KR20220134830A - Fibrinogen-based 3dimensional spheroid cell sheet, and method for preparing thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 피브리노젠을 기반으로 한 3차원 스페로이드 세포 시트 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 상세하게는 3차원 구조의 스페로이드 세포를 포함하는 세포 배양액에 피브리노젠을 첨가하여 간단한 방법으로 3차원 스페로이드 세포 시트를 얻을 수 있는 피브리노젠을 기반으로 한 3차원 스페로이드 세포 시트 및 이의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet and a method for manufacturing the same, and more particularly, by adding fibrinogen to a cell culture medium containing spheroid cells having a three-dimensional structure in a simple way It relates to a fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet capable of obtaining a three-dimensional spheroid cell sheet and a manufacturing method thereof.
종래 세포를 이식하기 위해서는 화학적 혹은 물리적 방법을 이용했으며, 화학적 방법은 트립신(trypsin)과 같은 효소에 의한 단백질 분해(enzymatic proteolysis)로 인해 ECMs, 세포-세포 간 결합(cell-cell junction), 막 단백질(membrane protein) 등이 분해된다는 단점이 있다. 또한, 물리적 방법은 세포 결합, ECM의 손상으로 인해 세포 활성이 낮아지는 문제가 있었다.Conventionally, chemical or physical methods were used to transplant cells, and the chemical methods are ECMs, cell-cell junctions, and membrane proteins due to enzymatic proteolysis by enzymes such as trypsin. (membrane protein), etc. has a disadvantage that it is degraded. In addition, the physical method had a problem in that cell activity was lowered due to cell binding and damage to the ECM.
이러한 한계점을 해결하기 위해 Okano 교수팀이 세포 시트 공학(cell sheet engineering)을 제안했다. 상기 세포 시트 공학은 온도 감응성 고분자인 Poly(N-sopropylacrylamide)(PNIPAAm)로 코팅한 배양 접시에 세포를 배양시킨 후, 온도를 낮추어 온도 감응성 고분자의 소수성(hydrophobic) 상태를 친수성(hydrophilic) 상태로 변화시키는, 표면매질의 상태를 변화시키는 특성을 이용한다. 이런 과정으로 PNIPAAm과 세포 표면 사이의 결합이 감소되어 배양 접시로부터 분리되고 ECM, cell junction, membrane protein이 보존된 세포시트를 얻는 기술이다.To solve this limitation, Professor Okano's team proposed cell sheet engineering. The cell sheet engineering changes the hydrophobic state of the temperature-sensitive polymer to a hydrophilic state by culturing the cells in a culture dish coated with Poly(N-sopropylacrylamide) (PNIPAAm), which is a temperature-sensitive polymer, and then lowering the temperature. It uses the property of changing the state of the surface medium. In this process, the binding between PNIPAAm and the cell surface is reduced, so it is separated from the culture dish, and it is a technology to obtain a cell sheet in which ECM, cell junction, and membrane protein are preserved.
그러나, 이러한 온도감응성 고분자를 배양 접시에 코팅하기 위해서는 전자 빔(electron beam), 기상 중합(vapor phase polymerization)을 위한 기기 등 고가의 특수 장비를 사용하기 때문에, 이를 이용해 상업용으로 시판된 배양 접시 또한 고가라는 문제가 있다. 또한, 여러 종류의 폴리머를 사용하는 과정 등 복잡한 화학적 과정도 추가되어야 하고, 온도 감응성 재료가 코팅되어 시판되는 배양 접시는 크기와 모양에 획일화되어 있어, 이식 부위를 고려한 다양한 형태를 가지는 세포 시트를 제작하는 데는 한계가 있다. However, in order to coat such a temperature-sensitive polymer on a culture dish, expensive special equipment such as an electron beam or a device for vapor phase polymerization is used, so commercial culture dishes using this are also expensive. there is a problem that In addition, complex chemical processes such as the use of several types of polymers must be added, and the commercially available culture dishes coated with temperature-sensitive materials are uniform in size and shape. There are limits to production.
뿐만 아니라, 온도 감응성 고분자를 이용한 세포 시트 제작은 필연적으로 온도를 20℃로 낮추는 과정에서의 세포 생존능(cell viability) 및 기능 활성에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며, 만들어진 세포 시트의 기계적 물성이 낮아 3차원 세포 시트로 제조 시, 별도의 도구와 조작(manipulator)이 필요한 문제가 있다.In addition, cell sheet production using a temperature-sensitive polymer inevitably can negatively affect cell viability and functional activity in the process of lowering the temperature to 20 °C, and the mechanical properties of the prepared cell sheet are low, resulting in a three-dimensional When manufacturing a cell sheet, there is a problem that a separate tool and manipulator are required.
이러한 세포 시트 제조에 따른 종래기술로는, 한국등록특허 10-1922346에서는 (A) 온도감응성 수화젤의 제조 단계; (B) 단일세포 형태의 줄기세포를 3D culture dish에서 배양하여 줄기세포 스페로이드를 제조하는 단계; (C) 상기 줄기세포 스페로이드를 상기 수화젤에 분주하여 배양하는 단계; 및 (D) 상기 수화젤 표면을 냉각하여 상기 수화젤 표면에서 배양한 줄기세포 스페로이드를 시트의 형태로 분리하는 단계;를 포함하는 줄기세포 스페로이드-시트 복합체의 제조방법을 제시하였다. As a prior art according to the production of such a cell sheet, Korean Patent Registration No. 10-1922346 discloses (A) a manufacturing step of a temperature-sensitive hydrogel; (B) preparing stem cell spheroids by culturing single cell-type stem cells in a 3D culture dish; (C) culturing by dispensing the stem cell spheroids on the hydrogel; And (D) cooling the hydrogel surface to separate the stem cell spheroids cultured on the hydrogel surface in the form of a sheet;
상기 특허에서는 저임계 용액 온도 (lower critical solution temperature; LCST)를 보이는 온도감응성 고분자로 구성된 ‘온도감응성 수화젤’을 사용한 것으로, LCST보다 높은 온도에서 수축하고, 그보다 낮은 온도에서 팽창하는 특성을 가지고 있다. 따라서, 상기와 같은 온도감응성 수화젤의 특성을 이용하면서, 세포접착 단백질로서 세포와 세포, 세포와 matrix, 세포와 기타 물질의 결합을 용이하게 하는 것으로써, 예를 들어, 카드헤린(Cadherin), 피브리노젠(fibrinogen), 피브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitroectin), 라미닌(laminin), 콜라젠(collagen), 셀렉틴(selectin) 등을 포함한다. In the above patent, a 'temperature-sensitive hydrogel' composed of a temperature-sensitive polymer showing a lower critical solution temperature (LCST) is used. . Therefore, while using the characteristics of the temperature-sensitive hydrogel as described above, as a cell adhesion protein, it facilitates the binding of cells and cells, cells and matrix, and cells and other substances, for example, cadherin, fibrinogen, fibronectin, vitroectin, laminin, collagen, selectin, and the like.
그러나, 상기 특허의 경우 온도감응성 고분자를 사용함에 따른 문제를 해결할 수 없을 뿐만 아니라, 수화젤 표면에서 배양한 줄기세포 스페로이드를 시트의 형태로 분리하기 위해서는 수화젤 표면을 0℃ 내지 10℃까지 냉각시키는 별도의 과정이 필요한 등 공정이 매우 복잡하고 까다로운 문제가 있다.However, in the case of the above patent, not only cannot solve the problem of using a temperature-sensitive polymer, but also, in order to separate the stem cell spheroids cultured on the surface of the hydrogel in the form of a sheet, the surface of the hydrogel is cooled to 0°C to 10°C. There is a very complicated and difficult problem in the process, such as a separate process is required.
또한, 한국등록특허 10-1894486에서는 (1) 신경능선줄기세포(neural crest stem cells, NCSCs)를 분리하여 배양하는 단계; (2) 상기 배양된 신경능선줄기세포를 최종 농도 0.1% 내지 1%의 콜라겐 및 최종 농도 0.1% 내지 1%의 피브리노겐을 함유하는 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤 내로 함입시키는 단계; (3) 상기 신경능선줄기세포가 함입된 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤을 물리적 지지가 유지되는 부착배양조건에서 배양하는 단계; 및 (4) 상기 (3) 단계에서 배양된 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤을 물리적 지지가 배제된 부유배양조건에서 배양하는 단계를 포함하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법을 제시하였다. In addition, in Korean Patent No. 10-1894486, (1) separating and culturing neural crest stem cells (NCSCs); (2) incorporating the cultured neural crest stem cells into a collagen-fibrinogen mixed hydrogel containing collagen at a final concentration of 0.1% to 1% and fibrinogen at a final concentration of 0.1% to 1%; (3) culturing the collagen and fibrinogen mixed hydrogel into which the neural crest stem cells are embedded in an adherent culture condition in which physical support is maintained; and (4) culturing the collagen and fibrinogen mixed hydrogel cultured in step (3) in a suspended culture condition excluding physical support.
한편, 스페로이드 세포는 내부의 저 산소 환경으로 인해 산소와 영양분을 공급받기 위해 혈관신생인자(angiogenesis factor)들을 분비하는 다양한 인자분비능(paracrine effect)를 갖고 있다. 따라서, 이러한 스페로이드의 특성을 이용하여 신 혈관 재생을 위해 많은 연구들이 진행되고 있지만, 스페로이드를 이식하기 위해서는 전달체(delivery) 혹은 주사법(injection) 등의 복잡한 방법들이 요구되는 문제가 있다.On the other hand, spheroid cells have a variety of paracrine effect to secrete angiogenesis factors to receive oxygen and nutrients due to an internal hypoxic environment. Therefore, although many studies are being conducted for the regeneration of new blood vessels using the properties of these spheroids, there is a problem that complex methods such as delivery or injection are required to implant the spheroids.
