IL-2 자극 이후의 IFN-γ 수준, 퍼포린 수준, 및 분열 인덱스를 확인한 결과를 나타낸다.
도 32a는 암환자의 DP Temra % 및 DP Tem % 데이터로 2차원 그래프를 그리고, Q1 내지 Q4 그룹으로 환자를 분류한 후, 각 환자의 tilTemra %를 나타낸 그림이다.
도 32b는 상기 도 32a의 Q1, Q2, 및 Q3/Q4 그룹의 tilTemra %를 비교한 결과를 나타낸다.
도 33은 DP Tem 및 DN Tem을 간접적으로 정의할 수 있는 분자 마커를 발굴하기위해, DP Tem, SP Tem, 및 DN Tem의 각 마커들의 발현 수준을 비교한 히트맵이다.
도 34는 본 발명에 따른 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측 방법의 전체적인 원리를 나타낸 그림이다.
본 발명은 암환자의 예후 및/또는 항암 치료에 대한 반응성을 예측하는 방법 등에 관한 것으로서, 특정 CD8+ T 세포 아형 (subset)의 비율이 암환자의 예후 및 항암 치료에 대한 반응성과 관련이 있음을 확인하여 완성된 것이다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 DP pTemra (CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포)가 종양 돌연변이 부하 (Tumor mutation burden, TMB) 및 종양-침윤 CD8 T 세포의 수와 역 상관관계를 가지며, 따라서 환자의 종양 면역원성 (immunogenecity; 혹은 항원성 (antigenecity))상태를 반영하는 마커이자 면역항암치료에 대한 환자의 반응성을 예측하기 위한 마커로 활용될 수 있음을 확인하였다 (실시예 I).
본 발명의 다른 실시예에서는 암환자의 CD8+ 독성 T 림프구 (CD8+ cytotoxic T lymphocyte: CTL)의 항암면역반응 유도 및 수행 능력 (즉 면역력: 면역항암치료에 대해 반응할 수 있는 능력)을 반영할 수 있는 적합성 인자 (Fitness factor) 마커(marker) 들을 발굴하여, DP Tem%이 높을수록; DN Tem%가 낮을수록; 면역항암치료 후 Perforin (퍼포린)+ Tem%이 증가할수록; 면역항암치료 후 Granzyme B (그랜자임 B)+ Tem%이 증가할수록; 그리고 면역항암치료 후 IL-2+ Tem%이 감소할수록 암환자의 독성 T 세포 면역력이 높아 항암치료에 유리한 것을 확인하였으며, 따라서 상기 Fitness factor를 면역항암치료에 대한 환자의 반응성을 예측하기 위한 독립적인 바이오마커로 활용할 수 있음을 확인하였다 (실시예 II).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 암의 면역원성 (및 항원성) 상태를 나타내는 DP Temra 및 환자의 독성 T 세포 면역력 상태를 나타내는 Fitness factor를 조합하는 것이, 각 마커를 독립적으로 이용할 때보다 예후 예측 능력 및 면역항암제에 대한 암환자의 반응성 예측 능력이 더욱 우수한 것을 확인하였으며, DP Temra 및 Fitness factor 데이터를 기반으로 K-NN (K-Nearest Neighbor algorithm) 알고리즘에 기반한 머신러닝을 통해 암환자의 예후 예측 능력 및 항암 치료에 대한 반응성 예측 시스템 (pGRAPH)을 확립하였다 (실시예 III).
이하, 본 발명에 대해 구체적으로 서술한다.
본 발명은 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CD8+ T 세포 아형의 비율을 측정하는 단계를 포함하는, 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측 방법 (또는 이를 위한 정보제공방법)으로서, 상기 CD8+ T 세포 아형의 비율은 하기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다:
(i) 전체 CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (Temra) 대비 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (DP (double positive) Temra)의 비율;
(ii) 전체 CD8+ T 세포 대비 CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (Temra)의 비율;
(iii) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (DP Tem)의 비율;
(iv) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 CD27- CD28- CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (DN (double negative) Tem)의 비율;
(v) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 Perforin+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Perforin 발현 Tem)의 비율;
(vi) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 Granzyme B+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Granzyme B 발현 Tem)의 비율; 및
(vii) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 IL-2+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (IL-2 발현 Tem)의 비율.
상기 DP 및 DN은 CD27 및 CD28의 발현 수준을 기준으로 한 것이다. CD27 및 CD28은 T 세포 표면에 발현될 수 있는 보조자극 분자 (co-stimulatory molecule)이다.
상기 “+”는 해당 단백질을 발현하는 경우는 물론, 기타 아형에 비해 해당 단백질의 발현 수준이 높은 경우를 포함하는 의미이다. 즉, 본 발명에 있어서 “+”는 고발현을 의미하는 “high (hi)”을 포함하는 의미이다. 마찬가지로, 상기 “-“는 해당 단백질을 발현하지 않는 경우는 물론, 기타 아형에 비해 해당 단백질의 발현 수준이 낮은 경우, 및 해당 단백질의 검출이 불가능할 정도록 발현 수준이 매우 낮은 경우를 모두 포함하는 의미이다. 즉, 본 발명에 있어서 “-“는 저발현을 의미하는 “low (lo)”를 포함하는 의미이다.
본 발명에 있어서, “CD8+ T 세포”는 세포 표면에 CD8 당단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 T 세포로서, 바이러스나 박테리아와 같은 병원체 및 종양, 이식된 장기 등에서 발현되는 외부 항원을 인지하고, 해당 항원을 발현하는 세포를 제거하는 기능을 갖는 세포독성 T 세포 (cytotoxic T cells)이다.
CD8+ T 세포는 분화 상태에 따라 다양한 아형 (subset)으로 나뉘며, 이들 아형은 C-C chemokine receptor type 7 (CCR7), CD45RA, CD45RO, CD57과 같은 세포 표면 마커로 구별될 수 있다. 특히, CCR7 및 CD45RA는 건강한 사람과 환자 모두에서 CD8+ T 세포의 분화 상태를 구별하는데 널리 사용되었다. 완전히 성숙한 CD8+ T 세포는 na
ve T 세포 (CCR7+ CD45RA+, Tn)로서 흉선을 빠져나오는 세포이다. 활성화가 되면 Tn 세포의 CCR7 및 CD45RA의 발현이 점차 하향조절 되어, 이펙터 T 세포 (CCR7- CD45RA-; Teff)로의 분화가 유도된다. Teff 세포는 더욱 분화되어 이펙터 메모리 T 세포 (CCR7- CD45RA-; Tem)가 되거나, 또는 CCR7의 발현이 점차 증가하여 중앙 메모리 T 세포 (CCR7+ CD45RA-; Tcm)가 된다. 그러나 일부 세포의 경우, CD45RA를 재발현하는 Temra 세포 (CCR7- CD45RA+)로 분화한다. CD8+ T 세포의 다양한 아형 중 Temra는 가장 최종적으로 분화된 (terminally differentiated) 아형으로 여겨지며, 퍼포린 (perforin) 및 그랜자임 B (Granzyme B)를 활발히 생성하고, 낮은 세포증식력과 분화 가소성 (differentiation plasticity)을 특징으로 한다.
각각의 CD8+ T 세포 아형은 또 다시 보조자극 분자 (costimulatory molecules) CD27 및 CD28의 발현 양상 등을 기반으로 더욱 하위 분류로 나뉠 수 있다. Tn 세포는 일반적으로 CD27 및 CD28 모두 높은 수준으로 발현하지만, Teff, Tem, 및 Temra 세포의 경우 CD27 및 CD28의 발현 양상이 다양하게 나뉜다.
상기 정보를 기초로, 본 발명자들은 CD8+ T 세포 아형들의 수준과 암환자의 예후 및/또는 항암제에 대한 반응성 간의 상관관계를 탐색하였으며, 그 결과, 전체 CD8+ T 세포 중 특정 CD8+ T 세포 아형이 차지하는 비율이 암환자의 예후 및 항암제에 대한 반응성을 결정한다는 것을 확인하였다.
한편, “퍼포린 (Perforin)”은 세포독성 T 세포 및 자연살해 세포 (NK 세포) 등에서 발견되는 단백질로서, 타겟 세포 (예를 들어, 암세포)의 세포막에 구멍을 형성할 수 있는 세포용해성 (cytolytic) 단백질이다. “그랜자임 (Granzyme)” 역시 세포독성 T 세포 및 NK 세포에서 발현되는 대표적인 단백질이며, 타겟 세포의 세포자멸사 (apoptosis)를 유도할 수 있다. 즉, 세포독성 T 세포는 퍼포린을 통해 타겟 세포의 막에 구멍을 뚫은 후 그랜자임 (예를 들어, 그랜자임 B)을 전달하여 타겟 세포의 사멸을 유도한다. “IL-2 (인터루킨-2, Interleukin-2)”는 면역세포들의 생존, 확장, 및 기능 활성화에 필수적인 역할을 하는 사이토카인이다. T 세포는 IL-2 수용체를 표면에 발현하고 있어, IL-2와 수용체의 상호작용시 세포 분열 및 활성이 증가한다.
즉, 퍼포린, 그랜자임 B, 및 IL-2는 모두 T 세포의 기능과 관련성이 높은 단백질인데, 본 발명자들은 CD8+ T 세포의 아형 내에서도 상기 단백질들의 발현 수준에 차이가 있으며, 특정 발현 양상을 보이는 세포들이 암환자의 예후 및 항암제에 대한 반응성과 연관이 있음을 발견하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (DP Temra)가 종양 돌연변이 부하 (Tumor mutation burden, TMB) 및 조직 내 종양-침윤 CD8 T 세포의 수와 역 상관관계를 갖는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 DP Temra는 암항원 돌연변이 또는 암항원면역원성과 음의 상관관계에 있는 것이 확인되었다. 나아가, 본 발명자들은 상기 DP Temra가 암환자의 종양 항원에 대한 면역원성 (및 항원성) 상태를 반영할 수 있으며, 전체 Temra 대비 DP Temra의 수준이 낮은 환자가 면역항암치료 후 부분 관해 (partial response, PR)를 나타냄을 확인하였다.
즉, 본 발명에 따른 예측 방법은 전체 Temra 대비 DP Temra의 비율이 대조군과 비교하여 낮은 경우, 피검체의 예후가 더 좋을 것으로 판정하거나, 항암 치료에 대한 반응성이 더 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 예측 방법은 상기 CD27 및 상기 CD28이 모두 양성인 Temra (CD45RA+, CCR7-) 세포 수가 상기 시료에 존재하는 전체 Temra (CD45RA+, CCR7-) 세포 수 대비 소정의 비율 이하로 검출되면 항암 치료 (바람직하게는, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 치료)에 대한 반응성이 더 높은 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있고, 구체적으로 소정의 비율은 1 내지 10%, 1 내지 9%, 1 내지 8%, 1 내지 7%, 1 내지 6%, 2 내지 10%, 3 내지 10%, 4 내지 8%, 5 내지 7%, 또는 6% 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일 실시예에 따르면 정보제공방법은 상기 CD27 및 상기 CD28이 모두 양성인 Temra (CD45RA+, CCR7-) 세포 수가 상기 시료에 존재하는 전체 Temra (CD45RA+, CCR7-) 세포 수 대비 10%, 9%, 8%, 7%, 또는 6% 이하로 검출되면 면역 항암제 치료 반응성이 더 높은 것으로 판단할 수 있다.
또한, 본 발명자들은 하기 CD8+ T 세포 아형들의 비율이 암환자의 독성 T 세포 면역력 (항암 치료, 특히 면역항암치료에 대해 반응할 수 있는 능력)을 반영할 수 있는 것을 확인하였으며, 이들을 종합적으로 “Fitness factor”로 명명하였다:
(a) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (DP Tem)의 비율;
(b) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 CD27- CD28- CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (DN Tem)의 비율;
(c) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 Perforin+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Perforin 발현 Tem)의 비율;
(d) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 Granzyme B+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Granzyme B 발현 Tem)의 비율; 및
(e) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 IL-2+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (IL-2 발현 Tem)의 비율.
구체적으로, 본 발명자들은 전체 Tem 대비 DP Tem의 비율이 높은 환자; 및 전체 Tem 대비 DN Tem 비율이 낮은 환자가 면역항암치료 (항-PD-1/PD-L1 치료) 후 부분 관해 (partial response, PR)를 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 예측 방법은 전체 Tem 대비 DP Tem의 비율이 대조군과 비교하여 높은 경우, 및/또는 전체 Tem 대비 DN Tem의 비율이 대조군과 비교하여 낮은 경우, 피검체의 예후가 더 좋을 것으로 판정하거나, 항암 치료 (바람직하게는, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 치료)에 대한 반응성이 더 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명자들은 면역항암치료 후 부분 관해를 나타낸 환자들은 면역항암치료 전에 비해 면역항암치료 (항-PD-1 또는 항-PD-L1 치료) 후 전체 Tem 대비 Perforin+ Tem 및/또는 Granzyme B+ Tem 비율이 증가하는 것을 확인하였으며, 이와 같은 증가 경향성을 보이는 환자들은 면역항암치료 전에 전체 Tem 대비 Perforin+ Tem 및/또는 Granzyme B+ Tem 비율이 낮았던 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 예측 방법은 전체 Tem 대비 Perforin+ Tem의 비율이 대조군과 비교하여 낮은 경우, 및/또는 전체 Tem 대비 Granzyme B+ Tem의 비율이 대조군과 비교하여 낮은 경우, 피검체의 예후가 더 좋을 것으로 판정하거나, 항암 치료 (바람직하게는, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 치료)에 대한 반응성이 더 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 때, 바람직하게는, 상기 피검체는 항암 치료를 받기 전의 피검체, 더욱 바람직하게는 면역항암치료를 받기 전의 피검체일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 예측 방법은 면역항암치료 전 대비 면역항암치료 (바람직하게는, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 치료) 후 전체 Tem 대비 Perforin+ Tem의 비율 및/또는 전체 Tem 대비 Granzyme B+ Tem의 비율이 증가하는 경우, 피검체의 예후가 더 좋을 것으로 판정하거나, 항암 치료에 대한 반응성이 더 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명자들은 면역항암치료 후 부분 관해를 나타낸 환자들은 면역항암치료 전에 비해 면역항암치료 (항-PD-1/PD-L1 치료) 후 전체 Tem 대비 IL-2+ Tem의 비율이 감소하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 예측 방법은 전체 Tem 대비 IL-2+ Tem의 비율이 대조군과 비교하여 높은 경우 피검체의 예후가 더 좋을 것으로 판정하거나, 항암 치료 (바람직하게는, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 치료)에 대한 반응성이 더 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기서, 바람직하게는, 상기 피검체는 항암 치료를 받기 전의 피검체, 더욱 바람직하게는 면역항암치료를 받기 전의 피검체일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 예측 방법은 면역항암치료 (바람직하게는, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 치료) 전 대비 면역항암치료 후 전체 Tem 대비 IL-2+ Tem의 비율이 감소하는 경우, 피검체의 예후가 더 좋을 것으로 판정하거나, 항암 치료에 대한 반응성이 더 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상술한 항암 치료에 대한 반응성 예측 방법은 면역항암치료, 특히 PD-L1 치료 또는 PD-1 치료에 대한 반응성 예측에 적합한 것일 수 있다.
실제로, 본 발명자들은 DP Tem의 비율이 높을수록, DP Temra의 비율이 낮을수록 암환자의 PD-1 치료에 대한 반응성이 높은 것을 확인하였으나, CCRT (Concurrent chemoradiation therapy)의 경우, 오히려 DP Tem의 비율이 높고 DP Temra 비율이 낮은 환자들에서 반응성이 가장 좋지 않은 것으로 나타났다. 이에 의하면, DP Tem의 비율이 높고 DP Temra 비율이 낮은 환자는 항-PD-1 또는 항-PD-L1 치료가 암 치료에 적절할 것으로 예상되며, 그 외의 한자는 CCRT 치료를 받는 것이 적절할 것으로 사료된다.
