KR20220133262A - 박테리아 혼합물 - Google Patents

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줄리아 오
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더 잭슨 래보라토리
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Abstract

본 개시내용은 병독성 인자 유전자 및 병독성에 기여하는 다른 유전자, 예컨대 질소 호흡 유전자, 우레아제 활성 유전자, 탄수화물 대사 유전자, 철 흡수 유전자, 황 대사 유전자의 발현을 변형시킬 수 있는 에스. 에피더미디스 유형 I 세포, 에스. 에피더미디스 유형 II 세포, 에스. 에피더미디스 유형 III 세포, 에스. 에피더미디스 유형 IIIb 세포, 및 에스. 에피더미디스 유형 IV 세포로부터 선택된 스타필로코커스 (에스.) 에피더미디스 세포의 혼합물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 에스. 에피더미디스 세포 유형의 혼합물을 투여함으로써 대상체에서 피부 질환을 치료 또는 예방하고, 재발성 피부 질환의 위험을 감소시키는 방법을 제공한다.

Description

박테리아 혼합물
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)하에 2020년 1월 29일에 출원한 미국 가출원 번호 62/967,310을 우선권으로 주장하며, 이는 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
미생물 다양성은 궁극적으로 최고의 분류학적 분석이며: 미생물 종의 개별 균주는 광범위하게 다양한 표현형을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 대부분의 에스케리키아 (이.) 콜라이(Escherichia (E.) coli) 균주가 인간 위장관에서는 공생하지만, 일부 균주는 중증 질환을 유발할 수 있다 (Leimbach et al., 2013). 인간 피부에서, 보편적인 피부 콜로나이저인 스타필로코커스 (에스.) 에피더미디스(Staphylococcus (S.) epidermidis)의 공생 균주 (Oh et al., 2014, 2016)는 피부 병원체에 의한 콜로니화에 대해 보호할 수 있고 (Cogen et al., 2010a, 2010b; Lai et al., 2010), 면역계를 조절할 수 있으며 (Lai et al., 2009; Linehan et al., 2018; Naik et al., 2012; Scharschmidt et al., 2015), 심지어 피부암을 예방할 수 있다 (Nakatsuji et al., 2018). 동시에, 에스. 에피더미디스는 혈류 및 유치 의료 기기 감염의 일반적인 원인이다 (National Nosocomial Infections Surveillance System, 2004). 더욱이, 에스. 에피더미디스의 여러 임상 분리주는 항생제 내성 또는 바이오필름 형성을 코딩하는 유전자를 보유하여 ([Otto, 2009]에서 검토됨), 치료를 방해한다.
균주-수준 다양성에 대한 이해는 비교 메타게놈 (Lloyd-Price et al., 2017; Oh et al., 2014) 및 배양물-기반 연구 (Nataro and Kaper, 1998)에 의해 밝혀진 바와 같이 각각의 인간이 미생물 균주의 고유한 집합을 보유한다는 관찰에 의해 복잡해진다. 이들 균주는 모계 전파를 통해 기원할 수 있고 (Asnicar et al., 2017; Ferretti et al., 2018; Yassour et al., 2018), 상이한 숙주-특이적인 인자, 예컨대 질환 및 건강 상태에 의해 형성될 수 있다 (Duvallet et al., 2017; Greenblum et al., 2015; Tett et al., 2017; Zhang and Zhao, 2016). 그러나, 메타게놈 연구의 시퀀싱 깊이 및 배양물-기반 연구의 샘플 크기에 대한 한계로 인해, 개체 내의 후속적인 균주 다양화 (개체 자신의 고유한 박테리아 집단 다양성)는 잘 이해되어 있지 않다.
본 개시내용은 부분적으로 다중 균주를 포함하는 스타필로코커스 에피더미디스 (에스. 에피더미디스) 세포의 혼합물 (예를 들어, 에스. 에피더미디스 agr 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 IIIb, 및 유형 IV 균주로부터의 세포의 조합물)이 에스. 에피더미디스의 병독성을 감소시킴을 나타내는 예상하지 못한 데이터를 기반으로 한다. 이는 적어도 2종의 이유로 예상하지 못한 것이었다: (1) 에스. 에피더미디스 유형 IIIb 및 IV의 존재는 이전에 알려지 있지 않았고; (2) 데이터는 병독성에 대한 효과가 선택된 특정한 유형과는 무관하게 단순히 임의의 2종 이상의 에스. 에피더미디스 유형의 세포를 조합한 결과임을 시사한다. 본원의 데이터는 또한 적어도 2종의 또는 적어도 3종의 상이한 에스. 에피더미디스 유형으로부터의 세포의 존재가 박테리아 정족수 감지에 영향을 미쳐서, 정족수 감지에 의해 조절되는 세포 과정, 예컨대 병독성, 공생 접합, 및 바이오필름 형성을 변형시킴을 시사한다.
본 개시내용의 일부 측면은 (a) 스타필로코커스 (에스.) 에피더미디스 유형 I 세포, 에스. 에피더미디스 유형 II 세포, 에스. 에피더미디스 유형 III 세포, 에스. 에피더미디스 유형 IIIb 세포, 및 에스. 에피더미디스 유형 IV 세포로부터 선택된 적어도 2종의 박테리아 세포 유형을 포함하는 세포의 혼합물; 및 (b) 합성 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 합성 부형제는 희석제, 증점제, 습윤제, 보존제, 중화제, 보조유화제, 밀폐제, 및 향료로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 다른 측면은 스타필로코커스 (에스.) 에피더미디스 유형 I 세포, 에스. 에피더미디스 유형 II 세포, 에스. 에피더미디스 유형 III 세포, 에스. 에피더미디스 유형 IIIb 세포, 및 에스. 에피더미디스 유형 IV 세포로부터 선택된 적어도 2종의 박테리아 세포 유형을 포함하는 세포의 혼합물을 포함하는 조성물을 제공하며, 에스. 에피더미디스 세포 유형 중 적어도 1종은 유전자 조작된다.
본 개시내용의 추가의 측면은 스타필로코커스 (에스.) 에피더미디스 유형 I 세포, 에스. 에피더미디스 유형 II 세포, 에스. 에피더미디스 유형 III 세포, 에스. 에피더미디스 유형 IIIb 세포, 및 에스. 에피더미디스 유형 IV 세포로부터 선택된 적어도 2종의 세포 유형을 포함하는 세포의 혼합물을 제공하며, 혼합물은 국소 전달을 위한 부형제와 함께 제형화된다.
일부 실시양태에서, 혼합물의 세포는 집합적으로 대조군에 비해 질소 호흡 유전자, 우레아제 활성 유전자, 탄수화물 대사 유전자, 철 흡수 유전자, 황 대사 유전자, 및 병독성 인자 유전자로부터 선택된 유전자의 발현 수준을 변형시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 질소 호흡 유전자는 에스. 에피더미디스 narT, nreC, nreB, narX, narH, narG, sumT, nasE 및 nasD로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 우레아제 활성 유전자는 에스. 에피더미디스 ureA, ureB, ureC, ureD, ureE 및 ureF로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 탄수화물 대사 유전자는 에스. 에피더미디스 FruB, GlmS, Fba, Tkt, Tpi, Gap, GapB, Pgi, Pgk, Eno, PepcK, CitB, CitC, OgdH, Sucla2, SdhA, CitG, Mdh1, PckA, LDH, PDH, ScaD, PflB, Fdh 및 BdhA로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 철 흡수 유전자는 에스. 에피더미디스 fecD, feuC, fecE 및 yclQ로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 황 대사 유전자는 에스. 에피더미디스 cysH, cysJ, cysI, sirC, sat 및 cysC로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 병독성 인자 유전자는 에스. 에피더미디스 icaA, icaB, icaC, icaD, icaR, atl, atlE, ebh, ebhA, ebp, geh, gehD, hlb, lip, nuc, psmB, sdrF, sdrH, se2319, sspA 및 sspB로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 유전자의 발현 수준은 1.5 배 내지 12 배만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, 스타필로코커스 에피더미디스 세포 유형 중 적어도 1종은 유전자 조작된다.
본 개시내용의 일부 측면은 대상체에게 이전 실시양태 중 어느 하나의 혼합물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 피부 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 피부 질환은 모낭염, 종기, 부스럼, 농가진, 농창, 봉와직염, 아토피성 피부염, 옴, 및 탈모성 모낭염으로부터 선택된다.
본 개시내용의 다른 측면은 대상체에게 이전 청구항 중 어느 하나의 혼합물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 재발성 피부 질환의 위험을 감소시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 재발성 질환은 아토피성 피부염이다.
일부 실시양태에서, 투여는 국소 투여이다.
도 1a-1d. 개별화된 스타필로코커스 에피더미디스 (에스. 에피더미디스) 분리주의 계통발생학적 변이. (도 1a) 개체 내 진화의 2개의 대안적인 시나리오. 각각의 원은 주어진 숙주를 콜로니화하는 단일 창시자 계통으로부터 분기된 분리주의 클러스터를 나타낸다. 제1 시나리오에서 (좌측), 단일 창시자 계통으로부터 분기된 주어진 숙주로부터의 모든 분리주; 제2 시나리오에서 (우측), 다중 별개의 창시자 계통으로부터 분기된 각각의 숙주로부터의 분리주. (도 1b) 이 연구에서 샘플링된 1482개의 분리주 및 다중의 발병한 및 건강한 개체로부터의 50개의 이전에 시퀀싱된 분리주에 대한 58498개의 핵심-게놈 SNP 유전자좌를 기반으로 하는 핵심-게놈 계통발생 (중간점 루팅됨). 각각의 분리주의 피부 부위가 표시된다. (도 1c) 다중 창시자 계통으로부터 진화된 개별화된 에스. 에피더미디스 분리주. 각각의 창시자 계통은 원으로 표시되고, 유래된 분리주의 적어도 95% (즉, 끝난 마디)가 동일한 대상체 또는 공개 균주에서 발견된 가장 높은 마디로서 정의된다. 원의 크기는 해당 계통으로부터 유래된 분리주의 수를 나타낸다. (도 1d) 1482개의 분리주의 쌍별 공표형 거리. '대상체 사이의' 거리의 분포가 대상체당 샘플 크기에 따라 좌우됨을 유의하며, 가장 많은 분리주를 배양한 p0은 가장 큰 기여를 갖는다. 발샅은 대상체 사이의 그의 특이한 유사성을 설명하기 위해 강조되었다.
도 2a-2b. 에스. 에피더미디스 분리주의 대상체-특이적인 전파 패턴. (도 2a) 두 피부 부위 사이에서 공유된 시스터 분리주의 비율. (도 2b) BEAST 분석을 요약하는 전파 맵. 피부 부위를 연결하는 선의 음영은 두 부위 사이의 전파율이 0이 아니라는 사후 확률을 나타낸다. 더 나은 시각화를 위해 사후 확률 < 0.3인 선은 제거되었다.
도 3a-3d. 진화 역사의 베이지안(Bayesian) 추론. (도 3a) 과거 전파 사건으로 주석 처리된 최대 분기군 신뢰성 트리. 마디 및 가지의 선은 조상 계통의 예측된 피부 부위를 나타내는 반면에, 마디의 크기는 피부 부위 예측의 사후 확률에 비례한다. N=2000 트리를 최종 전파 추론을 위해 사용하였다. 더 나은 시각화를 위해 트리를 분기도로 변환시켰다. 화살표는 콧구멍_R에서 볼_L로의 전파 사건의 예를 도시한다. (도 3b) 계통수에서 모든 조상 마디의 추정된 연대순 연령. 조상 마디는 그들의 추정된 중간 마디 연령에 의해 분류되었고, x 축에서 각각의 단위는 상이한 조상 마디를 나타내었다. 오차 막대는 95% 최고 사후 밀도 (HPD) 간격을 나타낸다. 12-20개의 창시자 균주는 숙주보다 더 오래된 95% 최고 사후 확률 밀도의 더 낮은 종점을 갖는 마디를 기반으로 하여 예상된다. y 축 상의 표지는 기밀성을 위해 재조정되었다. (도 3c) 전파와 하위 집단 다양화 사이의 부정적인 연관성. 각각의 데이터 점은 예측된 전파율 (BEAST에 의해 추정됨) 및 피부 부위 쌍 사이의 FST 값을 나타낸다. *는 유의한 기울기를 갖는 선형 회귀선을 나타낸다 (p<0.05). 강조된 데이터 점은 쌍별 비교에서 배꼽 또는 발샅을 나타낸다. (도 3d) 2 회의 독립적인 MCMC 실행으로부터 추정된 쌍별 전파 사건을 뒷받침하는 베이즈(Bayes) 인자 (상부) 및 사후 확률 (하부)의 일관성.
도 4a-4e. 대상 분리주의 유전자 함량 다양성. (도 4a) 시퀀싱된 분리주의 수의 함수로서, 대상체-특이적인 범-게놈 (5476-6436개의 유전자 클러스터) 및 핵심-게놈 (954-1325개의 유전자 클러스터)에 대한 유전자 축적 곡선, 또는 50개의 공개 분리주의 것. 오차 막대는 10 회 시뮬레이션에 대한 표준 편차를 나타낸다. (도 4b) 대상 분리주 및 공개 균주에서 공유된 대 고유한 대상체-특이적인 범- 및 핵심-유전자. (도 4c) 보조 유전자의 존재 및 부재를 기반으로 하는 대상 분리주의 다양성. 잎 마디는 기원 피부 부위에 의해 음영 처리되고; 배경 음영은 대상체를 나타낸다. 5명의 대상체 모두로부터의 발샅 분리주를 함유하는 클러스터는 강조된다. (도 4d) 피부 부위에 걸친 변동성과 관련하여 p0에서의 에스. 에피더미디스 유전자의 분포 (다른 대상체에 대해서는 도 5d 참고). 높은 변동성을 갖는 유전자 클러스터의 예는 박스로 강조되고 (경계는 임의로 선택됨), 그들의 발생률(prevalence)은 히트맵에서 도시된다. 히트맵에서 각각의 행은 고유한 에스. 에피더미디스 유전자를 나타내고, 행 및 열 계층적 클러스터는 유클리드(Euclidean) 거리를 기반으로 하여 생성되었다. (도 4e) 대표적인 발샅 유전자의 COG 기능적 카테고리 (즉, 발샅 분리주의 >40%에서 존재하지만, 임의의 다른 피부 부위에서는 <10% 존재함, n=28).
도 5a-5j. 에스. 에피더미디스 기능적 특징의 시공간 분포. (도 5a) 상이한 시점에서 공유된 대 고유한 에스. 에피더미디스 유전자 클러스터. 도 4와 관련됨. 적어도 하나의 분리주가 하위 집단으로부터 성공적으로 배양된 시점의 총 수는 각각의 그래프의 상단에 도시된다. 유의한 시간적 변화가 있는 하위 집단은 "*"로 표시된다. 제한된 수의 분리주 (n=2)가 한 시점에서 배양되었기 때문에, p0에서 오른손 검지는 삼각형으로 표시되었다. (도 5b) 샘플 크기와 시간적 변화의 p-값 사이의 관계. 각각의 주어진 하위 집단의 경우 (데이터 점), 가장 적은 수의 분리주가 배양된 시점, 가장 많은 수의 분리주가 배양된 시점, 및 시점에 걸쳐 배양된 분리주의 총 수가 시각화되었다. (도 5c) 희귀 유전자를 포함하거나 또는 제외하는 시간적 변화의 p-값의 비교. 순열 분석은 희귀 유전자 (해당 하위 집단에서 단지 하나의 분리주에만 존재하는 이들 에스. 에피더미디스 유전자로서 정의됨)를 필터링하거나 또는 필터링하지 하지 않고 별도로 실행되었다. 이어서, 분석의 벤자미니-호흐베르크(Benjamini-Hochberg) 조정된 p-값을 비교하여, 통계적 유의성이 희귀 유전자의 존재에 대해 확고하였음을 검증하였다. (도 5d) 피부 부위에 걸쳐 그들의 변동성에 대한 에스. 에피더미디스 유전자의 분포 (대상체 p0의 경우 도 4d 참고). 높은 변동성을 갖는 유전자 클러스터의 예는 박스로 강조하였다 (경계는 임의로 선택됨). 각각의 강조된 클러스터에서 유전자의 피부-부위 분포 및 그들의 발생률이 히트맵에 도시되었다. 히트맵에서 각각의 행은 고유한 에스. 에피더미디스 유전자를 나타내고, 행 및 열 계층적 클러스터는 유클리드 거리를 기반으로 하여 생성되었다. (도 5e) 대상체 및 피부 부위에 걸쳐 차등 표현을 갖는 KEGG 모듈의 예 (전체 목록에 대해서는, 표 4 참고). 모듈 표현 (분리주에 존재하는 모듈에서 KEGG 오르토로그의 비율)은 각각의 피부 부위에서 평균 모듈 표현에 비례하게 재조정되었다. (도 5f) 대상체 및 피부 부위에 걸쳐 예측된 BGC의 발생률. (도 5g) nrps 및 철결합체 BGC의 SNP-기반 유전자 트리, 및 대상체 및 피부 부위에 걸쳐 그들의 분포. 각각의 BGC-보유 분리주의 피부 부위는 녹색으로 표시된다. (도 5h) 테르펜 BGC의 SNP-기반 유전자 트리, 및 대상체 및 피부 부위에 걸쳐 그들의 분포. 각각의 BGC-보유 분리주의 피부 부위는 녹색으로 표시된다. (도 5i-5j) 대상체 및 피부 부위에 걸쳐 상이한 유형의 박테리오신 (도 5i) 및 란티펩티드 (도 5j) BGC의 분포. 각각의 "유형"은 80% 서열 동일성으로 클러스터링된 BGC 서열을 나타낸다. 공선형 영역의 결여로 인해 이들 BGC에 대한 유전자 트리가 구축되지 않았다.
도 6. 콘티그(contig) 크기의 함수로서 콘티그 리드 커버리지(read coverage). 플롯은 50000개의 무작위로 샘플링된 데이터 점을 함유하였다.
도 7a-7d. 잠재적인 HGT 사건으로부터 유래된 시스터 분리주의 다양화. (도 7a) 쌍별 핵심-게놈 뉴클레오티드 차이의 함수로서 유전자 함량 이질성 (한 쌍의 분리주 중 한 분리주에만 존재하는 유전자의 비율). 시각화를 위해, 플롯은 10000개의 무작위로 샘플링된 데이터 점만을 포함한다. 시스터 분리주 사이의 유전자 함량 이질성은 박스로 강조된다. (도 7b) 차등 유전자의 기능적 주석. 모든 차등 유전자는 KEGG 오르토로그에 대해 맵핑되었고 (KEGG 오르토로그의 주석은 가능한 경우 도시되었음), 시스터 분리주 그룹 내에서 그들의 발생률이 도시된다. p-값은 단지 게놈 불완전성으로 인한 차등 발생률을 관찰할 확률을 나타낸다. 오차 막대는 시스터 분리주 그룹에 걸친 표준 편차를 나타낸다. (도 7c) 플라스플로우(PlasFlow)를 이용하여 확인된 20개의 고유한 이동성 요소-유사 콘티그에서 차등 유전자의 존재. 히트맵은 차등 유전자를 함유하는 확인된 25개의 염색체-유사 콘티그에 대해 정렬된 이동성 요소-유사 콘티그에서 뉴클레오티드의 분획을 나타낸다. 오차 막대는 시스터 분리주 그룹에 걸친 표준 편차를 나타낸다. 2종의 예측된 파지 서열 (콘티그 길이에 대해 거의 100% 정렬)은 화살표로 표시된다. (도 7d) (도 7c)에서 표시된 예측된 파지 서열의 유전자 함량. 서열이 원형 레이아웃으로 시각화되지만, 반드시 원형 DNA는 아님을 주목한다.