또한, 이식 부위에서 유실되는 문제로 현재 다양한 전달 방법이 연구되고 있으나, 아직까지 스페로이드 세포를 효과적으로 이식할 수 있는 연구들은 제시되지 못하고 있는 실정이다. In addition, various delivery methods are currently being studied due to the problem of loss at the transplant site, but studies capable of effectively transplanting spheroid cells have not yet been presented.
이에 본 발명은 3차원 구조체인 컨케이브를 이용하여 배양한 스페로이드 세포를 이용하면서도 별도의 온도 조절이나 시약의 사용 없이, 배양된 세포에 특정 농도의 피브리노젠을 첨가함으로써 촉발되는 피브린으로 응집(aggregation)되는 기전을 이용하여 3차원 구조의 스페로이드 세포 시트를 제조하고, 이의 회수와 이식을 원스텝으로 제공할 수 있는 피브리노젠 기반 3차원 스페로이드 세포 시트를 제공하는 데 그 목적이 있다.Accordingly, the present invention uses spheroid cells cultured using a three-dimensional construct, a concave, while using fibrin aggregation ( It aims to provide a fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet that can provide a three-dimensional structure of a spheroid cell sheet by using the mechanism of aggregation, and its recovery and transplantation in one step.
또한, 본 발명에서는 이러한 특징을 가지는 피브리노젠 기반 3차원 스페로이드 세포 시트의 제조방법을 제공하는 데도 그 목적이 있다.In addition, the present invention also has an object to provide a method for manufacturing a fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet having these characteristics.
또한, 본 발명은 상기 피브리노젠 기반 3차원 스페로이드 세포 시트를 다수개 적층시킨 다층 구조의 3차원 구조의 스페로이드 세포 시트; 및 상기 3차원 구조의 스페로이드 세포 시트에 약물을 탑재시킨 3차원 구조의 스페로이드 세포 시트를 이용한 약물 전달체로의 응용이 가능하다. In addition, the present invention is a spheroid cell sheet of a three-dimensional structure of a multi-layer structure in which a plurality of the fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet is laminated; And it is possible to apply it as a drug delivery system using the spheroid cell sheet of the three-dimensional structure in which the drug is loaded on the spheroid cell sheet of the three-dimensional structure.
본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 구조의 스페로이드 세포 시트는 피브리노젠을 기반으로 하되, 상기 피브리노젠으로부터 형성된 피브린층과 스페로이드(spheroid) 세포를 포함하는 것을 특징으로 한다.The three-dimensional spheroid cell sheet according to an embodiment of the present invention is based on fibrinogen, and it is characterized in that it includes a fibrin layer and spheroid cells formed from the fibrinogen.
상기 3차원 구조의 스페로이드 세포 시트는 피브리노젠을 배양중인 세포에 분주시켜 상기 피브리노젠이 피브린층으로 응집(aggregation) 반응을 통하여 3차원 구조의 스페로이드 세포를 포함하는 시트 형태로 형성되는 것일 수 있다.The spheroid cell sheet of the three-dimensional structure is formed in the form of a sheet including the spheroid cells of the three-dimensional structure through the aggregation reaction of the fibrinogen into the fibrin layer by dispensing fibrinogen into cells in culture it could be
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 피브리노젠은 500 ㎍/㎖ ~ 10.0 ㎎/㎖의 농도로 포함되는 것이 바람직하다. According to one embodiment of the present invention, the fibrinogen is preferably contained in a concentration of 500 ㎍ / ㎖ ~ 10.0 mg / ㎖.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포 시트에 포함되는 세포는 인간 섬유아세포(Fibroblast), 인간 평활근세포(SMC), 인간 혈관세포(HUVEC), 근육세포(C2C12), 신경세포(PC12 Sheet), 쥐(rat) 골세포(Osteoblast) 와 같은 성체 세포, 인간 지방유래 줄기세포 (hADSC), 성체줄기세포(adult stem cell, ASC), 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC), 유도만능줄기세포 유래된 전구세포(induced pluripotent stem cell derived progenitor cell) 중에서 선택되는 1종 이상이 바람직하다. According to an embodiment of the present invention, the cells included in the cell sheet include human fibroblasts, human smooth muscle cells (SMC), human vascular cells (HUVEC), muscle cells (C2C12), and nerve cells (PC12 Sheet). , adult cells such as rat osteoblasts, human adipose-derived stem cells (hADSC), adult stem cells (ASC), embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells At least one selected from among induced pluripotent stem cell derived progenitor cells is preferred.
또한, 상기 세포 시트에 포함되는 세포는 1종 또는 2종 이상의 세포를 포함하는 것일 수 있다. In addition, the cells included in the cell sheet may include one or two or more types of cells.
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 3차원 구조의 스페로이드 세포 시트에는 단일 세포를 더 포함할 수 있다.In addition, according to another embodiment of the present invention, the spheroid cell sheet of the three-dimensional structure may further include a single cell.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 3차원 구조의 스페로이드 세포 시트의 제조방법은 피브리노젠을 무혈청배지에 녹여 저장 용액을 제조하는 단계, 다수의 컨케이브를 포함하는 세포 배양 몰드에 세포를 담지시켜 3차원 구조의 스페로이드 세포를 제조하는 단계, 상기 제조된 3차원 구조의 스페로이드 세포를 포함하는 세포 배양 몰드에 상기 피브리노젠 저장 용액을 분주시키는 단계, 상기 피브리노젠 분주된 세포를 배양시켜 피브린층이 형성되면서 3차원 구조의 스페로이드를 포함하는 세포 시트로 시트화시키는 단계, 및 상기 시트화된 세포 시트를 세포 배양 몰드로부터 박리시키는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다. The manufacturing method of the spheroid cell sheet of the three-dimensional structure according to an embodiment of the present invention comprises the steps of dissolving fibrinogen in a serum-free medium to prepare a stock solution, the cells in a cell culture mold comprising a plurality of concaves Preparing the spheroid cells of the three-dimensional structure by loading, dispensing the fibrinogen stock solution into a cell culture mold containing the prepared spheroid cells of the three-dimensional structure, the fibrinogen-dispensed cells It may be formed by culturing to form a cell sheet including a spheroid having a three-dimensional structure while forming a fibrin layer, and peeling the sheeted cell sheet from a cell culture mold.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포 배양 몰드는 크기 제한없이 사용 가능한 특징을 가진다. In addition, according to an embodiment of the present invention, the cell culture mold has a feature that can be used without size limitation.
또한, 상기 세포 배양 몰드에 분주되는 피브리노젠 저장 용액의 농도는 500 ㎍/㎖ ~ 10.0 ㎎/㎖인 것이 바람직하다. In addition, the concentration of the fibrinogen stock solution dispensed into the cell culture mold is preferably 500 ㎍ / ㎖ ~ 10.0 mg / ㎖.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 시트화된 세포 시트를 세포 배양 몰드로부터의 박리는 별도의 온도조절, 화학적 및 물리적 박리 기작을 거치지 않고도 가능한 특징을 가진다. According to an embodiment of the present invention, the exfoliation of the sheeted cell sheet from the cell culture mold is possible without separate temperature control, chemical and physical exfoliation mechanisms.
본 발명의 추가의 일 실시예에 따르면, 상기 세포 배양 몰드에 세포를 담지시키는 단계는; 상기 세포를 세포 배양 몰드의 컨케이브 내에만 담지시켜 3차원 구조의 스페로이드 세포를 제조할 수 있다. According to a further embodiment of the present invention, the step of supporting the cells in the cell culture mold; Spheroid cells of a three-dimensional structure can be prepared by supporting the cells only in the concave of a cell culture mold.
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 세포 배양 몰드에 세포를 담지시키는 단계는; 상기 세포를 상기 세포 배양 몰드의 컨케이브와 상기 컨케이브를 제외한 영역의 세포 배양 몰드 모두에 담지시켜 3차원 구조의 스페로이드 세포와 단일 세포를 모두 포함할 수 있다. In addition, according to another embodiment of the present invention, the step of supporting the cells in the cell culture mold; The cells may be supported in both the concave of the cell culture mold and the cell culture mold in a region excluding the concave, thereby including both spheroid cells and single cells having a three-dimensional structure.
또한, 본 발명은 상기 피브리노젠 기반 3차원 스페로이드 세포 시트를 다수개 적층시킨 다층 구조의 피브리노젠 기반 3차원 스페로이드 세포 시트를 제공할 수 있다.In addition, the present invention may provide a fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet of a multilayer structure in which a plurality of the fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet is laminated.
상기 다층 구조의 스페로이드 세포 시트는 이식할 세포의 양을 증대시킬 수 있으며, 서로 다른 세포를 포함하는 스페로이드 세포 시트를 적층시킬 수 있다. The multi-layered spheroid cell sheet can increase the amount of cells to be transplanted, and spheroid cell sheets including different cells can be stacked.
또한, 추가적으로 본 발명은 상기 피브리노젠 기반 3차원 스페로이드 세포 시트에 약물을 탑재시킨 피브리노젠 기반 3차원 스페로이드 세포 시트를 이용한 약물 전달체를 제공할 수 있다. In addition, the present invention may additionally provide a drug delivery system using the fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet loaded with a drug on the fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet.
