KR20220136212A - Kcnk1 bac-gfp로 형질전환된 동물모델 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 KCNK1 BAC-GFP로 형질전환된 동물모델 및 이의 제조방법 등에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규한 형질전환 동물모델을 통해 KCNK1 유전자의 발현을 GFP의 발현을 관측하여 용이하게 확인할 수 있으며, 신경세포 활성화 의존적 KCNK1 유전자 발현 증가 기전을 확인하였다. 따라서, 본 발명으로 KCNK1 유전자 발현을 조절하는 인자를 스크리닝할 수 있으며, 다양한 뇌 질환의 새로운 치료법을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 KCNK1 BAC-GFP로 형질전환된 동물모델 및 이의 제조방법 등에 관한 것이다.
뇌전증(epilepsy)이란 다양한 원인과 복합적인 발병 과정을 통하여 반복적으로 발작(seizure)이 발생하고, 신경 생물학적, 정신적, 인지적, 사회적 변화를 수반하는 심각한 신경 질환으로, 원인에 따라서 원인을 모르는 특발성 뇌전증(idiopathic epilepsy), 위험인자나 원인이 확인되는 증상뇌전증(symptomatic epilepsy), 위험인자나 원인이 있을 것으로 추정되는 잠재뇌전증(symptomatic epilepsy)으로 나뉜다. 뇌병변을 일으킬 수 있는 다양한 질환이 뇌전증 발생의 위험인자 또는 원인으로, 선천 발달 및 유전질환은 대부분 소아기, 사춘기 및 초기 성인기의 주요 원인이며, 머리외상, 중추신경계 감염 및 뇌종양은 모든 연령에서 뇌전증의 원인이고, 뇌혈관 질환은 60세 이상의 뇌전증에서 가장 흔한 원인으로 알려져 있다. 뇌전증은 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 및 뇌졸중(Stroke)에 이어 세 번째로 흔한 신경계 질환으로, 전 세계적으로 약 6,500만 명이 앓고 있으며 유병률이 1000명 당 2.2명에서 41명으로 보고되고 있으나 보통 4~10명 정도로, 일생 동안 누적 발생률은 약 4.5%에 달한다. 국내의 경우에는 약 30~40만 명의 뇌전증 환자가 있는 것으로 추정되며 인구 1,000명 당 약 4명의 유병률을 보인다.
일반적인 뇌전증의 진단에는 뇌파검사와 뇌 영상 검사가 이용된다. 뇌파검사는 뇌전증의 진단에 있어서 가장 중요한 검사이나 민감도가 낮아 일반적으로 뇌전증 환자가 첫 번째 뇌파검사를 받을 경우 뇌전증파가 기록될 확률은 50%에 지나지 않는다. 뇌전증이 의심되는 환자에서는 일반적으로 3회 정도 검사를 반복하며, 여러 차례 검사를 하더라도 두피에서 기록되는 뇌파검사는 약 20% 정도는 뇌전증파를 기록하지 못한다고 알려져 있다. 또한 정상인의 약 1~2% 정도에서는 뇌전증파와 비슷한 모양의 뇌파가 관찰되는 경우도 있고, 특히 소아에서는 이러한 뇌파에 의해 판독이 어려운 경우가 있다. 뇌 영상 검사, 특히 뇌 자기공명영상 촬영(뇌 MRI)은 뇌전증의 원인을 규명하는데 뇌파검사와 함께 가장 중요한 검사이지만 MRI로 병리적 변화를 발견할 수 있는 확률은 새로 뇌전증을 진단받은 환자에서는 10~30%이고, 난치성 뇌전증 환자에서는 60% 정도로 알려져 있다. 이처럼 현존하는 검사 방법으로 뇌전증이 진단되지 못하는 경우가 존재한다. 또한, 뇌전증의 분자/유전학적 기전의 연구와 뇌전증 약물 치료제 검증에 활용하기 위한 적절한 동물모델이 부족한 실정이다.
형질전환 동물(transgenic animals)이란 인위적으로 외부의 유전자를 삽입하거나 또는 유전자를 제거하여 의도하는 유전형질을 발현시킨 동물을 말하며, 생명체에서의 특정 유전자의 역할을 파악하는 기초연구에 유용하게 쓰일 수 있다. 즉, 연구하고자 하는 유전자를 삽입 또는 결손시키고, 그 영향이 어떻게 나타나는지를 관찰하여 상기 유전자가 매개하는 생리적 기능을 유추할 수 있다. 뿐만 아니라, 형질전환 동물은 사람 질병의 한 모델로서 사용할 수 있고, 질병의 원인이나 질병의 진행과정 등을 파악하거나 잠재적 치료약품의 효과나 부작용을 알아보는데 매우 유용하게 사용되고 있다. 또한, 현재 치매, 암, 심장병, 유전병 등의 질병에 걸린 형질전환 생쥐, 제브라피쉬 등이 개발되고 있다.
본 발명자들은 KCNK1 유전자 발현을 GFP로 손쉽게 확인할 수 있는 형질전환 동물모델을 제작하여, 본 발명의 KCNK1 유전자 발현을 조절하는 인자를 스크리닝하는 시스템 등을 완성하였다.