도 8. 시스터 분리주의 시공간 분포. 각각의 패널은 상이한 시점에서 확인된 시스터 분리주의 수 (상부) 및 해당 그룹으로부터의 적어도 하나의 시스터 분리주를 함유한 피부 부위의 총 수 (하부)를 나타낸다.
도 9a-9d. 예측된 에스. 에피더미디스 플라스미드에 의해 코딩된 ABR 유전자. (도 9a) 대상체 및 피부 부위에 걸쳐 예측된 플라스미드 세그먼트의 발생률 (즉, 예측된 플라스미드 세그먼트를 보유하는 분리주의 비율). 행 및 열 계층적 클러스터는 유클리드 거리를 기반으로 하여 생성되었다. 이 패널은 상이한 플라스미드 예측 방법을 이용하는 도 10b와 관련이 있다. (도 9b) 예측된 플라스미드-코딩된 ABR의 발생률. 히트맵은 행 및 열 항생제 둘 다에 내성을 부여하는 예측된 플라스미드 세그먼트의 수를 나타낸다. (도 9c) 예측된 MDR 플라스미드 세그먼트의 숙주-특이적인 분포. 2종의 예측된 MDR 플라스미드 세그먼트에 의해 코딩된 ABR 유전자 (및 그들이 내성을 부여하는 각각의 항생제)가 도시된다. 서열이 원형 레이아웃으로 시각화되지만, 갭-밀폐되지 않았음을 주목한다. (도 9d) 선택된 항생제의 MIC50 및 MIC90, 및 예측된 플라스미드-코딩된 ABR 유전자와 그들의 연관성. 시험한 6종의 모든 항생제에 내성을 부여하는 2개의 분리주 (0995 및 1085)는 화살표로 표시하였다.
도 10a-10d. 예측된 플라스미드-코딩된 ABR 유전자의 분포. (도 10a) 대상체 및 피부 부위에 걸쳐 예측된 파지 서열의 발생률 (즉, 예측된 파지 서열을 보유하는 분리주의 비율). 행 계통도는 유전자 함량의 존재 및 부재를 기반으로 하여 예측된 파지의 다양성을 나타내며, PHASTER에 의해 예측되는 바와 같이 가장 가까운 파지 기준 서열을 기반으로 하여 음영 처리된다. 열 계층적 클러스터는 유클리드 거리를 기반으로 하여 생성되었다. (도 10b) 대상체 및 피부 부위에 걸쳐 예측된 플라스미드 콘티그의 발생률 (PLSDB에 대해 정렬됨). 행 및 열 계층적 클러스터는 유클리드 거리를 기반으로 하여 생성되었다. 이 패널은 도 9a와 관련이 있다. (도 10c) 단일 대상체에서만 관찰된 예측된 플라스미드-코딩된 ABR 유전자의 피부-부위 발생률. 발생률은 해당 항생제에 대한 내성을 코딩하는 적어도 하나의 예측된 플라스미드 세그먼트를 보유하는 하위 집단에서 분리주의 비율로서 정의되었다. (도 10d) 적어도 2명의 대상체에서 관찰된 예측된 플라스미드-코딩된 ABR의 피부-부위 발생률. 주어진 항생제에 대해 예측된 플라스미드-코딩된 내성을 갖지 않는 대상체는 증가된 투명도로 나타내었다. 발생률은 해당 항생제에 대한 내성을 코딩하는 적어도 하나의 예측된 플라스미드 세그먼트를 보유하는 하위 집단에서 분리주의 비율로서 정의되었다.
도 11a-11c. 병독성에 영향을 미칠 수 있는 예측된 에스. 에피더미디스 유전자 및 변이체. (도 11a) 대상체 및 피부 부위에 걸쳐 공지된 에스. 에피더미디스 병독성 유전자의 발생률. (도 11b) 생어(Sanger) 시퀀싱에 의해 검증되는 AgrC의 막횡단 도메인을 분할하는 돌연변이. (도 11c) agr 간섭 실험에서 집단 상청액의 존재와 함께 더 높은 발현 수준을 나타내는 탄수화물 대사 유전자의 예로서, TCA 주기 경로에 관여하는 유전자.
도 12a-12f. agr 유전자좌에서의 변동성 및 예측된 병독성 발현에서의 변동. (도 12a) agrABCD 오페론의 신규한 서열 유형, 및 관련 대상체 및 피부 부위에 걸친 발생률. 팩바이오(Pacbio) 시퀀싱에 의해 검증되는 2개의 신규한 agrD 유전자의 아미노산 서열이 도시된다. (도 12b) 유형 IV 상청액에 의한 agr 유형 I-III 분리주의 정족수 감지 간섭. ddCt 값은 4 시간째에 측정된 dCT 값으로부터 0 시간째에 측정된 dCT 값을 차감함으로써 수득되었다. *: ddCt 값에 대한 웰치(Welch) t-검사 p < .05. **: ddCt 값에 대한 웰치 t-검사 p < 0.01. 각각의 실험에 대해 적어도 3 회의 생물학적 반복을 수행하였다. (도 12c) 도 12b에서와 같이 유형 I-III 상청액에 의한 agr 유형 IV 분리주의 정족수 감지 간섭. (도 12d) 대상체 및 피부 부위에 걸쳐 3종의 정통적인 agr 유형 (유형 I-III)의 분포 및 우성 유형 빈도. (도 12e) 도 12b에서와 같이 혼합 배양물에 의해 생성된 집단 상청액에 의한 agr 유형 I-III 분리주의 정족수 감지 간섭. (도 12f) 집단 상청액의 존재에 의해 유의하게 낮은 발현 수준을 나타내는 에스. 에피더미디스 오페론. *: ddCt 값에 대한 웰치 t-검사 p < .05. **: ddCt 값에 대한 웰치 t-검사 p < 0.01.
도 13a-13h. 에스. 에피더미디스 유전자 발생률과 국소 피부 미생물총 사이의 연관성. (도 13a-13d) 피부 미생물총의 분류학적 및 유전자 함량 조성. 대상체 (도 13a) 및 피부 부위 (도 13b)에 걸쳐 피부 마이크로바이옴 조성의 다양화를 설명하기 위해 종 수준에서 마이크로바이옴 분류학적 조성의 주성분 분석이 수행되었다. 가장 큰 표준을 갖는 5종의 로딩 벡터가 플롯 상에 시각화된다. 유사하게, 대상체 (도 13c) 및 피부 부위 (도 13d)에 걸쳐 피부 미생물총의 코딩 잠재성의 다양화를 설명하기 위해 마이크로바이옴 유전자 커버리지의 주성분 분석이 수행되었다. (도 13e) 재귀적 분할 트리 모델의 훈련 및 평가를 개관하는 다이어그램. (도 13f-h), 하위 집단에 걸친 에스. 에피더미디스 유전자의 변동성 (즉, 유전자 발생률 수준의 필로우(Pielou) 지수, x 축)을 고려할 때, 새로운 숙주 (즉, 시험 세트)에서 에스. 에피더미디스 유전자 발생률의 사전 예측 가능성 (도 13f), 및 피부 부위 사양 (도 13g) 및 맥락적 마이크로바이옴 특징 (도 13h)을 포함할 때의 증가된 예측 가능성이 도시된다. 피부 부위 사양 또는 마이크로바이옴 특징이 포함될 때 예측 가능성에서 가장 큰 증가를 갖는 상위 20개의 유전자는 강조되었다.
도 14a-14b. 에스. 에피더미디스 유전자 발생률과 맥락적 환경의 연관성. (도 14a) 발생률이 마이크로바이옴 조성을 설명하는 주성분 중 적어도 하나와 유의한 연관성을 갖는 에스. 에피더미디스 유전자. (도 14b) 마이크로바이옴-의존성 에스. 에피더미디스 유전자의 기능 및 플라스미드 연관성. 피부 부위 사양 또는 마이크로바이옴 특징이 포함될 때 예측 가능성에서 가장 큰 증가를 갖는 상위 20개의 유전자의 COG 기능적 카테고리 (상부), 뿐만 아니라 예측된 (플라스플로우를 통해) 및 공지된 (PLSDB를 통해) 플라스미드에서 예측 가능성 (하부)이 도시된다.
인간 피부 마이크로바이옴에서 개체내 집단-수준 다양성의 심층 조사가 본원에 제공된다. 이전에는 제한된 메타게놈 추론을 이용하여, 계통발생학적으로 다양한 균주가 피부에 공존할 수 있다고 가정되었다 (Oh et al., 2014). 건강한 피부로부터 배양된 1482개의 분리주에 대한 광범위한 게놈 및 메타게놈 조사에서, 결정적으로 각각의 대상체가 에스. 에피더미디스 계통발생학적 변동의 초기 평가에서 확인된 2종의 우세한 계통발생학적 분기군으로부터 다양한 에스. 에피더미디스 균주에 의해 콜로니화되었음이 입증되었다 (Conlan et al., 2012). 여기서, 숙주-특이적인 피부 부위 특수화, 및 진화학적 및 인구 통계학적 사건을 깊이 있게 조사하여, 공생 피부 박테리아의 시공간 다양성 및 기능에 대한 새로운 통찰을 제공하였다.
스타필로코커스 에피더미디스
일부 측면에서, 본 개시내용은 에스. 에피더미디스 유형 I 세포, 에스. 에피더미디스 유형 II 세포, 에스. 에피더미디스 유형 III 세포, 에스. 에피더미디스 유형 IIIb 세포, 및 에스. 에피더미디스 유형 IV 세포로부터 선택된 적어도 2종의 에스. 에피더미디스 세포 유형을 포함하는 스타필로코커스 에피더미디스 (에스. 에피더미디스) 세포의 혼합물을 제공한다.
에스. 에피더미디스는 정상 포유동물 피부 및 점막 마이크로바이옴의 일부인 그람-양성의 구균-형상 공생 박테리아이다. 이는 코아굴라제-음성이라는 점에서 병원성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 구별된다. 에스. 에피더미디스는 주로 겨드랑이, 팔꿈치, 무릎, 손, 발, 머리 및 배꼽을 콜로니화하지만, 콜로니화 패턴은 대상체마다 다르다.
일반적으로 위험하지는 않지만, 에스. 에피더미디스는 면역 손상된 숙주에서 기회감염 병원체이다. 특히, 에스. 에피더미디스는 유치 의료 기기, 예컨대 카테터, 인공 관절, 혈관 이식편, 중추 신경계 션트, 및 심장 판막의 감염에서 가장 흔한 원인 박테리아이다 (예를 들어, [Otto, "Staphylococcus epidermidis - the "accidental pathogen", Nat. Rev. Microbiol., 2010, 7(8): 555-567] 참고). 감염을 유발하는 다른 박테리아 중에서, 에스. 에피더미디스는 항생제 (예를 들어, 페니실린, 아미노글리코시드, 및 퀴놀론) 및 림프구 식균작용에 대해 내성인 3 차원 바이오필름을 형성하고 그에 존재하는 능력으로 인해 선천성 면역계의 경우 제거하기가 특히 어렵다.
에스. 에피더미디스 유형
에스. 에피더미디스는 정족수 감지에 의해 박테리아 집단 밀도의 변동에 대한 반응으로 유전자 발현을 조절한다. 정족수 감지는 박테리아 (예를 들어, 에스. 에피더미디스) 표현형 발현을 조절하고, 이는 박테리아 거동을 조절한다. 정족수 감지 박테리아 (예를 들어, 에스. 에피더미디스)는 세포 밀도의 함수로서 농도가 증가하는 자가 유도 물질로 지칭되는 화학적 신호 분자를 생성하고 방출한다. 자가 유도 물질에 대한 최소 농도 임계값에 도달하면, 유전자 발현에서의 변화가 박테리아 (예를 들어, 에스. 에피더미디스)에서 발생한다. 에스. 에피더미디스는 정족수 감지를 이용하여, 병독성, 공생 접합, 및 바이오필름 형성을 비롯하여 이로 제한되지 않는 세포 과정을 조절한다.
에스. 에피더미디스 병독성은 보조 유전자 조절 (agr 시스템)을 이용하여 정족수 감지에 의해 조절된다. 시퀀싱 연구는 임상적 분리주에서 에스. 에피더미디스 agr 시스템의 3종의 상이한 부류를 밝혀내었으며 (DUfour P. et al. J. Bacteriol. 2002; 184:1180-1186), 이는 본원에서 agr 유형 I, II 및 III으로 지칭된다. [Olsen ME et al. J Bacteriol. 2014; 196(19): 3482-93] 또한 참고한다. 본원에 제공된 데이터는 2종의 추가의 agr 유형: 유형 IIIb 및 IV를 확인하였다. agr 시스템은 자가 유도 펩티드 (AIP)로 공지된 세포외 펩티드 신호에 의해 제어되며, 이는 성장 동안에 분비되고 세포-밀도 의존적인 방식으로 유전자 발현을 활성화시킨다. 에스. 에피더미디스에서 agr 유전자좌는 AIP를 생성하고 검출하는 핵심 기구를 코딩하는 agrABCD 오페론으로 구성된다. AgrD는 AIP를 세포외로 분비하기 위해 신호 펩티다제와 쌍을 이루는 내재 막 펩티다제인 AgrB에 의해 분비되고 가공되는 프로펩티드 전구체이다. AIP의 축적은 히스티딘 키나제 AgrC에 의해 감지되고, 이는 신호 캐스케이드를 개시하여 ArgC가 조절인자 AgrA를 인산화시킨다. 인산화된 AgrA는 전사 인자 RNAIII의 발현을 유도하는 agr P2 및 P3 프로모터로부터의 발현을 유도한다.
에스. 에피더미디스 유형은 agrABCD 오페론에서 AgrD 서열을 기반으로 하여 분류된다. 에스. 에피더미디스 유형보다 더 많은 에스. 에피더미디스 균주가 있어서, 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물은 단지 2종의 에스. 에피더미디스 유형을 함유함과 동시에 예를 들어 적어도 5종 (예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 또는 그 초과)의 에스. 에피더미디스 균주를 함유할 수 있다. 유형 I, II, III, IIIb, 및 IV에서 AgrD 서열의 요약은 하기 표 1에 나타내었다.
표 1. - AgrD 유형 서열
Figure pct00001
* [Dufour, et al., "High genetic variability of the agr locus in Staphylococcus species," J. Bacteriol, 2002, 184: 1180-1186] 참고.
+ 실시예 4 및 도 6 참고
일부 실시양태에서, 혼합물은 2 - 500종의 에스. 에피더미디스 유형을 함유한다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 5 - 100, 50 - 250, 10 - 200, 25 - 400, 75 - 350, 또는 100 - 500종의 에스. 에피더미디스 유형을 함유한다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 2, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500종의 에스. 에피더미디스 유형을 함유한다.
일부 실시양태에서, 혼합물은 유전자 조작된 에스. 에피더미디스 세포 유형을 함유한다 (예를 들어, US 2019/0040116 참고, 2019년 2월 7일 공개됨). 유전자 조작은 천연 발생 균주 (예를 들어, 에스. 에피더미디스 균주)에 대한 게놈 변형을 지칭한다. 게놈 변형은 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR/Cas) (예를 들어, [Cong, et al., "Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems," Science, 2013, 339(6121): 819-823] 참고), 아연 핑거 뉴클레아제 (예를 들어, [Proteus and Baltimore, "Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells," Science, 2003, 300(5620): 763] 참고), 및 전사 활성화제-유사 이펙터 (예를 들어, [Boch, et al., "Breaking the code of DNA binding specificity in TAL-type III effectors," Science, 2009: 326(5959): 1509-1512] 참고)를 비롯하여 이로 제한되지 않는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 조작된 에스. 에피더미디스 유형은 유전자 조작되지 않은 (예를 들어, 천연 발생) 유형에 비해 생물학적 이점을 갖는다. 생물학적 이점은 추가 부위의 콜로니화, 증가된 생존, 증가된 증식, 항생제 내성, 병독성, 및/또는 바이오필름 형성을 비롯하여 이로 제한되지 않는 관련 기술분야에 공지된 임의의 이점일 수 있다.
일부 실시양태에서, 혼합물은 2 - 500종의 유전자 조작된 에스. 에피더미디스 유형을 함유한다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 5 - 100, 50 - 250, 10 - 200, 25 - 400, 75 - 350, 또는 100 - 500종의 유전자 조작된 에스. 에피더미디스 유형을 함유한다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 2, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500종의 유전자 조작된 에스. 에피더미디스 유형을 함유한다.
에스. 에피더미디스의 혼합물
상기 나타낸 바와 같이, 현재 5종의 에스. 에피더미디스 유형이 공지되어 있다. 아직 확인되지 않은 다른 에스. 에피더미디스 유형 또한 본 개시내용의 혼합물에 포함될 수 있다. 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물은 적어도 2종의 에스. 에피더미디스 유형을 포함하는 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 3종 이상, 4종 이상 또는 5종의 에스. 에피더미디스 유형을 포함한다. 숙련된 기술자는 에스. 에피더미스 세포의 혼합물이 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 IIIb, 및 유형 IV 에스. 에피더미스 세포의 임의의 조합물을 함유할 수 있음을 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, 혼합물은 유형 I, II, 및 III 에스. 에피더미디스 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 유형 I, II, III, IIIb, 및 IV 에스. 에피더미디스 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 유형 I, II, III, 및 IIIb 에스. 에피더미디스 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 유형 I 및 II, 유형 I 및 III, 유형 I 및 IIIb, 또는 유형 I 및 IV 에스. 에피더미디스 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 유형 I, II, 및 IIIb; 유형 I, II, 및 IV, 유형 II, III, 및 IIIb, 또는 유형 II, III, 및 IV 에스. 에피더미디스 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 유형 III, IIIb, 및 IV 에스. 에피더미디스 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 유형 III, IIIb, 및 IV 에스. 에피더미디스 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 유형 II 및 III, 유형 II 및 IIIb, 또는 유형 II 및 IV 에스. 에피더미디스 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 유형 III 및 IIIb 또는 유형 III 및 IV 에스. 에피더미디스 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 유형 IIIb 및 IV 에스. 에피더미디스 세포를 포함한다.
적어도 2종의 에스. 에피더미디스 유형을 포함하는 혼합물은 에스. 에피더미디스 세포 유형의 불균등한 분포 또는 균등한 분포를 포함할 수 있다. 불균등하게 분포된 혼합물에서, 혼합물 중 세포 유형의 백분율은 균등하지 않다. 일부 실시양태에서, 2종의 에스. 에피더미디스 세포 유형의 불균등하게 분포된 혼합물은 1종의 유형 (예를 들어, 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 IIIb, 또는 유형 IV)을 다른 세포 유형에 비해 더 높은 백분율로 포함한다. 일부 실시양태에서, 3종의 에스. 에피더미디스 세포 유형의 불균등하게 분포된 혼합물은 1종의 유형 (예를 들어, 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 IIIb, 또는 유형 IV)을 다른 2종의 세포 유형에 비해 더 높거나 또는 낮은 백분율 등으로 포함한다. 균등하게 분포된 혼합물에서, 각각의 에스. 에피더미디스 세포 유형의 혼합물의 백분율은 균등하지 않다. 일부 실시양태에서, 2종의 에스. 에피더미디스 세포 유형의 불균등하게 분포된 혼합물은 1종의 유형 (예를 들어, 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 IIIb, 또는 유형 IV)을 다른 세포 유형에 비해 더 높은 백분율로 포함한다. 일부 실시양태에서, 3종의 에스. 에피더미디스 세포 유형의 불균등하게 분포된 혼합물은 1종의 유형 (예를 들어, 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 IIIb, 또는 유형 IV)을 다른 2종의 세포 유형에 비해 더 높거나 또는 낮은 백분율 등으로 포함한다. 불균등하게 분포된 혼합물에서, 혼합물 중 세포 유형의 백분율은 균등하다. 일부 실시양태에서, 2종의 에스. 에피더미디스 세포 유형의 균등하게 분포된 혼합물은 1종의 세포 유형 (예를 들어, 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 IIIb, 또는 유형 IV)을 다른 세포 유형과 균등한 백분율로 포함한다.