상기 약물 전달체는 헤파린이 결합된 피브리노젠, 및 자유 피브리노젠의 혼합 피브리노젠에 약물을 혼합하여 배양된 세포에 첨가하여 상기 혼합 피브리노젠으로부터 형성된 피브린층에 상기 약물이 탑재됨과 동시에 세포 시트를 형성하는 것일 수 있다. The drug carrier is added to the cultured cells by mixing the drug with the mixed fibrinogen of heparin-bound fibrinogen and free fibrinogen, and the drug is loaded on the fibrin layer formed from the mixed fibrinogen. It may be to form a sheet.
상기 약물은 헤파린과 결합가능한 약물로써, 골형성 단백질 (Bone morphogenetic protein; BMP), 혈관 내피 성장 인자 (Vascular endothelial growth factor; VEGF), 변형 성장 인자 (Transforming growth factor-β; TGF-β), 혈소판 유도 성장인자 (Platelet derived growth factor; PDGF) 및 섬유아세포 성장인자 (Fibroblast growth factor; FGF)로부터 선택되는 1종 이상의 성장인자가 바람직하게 사용될 수 있다. The drug is a drug capable of binding to heparin, and includes bone morphogenetic protein (BMP), vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth factor-β (TGF-β), platelets. At least one growth factor selected from platelet derived growth factor (PDGF) and fibroblast growth factor (FGF) may be preferably used.
본 발명에 따른 3차원 스페로이드 세포 시트는 스페로이드 세포로부터 방출된 신혈관 재생 관련 다양한 인자분비능(paracrine factor)들을 손실 없이 담지하고 있기 때문에 허혈성 조직 손상에서의 신혈관 형성을 유도하여 손상된 허혈 조직의 재생을 빠르게 유도할 수 있는 효과를 가진다.Since the three-dimensional spheroid cell sheet according to the present invention carries various paracrine factors related to neovascularization released from the spheroid cells without loss, it induces neovascularization in ischemic tissue damage, thereby reducing the damage to the ischemic tissue. It has the effect of inducing rapid regeneration.
또한, 본 발명은 화학적 혹은 물리적 방법을 이용하지 않고 혈장 단백질인 피브리노젠을 이용하여 배양중인 세포를 간단하게 피브린층으로 응집 반응을 통해 3차원 스페로이드 세포를 포함하는 시트 형태로 시트화시킬 수 있다. In addition, the present invention can form a sheet including three-dimensional spheroid cells through aggregation reaction into a fibrin layer by simply using fibrinogen, a plasma protein, without using a chemical or physical method. have.
또한, 본 발명은 피브리노젠의 농도에 의한 기계적 물성을 조절할 수 있으며, 세포를 배양하는 세포 배양 접시 내의 컨케이브 형태를 다양하게 설계하여 다양한 형태와 여러 가지 세포를 포함하는 3차원 스페로이드 세포 시트를 종래기술 대비 저렴한 비용으로 제작할 수 있다는 장점이 있다. In addition, the present invention can control the mechanical properties by the concentration of fibrinogen, and a three-dimensional spheroid cell sheet containing various types and various cells by designing various concave shapes in a cell culture dish for culturing cells. It has the advantage that it can be manufactured at a low cost compared to the prior art.
발명은 상기 3차원 스페로이드 세포 시트를 이용하여 다수개 적층시킨 구조의 3차원 스페로이드 세포 시트; 및 상기 3차원 스페로이드 세포 시트에 약물을 포함하는 약물전달체 등으로 다양한 기능성을 가지는 세포 시트로의 응용이 가능하다. The present invention is a three-dimensional spheroid cell sheet of a structure in which a plurality of stacked using the three-dimensional spheroid cell sheet; And the three-dimensional spheroid cell sheet can be applied to a cell sheet having various functionalities, such as a drug delivery system containing a drug.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 3차원 스페로이드 세포 시트의 제조 과정을 나타낸 것으로, (a)각각의 컨케이브 내로 세포를 접종한 상태의 전자현미경 사진이고, (b)는 컨케이브로부터 박리시킨 3차원 스페로이드 세포 시트의 전자현미경 사진이고, (c)는 (b)의 일부를 확대한 사진이고, (d)는 실제 제조된 3차원 스페로이드 세포 시트의 사진이며,
도 2와 3은 실시예 1에서 제조된 3차원 스페로이드 세포 시트를 누드 마우스 하지 허혈 모델에 이식하여 이식한 스페로이드 시트가 허혈 조직부위에서 신혈관 형성 유도에 의한 괴사를 억제할 수 있는지 Laser doppler perfusion image 장비를 통해 확인한 각각 정성분석 결과와 정량분석 결과이고,
도 4는 상기 ischemia leg의 상태를 limb loss, necrosis, salvage 세 가지 상태로 나눠 평가한 Physiological status 결과이고,
도 5와 6은 각각 상기 실험예 1에 따른 각 세포 시트를 이식 후 28일 후에 hind limb을 회수하여 H&E 염색 및 Masson’trichrome 염색을 통한 조직학 분석 결과이고,
도 7은 실시예 2에 따른 단일 세포와 3차원 스페로이드 세포를 동시에 포함하는 세포 시트의 형광현미경 사진이다.1 shows the manufacturing process of a three-dimensional spheroid cell sheet according to Example 1 of the present invention, (a) is an electron micrograph of a state inoculated cells into each concave, (b) is from the concave It is an electron microscope photograph of the peeled three-dimensional spheroid cell sheet, (c) is an enlarged photograph of a part of (b), (d) is a photograph of the actually prepared three-dimensional spheroid cell sheet,
2 and 3 show whether the three-dimensional spheroid cell sheet prepared in Example 1 is transplanted into a nude mouse lower extremity ischemia model, and the implanted spheroid sheet can inhibit necrosis caused by neovascularization in the ischemic tissue site. Qualitative analysis results and quantitative analysis results, respectively, confirmed through perfusion image equipment,
Figure 4 is a Physiological status result evaluated by dividing the state of the ischemia leg into three states: limb loss, necrosis, and salvage;
5 and 6 are the results of histological analysis through H&E staining and Masson's trichrome staining by recovering the
7 is a fluorescence micrograph of a cell sheet containing a single cell and a three-dimensional spheroid cell at the same time according to Example 2.
이하에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail as follows.
본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다.The terminology used herein is used to describe specific embodiments, not to limit the present invention.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는 (comprising)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.As used herein, the singular form may include the plural form unless the context clearly dictates otherwise. Also, as used herein, “comprise” and/or “comprising” refers to the presence of the recited shapes, numbers, steps, actions, members, elements, and/or groups of which are specified. and does not exclude the presence or addition of one or more other shapes, numbers, movements, members, elements and/or groups.
본 발명은 피브리노젠을 기반으로 하되, 3차원 구조의 스페로이드 세포를 이용한 세포 시트, 이의 제조방법, 및 이를 다양한 형태로 이용하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a cell sheet based on fibrinogen, using spheroid cells having a three-dimensional structure, a manufacturing method thereof, and a method using the same in various forms.
본 발명에서 사용된 '피브리노젠 기반 3차원 스페로이드 세포'는 피브리노젠을 기본적으로 첨가하여 이루어진 것으로, 3차원 스페로이드(3-demensional spheriod)는 회전타원체(spheroid)와 같은 구형의 형태를 포함하는 의미이다. 또한, 단일 세포(single cell)와는 상이한 개념을 가지는 것으로, 본 발명의 3차원 스페로이드 세포는 통상의 단일 세포를 제조하는 것과는 상이한 배양 용기를 이용하는 것은 당업자들에 있어서 자명하다. 상기 배양 용기는 예를 들어 가로 x 세로 x 높이가 일정한 크기를 가지는 3차원 구조의 컨케이브(concave)를 포함하는 세포 배양 몰드를 이용하여 제조되는 것일 수 있으며, 상기 3차원 구조의 컨케이브(concave)의 크기 및 모양은 크게 한정되지 않고 3차원 구조의 스페로이드 형태를 제조할 수 있는 것이면 어느 것이나 가능하다. The 'fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell' used in the present invention is basically made by adding fibrinogen, and the three-dimensional spheroid (3-demensional spheriod) has a spherical shape such as a spheroid. meaning to include In addition, as having a concept different from that of a single cell, it is obvious to those skilled in the art that the three-dimensional spheroid cell of the present invention uses a culture vessel different from that for preparing a conventional single cell. The culture vessel may, for example, be manufactured using a cell culture mold including a concave of a three-dimensional structure having a constant size of width x length x height, and a concave of the three-dimensional structure. ), the size and shape are not significantly limited, and any one capable of producing a spheroid form of a three-dimensional structure is possible.
이러한 3차원 스페로이드 세포 시트를 이용하는 경우 단일 세포(single cell)를 이용하여 제조된 세포 시트에 비해, 스페로이드로부터 방출된 신혈관 재생 관련 다양한 인자분비능(paracrine factor)들을 손실 없이 담지하고 있기 때문에 허혈성 조직 손상에서의 신혈관 형성을 유도하여 손상된 조직의 재생을 빠르게 유도할 수 있는 효과를 가질 수 있어 더 바람직하다.In the case of using such a three-dimensional spheroid cell sheet, as compared to a cell sheet prepared using a single cell, various paracrine factors related to neovascularization released from the spheroid are supported without loss. It is more preferable because it can have the effect of inducing the formation of new blood vessels in tissue damage and thus rapidly inducing regeneration of the damaged tissue.