추가로, 본 발명자들은 상기 CD8+ T cell의 아형의 수준과 IL-2 치료 (IL-2 단독 또는 병용 항암 치료)에 대한 반응성의 상관관계를 확인한 결과, (i) IL-2 치료 전 전체 CD8+ T 세포 대비 초기 Temra 비율이 높을수록 암환자의 IL-2 치료에 대한 반응성이 더 높고, (ii) 전체 Tem 중 DP Tem이 차지하는 비율이 낮을수록 tilTemra의 비율이 높은 것을, 즉, 암환자의 IL-2 치료에 대한 반응성이 높다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 예측 방법은, IL-2 치료에 대한 반응성을 예측하기 위한 것으로서, 상기 피검체는 상기 항암 치료 (IL-2 단독 혹은 병용 항암 치료)를 받기 전의 피검체이며,
전체 CD8+ T 세포 대비 CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (Temra)의 비율을 측정하는 단계; 및 상기 전체 CD8+ T 세포 대비 Temra의 비율이 대조군과 비교하여 높은 경우, 피검체의 예후가 더 좋을 것으로 판정하거나, 대조군에 비해 피검체의 항암 치료에 대한 반응성이 더 높을 것으로 예측하는 단계를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 예후가 더 좋을 것으로 판정된 환자, 또는 항암치료에 대한 반응성이 더 높을 것으로 예측된 환자의 전체 Temra 대비 DP Temra의 비율은 대조군과 비교하여 높거나, 동등하거나, 혹은 낮을 수 있다. 바람직하게는, 상기 전체 Temra 대비 DP Temra의 비율은 대조군과 비교하여 낮을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또는, 본 발명에 따른 예측 방법은, IL-2 치료에 대한 반응성을 예측하기 위한 것으로서, 상기 피검체는 상기 항암 치료 (IL-2 단독 혹은 병용 항암 치료)를 받기 전의 피검체이며,
전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (DP Tem)의 비율을 측정하는 단계; 및 상기 전체 Tem 세포 대비 DP Tem의 비율이 대조군과 비교하여 낮은 경우 대조군에 비해 피검체의 항암 치료에 대한 반응성이 더 높을 것으로 예측하는 단계를 포함할 수 있다.
이 때, 상기 IL-2 치료는 IL-2 및 IL-2 특이적 항체 (바람직하게는, TCB2)의 복합체에 의한 것일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 IL-2 치료는 대한민국 등록특허 제10-2099593호에 개시된 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 hIL-2가 결합된 복합체(TCB2-IL-2)에 의한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 예측 방법은 암 환자의 항암 치료 전, 중 또는 후에 수행될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 항암 치료 전에도 그 환자가 항암 치료 반응성이 좋을지를 미리 알 수 있으므로, 본 발명의 방법은 항암 치료 전에 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, “암 (cancer)”은 제어되지 않은 세포성장으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 하는 것을 말한다. 상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있으며, 이의 비제한적인 예로서, 흑색종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신경교종, 간암, 갑상선 종양, 위암, 전립선암, 난소암, 방광암, 폐암, 대장암, 유방암, 호지킨림프종, 요로상피세포암, 교모세포종, 자궁내막암, 자궁경부암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도암종, 두경부암, 중피종, 육종, 담관암, 소장 선암, 소아 악성암, 표피암, 고환암, 혈액암, 및 뇌암 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 면역체크포인트 억제제 또는 면역세포 활성제에 의해 치료될 수 있는 암이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 암은 비소세포 폐암 또는 흑색종일 수 있다.
본 발명에 있어서, “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상 (subject)의 감수성 (susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후 (prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스 (therametrics) (예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)를 포함한다.
본 발명에 있어서, “예후” 는 병의 발생, 진행, 치료의 성공 여부, 회복, 재발, 및 약물 내성 등에 관한 예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다. 즉, 의학적 귀추 (예컨대, 장기 생존 가능성, 무병생존율 등)에 대한 예상을 의미하며, 양성적 예후 (긍정적 예후) 또는 음성적 예후 (부정적 예후)를 포함하며, 상기 음성적 예후는 재발, 증상 악화 (암의 경우, 종양의 성장, 전이 등), 약 저항성 등의 병의 진행 또는 치명성 (mortality)을 포함하고, 양성적 예후는 질병이 없는 상태 등의 질병의 차도, 질병의 개선 또는 안정화 (stabilization)를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 있어서 “예후”는 암 또는 종양의 발생, 중증도, 진행 (progression), 재발, 무질병 생존 (disease-free survival), 무진행생존 (progression-free survival, PFS), 전체 생존 (overall survival), 및 합병증 발생 여부 등을 종합적으로 고려하여 판단할 수 있다.
본 발명에 있어서 “반응성”은 의학적 치료 또는 약물에 대한 반응 정도를 의미하며, 반응성 예측이란 대상 환자에게 의학적 치료 또는 약물을 처리하였을 때 치료 효과가 어느 정도인지를 예측하는 것을 의미한다. 구체적으로, 해당 치료 또는 약물에 대한 반응성이 높은 경우는 우수한 치료 효과를 기대할 수 있는 반면, 반응성이 낮은 경우는 저조한 치료 효과가 예측된다. 본 발명에 있어서, “반응성이 높다”고 예측하는 것은 환자가 항암 치료 후 부분 관해 (Partial response), 또는 완전 관해 (Complete response)를 보일 가능성이 높다고 예측하는 것을 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어, “예측”은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 암으로 진단받은 환자의 병의 경과 (병의 진행, 개선, 재발, 중증화, 약 저항성 등)를 미리 짐작하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 “항암 치료”는 면역항암요법, 화학항암요법, 방사선치료요법, 및 화학치료-방사선치료 병용요법으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 면역항암요법은 면역체크포인트 억제제 또는 면역세포 활성제에 의한 것일 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 기 면역항암요법은 항-PD-L1 치료, 항-PD-1 치료, 항-CTLA-4 치료, 항-LAG3 치료, 항-TIM3 치료, 항-BTLA 치료, 항-4-1BB 치료, 항-OX40 치료, 사이토카인 치료, IL-2 치료, 사이토카인 수용체 치료, CAR-T 세포 치료, 및 자가 유래 CD8+ T 면역 세포 치료로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항암 치료는 암 조직 내에서 CD8+ T 세포를 활성화시키거나 증식시키는 약물에 의한 치료일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 항암 치료는 항-PD-1/PD-L1 치료일 수 있고, 더욱 바람직하게는 티쎈트릭주 (Tecentriq), 키트루다 (Keytruda), 또는 옵디보 (Opdivo)일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항암 치료는 대한민국 등록특허 제10-2099593호에 개시된 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 hIL-2가 결합된 복합체일 수 있다
따라서 본 발명에 따른 “피검체”는 면역 관문 억제제 또는 면역 세포 활성제에 의한 치료를 받고 있거나 받을 예정인 환자일 수 있고, 구체적으로 항-PD-L1 치료, 항-PD-1 치료, 항-CTLA-4 치료, 항-LAG3 치료, 항-TIM3 치료, 항-BTLA 치료, 항-4-1BB 치료, 항-OX40 치료, 사이토카인 치료 (예컨대, IL-2 치료, IL-4 치료, IL-7 치료, IL-15 치료), 사이토카인-항체 복합체 치료, 사이토카인 수용체 치료 (예컨대, IL-2 수용체 치료, IL-4 수용체 치료, IL-7 수용체 치료, IL-15 수용체 치료), CAR-T 세포 치료, 및 자가 유래 CD8+ T 면역 세포 치료를 받고 있거나 받을 예정인 환자일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 암환자는 항-PD-1/PD-L1 치료 (더욱 구체적으로는 티쎈트릭주, 키트루다 또는 옵디보)를 받고 있거나 받을 예정인 환자일 수 있다.
바람직하게는, 상기 사이토카인-항체 복합체 치료는 IL-2 사이토카인; 및 항-IL-2 항체 또는 이의 단편의 컨쥬게이트에 의한 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 사이토카인-항체 복합체 치료는 대한민국 등록특허 제10-2099593호에 개시된 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 hIL-2가 결합된 복합체일 수 있다.
본 발명에 따른 항암 치료가 화학항암요법인 경우, 상기 항암 치료는 알림타 (Alimta), 옥살리플라틴 (Oxaliplatin), 페메트렉시드 (Pemetrexed), 시스플라틴 (Cisplatin), 젬시타빈 (Gemcitabine), 카보플라틴 (Carboplatin), 플루오로우라실 (5-FU), 사이클로포스파미드 (Cyclophosphamide), 파클리탁셀 (Paclitaxel), 빈크리스틴 (Vincristine), 에토포사이드 (Etoposide), 및 독소루비신 (Doxorubicin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상에 의해 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 항암 치료가 방사선치료요법인 경우, 상기 항암 치료는 x-선, 감마선 및 중성자를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 고에너지 방사선을 환자에게 가함으로써 이루어지는 것일 수 있다. 이런 유형의 요법으로는 외부광선 요법, 내부 방사선 요법, 삽입 방사선, 근접 치료, 및 전신 방사선 요법을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 “대조군 (control)”은 정상인 또는 항암 치료 후 완전 관해 또는 부분 관해를 보인 암환자 (즉, 항암 치료에 대해 반응성이 있는 환자)로부터 분리된 생물학적 시료일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 즉, 본 발명에 따른 예측 방법은 암환자 각각의 CD8+ T 세포 아형의 비율을 측정한 후 비교하여 암환자 간 상대적인 예후 및/또는 상대적인 항암 치료에 대한 반응성을 예측할 수 있다.
본 발명에 있어서 “생물학적 시료”란 암의 예후를 예측하고자 하는 피검체 혹은 항암 치료에 대한 반응성을 예측하고자 하는 피검체로부터 채취된 것이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 소변, 타액, 조직, 세포, 기관, 골수, 미세침흡인 검체, 중심부바늘생검(core needle biopsy) 검체, 및 진공흡입생검 검체 등으로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 및 혈장과 같은 비침습적 시료이다. 더욱 바람직하게는, 상기 혈액은 말초혈액이다. 즉 본 발명에 따른 예측 방법에 의하면 조직이 아닌 혈액 시료 내 특징적인 세포 유형을 검출함으로써 정확한 예후 예측 및 항암 치료에 대한 반응성 예측이 가능하다. 시료가 혈액 시료인 경우, 암 환자의 암 병변 조직 분석을 수반하지 않고도 암 환자의 면역 항암제 치료 반응성 예측을 위한 정보를 제공할 수 있다. 이 경우, 암 병변 조직 기반 분석하는 경우의 암 세포 및 암 조직의 다양성, 원발암 및 전이암 조직의 다양성 등 변수의 발생 가능성을 감소시킬 수 있다. 또한, 암종, 암 진행 단계, 항암 약물 처리 등 다양한 조건에서 암 환자의 면역 항암제 치료 반응성 예측을 위한 정보를 제공할 수 있고, 신속하고 정확한 예측을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명에 따른 CD8+ 세포 아형은 말초혈액 내의 CD8+ 세포 아형일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 검출 또는 진단에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 상기 시료는 단백질 마커의 탐지 감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데, 예를 들어 환자로부터 수득한 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “측정”은 목적하는 물질 (본 발명의 경우 전체 CD8+ T 세포 및 CD8+ T 세포 아형들; 및 이들을 구별하기 위한 이하의 분자적 마커들: CD27, CD28, Granzyme B, Perforin, IL-2, CCR7, CD45RA, 및 CD8 등)의 존재 (발현) 여부를 측정 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준 (발현 수준)의 변화를 측정 및 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 즉, 특정 유전자의 발현 수준을 측정하는 것은 발현 여부를 측정하는 것 (즉, 발현 유무를 측정하는 것), 또는 상기 유전자로부터 발현된 mRNA 및/또는 단백질의 질적, 양적 변화 수준을 측정하는 것을 의미한다. 상기 측정은 정성적인 방법(분석)과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있다. mRNA 또는 단백질 수준의 측정에 있어서 정성적 방법과 정량적 방법의 종류는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 기술한 실험법들이 이에 포함된다. 각 방법 별로 구체적 mRNA 또는 단백질 수준 비교 방식은 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서 상기 목적 mRNA 및/또는 단백질 검출은 본 발명에 따른 CD8+ T 세포 아형의 존재 여부의 검출, 또는 상기 CD8+ T 세포 아형의 수준 (혹은 비율)의 증가 (상향 조절) 또는 감소 (하향 조절)를 확인하는 것을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 사용된 용어, “분석”은 바람직하게는 “측정”을 의미하는 것일 수 있고, 상기 정성분석은 목적하는 물질의 존재 여부를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있으며, 상기 정량분석은 목적하는 물질의 존재 수준 (발현 수준) 또는 양의 변화를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 본 발명에서 분석 또는 측정은 정성적인 방법과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있으며, 바람직하게는 정량적인 측정이 수행되는 것일 수 있다.
본 명세서에 있어서, “수준이 증가되어 있다”는 것은, 검출되지 않던 것이 검출된 것, 또는 정상적인 수준보다 상대적으로 검출량이 많아지는 것을 의미한다. 이의 반대적 용어의 의미는 당업자라면 상기 정의에 준하여, 반대 의미를 가지는 것으로 이해 가능하다.
예를 들어, 수준이 “증가”되어 있다는 것은, 실험군의 수준이 대조군의 그것에 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 또는 그 이상, 예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 높은, 및/또는 0.5배, 1.1배, 1.2배, 1.4배, 1.6배, 1.8배 또는 그 이상 높은 것을 의미한다. 구체적으로는, 대조군의 그것에 비해 1 내지 1.5배, 1.5 내지 2배, 2 내지 2.5배, 2.5 내지 3배, 3 내지 3.5배, 3.5 내지 4배, 4 내지 4.5배, 4.5 내지 5배, 5 내지 5.5배, 5.5 내지 6배, 6 내지 6.5배, 6.5 내지 7배, 7 내지 7.5배, 7.5 내지 8배, 8 내지 8.5배, 8.5 내지 9배, 9 내지 9.5배, 9.5 내지 10배, 또는 10배 이상 증가한 것을 의미할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서 단백질 수준은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(Rocket immunoelectrophoresis), 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분석법(Mass spectrometry), FACS, 및/또는 단백질칩 등의 방법으로 측정될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 전체 CD8+ T 세포 대비 CD8+ T 세포 아형의 비율은 ELISA 또는 유세포분석 (Flow cytometry)을 통해 측정될 수 있다.
본 발명에 있어서 mRNA 수준은 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(southern blotting), In situ 교잡법, DNA 칩, 및/또는 RNA 칩 등의 방법으로 측정될 수 있다.
또한, 본 발명은 CD8+ T 세포 아형 검출용 제제를 유효성분으로 포함하는, 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측용 조성물로서, 상기 CD8+ T 세포 아형은 하기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물을 제공한다:
CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (Temra);
CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (DP Temra);
CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem);
CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (DP Tem);
CD27- CD28- CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (DN Tem);
Perforin+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Perforin 발현 Tem);
Granzyme B+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Granzyme B 발현 Tem); 및
IL-2+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (IL-2 발현 Tem).
상기 CD8+ T 세포 아형 검출이 각 세포 아형의 분자적 마커의 mRNA 수준의 측정을 통해 이루어지는 것인 경우, 각 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브일 수 있다. 상기 마커들의 mRNA에 특이적인 프라이머 세트 또는 프로브를 포함하는 본 발명의 조성물은 공지된 RNA를 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물을 이용하여 공지된 RNA를 감지하는 방법을 제한없이 사용함으로써 피검체에서 본 발명에 따른 바이오마커들의 mRNA의 수준을 측정할 수 있다.
상기 “프라이머” 또는 “프로브”는 포스포아미다이트 (phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 모든 기능적 등가물을 포함한다. 또한 프라이머 또는 프로브는 mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.
상기 CD8+ T 세포 아형 검출이 각 세포 아형의 분자적 마커의 단백질 수준의 측정을 통해 이루어지는 것인 경우, 각 단백질의 수준을 측정하는 제제는 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 앱타머는 ELISA 또는 유세포분석에 특히 적합한 항체 또는 앱타머일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “항체”는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한 항원-항체 결합성을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며, 본 발명 단백질에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편, 즉 항원 결합 기능을 갖는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 나아가 본 발명의 항체에는 본 발명 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체, 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다.