유전자 발현
본 개시내용의 일부 측면에서, 대상체의 피부 세포 (예를 들어, 콜로니화된 피부 세포를 갖는 에스. 에피더미디스)와 에스. 에피더미디스의 적어도 2종의 유형이 존재하는 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물의 접촉은 대조군 세포와 비교하여 유전자 발현을 변형시킨다. 대조군 세포는 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물과 접촉하지 않은 동일한 대상체의 피부 세포를 콜로니화하는 에스. 에피더미디스 세포 및/또는 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물과 접촉하지 않은 또 다른 대상체의 피부 세포를 콜로니화하는 에스. 에피더미디스 세포일 수 있다. 변형된 발현은 감소된 유전자 발현 또는 증가된 유전자 발현일 수 있다. 변형된 발현 수준의 통계적 유의성은 웰치 t-검사, 피어슨(Pearson) t-검사, 스튜던트(Student) t-검사, 및 일원 분산 분석 (ANOVA)을 비롯하여 이로 제한되지 않는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 유전자 발현은 정량적인 역전사 PCR (qRT-PCR), 마이크로어레이 분석, 노던 블롯, 유전자 발현의 일련의 분석 (SAGE), 웨스턴 블롯, 및 RNA Seq를 비롯하여 이로 제한되지 않는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다.
피부 세포를 콜로니화하는 에스. 에피더미디스 세포에서 발현되는 임의의 유전자는 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물과의 접촉에 의해 그의 발현 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체의 피부 세포와 에스. 에피더미디스의 적어도 2종의 유형이 존재하는 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물의 접촉은 질소 호흡 유전자, 우레아제 활성 유전자, 탄수화물 대사 유전자, 철 흡수 유전자, 황 대사 유전자, 및/또는 병독성 인자 유전자의 유전자 발현을 변형시킨다.
질소 호흡 유전자
일부 실시양태에서, 피부 세포를 콜로니화하는 에스. 에피더미디스 세포에서 질소 호흡 유전자의 발현은 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물에 의해 변형된다. 에스. 에피더미디스에서 질소 호흡은 2 단계로 발생한다: (i) 니트레이트 흡수, 및 이화성 니트레이트 리덕타제에 의한 니트라이트로의 환원, 이는 후속적으로 배설됨; 및 (ii) 니트레이트의 고갈 후, 축적된 니트라이트가 유입되어, NADH-의존성 니트라이트 리덕타제에 의해 암모니아로 환원됨. 에스. 에피더미디스에서 질소 호흡에 관여하는 단백질에는 하기가 포함되나 이로 제한되지 않는다: 니트레이트를 에스. 에피더미디스 세포로 수송하는 니트레이트 수송자 단백질 (narT); 산소-고갈 조건하에 표적을 인산화시키는 세포질 히스티딘 키나제 (nreB); 니트레이트 이용가능성의 신호로 narL 단백질로 변환시키고, 니트레이트 및 니트라이트 둘 다의 신소를 narP 단백질로 변환시키는 니트레이트/니트라이트 센서 단백질 X (narX); 전자를 전달하여 니트레이트를 환원시키는 니트레이트 리덕타제 단백질 (narH, narG, nasD 및 nasE); 및 시스테인 생합성에 참여하는 S-아데노실-L-메티오닌 유로포르피리노겐 III C-메틸트랜스퍼라제 (sumT).
에스. 에피더미디스에서 질소 호흡에 관여하는 임의의 유전자는 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물과의 접촉에 의해 그의 발현이 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현이 변형된 질소 호흡 유전자는 narT, nreC, nreB, narX, narH, narG, sumT, nasE, 및 nasD로부터 선택된다.
우레아제 활성 유전자
일부 실시양태에서, 피부 세포를 콜로니화하는 에스. 에피더미디스 세포에서 우레아제 활성 유전자의 발현은 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물에 의해 변형된다. 우레아제는 수성 환경에서 우레아를 2개의 암모니아 분자 및 1개의 이산화탄소 분자로 가수분해하는 것을 촉매한다. 일반적으로, 우레아제 활성은 중화 산에 의해 산성 환경에서 박테리아 (예를 들어, 에스. 에피더미디스)를 보호한다. 따라서, 박테리아 (예를 들어 에스. 에피더미디스) 배양물을 산으로 처리하거나 또는 박테리아 배양물이 존재하는 환경을 산성화시키면 우레아제 활성이 상향 조절된다. 에스. 에피더미스 우레아제는 3종의 구조적 서브유닛: UreA, UreB, 및 UreC로 구성된 다량체성 효소이다. 우레아제는 부수 단백질 UreD, UreE, UreF, UreG, 및 UreH에 의해 활성화된다.
에스. 에피더미디스에서 우레아제 활성에 관여하는 임의의 유전자는 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물과의 접촉에 의해 그의 발현이 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현이 변형된 우레아제 활성 유전자는 ureA (유전자 ID: 1057998), ureB (유전자 ID: 1055719), ureC (유전자 ID: 1057996), ureD (유전자 ID: 1055730), ureE (유전자 ID: 1055725), 및 ureF (유전자 ID: 1057994)로부터 선택된다.
탄수화물 대사 유전자
일부 실시양태에서, 피부 세포를 콜로니화하는 에스. 에피더미디스 세포에서 탄수화물 대사 유전자의 발현은 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물에 의해 변형된다. 에스. 에피더미디스는 글루코스, 수크로스 및 락토스를 사용하여 탄수화물 대사 동안에 산 생성물을 형성할 수 있다. 탄수화물 대사 유전자는 해당 과정, 시트르산 주기를 비롯하여 이로 제한되지 않는 에스. 에피더미디스에서의 임의의 탄수화물 대사 경로에 참여할 수 있다.
일부 실시양태에서, 발현이 변형된 에스. 에피더미디스 세포에서 탄수화물 대사 유전자의 발현은 해당 과정에 참여한다. 해당 과정은 글루코스를 2개의 피루베이트 분자로 분해하여, ATP 및 NADH를 생성하는 효소적 경로이다. 해당 과정에 참여하는 단백질의 비제한적인 예에는 하기가 포함된다: 프럭토스 1-포스페이트 키나제 (FruB), 글루코사민 6-포스페이트 신테타제 (GlmS), 프럭토스 비스포스페이트 알돌라제 (Fba), 트랜스케톨라제 (Tkt), 트리오스-포스페이트 아이소머라제 (Tpi), 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제 (Gap, GapB), 포스포글리세레이트 아이소머라제 (Pgi), 포스포글리세레이트 키나제 (Pgk), 에놀라제 (Eno), 및 포스포세놀피루베이트 카르복시키나제 (PEPCK).
일부 실시양태에서, 발현이 변형된 에스. 에피더미디스 세포에서 탄수화물 대사 유전자의 발현은 시트르산 주기 (트리카르복실산 주기로도 공지됨)에 참여한다. 시트르산 주기는 아세틸-coA를 옥살로아세테이트로 효소적으로 분해하여, NADH, GTP, 및 FADH2를 생성한다. 시트르산 주기에 참여하는 단백질의 비제한적인 예에는 하기가 포함된다: 아코니타제 히드라타제 (CitB), 이소시트레이트 데히드로게나제 (CitC), 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 (OgdH), 숙시닐-CoA 신테타제 (Sucla2), 숙시네이트 데히드로게나제 (SdhA), 푸마레이트 히드라타제 (CitG), 말레이트 데히드로게나제 (MDH1), 및 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 (PckA).
일부 실시양태에서, 발현이 변형된 에스. 에피더미디스 세포에서 탄수화물 대사 유전자의 발현은 발효에 참여한다. 발효는 산소의 부재하에 탄수화물로부터 에너지 (예를 들어, ATP)의 추출이다. 발효에 참여하는 단백질의 비제한적인 예에는 락테이트 데히드로게나제 (LDH), 피루베이트 데히드로게나제 (PDH), 단쇄 아실-CoA 데히드로게나제 (ScaD), 알콜 데히드로게나제 (PflB), 포르메이트 데히드로게나제 (Fdh), 및 아세토인 리덕타제 (BdhA)가 포함된다.
에스. 에피더미디스에서 탄수화물 대사에 관여하는 임의의 유전자는 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물과의 접촉에 의해 그의 발현이 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현이 변형된 탄수화물 대사 유전자는 FruB, GlmS, Fba, Tkt, Tpi, Gap, GapB, Pgi, Pgk, Eno, PepcK, CitB, CitC, OgdH, Sucla2, SdhA, CitG, Mdh1, PckA, LDH, PDH, ScaD, PflB, Fdh, 및 BdhA로부터 선택된다.
철 흡수 유전자
일부 실시양태에서, 피부 세포에 존재하는 에스. 에피더미디스 세포에서 철 흡수 유전자의 발현은 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물에 의해 변형된다. 공생 및 병원성 박테리아 (예를 들어, 에스. 에피더미디스)는 증식하기 위해 철을 필요로 하며, 숙주 단백질 트랜스페린 및 락토페린으로부터 철을 제거하도록 조정된다. 에스. 에피더미디스 박테리아는 단백질 트랜스페린과 결합하는 그의 세포 벽에 트랜스페린-결합 단백질 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 함유한다. 이 결합은 트랜스페린으로부터 철을 제거하고, 이는 에스. 에피더미디스 세포 벽의 표면 지단백질 및 수송 단백질에 전달된 후, 세포로 전달된다. 에스. 에피더미디스에서 철 흡수에 관여하는 단백질에는 막을 가로질러 철을 수송하는 것을 돕는 철 (III) 디시트레이트 수송 시스템 퍼미아제 단백질 (fecD); 철-흡수 시스템 퍼미아제 단백질 (feuC), ATP-의존성 막 수송자; 철 수송 시스템에 에너지를 커플링시키는 철 (III) 디시트레이트 수송 ATP-결합 단백질 (FecE); 및 철-무함유 및 제2철 페트로박틴에 선택적으로 결합하는 페트로박틴-결합 단백질 (YclQ)이 포하되나 이로 제한되지 않는다.
에스. 에피더미디스에서 철 흡수에 관여하는 임의의 유전자는 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물과의 접촉에 의해 그의 발현이 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현이 변형된 철 흡수 유전자는 fecD, feuC, fecE, 및 yclQ로부터 선택된다.
황 대사 유전자
일부 실시양태에서, 피부 세포에 존재하는 에스. 에피더미디스 세포에서 황 대사의 발현은 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물에 의해 변형된다. 황 대사는 황의 산화 또는 환원을 지칭한다. 환원된 황 형태 (예를 들어, 술파이트, 황화수소, 원소 황, 티올술페이트)가 황으로 산화될 때, 술페이트-산화 박테리아 (예를 들어, 에스. 에피더미디스)는 ATP를 생성한다. 술페이트-환원 박테리아 (예를 들어, 에스. 에피더미디스)는 술페이트 및 다른 산화된 황 화합물, 예컨대 술파이트, 티오술페이트, 및 원소 황을 술피드로 환원시킨다. 술페이트를 환원시키는 목적은 효소 ATP 술푸릴라제, APS 리덕타제 및 술파이트 리덕타제를 사용하여 에너지를 생성하기 위한 것이며, 술피드는 배설된다. 황 대사에 관여하는 단백질에는 하기가 포함되나 이로 제한되지 않는다: 활성화된 술페이트를 술파이트로 환원시키는 포스포아데노신 포스포술페이트 리덕타제 (cysH); 술파이트에서 술피드로의 6-전자 환원을 촉매하는 술파이트 리덕타제 복합체의 성분인 술파이트 리덕타제 서브유닛 알파 (cysJ) 및 술파이트 리덕타제 서브유닛 베타 (cysI); 프레코린-2 데히드로게나제 (sirC), 막횡단 철 수송자; ATP 및 술페이트로부터 아데노신 5'-포스포술페이트의 형성을 촉매하는 술페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 (sat); 활성화된 술페이트의 합성을 촉매하는 아데닐릴 술페이트 키나제 (cysC); 및 L-시스테이닐-tRNAcys의 형성을 촉매하는 시스테인 tRNA 리가제 (cysS).
에스. 에피더미디스에서 황 대사에 관여하는 임의의 유전자는 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물과의 접촉에 의해 그의 발현이 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현이 변형된 철 흡수 유전자는 cysH, cysJ, cysI, sirC, sat, cysC, 및 cysS (유전자 ID: 1058061)로부터 선택된다.
병독성 인자 유전자
일부 실시양태에서, 피부 세포에 존재하는 에스. 에피더미디스 세포에서 병독성 인자 유전자의 발현은 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물에 의해 변형된다. 병독성 인자는 그들의 생존, 증식, 및 면역기피를 증가시키는 박테리아 (예를 들어, 에스. 에피더미디스)에 의해 생성되는 단백질이다. 에스. 에피더미디스에서 병독성 인자인 단백질에는 하기가 포함되나 이로 제한되지 않는다: 바이오필름 형성에 중요한 엑스포다당류 다당류 세포간 부착 (PIA)을 생성하는 세포내 부착 단백질 A (icaA), 세포내 부착 단백질 B (icaB), 세포내 부착 단백질 C (icaC), 세포내 부착 단백질 D (icaD), 및 세포내 부착 단백질 R (icaR); 세포질 단백질을 배설하고 부착 분자로서 작용하는 오토리신 (atl) 및 오토리신 E (altE); 피브로넥틴의 가용성 및 고정된 형태 둘 다에 대한 부착을 촉진시키는 세포외 매트릭스 결합 단백질 (ebh), 세포외 매트릭스 결합 단백질 A (ebhA), 및 세포외 매트릭스 결합 단백질 B (ebhB); 엘라스틴에 결합하는 엘라스틴 결합 단백질 (ebp); 농양에서 생존을 촉진시킬 수 있는 글리세롤 에스테르 히드롤라제 (geh) 및 글리세롤 에스테르 히드롤라제 D (gehD); 스핑고미엘린에 대해 특이적인 활성을 갖는 포스포리파제 C 효소인 베타 헤모리신 (hlb); 지방 알콜을 가수분해하는 트리아실글리세롤 리파제 (lip); 단일-가닥 핵산을 소화시키는 뉴클레아제 (nuc); 독소로서 작용하고, 바이오필름 형성 및 콜로니 확산을 보조하는 페놀-가용성 모듈린 베타 (psmB); 바이오필름 형성에서 유형 I 콜라겐 결합을 매개하는 세린-아스파르테이트 반복 단백질 F (sdrF); 에스. 에피더미디스 세포의 표면에서 발현되는 세린-아스파르테이트 반복 단백질 H (sdrH); 에스. 에피더미디스 세포의 표면에서 발현되는 리신 단백질인 오토리신 (se2319); 피브로넥틴-결합 단백질 (FnBP) 및 표면 단백질 A의 분해에 대해 가장 중요한 프로테아제인 글루타밀 엔도펩티다제 (sspA); 및 숙주 엘라스틴, 피브로겐, 피브로넥틴, 및 키니노겐을 분해하는 시스테인 프로테아제인 스타포파인 B (sspB).
에스. 에피더미디스에서 병독성 인자를 코딩하는 임의의 유전자는 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물과의 접촉에 의해 그의 발현이 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현이 변형된 병독성 인자 유전자는 icaA, icaB, icaC, icaD, icaR, atl, atlE, ebh, ebhA, ebp, geh, gehD, hlb, lip, nuc, psmB, sdrF, sdrH, se2319, sspA, 및 sspB로부터 선택된다.
발현 변화의 수준
에스. 에피더미디스 세포의 혼합물과 접촉한 피부 상의 에스. 에피더미디스 세포에서 변형된 유전자 발현은 감소된 유전자 발현 또는 증가된 유전자 발현일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현은 대조군과 비교하여 감소된다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현은 대조군과 비교하여 증가된다. 일부 실시양태에서, 일부 유전자의 유전자 발현은 감소되고, 일부 유전자의 유전자 발현은 증가된다.
일부 실시양태에서, 유전자 발현은 1.5 배 내지 12 배만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현은 1.0 배 내지 10 배, 2.0 배 내지 5.0 배, 4.0 배 내지 12 배, 또는 3 배 내지 9 배만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현은 1.5 배, 2.0 배, 2.5 배, 3.0 배, 3.5 배, 4.0 배, 4.5 배, 5.0 배, 5.5 배, 6.0 배, 6.5 배, 7.0 배, 7.5 배, 8.0 배, 8.5 배, 9.0 배, 9.5 배, 10.0 배, 10.5 배, 11.0 배, 11.5 배, 또는 12.0 배만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, 유전자 발현은 10% 내지 100%만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현은 20% 내지 90%, 30% 내지 80%, 40% 내지 70%, 또는 50% 내지 60%만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현은 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 100%만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, 유전자 발현은 1.5 배 내지 12 배만큼 증가된다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현은 1.0 배 내지 10 배, 2.0 배 내지 5.0 배, 4.0 배 내지 12 배, 또는 3 배 내지 9 배만큼 증가된다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현은 1.5 배, 2.0 배, 2.5 배, 3.0 배, 3.5 배, 4.0 배, 4.5 배, 5.0 배, 5.5 배, 6.0 배, 6.5 배, 7.0 배, 7.5 배, 8.0 배, 8.5 배, 9.0 배, 9.5 배, 10.0 배, 10.5 배, 11.0 배, 11.5 배, 또는 12.0 배만큼 증가된다.
일부 실시양태에서, 유전자 발현은 10% 내지 100%만큼 증가된다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현은 20% 내지 90%, 30% 내지 80%, 40% 내지 70%, 또는 50% 내지 60%만큼 증가된다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현은 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 100%만큼 증가된다.
조성물
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 혼합물은 조성물에 존재한다. 혼합물을 포함하는 조성물은 예를 들어 치료 유효량인 혼합물의 임의의 양을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물의 중량을 기준으로 적어도 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 3.0%, 4.0%, 5.0%, 6.0%, 7.0%, 8.0%, 9.0%, 10.0%, 11.0%, 12.0%, 13.0%, 14.0%, 15.0%, 16.0%, 17.0%, 18.0%, 19.0%, 20.0%, 25.0%, 30.0%, 35.0%, 40.0%, 45.0%, 50.0% 또는 그 초과를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상한은 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물의 중량을 기준으로 90.0%이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물의 중량을 기준으로 0.01% 내지 30%, 0.01% 내지 20%, 0.01% 내지 5%, 0.1% 내지 30%, 0.1% 내지 20%, 0.1% 내지 15%, 0.1% 내지 10%, 0.1% 내지 5%, 0.2% 내지 5%, 0.3% 내지 5%, 0.4% 내지 5%, 0.5% 내지 5%, 1% 내지 5%, 또는 그 초과를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 2 - 500종의 에스. 에피더미디스 유형을 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 5 - 100, 50 - 250, 10 - 200, 25 - 400, 75 - 350 또는 100 - 500종의 에스. 에피더미디스 유형을 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 또는 500종의 에스. 에피더미디스 유형을 함유한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 국소 조성물이다. 국소 조성물은 그를 필요로 하는 대상체에게 국소 투여하기 위해 제형화된다. 일부 실시양태에서, 국소 조성물은 제약학적 부형제를 함유한다.