한편, 통상 혈액을 원심분리 할 경우 밀도 차에 의해서 혈구와 혈장으로 나뉘어지며, 혈구에는 백혈구, 적혈구, 혈소판을 포함한다. 적혈구를 포함하고 있기 때문에 붉은색을 띄는 것이 특징이다. 혈장에는 섬유소원인 피브리노젠(fibrinogen)을 포함하고 있으며 이 섬유소원을 제거한 것이 혈청이다. On the other hand, when blood is usually centrifuged, it is divided into blood cells and plasma by the difference in density, and the blood cells include white blood cells, red blood cells, and platelets. It is characterized by its red color because it contains red blood cells. Plasma contains fibrinogen, a source of fibrin, and serum is the result of removing this fibrinogen.
한편, 출혈이 발생하게 되면, 혈소판이 파괴되어 혈소판이 가지고 있는 트롬보키나아제가 방출된다. 혈장에 존재하는 프로트롬빈이 트롬보키나아제에 의해 트롬빈이라는 효소로 전환되며, 전환된 트롬빈은 혈장단백질인 피브리노젠과 반응하여 피브린이라는 섬유소 단백질로 전환되어 적혈구, 백혈구를 서로 엉켜 응고시킨다.On the other hand, when bleeding occurs, platelets are destroyed and thrombokinase possessed by platelets is released. Prothrombin present in plasma is converted into an enzyme called thrombin by thrombokinase, and the converted thrombin reacts with fibrinogen, a plasma protein, and is converted into fibrin protein, which causes red blood cells and white blood cells to tangle with each other and coagulate.
본 발명에서는 이러한 기전을 이용한 것으로, 피브리노젠을 혈청(혈청에 혈액응고단백질인 피브리노젠, 프로트롬빈이 포함되어있지 않다고 알려져 있음)이 포함된 배지에 첨가하여 일정시간 반응시켰을 때, 반응물이 형성되는 것을 확인하였다. In the present invention, this mechanism is used, and when fibrinogen is added to a medium containing serum (which is known to not contain fibrinogen and prothrombin, which are blood clotting proteins in serum) and reacted for a certain period of time, a reactant is formed confirmed to be.
따라서, 본 발명에 따른 세포 시트는 피브리노젠을 기반으로 하되, 상기 피브리노젠으로부터 형성된 피브린층과 3차원 구조의 스페로이드 세포를 포함하는 구조를 가진다. Therefore, the cell sheet according to the present invention is based on fibrinogen, but has a structure including a fibrin layer formed from the fibrinogen and spheroid cells having a three-dimensional structure.
즉, 본 발명에서는 혈장 단백질인 피브리노겐을 배양중인 3차원 구조의 스페로이드 세포에 처리하여 배지에 포함된 혈청과 피브리노젠의 응집(aggregation) 반응을 유도하여 상기 피브리노젠이 피브린층을 형성하면서 다른 물리적 혹은 화학적인 방법을 이용하지 않고 세포외 기질 (ECM, extracellular matrix)을 포함하는 3차원 구조의 스페로이드세포 시트 (Cell sheet)를 제조할 수 있다. 즉, 세포 배양 시 별다른 효소의 사용없이 피브리노젠을 일반 세포 배양액에 넣게 되면, 3차원 구조의 스페로이드 세포와 피브리노젠/트롬빈 등이 결합된 3차원 구조의 스페로이드 세포 시트를 제조할 수 있고, 이를 간단히 회수하여 원하는 용도에 이식하여 사용할 수 있다.That is, in the present invention, fibrinogen, a plasma protein, is treated with spheroid cells having a three-dimensional structure in culture to induce an aggregation reaction between the serum and fibrinogen contained in the medium, so that the fibrinogen forms a fibrin layer. A spheroid cell sheet (Cell sheet) having a three-dimensional structure including an extracellular matrix (ECM) can be prepared without using other physical or chemical methods. That is, when fibrinogen is put into a general cell culture medium without the use of a special enzyme during cell culture, a spheroid cell sheet of a three-dimensional structure in which a three-dimensional structure of spheroid cells and fibrinogen/thrombin, etc. are combined can be prepared. and it can be simply recovered and transplanted for a desired use.
이를 위해 본 발명에서는 피브리노젠을 먼저 무혈청 배지에 용해시켜 피브리노젠 저장 용액(stock solution)을 제조한 다음, 이를 혈청이 포함되어 있는 3차원 구조의 컨케이브를 포함하는 세포 배양 몰드에 유효한 농도로 첨가 및 반응시킴으로써 3차원 구조의 스페로이드 세포 시트를 제조할 수 있다. 이때, 상기 피브리노젠은 혈청에 포함된 혈액응고 전구물질들과 유도되는 응집(aggregation) 반응을 통하여 세포를 포함하는 시트 형태를 형성하는 것으로 유추된다. 상기 응집되는 과정에서 형성된 피브린층이 세포를 감싸는 구조가 될 수도 있고, 세포 위에서 응집될 수도 있다. To this end, in the present invention, fibrinogen is first dissolved in a serum-free medium to prepare a fibrinogen stock solution, and then it is effective for a cell culture mold containing a three-dimensional concave containing serum. By adding and reacting at a concentration, a spheroid cell sheet having a three-dimensional structure can be prepared. At this time, it is inferred that the fibrinogen forms a sheet form including cells through an aggregation reaction induced with blood coagulation precursors contained in serum. The fibrin layer formed in the aggregation process may have a structure surrounding the cell or may be aggregated on the cell.
본 발명의 3차원 구조의 스페로이드 세포 시트 내에서 피브리노젠은 500 ㎍/㎖ ~ 10.0 ㎎/㎖의 농도로 포함되는 것이 바람직하며, 통상적으로 사용되는 세포 배양 접시에서 배양되는 세포의 양보다 더 많은 세포의 양이 컨케이브에 접종되기 때문에 세포의 양 및 상기 피브리노젠의 농도와 다수의 컨케이브가 포함된 세포 배양 몰드의 가벽 높이에 따라 최종 제조되는 세포 시트의 두께가 결정된다고 할 수 있다.Fibrinogen in the three-dimensional structure of the spheroid cell sheet of the present invention is preferably contained in a concentration of 500 ㎍ / ㎖ ~ 10.0 mg / ㎖, more than the amount of cells cultured in a conventionally used cell culture dish Since a large amount of cells is inoculated into the concave, it can be said that the thickness of the finally manufactured cell sheet is determined according to the amount of cells, the concentration of the fibrinogen, and the height of the false wall of the cell culture mold containing a plurality of concaves. .
즉, 본 발명에 따른 세포 시트는 피브리노젠으로부터 형성된 피브린층과 3차원 구조의 스페로이드 세포로 구성되어 있기 때문에 상기 피브리노젠의 농도가 높고 컨케이브 몰드의 가벽의 높이가 높을수록 소요되는 배지의 양도 증가하기 때문에 최종 제조되는 3차원 구조의 스페로이드 세포 시트의 두께도 두꺼워진다.That is, since the cell sheet according to the present invention is composed of a fibrin layer formed from fibrinogen and spheroid cells having a three-dimensional structure, the medium required as the concentration of fibrinogen is high and the height of the temporary wall of the concave mold is high. The thickness of the spheroid cell sheet of the final manufactured three-dimensional structure also becomes thicker because the amount of is also increased.
상기 분주되는 피브리노젠의 농도는 다수의 켄케이브가 포함된 하나의 몰드를 기준으로 한 농도이며, 소정의 용도에 따라 피브리노젠의 농도를 상기 범위로 조절함과 동시에 사용되는 컨케이브 몰드 가벽의 높이를 조절하여 그 두께를 조절할 수 있다. The concentration of the dispensed fibrinogen is a concentration based on one mold including a plurality of cancave, and the concave mold barrier used at the same time as adjusting the concentration of fibrinogen to the above range according to a predetermined use The thickness can be adjusted by adjusting the height of the .
그러나 본 발명에 따른 3차원 구조의 스페로이드 세포 시트가 조직에 이식되어 사용되기 위해서는 그 두께는 얇을수록 좋지만 너무 얇은 경우에는 물성이 약한 문제가 있기 때문에 물성을 유지하면서도 적절한 두께를 유지하는 것이 필요하다. 따라서, 상기 피브리노젠의 농도가 500 ㎍/㎖ 미만에서는 두께가 얇아서 좋지만 물성이 약할 수 있어 바람직하지 못하고, 10.0 ㎎/㎖의 농도를 초과하는 경우에는 물성은 확보될 수 있으나, 제조되는 세포 시트의 두께가 너무 두꺼워 지기 때문에, 이식 공간 확보에 어려움이 있을 수 있어 피브리노젠의 농도를 정확하게 조절할 필요가 있다.However, in order for the spheroid cell sheet of the three-dimensional structure according to the present invention to be transplanted into tissue and used, the thinner the thickness, the better, but if it is too thin, it is necessary to maintain an appropriate thickness while maintaining the physical properties because there is a problem of weak physical properties. . Therefore, when the concentration of fibrinogen is less than 500 μg/ml, the thickness is good, but the physical properties may be weak, which is not preferable. Since the thickness of the fibrinogen becomes too thick, it may be difficult to secure an implantation space, so it is necessary to precisely control the concentration of fibrinogen.