본 명세서에서 사용된 용어, “앱타머 (aptamer)”는 시료 내의 검출하고자 하는 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는 것으로, 특이적으로 시료 내의 표적 단백질의 존재를 확인할 수 있다. 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 표적 단백질에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 앱타머 칩의 관능기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 NH2로 변형을 시킴으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명 따른 조성물은 공지된 단백질을 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 본 조성물을 이용하여 공지된 단백질을 감지하는 방법을 제한없이 사용하여 피검체 (본 발명에서는 피검체로부터 수득한 생물학적 시료)에서 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는, 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, “키트 (kit)”란 특히 생물학적 시료 내에 포함되어 있는 전체 CD8+ T 세포 및 CD8+ T 세포 아형 그 자체, 혹은 이들을 검출하기 위한 분자적 마커들 (CD27, CD28, Granzyme B, Perforin, IL-2, CCR7, CD45RA, 및 CD8 등)의 mRNA 또는 단백질의 양을 측정하여 암의 예후를 예측하거나 항암 치료에 대한 반응성을 예측할 수 있는 검진용 기기를 의미하며, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 상기 마커들의 발현량을 측정할 수 있는 형태, 나아가 CD8+ T 세포 아형들을 검출할 수 있는 형태라면 제한이 없다. 따라서, 본 발명의 키트에는 표적 단백질을 마커로 인식하는 항체 또는 mRNA를 마커로 인식하는 프라이머 세트, 프로브뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 키트는 본 발명에 따른 바이오마커 펩티드가 코팅된 플레이트, 항체-펩티드 결합을 검출하기 위한 효소 및/또는 발광 반응을 위한 기질, 세척 용액, 대조군 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 나아가, 상기 키트는 본 발명에 따른 예측 방법이 기재된 설명서 내지 지시서를 추가로 포함할 수 있다.
상기 키트의 종류는 당업자에게 공지된 모든 키트일 수 있고, 예를 들어 면역크로마토그래피 스트립 키트, 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트, ELISA 키트, 유세포 분석 키트 또는 면역학적 도트 키트일 수 있다. 또한 상기 키트는 웨스턴 블롯, 면역침전분석법, 보체 고정 분석법, 유세포분석 또는 단백질 칩 등을 구현하기 위한 키트일 수 있으며, 각 분석 방법에 적합한 부가적인 구성을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암의 치료 방법을 제공한다:
(S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 전체 CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (Temra) 대비 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (DP Temra)의 비율을 측정하는 단계;
(S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 전체 Temra 대비 DP Temra의 비율을 대조군과 비교하여 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성을 예측하는 단계; 및
(S3) 상기 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성이 예측된 피검체를 항암 치료하는 단계.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암의 치료 방법을 제공한다:
(S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 전체 CD8+ T 세포 대비 CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (Temra)의 비율을 측정하는 단계;
(S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 전체 CD8+ T 세포 대비 Temra의 비율을 대조군과 비교하여 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성을 예측하는 단계; 및
(S3) 상기 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성이 예측된 피검체를 항암 치료 (바람직하게는, IL-2 또는 TCB2-IL-2)하는 단계.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암의 치료 방법을 제공한다:
(S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (DP Tem)의 비율을 측정하는 단계;
(S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 전체 Tem 대비 DP Tem의 비율을 대조군과 비교하여 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성을 예측하는 단계; 및
(S3) 상기 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성이 예측된 피검체를 항암 치료 (바람직하게는, IL-2 또는 TCB2-IL-2)하는 단계.
상기 치료 방법은 상술한 기타 피트니스 인자들을 측정 및 대조군과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서 상기 항암 치료는 화학 요법, 면역 요법, 방사선 요법, 외과적 수술, 생물학적 요법, 또는 항생제 투여 등의 방법을 사용할 수 있다.
상기 외과적 수술은 치유, 치료 또는 진단 효과를 얻기 위해 개체의 신체에 대하여 손(hand) 혹은 기기와 함께 손의 방법적 작용을 포함하는 어떠한 치료상 또는 진단 처치를 모두 포함한다.
상기 생물학적 요법은 생물체에서 유래된 물질이나 생물체를 이용하여 생성시킨 물질을 함유한 생물학적 제제를 이용하여 직, 간접적으로 인체의 면역체계를 이용하는 치료법을 의미하며, 상기 생물학적 제제는 물리적, 화학적 시험만으로는 그 역가와 안정성을 평가할 수 없는 백신, 알레르겐, 항원, 호르몬, 사이토카인, 효소, 혈액 및 혈장, 면역 혈청, 단클론 항체, 발효 제품, 항독소, 및 실험실 진단제 등을 포함한다. 상기 생물학적 제제는 예컨대 아달리무맙(Adalimumab), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 베바시주맙(Bevacizumab), 세툭시맙(Cetuximab), 다라투무맙(Daratumumab), 파니투무맙(Panitumumab), 리툭시맙(Rituximab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 퍼투주맙(Pertuzumab), 이필리무맙(Ipilimumab), 니볼루맙(Nivolumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), 더발루맙(Durvalumab), 아벨루맙(Avelumab), 토실리주맙(tocilizumab), 사릴루맙(sarilumab), 사트랄리주맙(satralizumab), 및 실툭시맙(siltuximab)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
그러나 바람직하게는, 상기 항암 치료는 상술한 바와 같이 면역항암요법, 화학항암요법, 방사선치료요법, 및 화학치료-방사선치료 병용요법으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 통해 이루어질 수 있으며, 더욱 바람직하게는 면역항암요법을 통해 이루어질 수 있고, 가장 바람직하게는 항-PD-1 요법, 항-PD-L1 요법, 및/또는 IL-2 요법 등을 통해 이루어질 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 예측 방법 및 이를 위한 정보제공방법은 머신러닝에 기반한 예측모델을 통해 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 머신러닝은 K-NN 알고리즘 (K-Nearest Neighbor algorithm)에 기반한 머신러닝일 수 있다.
즉, 본 발명은, 하기를 포함하는 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측 시스템을 제공한다:
(S1) 전체 CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (Temra) 대비 (i) CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (DP Temra)의 비율, 및 (ii) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (DP Tem) 또는 CD27- CD28- CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (DN Tem)의 비율의 데이터를 추출하는 측정부;
(S2) 상기 추출된 데이터와 샘플 데이터 간 거리를 계산하는 거리 계산부; 및
(S2) 상기 추출된 데이터를 기준으로 소정의 범위 내에서 가장 가까운 거리에 위치하는 샘플 데이터를 이용하여 암환자의 예후가 좋을 확률 또는 항암 치료에 대해 반응성을 보일 확률을 계산하는 분석부를 포함하는, 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측 시스템.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 거리 계산부는 K-NN 알고리즘 방식을 이용하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 거리 계산은 유클리드 거리 (Euclidean Distance) 계산 방식 또는 맨해튼 거리 (Manhattan Distance) 계산 방식에 의한 것일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 유클리드 거리 계산 방식은 하기의 수식을 통해 거리를 산출할 수 있다:
상기 수식에서, 상기 x는 전체 Temra 대비 DP Temra의 비율이고, 상기 y는 전체 Tem 대비 DP Tem 또는 DN Tem의 비율일 수 있고, 그 반대의 경우도 가능하다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 거리 계산부는 K-NN 알고리즘 방식을 이용하는 것일 수 있이고, 상기 소정의 범위는 K가 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 2 내지 10, 3 내지 10, 4 내지 10, 5 내지 10, 6 내지 10, 7 내지 10, 8 내지 10, 6 내지 9, 6 내지 8, 또는 7인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 분석부는 상기 추출된 데이터를 기준으로 소정의 범위 내에서 가장 가까운 거리에 위치하는 전체 샘플 데이터 중 항암 치료 후 완전 관해 또는 부분 관해를 보인 환자의 데이터의 비율을 계산함으로써 암환자의 예후가 좋을 확률 또는 항암 치료에 대해 반응성을 보일 확률을 계산하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측 시스템을 이용하여 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성을 예측하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(S1) 전체 CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (Temra) 대비 (i) CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 (DP Temra)의 비율, 및 (ii) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (Tem) 대비 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (DP Tem) 또는 CD27- CD28- CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 (DN Tem)의 비율의 데이터를 추출하는 단계;
(S2) 상기 추출된 데이터와 샘플 데이터 간 거리를 계산하는 단계; 및
(S3) 상기 추출된 데이터를 기준으로 소정의 범위 내에서 가장 가까운 거리에 위치하는 샘플 데이터를 이용하여 암환자의 예후가 좋을 확률 또는 항암 치료에 대해 반응성을 보일 확률을 계산하는 단계.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
이하의 실시예에서, 하기 약어는 다음의 의미를 나타낸다.
- CD8 T 세포 (“CD8+ 세포”로도 표기함): CD8+ CD3+ T 세포
- Tn: CD8 T 세포 중 CCR7+ CD45RA+ CD8 T 세포
- Tcm: CD8 T 세포 중 CCR7+ CD45RA- CD8 T 세포
- Tem: CD8 T 세포 중 CCR7- CD45RA- CD8 T 세포
- Temra: CD8 T 세포 중 CCR7- CD45RA+ CD8 T 세포
- DP: CD27+ 및 CD28+
- DN: CD27- 및 CD28-
[실험 방법]
1. 인간 샘플
하기 실시예를 위해 NSCLC (Non-Small-Cell Lung Cancer, 비소세포폐암) 환자 (n=26)의 종양 조직과 혈액 샘플을 전남 대학교 화순 병원에서 채취했다. 일부 실시예에서 NSCLC 암환자 (n=30)의 또 다른 혈액 샘플 세트를 사용했다. 환자의 임상적 특성은 표 1 및 표2에 요약되어 있다. 표 1은 도 1a 내지 도 6i의 실시예와 관련된 26명의 NSCLC 환자와 그들의 종양 및 혈액 특성을 나타낸 것이다. 표 2는 도 6f 내지 도 6i, 및 도 12b 내지 도 12e의 실시예와 관련된 30명의 NSCLC 환자와 그들의 혈액 특성을 나타낸 것이다. 본 실시예의 실험은 전남 대학교 화순 병원 기관 심의 위원회의 승인을 받았다.
2. 샘플 준비
종양 조직은 수술실에서 직접 받아 즉시 처리했다. 조직을 작은 조각으로 자른 다음 37℃ 자석 교반기에서 0.5 ㎎/㎖ Collagenase IV (Gibco) 및 200 U DNase I (Roche)로 분해했다. Percoll (Cytiva)을 사용하여 소화된 조직에서 TIL (tumor-infiltrating lymphocyte, 종양 침윤성 림프구)을 정제했다. 혈액 샘플은 BD Vacutainer (BD Biosciences)에서 수집하였다. PBMC (peripheral blood mononuclear cell, 말초 혈액 단핵세포)는 Lymphoprep (Alere Technologies)를 사용하여 정제했다.
3. 유세포 분석
TIL 또는 PBMC의 세포 현탁액을 준비하고 FACS (Fluorescence activated cell sorter) 분석을 위해 하기 항체들 (BioLegend, eBioscience 및 BD Biosciences에서 구입) 로 염색하였다: CD45RA (HI100), CD45RO (UCHL1), CD27 (LG.7F9), CD28 (CD28.2), CD57 (QA17A4), CD5 (L17F12), CD3 (HIT3a), CCR7 (G043H7), CD8 (SK1), CD279 (MIH4), Perforin (BD48), Granzyme B (GB11), IFNg (B27), IL2 (MQ1-17H12), Ki67 (Ki-67).
FACSCantoII (BD Biosciences) 또는 CytoFLEX LX (Beckman Coulter)를 사용하여 유세포 분석 샘플을 실행하고 FlowJo 소프트웨어 (Tree star)로 분석했다.
4. 세포 내 염색
세포를 96 웰 세포 배양 접시 (1x106 cells/well)에 넣고 37℃ CO2 인큐베이터에서 eBioscienceTM Cell Stimulation Cocktail (단백질 수송 억제제 포함) (Invitrogen)으로 4 시간 동안 배양했다. 세포를 표면 마커로 염색 한 다음 BD Cytofix/Cytoperm 버퍼 (BD Biosciences)를 사용하여 고정하고 투과화했다. 그런 다음 세포를 표시된 세포 내 분자에 대해 염색하고 유세포 분석기로 분석했다. Ki-67 염색을 위해, eBioscience Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience)를 생체 외 샘플과 함께 사용했다.
5. 상대적 텔로미어 길이
상대적 텔로미어 길이는 상대적 텔로미어 대 단일 복사 비율을 사용하여 측정되었다. 간단히 말해, 1x105 세포를 정제하여 DNA extraction kit (Bioneer)를 사용한 DNA 추출에 사용했다. 정량적 PCR은 하기 프라이머를 사용하여 SYBR Green qPCR Master Mix (Maxima)에 의해 수행하였다:
tel1 (서열번호 1):
GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT
tel2 (서열번호 2):
TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA
36B4u (서열번호 3):
CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC
36B4d (서열번호 4):
CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA
6. 체외 활성화
표시된 세포 유형을 FACSAriaTM III (BD Biosciences)를 사용하여 정제하고 anti-CD3 및 anti-CD28 코팅된 Nunc MaxiSorpTM Flat-Bottom Plate (Invitrogen) 또는 96-well 세포 배양 접시 (SPL)에 플레이팅 (5x103 cells/well)했다. 일부 실험의 경우, 자극 전에 세포를 2.5μM Cell TraceTM Violet (Invitrogen) (CTV)로 표지했다. 0.5 ng/㎖의 IL-7을 모든 웰에 적용하여 생존을 촉진했다. 7일 동안 표시된 자극으로 세포를 자극한 다음, 염색하고 유세포 분석기로 분석하였다. 세포 분열 정도는 CTV dilution index를 측정하여 관찰했다. 상기 index 값이 높을수록 세포 분열이 많이 일어났음을 의미한다.
7. 생물정보학 분석
RNA 시퀀싱을 위해 3x105 세포를 정제하고 TriZOL (Invitrogen)을 사용한 RNA 추출에 사용했다. 라이브러리는 TruSeq RNA Sample Prep Kit (Illumina)를 사용하여 구성되었으며 제조업체의 프로토콜에 따라 Illumina HiSeq2500 sequencer (Illumina)로 시퀀싱하였다. PCA 및 계층적 클러스터링은 Factoextra R Package를 사용하여 수행하였다. tSNE 분석은 FlowJo Software (Tree star)를 사용하여 수행하였다. FLOW-MAP는 개발자의 프로토콜에 따라 FLOWMAPR R 패키지를 사용하여 수행하였다. 간단히 말해, CD3+ CD8+ 셀은 FlowJo를 사용하여 게이트 및 내보내기하였다. 내보낸 fcs 파일을 FLOW-MAP에 사용하였다. Force-directed layout (Force Atlas)은 Gephi software로 수행하였다. 유전자 세트 농축 분석은 GSEA tool (Broad Institute)로 수행하였다.
8. 통계
각 도면에 표시된 대로 Prism (GraphPad Software)을 사용하여 통계적 유의성을 테스트하기 위해 Paired 또는 Un-paired Two-tailed Student 's t-test를 수행하였다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001의 값을 유의한 것으로 간주하였다.
[실시예]
<실시예 I> 암환자의 DP Temra (CD27
+
CD28
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Temra) 수준은 암환자의 종양 항원에 대한 면역원성 혹은 항원성 상태 및 면역항암치료에 대한 반응성을 반영한다.
암환자의 면역항암치료에 대한 반응성은 종양 항원의 면역원성 혹은 항원성 상태 및 환자의 면역력 (특히 독성 T 세포 반응 능력) 상태에 의해 좌우된다. 따라서, 암환자의 종양 면역원성 상태를 반영하는 factor는 면역항암치료에 대한 환자의 반응성 및 예후를 예측하기 위한 바이오마커로 활용될 수 있다. 한편, T 세포와 같은 면역세포는 종양의 진행 정도, 환자의 면역력, 및 예후 등과 밀접한 관련이 있다. 이에, 본 발명자들은 T 세포를 구체적으로 분석하여, 암환자의 종양 상태를 반영하는 마커이자 면역항암치료에 대한 반응성의 예측 인자로 활용 가능한 바이오마커를 탐색하였다.
실시예 I-1. CD8
+
TIL에는 Tem보다 더 분화된 특성을 가진 Temra가 포함되어 있다.