이에 본 발명의 목적은 KCNK1(Potassium channel subfamily K member 1) 유전자의 프로모터; 및 표지 단백질의 유전자를 포함하는 유전자 세트가 삽입된 BAC 벡터를 포함하는, KCNK1 BAC-GFP 발현 동물모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 KCNK1(Potassium channel subfamily K member 1) 유전자의 프로모터; 및 표지 단백질의 유전자를 포함하는 유전자 세트가 삽입된 BAC 벡터를 배아줄기 세포에 넣는 단계; 및
상기 배아줄기 세포를 암컷 동물에 이식하는 단계를 포함하는, KCNK1 BAC-GFP 발현 동물모델 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 뇌질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다:
(a) KCNK1(Potassium channel subfamily K member 1) 유전자의 프로모터; 및 표지 단백질의 유전자를 포함하는 유전자 세트가 삽입된 BAC 벡터를 포함하는, KCNK1 BAC-GFP 발현 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 동물모델에서 표지 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및
(c) 후보물질 비처리군과 비교하여, 표지 단백질의 발현량이 감소한 경우에, 상기 후보물질을 뇌질환 치료제로 판정하는 단계.
본 발명의 또 다른 목적은 KCNK1 유전자의 프로모터; 및 표지 단백질의 유전자를 포함하는 유전자 세트가 삽입된 BAC 벡터를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 KCNK1(Potassium channel subfamily K member 1) 유전자의 프로모터; 및 표지 단백질의 유전자를 포함하는 유전자 세트가 삽입된 BAC 벡터를 포함하는, KCNK1 BAC-GFP 발현 동물모델을 제공한다.
또한, 본 발명은 KCNK1(Potassium channel subfamily K member 1) 유전자의 프로모터; 및 표지 단백질의 유전자를 포함하는 유전자 세트가 삽입된 BAC 벡터를 배아줄기 세포에 넣는 단계; 및
상기 배아줄기 세포를 암컷 동물에 이식하는 단계를 포함하는, KCNK1 BAC-GFP 발현 동물모델 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 뇌질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) KCNK1(Potassium channel subfamily K member 1) 유전자의 프로모터; 및 표지 단백질의 유전자를 포함하는 유전자 세트가 삽입된 BAC 벡터를 포함하는, KCNK1 BAC-GFP 발현 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 동물모델에서 표지 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및
(c) 후보물질 비처리군과 비교하여, 표지 단백질의 발현량이 감소한 경우에, 상기 후보물질을 뇌질환 치료제로 판정하는 단계.
또한, 본 발명은 KCNK1 유전자의 프로모터; 및 표지 단백질의 유전자를 포함하는 유전자 세트가 삽입된 BAC 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 유전자 세트는 KCNK1 유전자의 시작 코돈 앞에 삽입되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서 상기 유전자 세트는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 KCNK1 유전자는 치아이랑에서 발현하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 표지 단백질은 GFP(Green fluorescent protein), YFP(Yellow fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein), CFP(Cyan fluorescent protein), DsRed, AsRed, AmCyan, ZsGreen, ZsTellow, mApple, mTagBFP2, 및 mCherry로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 BAC 벡터의 크기는 100 내지 350kb 인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 표지 단백질의 발현이 증가하는 것은 KCNK1 유전자의 발현의 증가를 의미하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 동물모델은 신경세포가 과활성되면 KCNK1 유전자의 발현이 증가하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 뇌질환은 뇌전증, 파킨슨씨병, 알츠하이머, 우울증, 및 조울증으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 신규한 형질전환 동물모델을 통해 KCNK1 유전자의 발현을 GFP의 발현을 관측하여 용이하게 확인할 수 있으며, 신경세포 활성화 의존적 KCNK1 유전자 발현 증가 기전을 확인하였다. 따라서, 본 발명으로 KCNK1 유전자 발현을 조절하는 인자를 스크리닝할 수 있으며, 다양한 뇌 질환의 새로운 치료법을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 형질전환 생쥐 제작에 사용한 유전자 컨스트럭트(gene construct)의 개념도를 나타낸 것이다.
도 2는 전체 뇌조직 수준과 세부 뇌조직 수준에서 GFP 발현을 분석하는 two-track 조직학적 분석 기법을 나타낸 것이다.
도 3a는 치아이랑(DG)에서 GFP를 발현하는 세포가 KCNK1(TWIK-1)을 함께 발현하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다(Scale bar는 각 200μm, 50μm).
도 3b는 GFP가 발현하는 뇌의 다른 조직 LEC(Lateral entorhinal cortex) 에서 GFP를 발현하는 세포가 KCNK1(TWIK-1)을 함께 발현하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다(Scale bar는 각 200μm, 50μm).
도 4a는 형질전환 생쥐의 GFP 발현의 결과를 나타낸 것이다(Scale bar는 각 1000μm, 200μm).
도 4b는 세포 마커와 함께 면역조직염색기법(IHC; imuunohistochemistry)을 사용하여 GFP 발현 세포를 확인한 결과를 나타낸 것이다(NeuN, 신경세포 마커; GAD67, 억제성 신경세포 마커; Scale bar 는 200μm).
도 5a는 정상 생쥐의 뇌조직에서 형광제자리혼성화(fluorescence in situ hybridization, FISH)를 사용하여 KCNK1 mRNA발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다(Scale bar는 100μm).