국소 또는 경피 투여를 위한 투여 형태에는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치, 점적제 및 흡입제가 포함된다. 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물은 멸균 조건하에 적합한 제약상 허용가능한 부형제 (예를 들어, 희석제 및/또는 담체)와 혼합될 수 있다. 따라서, 연고, 페이스트, 크림 및 겔은 부형제를 함유할 수 있다. 분말 및 스프레이는 부형제 및/또는 추진제를 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제형은 국소 제형이다. 국소 제형은 예를 들어 신체 표면에 적용하기에 적합한 임의의 형태, 예컨대 크림, 로션, 스프레이, 용액, 겔, 연고, 페이스트, 깁스, 페인트, 생체접착제, 현탁액, 에멀젼 등일 수 있고/거나, 리포솜, 미셀 및/또는 미세구를 함유하도록 제조될 수 있다. 이러한 제형은 신체 표면에 적용시 및 그 후에 신체 표면으로부터 증발하는 수분이 제형 내에서 유지되도록 폐쇄성 상층과 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제형은 살아있는 세포 배양 조성물을 포함할 수 있고, 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물을 포함할 수 있다. 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물의 이러한 살아있는 세포 배양물 조성물은 에스. 에피더미디스와 연관된 비정상적인 피부 상태를 치료하거나 또는 예방하기 위해 예를 들어 피부에 직접적으로 전달될 수 있다.
국소 제형에는 임의의 다른 활성 성분(들)이 관련 기술분야에 공지된 피부과용 비히클 (예를 들어, 수성 또는 비수성 겔, 연고, 유중수 또는 수중유 에멀젼)에 용해되거나 또는 분산된 것들이 포함된다. 이러한 비히클의 구성성분은 물, 수성 완충제 용액, 비-수성 용매 (예컨대 에탄올, 이소프로판올, 벤질 알콜, 2-(2-에톡시에톡시)에탄올, 프로필렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 모노라우레이트, 글리코푸롤 또는 글리세롤), 오일 (예를 들어 광유, 예컨대 액체 파라핀, 천연 또는 합성 트리글리세리드, 예컨대 미글리올(MIGLYOL)™, 또는 실리콘 오일, 예컨대 디메티콘)을 포함할 수 있다. 그 중에서도, 제형의 성질 뿐만 아니라 그의 의도된 용도 및 적용 부위에 따라, 사용된 제형은 하기 목록으로부터 선택된 적어도 하나의 성분 (예를 들어, 제형이 수성 겔인 경우, 물 이외의 성분)을 함유할 수 있다: 가용화제 또는 용매 (예를 들어, β-시클로덱스트린, 예컨대 히드록시프로필 β-시클로덱스트린, 또는 알콜 또는 폴리올, 예컨대 에탄올, 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤); 증점제 (예를 들어, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 또는 카르보머); 겔화제 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체); 보존제 (예를 들어, 벤질 알콜, 벤즈알코늄 클로라이드, 클로르헥시딘, 클로르부톨, 벤조에이트, 소르브산칼륨 또는 EDTA 또는 그의 염); 및 pH 완충화제(들) (예컨대 디히드로겐 포스페이트 및 히드로겐 포스페이트 염의 혼합물, 또는 시트르산 및 히드로겐 포스페이트 염의 혼합물). 제약상 허용가능한 부형제가 제형에 혼입될 수 있으며, 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 부형제 (예를 들어, 담체)일 수 있다. 비제한적인 예에는 물, 저급 알콜, 고급 알콜, 다가 알콜, 단당류, 이당류, 다당류, 탄화수소 오일, 지방 및 오일, 왁스, 지방산, 실리콘 오일, 비이온성 계면활성제, 이온성 계면활성제, 실리콘 계면활성제, 및 이러한 담체의 물-기반 혼합물 및 에멀젼-기반 혼합물이 포함된다.
제약학적 부형제의 다른 비제한적인 예에는 하기가 포함된다: 항접착제 (예를 들어, 스테아르산마그네슘), 결합제 (예를 들어, 수크로스, 락토스, 전분, 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스), 당 알콜 (예를 들어, 크실리톨, 소르비톨, 만니톨), 단백질 (예를 들어, 젤라틴), 합성 중합체 (예를 들어, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜), 코팅제 (예를 들어, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 셸락, 옥수수 단백질 제인); 붕해제 (예를 들어, 가교된 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스), 전분 (예를 들어, 글리콜레이트), 활택제 (예를 들어, 실리카 겔, 흄드 실리카, 활석, 탄산마그네슘), 보존제 (예를 들어, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C, 레티닐 팔미테이트, 셀레늄, 시스테인, 메티오닌, 시트르산, 시트르산나트륨, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤), 및 비히클 (예를 들어, 바셀린, 디메틸 술폭시드, 광유).
제약상 허용가능한 희석제 또는 담체는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며 (예를 들어, [Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, Pa.) 및 The National Formulary (American Pharmaceutical Association, Washington, D.C.)] 참고), 당 (예를 들어, 락토스, 수크로스, 만니톨, 및 소르비톨), 전분, 셀룰로스 제제, 인산칼슘 (예를 들어, 인산이칼슘, 인산삼칼슘 및 인산수소칼슘), 시트르산나트륨, 물, 수성 용액 (예를 들어, 식염수, 염화나트륨 주사, 링거(Ringer) 주사, 덱스트로스 주사, 덱스트로스 및 염화나트륨 주사, 락테이트화 링거 주사), 알콜 (예를 들어, 에틸 알콜, 프로필 알콜, 및 벤질 알콜), 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 글리콜), 유기 에스테르 (예를 들어, 에틸 올레에이트 및 트리글리세리드), 생분해성 중합체 (예를 들어, 폴리락티드-폴리글리콜리드, 폴리(오르토에스테르), 및 폴리(무수물)), 엘라스토머 매트릭스, 리포솜, 미세구, 오일 (예를 들어, 옥수수, 배아, 올리브, 피마자, 참깨, 면실 및 땅콩), 코코아 버터, 왁스 (예를 들어, 좌제 왁스), 파라핀, 실리콘, 활석, 실리실레이트 등이 포함된다. 본 개시내용의 제약학적 조성물에서 사용되는 각각의 제약상 허용가능한 희석제 또는 담체는 제형의 다른 성분과 상용성이고 대상체를 손상시키지 않는다는 관점에서 "허용가능"해야 한다. 선택된 투여 형태 및 의도된 투여 경로에 적합한 희석제 또는 담체는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 선택된 투여 형태 및 투여 방법을 위한 허용가능한 희석제 또는 담체는 관련 기술분야의 통상의 기술을 이용하여 결정될 수 있다.
필름 형성제는 건조되면 적용 부위 상에 보호 필름을 형성한다. 필름은 활성 성분의 제거를 억제하고, 치료할 부위와 접촉되게 유지시킨다. 본원에서 사용하기에 적합한 필름 형성제의 예는 플렉서블 콜로디온(Flexible Collodion), USP이다. [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed. (Easton, Pa.: Mack Publishing Co., 1995), at page 1530]에 기재된 바와 같이, 콜로디온은 피록실린 (니트로셀룰로스)을 함유하는 에틸 에테르/에탄올 용액이며, 증발하여 피록실린 필름을 남긴다. 필름 형성제는 추가로 담체로서 작용할 수 있다. 건조되어 필름을 형성하는 용액은 때때로 페인트로 지칭된다. 크림은 제약학적 제형 분야에 널리 공지된 바와 같이 점성 액체 또는 반고체 에멀젼, 수중유 또는 유중수이다.
크림 베이스는 물로 세척가능하며, 오일 상, 유화제, 및 수성 상을 함유한다. "내부" 상으로도 지칭되는 오일 상은 일반적으로 바셀린 및 지방 알콜, 예컨대 세틸 또는 스테아릴 알콜로 구성된다. 수성 상은 일반적으로 오일 상보다 부피가 더 크지만 반드시 그런 것은 아니며, 일반적으로 습윤제를 함유한다. 크림 제형에서 유화제는 일반적으로 비이온성, 음이온성, 양이온성 또는 양쪽성 계면활성제이다. 로션은 마찰 없이 피부 표면에 적용되는 제제이며, 전형적으로 활성 작용제를 비롯한 입자가 물 또는 알콜 베이스 중에 존재하는 액체 또는 반액체 제제이다. 로션은 일반적으로 고체의 현탁액이며, 일부 실시양태에서 수중유 유형의 액체 유성 에멀젼을 포함한다. 로션은 더 많은 유체 조성물의 적용을 용이하게 하기 때문에 큰 신체 면적을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 로션은 더 양호한 분산액을 생성하기 위한 현탁화제, 뿐만 아니라 피부와 접촉시 활성 작용제의 국소화 및 유지에 유용한 화합물, 예를 들어 메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스 등을 함유한다.
용액은 용해된 물질의 분자가 용매의 분자 사이에서 분산되도록 액체에 1 종 이상의 화학 물질 (용질)을 용해시킴으로써 제조된 균질한 혼합물이다. 용액은 용질을 완충시키거나, 안정화시키거나 또는 보존하기 위해 다른 제약학적으로 또는 미용학적으로 허용가능한 화학물질을 함유할 수 있다. 용액을 제조하는데 사용되는 용매의 일반적인 예는 에탄올, 물, 프로필렌 글리콜 또는 임의의 다른 허용가능한 비히클이다.
물론 널리 공지된 바와 같이, 겔은 반고체의 현탁액-유형 시스템이다. 단일-상 겔은 전형적으로 수성인 담체 액체에 걸쳐 실질적으로 균일하게 분포된 유기 거대 분자를 함유하지만, 바람직하게는 알콜 및 임의적으로 오일 또한 함유한다. 유기 거대 분자, 예를 들어 겔화제의 예는 가교된 아크릴산 중합체, 예컨대 중합체의 카르보머 패밀리, 예를 들어 카르보폴(CARBOPOL)® 상표명하에 상업적으로 입수될 수 있는 카르복시폴리알킬렌이다. 다른 예는 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 옥시드, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 및 폴리비닐알콜; 셀룰로스성 중합체, 예컨대 히드록시-프로필 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 히드록시-프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 및 메틸셀룰로스; 검, 예컨대 트래거캔쓰 및 크산탄 검; 알긴산나트륨; 및 젤라틴이다. 균일한 겔을 제조하기 위해, 분산화제, 예컨대 알콜 또는 글리세린이 첨가될 수 있거나, 또는 연화처리, 기계적 혼합 또는 교반, 또는 이들의 조합에 의해 겔화제를 분산시킬 수 있다. 관련 기술분야에 또한 널리 공지된 연고는 전형적으로 바셀린 또는 다른 석유 유도체를 기반으로 하는 반고체이다. 사용되는 구체적인 연고 베이스는 관련 기술분야의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 수많은 바람직한 특징, 예를 들어 연화성 등을 제공하는 것이다. 다른 담체 또는 비히클과 마찬가지로, 연고 베이스는 불활성이고, 안정하고, 자극적이지 않으며, 민감하지 않아야 한다. [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed. (Easton, Pa.: Mack Publishing Co., 1995), at pages 1399-1404]에서 설명된 바와 같이, 연고 베이스는 4종의 부류로 그룹화될 수 있다; 유화가능한 베이스; 에멀젼 베이스; 및 수용성 베이스. 유성 연고 베이스에는 예를 들어, 식물성 오일, 동물로부터 수득한 지방, 및 석유로부터 수득한 반고체 탄화수소가 포함된다.
흡수성 연고 베이스로도 공지된 유화가능한 연고 베이스는 물을 거의 또는 전혀 함유하지 않으며, 예를 들어 히드록시스테아린 술페이트, 무수 라놀린, 및 친수성 바셀린이 포함된다. 에멀젼 연고 베이스는 유중수 (W/O) 에멀젼 또는 수중유 (O/W) 에멀젼이며, 예를 들어 아세틸 알콜, 글리세릴 모노스테아레이트, 라놀린, 및 스테아르산이 포함된다. 바람직한 수용성 연고 베이스는 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜로부터 제조되며; 추가의 정보를 위해서는 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy]를 참고한다.
페이스트는 활성 작용제가 적합한 베이스에 현탁되어 있는 반고체 투여 형태이다. 베이스의 성질에 따라, 페이스트는 지방 페이스트 또는 단일-상 수성 겔로 제조된 것들로 나뉘어 진다. 지방 페이스트에서 베이스는 일반적으로 바셀린 또는 친수성 바셀린 등이다. 단일-상 수성 겔로 제조된 페이스트는 일반적으로 베이스로서 카르복시메틸셀룰로스 등을 포함한다.
증진제는 전형적으로 가소화 증진제로 지칭되는 친유성 공동-증진제, 예를 들어 150 내지 1000 범위의 분자량, 1 중량% 미만, 0.5 중량% 미만 또는 0.2 중량% 미만의 수용해도를 갖는 증진제이다. 가소화 증진제의 힐데브란트(Hildebrand) 용해도 파라미터 (δ)는 2.5 내지 10의 범위, 또는 5 내지 10의 범위이다. 친유성 증진제의 예에는 지방 에스테르, 지방 알콜, 및 지방 에테르가 포함된다. 구체적인 지방산 에스테르의 예에는 메틸 라우레이트, 에틸 올레에이트, 프로필렌 글리콜 프로필렌 글리세롤 디라우레이트, 글리세롤 모노라우레이트, 글리세롤 모노올레에이트, 이소프로필 n-데카노에이트, 및 옥틸도데실 미리스테이트가 포함된다. 지방 알콜에는 예를 들어 스테아릴 알콜 및 올레일 알콜이 포함되는 반면에, 지방 에테르에는 디올 또는 트리올, 바람직하게는 C2-C4 알칸 디올 또는 트리올이 1 또는 2개의 지방 에테르 치환체로 치환된 화합물이 포함된다.
추가의 투과 증진제는 국소 약물 전달 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고/거나, 관련 문서 및 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, [Percutaneous Penetration Enhancers, eds. Smith et al. (CRC Press, 1995)]를 참고한다.
상기 확인된 것 이외의 다양한 다른 첨가제가 본 개시내용의 조성물에 포함될 수 있다. 이들에는 항산화제, 수렴제, 향수, 보존제, 연화제, 안료, 염료, 습윤제, 추진제, 및 자외선 차단제, 뿐만 아니라 제약학적으로 존재할 수 있거나 또는 달리 바람직한 다른 부류의 물질이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 본 개시내용의 제형에 포함되는 임의적인 첨가제의 전형적인 예는 다음과 같다: 보존제, 예컨대 소르베이트; 용매, 예컨대 이소프로판올 및 프로필렌 글리콜; 수렴제, 예컨대 멘톨 및 에탄올; 연화제, 예컨대 폴리알킬렌 메틸 글리코시드; 습윤제, 예컨대 글리세린; 유화제, 예컨대 글리세롤 스테아레이트, PEG-100 스테아레이트, 폴리글리세릴-3 히드록시라우릴 에테르, 및 폴리소르베이트 60; 소르비톨 및 다른 폴리히드록시알콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜; 자외선 차단제, 예컨대 옥틸 메톡실 신나메이트 (파르솔(Parsol) MCX로서 상업적으로 입수가능함) 및 부틸 메톡시 벤조일메탄 (상표명 파르솔® 1789하에 입수가능함); 항산화제, 예컨대 아스코르브산 (비타민 C), a-토코페롤 (비타민 E), β-토코페롤, γ-토코페롤, δ-토코페롤, ε-토코페롤, ζι-토코페롤, ZΓ-토코페롤, η-토코페롤, 및 레티놀 (비타민 A); 필수 오일, 세라미드, 필수 지방산, 광유, 식물성 오일 (예를 들어, 대두유, 야자유, 시어 버터의 액체 분획, 해바라기유), 동물 오일 (예를 들어, 퍼히드로스쿠알렌), 합성 오일, 실리콘 오일 또는 왁스 (예를 들어, 시클로메티콘 및 디메티콘), 플루오린화 오일 (일반적으로 퍼플루오로폴리에테르), 지방 알콜 (예를 들어, 세틸 알콜), 및 왁스 (예를 들어, 밀랍, 카르나우바 왁스, 및 파라핀 왁스); 피부-감촉 변형제; 및 증점제 및 구조화제, 예컨대 팽윤성 점토, 및 카르보폴® 상표명하에 상업적으로 입수할 수 있는 가교된 카르복시폴리알킬렌. 다른 첨가제에는 유익한 작용제, 예컨대 피부 (특히, 각질층에서 피부 상층)를 컨디셔닝하고, 그의 물 함량의 감소를 지연시킴으로써 그를 부드럽게 유지시키고/거나, 피부를 보호하는 물질이 포함된다. 이러한 컨디셔너 및 보습제에는 예를 들어 피롤리딘 카르복실산 및 아미노산; 유기 항미생물제, 예컨대 2,4,4'-트리클로로-2-히드록시 디페닐 에테르 (트리클로산) 및 벤조산; 항염증제, 예컨대 아세틸살리실산 및 글리시르레틴산; 항지루성 작용제, 예컨대 레티노산; 혈관확장제, 예컨대 니코틴산; 멜라닌 형성의 억제제, 예컨대 코지산; 및 이들의 혼합물이 포함된다. 추가로, 추가의 활성 작용제에는 예를 들어 알파 히드록시산, 알파 케토산, 중합체성 히드록시산, 보습제, 콜라겐, 해양 추출물, 및 항산화제, 및/또는 제약상 허용가능한 염, 에스테르, 아미드, 또는 이들의 다른 유도체가 포함된다. 추가의 작용제에는 피부 조직에서 산소 공급을 개선시킬 수 있는 것들이 포함된다. 선스크린 및 UV 흡수 화합물 또한 포함될 수 있다. 이러한 선스크린 및 UV 흡수 화합물의 비제한적인 예에는 아미노벤조산 (PABA), 아보벤존, 시녹세이트, 디옥시벤존, 호모살레이트, 멘틸 안트라닐레이트, 옥스토크릴렌, 옥틸 메톡시신나메이트, 옥틸 살리실레이트, 옥시벤존, 파디르네이트 O, 페닐 벤즈이미다졸 술폰산, 술리소벤존, 이산화티타늄, 트롤아민 살리실레이트, 산화아연, 엔술리졸, 메라디라에이트, 옥티녹세이트, 옥티살레이트 및 옥토크릴렌이 포함된다.
다른 실시양태는 본 개시내용의 제형으로의 처리를 용이하게 하는 다양한 비-발암성, 비-자극성 치유 물질을 포함할 수 있다. 이러한 치유 물질에는 영양분, 무기질, 비타민, 전해질, 효소, 허브, 식물 추출물, 선 또는 동물 추출물, 또는 피부 장애의 치유를 용이하게 하도록 제형에 첨가될 수 있는 안전한 치료제가 포함된다.
이들 다양한 첨가제의 양은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예를 들어 국소 제형의 총 중량의 0.01% 내지 20%의 범위이다.
본 개시내용의 제형은 또한 통상적인 첨가제, 예컨대 불투명화제, 향료, 착색제, 안정화제, 계면활성제 등을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보관시 부패를 방지하기 위해, 즉, 미생물, 예컨대 효모 및 곰팡이의 성장을 억제하기 위해 다른 작용제, 예컨대 항미생물제 또한 첨가될 수 있다.
적합한 항미생물제는 전형적으로 p-히드록시벤조산의 메틸 및 프로필 에스테르 (메틸 및 프로필 파라벤), 나트륨 벤조에이트, 소르브산, 이미드우레아, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 예를 들어 관심 폴리펩티드의 생성을 억제하거나 (글리코스) 또는 유도하기 (크실로스) 위해 다른 작용제, 예컨대 억제제 및 유도제 또한 첨가될 수 있다. 이러한 첨가제는 제형과 상용성이며 제형의 기능을 방해하지 않는다면 사용될 수 있다.