이러한 본 발명에 따른 3차원 구조의 스페로이드 세포 시트의 제조방법은 피브리노젠을 무혈청배지에 녹여 저장 용액을 제조하는 단계, 다수의 컨케이브를 포함하는 세포 배양 몰드에 세포를 담지시켜 3차원 구조의 스페로이드 세포를 제조하는 단계, 상기 제조된 3차원 구조의 스페로이드 세포를 포함하는 세포 배양 몰드에 상기 피브리노젠 저장 용액을 분주시키는 단계, 상기 피브리노젠 분주된 세포를 배양시켜 피브린층이 형성되면서 3차원 구조의 스페로이드를 포함하는 세포 시트로 시트화시키는 단계, 및 상기 시트화된 세포 시트를 세포 배양 몰드로부터 박리시키는 단계를 포함할 수 있다.The method for producing a spheroid cell sheet having a three-dimensional structure according to the present invention comprises the steps of preparing a stock solution by dissolving fibrinogen in a serum-free medium, and supporting the cells in a cell culture mold including a plurality of concaves to provide three-dimensional Preparing the spheroid cells of the structure, dispensing the fibrinogen stock solution into a cell culture mold containing the prepared spheroid cells of the three-dimensional structure, culturing the fibrinogen-dispensed cells to form a fibrin layer This may include the step of forming a sheet into a cell sheet containing a spheroid of a three-dimensional structure while forming, and peeling the sheeted cell sheet from the cell culture mold.
먼저 첫 번째 단계는 피브리노젠을 혈청이 포함되어 있지 않은 무혈청 배지에 녹여 피브리노젠 저장 용액(stock solution)을 제조한다. First, in the first step, fibrinogen stock solution is prepared by dissolving fibrinogen in serum-free medium.
두 번째 단계는 다수의 컨케이브를 포함하는 세포 배양 몰드에 세포를 담지시켜 3차원 구조의 스페로이드 세포를 제조하는 단계로서, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 단계에서는 상기 세포를 컨케이브 내에만 담지시킴으로써 3차원 구조를 가지는 스페로이드 세포를 제조하도록 하는 것이 바람직하다.The second step is to prepare a three-dimensional structure of spheroid cells by supporting the cells in a cell culture mold containing a plurality of concaves. According to an embodiment of the present invention, in the step, the cells are placed in a It is preferable to prepare a spheroid cell having a three-dimensional structure by only supporting it.
그러나, 필요에 따라, 본 발명의 다른 일 실시예와 같이, 상기 세포 배양 몰드에 세포를 담지시키는 단계에서는 상기 세포를 컨케이브와 컨케이브를 제외한 세포 배양 몰드 영역에 모두에 담지시키는 것도 가능하다.However, if necessary, as in another embodiment of the present invention, in the step of loading the cells in the cell culture mold, it is also possible to support the cells in all areas of the cell culture mold except for the concave and the concave.
이 경우, 세포 배양 몰드의 컨케이브 내에 담지된 세포로부터는 3차원 구조를 가지는 스페로이드 세포를 제조할 수 있고, 세포 배양 몰드의 컨케이브를 제외한 영역(평평한 부분)의 세포 배양 몰드에 담지된 세포로부터는 단일 세포를 제조할 수 있기 때문에 최종 제조되는 세포 시트에서는 3차원 구조의 스페로이드 세포와 단일 세포를 모두 포함할 수 있는 특징을 가진다.In this case, spheroid cells having a three-dimensional structure can be prepared from the cells supported in the concave of the cell culture mold, and the cells supported in the cell culture mold in the region (flat part) excluding the concave of the cell culture mold. Since a single cell can be prepared from the cell sheet, it has a feature that can include both spheroid cells and single cells of a three-dimensional structure.
이때 사용되는 세포는 인간 섬유아세포(Fibroblast), 인간 평활근세포(SMC), 인간 혈관세포(HUVEC), 근육세포(C2C12), 신경세포(PC12 Sheet), 쥐(rat) 골세포(Osteoblast) 등의 성체 세포, 인간 지방유래 줄기세포 (hADSC), 성체줄기세포(adult stem cell, ASC), 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC), 유도만능줄기세포 유래된 전구세포(induced pluripotent stem cell derived progenitor cell) 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The cells used at this time include human fibroblasts, human smooth muscle cells (SMC), human vascular cells (HUVEC), muscle cells (C2C12), nerve cells (PC12 Sheet), and rat osteoblasts. Adult cells, human adipose-derived stem cells (hADSC), adult stem cells (ASC), embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cell derived progenitor cells ) may be one or more selected from, but is not limited thereto.
또한, 지금까지의 세포 시트는 정해진 규격의 배양 접시에만 한정되어 다양한 크기의 세포 시트의 제조가 불가능하였고, 주로 판상의 2차원 세포 시트의 제조에만 한정되었다. 그러나, 본 발명은 종래 기술들과 같이 온도감응성 고분자를 이용한 것이 아니기 때문에 사용되는 배양 접시의 크기나 형태에 영향 받지 않는다. 따라서, 본 발명에서는 목표로 하는 크기에 따라 종래의 세포를 이용하여 3차원 스페로이드 형태로 제조할 수 있는 구조를 가지는 다수의 컨케이브 몰드를 배양 배지로 사용하는 것이면, 그 크기에 제한없이 3차원 스페로이드 세포 시트를 제조할 수 있는 특징을 가진다.In addition, cell sheets up to now have been limited only to culture dishes of predetermined specifications, making it impossible to manufacture cell sheets of various sizes, and it is mainly limited to the manufacture of plate-shaped two-dimensional cell sheets. However, since the present invention does not use a temperature-sensitive polymer as in the prior art, it is not affected by the size or shape of the culture dish used. Therefore, in the present invention, if a number of concave molds having a structure that can be prepared in a three-dimensional spheroid form using conventional cells according to a target size are used as a culture medium, the size is not limited in three dimensions. It has the characteristics of being able to manufacture a spheroid cell sheet.
또한, 상기 세포 배양 몰드에 분주되는 세포는 동일한 세포를 단독으로 사용하거나, 상이한 2종 이상의 세포를 동시에 분주시켜 복합 스페로이드 형태로 제조 할 수 있어 각각의 세포들이 가지는 효과를 소정의 조직에 이식함으로써 그 효과를 극대화시키는 것도 가능하다. In addition, the cells to be dispensed into the cell culture mold can be prepared in the form of a complex spheroid by using the same cells alone, or by dispensing two or more different cells at the same time, so that the effect of each cell is transplanted into a predetermined tissue. It is also possible to maximize the effect.
그 다음에는 상기 단계에서 제조된 3차원 구조의 스페로이드 세포를 포함하는 세포 배양 몰드에 준비된 피브리노젠 저장 용액을 분주시키는 단계이다. 이 단계에서 피브리노젠 저장 용액은 500 ㎍/㎖ ~ 10.0 ㎎/㎖의 농도로 분주시켜 소정의 조절된 두께를 가지도록 하는 것이 바람직하다. Next, it is a step of dispensing the prepared fibrinogen stock solution into the cell culture mold containing the spheroid cells of the three-dimensional structure prepared in the above step. In this step, the fibrinogen stock solution is preferably dispensed at a concentration of 500 μg/ml to 10.0 mg/ml to have a predetermined controlled thickness.
또한, 상기 피브리노젠 분주된 세포를 배양시켜 피브린층이 형성되면서 3차원 구조의 스페로이드 세포를 포함하는 시트 형태로 시트화시키는 단계이다. 이때 3차원 구조의 스페로이드 세포 시트는 3차원 스페로이드 세포-컨케이브 간의 점착력보다 3차원 스페로이드 세포-피브리노젠의 점착력이 커서 배양 접시의 각 컨케이브로부터 쉽게 회수 가능하고 피브린이 형성된 세포 시트를 형성하게 된다.In addition, it is a step of culturing the fibrinogen-infused cells to form a sheet in the form of a sheet including spheroid cells having a three-dimensional structure while forming a fibrin layer. At this time, the three-dimensional spheroid cell sheet can be easily recovered from each concav in the culture dish because the adhesion of the three-dimensional spheroid cell-fibrinogen is greater than the adhesion between the three-dimensional spheroid cell-concave, and the fibrin-formed cell sheet will form
상기 단계에서는 통상적인 세포 배양 조건으로 알려진 37℃의 온도에서, CO2 농도 5%에서 수행되는 것이 바람직하다. 특별히 세포 활성은 온도 변화에 많은 영향을 받을 수 있기 때문에 37℃에서 세포를 배양시키는 것이 중요하다. In the above step, it is preferably carried out at a temperature of 37° C., which is known as a conventional cell culture condition, at a concentration of CO 2 of 5%. In particular, it is important to incubate the cells at 37 °C because cell activity can be greatly affected by temperature changes.
마지막으로 상기 시트화된 3차원 스페로이드 세포 시트를 각 컨케이브를 포함하는 배양 몰드로부터 박리시키는 단계를 거쳐 최종 세포 시트를 얻을 수 있다. Finally, the final cell sheet can be obtained through the step of peeling the sheeted three-dimensional spheroid cell sheet from the culture mold including each concave.
종래에는 제조된 세포 시트를 세포 배양 몰드로부터 박리시키기 위하여 온도를 조절하거나 박리하기 위한 도구를 사용하는 등이 필요하였으나, 본 발명에서는 피브리노젠이 피브린층으로 응집되면서 별도의 온도조절, 화학적 및 물리적 박리 기작없이 간단히 포셉을 이용해 형성된 시트를 컨케이브로부터 박리시킬 수 있다.Conventionally, in order to peel the prepared cell sheet from the cell culture mold, it was necessary to control the temperature or use a tool for peeling, but in the present invention, as fibrinogen aggregates into the fibrin layer, separate temperature control, chemical and physical The formed sheet can be peeled from the concave simply by using forceps without a peeling mechanism.