도 5b는 정상 생쥐의 뇌조직에서 면역조직염색기법(IHC; imuunohistochemistry)을 사용하여 TWIK-1 단백질 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다(Scale bar는 200μm).
도 6은 형질전환 생쥐의 뇌의 치아이랑(DG; dentate gyrus)에서 카이닌산 여부에 따른 GFP 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다(Scale bar는 각 1000μm, 200μm).
도 7a은 생쥐의 뇌의 치아이랑에 카이닌산 또는 생리식염수를 주사하는 도식도를 나타낸 것이다.
도 7b는 쥐의 뇌의 치아이랑에서 카이닌산 여부에 따른 GFP 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다(Scale bar는 200μm).
도 8a는 화학유전학적 기법인 AAV-hSyn-hM3d(Gq)-mCherry 바이러스를 본 발명의 형질전환생쥐의 치아이랑 부위에 주입시키는 실험 계획 및 바이러스 주입 위치를 나타낸 것이다.
도 8b는 형질전환생쥐에서 바이러스가 도입된 치아이랑과 반대쪽 치아이랑에서 IHC를 사용하여 GFP, mCherry, c-fos 발현을 확인한 이미지; 치아이랑의 과립 신경세포층(Granule cell layer)에서의 c-fos-positive 세포의 밀도를 정량화한 그래프; 및 평균 GFP 발현을 정량화한 그래프를 나타낸 것이다.
도 2는 전체 뇌조직 수준과 세부 뇌조직 수준에서 GFP 발현을 분석하는 two-track 조직학적 분석 기법을 나타낸 것이다.
도 3a는 치아이랑(DG)에서 GFP를 발현하는 세포가 KCNK1(TWIK-1)을 함께 발현하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다(Scale bar는 각 200μm, 50μm).
도 3b는 GFP가 발현하는 뇌의 다른 조직 LEC(Lateral entorhinal cortex) 에서 GFP를 발현하는 세포가 KCNK1(TWIK-1)을 함께 발현하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다(Scale bar는 각 200μm, 50μm).
도 4a는 형질전환 생쥐의 GFP 발현의 결과를 나타낸 것이다(Scale bar는 각 1000μm, 200μm).
도 4b는 세포 마커와 함께 면역조직염색기법(IHC; imuunohistochemistry)을 사용하여 GFP 발현 세포를 확인한 결과를 나타낸 것이다(NeuN, 신경세포 마커; GAD67, 억제성 신경세포 마커; Scale bar 는 200μm).
도 5a는 정상 생쥐의 뇌조직에서 형광제자리혼성화(fluorescence in situ hybridization, FISH)를 사용하여 KCNK1 mRNA발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다(Scale bar는 100μm).
도 5b는 정상 생쥐의 뇌조직에서 면역조직염색기법(IHC; imuunohistochemistry)을 사용하여 TWIK-1 단백질 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다(Scale bar는 200μm).
도 6은 형질전환 생쥐의 뇌의 치아이랑(DG; dentate gyrus)에서 카이닌산 여부에 따른 GFP 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다(Scale bar는 각 1000μm, 200μm).
도 7a은 생쥐의 뇌의 치아이랑에 카이닌산 또는 생리식염수를 주사하는 도식도를 나타낸 것이다.
도 7b는 쥐의 뇌의 치아이랑에서 카이닌산 여부에 따른 GFP 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다(Scale bar는 200μm).
도 8a는 화학유전학적 기법인 AAV-hSyn-hM3d(Gq)-mCherry 바이러스를 본 발명의 형질전환생쥐의 치아이랑 부위에 주입시키는 실험 계획 및 바이러스 주입 위치를 나타낸 것이다.
도 8b는 형질전환생쥐에서 바이러스가 도입된 치아이랑과 반대쪽 치아이랑에서 IHC를 사용하여 GFP, mCherry, c-fos 발현을 확인한 이미지; 치아이랑의 과립 신경세포층(Granule cell layer)에서의 c-fos-positive 세포의 밀도를 정량화한 그래프; 및 평균 GFP 발현을 정량화한 그래프를 나타낸 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 신규한 형질전환 생쥐를 제작하고, 해마의 치아이랑에서 GFP 발현이 가장 높은 것을 확인하였고, GFP 발현이 KCNK1 유전자의 발현을 의미한다는 것을 확인하였다(실시예 1 및 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명의 형질전환 생쥐를 이용하여 카이닌산이 KCNK1 유전자의 발현을 증가시키며, GFP 발현도 증가시킴을 확인하였다(실시예 3 내지 5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명의 형질전환 생쥐를 이용하여 신경세포 활성화 의존적 KCNK1 유전자 발현 증가 기전을 확인하였다(실시예 6 참조).
본 발명자들은 KCNK1(Potassium channel subfamily K member 1) 유전자의 프로모터; 및 표지 단백질의 유전자를 포함하는 유전자 세트가 삽입된 BAC 벡터를 포함하는, KCNK1 BAC-GFP 발현 동물모델을 제공한다.
또한, KCNK1(Potassium channel subfamily K member 1) 유전자의 프로모터; 표지 단백질의 유전자를 포함하는 유전자 세트; 및 KCNK1 유전자가 삽입된 BAC 벡터를 포함하는, KCNK1 BAC-GFP 발현 동물모델을 제공한다.