이종 CD8+ TILs를 다루기 위해, 26명의 NSCLC 환자의 PBMCs 및 TILs 을 유세포 분석기를 사용하여 분석했다. 환자의 임상 정보 요약은 상기 표 1에 기재되어 있다. CD8+ T 세포는 CCR7 및 CD45RA를 기준으로 크게 4개의 아형 (subset)으로 분리되었다: CCR7+CD45RA+ Tn, CCR7+CD45RA- Tcm, CCR7-CD45RA- Teff/Tem (“Tem”으로 지칭함) 및 CCR7-CD45RA+ Temra (도 1a 및 도 7a). PBMC와 달리, Tn 및 Tcm은 TIL에서 대부분 검출할 수 없었다 (평균<1%). 대신, Tem이 68.2 내지 98.7% (평균 92.29%)로 TIL의 대부분을 차지했다 (도 1b 및 도 7b). Temra는 TIL에서 일관되게 발견되어 0.68 내지 30.4 % (평균 5.72 %)를 차지했다.
짧은 길이의 텔로미어와 퍼포린 및 그랜자임 B의 발현 증가로 입증된 바와 같이, Temra는 인간 CD8+ T 세포의 가장 분화된 아형으로 간주된다. Temra의 대부분의 특성화는 말초 혈액 Temra (pTemra, peripheral blood Temra)로 확립되었기 때문에, 종양 침윤성 Temra (tilTemra)가 pTemra의 표준 특성화에 적합한지 여부를 조사했다. 실제로 tilTemra는 tilTem 보다 짧은 텔로미어 길이를 가졌다 (도 1c). 또한, tilTemra는 퍼포린 및 그랜자임 B (도 1d 내지 도 1e)의 발현이 증가한 반면 IFN-γ (Interferon gamma) 생산은 유사했다 (도 1f). 세포 용해 기능과 달리, 증식 능력은 T 세포가 분화함에 따라 감소한다. 따라서 tilTemra는 tilTem에 비해 IL-2 (Interleukin-2) 생산이 감소한 것으로 나타났다 (도 1g). 유사한 패턴이 항-CD3/CD28 및 IL-2에 의한 자극 시의 증식 능력에서 관찰되었다 (도 1h). 이 데이터는 tilTemra가 PBMC에서 정의된 Temra와 광범위하게 유사한 특성을 나타냄을 시사한다 (도 7c 내지 도 7f).
실시예 I-2. tilTemra는 pTemra와 다른 독특한 전사체를 가진다.
전반적인 유사성에도 불구하고, 본 발명자들은 tilTemra와 pTemra가 실제로 공간적으로 다른 위치에 분포된 동일한 집단인지 여부를 조사했다. 이를 위해 NSCLC 환자 (tilTemra_1 내지 3, pTemra_1 내지 3)의 FACS-purified tilTemra 및 pTemra의 유전자 발현 프로파일을 RNAsequencing (RNA-seq) 분석을 통해 건강한 기증자 (pTemra_4 내지 6)의 pTemra와 비교했다. 주성분 분석 (PCA, Principal Component Analysis)은 첫 번째 주성분 (PC1)에 의해 pTemra에서 tilTemra가 명확하게 분리되었음을 보여주었다 (도 2a). 두 번째 주성분 (PC2)의 차이는 tilTemra에서는 두드려졌으나, pTemra에서는 그렇지 않았다. 이는 PC2가 각 종양 미세 환경 (TME, tumor microenvironment)의 차등적 컨텍스트 (differential contexts)에 의한 tilTemra의 이종성 (heterogeneity)을 나타낸 것으로 판단된다. 본 발명자들은 각각 다른 클러스터에서 tilTemra 및 pTemra를 그룹화한 계층적 클러스터링으로 관찰을 확인했다 (도 2b). “height”로 표시된 각 샘플 사이의 거리는 pTemra 사이에서 더 낮았고 tilTemra 사이에서 더 높았다. 이는 tilTemra의 이종성이 더 높다는 것을 보여준다.
다음으로, pTemra와 tilTemra 사이의 차별 발현 유전자 (DEGs, differentially expressed genes)를 분석했다. 분석된 15,299 개의 유전자 중 1,708 개의 유전자 (11.16%)가 차별적으로 발현되었다 (도 2c). 910 개의 유전자 (5.95%)는 tilTemra (빨간색 점)에서 높게 발현된 반면, 798 개의 유전자 (5.22%)는 pTemra (파란색 점)에서 높게 발현되었다. TBX21, EOMES, PRF1, GZMB, GZMH4와 같은 분화된 세포의 시그니처 유전자는 pTemra에서 상향 조절된 반면 (도 8a), 분화된 CD8+ T 세포에서 감소하는 보조자극 분자 ICOS 및 CD28은 tilTemra에서 더 높았다 (도 8b). T 세포 노화 (senescence) 또는 탈진 (exhaustion)과 관련된 마커인 B3GAT1 및 TOX는 pTemra에서 상향 조절되었으며 (도 8c), 줄기세포-유사 자가분열능력을 암시하는 마커인 MYC 및 TCF7은 tilTemra에서 상향 조절된 것으로 나타났다 (도 8d).
tilTemra와 pTemra의 기능적 차이를 더 이해하기 위해, GSEA (gene set enrichment analysis)를 사용하여 경로 분석을 수행했다. 본 발명자들은 오픈 리소스 (Gene ontology 및 Broad Institute)에서 분화, 세포 독성 및 증식에 관한 여러 유전자 세트를 얻었다. 분화에 관한 유전자 세트는 tilTemra가 pTemra에 비해 나이브세포-유사 표현형(naive-like phenotype)에 더 가깝다는 것을 보여주었다 (도 2d 상단, 도 8e). 또한, pTemra는 세포 독성과 관련된 유전자 세트가 풍부한 반면 (도 2d 중단, 도 8f), tilTemra는 증식과 관련된 유전자 세트가 풍부했다 (도 2d 하단, 도 8g). 이러한 데이터는 tilTemra가, 말기 분화된 (terminally differentiated) pTemra와 뚜렷하게 구별되는 고유한 전사체로서, 덜 탈진된 (TBX21 lo TOX lo PDCD1 lo ), 나이브 (및 줄기)-유사 (TCF7 hi MYC hi ) 유전자 발현 프로파일을 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 I-3. tilTemra는 종양 진행과 관련하여 표현형 및 기능이 이질적이다.
tilTemra가 pTemra와 전사적으로 (transcriptionally) 다르기 때문에, 본 발명자들은 기능적 특성의 차이를 확인하였다. 이전의 발견들과 일치하는 양상으로서, pTemra는 더 많은 퍼포린 (perforin), 그랜자임 B (granzyme B) 및 IFN-γ 생산을 보인 반면, tilTemra는 IL-2의 생산 및 증식에서 더 높은 능력을 보였다 (도 3a 내지 도 3e; 도 9a). 유사한 패턴이 tilTem과 pTem 사이에서 관찰되었으며, pTem은 더 많은 퍼포린 및 그랜자임 B 생산을 보였다 (도 9b 내지 도 9e).
위의 기능 데이터에 따르면, tilTemra는 pTemra보다 기능적으로 덜 분화된 상태인 것으로 확인된다. 각 아형의 분화 상태는 보조자극 수용체, CD27 및 CD28의 발현에 의해 추가로 정의될 수 있다. 덜 분화된 세포는 이중 양성 (CD27+CD28+; DP, double-positive) 표현형을 나타내지만, 더욱 분화된 세포는 단일 양성 (CD27+CD28- 또는 CD27-CD28+; SP, single-positive) 또는 이중 음성 (CD27-CD28-; DN, double-negative) 표현형을 나타낸다. tilTemra는 pTemra 보다 DP 표현형의 비율이 더 높았다 (도 3f 내지 도 3g). 흥미롭게도, tilTemra에서 DP 표현형의 비율은 항상 pTemra 보다 높았다. 방정식 “tilDP % - pDP %”에서 볼 수 있듯이 예외 없이 모든 환자에서 0 보다 컸다 (도 3h). 이는 DP Temra의 종양 특이적 축적을 의미한다. Temra와 달리 Tem은 이러한 일관성을 보여주지 않은 바 (도 3h, 도 9f), DP Temra의 고유한 특성뿐만 아니라 종양 진행 및 DP Temra의 밀접한 관계를 지지한다.
본 발명자들은 tilTemra와 pTemra의 기능적 차이가 이 두 아형에서 DP 세포의 분화된 비율에 기인하는지 여부를 추가적으로 확인하였다. 예상대로 CD27+Temra는 동일한 기원 (TIL 또는 PBMC)의 CD27- 대응물 (counterpart) 대비 낮은 퍼포린 생산과 높은 IL-2 생산을 나타냈다 (도 3i 내지 도 3j). 도 2a 내지 2d의 전사 분석과 함께 이러한 데이터는 tilTemra 및 pTemra가 표현형 및 기능이 이질적인 집단이며, tilTemra (특히 DP)는 훨씬 덜 분화된 기능적 특성을 나타낸다는 것을 시사한다.
실시예 I-4. CD8
+
T 세포는 Temra로의 분화 과정에서 분기된 궤적을 보여준다.
DN과 DP Temra 간의 분화 및 계보 관계를 더 이해하기 위해, tSNE (t-distributed stochastic neighbor embedding) 방법을 적용하여 유세포 분석 데이터에서 표현형적으로 유사한 세포들의 클러스터링을 시각화했다. 흥미롭게도, tilTemra는 두 개의 다른 집단으로 클러스터링 되었다: (1) CD27loCD28loCD57hi 및 (2) CD27hiCD28hiCD57lo (도 4a; 도 10a). tilTemra의 이러한 분기는 다른 NSCLC 환자로부터 일관되게 관찰되었으며 (도 4b; 도 10b), 이와 같은 결과는 Temra의 분화와 종양 진행 사이에 복잡한 상호작용이 존재한다는 것을 시사한다.
다음으로, 본 발명자들은 최근에 발표된 FLOW-MAP을 활용하여 DP Temra로의 분화 궤적 (differentiation trajectory)을 정의하고자 했다. FLOW-MAP은 표현형이 유사한 세포들을 '노드 (nodes)'로 클러스터하고 유사한 노드들을 '엣지 (edges)'로 연결하여, 노드 궤적(trajectory of nodes)을 생성한다 (도 4c 좌측). 본 발명자들은 CD45RA, CD45RO, CD27, 및 CD28의 발현을 기반으로 각 노드를 레이블링하였다 (도 4c 우측; 도 10c). 본 발명자들은 CD45RO+ Temra 노드 (좌측)에서 CD45RA+ 노드 (우측)로의 전환(transition)을 관찰하였지만, 전환은 분기된 궤적을 따랐다 (도 4d): (1) DP Tem → SP Tem → DN Tem → DN Temra (파란색 화살표) 및 (2) DP Tem → DP Temra (빨간색 화살표). 이러한 결과는 DP tilTemra가 SP 또는 DN tilTem의 전환 상태를 거치지 않고 DP tilTem에서 직접 생성됨을 강력하게 시사한다. 이 아이디어에 따라, DP tilTem과 DP tilTemra의 비율 사이에 높은 상관 관계도 관찰했다 (도 4e).
실시예 I-5. TCR 관여의 강도가 Temra 분화를 결정한다.
다음으로, 본 발명자들은 전술한 DN 또는 DP tilTemra로의 분기된 분화 (divergent differentiation)의 기본 기전을 확인했다. 이 분기의 핵심 요구 사항은 종양의 진행 동안 Temra의 특징인 CD45RA를 재발현하면서 CD27 및 CD28의 적시에 적절히 상향 또는 하향 조절하는 것이다. 따라서 본 발명자들은 TCR 관여에 의한 항원 자극의 역할 및 종양 미세 환경 (TME)에서 다양한 세포 유형에 의해 생성되는 사이토카인의 역할을 확인하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 tilTem을 FACS로 정제하고 다양한 용량의 anti-CD3/CD28 또는 다양한 사이토카인으로 tilTem을 배양했다. Tn (도 11a)과 달리, tilTem은 anti-CD3/CD28 자극시 CD28을 상당히 하향 조절했다 (도 5a 좌측). 그러나, tilTem의 CD27 발현은 고농도의 anti-CD3에서만 적당히 감소했지만 크게 변하지 않았다 (도 5b 좌측).
TCR 결과와는 대조적으로, 본 발명자들이 시험관 내에서 테스트한 다양한 사이토카인 중에서 IL-2는 CD27 (도 5b, 도 11b)의 실질적인 하향 조절을 유도했지만 CD28 감소는 유도하지 않았다 (도 5a 우측, 도 11c). 이 발견과 일치되게, CD27를 발현하는 (CD27+) tilTem의 비율은, IL-2를 생성하는 (IL-2+) 총 CD3+ T 세포의 비율과 유의한 역상관 관계를 보였다 (도 5c). IL-2는 주로 TCR 자극 후 활성화된 CD3+ T 세포 (CD4+ 및 CD8+)에 의해 생성되기 때문에 (도 11d), TCR 자극이 직접 또는 간접적 (IL-2를 통해)으로 CD27 및 CD28 발현을 조절하는 것으로 보인다. 따라서 이러한 데이터는 강력한 TCR 관여가 CD27 및 CD28의 하향 조절을 분명히 촉진하고 그에 따라 DN Temra을 유도하지만 DP Temra 분화는 억제됨을 시사한다.
CD27 및 CD28 발현 조절에서 TCR의 역할을 고려하여, 본 발명자들은 TCR이 Temra 분화 동안 상향 조절되는 CD45RA 발현에 미치는 영향을 조사했다. CD45RA는 tilTem에서는 발현 수준이 매우 낮지만, anti-CD3/CD28 자극 (도 5d 좌측)으로 처리한 후에는, 더욱 분명하게 하향 조절되었다. 유사한 CD45RA 하향 조절은 Temra에서도 관찰된 바 (도 11e), tilTem에서 tilTemra로의 전환 과정에서 CD45RA를 상향 조절하기 위해서는 강력한 항원 자극을 피해야 함을 시사하였다. TCR 관여와 달리, IL-2 처리는 CD45RA 발현의 상향 조절을 유도했다. 다만 상기 상향 조절을 위해서는 많은 양의 IL-2가 필요했다 (도 5d 우측). 상기 결과는 IL-2가 Temra 세포의 분화를 조절하는데 관여한다는 것을 시사한다.
Temra는 장기간의 반복적인 증식으로 인해 텔로미어 길이가 짧다 (도 1c). 이에, 본 발명자들은 tilTem 세포가 실제로 TCR 자극에 반응하여 지속적으로 증식할 수 있는지 확인하였다. 흥미롭게도, tilTem은 anti-CD3/CD28 관여 (도 5e 좌측, 도 11f)시 제대로 증식하지 않았으나, IL-2 노출시 현저하게 증식하였다 (도 5e 우측, 도 11g). IL-2를 단독 처리한 경우에도 현저한 증식이 이루어졌고, 추가적인 TCR 관여의 영향은 거의 없었다 (도 5f). TCR 자극에 대한 Tem 세포의 낮은 반응성을 보여주는 이전의 보고와 함께, 상기 결과는 TCR 신호가 tilTemra 분화 동안 불필요하며, (TCR desensitization과 같은 능동적 매커니즘을 통해) 적시에 억제될 수 있음을 시사한다.
이 아이디어를 뒷받침하는 tilTem의 CD45RA 재발현은 실제로 CD27- 및 CD28- 세포 (즉, TCR 신호전달을 위한 보조자극 분자가 결핍된 세포)에서 훨씬 더 두드러졌다. 유사하게, CD45RA의 발현 수준은 tilTem 세포가 DP에서 SP나 DN 상태로 분화함에 따라 크게 증가했다 (도 5h). 유사한 데이터가 pTem에서도 관찰되었다 (도 11h 내지 도 11i). 이러한 데이터는 무시할 수 있거나 낮은 수준의 TCR 관여 (보조자극 분자의 손실과 함께)가 Tem (또는 Teff) 세포가 CD45RA를 재발현하고 DN 또는 DP Temra가 되도록 촉진한다는 것을 강력하게 시사한다.
실시예 I-6. DP Temra의 비율은 CD8
+
TIL 수 및 종양 돌연변이 부하 (Tumor mutation burden, TMB)와 역 상관관계가 있다.