또한, 본 발명에서는 상기 탈착된 세포 시트를 별도의 도구 사용 및 조작(manipulator) 과정을 거치지 않고 다양한 형태로 조작이 가능하다. 기존 세포 시트 기술에서는 세포 시트를 조작 및 이식하기 위하여 피브린이 코팅된 plunge stamp 등을 사용하였지만 본 발명에서 새롭게 개발한 세포 시트는 피브린층을 포함하고 있어 포셉(tweezer)을 이용하여 단순히 조작 및 이식이 가능한 장점을 가진다.In addition, in the present invention, it is possible to manipulate the detached cell sheet in various forms without using a separate tool and going through a manipulator process. In the existing cell sheet technology, a plunge stamp coated with fibrin was used to manipulate and implant the cell sheet, but the cell sheet newly developed in the present invention contains a fibrin layer, so manipulation and transplantation are difficult using forceps (tweezer). have possible advantages.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에서는 상기 특징을 가지는 3차원 스페로이드 세포 시트를 다수 개 적층시킨 것으로 이루어진 다층 구조의 3차원 스페로이드 세포 시트를 제공할 수 있다. In addition, according to an embodiment of the present invention, in the present invention, it is possible to provide a three-dimensional spheroid cell sheet of a multi-layer structure consisting of a plurality of stacked three-dimensional spheroid cell sheet having the above characteristics.
상기 다층 구조의 3차원 스페로이드 세포 시트 제조를 위한 세포 시트의 적층은 상기 3차원 스페로이드 세포 시트를 순차적으로 위치시키는 간단한 방법으로 이루어질 수 있다. The lamination of the cell sheet for the production of the three-dimensional spheroid cell sheet of the multi-layer structure can be made by a simple method of sequentially positioning the three-dimensional spheroid cell sheet.
따라서 본 발명과 같이 3차원 스페로이드 세포 시트를 다수 개 적층시키는 경우, 이식할 세포의 양을 증대시킬 수 있으며, 서로 다른 세포를 포함하는 세포 시트를 적층시킴으로써 조직 결손 부위에 이식하여 재생 효과를 극대화시킬 수 있다. Therefore, when a plurality of three-dimensional spheroid cell sheets are stacked as in the present invention, the amount of cells to be transplanted can be increased, and by stacking cell sheets containing different cells, transplantation to the tissue defect site to maximize the regenerative effect can do it
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기와 같이 제조된 3차원 스페로이드 세포 시트에 포함된 피브린층에 약물이 탑재되어 3차원 스페로이드 세포 시트를 이용한 약물 전달체로도 이용 가능한 특징을 가진다. In addition, according to an embodiment of the present invention, the drug is mounted on the fibrin layer included in the three-dimensional spheroid cell sheet prepared as described above, and has a feature that can be used as a drug delivery system using the three-dimensional spheroid cell sheet.
상기 3차원 스페로이드 세포 시트를 이용한 약물 전달체는 활성화시킨 헤파린을 피브리노젠과 결합하여 헤파린이 결합된 피브리노젠을 이용하며, 여기에 자유 피브리노젠을 적절한 비율로 혼합하여 혼합 피브리노젠을 준비한다. 상기 혼합 피브리노젠과 약물(성장인자)를 세포가 배양되어져 있는 배양접시에 배지와 함께 분주시키면 상기 혼합 피브리노젠으로부터 형성된 피브린층에 상기 약물이 결합됨과 동시에 세포 시트를 형성하게 된다. The drug delivery system using the three-dimensional spheroid cell sheet combines activated heparin with fibrinogen to use heparin-coupled fibrinogen, and free fibrinogen is mixed thereto in an appropriate ratio to obtain mixed fibrinogen. Prepare. When the mixed fibrinogen and the drug (growth factor) are dispensed together with a medium in a culture dish in which cells are cultured, the drug is bound to the fibrin layer formed from the mixed fibrinogen, and a cell sheet is formed at the same time.
이때 사용 가능한 약물은 골형성 단백질 (Bone morphogenetic protein; BMP), 혈관 내피 성장 인자 (Vascular endothelial growth factor; VEGF), 변형 성장 인자 (Transforming growth factor-β; TGF-β), 혈소판 유도 성장인자 (Platelet derived growth factor; PDGF) 및 섬유아세포 성장인자 (Fibroblast growth factor; FGF) 등과 같은 성장인자가 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 복수의 성장인자가 사용될 수도 있다. In this case, the available drugs are bone morphogenetic protein (BMP), vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth factor-β (TGF-β), platelet-derived growth factor (Platelet). Growth factors such as derived growth factor; PDGF) and fibroblast growth factor (FGF) are preferred, but are not limited thereto, and a plurality of growth factors may be used.
또한, 상기 약물 전달체는 성장 인자 단백질의 전달이 용이하여 세포 시트와 더불어 뼈, 피부, 혈관, 연골 등의 결손 부위의 조직 재생에 탁월한 효과를 나타내는 치료제로 사용될 수 있다. In addition, the drug delivery system can be used as a therapeutic agent that exhibits an excellent effect on tissue regeneration of defect sites such as bone, skin, blood vessel, cartilage, etc. along with the cell sheet because the delivery of the growth factor protein is easy.
이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 이하의 실시예에서는 특정 화합물을 이용하여 예시하였으나, 이들의 균등물을 사용한 경우에 있어서도 동등 유사한 정도의 효과를 발휘할 수 있음은 당업자에게 자명하다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail. The following examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention should not be construed as being limited by these examples. In addition, although specific compounds are used for illustration in the following examples, it is obvious to those skilled in the art that similar effects can be exerted even when equivalents thereof are used.
실시예 1 : 3차원 스페로이드 세포를 이용한 세포 시트의 제작Example 1: Preparation of a cell sheet using three-dimensional spheroid cells
인간 지방 유래 줄기 세포 (hADSC)를 포함하는 3차원 구조의 컨케이브 몰드에 피브리노젠 스톡 용액을 분주시켜 3차원 스페로이드 세포 시트를 제조하였다. (도 1 참조)A three-dimensional spheroid cell sheet was prepared by dispensing a fibrinogen stock solution into a three-dimensional concave mold containing human adipose-derived stem cells (hADSC). (See Fig. 1)
상세히 살피면, 먼저 다음 도 1의 (a)와 같은 컨케이브(StemFIT 3D®, H389600L)가 389개 포함되어 있는 몰드에 인간 지방 유래 줄기 세포 (hADSC)를 세포 배양 배지와 함께 주입시켰다. 이 때 컨케이브에만 세포를 주입하기 위해 15분 동안 세포를 침하시킨 후, 컨케이브 가벽 위에 위치한 세포를 제거하기 위해 상층액을 제거한 후 세포 배양 배지를 첨가해 주어 24시간동안 인큐베이터 (5% CO2, 37℃)에서 배양해 세포 스페로이드를 형성시켰다. In detail, first, human adipose-derived stem cells (hADSC) were injected together with a cell culture medium into a mold containing 389 concaves (StemFIT 3D ® , H389600L) as shown in FIG. 1 (a). At this time, after submerging the cells for 15 minutes to inject the cells only into the concave, the supernatant was removed to remove the cells located on the temporary wall of the concave, and then the cell culture medium was added and the incubator (5% CO 2 ) , 37°C) to form cell spheroids.
또한, 피브리노젠을 Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 에 25 mg/mL의 농도로 37 ℃에서 녹여 저장 용액(stock solution)을 제조하였다. In addition, fibrinogen was dissolved in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) at a concentration of 25 mg/mL at 37° C. to prepare a stock solution.
상기 제조된 피브리노젠 저장 용액을 상기 세포가 포함된 컨케이브에 세포 배양 배지(세포의 성장 배지(Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM+10% Fetal Bovine Serum (FBS)+1% Penicillin Streptomycin (PS))에 첨가하여 피브리노젠의 최종 농도를 7.5㎎/mL로 분주시켰다. The prepared fibrinogen stock solution was added to the cell culture medium (Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM + 10% Fetal Bovine Serum (FBS) + 1% Penicillin Streptomycin (PS)) in the concave containing the cells. The final concentration of fibrinogen was dispensed to 7.5 mg/mL.
그 다음, 피브리노젠 처리된 세포를 5% CO2, 37℃의 환경의 인큐베이터에서 약 4시간 정도 배양시키면 세포를 포함하는 각각의 컨케이브에서 피브리노젠이 aggregation된 3차원 스페로이드 세포 시트가 세포 컨케이브 몰드에 형성되어, 포셉을 이용해 간단히 3차원 스페로이드 세포 시트를 획득하였다.Then, when the fibrinogen-treated cells are incubated for about 4 hours in an incubator at 5% CO 2 , 37° C., a three-dimensional spheroid cell sheet in which fibrinogen is aggregated in each concav including cells is produced. Formed in a cell concave mold, a three-dimensional spheroid cell sheet was obtained simply using forceps.
다음 도 1의 (b)는 컨케이브로부터 박리시킨 3차원 스페로이드 세포 시트를 나타낸 것이고, (c)는 이의 일부를 확대한 사진이고, (d)는 실제 얻어진 스페로이드 시트의 사진이다.Next, (b) of Figure 1 shows a three-dimensional spheroid cell sheet peeled from the concave, (c) is an enlarged photograph of a part thereof, (d) is a photograph of the actually obtained spheroid sheet.