본 발명에 있어서, “KCNK1(Potassium channel subfamily K member 1)”은 TWIK1(tandem of P domains in a weak inward rectifier K channel 1)이라고도 하며, 뇌 내 포타슘 농도를 조절하는 주요 막단백질군 중 하나인 K2P family 의 하나로서, potassium(K) 이온통로이다. 상기 potassium(K) 이온통로(칼륨 이온통로)는 신경세포의 흥분성을 조절하는 방면에서 중요한 작용을 한다. 이의 이온기초는 세포 내 칼륨 이온 농도가 세포 외 칼륨 이온 농도보다 높고 막전위 탈분극에 의해 통로를 활성화시킨 후, 양전하를 띤 칼륨 이온은 밖으로 흐르고, 막전위는 이로 인해 음전하를 띠고(재분극 또는 과분극), 세포 흥분성은 하강되는 것이다. 상기 KCNK1 유전자는 치아이랑에서 발현할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “치아이랑(Dentate gyrus)”은 뇌 해마(Hippocampus)의 내부 영역으로, 해마 외부의 후각뇌피질(Entorhinal cortex) 영역으로부터 신경입력을 받아 해마 내부의 다른 영역인 CA3(cornu Ammonis 3)로 신경출력을 내보내는 역할을 한다. 또한 상기 치아이랑은 학습과 기억, 스트레스에 의한 우울증 유발 등의 과정에 관여한다.
본 발명에 있어서, “BAC(bacterial artificial chromosome)”는 분자 생물 실험에서 사용되는 DNA 구조물이다. 이는 벡터로서 형질전환이나 클로닝 등에 이용될 수 있다. 플라스미드에 비해 더 큰 DNA 절편을 운반할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자 세트는 2개 이상의 유전자가 모여있는 집합을 의미하는 것으로, 본 발명의 일 실시예에서는 KCNK1(Potassium channel subfamily K member 1) 유전자의 프로모터; 및 표지 단백질의 유전자을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 유전자 세트는 KCNK1 유전자의 시작 코돈 앞에 삽입될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 유전자 세트는 Poly A 서열, 및 항생제 저항성 유전자를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 항생제 저항성 유전자는 엠피실린(ampicillin), 네오마이신(Neomycin, G418), 푸로마이신(Puromycin), 반코마이신(Vancomycin), 메티실린 (Methicillin), 또는 히그로마이신(Hygromycin) 항생제에 저항성을 가진 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 세트는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, 상기 BAC 벡터의 크기는 100 내지 350kb, 100 내지 300kb, 100 내지 280kb, 100 내지 260kb, 100 내지 240kb, 100 내지 220kb, 150 내지 350kb, 150 내지 300kb, 150 내지 280kb, 150 내지 260kb, 150 내지 240kb, 150 내지 220kb, 200 내지 350kb, 200 내지 300kb, 200 내지 280kb, 200 내지 260kb, 200 내지 240kb, 200 내지 220kb, 또는 210 kb일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 표지 단백질은 GFP(Green fluorescent protein), YFP(Yellow fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein), CFP(Cyan fluorescent protein), DsRed, AsRed, AmCyan, ZsGreen, ZsTellow, mApple, mTagBFP2, 및 mCherry로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 표지 단백질의 발현이 증가하는 것은 KCNK1 유전자의 발현의 증가를 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 동물모델은 신경세포가 과활성되면 KCNK1 유전자의 발현이 증가하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 KCNK1(Potassium channel subfamily K member 1) 유전자의 프로모터; 및 표지 단백질의 유전자를 포함하는 유전자 세트가 삽입된 BAC 벡터를 배아줄기 세포에 넣는 단계; 및
상기 배아줄기 세포를 암컷 동물에 이식하는 단계를 포함하는, KCNK1 BAC-GFP 발현 동물모델 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 뇌질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) KCNK1(Potassium channel subfamily K member 1) 유전자의 프로모터; 및 표지 단백질의 유전자를 포함하는 유전자 세트가 삽입된 BAC 벡터를 포함하는, KCNK1 BAC-GFP 발현 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 동물모델에서 표지 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및
(c) 후보물질 비처리군과 비교하여, 표지 단백질의 발현량이 감소한 경우에, 상기 후보물질을 뇌질환 치료제로 판정하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 측정은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다
본 발명에 있어서, 상기 후보 물질은 KCNK1 유전자의 발현 수준이 정상 수준으로 회복되는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 후보물질은 화학물질, 펩타이드, 단백질, 항체 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 뇌질환은 뇌전증, 파킨슨씨병, 알츠하이머, 우울증, 및 조울증으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 “뇌전증”은 뇌의 비정상적인 과흥분과 과동기화로 인해 신경세포 중 일부가 짧은 시간에 과도한 전기를 발생시켜 반복적으로 발작(seizure)이 발생하는 만성화된 질환군으로, 신경생물학적, 정신적, 인지적, 사회적 변화를 수반하는 심각한 신경 질환이다. 또한, 신경세포의 비정상적 과다흥분성 (hyperexcitability)에 의한 흥분독성(excitotoxicity)이 유발되어 뇌전증에 의한 병리학적 손상이 잘 나타나는 대뇌 부위 중 해마(hippocampus) 내에서 해마경화증(hippocampal sclerosis), 교질화(gliosis), 비정상적 신경 발생(abnormal neurogenesis)과 치아이랑 과립세포 비정상적 세포구축(cytoarchitectural abnormality of dentate granule cells), 및 이상시냅스회로 형성(aberrant synpatic circuit)등이 나타난다. 상기와 같이, 해마 내 병리학적 현상들이 진행됨으로서 만성 뇌전증 발작(chronic epileptic seizure)이 발생되고 인지 및 기억 장애뿐만 아니라 약물 치료에 반응하지 않는 약제불응성 난치성 뇌전증이 발생된다.