상기 실험 결과의 주요 의미는 종양 항원과의 TCR 결합을 통한 강력하고 반복적인 항원 자극이 Temra (특히 DP Temra) 분화에 부정적인 영향을 미친다는 것이다. 이와 같은 결과는 CD27-CD28-DN Temra가 만성적으로 감염된 바이러스 항원 특이적 CD8+ T 세포에 더 널리 퍼져 있음을 확인한 이전 보고와도 일치한다. 따라서, 본 발명자들은 항원-특이적 CD8+ Tem (또는 Teff)가 어떻게 DN Temra가 아닌 DP Terma로 분화할 수 있는지에 대해 의문을 가졌다. 이에 대하여, 본 발명자들은, 고용량의 anti-CD3/CD28 처리가 CD27 및 CD28을 하향 조절한다는 점을 감안할 때 (도 5a 및 5b), DP에서 DN으로의 전환을 유발하지 않는 수준 이하로 TCR 자극을 낮추는 것이, 종양 진행 중의 Temra 분화에 있어서 지속적으로 높은 수준의 CD27 및 CD28 보조자극 분자를 유지하는 데 중요할 것이라고 가정했다.
종양 관련 항원 (TAAs, tumor-associated antigens) 및 신생 항원 (neo-antigens)(종양 돌연변이 부하와 관련됨)과 같은 종양 항원은, TCR 관여가 그 강도에 따라 다양한 Tn 세포 확장 (expansion)을 유도할 수 있는 것과 마찬가지로, 항원 특이적 CD8+ Tn 세포 및 CD8+ TILs에 대한 자극 능력이 다양하다 (도 12a). 따라서 본 발명자들은 TAAs와 신생 항원은 DN과 DP Temra 분화 간 다른 경로 선택을 가질 수 있다고 추측하였다. 특히 본 발명자들은 NSCLC 환자의 CD8+ TIL 수가 DP tilTem (도 6a) 및 DP tilTemra (도 6b)의 비율과 역상관 관계에 있음에 주목하였다. 따라서, 상기 결과는 종양 항원 (예를 들어, TAAs)을 사용한 낮은 면역원성 자극이 종양 특이적 CD8+ T 세포에서 CD27 및 CD28의 지속적인 발현을 유도하고 DN Temra보다 DP Temra로의 분화 경로를 촉진한다는 본 발명자들의 아이디어를 강력하게 뒷받침한다.
흥미롭게도, 본 발명자들은 또한 DP pTemra 및 DP tilTemra (도 6c)의 비율에서 강한 상관 관계를 관찰하였는데, 이는 이 두 아형이 주어진 종양 항원에 대해 어느 정도의 특이성을 공유하고, 종양과 말초 혈액 사이를 순환할 수 있음을 시사한다. 또한, DP pTemra의 비율은 CD8+ TIL의 수와 역상관 관계임이 확인되었다 (도 6d). 따라서 상대적으로 낮은 비율의 DP pTemra (<6%)를 가진 환자는 높은 비율의 DP pTemra (>6%)를 가진 환자보다 CD8+ TIL을 두 배 더 많이 나타내어, NSCLC 환자의 혈액에서 DP Temra를 분석함으로써, CD8+ TIL의 수를 간단히 예측할 수 있다.
DP tilTemra와 DP pTemra 사이의 관련성을 더 구체적으로 살펴보기 위해, NSCLC 환자 6명의 PBMC 및 TIL에서 CD8+ T 세포 아형 (CD27+/CD27-Tem 및 CD27+/CD27-Temra) 내 TCR α/β 사용 (usages)을 확인했다. 상기 아형들 중에서 CD27+ pTemra 및 CD27+ tilTemra 세포는 가장 유사한 수준의 TCR Vα7.2, Vβ8, Vβ12 사슬 사용을 공유하는 것으로 나타났다 (빨간색 상자, 도 12b 내지 12d). 특히, CD27+ tilTemra 및 CD27- tilTemra 세포는 TCR Vα7.2, Vβ8, Vβ12 사슬 사용 수준 (파란색 상자, 도 12b 내지 12d)에서 뚜렷하게 차이를 나타낸 바, 상기 아형 간에 관련성이 거의 없음을 시사했다. 추가 검증을 위해, PBMC 또는 TIL 유래 CD27+/CD27- Tem 및 CD27+/CD27- Temra 세포의 TCR α/β 사용 (Va2, Vα7.2, Vα12.1, Vβ3, Vβ5b, Vβ8, Vβ12, 및 Vβ13.1)을 분석하고, 샘플 거리 매트릭스 (sample distance matrix, DESeq2)를 사용하여 8가지 TCR α/β 사용 간의 유사성을 계산했다. 그 결과, CD27+ tilTemra 및 CD27+ pTemra 세포는 가장 가까운 것 (빨간색 선, 도 12e)에 해당하는 반면, CD27- tilTemra 세포는 가장 멀리 떨어진 것으로 확인됐다 (파란색 선).
종양 면역원성 정도 (TMB 로드 (TMB load))와 함께 DP pTemra 비율 및 CD8+ TIL 수 사이의 강력한 역상관 관계를 추가로 확인하기 위해 30명의 NSCLC 환자 (표 2)로부터 PBMC를 새롭게 수집하여 DP pTemra의 비율에 따라 두 그룹으로 나누었다. DP pTemra가 낮은 그룹 (DP pTemra % < 6%)은 DP pTemra가 높은 그룹 (DP pTemra % > 6%)에 비해 증가된 Ki-67+ CD8+ T 세포 (도 12f) 및 PD-1+ (도 12g) CD8+ T 세포 수준을 나타냈는데, 이는 보다 강력한 면역 반응이 진행 중임을 나타낸다.
다음으로, 이 두 그룹 간의 관찰된 차이가 종양 면역원성의 정도와 실제로 관련이 있는지 확인하기 위해, 잘 알려진 TMB 로드를 기준으로 환자의 임상 정보를 분류했다. 먼저, 편평 세포 암종 (SCC, squamous cell carcinoma)은 비편평 세포 암종 (Non-SCC)보다 TMB가 더 높은 것으로 알려져 있는데, 이와 일치하게, SCC 환자의 20% (TMB: 9)가 고-DP pTemra 그룹으로 분류되었으며, Non-SCC 환자의 45% (TMB: 6)가 고-DP pTemra 그룹으로 분류되었다 (도 6f; 도 12h). 마찬가지로 흡연 이력 역시 NSCLC TMB의 중요한 요소로 알려져 있는데, 흡연자의 24% (TMB: 11)만이 고-pTemra 그룹으로 분류되었지만, 비흡연자 (TMB: 0.6)는 전원이 고-DP pTemra 그룹에 속했다 (도 6g; 도 12i).
CD8+ TIL의 수 및 TMB는 암 면역요법에 대해 가장 널리 사용되는 바이오마커이다. CD8+ TIL 또는 TMB 수준이 높은 환자는 면역체크포인트 억제제 (immune checkpoint inhibitors, ICI; 예를 들어, anti-PD-1 또는 anti-PD-L1)에 대한 반응성이 높은 것으로 알려져 있기 때문에, 본 발명자들은 DP pTemra 세포의 비율이 낮은 환자일수록, ICI에 대한 반응성이 더욱 높을 것으로 추측했다. 이를 검증하기 위해, 혈액 분석 (도 6f 내지 6g) 후 환자를 ICI (ani-PD-1/PD-L1)로 치료하였으며, ICI에 대한 환자의 반응성을 모니터링하고, 임상 결과를 치료 전 수득한 DP pTemra 세포의 비율과 비교했다. 그 결과, 부분 관해 (partial response, PR) 환자의 20%만이 고-DP pTerma 그룹 (high proportion of DP pTemra cells)으로 분류된 반면, 안정적 질환 (steady disease, SD) 및 진행성 질환 (progressive disease, PD) 환자는 각각 36.4% 및 42.9%가 고-DP pTerma 그룹에 해당하는 것으로 나타났다 (도 6h).
상기 결과는 DP pTemra의 비율이 종양 항원의 면역원성 정도 (즉, TMB) 및 CD8+ TIL의 수와 역 상관관계가 있으며, 암환자의 면역요법에 대한 반응성을 예측하기 위한 마커로 활용될 수 있음을 보여준다.
<실시예 II> 암환자의 Fitness factor (DP/DN Tem%, Perforin+ Tem%, Granzyme B+ Tem%)은 환자의 면역력 및 면역항암치료에 대한 반응성을 반영한다.
실시예 I를 통해 DP pTemra가 종양 돌연변이 부하 (Tumor mutation burden, TMB) 및 종양-침윤 CD8 T 세포의 수와 역 상관관계를 가지며, 따라서 환자의 종양 항원에 대한 면역원성 및 항원성 상태를 반영하는 마커이자 면역항암치료에 대한 환자의 반응성을 예측하기 위한 마커로 활용될 수 있음을 확인하였다.
이하의 실시예에서는 종양의 진행에 따라 점차 약해지는 환자의 면역력 (즉, PD-1 치료와 같은 면역요법에 대해 반응할 수 있는 능력)을 나타낼 수 있는 바이오마커 (Fitness factor)를 발굴하기 위해, 종양의 진행에 따른 면역세포의 특성을 분석하고, 면역요법에 대한 반응성과 상관관계를 보이는 인자들을 탐색하였다.
실시예 II-1. 종양은 CD8 T 세포의 분화를 촉진한다.
환자의 면역력 및 이에 따른 면역항암치료 반응성을 반영하는 바이오마커를 발굴하기 위해, 가장 먼저 NSCLC 암환자와 건강한 사람이 면역학적으로 어떠한 차이를 갖는지 확인하였다. 이를 위해, NSCLC 암환자 33명 및 정상인 25명 각각으로부터 PBMC를 확보하였으며, 유세포분석을 통해 CD8 T 세포 (CD8+CD3+ T 세포) 중 각 아형 (Tn, Tcm, Tem, 및 Temra)의 비율을 측정하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 암환자는 정상인과 비교하여 Tn 세포의 비율은 낮고, Tem 및 Temra 세포의 비율은 더 높은 것으로 나타났다. Tn 세포는 상대적으로 덜 분화된 세포인 반면, Tem 및 Temra는 상대적으로 분화가 더욱 진행된 세포이다 (즉, Tn → Tcm → Tem → Temra 순으로 분열됨). 따라서, 상기 결과는 암환자의 CD8 T 세포의 아형이 전체적으로 더 분화가 진행된 (more differentiated) 세포로 치중되었음 (shift)을 나타내는 것이며, 이는 앞선 실시예에서도 확인한 것과 마찬가지로, 종양이 CD8 T 세포의 분화를 촉진시킨다는 것을 의미한다.
실시예 II-2. CD8 T 세포의 분화가 진행될수록 세포독성은 증가하지만 분열 능력은 감소한다.
이어서, 암환자의 CD8 T 세포의 각 아형의 기능 (분열 능력 및 세포독성)을 관찰하였다. 구체적으로, 암환자 69명으로부터 확보한 PBMC를 PMA/ionomycin를 사용하여 4시간 동안 재자극시켜 (GolgiStop도 첨가함) 사이토카인의 분비를 유도하였다. 이후 유세포분석을 통해 각 CD8 T 세포의 아형에서 퍼포린, 그랜자임 B, IFN-γ, 및 IL-2를 분비하는 세포의 비율을 확인하였다.
결과는 도 14에 나타냈다. 상기 도면에서 확인 가능한 바와 같이, 퍼포린, 그랜자임 B, 및 IFN-γ는 분화가 더 진행된 세포에서 더 높은 수준으로 분비된 반면, IL-2의 경우 분화가 덜 진행된 세포에서 더 높게 분비된 것으로 나타났다.
퍼포린 및 그랜자임 B는 CD8 T 세포가 암세포를 공격할 때 사용되는 세포독성 분자이며, IFN-γ는 면역세포를 활성화여 암세포 공격이 더욱 효과적으로 이루어지게 하는 환경을 만들어주는 사이토카인이다. IL-2는 T 세포의 분열을 촉진하는 사이토카인이다. 따라서, 상기 결과는 CD8 T 세포의 분화가 진행될수록 세포독성은 증가하지만 분열 능력은 낮아진다는 것을 시사한다.
실시예 II-3. Tem 세포의 퍼포린 및 그랜자임 B의 증가는 암환자 특이적인 면역학적 특성이다.
CD8 T 세포의 분화가 진행될수록 세포독성은 증가하는 반면 분열 능력은 감소한다는 발견을 기초로, 암환자와 정상인의 T 세포가 기능 면에서 차이가 있는지 확인하였다.
따라서, NSCLC 환자 33명 및 건강한 사람 25명으로부터 각각 확보한 PBMC를 PMA/ionomycin를 사용하여 4시간 동안 재자극시켜 (GolgiStop도 첨가함) 사이토카인의 분비를 유도하고, 유세포분석을 통해 CD8 T 세포의 아형 중 Tem 세포 집단에서 퍼포린, 그랜자임 B, IFN-γ, 및 IL-2를 분비하는 세포의 비율을 확인하였다.
그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 정상인과 암환자의 Tem 세포 간에 IFN-γ 분비 세포 및 IL-2 분비 세포의 비율에는 유의미한 차이가 없으나, 퍼포린 분비 세포 및 그랜자임 B 분비 세포의 경우 암환자의 Tem 세포에서 비율이 더 높은 것으로 나타났다. 앞선 실시예에서 살펴본 바와 같이, 퍼포린 및 그랜자임 B는 분화가 더 진행된 세포에서 더 높은 수준으로 발현된다. 따라서, 암환자에서 퍼포린 또는 그랜자임 B 분비 세포의 비율이 증가했다는 상기 결과는, 정상인의 Tem에 비해 암환자의 Tem이 더욱 분화되었다는 것을 시사한다. 즉, Tem 세포의 퍼포린 및 그랜자임 B의 증가는 암환자 특이적인 면역학적 특성임을 알 수 있다.
실시예 II-4. 면역항암요법은 암환자에서 퍼포린 또는 그랜자임 B 발현 Tem을 증가시킨다.
암환자 특이적인 면역학적 특성 (퍼포린 또는 그랜자임 B 발현 Tem 세포의 증가)을 확인하였으므로, 이 다음 단계로서 암환자가 면역항암요법 (PD-1 요법)을 받았을 때 발생하는 면역학적 변화를 관찰하였다.
구체적으로, 암환자가 PD-1 요법 (Keytruda 또는 Tecentriq)을 받기 전의 혈액 (“Before”)과 PD-1 요법을 받고 7 내지 14일이 경과된 후의 혈액 (“After”)을 확보하고 (총 42 세트), 각 혈액에서 얻은 PBMC를 PMA/ionomycin로 4시간 동안 재자극 (GolgiStop도 첨가함)한 후, 유세포분석을 통해 CD8 T 세포의 아형 중 Tem 세포 집단에서 퍼포린, 그랜자임 B, IFN-γ, 및 IL-2를 분비하는 세포의 비율을 확인하였다.
그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 암환자의 Tem의 퍼포린 및 그랜자임 B 발현 수준은 PD-1 요법을 받기 전에 비해 PD-1 요법을 받은 후에 더 증가한 것으로 나타났다. INF-γ 분비 세포의 경우 PD-1 요법을 받기 전후에 유의미한 차이가 없었으며, IL-2 분비 세포의 경우 PD-1 요법을 받은 후 다소 비율이 감소한 것으로 나타났다.
이상의 실시예를 종합하여 볼 때, 암환자와 건강한 사람의 Tem은 퍼포린 및 그랜자임 B의 발현 수준에 차이가 있었으며 (실시예 II-3), 암환자에서도 면역항암요법의 진행 전후에 Tem의 퍼포린 및 그랜자임 B의 생성에 차이가 있는 것으로 나타났다 (실시예 II-4). 이와 같은 결과들은 종양의 진행과 퍼포린 및/또는 그랜자임 B의 발현 수준에 유의한 상관관계가 있음을 시사한다. 다만, 퍼포린 및 그랜자임 B가 면역항암요법을 받은 후에 전체적으로 증가한 양상은 확인되었으나, 구체적으로 살펴보면 면역항암요법 후에 퍼포린 및 그랜자임 B의 수준이 증가한 환자와 증가하지 않은 환자가 혼재되어 있었으므로, 이에 대한 추가 분석을 진행하였다.
실시예 II-5. Tem의 퍼포린 및 그랜자임 B 생성 증가는 암환자의 면역항암요법에 대한 반응성과 상관관계가 있다.
상술한 바와 같이, 여러 암환자에서 면역항암요법 이후의 퍼포린 및 그랜자임 B의 증가 양상은 확인되었으나, 면역항암요법 후에 퍼포린 및 그랜자임 B의 수준이 감소한 환자도 확인된 바, 퍼포린/그랜자임 B가 증가한 환자와 증가하지 않은 환자 간에 PD-1 요법에 대한 반응성 차이가 있는지 확인하였다.