제형은 또한 투여되는 화학 물질 또는 조성물의 다른 성분으로 인한 피부 자극 또는 피부 손상의 가능성을 최소화하거나 또는 제거하기 위해 자극-완화 첨가제를 함유할 수 있다.
적합한 자극-완화 첨가제에는 예를 들어 하기가 포함된다: a-토코페롤; 모노아민 옥시다제 억제제, 특히 페닐 알콜, 예컨대 2-페닐-1-에탄올; 글리세린; 살리실레이트; 아스코르베이트; 이오노포어, 예컨대 모넨신; 양염성 아민; 염화암모늄; N-아세틸시스테인; 캡사이신; 및 클로로퀸. 자극-완화 첨가제는 존재하는 경우 자극 또는 피부 손상을 완화시키는데 효과적인, 전형적으로 제형의 20 중량% 이하, 더욱 전형적으로 5 중량% 이하를 나타내는 농도로 조성물에 혼입될 수 있다.
일부 실시양태에서 본 발명의 제형에 혼입될 수 있고, 따라서 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물과 함께 국소적으로 도포될 수 있는 추가로 적합한 약리학적 활성 작용제에는 하기가 포함되나 이로 제한되지 않는다: 착색된 또는 착색되지 않은 검버섯, 각화증 또는 주름을 개선시키거나 또는 근절시키는 작용제; 항미생물제; 항박테리아제; 항소양제 및 항건조증제; 항염증제; 국소 마취제 및 진통제; 코르티코스테로이드; 레티노이드; 비타민; 호르몬; 및 항대사물.
국소 약리학적 활성 작용제의 일부 예에는 아시클로비르, 암포테리신, 클로르헥시딘, 클로트리마졸, 케토코나졸, 에코나졸, 미코나졸, 메트로니다졸, 미노시클린, 니스타틴, 네오마이신, 카나마이신, 페니토인, 파라-아미노 벤조산 에스테르, 옥틸 메톡시신나메이트, 옥틸 살리실레이트, 옥시벤존, 디옥시벤존, 토코페롤, 토코페릴 아세테이트, 셀레늄 술피드, 아연 피리티온, 디펜히드라민, 프라목신, 리도카인, 프로카인, 에리트로마이신, 테트라시클린, 클린다마이신, 크로타미톤, 히드로퀴논 및 그의 모노메틸 및 벤질 에테르, 나프록센, 이부프로펜, 크로몰린, 레티놀, 레티닐 팔미테이트, 레티닐 아세테이트, 콜타르, 그리세오풀빈, 에스트라디올, 히드로코르티손, 히드로코르티손 21-아세테이트, 히드로코르티손 17-발레레이트, 히드로코르티손 17-부티레이트, 프로게스테론, 베타메타손 발레레이트, 베타메타손 디프로피오네이트, 트리암시놀론 아세토니드, 플루오시노니드, 클로베타솔 프로피오네이트, 미녹시딜, 디피리다몰, 디페닐히단토인, 벤조일 퍼옥시드, 및 5-플루오로우라실이 포함된다.
크림, 로션, 겔, 연고, 페이스트 등을 환부에 펴바르고, 부드럽게 문지를 수 있다. 용액은 동일한 방식으로 적용될 수 있지만, 더욱 전형적으로 점적기, 면봉 등으로 적용되고, 환부에 조심스럽게 적용될 것이다.
적용 레지멘은 용이하게 결정될 수 있는 수많은 인자, 예컨대 상태의 중증도 및 초기 치료에 대한 그의 반응성에 따라 좌우될 것이지만, 일반적으로 지속적으로 하루에 1 회 이상 적용을 수반할 것이다. 통상의 기술자는 투여되는 제형의 최적량, 투여 방법 및 반복률을 용이하게 결정할 수 있다. 일반적으로, 본 개시내용의 제형은 1 주에 1 회 또는 2 회 내지 1 일에 1 회 또는 2 회의 범위로 적용될 것이다.
질환을 치료 또는 예방하는 방법
일부 측면에서, 본 개시내용은 대상체에게 예를 들어 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물을 포함하는 본원에 제공된 조성물을 투여함으로써 대상체에서 피부 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 질소 호흡 유전자, 우레아제 활성 유전자, 탄수화물 대사 유전자, 철 흡수 유전자, 황 대사 유전자, 및/또는 병독성 인자 유전자의 발현 수준을 변형시킨다. 피부 질환은 임의의 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환일 수 있다. 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환의 비제한적인 예에는 모낭염, 종기, 부스럼, 농가진, 농창, 봉와직염, 아토피성 피부염, 및 탈모성 모낭염이 포함된다.
일부 실시양태에서, 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환은 모낭염이다. 모낭염은 박테리아 또는 진균 감염의 결과로서 모낭에 염증이 생기기 시작하는 일반적인 피부 상태이다. 모낭염의 증상에는 흰색으로 덮힌 작은 붉은색 돌기의 그룹, 터지는 물집, 고름이 누출될 수 있는 붉고 부어오른 피부의 큰 영역, 가려운 피부, 부드러운 피부, 및 통증성 피부가 포함된다.
일부 실시양태에서, 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환은 종기 (농포)이다. 종기는 농양 형성, 고름 축적, 및 괴사성 조직 형성을 유발하는 모낭의 깊은 감염이다. 종기의 증상에는 임의적인 중첩된 농포를 갖는 다양한 크기의 붉고 부어오른 부드러운 결절; 열; 및 림프절 비대가 포함된다.
일부 실시양태에서, 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환은 부스럼이다. 부스럼은 전형적으로 고름이 차 있고, 신체의 어느 곳에서나 발생할 수 있는 종기의 클러스터이다. 부스럼의 증상에는 이후에 중앙에서 부드러워지고 고름을 방출하는 붉고 부어오른 덩어리, 가려움, 국소 홍반, 피부 자극, 접촉시 통증, 피로, 열, 오한, 및 전신 권태가 포함된다.
일부 실시양태에서, 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환은 농가진이다. 농가진은 표재성 피부와 관련된 고도로 전염성인 박테리아 감염이다. 농가진의 증상에는 얼굴, 팔 또는 다리에 황색 딱지; 사타구니 또는 겨드랑이에 큰 물집; 열; 및 통증성 또는 가려운 피부가 포함된다.
일부 실시양태에서, 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환은 농창이다. 농창은 진피로 뻗어있는 피부의 더 깊은 미란을 야기하는 깊은 형태의 농가진이다. 농창은 엉덩이, 허벅지, 다리, 발목 및 발에서 매우 흔히 발생한다. 농창의 증상에는 경화된 궤양, 부어오른 림프절, 접촉시 통증, 열, 및 전신 권태가 포함된다.
일부 실시양태에서, 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환은 봉와직염이다. 봉와직염은 진피 및 피하 지방을 비롯한 피부의 더 깊은 층과 관련된 박테리아 감염이다. 봉와직염은 일반적으로 다리 및 얼굴에서 발생하지만, 신체의 임의의 부분이 감염될 수 있다. 봉와직염의 증상에는 수일에 걸쳐 크기가 증가하는 발적 부위; 부어오른 피부, 접촉시 통증; 열; 및 전신 권태가 포함된다.
일부 실시양태에서, 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환은 아토피성 피부염 (습진)이다. 1 세 미만의 어린이에서는 신체의 많은 부분에서 발병하는 반면에, 나이가 더 많은 어린이는 무릎 뒤쪽 및 팔꿈치 앞쪽에서 발병하는 경향이 있고, 성인은 손 및 발에서 발병하는 경향이 있다. 아토피성 피부염은 투명한 유체가 누출될 수 있는 가렵고, 붉고, 부어오르고, 갈라진 피부를 일으키는 피부의 염증이다. 아토피성 피부염의 증상에는 신체를 덮고 있는 건조하고 인설 모양인 피부, 및 팔 또는 다리, 얼굴 및 목의 굴곡부에서 심하게 가렵고, 붉고, 반점이 있는 병변이 포함된다.
일부 실시양태에서, 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환은 탈모성 모낭염이다. 탈모성 모낭염은 모낭의 감염 및 염증이다. 탈모성 모낭염의 증상에는 농포, 미란, 딱지, 궤양 및 인설과 함께 두피의 경화가 포함된다. 이러한 경화는 중심점에서 시작하여, 바깥쪽으로 퍼지고, 흉터, 궤양 및 탈모로 이어진다.
일부 실시양태에서, 니트레토(Netherton) 증후군과 연관된 피부 질환. 니트레토 증후군은 피부, 모발 및 면역계에서 발병하는 장애이다. 니트레토 증후군을 가진 신생아는 붉고 인설이 있는 피부를 갖고 (어린선양 홍피증), 피부에서 유체가 누출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 혼합물 및 조성물은 에스. 에피더미디스에 의한 혈류 (예를 들어, 카테터로 인한) 감염의 위험을 치료, 예방 및/또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
에스. 에피더미디스 세포의 혼합물은 관련 기술분야에 공지된 임의의 경로로 투여될 수 있다. 투여 경로의 비제한적인 예에는 국소, 경피, 경구 (액체 또는 고체), 정맥내, 근육내, 설하, 협측 및 비강이 포함된다.
본 개시내용의 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물이 투여되는 대상체는 그를 필요로 하는 임의의 대상체일 수 있다. 이 대상체는 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 피부 질환 (예를 들어, 모낭염, 종기, 부스럼, 농가진, 농창, 봉와직염, 아토피성 피부염, 탈모성 모낭염, 및 니트레토 증후군)을 갖고 있거나 또는 가질 위험이 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예컨대 인간이다. 다른 포유동물이 본원에서 고려된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 포유동물의 비제한적인 예에는 인간, 농장 동물, 가축, 실험실 동물 등이 포함된다. 농장 동물의 일부 예에는 소, 돼지, 말, 염소 등이 포함된다. 가축의 일부 예에는 개, 고양이 등이 포함된다. 실험실 동물의 일부 예에는 영장류, 래트, 마우스, 토끼, 기니 피그 등이 포함된다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
용어 "치료하다" (및 그의 변형어)는 대상체에게 해당 대상체, 예를 들어 환자에서 생리학적 반응 또는 결과를 얻는 것이 바람직한 프로토콜, 레지멘, 과정 또는 치료법을 제공하는 것을 의미한다. 특히, 본 개시내용의 방법 및 조성물을 이용하여, 피부 질환 증상 (예를 들어, 에스. 에피더미디스 감염과 연관됨)의 발달을 늦추거나 또는 질환의 발병을 지연시키거나, 또는 질환 발달의 진행을 중단시킬 수 있다. 모든 치료 대상체가 특정한 치료 프로토콜, 레지멘, 과정 또는 치료법에 대해 반응하지 않을 수 있기 때문에, 치료는 원하는 생리학적 반응 또는 결과가 각각의 모든 대상체 또는 대상체 집단에서 달성되는 것을 요구하지 않는다. 따라서, 주어진 대상체는 치료에 반응하는데 실패하거나 또는 부적절하게 반응할 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료는 대조군과 비교하여 50% - 100%만큼 피부 질환 증상의 발달을 늦추거나 또는 질환의 발병을 지연시키거나 또는 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환의 질환 발달의 진행을 중단시킨다. 일부 실시양태에서, 치료는 60% - 95%만큼 피부 질환 증상의 발달을 늦추거나 또는 질환의 발병을 지연시키거나 또는 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환의 질환 발달의 진행을 중단시킨다. 일부 실시양태에서, 치료는 70% - 80%만큼 피부 질환 증상의 발달을 늦추거나 또는 질환의 발병을 지연시키거나 또는 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환의 질환 발달의 진행을 중단시킨다. 일부 실시양태에서, 치료는 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%만큼 피부 질환 증상의 발달을 늦추거나 또는 질환의 발병을 지연시키거나 또는 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환의 질환 발달의 진행을 중단시킨다.
용어 "예방하다" (및 그의 변형어)는 대상체에게 해당 대상체, 예를 들어 환자에서 피부 질환을 예방하는 것이 바람직한 프로토콜, 레지멘, 과정 또는 치료법을 제공하는 것을 의미한다. 특히, 본 개시내용의 방법 및 혼합물을 이용하여, 피부 질환 증상 (예를 들어, 에스. 에피더미디스 감염과 연관됨)의 발달을 예방할 수 있다. 모든 치료 대상체가 특정한 예방 프로토콜, 레지멘, 과정 또는 치료법에 대해 반응하지 않을 수 있기 때문에, 예방은 원하는 생리학적 반응 또는 결과가 각각의 모든 대상체 또는 대상체 집단에서 달성되는 것을 요구하지 않는다. 따라서, 주어진 대상체는 예방에 반응하는데 실패하거나 또는 부적절하게 반응할 수 있다.
일부 실시양태에서, 예방은 대조군과 비교하여 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환을 50% - 100%만큼 방지한다. 일부 실시양태에서, 예방은 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환을 60% - 95%만큼 방지한다. 일부 실시양태에서, 예방은 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환을 70% - 80%만큼 방지한다. 일부 실시양태에서, 예방은 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환을 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%만큼 방지한다.
본 개시내용의 혼합물은 그를 필요로 하는 대상체에게 유효량으로 투여된다. 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물의 유효량 (치료 유효량으로도 지칭됨)은 대상체에게 투여될 때 본원에 기재된 유익한 또는 원하는 결과를 달성하는데 (예를 들어, 피부 질환의 증상을 개선시키는데) 충분하다. 효과적인 투여 형태, 투여 방식, 및 투여량은 경험적으로 결정될 수 있고, 이러한 결정은 관련 기술분야의 기술 내에 있다. 관련 기술분야의 기술자라면, 투여량이 투여 경로, 배설률, 치료 기간, 투여되는 임의의 다른 약물의 종류, 포유동물, 예를 들어 인간 환자의 연령, 크기 및 종 등의 의약 및 수의학적 의약 분야에 널리 공지된 인자에 다라 달라진다는 것을 이해할 것이다. 일반적으로, 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물의 적합한 용량은 원하는 효과를 제공하는데 효과적인 최저 용량이다. 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물의 효과적인 용량은 예를 들어 하루에 걸쳐 적당한 간격으로 별도로 투여되는 2, 3, 4, 5, 6 개 또는 그 초과의 하위 용량으로 투여될 수 있다.
에스. 에피더미디스 세포의 혼합물의 유효량은 대조군 세포와 비교하여 피부 세포에서 질소 호흡 유전자, 우레아제 활성 유전자, 탄수화물 대사 유전자, 철 흡수 유전자, 황 대사 유전자 및/또는 병독성 인자 유전자의 유전자 발현을 변형시키는 임의의 양일 수 있다.
일부 실시양태에서, 유효량은 106 - 1014 cfu/밀리리터 (cfu/mL)의 총 콜로니 형성 단위 (cfu) 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 유효량은 107 - 1012 cfu/mL의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 유효량은 108 - 1011 cfu/mL의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 유효량은 106 cfu/mL, 107 cfu/mL, 108 cfu/mL, 109 cfu/mL, 1010 cfu/mL, 1011 cfu/mL, 1012 cfu/mL, 1013 cfu/mL, 또는 1014 cfu/mL의 IC50을 갖는다.
재발성 피부 질환의 위험을 감소시키는 방법
일부 측면에서, 본 개시내용은 대상체에게 질소 호흡 유전자, 우레아제 활성 유전자, 탄수화물 대사 유전자, 철 흡수 유전자, 황 대사 유전자, 및/또는 병독성 인자 유전자의 발현 수준을 변형시키는 에스. 에피더미디스 세포의 혼합물을 투여함으로써 대상체에서 재발성 피부 질환의 위험을 감소시키는 방법을 제공한다. 재발성 피부 질환은 증상이 사라진 후에 적어도 하나가 재발하는 임의의 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환일 수 있다. 재발성 피부 질환의 원인에는 에스. 에피더미디스의 불완전한 탈콜로니화, 에스. 에피더미디스 감염에 대한 증가된 대상체 감수성, 및 에스. 에피더미디스의 전염성 확산이 포함될 수 있다. 에스. 에피더미디스와 연관된 재발성 피부 질환의 비제한적인 예에는 아토피성 피부염, 종기, 부스럼, 및 농가진이 포함된다. 이들 피부 질환의 징후 및 증상은 상기 논의된 바와 같다.
용어 "위험 감소" (및 그의 변형어)는 대상체에게 해당 대상체, 예를 들어 환자에서 이미 발생한 피부 질환을 예방하는 것이 바람직한 프로토콜, 레지멘, 과정 또는 치료법을 제공하는 것을 의미한다. 특히, 본 개시내용의 방법 및 혼합물을 이용하여, 대상체에서 이미 발생한 피부 질환 증상의 발달 위험을 감소시킬 수 있다. 모든 치료 대상체가 특정한 위험 감소 프로토콜, 레지멘, 과정 또는 치료법에 대해 반응하지 않을 수 있기 때문에, 위험 감소는 원하는 생리학적 반응 또는 결과가 각각의 모든 대상체 또는 대상체 집단에서 달성되거나, 또는 원하는 생리학적 반응이 대상체에서 완전히 부재하는 것을 요구하지 않는다. 따라서, 주어진 대상체는 위험 감소에 반응하는데 실패하거나 또는 부적절하게 반응할 수 있다.
일부 실시양태에서, 위험 감소는 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환의 재발을 50% (예를 들어, 대조군과 비교하여 절반의 재발) - 100% (예를 들어, 대조군과 비교하여 재발이 없음)만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 위험 감소는 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환의 재발을 60% - 95%만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 위험 감소는 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환의 재발을 70% - 80%만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 위험 감소는 에스. 에피더미디스와 연관된 피부 질환의 재발을 적어도 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%만큼 감소시킨다.
대조군 대상체는 위험이 감소되지 않은 에스. 에피더미디스 연관된 피부 질환의 동일한 병력을 가진 대상체, 또는 위험 감소 이전의 동일한 대상체일 수 있다.
실시예
실시예 1: 피부 스타필로코커스 에피더미디스 (에스. 에피더미디스) 집단 다양성은 전파 및 피부 부위 특수화에 의해 형성된다
인간 피부 상의 미생물 집단은 주요 교란의 부재하에 한 평생에 걸쳐 단일 창시 구성원으로부터 유래될 수 있거나 (단일 콜로나이저 가설), 또는 대안적으로다중 창시자 계통에 의해 콜로니화될 수 있다. 이들 가설 과정은 상이한 개체로부터 샘플링된 분리주가 뚜렷한 가장 최근의 공통 조상 (MRCA)을 갖는지 (이는 인간 장에서 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis)에 대해 관찰된 것과 같이 각각의 개체에서 단일 콜로니화 사건을 시사함 (Zhao et al., 2019)) 또는 갖지 않는지 (이는 다중 창시자 계통의 존재를 시사함) 여부에 따라 구별될 수 있다 (도 1a). 여기서, 본 발명자들은 본 발명자들의 1482개의 대상 분리주 (데이터는 도시되지 않음) 및 건강한 및 발병한 개체로부터 샘플링된 50개의 공개 기탁된 고품질 에스. 에피더미디스 게놈 (Conlan et al., 2012 및 미공개 VCU 콜렉션, 데이터는 도시되지 않음)으로부터의 핵심 게놈 (모든 분리주에 걸쳐 보존된 영역)에서 SNP를 기반으로 하는 분자 계통발생을 재구성하였다. 집합적으로, 에스. 에피더미디스 분리주는 이전의 관찰과 유사한 2종의 주요 계통발생학적 분기군을 형성하였다 (도 1b) (Conlan et al., 2012; Oh et al., 2014). 놀랍게도, 각각의 대상체로부터의 분리주, 뿐만 아니라 50개의 공개 분리주는 MRCA를 공유하였고, 이는 다중 창시자 계통의 존재를 시사한다 (도 1b 및 1c). 이 관찰은 비. 프라길리스와 달리, 창시자 계통 내의 다양성이 에스. 에피더미디스에서 유지되어, 단일 숙주 내에서 넓은 계통발생학적 표현을 생성한다는 것을 밝혀 내었다.