다음 도 1을 참조하면, 3차원 구조를 가지는 스페로이드 세포를 이용할 때도 세포 시트를 효과적으로 제조할 수 있음을 확인하였다. 스페로이드(3차원 세포 구체)는 내부의 저 산소 환경으로 인해 산소와 영양분을 공급받기 위해 혈관형성인자(angiogenesis factor)들을 분비하는 다양한 인자 분비능(paracrine effect)을 갖고 있다. 따라서 이러한 스페로이드의 특성을 이용하여 신 혈관 재생을 위해 많은 연구들이 진행되고 있지만, 스페로이드를 이식하기 위해서는 별도의 전달체(delivery)를 이용하거나, 특정 주사(injection) 등의 복잡한 방법들이 요구되는 문제가 있으며 이식 부위에서의 유실의 문제로 현재 다양한 전달 방법이 연구되고 있다. 1, it was confirmed that the cell sheet can be effectively prepared even when using spheroid cells having a three-dimensional structure. Spheroids (3D cell spheres) have a paracrine effect of secreting angiogenesis factors to receive oxygen and nutrients due to an internal hypoxic environment. Therefore, many studies are being conducted for the regeneration of new blood vessels using the characteristics of these spheroids, but complex methods such as using a separate delivery or specific injection are required to implant the spheroids. Various delivery methods are currently being studied due to the problem of loss at the transplant site.
이러한 문제들을 감안할 때 본 발명에서는 3차원 구조의 스페로이드 세포 시트를 효과적으로 제조하여 별도의 공정없이 이의 회수와 이식을 원스텝(one step)으로 하는 방법이라 할 수 있다. In consideration of these problems, the present invention can be said to be a method of effectively manufacturing a three-dimensional structure of a spheroid cell sheet, and recovering and transplanting it in one step without a separate process.
실험예 1 : Mouse hind limb ischemia 모델 적용 및 laser doppler imaging 평가Experimental Example 1: Mouse hind limb ischemia model application and laser doppler imaging evaluation
상기 실시예 1에서 제조된 스페로이드 세포 시트를 누드 마우스 하지 허혈 모델에 이식하여 이식한 스페로이드 세포 시트가 허혈 조직부위에서 신혈관 형성 유도에 의한 괴사를 억제할 수 있는지 Laser doppler perfusion image 장비를 통해 정성적으로 신 혈관 유도 과정을 확인하였으며, 그 결과를 다음 도 2(정성분석), 3(정량분석)에 나타내었다. Physiological status 결과는 ischemia leg의 상태를 limb loss, necrosis, salvage 세 가지 상태로 나눠 평가하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. The spheroid cell sheet prepared in Example 1 was transplanted into a nude mouse lower extremity ischemia model to see if the transplanted spheroid cell sheet could inhibit necrosis caused by neovascularization in the ischemic tissue site through a laser doppler perfusion image device. The renal blood vessel induction process was qualitatively confirmed, and the results are shown in the following FIGS. 2 (qualitative analysis) and 3 (quantitative analysis). Physiological status results were evaluated by dividing the state of the ischemia leg into three states: limb loss, necrosis, and salvage, and the results are shown in FIG. 4 .
각 실험은 다음 5가지의 그룹으로 나누어 실시하였으며, 사용된 세포는 hADSC (1x10^6 cells/mL)를 사용하였다. Each experiment was divided into the following 5 groups, and the cells used were hADSC (1x10^6 cells/mL).
1. No treatment (대조군) → N.t1. No treatment (control group) → N.t.
2. Single cell을 ischemia site에 직접 주사(비교예 1) → SC inj. 2. Direct injection of single cell into ischemia site (Comparative Example 1) → SC inj.
3. Spheroid를 ischemia site에 직접 주사(비교예 2) → SP inj. 3. Direct injection of spheroid into ischemia site (Comparative Example 2) → SP inj.
4. fibrinogen-based cell sheet 이식(대조군2) → CS 4. Fibrinogen-based cell sheet transplantation (control group 2) → CS
5. fibrinogen-based spheroid sheet 이식(실시예 1) → SPS5. Fibrinogen-based spheroid sheet transplantation (Example 1) → SPS
다음 도 2와 3을 참조하면, 다른 그룹과 달리 스페로이드 세포 시트(SPS, 실시예 1)를 이식한 그룹에서 각각의 time point 별로 다른 그룹과 비교했을 때, 사진 상 허혈 부위에서 높은 혈액 관류를 보여주었고, 왼쪽 다리에 혈관이 가장 잘 유도된 것을 laser doppler perfusion image에서 정성분석, 및 정량분석(도 3)으로 확인할 수 있었다. 또한, 다음 도 4의 결과로부터, 스페로이드 세포 시트(SPS, 실시예 1)를 이식한 그룹이 다른 그룹과 달리 이식한 개체의 ischemia 부위에 necrosis 나 limb loss가 전혀 일어나지 않고 수술 개체의 hind limb이 정상에 가까운 상태를 유지하고 있는 것을 확인할 수 있었다.2 and 3, when compared with other groups for each time point in the group transplanted with a spheroid cell sheet (SPS, Example 1), unlike other groups, high blood perfusion at the ischemia site on the photo was observed. was shown, and it was confirmed by qualitative and quantitative analysis (FIG. 3) in the laser doppler perfusion image that blood vessels were best induced in the left leg. In addition, from the results of FIG. 4, the group transplanted with the spheroid cell sheet (SPS, Example 1) did not show any necrosis or limb loss in the ischemia site of the transplanted subject, unlike other groups, and the hind limb of the operated subject was It was confirmed that the state was maintained close to the normal.
이런 결과를 통해 이식한 hADSC spheroid sheet의 paracrine effect를 통해 신 혈관 재생에 유의미하게 작용하는 것을 확인하였다. Through these results, it was confirmed that the transplanted hADSC spheroid sheet had a significant effect on neovascularization through the paracrine effect.
실험예 2 : 조직학 분석Experimental Example 2: Histological analysis
상기 실험예 1에 따른 각 세포 시트를 이식 후 28일 후에 hind limb을 회수하여 H&E 염색 및 Masson’trichrome 염색을 통하여 조직학 분석을 진행하였으며, 그 결과를 다음 도 5에 나타내었다. After transplanting each cell sheet according to Experimental Example 1, the hind limb was recovered 28 days after transplantation, and histological analysis was performed through H&E staining and Masson' trichrome staining, and the results are shown in FIG. 5 .
조직학 결과, 대부분의 그룹에서 혈관 제거로 인해 염증과 괴사가 진행되어 손상된 근육 조직사이에 지방조직이 차 들어 온 것을 확인할 수 있었으나, 스페로이드 세포를 시트화시킨 SPS 그룹(실시예 1)의 경우, hind limb의 결손 부위에서 지방조직 (Adipose tissue, AT) 없이 조밀한 근육다발 (Muscle tissue, MT)이 형성되어 있는 반면, 스페로이드 세포를 직접 주사한 그룹(SP inj., 비교예 2)은 근육다발 사이에 지방조직과 fibrosis가 형성되어 있음으로 보아 시트화 시킨 SPS 그룹(실시예 1)에 비해 치료효과가 미흡한 것으로 확인되었다. As a result of histology, it was confirmed that adipose tissue entered between the damaged muscle tissue due to inflammation and necrosis progressed due to the removal of blood vessels in most groups, but in the case of the SPS group in which the spheroid cells were sheeted (Example 1), While a dense muscle bundle (MT) is formed without adipose tissue (AT) at the defect site of the hind limb, the group directly injected with spheroid cells (SP inj., Comparative Example 2) Since adipose tissue and fibrosis were formed between the bundles, it was confirmed that the therapeutic effect was insufficient compared to the sheet-formed SPS group (Example 1).
또한, fibrosis의 형성 정도를 반막양근(Semimembranosus)과 비복근 (Gastrocnemius) 에서 측정하였으며, 그 결과를 다음 도 6에 나타내었다. Fibrosis는 근육 기능을 손상시키고 근육 손상 후, 근육 재생에 부정적인 영향을 미치며 재부상에 대한 근육 감수성을 증가시킨다고 알려져 있으며, 이를 정량 했을 때, 두 근육에서 세포 시트화 그룹인 CS(대조군 2), SPS 그룹(실시예 1)에서 상대적으로 낮은 fibrosis 형성 정도를 보이나 특히, SPS 그룹의 경우 그룹간의 유의한 차를 보여 높은 재생능을 보임을 확인하였다. In addition, the degree of fibrosis formation was measured in semimembranosus and gastrocnemius, and the results are shown in FIG. 6 below. Fibrosis is known to impair muscle function, negatively affect muscle regeneration after muscle injury, and increase muscle susceptibility to re-injury. Although the group (Example 1) showed a relatively low degree of fibrosis formation, in particular, the SPS group showed a significant difference between the groups, confirming that it showed high regenerative ability.
실시예 2 : 단일 세포와 3차원 스페로이드 세포를 동시에 포함하는 세포 시트의 제작Example 2: Preparation of a cell sheet containing a single cell and a three-dimensional spheroid cell at the same time
상기 실시예 1의 3차원 스페로이드 제작하는 과정에서, 상기 컨케이브 몰드에 세포와 세포 배양 배지를 함께 주입시킨 후, 가벽에 위치한 세포 제거 없이 24시간동안 인큐베이터 (5% CO2, 37℃)에서 배양해 스페로이드 세포를 형성시켰다. 그 후, 상기 피브리노젠 저장 용액을 첨가한 후 인큐베이터에서 4시간 동안 배양하여 컨케이브를 제외한 영역에서 형성된 단일 세포층이 포함된 최종 스페로이드 세포 시트를 얻었다. 제조된 세포 시트의 형광현미경 사진을 다음 도 7에 나타내었다.In the process of manufacturing the three-dimensional spheroid of Example 1, after injecting the cells and the cell culture medium together into the concave mold, in an incubator (5% CO 2 , 37° C.) for 24 hours without removing the cells located on the false wall Cultured to form spheroid cells. After that, the fibrinogen stock solution was added and cultured in an incubator for 4 hours to obtain a final spheroid cell sheet containing a single cell layer formed in the region except for the concave. A fluorescence micrograph of the prepared cell sheet is shown in FIG. 7 .