구체적으로, 퍼포린 및 그랜자임 B의 수준이 유의미하게 증가한 환자들과 그렇지 않은 환자들을 각각 별개의 그룹으로 나누고, 각 그룹 내에서 면역항암요법에 대한 부분 관해 (PR)을 보인 환자들의 비율을 측정하였다.
그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 퍼포린 또는 그랜자임 B의 발현이 증가한 환자가 PD-1 요법에 대한 반응성이 더 높은 것으로 확인됐다. 이와 같은 결과는 Tem의 퍼포린 및 그랜자임 B 생성 증가가 면역항암요법에 대한 암환자의 반응성과 상관관계가 있음을 시사한다.
실시예 II-6. 항암 치료 전 초기 퍼포린 및 그랜자임 B의 수준은 면역항암요법에 대한 반응성을 결정한다.
앞선 실시예를 통해 퍼포린 및 그랜자임 B의 증가가 암환자의 면역항암요법에 대한 반응성과 상관관계가 있음을 확인하였으므로, 어떤 특성을 가진 환자가 퍼포린 및 그랜자임 B의 증가를 나타내게 되었는지 확인하였다.
구체적으로, 퍼포린 및 그랜자임 B의 수준이 유의미하게 증가한 환자들 (즉, PD-1 요법에 대한 반응성이 더 높은 환자들)과 그렇지 않은 환자들 (즉, PD-1 요법에 대한 반응성이 낮은 환자들)을 각각 별개의 그룹으로 나누고, 각 그룹별로 면역항암요법이 진행되기 전 (“Before”)의 혈액 샘플 내의 퍼포린 및 그랜자임 B 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 면역항암요법 후 퍼포린 및 그랜자임 B의 수준이 증가한 환자 그룹 (“Perforin increased” 및 “Granzyme B increased”)은 면역항암요법이 진행되기 전에는 오히려 퍼포린/그랜자임 B 수준이 변하지 않은 환자 그룹 (“Perforin NOT increased” 및 “Granzyme B NOT increased”)에 비해 퍼포린 및 그랜자임 B의 수준이 더 낮았던 것으로 확인됐다.
상기 결과를 살펴보건대, 항암 치료 전 초기 퍼포린 및 그랜자임 B의 수준이 낮았던 환자들은, 면역항암요법에 반응하여 퍼포린 및 그랜자임 B의 수준이 증가할 수 있는 것으로 보이며, 반면 항암 치료를 받기 전부터 초기 퍼포린 및 그랜자임 B의 수준이 높았던 환자들은 면역항암요법을 받더라도 퍼포린 및 그랜자임 B의 수준이 더 이상 증가할 수 없는 것으로 보인다. 또한 이와 같은 차이가 결국 면역항암요법에 대한 반응성으로 이어지는 것으로 보인다.
실시예 II-7. 분화가 더 진행된 Tem 일수록 퍼포린 및 그랜자임 B의 발현 수준이 증가한다.
상기 실시예가 Tem이 초기에 발현하는 퍼포린 및 그랜자임 B의 수준이 면역항암요법에 대한 암환자의 반응성을 결정한다는 것을 보여주었으므로, 암환자 간에 Tem에 의한 퍼포린 및 그랜자임 B 발현 차이가 어떤 원인에 의한 것인지 확인하고자 하였다.
구체적으로, 69명의 암환자 유래 PBMC를 PMA/ionomycin로 4시간 동안 재자극 (GolgiStop도 첨가함)한 후 유세포분석을 통해 Tem의 아형 각각에서 퍼포린, 그랜자임 B, INF-γ, 또는 IL-2를 분비하는 세포의 비율을 확인하였다. 추가로, 정성적 분석을 위해 각 분자를 발현하는 세포들에서 각 분자의 MFI를 측정하였다. Tem의 아형은 CD27 및 CD28의 발현 양상에 따라 다음과 같이 나뉜다: DP Tem (CD27 및 CD28 이중 양성; CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA-), SP Tem (CD27 또는 CD28 단일 양성; CD27+ CD28- CCR7- CD45RA- 또는 CD27- CD28+ CCR7- CD45RA-), 및 DN Tem (CD27 및 CD28 이중 음성; CD27- CD28- CCR7- CD45RA-).
결과는 도 19a 및 19b에 나타냈다. Tem을 상기 3가지 하위 그룹으로 나누었을 때, 퍼포린 또는 그랜자임 B 발현 세포의 비율은 높은 순서대로, DN, SP, 및 DP 순이었다 (즉, DN>SP>DP Tem). 또한, 퍼포린 MFI 및 그랜자임 B MFI 역시 DN>SP>DP Tem 인 것으로 나타났다. 반면, IL-2 발현 세포의 비율은 DP>SP>DN Tem 인 것으로 나타났다. IFN-γ는 하위그룹간에 큰 차이가 없었다.
Tem의 분화 순서는 DP, SP, 및 DN 순이다. 즉, 상기 결과는 Tem 그룹 내에서도, Tem 세포의 분화가 더 많이 진행될수록 퍼포린 및 그랜자임 B의 발현은 증가하고, IL-2의 발현은 감소한다는 것을 보여주는 것이며, 이와 같은 경향성은 앞서 CD8 T 세포를 통해 본 경향성과 일치한다. 따라서, Tem 집단 내의 DP, SP, 및 DN Tem 분포에 따라 전체 Tem이 발현하는 퍼포린 및 그랜자임 B의 수준이 달라지며, 이것이 결국 면역항암요법에 대한 반응성을 결정하는 것이라고 판단된다.
실시예 II-8. Tem의 아형 (DP 및 DN)의 분포 양상에 따라 암환자의 초기 퍼포린 및 그랜자임 B의 수준이 결정된다.
상기 실시예를 통해 Tem의 아형 중 가장 분화가 덜 일어난 DP Tem은 퍼포린/그랜자임 B를 가장 적게 발현하고, Tem의 아형 중 가장 분화가 많이 일어난 DN Tem은 퍼포린/그랜자임 B를 가장 많이 발현한다는 것이 확인되었다. 따라서, 암환자 간의 퍼포린 및 그랜자임 B의 발현 수준의 차이가 Tem 내의 DP, SP, 및 DN Tem 아형의 분포 차이에 기인한 것인지 확인하였다.
이를 위해, 69명의 NSCLC 환자의 PBMC로부터 유래한 전체 Tem의 퍼포린 및 그랜자임 B 발현 수준이, 전체 Tem 세포 중 DP Tem 및 DN Tem의 비율과 일치하는지 확인하였다.
그 결과, 도 20a 및 20b에 나타낸 바와 같이, 전체 Tem 세포 중 DP Tem의 비율이 낮을수록 (도 20a), 그리고 DN Tem 비율이 높을수록 (도 20b) 퍼포린 및 그랜자임 B의 발현 수준이 증가하는 것으로 나타났다.
상기 결과는 암환자 간의 퍼포린 및 그랜자임 B의 발현 수준 차이는 전체 Tem 세포 중 DP 및 DN Tem의 분포 차이에 기인한 것임을 보여준다.
실시예 II-9. Tem의 아형 (DP 및 DN)의 분포 양상에 따라 면역항암요법에 의한 퍼포린 및 그랜자임 B의 증가 경향성이 결정된다.
이전 실시예를 통해, 면역항암요법 전 초기 퍼포린 및 그랜자임 B의 수준이 낮았던 환자들이, 면역항암요법 후 퍼포린 및 그랜자임 B의 증가 경향성을 나타내면서 면역항암요법에 대한 더 높은 반응성을 보이는 것을 확인하였다 (실시예 II-5). 또한 앞선 실시예를 통해 전체 Tem 세포 중 DP/DN Tem의 분포에 따라 초기 퍼포린 및 그랜자임 B의 수준이 결정되는 것을 확인하였다 (실시예 II-8). 이에, 전체 Tem 세포 중 DP/DN Tem의 분포가 면역항암요법에 의한 퍼포린 또는 그랜자임 B의 증가 경향성에 영향을 미치는지 확인하였다.
구체적으로, 암환자를 DP Tem 및 DN Tem의 비율에 따라 다음의 4개 그룹으로 나누고, 각 그룹별로 면역항암요법 (PD-1 요법)을 받기 전과 후의 퍼포린 또는 그랜자임 B의 수준을 확인하였다: DP Tem 비율이 높은 그룹 (고-DP Tem %); DP Tem 비율이 낮은 그룹 (저-DP Tem %); DN Tem 비율이 높은 그룹 (고-DN Tem %); 및 DN Tem 비율이 낮은 그룹 (저-DN Tem %).
그 결과, 도 21a 및 12b에 나타낸 바와 같이, DP Tem 비율이 높은 환자일수록, 또는 DN Tem 비율이 낮은 환자일수록 면역항암요법을 받은 후에 퍼포린 및 그랜자임 B의 수준이 증가하는 것을 확인하였다.
상기 결과는 전체 Tem 중 DP/DN Tem의 분포가 면역항암요법에 의한 퍼포린 및 그랜자임 B의 증가 여부를 결정한다는 것을 보여준다. 또한, 이와 같은 결과는, 암환자의 전체 Tem 중 DP/DN Tem의 분포가 면역항암요법에 대한 반응성을 결정한다는 것을 시사하는 것이다.
실시예 II-10. Tem의 아형 (DP 및 DN)의 분포 양상이 면역항암요법에 대한 암환자의 반응성 및 예후를 결정한다.
앞선 실시예들을 통해 면역항암요법에 의한 퍼포린/그랜자임 B의 증가가 면역항암요법에 대한 암환자의 반응성과 관련이 있음을 확인하였으며, 또한 전체 Tem 중 DP/DN Tem의 분포가 면역항암요법에 의한 퍼포린/그랜자임 B의 증가 여부를 결정하는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명자들은 실제로 DP 및 DN Tem 분포에 따라 암환자의 면역항암요법에 대한 반응성이 달라지는지 확인하였다.
구체적으로, 환자를 전체 Tem 중 DP Tem 및 DN Tem의 비율에 따라 4개 그룹으로 나누었다: DP Tem 비율이 높은 그룹 (고-DP Tem %); DP Tem 비율이 낮은 그룹 (저-DP Tem %); DN Tem 비율이 높은 그룹 (고-DN Tem %); 및 DN Tem 비율이 낮은 그룹 (저-DN Tem %). 각 그룹별로 면역항암요법 (PD-1 요법)을 하기 전 (Before)과 후 (After)의 Tem의 Ki-67 발현 수준을 비교하였으며, 마찬가지로 각 그룹별로 면역항암요법에 대해 부분 관해 (PR)을 보인 환자의 비율을 확인했다.
그 결과, DP Tem의 비율이 높은 환자일수록, 또는 DN Tem 비율이 낮은 환자일수록 면역항암요법 후 Ki-67 발현이 증가하는 것으로 확인되었다 (도 22a). Ki-67은 분열 중인 세포에서 발현되는 분자로, PD-1 요법을 받은 암환자 중 Ki-67의 발현 증가가 관찰된 환자의 예후가 더 좋다는 것이 알려져 있다. 따라서 상기 결과는 DP Tem의 비율이 높은 환자일수록, 또는 DN Tem 비율이 낮은 환자일수록 면역항암요법에 대해 반응성이 좋으며 (세포 분열이 더 많이 일어남), 예후가 좋다는 것을 보여주는 것이다. 실제로, 면역항암요법에 대한 부분 관해를 보인 환자의 비율을 확인한 결과, DP Tem의 비율이 높은 환자일수록, 또는 DN Tem 비율이 낮은 환자일수록 면역항암요법에 대해 부분 관해를 보인 환자의 비율이 더 높은 것으로 확인됐다 (도 22b). 종합적으로, 상기 결과는 암환자의 전체 Tem 세포 중 DP 및 DN Tem의 분포가 면역항암요법에 대한 환자의 반응성 및 예후를 결정한다는 것을 입증하는 것이다.
실시예 II-11. 나이가 아닌 종양 유무가 Tem의 아형 (DP 및 DN)의 분포를 결정한다.
이상의 실시예를 통해 암환자의 Tem 내 DP/DN Tem 비율이 면역항암요법에 대한 반응성 및 예후를 결정한다는 것을 확인하였다. 이에, 암환자에서 DP/DN Tem의 분포가 달라지는 요인을 알아보고자 하였다. 특히, Tem은 DP, SP, 및 DN 순으로 분화되는데, 사람은 나이가 많을수록 더 많은 면역 자극을 받아왔기 때문에 분화된 세포들의 비율이 높다. 이에, DP/DN Tem의 분포가 환자의 연령에 따라 달라지는지 확인하였다.
먼저, NSCLC 3기 및 4기 환자 (Stage III, IV)를 연령대에 따라 40대/50대 그룹; 60대 그룹; 및 70/80대 그룹으로 나누었으며, 각 그룹별로 전체 Tem 중 DP Tem 및 DN Tem 각각의 비율을 유세포분석으로 확인하였다. 또한, 건강한 사람 중 40대/50대에 해당하는 사람과 NSCLC 3기 및 4기 환자 중 40대/50대에 해당하는 사람의 DP Tem 및 DN Tem 비율을 비교하였다.
먼저, 연령대에 따른 DP/DN Tem 분포를 확인한 결과, NSCLC 3기 및 4기 환자 내에서는 연령에 따른 DP/DN Tem 분포의 유의미한 차이가 없는 것으로 확인되었다 (도 23a). 반면, 동일한 연령대 (40/50대)의 정상인과 암환자의 DP/DN Tem 분포를 비교한 결과, 정상인에 비해 암환자의 DP Tem 비율이 낮고, DN Tem 비율이 높은 것으로 확인되었다 (도 23b).
상기 결과는 전체 Tem 세포 중 DP/DN Tem의 분포는 나이가 아닌 종양의 유무의 영향을 받는다는 것을 보여준다.
실시예 II-12. 종양이 진행될수록 DP Tem의 비율은 감소한다.
앞선 실시예를 통해 종양의 유무가 DP/DN Tem의 분포를 결정하는 것을 확인하였으므로, 종양의 진행 정도에 따라 DP/DN Tem의 분포가 변화하는지 확인하였다.
구체적으로, 건강한 사람 및 NSCLC 환자 (StageI/II, Stage III, 및 Stage IV)에서 전체 Tem 중 DP Tem 및 DN Tem 각각의 비율을 유세포분석으로 확인하였다.
그 결과, 전체 NSCLC 환자 그룹은 정상인 그룹에 비해 평균 DP Tem의 비율이 낮았으며, NSCLC 환자 그룹 내에서도 종양이 진행된 그룹일수록, 즉, 병기가 더 높은 그룹일수록 DP Tem의 비율이 감소하는 것으로 확인됐다 (도 24). 또한, 전체 NSCLC 환자 그룹은 정상인 그룹에 비해 평균 DN Tem의 비율이 높았으며, 종양이 진행된 그룹일수록, 즉, 병기가 더 높은 그룹일수록 DN Tem의 비율이 증가하는 것으로 확인됐다. 상기 결과는 종양이 진행됨에 따라 DP 및 DN Tem의 분포가 변하며, 병기가 높아질수록 DP Tem의 비율은 증가하고, DN Tem의 비율은 감소한다는 것을 나타낸다.
앞의 실시예를 통해 본 발명자들은 DP Tem의 비율이 높을수록, DN Tem의 비율이 낮을수록 면역항암요법에 대한 반응성이 높은 것을 확인하였다 (실시예 II-10). 이는, 분화가 덜 진행된 세포 (DP Tem)가 많을수록 면역항암요법에 반응하여 종양이 공격 당할 가능성이 큰 반면, 분화가 더욱 진행된 세포 (DN Tem)가 많을수록 면역항암요법에 반응할 수 있는 세포의 비율이 낮기 때문에 종양이 공격 당할 가능성 역시 감소한다는 것을 의미한다. 이 때, 종양이 더 진행됨에 따라 DN Tem의 비율이 증가하는 것은, 암세포와 T 세포 간 상호작용이 증가함에 따라 T 세포가 종양에 지속적으로 반응하여 더 분화된 세포가 되어간다는 것을 시사한다. 즉, 암세포와 T 세포간의 상호작용이 지속될수록 DP Tem의 비율이 감소하여 면역항암요법에 대한 반응성도 감소하기 때문에, 면역력이 남아있을 때 (즉, DP Tem 비율이 높을 때) 면역항암요법을 받는 것이 암치료에 중요하다는 것을 알 수 있다.