더욱이, 대상 분리주는 대상체- 및 피부 부위-특이적인 계통발생학적 구조화를 나타내었다 (도 1d, 공표형 거리를 기반으로 하는 PERMANOVA, 피부 부위, 대상체, 및 그들의 상호작용 용어의 경우 p=0.001). 놀랍게도, 모든 발샅 분리주는 각각의 5명의 대상체 내에서 뿐만 아니라 대상체 사이에서도 제한된 계통발생학적 공간에 걸쳐 있었다 (도 1d). 발샅 분리주의 계통발생학적 유사성에서 이러한 균일성은 확률적 메카니즘으로 인해 가능성이 낮으며 (예를 들어, 집단 병목현상), 이는 특정한 유전자 구성의 성장을 선호하는 더 강한 정제 선택을 시사한다.
특히 피부 미생물과 관련된 진화 과정은 환경적 장벽을 가로지르는 박테리아의 전파이며, 이는 유전자 다양성 환경을 추가로 조절할 수 있다 (Brito and Alm, 2016; Mideo et al., 2008; Niehus et al., 2015). 실제로, 시스터 분리주 (핵심-게놈 뉴클레오티드 차이가 없는 분리주가며, 동일한 계통의 최근 자손을 나타낼 가능성이 있음)가 상이한 피부 부위에서 관찰되었다 (도 2a). 공유된 시스터 분리주의 수가 샘플링 깊이 및 집단 내에서 시스터 분리주의 전체 빈도로 인해 왜곡될 수 있지만, 상이한 피부 부위에서 관찰된 분리주의 경우 모든 핵심-게놈 SNP 유전자좌 (n=58498)에서 정확하게 동일한 대립유전자를 축적할 가능성은 매우 낮다. 따라서, 공유된 시스터 분리주의 존재는 최근의 전파 사건의 존재를 발견적으로 뒷받침한다. 그러나, 공유된 시스터 분리주는 과거 전파를 추론하거나 전파율의 정량적인 추정치를 제공하는데 사용될 수 없다. 피부 부위 사이의 전파를 정량적으로 추정하고 비교하기 위해, 본 발명자들은 샘플링 트리에 의한 베이지안 진화 분석 (BEAST)을 이용하여 계통수를 따라 전파 사건을 추론하였다 (Suchard et al., 2018). BEAST는 마디 상태에서 스위치로서 전파 사건을 나타내었고 (예를 들어, 도 3a 참고), 여러 시간-보정된 계통수 (이 연구에서는 n=2000)를 샘플링함으로써 전파 확률을 추정하였다. 시간 보정을 기반으로 하여, 각각의 대상체로부터의 분리주는 대상체보다 더 오래된 다중 조상 마디로부터 분기되었고 (도 3b), 주어진 대상체에서 에스. 에피더미디스 집단이 적어도 12-20종의 창시자 균주에 의해 확립되었을 가능성이 있음을 시사하였다 (도 3b). 이어서, 다양한 창시자 균주는 이 연구에서 관찰된 분리주로 추가로 분기되었고, 이는 적어도 부분적으로 그들의 넓은 계통발생학적 표현을 설명한다 (도 1b).
이어서, 본 발명자들은 피부 부위의 각각의 쌍 사이의 전파 확률을 추정하여, 인간 피부에서 개체내 에스. 에피더미디스의 확률적 전파 맵을 생성하였다 (도 2b). 전파 맵 및 이전의 발견적 방법 모두 (도 2a)는 1) 전파가 상대적으로 노출된 얼굴 부위 및 손 부위 사이에서 빈번하게 발생하고, 2) 전파 패턴이 대상체-특이적이며, 3) 배꼽 및 발샅이 나머지 피부 부위로부터 상대적으로 단리되었음을 밝혀 내었다. 발샅 및 배꼽의 경우, 전파의 결여로 인해 이들 하위 집단에서 뚜렷한 에스. 에피더미디스 유전자 함량을 나타낼 수 있다 (도 3c). 흥미롭게도, 비교적 적은 공유된 시스터 분리주를 갖는 대상체 p3에서 (도 2a), 얼굴 및 손 부위 사이의 전파는 여전히 빈번하였으며 (도 2b), 이는 상이한 피부 부위에서 적은 (그러나 0은 아님) SNP를 갖는 밀접하게 관련된 분리주의 존재와 일치한다 (도 1d). 생물학적으로, 이는 p3에서 더 큰 유효 집단 크기로 인한 것일 수 있으며, 이는 피부 부위 사이에서 공유된 시스터 분리주를 관찰할 가능성을 감소시켰다. 발견적 방법 (도 2a) 및 확률적 전파 맵 (도 2b)은 피부 부위의 하위 집합에 대해 다소 불일치를 나타내었고; 이는 발견적 방법이 시스터 분리주의 공유를 "있는 그대로" 보고하는 반면에, 확률적 전파 분석은 변수 선택을 통해 데이터를 설명하는데 필요한 전파율을 추가로 추론하기 때문이다 (실시예 5 참고, 물질 및 방법). 종합하면, 이들 발견은 지형이 피부에서 에스. 에피더미디스 집단 다양성의 중요한 결정요인이며, 손 및 얼굴과 같은 부위 사이의 전파, 또는 배꼽 및 발샅에서와 같이 지형학적 단리에 의해 추가로 형성됨을 시사하였다.
실시예 2: 에스. 에피더미디스 유전자 함량의 개별화된, 피부-부위-의존성 및 동적 진화
유전자 함량 다양화 (전파 및 천연 선택 둘 다에 의해 유사하게 유도됨)는 주어진 분리주의 기능적 능력을 나타내고, 또한 해당 능력이 숙주 내에서 어떻게 제한되고, 피부 부위와 연관이 있으며, 시간에 걸쳐 변동하는지를 나타내기 때문에 중요하다. 이전의 메타게놈 연구는 균주-특이적인 유전자 함량의 숙주- 및 피부-부위-특이성을 제안하였으며 (Tett et al., 2017); 여기서 본 발명자들은 이들 가설을 시험하기 위해 본 발명자들의 대규모 분리주 데이터세트를 활용하였다.
각각의 대상체로부터 샘플링된 분리주는 대상체에 걸쳐 비슷한 크기를 갖는 비교적 밀접한 범-게놈을 구성하였으며 (도 4a), 이는 개체내 유전자 함량의 제한된 레퍼토리를 시사한다. 반대로, 이 유전자 함량은 상당한 대상체-특이성을 나타내었다. 주어진 대상체에서 관찰된 에스. 에피더미디스 유전자 클러스터의 단지 55.4%-65.1% (즉, 대상체-특이적인 범-게놈) 및 주어진 대상체의 모든 분리주에서 관찰된 유전자 클러스터의 58.0%-80.5% (즉, 대상체-특이적인 핵심-게놈)가 5명의 모든 대상체 사이에서 공유되었고, 유전자 클러스터의 9.5%-15.6%는 대상체에 대해 완전히 고유하였다 (도 4b). 이들 발견은 집단-수준에서 유전자 함량의 개인화를 시사하였으며: 단일 숙주에서 발견된 에스. 에피더미디스 집단은 다중 창시자 계통으로부터의 고유한 다양성을 유지하는 반면에, 에스. 에피더미디스 유전자 레퍼토리의 추가의 진화는 숙주-특이적인 방식으로 발생하였다. 이러한 관찰과 일치하게, 50개의 공개 입수가능한 게놈의 집합적인 범-게놈 (도 4a) 및 공개 균주에 대해 고유한 유전자 클러스터의 추가의 17.4% (도 4b)의 훨씬 더 큰 크기였다. 종합하면, 본 발명자들의 결과는 SNP-기반 계통발생에서 그들의 광범위한 분포에도 불구하고 (도 1b), 단일 숙주 내의 에스. 에피더미디스가 유전자 함량 다양성을 제한하였음을 나타내었다.
다음으로, 본 발명자들은 이 개별화된 유전자 레퍼토리에서 시공간 변동을 추가로 해부하고자 하였다. 중간 정도이지만 잠재적으로 유의한 시간적 변동 외에도 (도 5a - 5c), 에스. 에피더미디스 유전자 함량은 피부 부위별로 구조화됨을 나타내었고: 보조 유전자의 존재 및 부재를 기반으로 하여 대상 분리주의 계층적 클러스터링에 의해 밝혀진 바와 같이, 발샅 분리주는 다른 피부 부위로부터의 분리주와 비교하여 일관되게 뚜렷한 유전자 함량을 함유하였다 (도 4c). 발샅 분리주에 특이적으로 존재 또는 부재하는 유전자는 부위-특이적인 보조 유전자의 상당한 부분을 일관되게 구성하였다 (즉, 피부 부위에 걸쳐 발생률의 비교적 큰 표준 편차, 도 4d 및 5d). 이는 완전히 고유한 유전자 뿐만 아니라 다른 피부 부위와 공통되는 여러 유전자의 결여를 통해 발샅에 대한 유전자 함량의 강한 특수화를 시사하였다 (도 4d 및 5d). 전파 결여 또한 이들 하위 집단에서 뚜렷한 에스. 에피더미디스 유전자 함량에 기여했을 가능성이 있으며, 이는 배꼽에서도 관찰되었다 (도 4d 및 3c). 발샅-특이적인 유전자의 생물학적 기능은 대체로 아직 알려지지 않았으며 (도 4e 및 데이터는 도시되지 않음), 균주-특이적인 유전자 기능을 연구하기 위해 추가의 도구의 필요성을 강조한다. KEGG 모듈, 란티바이오틱, 및 다른 생합성 유전자 클러스터 (BGC)를 비롯한 다른 주석 처리가능한 생물학적 기능 또한 발생률 (도 5e-5f) 및 서열 변동 (도 5g-5j) 둘 다에서 숙주-특이성 및 피부 부위-이질성을 나타내었다 (데이터는 도시되지 않음).
이 광범위한 유전자-수준 다양성을 고려하여, 본 발명자들은 가장 가까운 수직 진화 역사를 갖는 분리주 (핵심-게놈 SNP 차이에 의해 평가됨, Duchene et al., 2016)가 가장 유사한 유전자 함량을 갖는 것으로 예상되었다. 그러나, 본 발명자들은 SNP 차이 및 유전자 함량 이질성에서 유의한 불일치를 발견하였고 (도 7a, 선형 회귀 R2=0.503): 유전자의 5.0%±3.2%가 심지어 핵심-게놈 SNP 차이가 없는 시스터 분리주 사이에서도 상이하였으며, 이는 유전자 함량 다양성을 증가시키는 가장 최근의 진화 과정의 존재를 시사한다 (도 7a). 이러한 과정을 연구하기 위해, 본 발명자들은 시스터 분리주의 239개의 그룹을 체계적으로 확인하였고 (핵심 게놈 SNP 차이가 없고, 매우 낮은 쌍별 뉴클레오티드 차이를 갖는 것으로 정의됨, 도 8 및 데이터는 도시되지 않음), 각각의 그룹 내에서 유전자 함량 차이를 확인하였다. 놀랍게도, 범-게놈에서 유전자 클러스터 중 절반 이상 (10583개 중에서 5853개)이 시스터 분리주의 239개 그룹 중 적어도 하나에서의 분리주 사이에서 차등적으로 존재하였다 (데이터는 도시되지 않음, 이후 "차등 유전자"로 지칭됨). 본 발명자들은 대부분의 이들 차등 유전자 (n=4217)가 불완전한 게놈 어셈블리로 인해 확인될 가능성이 낮았음을 주목한다 (도 7b, 조정된 p<0.001).
시스터 분리주 사이의 기능적 이질성은 수송 및 대사에서부터 세포 구조 및 방어에 이르며 (도 7b), 유전자 손실 및 유전자 획득 사건 둘 다로부터 발생할 수 있다. 예를 들어, 대부분의 시스터 분리주에서 부재하지만 작은 분획에서만 존재하는 차등 유전자 (예를 들어, K12549, 동일한 그룹에서 1/11 분리주에 존재함, 도 7b 하부)는 최근의 유전자 획득 사건으로부터 발생했을 가능성이 더 높다. 평균적으로, 시스터 분리주는 유전자 획득 사건으로부터 발생할 가능성이 있는 26±29개의 유전자를 함유하였다 (즉, 동일한 그룹의 시스터 분리주의 50% 초과에서는 누락됨). 대안적으로, 대부분의 시스터 분리주에서 보유되지만, 분리주의 작은 하위 집합에서만 존재하는 차등 유전자 (예를 들어, 헤민 퍼미아제 단백질 K09813, 동일한 그룹에서 9/11 시스터 분리주에 존재함, 도 7b 상부)는 작은 하위 집합과 연관된 유전자 손실 사건으로부터 발생했을 가능성이 더 높다. 시스터 분리주 사이에서 차등 유전자의 발생률의 큰 변동을 고려하면 (도 7b), 유전자 획득 사건 및 유전자 손실 사건 둘 다 시스터 분리주의 분기에 기여했을 가능성이 있다.
핵심-게놈 SNP 다양성의 축적을 수반하지 않고 유전자 획득 사건에 대한 공통 메카니즘은 수평 유전자 전달 (HGT) (유전자 요소의 직접적인 교환)이다. 핵심-게놈 영역에서, 대상 분리주 사이의 HGT 가능성이 있지만 (104개의 예측된 재조합 사건에 의해 제안되며, 각각의 분리주는 6.2±3.8개의 사건에 의해 영향을 받았고, 데이터는 도시되지 않음), 비교적 낮은 비율이었다 (집단-규모 재조합률 = 0.14%). 보조 유전자의 경우, 본 발명자들은 차등 유전자가 이동성 요소-유사 콘티그에서 관찰되는지 여부를 시험함으로써 HGT가 시스터 분리주 사이에서 유전자 함량 다양성에 기여하였는지를 추론하였다. 적어도 10개의 차등 유전자를 함유한 171개의 콘티그 중에서, 53개의 콘티그 (20개의 고유한 콘티그 서열을 가짐, 도 7c)는 플라스플로우에서 구현된 인공 신경망 모델을 이용하여 이동성 요소로서 예측되었으며 (Krawczyk et al., 2018), 이는 다시 HGT가 가능성이 있음을 시사한다. 이동성 요소-유사 콘티그 외에도, 본 발명자들은 25개의 고유한 염색체-유사 콘티그 서열을 확인하였다 (도 7c). 흥미롭게도, 콘티그의 길이에 걸쳐 거의 100% 정렬에 의해 정의되는 바와 같이, 적어도 2개의 이동성 요소-유사 콘티그는 다중 염색체-유사 콘티그에 통합된 것으로 보였다 (도 7c). 이들은 파지 서열로서 주석 처리되었으며 (도 7d), 이는 추가로 이동성 요소, 예컨대 파지가 공통 조상으로부터 최근에 파생된 시스터 분리주의 분기를 동적으로 추진할 수 있음을 나타낸다.
예측된 플라스미드 세그먼트 (383개의 고유한) 및 파지 (61개의 고유한)는 대상체 및 피부 부위에 걸쳐 유의하게 상이한 발생률을 가졌다 (도 9a 및 10a, 두 경우 모두, 유클리드 거리를 기반으로 하는 PERMANOVA 피부 부위 및 대상체 둘 다에 대해 p<0.001). 본 발명자들의 게놈은 초안 품질이기 때문에, 피부 부위 분포를 기반으로 한 클러스터링이 가능한 물리적 또는 기능적 연결을 나타내긴 했지만, 예측된 플라스미드 세그먼트가 동일한 레플리콘 상에 물리적으로 위치하는지는 명확하지 않다 (게놈당 9.5±1.6개의 콘티그에 맵핑됨) (도 9a). 두 클러스터, X 및 XI는 발샅 분리주와 강하게 연관되었고 (도 9a), 이는 발샅 하위 집단이 고유한 이동성 요소를 함유하였음을 시사한다. 이전에 확인된 플라스미드만을 고려하는 경우에도 (4.6±2.7개의 예측된 플라스미드 콘티그/게놈), 발샅 하위 집단은 예측된 플라스미드 세그먼트의 고유한 세트를 여전히 함유하였다 (도 10b). 종합하면, 플라스미드 및 파지가 일반적으로 HGT를 매개한다는 점을 고려할 때, 대상체, 피부 부위 및 예측된 플라스미드/파지 유형 사이에서 관찰된 연관성은 에스. 에피더미디스 하위 집단이 상이한 피부 부위에서 및 상이한 숙주에서 HGT 유전자의 상이한 세트에 접근할 수 있음을 시사하였다.
실시예 3: 집단-수준 다양성의 기능적 결과
기회감염 병원체 및 다른 피부 병원체, 예컨대 에스. 아우레우스에 대한 유전자 저장소 모두로서 에스. 에피더미디스의 역할을 고려하여 (Archer and Johnston, 1983; Forbes and Schaberg, 1983; Meric et al., 2015), 다음으로 본 발명자들은 에스. 에피더미디스의 관찰된 유전자 다양성이 피부 건강 및 질환에서 그의 역할에 영향을 미칠 수 있는 기능적 결과를 가질 수 있는지를 조사하였다. 본 발명자들은 특히 이동성 유전자 요소가 에스. 에피더미디스의 유전자 함량 환경을 형성할 수 있고, 병독성 인자 및 항생제 내성 유전자 (ABR)의 확산에 잠재적으로 기여할 수 있다는 점을 고려하여, 이들을 조사하였다.
중요하게는, 예측된 플라스미드 세그먼트의 유의한 분획 (도 9a, 383개 중에서 39개)은 ABR 유전자를 함유하였지만, 예측된 파지 서열을 함유하지 않았으며, 이는 그들의 전달이 주로 플라스미드에 의해 발생함을 시사한다. 푸시드산 불활성화 효소 (fusC)를 제외하고 모든 예측된 플라스미드-매개 ABR 유전자는 공지된 플라스미드에서 유전자에 대한 상동성을 나타내었다. 5개의 예측된 플라스미드 세그먼트만이 예측된 병독성 유전자를 보유하였다 (도 9a). 전반적으로, 예측된 플라스미드-코딩된 ABR의 분포는 고도로 숙주-특이적 및 피부 부위-특이적이며 (도 10c-10d), 이는 에스. 에피더미디스 기능적 특징의 생물지형적 이질성을 추가로 강조한다. 예측된 플라스미드-코딩된 ABR 유전자는 스타필로코커스 피부 감염을 치료하기 위해 특이적으로 사용되는 최근에 개발된 항생제인 무피로신 및 스트렙토그라민을 비롯한 (도 9b, 표 6) 적어도 15종의 유형의 항생제에 대해 내성을 부여하는 것으로 예측되었으며 (도 9b, 데이터는 도시되지 않음), 이는 이들 약물의 장기적인 효과에 대한 우려를 증가시킨다. 더욱이, ABR 유전자 및 메카니즘의 다면 발현 및/또는 공존으로 인해 (도 9b, 데이터는 도시되지 않음) 여러 예측된 플라스미드 세그먼트는 다중 항생제에 대한 내성을 코딩하였다 (도 9b). 예를 들어, 본 발명자들은 2종의 다중-약물 내성 (MDR) 플라스미드 세그먼트를 예측하였고, 각각은 3종의 뚜렷한 유형의 항생제를 표적화하는 3종의 뚜렷한 ABR 유전자를 갖고, 각각 1명의 대상체에서만 관찰되었다 (도 9c).