본 발명에 있어서, 상기 “우울증”은 감정을 조절하는 뇌의 기능에 변화가 생겨 부정적인 감정이 나타나는 병으로, 정확한 발병 원인은 밝혀지지 않았으며, 세로토닌 및 멜라토닌을 비롯하여 도파민, 노르에피네프린 등 신경과 관련된 여러 가지 호르몬이 우울증에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 동물은 인간을 제외하고 케이지 안에서 사육할 수 있는 동물이라면 제한되지 아니하며, 설치류, 토끼, 및 원숭이 등을 포함하나, 바람직하게는 실험용 쥐(mouse 및 rat)일 수 있다. 설치류에 속하는 쥐는 동물실험에 가장 많이 이용되는 것으로서, 특히 실험용 쥐는 마우스(mus musculus: mouse) 및 래트(rattus norvegicus: rat) 등이 있으며, 기르기 쉽고, 번식이 빠르며, 가격이 저렴하다는 점에서 실험동물로서 유리하다. 본 발명에서 실험용 쥐는 마우스와 래트을 포함하는 의미로 사용되며, 본 명세서에서 실험용 쥐는 생쥐라고 호칭한다.
또한, 본 발명은 KCNK1 유전자의 프로모터; 및 표지 단백질의 유전자를 포함하는 유전자 세트가 삽입된 BAC 벡터를 제공한다.
즉, 본 발명에 따른 형질전환 생쥐는 KCNK1 유전자 발현을 조절하는 인자를 손쉽게 스크리닝할 수 있는 이상적인 동물모델로서, KCNK1과 관련된 뇌질환 연구를 위한 유용한 동물모델로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 동물모델을 활용하여 뇌질환 치료 약물을 스크리닝하고, 이를 검증하는 것에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. KCNK1 BAC-GFP 형질전환 생쥐의 제작
KCNK1(Potassium channel subfamily K member 1)의 유전자 발현을 녹색형광단백질(GFP; Green fluorescent protein)의 형광빛으로 관측할 수 있는 형질전환 생쥐를 제작하였다. 구체적으로, TWIK-1(KCNK1) 유전자좌(GENSAT1-BX1474, Entrez Gene ID: 16525)를 덮는 변형된 BAC 클론은 BACPAC 리소스 센터에서 구입하였다. GENSAT 홈페이지에 자세히 설명된 대로 변형된 BAC 벡터(GENSAT1-BX1474)는 BAC 벡터(RP23-385E8)를 재조합하여 생성하였다. 구체적으로, KCNK1 단백질의 시작 코돈(starting codon) 바로 앞에 녹생형광단백질(GFP) 유전자; polyA 서열; 및 재조합 유전자 선별을 위한 항생제 발현 유전자로 이루어진 유전자 세트를 삽입함으로써, KCNK1 유전자의 발현 조절 조건에 따라 GFP가 대신 발현할 수 있는 변형된 BAC 벡터(GENSAT1-BX1474)를 생성하였다. 그 후, 변형된 BAC DNA를 Large-Construct Kit(Qiagen, Cat#; 12462, Germantown MD, USA)를 사용하여 정제하고, P1-Sce1 소화에 의해 선형화하였다. 그 후, 이를 C57BL/6N 암컷에서 채취한 ES 세포(embryonic stem cell)에 전핵주사하였다. 그런 다음, 수정란을 가임신한 C57BL6/N 암컷(오리엔트바이오, 성남시)에 이식하여 KCNK1의 유전자 발현 조절에 상응하여 녹색형광단백질(GFP)을 발현하는 형질전환 생쥐를 제작하였다. 도 1에 KCNK1-GFP BAC 벡터의 개략도를 나타내었다. 또한, 상기 유전자 세트의 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
| 유전자 세트 | 서열(5'-3') |
| ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGCCCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGACGACTAGTGCGGTAAATAGCAATAAATTGGCCTTTTTTATCGGCAAGCTCTTTTAGGTTTTTCGCATGTATTGCGATATGCATAAACCAGCCATTGAGTAAGTTTTTAAGCACATCATCATCATAAGCTTTAAGTTGGTTCTCTTGGATCAATTTGCTGACAATGGCGTTTACCTTACCAGTAATGTATTCAAGGCTAATTTTTTCAAGTTCATTCCAACCAATGATAGGCATCACTTCTTGGATAGGGATAAGGTTTTTATTATTATCAATAATATAATCAAGATAATGTTCAAATATACTTTCTAAGGCAGACCAACCATTTGTTAAATCAGTTTTTGTTGTGATGTAGGCATCAATCATAATTAATTGCTGCTTATAACAGGCACTGAGTAATTGTTTTTTATTTTTAAAGTGATGATAAAAGGCACCTTTGGTCACCAACGCTTTTCCCGAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTCCCATGTCAGCCGTTAAGTGTTCCTGTGTCACTCAAAATTGCTTTGAGAGGCTCTAAGGGCTTCTCAGTGCGTTACATCCCTGGCTTGTTGTCCACAACCGTTAAACCTTAAAAGCTTTAAAAGCCTTATATATTCTTTTTTTTCTTATAAAACTTAAAACCTTAGAGGCTATTTAAGTTGCTGATTTATATTAATTTTATTGTTCAAACATGAGAGCTTAGTACGTGAAACATGAGAGCTTAGTACGTTAGCCATGAGAGCTTAGTACGTTAGCCATGAGGGTTTAGTTCGTTAAACATGAGAGCTTAGTACGTTAAACATGAGAGCTTAGTACGTGAAACATGAGAGCTTAGTACGTACTATCAACAGGTTGAACTGCTGATCTTCAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGATCGCGGCCCGGCGCG |
실시예 2. 형질전환 생쥐의 뇌조직에서 녹색형광단백질(GFP) 발현 분석
본 발명의 형질전환 생쥐의 뇌에서 GFP 발현을 분석하기 위하여, 도 2와 같이 전체 뇌조직 수준과 세부 뇌조직 수준에서 GFP 발현을 분석하는 two-track 조직학적 분석 기법을 사용하여 분석하였다. 구체적으로, KCNK1 BAC-GFP 형질전환 생쥐에서 GFP 발현을 체계적으로 분석하기 위해 거시적 해상도에서 미시적 해상도를 포함한 실험 파이프라인을 구축하였다. 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
표 2에 나타난 바와 같이, 생쥐의 뇌 내 부위 중 특히 해마의 치아이랑(Hippocampal dentate gyrus) 부위에서 GFP 발현이 가장 높은 것을 확인하였다.
또한, 형질전환 생쥐의 뇌 내 GFP 발현과 KCNK1(TWIK-1) 발현의 유사성을 검증하였다. 그 결과는 도 3a 및 3b에 나타내었다.
도 3a 및 3b에 나타난 바와 같이, 치아이랑(DG; Dentate gyrus)에서 GFP를 발현하는 세포가 KCNK1(TWIK-1)을 함께 발현하고 있음을 확인하였다. 또한, GFP가 발현하는 뇌의 다른 조직인 LEC(Lateral entorhinal cortex)에서 GFP를 발현하는 세포가 KCNK1(TWIK-1)을 함께 발현하고 있음을 확인하였다. 이는 GFP 발현이 KCNK1 유전자 발현을 대신 보여줄 수 있음을 의미한다.
또한, 치아이랑에서 GFP를 발현하는 세포의 종류를 면역조직염색기법(imuunohistochemistry, IHC) 등을 통하여 확인하였다. 구체적으로, 뇌 조각을 실온에서 20분 동안 PBS로 세척한 다음, 85℃에서 30분 동안 10mM 시트르산나트륨 완충액으로 antigen retrieval 하였다. 그 후, 슬라이스를 PBS로 세척하고, PBS 중 0.4% Triton X-100으로 실온에서 20분 동안 투과화하였다. 그런 다음, 슬라이스를 PBS 중 10% 당나귀 혈청 및 0.1% Triton X-100으로 실온에서 3시간 동안 차단한 다음 4℃에서 PBS 중 1차 항체[chicken anti-GFP(Abcam, Cat#; ab136970, 1:300); rabbit anti-TWIK-1(Alomone labs, Cat#; APC-10, 1:200); mouse anti-NeuN(Abcam, Cat#; ab104224, 1:100); rabbit anti-GAD67(GeneTex, Cat#; GTX113190, 1:300)], 5% 당나귀 혈청 및 0.1% Triton X-100과 함께 16시간 동안 인큐베이션하였다. 0.1% Triton X-100으로 실온에서 15분 동안 3회 세척한 후, PBS 중 2차 항체[647-conjugated secondary antibodies (Jackson ImmunoResearch, 1:300)], 5% 당나귀 혈청, 및 0.1% Triton X-100에 4℃에서 2시간 동안 두었다. 그 후, 슬라이스를 DAPI로 대조염색하고 VECTASHIELD 변색 방지 장착 매체(VECTASHIELD antifade mounting media, Vector Laboratories, Cat#; H-1000, Burlingame CA, USA)로 장착하였다. 거시적 이미지 데이터는 ZEISS Axio Scan.Z1 slide scanner(Carl Zeiss, RRID; SCR_020927, Oberkochen, Germany)으로 얻었으며, 현미경 이미지 데이터는 Nikon Eclipse Ti2 공초점 현미경(Nikon, RRID; SCR_021068, Tokyo, Japan)으로 얻었다. 그 결과는 도 4a 및 4b에 나타었다.
도 4a 및 4b에 나타난 바와 같이, 형질전환 생쥐의 치아이랑(Dentate gyrus)에서 GFP 발현이 확인되었고, GFP 발현 세포는 과립신경세포층(granule cell layer)에서 확인되었다. 또한, 상기 세포가 흥분성 신경세포(NeuN+GAD67-)임을 확인하였다.