<실시예 III> 이중 마커 (DP Temra 및 Fitness factors)를 이용한 암환자의 면역항암치료 반응성 예측
실시예 I를 통해 DP pTemra가 종양 돌연변이 부하 (Tumor mutation burden, TMB) 및 종양-침윤 CD8 T 세포의 수와 역 상관관계를 가지며, 따라서 환자의 종양 항원에 대한 면역원성 및 항원성 상태를 반영하는 마커이자 면역항암치료에 대한 환자의 반응성을 예측하기 위한 독립적인 바이오마커로 활용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 실시예 II를 통해 DP Tem%이 높을수록; DN Tem%가 낮을수록; 면역항암치료 후 Perforin (퍼포린)+ Tem%이 증가할수록; 면역항암치료 후 Granzyme B (그랜자임 B)+ Tem%이 증가할수록; 그리고 면역항암치료 후 IL-2+ Tem%이 감소할수록 (종합적으로, “Fitness가 높은 것”으로 표현함), 암환자의 면역력 (면역항암치료에 대해 반응할 수 있는 능력)이 항암치료에 유리한 것을 확인하였으며, 따라서 상기 Fitness factor를 면역항암치료에 대한 환자의 반응성을 예측하기 위한 독립적인 바이오마커로 활용할 수 있음을 확인하였다.
암환자가 면역항암치료에 대해 높은 반응성을 보이기 위해서는, 암의 면역원성 상태 및 환자의 항암 면역력 상태가 모두 좋아야 한다. 따라서 이하의 실시예에서는, 암의 면역원성 상태를 나타내는 DP Temra 및 환자의 항암 면역력 상태를 나타내는 Fitness factor를 사용하여 2차원 그래프로 환자를 분류하고, K-NN 알고리즘 (K-Nearest Neighbor algorithm)에 기반한 머신러닝을 통해 암환자의 면역항암치료에 대해 부분 관해 (PR)을 가질 확률을 예측하는 모델을 확립하고자 하였다. K-NN 머신러닝의 장점은 임계점 경계 (Thereshold boundary)에서 누락되는 환자가 없으며, 환자별로 낮은 확률부터 높은 확률까지 다른 확률 값을 줄 수 있어 환자 맞춤형 치료가 가능해진다는 것에 있다.
실시예 III-1. DP Terma 및 Fitness factor (DP Tem 또는 DN Tem)의 이중 마커의 면역항암치료 반응성 예측 능력은 단일 마커에 비해 우수하다.
먼저, DP Temra 및 Fitness factor (DP Tem% 또는 DN Tem%)를 동시에 사용하여 암환자의 면역치료 (면역체크포인트 억제제)에 대한 반응성 예측 능력을 높이고자 하였다. 앞선 실시예에서 확인한 바와 같이, 암환자가 면역항암치료에 대해 높은 반응성을 보이기 위해서는 DP Temra의 수준은 낮고 (즉, 암의 상태가 TMB는 높고 tilCD8의 수가 많은 상태), 환자의 면역력 (즉, Fitness)이 좋아야 한다 (DP Tem%이 높고 DN Tem%이 낮음). 따라서, DP Temra 및 DP Tem을 각각 x축 및 y축으로 하여 2차원 그래프를 만들면 DP Temra가 낮고 DP Tem이 높은 환자들에서 면역치료 (면역체크포인트 억제제)에 대한 높은 반응성이 나올 것으로 예상하였으며; DN Temra 및 DN Tem을 각각 x축 및 y축으로 하여 생성된 2차원 그래프에서는 DP Temra 및 DN Tem이 모두 낮은 환자들에서 면역치료에 대한 높은 반응성이 나타날 것으로 예상하였다.
구체적으로, 120명의 NSCLC Stage III/IV 환자의 PBMC에서 DP Temra%, DP Tem%, 및 DN Tem%를 유세포분석으로 확인하였다. 그 후 먼저 x축을 DP Temra, y축을 DP Tem으로 사용하여 그래프를 그리고, 두 값에 따라 환자들을 Q1, Q2, Q3, 및 Q4 그룹으로 분류하였다. 동일한 방식으로 x축에 DP Temra, y축을 DN Tem으로 사용하여 그래프를 그리고, 두 값에 따라 환자들을 Q1, Q2, Q3, 및 Q4 그룹으로 분류하였다. 마지막으로, Q1 내지 Q4의 각 그룹에서 면역항암치료 (PD-1 요법)에 대해 부분 관해를 보인 환자의 비율 (“PR-환자 비율”)을 확인하였다.
DP Temra 및 DP/DN Tem을 이용한 2차원 그래프는 도 25a에 나타냈으며, Q1, Q2, Q3, 및 Q4 그룹별 부분 관해를 나타낸 환자의 비율은 도 25b에 나타냈다. 도면에서 확인 가능한 바와 같이, DP Temra 및 DP Tem으로 환자를 분류하였을 때에는 Q1 그룹의 PR-환자 비율이 다른 그룹에 비해 현저하게 높았으며, DP Temra 및 DN Tem을 사용하여 환자를 분류하였을 때에는 Q4 그룹의 PR-환자 비율이 다른 그룹에 비해 매우 높았다. 즉, 상기 결과는 DP Temra가 낮고 Fitness가 높은 환자일수록 면역항암치료 (면역체크포인트 억제제)에 대한 반응성이 좋을 것이라는 예측과 일치한다.
나아가, 본 발명자들은 DP Temra 및 DP Tem에 기초한 Q4 그룹; 및 DP Temra 및 DN Tem에 기초한 Q1 그룹의 PR-환자 비율이 각 마커를 단독으로 사용하여 확인한 PR-환자 비율보다 현저히 높은 것을 확인하였다 (도 25c). 이는 DP Temra 및 DP/DN Tem의 2가지 마커의 조합의 면역항암치료 반응성 예측 능력이 단일한 마커 (DP Temra, DP Tem, 또는 DN Tem) 단독의 면역항암치료 반응성 예측 능력보다 우수하다는 것을 의미한다.
실시예 III-2. K-NN 머신러닝을 이용한 면역항암치료 반응성 예측용 그래프 (pGRAPH) 확립.
본 발명자들은 앞선 실시예에서 확립한 그래프에서 임계치 (threshold)를 제거함으로써 그래프를 개선하고자 하였다. 따라서, K-NN 머신러닝을 사용하여 2가지 그래프 (Temra/DP Tem 그래프; 및 DP Temra/DN Tem 그래프) 상의 모든 플롯 (plot)마다 가장 가까운 7명의 환자 (7-NN)중 PR 환자의 빈도를 확인하고, PR 환자의 빈도가 높을수록 진한 붉은색으로 표시하였다. 주변에 7명의 환자가 없는 플롯은 회색으로 표시하였다. K-NN 머신러닝을 통해 확립한 그래프는 Probability graph (pGRAPH)라고 명명하였다.
그 결과, Temra/DP Tem 기반 pGRAPH에서는 DP Temra가 낮고 DP Tem이 높은 플롯일수록 강한 붉은색을 나타냈고, Temra/DN Tem 기반 pGRAPH에서는 DP Temra가 낮고 DN Tem이 낮은 플롯일수록 강한 붉은색을 나타냈다 (도 26). 즉, 이는 앞선 실시예에서 확인한 경향성 (DP Temra 낮을수록, Fitness가 높을수록 면역치료에 대한 반응성이 높음)과 일치하는 것이다.
본 실시예를 통해 확립된 pGRAPH는 DP Temra/Fitness 그래프의 각 플롯마다 주변 환자의 정보를 토대로 몇 퍼센테이지 (%)의 확률로 PR이 나올지 예측할 수 있게 한다 (“PR%”, 예를 들어, PR 환자=0명인 경우, PR%=0%; PR 환자=1명인 경우, PR%=14.3% (1/7); PR 환자=2명인 경우, PR%=28.6% (2/7)). 즉, 각 플롯의 PR%는 해당 환자가 면역항암치료 후 부분 관해를 보일 확률을 나타낸다.
실시예 III-3. pGRAPH의 면역항암치료 반응성 예측 능력 검증
이전 실시예를 통해 확립한 pGRAPH이 실제 암환자의 면역항암치료에 대한 반응성을 예측할 수 있는지 검증하기 위해, pGRAPH를 통해 NSCLC 환자의 면역항암치료 반응성을 예측하였다.
구체적으로, 각 환자별로 DP Temra 및 DN Tem 수준을 측정한 후, pGRAPH에 플롯팅하여 해당 플롯에 해당하는 PR% 값 (“예측 PR%”)을 받았다. 또한 확인된 PR% 값이 실제 각 환자의 임상적 예후와 일치하는지 검증하였다. 임상적 예후 인자로는 실제 PR%, 실제 DCB (Durable Clinical Benefit: PR (부분관해)+6개월간 SD (stable disease, 안정병변)%, mPFS (무진행생존기간 중앙값), 및 mOS (전체 생존기간 중앙값)을 사용하였다.
그 결과, 환자의 예측 PR%가 높을수록 실제 PR%, 실제 DCB %, mPFS, 및 mOS가 높은 것으로 나타났다 (도 27a). 뿐만 아니라, 환자의 예측 PR%에 따른 무진행생존기간 및 전체 생존기간을 확인한 결과, 예측 PR%이 높을수록 각 생존기간이 더 긴 것으로 나타났다 (도 27b). 상기 결과는 본 발명에 따른 pGRAPH가 환자의 면역항암요법 반응성을 포함한 임상적 예후를 예측하기 위한 진단모델로 사용될 수 있음을 증명하는 것이다.
실시예 III-4. pGRAPH는 종래의 바이오마커에 비해 예후 (면역항암치료 반응성 포함) 예측 기능이 우수하다.
이어서, 본 발명에 따른 pGRAPH가 암환자의 면역항암치료 반응성 바이오마커로서의 기능이 얼마나 우수한지 확인하기 위해, 종래 사용되던 면역치료 반응성 예측 마커와 기능을 비교하였다. pGRAPH는 PBMC, 즉, 혈액 바이오마커 (DP Temra, DP/DN Tem 등)에 기반한 것이므로, 정확한 비교를 위해 마차가지로 혈액 바이오마커인 NLR (Neutrophil to lymphocyte ratio) 및 PLR (Platelet to lymphocyte ratio)와 비교했다. 또한, 종양의 외과적 수술을 수행해야만 확인할 수 있는 바이오마커인 EGFR 돌연변이 수준 및 PD-L1 발현 수준과도 비교하였다.
구체적으로, 면역항암요법 (PD-1/PD-L1 요법; Keytruda 또는 Tecentriq)을 받은 120명의 NSCLC Stage III/IV 환자를 대상으로 분석을 수행하였다 (Keytruda를 받은 환자 18명 및 Tecentriq를 받은 환자 102명). 각 바이오마커의 임계치 (threshold)는 다음과 같은 기준으로 설정하였다: (1) 임계치를 통과 (pass)한 환자의 비율 (Proportion)이 30% (Tecentriq를 받은 환자의 경우 20%)가 되도록 설정함; (2) 상기 Proportion이 30%일 때에 비해 30% 초과일 때 객관적 반응률 (Objective response rate, ORR)이 더 높은 지점이 있으면 해당 지점을 임계치로 설정함.
결과는 아래 표 3 및 표 4에 나타냈다. 표 3은 전체 환자에 대한 분석 결과이고, 표 4는 Tecentriq를 받은 환자에 대해서만 분석한 결과이다.
|
Total
(120 patients) |
Biomarker source |
ORR | DCB | mPFS | mOS | AUC | Proportion |
| No biomarker | 19.2 | 27.5 | 5.3 | 10.5 | 0.500 | 100.0 | |
| NLR | PBMC | 20.5 | 33.3 | 5.9 | 13.6 | 0.496 | 32.5 |
| PLR | PBMC | 25.5 | 39.2 | 6.9 | 12.3 | 0.548 | 42.5 |
| EGFR mutation | Tumor | 25.0 | 34.7 | 5.9 | 11.0 | 0.620 | 60.0 |
| PD-L1 | Tumor | 28.6 | 45.7 | 7.4 | 12.4 | 0.629 | 30.7 |
| pGRAPH | PBMC | 38.9 | 47.2 | 7.8 | 11.0 | 0.710 | 30.0 |
|
Tecentriq
(102 patients) |
Biomarker source |
ORR | DCB | mPFS | mOS | AUC | Proportion |
| No biomarker | 15.7 | 20.6 | 4.6 | 9.9 | 0.500 | 100.0 | |
| NLR | PBMC | 15.9 | 25.4 | 5.1 | 11.3 | 0.464 | 61.2 |
| PLR | PBMC | 22.2 | 33.3 | 6.0 | 11.3 | 0.569 | 43.7 |
| EGFR mutation | Tumor | 20.0 | 25.0 | 4.9 | 9.9 | 0.613 | 81.1 |
| PD-L1 | Tumor | 20.8 | 29.2 | 5.7 | 11.0 | 0.532 | 24.7 |
| pGRAPH | PBMC | 39.1 | 39.1 | 7.2 | 10.3 | 0.767 | 22.5 |
상기 2개 표에서 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 바이오마커 pGRAPH는 면역항암치료 반응성 및 예후 예측 기능이 종래의 예후 예측 바이오마커에 비해 우수한 것으로 나타났다. 특히, 종양 조직의 PD-L1 발현 수준은 가장 대표적인 PD-1 요법의 반응성 예측용 바이오마커로 활용되는 것인데, pGRAPH는 혈액 기반 바이오마커임에도 불구하고 PD-L1 발현에 비해 훨씬 높은 ORR을 보여주었다 (38.9% vs. 28.6%). 또한, Tecentriq 요법의 경우 PD-L1 발현 수준이 정확한 바이오마커로 기능하지 못한다고 알려져 있으며, 실제로 상기 실험에서도 Tecentriq 요법만 받은 환자의 분석 결과는 전체 환자 분석 결과에 비해 PD-L1의 예측 기능이 낮은 것으로 나타났다. 반면, 본 발명의 pGRAPH의 경우, Tecentriq 요법만 받은 환자의 분석 결과에서도 높은 예측 기능을 유지하였다.
실시예 III-5. pGRAPH은 머신러닝에 사용되지 않은 환자에 대해서도 정확한 예후 예측이 가능하다.
pGRAPH의 예후 예측 모델로서의 유용성을 검증하기 위해, pGRAPH 확립 (머신러닝)에 사용되지 않은 환자에 대해서도 우수한 예후 예측 기능을 유지하는지 확인하였다.
이를 위해, 120명의 NSCLC 환자 중 Tecentriq 요법만 받은 환자 102명을 선별하였으며, 이들을 다시 실험 세트에 따라 72명의 환자 그룹과 30명의 환자 그룹으로 나누었다. 이어서 72명의 환자 그룹으로 머신러닝을 수행하여 pGRAPH를 제작했으며, 제작된 pGRAPH로 나머지 30명 환자의 예후를 예측하였다.
72명의 환자 그룹으로 제작한 pGRAPH로 다른 30명 환자의 예측 PR%를 확인한 후 이를 실제 예후 인자 (실제 PR%, 실제 DCB%, mPFS, 및 mOS)와 비교한 결과, 이전의 결과와 일치하게, 예측 PR%가 높을수록 예후가 좋은 것 (실제 PR%, 실제 DCB%, mPFS, 및 mOS가 높음)으로 나타났으며 (도 28a), 무진행 생존기간 및 전체 생존기간 역시 더 긴 것으로 확인됐다 (도 28b).
상기 결과는 본 발명에 따른 pGRAPH가 머신러닝에 사용되지 않은 환자에 대해서도 우수한 예후 예측 기능을 발휘한다는 것을 뒷받침한다.
실시예 III-6. DP Temra 및 Fitness factor 이외의 인자로 구현한 pGRAPH는 예후 예측 능력이 낮다.
앞선 실시예를 통해 DP Temra 및 Fitness factor를 기반으로 제작된 pGRAPH의 암환자의 예후 예측 능력이 우수하다는 것을 확인하였으므로, DP Temra 및 Fitness factor 이외의 인자를 사용하여 pGRAPH를 만들 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, 종양 진행 정도에 따라 일정한 변화 경향을 보이는 DP Tem% 및 DN Tem%과 달리, SP Tem%은 종양 진행 정도와 무관하게 일정한 수준을 유지하는 것에 착안하여 (도 29a), SP Temra 및 SP Tem을 기초로 pGRAPH를 제작하였다. 실시예 III-5와 마찬가지로, 72명의 암환자의 SP Temra 및 SP Tem 데이터로 pGRAPH를 제작했으며, 상기 pGRAPH로 다른 암환자 30명의 예후를 예측하였다.