예측된 ABR 유전자의 기능을 검증하기 위해, 본 발명자들은 상이한 ABR 유전자를 갖는 19개의 선택된 분리주를 억제하는 6종의 항생제의 최소 억제 농도 (MIC)를 측정하였다 (도 9d). 본 발명자들은 플라스미드-코딩된 ABR 유전자의 컴퓨터 예측이 일반적으로 실제 내성 표현형의 양호한 예측자인 반면에 (도 9d), 염색체 예측된 ABR 유전자, 예컨대 mgrA 및 norA는 예측된 플라스미드-코딩된 ABR 유전자와 유사한 수준의 내성을 부여하는데 종종 실패하였음을 발견하였다. 예외는 플루오로퀴놀론 항생제인 시프로플록사신에 대한 내성이며, 이는 예측된 염색체 또는 플라스미드-코딩된 유출 펌프가 아니라 DNA 토포아이소머라제 ParC에서 이전에 보고된 돌연변이 (D84Y)에 의해 부여되었을 가능성이 있다 (Yamada et al., 2008) (도 9d). 또한, 페니실린 결합 단백질을 코딩하고 조절하는 염색체 예측된 mecA 및 mecR1 유전자는 예측된 플라스미드-코딩된 베타-락타마제 BlaZ에 의해 부여된 내성을 혼합하는 것으로 보였다 (도 9d). 최종적으로, 다른 내성 유전자 외에도 MDR 플라스미드를 함유하는 분리주 0995 및 1085 (도 9c, 하부)는 시험한 6개의 모든 항생제에 대한 내성을 나타내었다 (도 9d, 화살표). 이들 결과는 MDR 표현형의 개채화 및 예측된 MDR 플라스미드의 확산과의 연관성을 입증하였다.
스타필로코커스 감염 또는 피부 질환에 대한 일반적인 가정은 병인이 환자 자신의 피부로부터 기원하였다는 것이다 (von Eiff et al., 2001; Kong et al., 2012; Meric et al., 2018; Otto, 2009; Sakr et al., 2018). 따라서, 병독성 인자의 생물지형적 분포, 및 이들이 각각의 미세환경에서 어떻게 조절되는지에 대한 이해는 감염 위험의 평가를 보조할 수 있고, 개입 접근법을 가이드할 수 있다. 다른 기능적 특징과 유사하게, 모든 발샅 분리주 및 p1로부터의 대부분의 분리주에서 ica 오페론 (icaA, icaB, icaC, icaD 및 icaR 유전자, 바이오필름 형성에 중요함)의 완전한 부재를 비롯하여 (도 11a) 예측된 에스. 에피더미디스 병독성 유전자는 대상체 및 피부 부위 사이에서 다양한 발생률을 나타내었다 (도 11a, 유클리드 거리를 기반으로 하는 PERMANOVA, 피부 부위 및 대상체 둘 다에 대해 p<0.001).
여러 스타필로코커스 병독성 인자의 추가의 조절은 agrABCD 오페론에 의해 코딩되는 agr 정족수 감지 시스템에 의해 시행된다 (Meric et al., 2018; Yarwood and Schlievert, 2003). agr 정족수 감지는 급성 감염 동안에 전파에 중요한 여러 세포외 병독성 인자의 발현을 제어하는 반면에 (Fey and Olson, 2010; Olson et al., 2014), 하향 조절된 agr 활성은 콜로니화 및 지속성과 연관이 있었다 (Le and Otto, 2015). agr 시스템은 AgrB를 통해 분비되고, AgrC에 의해 검출된 다음, 반응 조절인자 AgrA를 활성화시키는 자가 유도 펩티드 (AIP, agrD 유전자에 의해 코딩됨, 도 12a)를 생성한다. 이전의 연구는 에스. 에피더미디스 agr 유전자좌에서 상당한 서열 다형성을 나타내었고 (Olson et al., 2014), 3종의 '유형'이 AgrD의 서열을 기반으로 하여 확인되었다. 특히, Olson 등은 균주-수준 경쟁에서 이들 서열 변동의 중요성을 강조하였으며: AIP의 1종의 유형은 상이한 유형의 agr 시스템을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 피부에서 agr 유형 혼합물이 하위 집단에서 agr 유형의 조성에 따라 병독성을 억제할 수 있다는 가설을 세웠다.
따라서, 본 발명자들은 대상 분리주에서 agr 다양성을 조사하였다. 본 발명자들은 다중 대상체 및 피부 부위에서 관찰되는 정통적인 agr 서열 뿐만 아니라 agrC 막횡단 돌연변이체 (도 11b) 및 고도로 제한된 대상체 및 피부-부위 분포를 갖는 2종의 신규한 agr 서열 변이체, 유형 IIIb 및 유형 IV (도 12a)를 확인하였다. 유형 IIIb가 유형 III과 동일한 AIP (그러나 고유한 AgrD 리더 펩티드를 가짐)를 발현하는 반면에, 유형 IV는 고유한 AIP를 발현하고, 그의 상청액은 agr-조절된 프로테아제인 감소된 ecp 발현에 의해 측정되는 바와 같이 유형 II 및 III 균주의 정족수 감지를 방해할 수 있었다 (도 12b 및 데이터는 도시되지 않음, 웰치 t-검사 p<0.05) (Olson et al., 2014). 반대로, 유형 IV 분리주가 유형 I-III 분리주의 소비 배지 상청액과 함께 성장할 때, 잠재적으로 큰 변동으로 인해 ecp 발현에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다 (도 12c, 데이터는 도시되지 않음).
놀랍게도, 본 발명자들은 개체에 걸쳐 agr 유형에서 강한 편향을 확인하였으며 (도 12d), p2 분리주는 주로 agr 유형 I 및 유형 II로 구성되었고 (조정된 p<10-13), p4는 agr 유형 I 및 유형 III로 구성되었다 (p<10-20). 동시에, 하위 집단 내에서 agr 유형의 혼합물은 매우 일반적이었다 (도 12d). 상이한 수준의 agr 혼합물의 기능적 결과를 조사하기 위해, 본 발명자들은 실제 혼합물을 반영하는 분리주로부터의 혼합된 상청액 ('집단 상청액')에 노출시킬 때 ecp 발현 수준을 측정하였다. agr 유형이 인간 피부에서 다양한 비율로 존재함에 따라 (도 12d), 집단 상청액은 상이한 비율의 agr 유형으로 상응하게 생성되었다. 놀랍게도, 모든 agr 유형에 걸쳐, 거의 모든 집단 상청액과 조합될 때, ecp 발현은 자가-상청액 대조군과 비교하여 유의하게 감소하였으며 (도 12e, 데이터는 도시되지 않음), 이는 실제 균주 혼합물이 정족수 감지 및 잠재적으로 집단 병독성을 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
agr 정족수 감지가 기본 대사에서부터 병독성 및 병인에 이르는 다양한 생물학적 과정을 제어함으로써 집단의 기능적 상태를 정의할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 천연 집단에서 agr 유형의 혼합물이 해당 집단에서 균주의 기능적 프로파일에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지에 의문을 가졌다. agr 유형 I 분리주를 집단 상청액에 노출시키면 RNA-seq에 의해 측정되는 바와 같이 대사 유전자 발현을 비롯하여 다양한 오페론 및 경로의 발현 수준이 유의하게 변경되었다 (도 12f 및 13c, 데이터는 도시되지 않음). 이전의 보고와 일치하게 (Batzilla et al., 2006; Queck et al., 2008; Yao et al., 2006), 질소 대사 및 우레아제 활성에 관여하는 유전자는 집단 상청액의 존재하에 하향 조절되는 반면에, 탄수화물 대사에 관여하는 경로는 상향 조절되었다 (도 12f 및 13c, 데이터는 도시되지 않음). 이전의 연구와 일치하게 (Batzilla et al., 2006), 본 발명자들은 황 대사에 관여하는 유전자가 집단 상청액에 의해 하향 조절되었음을 발견하였고 (도 12f, 데이터는 도시되지 않음), 이는 잠재적인 균주-특이적인 효과를 강조한다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 또한 혼합물에서 잠재적인 병독성 인자의 발현에서의 변화를 확인하였다. 예를 들어, 집단 상청액에 노출될 때 pmt 유전자좌의 발현이 억제되었다 (도 12f, 데이터는 도시되지 않음). pmt는 주요 스타필로코커스 병독성 인자인 페놀-가용성 모듈린 (PSM)의 수출을 담당한다 (Cheung et al., 2014; Wang et al., 2011). 철 흡수에 관여하는 유전자 (fecD, feuC, fecE, yclQ)는 또한 집단 상청액의 존재하에 하향 조절되었다 (도 12f, 데이터는 도시되지 않음). 병독성에서 철 획득의 역할이 광범위하게 연구되었지만 (Oliveira et al., 2017; Trivier and Courcol, 1996; Trivier et al., 1995), 본 발명자들의 지식에 따르면, 세포 밀도와의 연관성은 논의된 적이 있지만, 정족수 감지와의 연관성이 에스. 에피더미디스에서 아직 입증되지 않았다 (Matinaho et al., 2001). 실제 혼합물에 대한 본 발명자들의 실험적 시뮬레이션에 의해, 본 발명자들은 정족수 감지 간섭에 의한 예측된 병독성 인자의 감소가 균주 이질성의 적어도 하나의 기능적 결과이고, 병원체로서 피부 공생 또는 지속성으로서 에스. 에피더미디스의 생존을 잠재적으로 도울 수 있음을 입증하였다.
실시예 4: 에스. 에피더미디스 유전자 함량은 국소 피부 미생물총에 의해 영향을 받는다
맥락적 미생물총과의 종간 상호작용 또한 대사 잠재성, 자원 경쟁, 또는 항미생물 활성을 통해 에스. 에피더미디스 균주 유전자 다양성을 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 분리주와 매칭된 샘플로서 수득된 메타게놈 샷건 데이터를 분석하였다. 본 발명자들의 이전의 보고와 일치하게 (Oh et al., 2014, 2016), 건강한 피부 마이크로바이옴은 숙주에 걸쳐 현저한 생물다양성 (도 13a, 데이터는 도시되지 않음) 및 피부 부위 (도 13b, 데이터는 도시되지 않음)를 특징으로 한다. 일반화된 선형 모델을 이용하여, 본 발명자들은 미생물 분류학적 조성과 유의하게 연관된 (풍부성, 변동 및 희소성을 기반으로 하여 필터링된 1130종의 유전자 중에서) 8종의 에스. 에피더미디스 유전자를 발견하였으며 (도 14a, 제한되지 않은 순열 및 대상체/대상체x피부 부위 내로 제한된 순열의 경우 조정된 p<0.05), 이는 변동의 82%를 설명하는 3종의 주요 성분에 의해 나타났다. 예를 들어, 폴리포스페이트 키나제는 스트레스 조건하에 박테리아 생존을 위해 필요한 폴리포스페이트를 합성하는데 중요하다 (Zhang et al., 2002). ccrB는 HGT 요소의 통합 및 절제에 관여하며 (Wang and Archer, 2010), 이는 집단-수준 내성 발생률과 맥락적 마이크로바이옴 사이의 연결을 시사한다. pnbA는 바실러스에서 베타-락탐 생성과 연결되지만 (Zock et al., 1994), 스타필로코커스에서 그의 기능은 완전히 연구되지 않았다. 마이크로바이옴 종 풍부성과의 이들 다양한 기능적 연관성에도 불구하고, 잠재적으로 시험한 에스. 에피더미디스 유전자의 많은 수에 비해 작은 샘플 크기로 인한 낮은 파워 때문에, 에스. 에피더미디스 유전자는 마이크로바이옴 유전자 풍부성과의 유의한 연관성을 나타내지 않았다 (도 13c 및 13d).
인간 마이크로바이옴 연구에서 또 다른 근본적인 질문은 집단 수준에서 얼마나 많은 마이크로바이옴 특징 (유전자 다양성 및 생태학적 상호작용 둘 다)이 숙주-특이적인지 또는 상이한 숙주에 대해 일반화가능한지이다. 본 발명자들은 새로운 숙주 (대상체 p3)에서 에스. 에피더미디스 유전자 예측 가능성을 증가시키는 (대상체 p0, p1, p2, 및 p4에서) 피부 부위 및 마이크로바이옴 특징을 연구하기 위해 기계 학습 모델을 생성하였다 (도 13e). 새로운 숙주에서 여러 유전자의 발생률이 임의의 부위 또는 마이크로바이옴 정보 없이도 예측될 수 있으며 (도 13f, 높은 "사전" 예측 가능성을 갖는 유전자), 모든 대상체에서 모든 피부 부위에서 유사한 발생률 (즉, 도 13f에서 발생률의 낮은 변동성)을 갖는 유전자 (예를 들어, 보편적인 기능을 코딩하는 핵심 유전자)를 나타낸다.
다른 유전자는 피부 부위 및 마이크로바이옴 정보를 포함할 때 증가된 예측 가능성을 나타내었고 (도 13g 및 13h), 이는 잠재적으로 환경 특수화 또는 종간 역학에서의 역할을 나타낸다. 상위 20개의 이러한 유전자의 생물학적 기능은 거의 알려져 있지 않고, 제한된 일관성을 나타내었지만 (도 14b, 상부), 대부분은 예측된 플라스미드 세그먼트에서 존재하였다 (도 14b, 하부). 추가로, 이들 예측된 플라스미드-연관된 유전자 중 절반 이상 (52.9% 및 52.6%)이 이전에 확인된 플라스미드에서 관찰된 상동체 또한 갖고 있다 (도 14b, 하부). 따라서, 이 분석으로부터의 중요한 결론은 피부 니쉐 및 주변 마이크로바이옴과 연관된 특징이 일관되게 에스. 에피더미디스 이동성 요소에 영향을 미치고, 따라서 HGT가 맥락적 환경의 상태에 달려 있다는 것이다.
본 발명자들의 연구의 주요 발견은 집단 수준에서 에스. 에피더미디스의 광범위한 개체내 변동이다. 본 발명자들의 접근법이 다른 인간-연관된 박테리아의 집단 다양성을 이해하기 위해 일반화될 수 있지만, 본 발명자들은 생물학적 역학이 개체, 신체 부위, 및 미생물-특이적일 것이고, 따라서 조사되어야 한다고 믿는다. 예를 들어, 에스. 에피더미디스의 개체내 진화는 장 미생물인 비. 프라길리스와 실질적으로 상이하다. 숙주내 에스. 에피더미디스 분리주는 다중 콜로니화 계통의 유전자 변동을 유지한 반면에, 숙주내 비. 프라길리스는 단일 콜로니화 계통만을 나타내었다 (Zhao et al., 2019). 이는 에스. 에피더미디스 창시자 균주의 다양한 풀이 환경에서 유지되고, 후속적으로 건강한 개체를 콜로니화함을 시사한다. 다음 2개의 근본적인 질문이 있다: 1) 창시자 계통의 다형성이 환경에서 어떻게 유지되었는가? 및 2) 창시자 균주의 다양한 집합이 각각의 개체에게 어떻게 전파되었는가? 본 발명자들은 두 질문이 에스. 에피더미디스의 주요 저장소가 한 개체 내에서 다양한 환경적 니쉐를 포함하는 포유동물 피부라는 사실에 의해 설명될 수 있다고 추측한다. 다중-니쉐 다형성은 천연 집단에서 다양성을 유지하는 것으로 공지되어 있고 (Brisson, 2018; Brisson and Dykhuizen, 2004; Dobzhansky, 1982), 동시에 다중 창시자 균주에 대한 수용자의 노출을 증가시킬 수 있다. 다른 한편으로, 비. 프라길리스의 상이한 계통이 개체에서 유지되는 것 또한 가능하지만, 특정한 장 니쉐를 점유하는 박테리아가 대변 샘플에서 과소 표현되는 것으로 공지되었기 때문에 확인되지 않는다 (Zmora et al., 2018).
에스. 에피더미디스 유전자 함량 및 다른 유전자 특징의 발생률은 현저한 피부 부위-특이성을 나타내었고, 이는 니쉐에 대한 기능적 특수화를 시사한다. 예를 들어, 숙주와 무관하게 뚜렷한 유전자 함량 및 기능적 특징을 갖는 발샅 분리주의 고유한 집단 구조화는 낮은 전파율로 인한 유전자 흐름의 부족, 및 니쉐 조정 모두 때문일 수 있다. 본 발명자들의 연구에서 대상체의 수가 제한되고, 따라서 일반성이 불분명하지만, 관찰된 수렴은 발샅에서 정제 선택, 및 발샅 니쉐에 대한 발샅 하위 집단의 적응을 시사하였다. 발샅에서 정제 선택이 빠르고 충분히 강하다면, 비록 이 가설이 생태학적 고립에 비해 덜 인색하긴 하지만, 심지어 생태학적 고립 없이도 뚜렷한 하위 집단이 형성될 수 있다. 이들 발견에 대한 흥미로운 결과는 다른 발샅 미생물의 생태이며, 이는 유사한 진화적 압력에 직면할 수 있다. 예를 들어, 메타게놈 추론을 기반으로 하여, 큐티박테리움 아크네스(Cutibacterium acnes) 또한 발샅과 연관된 계통발생학적으로 뚜렷한 균주를 가질 수 있다 (Oh et al., 2014). 다른 한편으로, ABR 및 예측된 병독성 유전자를 비롯한 에스. 에피더미디스의 임상적으로 중요한 특징은 강하게 숙주-특이적이었고, 예측된 ABR-코딩 플라스미드를 비롯하여 피부 부위 사이에서 동적 HGT를 나타내었다. 이는 콧구멍에서 메티실린-내성 에스. 아우레우스와 같이 병원체 운반 및 신체의 어느 곳에서나 증가된 감염 위험에 대한 (von Eiff et al., 2001; Kong et al., 2012; Sakr et al., 2018), 뿐만 아니라 병원성 저장소의 HGT를 통한 감염 위험에 영향을 미치는 맥락적 마이크로바이옴에 대한 강한 뒷받침을 제공한다.
ABR 외에도, 본 발명자들은 2종의 신규한 유형을 비롯한 agr 유형의 분포가 고도로 숙주-의존성이었음을 발견하였다. 주요 관찰은 시험관 내에서 정족수 감지를 유의하게 억제하고, 결과적으로 대사 제어에서부터 병독성에 이르는 다양한 생물학적 기능의 발현을 변형시키는 다중 agr 유형의 실질적인 혼합물이었다. 실제로, 임상적으로, agr 유형의 혼합물은 병독성이 (유전자-수준 메카니즘, 예컨대 발 분리주의 경우일 수 있는 예측된 병독성 인자의 부재, 또는 다른 피부 부위에 기여할 수 있는 물리적 인자, 예컨대 낮은 세포 밀도에 비해) 집단 수준에서 억제될 수 있는 메카니즘을 나타낼 수 있다. 집단 병목현상이 발생하여, 단일 agr 유형이 하위 집단에서 우세하게 되면, 병독성 유전자의 증가된 발현이 급성 감염을 용이하게 할 수 있다. 이 가설은 또한 지금까지 에스. 에피더미디스에 대한 게놈 연구가 원내 및 공생 분리주 중에서 병원성의 명백한 결정인자를 확인할 수 없는 것을 설명할 것이다 (Conlan et al., 2012; Meric et al., 2018).