실시예 3. 정상 생쥐 뇌조직에서 카이닌산(Kainic acid)에 의한 KCNK1의 유전자 발현 변화 확인
카이닌산(Kainic acid)은 신경세포의 과도한 활성을 일으켜 뇌전증으로 인한 세포손상을 일으키는 약물이다. 이에, 정상 생쥐에서 카이닌산에 의한 KCNK1의 유전자 발현 변화를 확인하였다. 구체적으로, 정상 생쥐에 카이닌산 또는 생리식염수(Saline)를 정맥주사한 후, 뇌조직에서 KCNK1 mRNA의 발현을 형광제자리혼성화(FISH; fluorescence in situ hybridization)를 통하여 확인하였다. 더 구체적으로, FISH는 RNAscope Fluorescent Multiplex Kit(Advanced Cell Diagnostics, RRID; SCR_012481, CA, USA) 및 Kcnk1-C1 probe (Advanced Cell Diagnostics, Cat#; ACD 535421, CA, USA)을 사용하여 제조지침에 따라 수행하였다. 또한, TWIK-1 단백질의 양을 면역조직염색기법(IHC; imuunohistochemistry)을 통하여 확인하였다. 그 결과는 도 5a 및 5b에 나타내었다.
도 5a 및 5b에 나타난 바와 같이, 카이닌산 처리군에서 생리식염수 처리군에 비하여 유의하게 KCNK1 mRNA 발현량 및 TWIK-1 단백질 활성이 증가하였음을 확인하였다.
실시예 4. 형질전환 생쥐 뇌조직에서 카이닌산(Kainic acid)에 의한 KCNK1의 유전자 발현 변화 확인
실시예 3과 같은 방법으로 형질전환 생쥐에 카이닌산 또는 생리식염수(Saline)를 정맥주사한 후, GFP 발현을 확인하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 카이닌산 처리군에서 생리식염수 처리군에 비하여, 생쥐 뇌의 해마조직 내 치아이랑의 GFP 발현이 증가하였음을 확인하였다.
실시예 5. 치아이랑에 카이닌산을 직접 처리한 경우, KCNK1 유전자 발현 변화 확인
생쥐 뇌의 해마조직 내에 치아이랑에 카이닌산 또는 생리식염수를 직접 주사한 후, GFP 발현을 확인하였다. 그 결과는 도 7a 및 7b에 나타내었다.
도 7a 및 7b에 나타난 바와 같이, 치아이랑에 카이닌산을 처리한 군이 생리식염수를 처리한 군에 비하여 GFP 발현이 유의하게 증가하였음을 확인하였다. 이는 치아이랑 과립신경세포의 KCNK1 유전자 발현의 증가는 카이닌산 약물에 의한 직접적 효과임을 의미한다.
실시예 6. 형질전환 생쥐에서 신경세포 활성화 의존적 KCNK1 유전자 발현 확인
카이닌산은 신경세포의 과도한 활성으로 뇌전증으로 인한 세포손상을 일으키는 바, 신경세포 과활성 자체가 KCNK1 유전자 발현을 증가시키는 신규 요소인지를 확인하였다. 화학유전학적 기법을 이용한 hM3d(Gq) 시스템은 CNO(clozapine N-oxide) 약물처리에 의해 세포내 칼슘의 양을 증가시킴으로써 신경세포의 활성을 선택적으로 증가시킬 수 있다. 구체적으로, hM3d(Gq)를 발현시키는 아데노 연관 바이러스(AAV; adeno-associated virus)를 본 발명의 형질전환 생쥐의 치아이랑의 한 쪽 부위에 도입하여 발현시킨 후, CNO 약물을 5일 동안 투여하여 hM3d(Gq)이 도입된 치아이랑 과립신경세포를 선택적으로 활성화시켰다. 그 후, 신경세포 활성 표적단백질인 c-fos의 활성 여부를 확인하여 치아이랑 과립신경세포의 과활성화를 확인하였고, 활성화된 과립신경세포에서 GFP 활성 증가를 확인하였다. 그 결과는 도 8a 및 8b에 나타내었다.