다음 도 7의 형광현미경 결과를 참조하면, 단일 세포와 스페로이드 세포가 동시에 존재하는 세포 시트의 제조가 가능함을 확인할 수 있다. 이로 인해 이식할 세포의 양을 증가시킬 수 있으며, 조직으로 이식할 때 손실되는 세포의 양을 줄이면서 세포 스페로이드에서 분비되는 파라크라인 팩터 (paracrine factor)를 안정하게 결손 부위에 전달 할 수 있는 효과를 가진다.Referring to the results of fluorescence microscopy of FIG. 7, it can be confirmed that it is possible to prepare a cell sheet in which single cells and spheroid cells are present at the same time. Due to this, the amount of cells to be transplanted can be increased, and the paracrine factor secreted from the cell spheroid can be stably delivered to the defect site while reducing the amount of cells lost when transplanted into the tissue. have an effect
Claims (19)
A fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet based on fibrinogen, comprising a fibrin layer and spheroid cells formed from the fibrinogen.
상기 3차원 구조의 스페로이드 세포 시트는 피브리노젠을 배양중인 세포에 분주시켜 상기 피브리노젠이 피브린층으로 응집(aggregation) 반응을 통하여 3차원 구조의 스페로이드 세포를 포함하는 시트 형태로 형성되는 것인 피브리노젠 기반 3차원 스페로이드 세포 시트.
According to claim 1,
The spheroid cell sheet of the three-dimensional structure is formed in the form of a sheet including the spheroid cells of the three-dimensional structure through the aggregation reaction of the fibrinogen into the fibrin layer by dispensing fibrinogen into cells in culture A fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet.
상기 피브리노젠은 500 ㎍/㎖ ~ 10.0 ㎎/㎖의 농도로 포함되는 것인 피브리노젠 기반 3차원 스페로이드 세포 시트.
According to claim 1,
The fibrinogen is a fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet that is included in a concentration of 500 ㎍ / ㎖ ~ 10.0 ㎎ / ㎖.
상기 세포 시트에 포함되는 세포는 인간 섬유아세포(Fibroblast), 인간 평활근세포(SMC), 인간 혈관세포(HUVEC), 근육세포(C2C12), 신경세포(PC12 Sheet), 쥐(rat) 골세포(Osteoblast), 인간 지방유래 줄기세포 (hADSC), 성체줄기세포(adult stem cell, ASC), 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC), 유도만능줄기세포 유래된 전구세포(induced pluripotent stem cell derived progenitor cell) 중에서 선택되는 1종 이상인 것인 피브리노젠 기반 3차원 스페로이드 세포 시트.
According to claim 1,
Cells included in the cell sheet include human fibroblasts, human smooth muscle cells (SMC), human vascular cells (HUVEC), muscle cells (C2C12), nerve cells (PC12 Sheet), and rat bone cells (Osteoblast). ), human adipose-derived stem cells (hADSC), adult stem cells (ASC), embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cell derived progenitor cells A fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet that is at least one selected from among.
상기 세포 시트에 포함되는 세포는 1종 또는 2종 이상의 세포를 포함하는 것인 피브리노젠 기반 3차원 스페로이드 세포 시트.
According to claim 1,
The cells included in the cell sheet are fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet comprising one or two or more types of cells.
상기 3차원 구조의 스페로이드 세포 시트에는 단일 세포를 더 포함하는 것인 피브리노젠 기반 3차원 스페로이드 세포 시트.
According to claim 1,
The fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet further comprising a single cell in the spheroid cell sheet of the three-dimensional structure.
다수의 컨케이브를 포함하는 세포 배양 몰드에 세포를 담지시켜 3차원 구조의 스페로이드 세포를 제조하는 단계,
상기 제조된 3차원 구조의 스페로이드 세포를 포함하는 세포 배양 몰드에 상기 피브리노젠 저장 용액을 분주시키는 단계,
상기 피브리노젠 분주된 세포를 배양시켜 피브린층이 형성되면서 3차원 구조의 스페로이드를 포함하는 세포 시트로 시트화시키는 단계, 및
상기 시트화된 세포 시트를 세포 배양 몰드로부터 박리시키는 단계를 포함하는 제1항에 따른 피브리노젠 기반 3차원 스페로이드 세포 시트의 제조방법.
Dissolving fibrinogen in a serum-free medium to prepare a stock solution,
Preparing a three-dimensional structure of spheroid cells by supporting the cells in a cell culture mold containing a plurality of concaves,
dispensing the fibrinogen stock solution into a cell culture mold containing the prepared three-dimensional spheroid cells;
Culturing the fibrinogen-infused cells to form a fibrin layer to form a sheet into a cell sheet containing spheroids having a three-dimensional structure, and
A method for producing a fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet according to claim 1, comprising the step of peeling the sheeted cell sheet from a cell culture mold.
상기 세포 배양 몰드는 크기 제한없이 사용 가능한 것인 제조방법.
8. The method of claim 7,
The cell culture mold is a manufacturing method that can be used without size restrictions.
상기 세포 배양 몰드에 분주되는 피브리노젠 저장 용액의 농도는 500 ㎍/㎖ ~ 10.0 ㎎/㎖인 것인 제조방법.
8. The method of claim 7,
The concentration of the fibrinogen stock solution dispensed in the cell culture mold is 500 ㎍ / ㎖ ~ 10.0 mg / ㎖ manufacturing method.
상기 시트화된 세포 시트를 세포 배양 몰드로부터의 박리는 별도의 온도조절, 화학적 및 물리적 박리 기작을 거치지 않는 것인 제조방법.
8. The method of claim 7,
The separation of the sheeted cell sheet from the cell culture mold is a manufacturing method that does not go through a separate temperature control, chemical and physical peeling mechanism.
상기 세포 배양 몰드에 세포를 담지시키는 단계는;
상기 세포를 세포 배양 몰드의 컨케이브 내에만 담지시키는 것인 제조방법.
8. The method of claim 7,
The step of loading the cells in the cell culture mold;
A method for manufacturing the cells to be supported only in a concave of a cell culture mold.
상기 세포 배양 몰드에 세포를 담지시키는 단계는;
상기 세포를 상기 세포 배양 몰드의 컨케이브와 상기 컨케이브를 제외한 영역의 세포 배양 몰드 모두에 담지시키는 것인 제조방법.
8. The method of claim 7,
The step of loading the cells in the cell culture mold;
A method for manufacturing the cell culture mold by supporting the cells in both the cell culture mold of the cell culture mold except for the concave and the concave.
상기 제조된 세포 시트에는 3차원 구조의 스페로이드 세포를 포함하는 것인 제조방법.
12. The method of claim 11,
The manufacturing method comprising the spheroid cells of the three-dimensional structure in the prepared cell sheet.
상기 제조된 세포 시트에는 3차원 구조의 스페로이드 세포와 단일 세포를 모두 포함하는 것인 제조방법.
13. The method of claim 12,
The manufacturing method comprising both spheroid cells and single cells of a three-dimensional structure in the prepared cell sheet.
A fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet having a multilayer structure in which a plurality of fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheets according to claim 1 are stacked.
상기 다층 구조의 스페로이드 세포 시트는 이식할 세포의 양을 증대시킬 수 있으며, 서로 다른 세포를 포함하는 스페로이드 세포 시트를 적층시킬 수 있는 것인 다층 구조의 피브리노젠 기반 3차원 스페로이드 세포 시트.
16. The method of claim 15,
The multi-layered spheroid cell sheet can increase the amount of cells to be transplanted, and a multi-layered fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet that can stack spheroid cell sheets including different cells .
A drug delivery system using a fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet loaded with a drug on the fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet according to claim 1.
상기 약물 전달체는 헤파린이 결합된 피브리노젠, 및 자유 피브리노젠의 혼합 피브리노젠에 약물을 혼합하여 배양된 세포에 첨가하여 상기 혼합 피브리노젠으로부터 형성된 피브린층에 상기 약물이 탑재됨과 동시에 세포 시트를 형성하는 것인 피브리노젠 기반 3차원 스페로이드 세포 시트를 이용한 약물 전달체.
18. The method of claim 17,
The drug carrier is added to the cultured cells by mixing the drug with the mixed fibrinogen of heparin-bound fibrinogen and free fibrinogen, and the drug is loaded on the fibrin layer formed from the mixed fibrinogen. A drug delivery system using a fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet that forms a sheet.
상기 약물은 헤파린과 결합가능한 약물로써, 골형성 단백질 (Bone morphogenetic protein; BMP), 혈관 내피 성장 인자 (Vascular endothelial growth factor; VEGF), 변형 성장 인자 (Transforming growth factor-β; TGF-β), 혈소판 유도 성장인자 (Platelet derived growth factor; PDGF) 및 섬유아세포 성장인자 (Fibroblast growth factor; FGF)로부터 선택되는 1종 이상의 성장인자인 피브리노젠 기반 3차원 스페로이드 세포 시트를 이용한 약물 전달체.18. The method of claim 17,
The drug is a drug capable of binding to heparin, and includes bone morphogenetic protein (BMP), vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth factor-β (TGF-β), platelets. A drug delivery system using a fibrinogen-based three-dimensional spheroid cell sheet, which is one or more growth factors selected from platelet derived growth factor (PDGF) and fibroblast growth factor (FGF).
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| AAAS Research, vol.2020, Article ID 8970480, pp.1~15(2020)* * |
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