SP Terma 및 SP Tem을 기반으로 제작된 pGRAPH는 도 29b에 나타냈으며, 여기에 암환자 30명의 데이터를 입력하여 예측 PR%를 받아 실제 예후 (실제 PR%, 실제 DCB%, mPFS, 및 mOS)와 비교하였다. 그 결과, DP Temra 및 Fitness 기반으로 제작된 pGRAPH가 실제 예후와 일치하는 경향을 가진 것과 달리, SP Terma 및 SP Tem을 기반으로 제작된 pGRAPH는 일관된 경향성을 보이는 것이 아니라, 산발적인 경향성을 띠는 것으로 나타났다 (도 29c). 즉, DP Temra 및 Fitness 기반 pGRAPH와 달리 SP Temra 및 SP Tem 기반 pGRAPH는 새로운 환자에 대한 예후 예측 능력이 매우 낮은 것으로 확인됐다.
상기 결과는 결국, 본 발명에 따른, DP Temra 및 Fitness 기반 pGRAPH의 우수한 예후 예측 기능을 입증하는 것이다.
실시예 III-7. CD8
+
T 세포 아형의 IL-2에 대한 반응성 확인
본 발명을 추가로 검증하기 위해, DP Temra 및 Fitness factor를 이용하여 암환자의 IL-2 요법에 대한 반응성을 예측하였다. 가장 먼저, CD8+ T 세포 아형 (Tn, DP Tem, DN Tem, Temra)의 IL-2에 대한 반응성을 확인하였다.
구체적으로, 건강한 공여자 PBMC로부터 Tn, DP Tem, DN Tem, Temra 세포를 분류하였으며, 분류된 세포들의 분열 정도를 측정하기 위해 각각 CTV로 표지하였다. 상기 CD8+ T 세포 아형들을 IL-2 (50 ng/ml)을 처리하여 7일간 배양하되, 이들 중 일부는 비교를 위해 anti-CD8/CD28 (즉, TCR 자극)을 처리하여 자극시켰다. 7일간의 배양을 마친 후 PMA/ionomycin을 5시간 동안 처리한 후, IFN-γ 발현 CD8+ T 세포 아형 및 IL-2 발현 CD8+ T 세포 아형의 비율을 유세포분석으로 측정했다. 또한, CTV의 희석 정도를 관찰하여 분열 인덱스를 측정했다.
결과는 도 30a 내지 30d에 나타냈다. IL-2로 자극한 경우, Tn<DP Tem<DN Tem<Temra 순으로 IFN-γ 발현 세포 및 퍼포린 발현 세포의 비율이 높은 것으로 나타났으며, 세포 증식도 더 많이 일어난 것으로 확인됐다 (도 30a). 특히, 분열 인덱스는 TCR 자극된 세포 (도 30b)와 반대 양상을 갖는 것으로 나타났다.
항-PD-1/PD-L1 요법은 TCR 자극에 대한 PD-1의 저해 효과를 억제함으로써 항암 효과를 달성하는 것이다. 그러나, 분열이 많이 이루어진 세포 (DN Tem, Temra)의 비율이 높은 암환자는 TCR 자극에 대한 반응성이 거의 없을 가능성이 높다. DN Tem의 비율이 높은 암환자는 결국 본 발명에 따른 Fitness가 낮다는 것이며, DP Temra 및 DP Tem 기반의 2차원 그래프에서 Q3 혹은 Q4에 해당하는 사람들이다 (항-PD-L1에 대한 반응성이 가장 낮은 환자). 즉, 이와 같은 환자들은 항-PD-1 또는 항-PD-L1 요법보다는 IL-2 요법에 더 높은 반응성을 보일 것으로 예상된다.
실시예 III-8. 초기 Temra 비율에 따른 IL-2 요법 반응성 확인
앞선 실시예를 통해 분화가 더 많이 일어난 세포의 비율이 높은 암환자는 오히려 IL-2 치료에 높은 반응성을 나타낼 수 있음을 확인하였다. 따라서, 실제로 분화된 세포를 많이 가진 암환자가 IL-2 치료에 더 좋은 반응성을 보일지 확인하였다.
구체적으로, 건강한 사람의 PBMC에서 FACS sorting으로 CD8+ T 세포를 분리하였으며, 이 때 분리 당시의 가장 분화된 세포 아형인 Temra의 비율을 측정했다. 분리된 CD8+ T 세포를 IL-2 (50 ng/ml) 또는 TCB2-IL2 복합체 (50 ng/ml; Selecxin)를 처리하여 7일간 배양하였다. 7일 후 PMA/ionomycin을 처리하고 IFN-γ 발현 수준 및 퍼포린-발현 수준을 측정하고, CTV 희석을 통해 분열 인덱스를 구했다. 나아가, 종양 특이적인 CD8+ T 세포에도 적용될지 알아보기 위해 tilCD8+ T 세포에서도 동일한 실험을 진행했다.
IL-2로 자극한 PBMC의 결과는 도 31b에, TCB2-IL-2 복합체로 자극한 PBMC의 결과는 도 31c에, IL-2로 자극한 tilCD8+ T 세포의 결과는 도 31d에 나타냈다. 세 가지 경우 모두, 초기에 Temra의 비율이 높았던 환자들이 퍼포린 발현 수준, IFN-γ 발현 수준, 및 분열 인덱스 모두 높은 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 치료 전 Temra 비율이 높은 환자일수록 IL-2 요법에 더 높은 반응성을 보일 것이라는 것을 의미한다.
실시예 III-9. DP Temra 및 Fitness factor를 이용한 IL-2 요법에 대한 반응성 예측
최종적으로, DP Temra 및 Fitness factor를 이용해 IL-2 요법에 대한 반응성을 예측하였다.
구체적으로, 환자의 혈액으로부터 측정한 DP Temra 및 Fitness factor 데이터를 기반으로 2차원 그래프를 제작했으며, 환자의 종양 침윤성 림프구에서 확보한 CD8+ T 세포에서 Temra의 비율 (tilTemra %)을 구했다. 이어서, 2차원 그래프를 quadrant (Q1 내지 Q4)로 나눈 후 각 quadrant에 속하는 환자들의 tilTemra %를 비교했다.
그 결과, Q1에서 tilTemra %가 가장 낮고, Q3/Q4에서 tilTemra %가 가장 높은 것으로 확인됐다 (도 32a 및 32b). 상기 tilTemra %는 tilCD8+ T 세포의 IL-2 요법에 대한 반응성과 비례하므로, 결국 Q3 또는 Q4에 속하는 환자들이 IL-2 치료에 대한 반응성이 가장 좋을 것으로 예상된다. 즉, 이는 (i) 전체 CD8+ T 세포 중 Temra의 비율이 높을수록 암환자의 IL-2 치료 (IL-2 단독 또는 병용 치료)에 대한 반응성이 높고, (ii) 전체 Tem 중 DP Tem이 차지하는 비율이 낮을수록 암환자의 IL-2 치료에 대한 반응성이 높다는 것을 뒷받침한다.
실시예 III-10. Fitness factor로 활용 가능한 세포 유형의 추가 탐색
본 발명에 따른 Fitness factor는 암환자의 면역력, 즉 면역요법에 대해 반응할 수 있는 능력을 대변하는 마커로서, DP Tem/DN Tem과 같이 종양 단계와 비례하여 변화는 세포 아형이라면 Fitness factor로 활용 가능하다. 특히, CD27 및 CD28 외에 다른 분자적 마커로도 DP Tem/DN Tem을 규명하는 것도 가능하다. 특히, DP Tem→SP Tem→DN Tem 순으로 일괄적으로 변하는 마커라면, 이를 통해 간접적으로 DP Tem 및 DN Tem을 규명할 수 있다. 따라서, 이와 같은 순서로 변화 양상을 나타내는 마커가 무엇이 있는지 유세포분석으로 확인하였다.
그 결과, CD28, CD27, TCF1, CD127, CD45RO, CXCR3, CD69, 및 PD1이 DP Tem>SP Tem>DN Tem 순으로 발현되고; CD45RA, Perforin, CD57은 DN Tem>SP Tem>DP Tem 순으로 발현되는 것이 확인되었다 (도 33).
즉, 반드시 CD27 또는 CD28에 의하지 않더라도, 상기 마커들을 이용하면 DP Tem 및 DN Tem을 간접적으로 정의할 수 있으며, 따라서 Fitness factor로 활용 가능하다. 나아가 상기 마커들이 아니더라도, 위와 같이 CD8+ 세포 아형에 따라 특이적인 발현 변화 양상을 보이는 분자적 마커라면 모두 Fitness factor로 활용 가능하다.
종합하면, 본 발명에 따른 DP Temra 및 Fitness factor는 각각 암환자의 종양 상태 및 암환자의 면역력을 대변하는 바이오마커로서, 각각 암환자의 면역항암치료에 대한 반응성에 대한 독립적인 바이오마커로 활용될 수 있으며, 둘의 조합은 더욱 강력한 암환자 예후 예측용 바이오마커로 기능할 수 있음이 증명되었다 (도 34). 따라서, 본 발명에 따른 바이오마커를 통해 암환자의 면역항암요법에 대한 반응성을 정확히 예측하여 더욱 효과적이고 효율적인 환자-맞춤형 치료가 가능할 것으로 보인다. 나아가, 본 발명은 머신러닝을 통해 DP Temra 및 Fitness factor를 기반으로 한 암환자의 예후 예측용 모델을 제공하는 바, 이는 암 치료 분야에서 유용히 활용될 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
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Claims (21)
- 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CD8+ T 세포 아형의 비율을 측정하는 단계를 포함하는, 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측을 위한 정보제공방법으로서,
상기 CD8+ T 세포 아형의 비율은 전체 CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 대비 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포의 비율인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
- 제1항에 있어서,
상기 정보제공방법은 피트니스 인자 (Fitness factor)를 측정하는 단계를 더 포함하고, 상기 피트니스 인자는 하기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법:
(a) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 대비 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포의 비율;
(b) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 대비 CD27- CD28- CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포의 비율;
(c) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 대비 Perforin+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포의 비율;
(d) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 대비 Granzyme B+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포의 비율; 및
(e) 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 대비 IL-2+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포의 비율.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 항암 치료는 면역항암요법, 화학항암요법, 방사선치료요법, 및 화학치료-방사선치료 병용요법으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
- 제3항에 있어서,
상기 면역항암요법은 면역체크포인트 억제제 또는 면역세포 활성제에 의한 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
- 제3항에 있어서,
상기 면역항암요법은 항-PD-L1 치료, 항-PD-1 치료, 항-CTLA-4 치료, 항-LAG3 치료, 항-TIM3 치료, 항-BTLA 치료, 항-4-1BB 치료, 항-OX40 치료, 사이토카인 치료, IL-2 치료, 및 사이토카인 수용체 치료로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
- 제1항에 있어서,
상기 항암 치료는 면역체크포인트 억제제에 의한 치료이고, 상기 정보제공방법이 상기 전체 CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 대비 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포의 비율이 대조군과 비교하여 낮은 경우, 피검체의 예후가 더 좋을 것으로 판정하거나, 항암 치료에 대한 반응성이 더 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함하는, 정보제공방법.
- 제2항에 있어서,
상기 항암 치료는 면역체크포인트 억제제에 의한 치료이고, 상기 정보제공방법이 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 만족하는 경우, 피검체의 예후가 더 좋을 것으로 판정하거나, 항암 치료에 대한 반응성이 더 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함하는, 정보제공방법:
(a) 상기 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 대비 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포의 비율이 대조군과 비교하여 높음; 및
(b) 상기 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 대비 CD27- CD28- CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포의 비율이 대조군과 비교하여 낮음.
- 제2항에 있어서,
상기 항암 치료는 면역체크포인트 억제제에 의한 치료이고, 상기 피검체는 항암 치료를 받기 전의 피검체이며, 상기 정보제공방법이 하기 특징 중 어느 하나 이상을 만족하는 경우 대조군에 비해 피검체의 예후가 더 좋을 것으로 판정하거나, 항암 치료에 대한 반응성이 더 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함하는, 정보제공방법:
(c) 상기 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 대비 Perforin+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포의 비율이 대조군과 비교하여 낮음;
(d) 상기 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 대비 Granzyme B+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포의 비율이 대조군과 비교하여 낮음; 및
(e) 상기 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 대비 IL-2+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포의 비율이 대조군과 비교하여 높음.
- 제1항에 있어서,
상기 항암 치료는 IL-2 치료이고, 상기 피검체는 항암 치료를 받기 전의 피검체이며, 상기 정보제공방법이 전체 CD8+ T 세포 대비 CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포의 비율이 대조군과 비교하여 높은 경우, 피검체의 예후가 더 좋을 것으로 판정하거나, 항암 치료에 대한 반응성이 더 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함하는, 정보제공방법.
- 제2항에 있어서,
상기 항암 치료는 IL-2 치료이고, 상기 정보제공방법이 상기 전체 CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포 대비 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포의 비율이 대조군과 비교하여 낮은 경우, 피검체의 예후가 더 좋을 것으로 판정하거나, 항암 치료에 대한 반응성이 더 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함하는, 정보제공방법.
- 제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 IL-2 치료는 IL-2; 및 항-IL-2 항체 또는 이의 단편의 컨쥬게이트에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
- 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대조군은 정상인 또는 항암 치료 후 완전 관해 또는 부분 관해를 보인 암환자로부터 분리된 생물학적 시료인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
- 제1항에 있어서,
상기 시료는 혈액, 말초혈액, 전혈, 혈장, 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
- 제1항에 있어서,
상기 CD8+ T 세포 아형은 말초혈액 내의 CD8+ T 세포 아형인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
- 제1항에 있어서,
상기 암은 흑색종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신경교종, 간암, 갑상선 종양, 위암, 전립선암, 난소암, 방광암, 폐암, 대장암, 유방암, 호지킨림프종, 요로상피세포암, 교모세포종, 자궁내막암, 자궁경부암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도암종, 두경부암, 중피종, 육종, 담관암, 소장 선암, 소아 악성암, 표피암, 고환암, 혈액암, 및 뇌암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
- CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 및 CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA+ CD8+ T 세포 검출용 제제를 유효성분으로 포함하는, 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측용 조성물.
- 제16항에 있어서,
상기 조성물은 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 CD8+ T 세포 아형 검출용 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물:
CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포;
CD27+ CD28+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포;
CD27- CD28- CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포;
Perforin+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포;
Granzyme B+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포; 및
IL-2+ CCR7- CD45RA- CD8+ T 세포.
- 제16항에 있어서,
상기 제제는 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제16항의 조성물을 포함하는, 암환자의 예후 또는 항암 치료에 대한 반응성 예측용 키트.
- 제19항에 있어서,
상기 키트는 전체 CD8+ T 세포 검출용 제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 제19항에 있어서,
상기 키트는 제1항 또는 제2항의 정보제공방법이 기재된 설명서를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP22784930.4A EP4321625A1 (en) | 2021-04-06 | 2022-04-06 | Method for predicting prognosis and responsiveness to anticancer therapy of cancer patients |
| PCT/KR2022/004909 WO2022216021A1 (ko) | 2021-04-06 | 2022-04-06 | 암환자의 예후 및 항암 치료에 대한 반응성 예측 방법 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210044488 | 2021-04-06 | ||
| KR20210044488 | 2021-04-06 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220042365A KR20220138828A (ko) | 2021-04-06 | 2022-04-05 | 암환자의 예후 및 항암 치료에 대한 반응성 예측 방법 |
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| KR101539098B1 (ko) | 2014-12-15 | 2015-07-23 | 이화여자대학교 산학협력단 | CD302 유전자 프로모터의 CpG 메틸화 변화를 이용한 난소암의 항암제 치료 반응성 예측용 조성물 및 이의 이용 |
-
2022
- 2022-04-05 KR KR1020220042365A patent/KR20220138828A/ko unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101539098B1 (ko) | 2014-12-15 | 2015-07-23 | 이화여자대학교 산학협력단 | CD302 유전자 프로모터의 CpG 메틸화 변화를 이용한 난소암의 항암제 치료 반응성 예측용 조성물 및 이의 이용 |
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