도 8a 및 8b에 나타난 바와 같이, 바이러스가 도입된 치아이랑에서 바이러스가 도입되지 않은 치아이랑에 비하여, c-fos-positive 신경세포의 숫자 및 GFP 발현이 증가하였다. 즉, 신경세포의 과활성화 자체만으로도 KCNK1 유전자 발현을 증가시킬 수 있음을 확인한 것이다. 이는 신경세포 활성화 의존적 KCNK1 유전자 발현 증가 기전이 존재하는 것을 의미한다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
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aagttggttc tcttggatca atttgctgac aatggcgttt accttaccag taatgtattc 1200
aaggctaatt ttttcaagtt cattccaacc aatgataggc atcacttctt ggatagggat 1260
aaggttttta ttattatcaa taatataatc aagataatgt tcaaatatac tttctaaggc 1320
agaccaacca tttgttaaat cagtttttgt tgtgatgtag gcatcaatca taattaattg 1380
ctgcttataa caggcactga gtaattgttt tttattttta aagtgatgat aaaaggcacc 1440
tttggtcacc aacgcttttc ccgagatcct ctacgccgga cgcatcgtgg ccggcatcac 1500
cggcgccaca ggtgcggttg ctggcgccta tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg 1560
ggctcgccac ttcgggctca tgagcgcttg tttcggcgtg ggtatggtgg caggccccgt 1620
ggccgggggc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct 1680
cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg 1740
cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag 1800
cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat 1860
aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 1920
gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 1980
gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 2040
cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 2100
gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 2160
gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctgca 2220
ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 2280
tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 2340
ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 2400
cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 2460
accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaaca 2520
cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 2580
tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 2640
cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 2700
acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 2760
atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 2820
tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 2880
aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 2940
cgtatcacga ggccctttcg tcttcaagaa ttcccatgtc agccgttaag tgttcctgtg 3000
tcactcaaaa ttgctttgag aggctctaag ggcttctcag tgcgttacat ccctggcttg 3060
ttgtccacaa ccgttaaacc ttaaaagctt taaaagcctt atatattctt ttttttctta 3120
taaaacttaa aaccttagag gctatttaag ttgctgattt atattaattt tattgttcaa 3180
acatgagagc ttagtacgtg aaacatgaga gcttagtacg ttagccatga gagcttagta 3240
cgttagccat gagggtttag ttcgttaaac atgagagctt agtacgttaa acatgagagc 3300
ttagtacgtg aaacatgaga gcttagtacg tactatcaac aggttgaact gctgatcttc 3360
agatcctcta cgccggacgc atcgtggccg gatcgcggcc cggcgcg 3407
Claims (12)
- KCNK1(Potassium channel subfamily K member 1) 유전자의 프로모터; 및 표지 단백질의 유전자를 포함하는 유전자 세트가 삽입된 BAC 벡터를 포함하는, KCNK1 BAC-GFP 발현 동물모델.
- 제1항에 있어서,
상기 유전자 세트는 KCNK1 유전자의 시작 코돈 앞에 삽입되는 것을 특징으로 하는, KCNK1 BAC-GFP 발현 동물모델.
- 제1항에 있어서,
상기 유전자 세트는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는, KCNK1 BAC-GFP 발현 동물모델.
- 제1항에 있어서,
상기 KCNK1 유전자는 치아이랑에서 발현하는 것을 특징으로 하는, KCNK1 BAC-GFP 발현 동물모델.
- 제1항에 있어서,
상기 표지 단백질은 GFP(Green fluorescent protein), YFP(Yellow fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein), CFP(Cyan fluorescent protein), DsRed, AsRed, AmCyan, ZsGreen, ZsTellow, mApple, mTagBFP2, 및 mCherry로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, KCNK1 BAC-GFP 발현 동물모델.
- 제1항에 있어서,
상기 BAC 벡터의 크기는 100 내지 350kb인 것을 특징으로 하는, KCNK1 BAC-GFP 발현 동물모델.
- 제1항에 있어서,
상기 표지 단백질의 발현이 증가하는 것은 KCNK1 유전자의 발현의 증가를 의미하는 것을 특징으로 하는, KCNK1 BAC-GFP 발현 동물모델.
- 제1항에 있어서,
상기 동물모델은 신경세포가 과활성되면 KCNK1 유전자의 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는, KCNK1 BAC-GFP 발현 동물모델.
- KCNK1(Potassium channel subfamily K member 1) 유전자의 프로모터; 및 표지 단백질의 유전자를 포함하는 유전자 세트가 삽입된 BAC 벡터를 배아줄기 세포에 넣는 단계; 및
상기 배아줄기 세포를 암컷 동물에 이식하는 단계를 포함하는, KCNK1 BAC-GFP 발현 동물모델 제조방법.
- 하기 단계를 포함하는 뇌질환 치료제의 스크리닝 방법:
(a) KCNK1(Potassium channel subfamily K member 1) 유전자의 프로모터; 및 표지 단백질의 유전자를 포함하는 유전자 세트가 삽입된 BAC 벡터를 포함하는, KCNK1 BAC-GFP 발현 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 동물모델에서 표지 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및
(c) 후보물질 비처리군과 비교하여, 표지 단백질의 발현량이 감소한 경우에, 상기 후보물질을 뇌질환 치료제로 판정하는 단계.
- 제10항에 있어서,
상기 뇌질환은 뇌전증, 파킨슨씨병, 알츠하이머, 우울증, 및 조울증으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 뇌질환 치료제의 스크리닝 방법.
- KCNK1 유전자의 프로모터; 및 표지 단백질의 유전자를 포함하는 유전자 세트가 삽입된 BAC 벡터.
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| KR20180065657A (ko) * | 2016-12-08 | 2018-06-18 | 경북대학교 산학협력단 | 삼중 리포터 유전자 발현 동물모델 |
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| KR20190129703A (ko) * | 2018-05-11 | 2019-11-20 | 고려대학교 산학협력단 | 별아교세포 특이적 수동전도도 억제약물의 스크리닝 시스템 및 이의 활용 |
| KR102210530B1 (ko) | 2019-06-20 | 2021-02-01 | 메디사피엔스 주식회사 | 뇌전증의 진단 마커 및 이의 용도 |
-
2022
- 2022-03-28 KR KR1020220038407A patent/KR102692859B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Cells vol10, 2751(2021.10.14., https://doi.org/10.3390/cells10102751) * |
| Molecular Brain vol.7 no.80 doi: 10.1186/s13041-014-0080-z.(2014) * |
| Sci Rep vol.9 no.1 pp.15603(2019) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102692859B1 (ko) | 2024-08-07 |
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