메타게놈 분석에서 최근의 발전은 SNP-기반 일배체형을 이용하여, 우세한 균주 일배체형을 재구성함으로써 (Truong et al., 2017), 또는 확률적 모델하에 SNP를 단계화함으로써 (O'Brien et al., 2014; Quince et al., 2017; Smillie et al., 2018) 샷건 메타게놈 데이터로부터 균주를 추론한 것이었다. 개체-특이적인 균주 다양성을 분해하고 (Segata, 2018; Tett et al., 2017; Zhang and Zhao, 2016), 개체간 균주 전파를 추적하기 위해 (Asnicar et al., 2017; Brito and Alm, 2016; Ferretti et al., 2018; Smillie et al., 2018; Yassour et al., 2018), 그들의 보고된 적용에도 불구하고, 이들 방법은 시퀀싱 깊이에 의해 제한되고 (이는 낮은 풍부성 종에 대해서는 적합하지 않음), 소수의 마커 유전자 영역으로 제한되고 (이는 계통발생학적 분해능을 감소시킴), 소수의 SNP 차이를 갖는 일배체형에 대해 민감하지 않다 (따라서 밀접하게 관련된 게놈을 분해하는 능력이 제한됨). 0 SNP 차이를 갖는 시스터 분리주를 구별하는 것이 불가능하기 때문에, 후자는 특히 제한적이다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 이러한 시스터 분리주가 예외적으로 유익하다는 것을 발견하였다. 이는 시스터 분리주가 동일한 부모 계통으로부터 매우 최근에 분기되었을 가능성이 있기 때문이다. 따라서, 상이한 피부 부위에서 검출된 시스터 분리주는 전파 사건을 나타낼 가능성이 있는 반면에, 상이한 유전자 함량을 갖는 시스터 분리주는 유전자 손실 또는 HGT에 의해 분기를 나타낼 가능성이 있다. 실제로, 확인된 시스터 분리주의 비교는 최근의 전파 사건, 뿐만 아니라 시스터 분리주 사이에서 광범위한 생물학적 기능을 갖는 차등 유전자 함량을 나타내었다. 추가로, 본 발명자들은 여러 차등 유전자가 예측된 이동성 요소-유사 요소에서 클러스터링되었음을 발견하였고, 이는 HGT가 시스터 분리주의 분기에 동적으로 기여하였음을 시사한다. 종합하면, 기능적 및 인구 통계학적 추론을 위해 시스터 분리주를 분해하는 능력은 메타게놈-기반 접근법에 비해 분리주 WGS의 중요한 이점을 나타낸다.
다른 한편으로, 메타게놈 시퀀싱은 에스. 에피더미디스 분리주의 미생물 거대 환경을 특징화하고, 환경적 선택이 그들의 진화에 어떠한 영향을 미쳤는지에 대해 밝힐 수 있다. 본 발명자들은 발생률이 맥락적 마이크로바이옴의 특징과 유의하게 연관이 있는 에스. 에피더미디스의 다중 보조 유전자를 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 에스. 에피더미디스 유전자, 특이 이동성 유전자와 맥락적 마이크로바이옴 사이의 일부 생태학적 상호작용이 새로운 숙주로 일반화될 수 있음을 또한 발견하였다. 이 발견은 숙주의 피부 마이크로바이옴 특징을 기반으로 하여 감염 선호를 비롯하여 균주간 기능적 차이를 추론하는 것이 가능함을 시사하였다. 본 발명자들은 대규모 컬쳐노믹스가 널리 정의된 선택적인 배양 조건 또는 스크리닝/특징분석 방법의 결여로 인해 어려운 여러 다른 미생물에 대해 이 가능성이 가치가 있을 수 있다는 것을 주목한다.
그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 이들 추론 및 접근법, 예컨대 더욱 일반적으로 본 발명자들의 것의 몇몇 한계를 주목한다. 첫째로, 풀링된 메타게놈 어셈블리에서 시퀀싱 깊이 및 기술적 한계로 인해, 재구성된 메타게놈 유전자 카탈로그가 맥락적 마이크로바이옴의 코딩 잠재성을 충분히 반영하지 못한다. 둘째로, 숙주내 다양성이 본 발명자들의 데이터세트에 의해 잘 포착되었지만, 이러한 무작위로 샘플링된 분리주는 필연적으로 상응하는 하위 집단 및 동원된 대상체의 적은 수를 불완전하게 대표하여, 시스터 분리주의 검출을 방해하고, 추정된 전파 확률의 신뢰도를 감소시킨다. 이는 하위 집단이 피부에서 빈번하게 동적 교란을 경험할 수 있어서, 집단 병목현상 및 결론적으로 유전적 부동을 일으키는 것인 에스. 에피더미디스와 특히 관련이 있을 수 있다 (모든 커뮤니티 규모에서, 피부 마이크로바이옴 조성물이 비교적 안정함 (Oh et al., 2016)). 집단 병목현상의 존재는 전파 패턴, 유전자 함량 다양성, 및 시간적 변동 패턴 모두에서 좌우 대칭이 결여되었음을 시사한다. 각각의 피부 부위의 더 깊은 샘플링 및 더 조밀한 시계열은 이러한 인구 통계학적 역학의 특징을 개선할 가능성이 있다. 추가로, 본 발명자들은 집단 다양성을 형성하는 근본적인 진화 메카니즘이 다른 대상체 및 심지어 다른 피부 미생물에 일반화될 수 있고, 이들 대상체에서 발견되는 생태학적 및 기능적 상호작용의 일반성이 큰 정도의 숙주-특이성을 고려하여 제한될 수 있다고 믿는다. 셋째로, 본 발명자들의 발견으로부터 의미있는 기능적 추론을 만드는 능력은 유전자 기능의 더욱 포괄적인 특징분석을 필요로 할 것이다 (본원에서 비록 플라스미드-코딩된 항생제 내성 유전자의 컴퓨터 예측이 실험 검증과 대체로 일치하였지만).
실시예 5: 물질 및 방법
20-60 세의 5명의 건강한 남성 및 여성이 이 연구에 동원되었고, 잭슨 래버러토리 인스티튜트 검토 위원회(Jackson Laboratory Institutional Review Board)에 의해 승인되었다. 제한된 샘플 크기로 인해, 본 발명자들은 기밀성을 보호하기 위해 구체적인 연령 및 성별을 보고하지 않는다. 배제 기준에는 샘플링 부위에서 온전하지 않은 피부의 임의의 시각적 징후, 등록 3 개월 내에 전신 항생제 또는 항진균제의 사용, 또는 등록 1 주일 내에 국소 레티노이드, 스테로이드 또는 항생제가 포함되었다. 퍼플록 울트라(PurFlock Ultra) 협측 면봉 (퓨리탄 메디컬 프로덕츠(Puritan Medical Products))을 사용하여 16개의 피부 부위 (데이터는 도시되지 않음)를 30 초 동안 강력하게 닦아낸 후, 면봉을 500μl 트립신 작용 소이 브로쓰 (TSB) 배양 배지 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))에 담구었다. 에스. 에피더미디스 단리 및 mWGS 시퀀싱 둘 다를 위해 동일한 면봉을 사용하였다. 에스. 에피더미디스의 단리를 위해, 50-100μl의 배양물을 사셀렉트(SaSelect) 배양 플레이트 (바이오-라드 래버러토리즈(Bio-Rad Laboratories))에 플레이팅하고, 37℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 작은 연분홍색 콜로니 (Hirvonen et al., 2014)를 플레이트로부터 무작위로 선택하고, 제조자의 지침에 따라 말디 바이오타이퍼(MALDI Biotyper) 시스템 (브루커 코퍼레이션(Bruker Corporation)) 상에서 확인하였다. 일반적으로, 각각의 피부 면봉으로부터, 본 발명자들은 바이오타이퍼에 의해 "에스. 에피더미디스"로 각주 처리된 ~10개의 콜로니를 수득하는 것을 목적으로 하였고, 후속적으로 1.5 mL TSB에 접종하여, DNA 추출을 위해 밤새 성장시켰다.
DNA 추출
에스. 에피더미디스 분리주로부터 신속한 DNA 추출은 [Koser et al. (2014)]로부터 채택되었다. 1 mL의 밤샘 배양물을 20,000 x g에서 1 분 동안 원심분리한 후, 박테리아 펠렛을 100 μL의 1X TE에 재현탁시키고, 100-125 μL 0.5 mm 직경 유리 비드 (바이오스펙 프로덕츠(BioSpec Products))를 갖는 2 mL 비드 비팅 튜브로 옮겼다. 추가 100 μL의 1X TE를 튜브에 첨가한 후, 샘플을 볼텍스 어댑터(Vortex Adapter) (모 바이오 래버러토리즈(Mo Bio Laboratories)) 상에서 30 초 동안 최대 속도에서 (3000 rpm) 볼텍싱하였다. 이어서, 혼합물을 13,000 x g에서 5 분 동안 원심분리하여, 세포 파편을 펠렛화하고, 상청액을 넥스테라(Nextera) XT 라이브러리 제조를 위한 주형으로서 사용되는 새로운 튜브로 옮겼다.
메타게놈 DNA의 추출을 위해, 피부 면봉을 350 μL 조직 및 세포 용해물 완충제 (에피센트레(Epicentre)) 및 100 μg 0.1 mm 지르코니아 비드 (바이오스펙 프로덕츠)를 함유하는 마이크로퓨즈 튜브에 넣었다. 하기 변형에 의해 젠일루트(GenElute) 박테리아 DNA 단리 키트 (밀리포어시그마(MilliporeSigma))를 사용하여 메타게놈 DNA를 추출하였으며: 각각의 샘플을 50 μg의 리소자임 및 5 단위의 리소스타핀 및 뮤타노리신으로 30 분 동안 소화시킨 후, 티슈라이저(TissueLyser) II (퀴아젠(QIAGEN))에서 2 x 3 분 동안 30 Hz에서 비드 비팅하였다. 각각의 샘플을 1 분 동안 15000 x g에서 원심분리한 후, 젠일루트(GenElute) 컬럼 상에 로딩하였다. 음성 (환경적) 대조군 및 양성 (모의 커뮤니티) 대조군을 추출하고, 각각의 추출 및 라이브러리 제조 배치로 시퀀싱하여, 샘플 온전성을 보장하였다.
라이브러리 제조 및 시퀀싱
모든 시퀀싱 라이브러리는 넥스테라 XT DNA 샘플 제조 키트 (일루미나 인크.(Illumina Inc.))를 사용하여 일루미나(Illumina) 표준화된 프로토콜로에 따라 제조하였다. 모든 DNA 샘플을 큐빗(Qubit) HS (써모피셔 사이언티픽(Thermofisher Scientific))에 의해 정량화하고, 1ng/μl로 희석하였다. 최적화된 쿼터 반응 프로토콜에서 200pg DNA의 각각의 샘플을 취함으로써 400bp의 평균 삽입물 크기에 의해 게놈 DNA의 듀얼 인덱싱된 쌍별-말단 라이브러리를 제조하였고, 라이브러리 제조를 위한 모든 시약은 1/4 양으로 취하였다. 태그 지정 및 PCR 반응은 제조자의 지침에 따라 수행하였다. 이어서, 생성된 넥스테라 WGS 라이브러리를 일루미나 HiSeq2500 상에서 2-150bp 쌍별 말단 판독에 의해 시퀀싱하였다.
게놈 어셈블리 및 품질 필터링
디폴트 파라미터와 함께 scythe (v0.994) (Buffalo) 및 sickle (v1.33) (Joshi and Fass)을 사용하여 시퀀싱 리드로부터 각각 시퀀싱 어댑터 및 저품질 염기를 제거하였다. 이어서, 필터링된 시퀀싱 리드를 디폴트 파라미터와 함께 SPAdes (v3.7.1) (Bankevich et al., 2012)를 사용하여 조립하였다. 본 발명자들은 저품질 샘플 또는 콘티그를 제거하기 위해 일련의 전략을 취하였다. 첫째로, 2.2 Mbps보다 작거나 또는 2.9 Mbps 보다 큰 크기 (에스. 에피더미디스에서는 없는 크기 (2.3 - 2.8 Mbps 범위의 VCU 및 NIH 콜렉션에서 50개의 공개 에스. 에피더미디스 게놈의 게놈 크기 [데이터는 도시되지 않음])를 갖는 초안 게놈을 데이터세트로부터 제거하였다. 둘째로, 나머지 초안 게놈의 품질을 에스. 에피더미디스 기준 게놈 (균주 ATCC12228, ACC#: GCA_000007645)에 대해 정렬시킴으로써 QUAST (v4.2) (Gurevich et al., 2013)를 사용하여 점검하고; 85% 미만의 기준 커버리지를 갖는 초안 게놈을 데이터세트로부터 제거하였다 (QUAST 출력에서 "게놈 분획"; 50개의 공개 에스. 에피더미디스의 기준 커버리지는 모두 86%보다 높았음). 셋째로, Kraken (v0.10.6) (Wood and Salzberg, 2014) (도 S1)을 이용하여 분류학적 분류를 기반으로 하여 잠재적인 오염물을 함유한 10X 커버리지보다 낮은 콘티그를 초안 게놈으로부터 제거하였다. 최종적으로, Bowtie2 (v2.3.1) (Langmead and Salzberg, 2012; Langmead et al.)를 이용하여 초안 게놈에 대해 시퀀싱 리드를 다시 맵핑하고, bcftools (v1.8) 및 samtools (v1.8, vcfutils) (Li, 2011; Li et al., 2009)를 사용하여 적어도 10X 커버리지를 갖는 부위에서 SNP를 호출함으로써 샘플 순도를 점검하였다. 에스. 에피더미디스 분리주의 혼합물을 강력하게 나타내는 변이체 대립유전자의 >0.5개의 대립유전자 빈도를 갖는 >10개의 부위를 갖는 샘플을 데이터세트로부터 제거하였다.
시퀀싱 및 품질 필터링 방법을 검증하기 위해, 상기 기재된 바와 같이 에스. 에피더미디스 균주 ATCC12228을 시퀀싱하고, 조립하고, 품질 필터링하고, QUAST (v4.2) (Gurevich et al., 2013)를 사용하여 그의 공개된 완전한 게놈 서열 (GCA_000007645)에 대해 정렬시켰다. 생성된 초안 게놈에서 염기의 99.2% (95개의 콘티그에서 2.54 Mbps, N50=71,627)를 완전한 기준 게놈에 대해 정렬시켰고, 0.01%의 미스매치 비를 가지며 기준 게놈의 98.0%를 나타내었다 (QUAST 출력에서 "게놈 분획"). 기준 게놈에 대해 정렬되지 않는 5개의 콘티그 (총 18,932 bps) 중에서 4개 (총 17,931)를 에스. 에피더미디스 균주 PM221 및 FDAARGOS_153에서 플라스미드에 대해 맵핑한 반면에 (BLASTN (Altschul et al., 1990)에 의해 84% 정렬 커버리지 및 96% 뉴클레오티드 서열 동일성), 다른 콘티그 (1001 bps)를 스타필로코커스 펠리스(Staphylococcus felis)에 대해 맵핑하였다 (BLASTN에 의해 98% 정렬 커버리지 및 81% 뉴클레오티드 서열 동일성). 정렬되지 않은 영역은 본 발명자들의 ATCC12228 균주 스톡 및 완전한 게놈을 생성하기 위해 시퀀싱된 스톡에서 플라스미드 불일치를 나타낼 수 있고, 이는 ATCC 12228의 2개의 완전한 서열 사이에서 관찰되었다 (MacLea and Trachtenberg, 2017; Zhang et al., 2003).
계통수의 시간 보정 및 전파 사건의 추론
Parsnp (v1.2) (Treangen et al., 2014)를 이용하여 구축된 핵심-게놈 정렬을 기반으로 하여 BEAST (v1.8.4) (Suchard et al., 2018)를 이용하여 숙주내 진화 역사 (5명의 각각의 대상체로부터 모든 분리주의 시간-보정된 계통수 및 전파 사건)을 추론하였다. 에스. 에피더미디스의 진화 역학이 광범위하게 연구되지 않았지만, 그의 가까운 친척인 스타필로코커스 아우레우스는 시계-유사 진화를 나타낸다 (예를 들어 [Frisch et al., 2018] 참고). 따라서, 본 발명자들은 개별화된 에스. 에피더미디스 분리주의 핵심-게놈 뉴클레오티드가 일반화된 시간 가역적인 (GTR) 모델하에 모델링된 뉴클레오티드 치환율 및 가지에 걸쳐 균일한 돌연변이율과 함께 BEAST에서 구현된 엄격한 시계 모델하에 변화한다고 가정하였다. 검증으로서, 모델을 기반으로 하여 추론된 돌연변이율 (연간 Mbps당 뉴클레오티드 변화) (p0의 경우 3.47±1.21, p1의 경우 1.47±0.68, p2의 경우 2.27±0.54, p3의 경우 0.62±0.48, 및 p4의 경우 1.42±0.52)은 스타필로코커스 아우레우스의 추정된 돌연변이율과 동일한 규모였다 (Duchene et al., 2016) (에스. 에피더미디스의 돌연변이율은 추정되지 않았음).
이전의 연구는 높은 비율의 게놈 재조합 (예를 들어 1%에 가까운 집단-규모 재조합률)이 인구 통계학적 추론에 영향을 미칠 수 있는 반면에, 동형 부위를 제거함으로써 보정하면 추론이 훨씬 악화될 수 있음을 입증하였다 (Hedge and Wilson, 2014). 따라서, 본 발명자들은 GTRCAT 모드하에 RAxML (v8.2.12) (Stamatakis, 2014)를 사용하여 구축된 디폴트 파라미터 및 최대-가능성 시작 계통발생과 함께 ClonalFrameML (v1.11) (Didelot and Wilson, 2015)을 사용하여 집단-규모 재조합률을 추정하였다. 추정된 집단-규모 재조합률은 낮았으며 (0.14%), 따라서 본 발명자들은 전체 게놈 집단 유전학을 기반으로 하여 인구 통계학적 파라미터를 추론하기 시작하였다.
10개의 윈도우를 갖는 유연한 베이지안 스카이라인 플롯 (Drummond et al., 2005)을 기반으로 하여 추정된 집단 크기와 함께 사전 합체한 트리가 사용되었다. 각각의 윈도우에서 집단 크기의 사전 확률은 0 내지 10100에서 균일하게 분포하는 것으로 가정되었다. 부위들 사이의 전파는 각각의 피부 부위 쌍 사이의 대칭 전파율과 함께 베이지안 이산 계통학적 접근법 (Lemey et al., 2009)을 이용하여 추정하였다. 접근법은 표준 연속-시간 마르코브(Markov) 체인을 이용하여 계통발생에서 조상 마디의 피부 부위 분류를 재구성하였고, 결론적으로 "전파"는 계통발생에 따라 피부 부위 분류에서의 변화로서 정의되었다. 베이지안 확률적 검색 변수 선택 (BSSVS) 절차를 전파 과정을 적절하게 설명하는 것들로만 전파율 파라미터를 제한하기 위해 적용하였다 (Lemey et al., 2009). 최종적으로, BEAST는 마르코브 체인 몬테 카를로(Markov Chain Monte Carlo, MCMC)를 이용하여 상기 모든 진화 파라미터를 동시에 추론하였다. 계통발생에 대한 전파를 시각화하기 위해, BEAST 팩키지에 포함된 Treeannotator (v1.8.4) (Suchard et al., 2018)를 사용하여 최대 분기군 신뢰성 트리를 재구성하였다. 사후 확률과 함께 피부 부위 분류를 계통발생에 대해 맵핑하고, FigTree (v1.4.3) (Rambaut)를 사용하여 최종 계통발생을 분기도로서 시각화하였다. 전파 맵을 이용하여 BSSVS 결과를 요약하기 위해, SpreaD3 (v0.9.6) (Bielejec et al., 2016)을 사용하여 BSSVS의 로그 파일을 분석하였다. 0.3 미만의 사후 확률을 갖는 전파 경로를 제거하였고, 생성된 전파 맵을 SpreaD3에서 D3 렌더러를 이용하여 시각화하였다.
전파 추론의 일관성을 평가하고, MCMC의 수렴을 검증하기 위해, 본 발명자들은 먼저 각각 500,000,000 및 50,000,000 세대 동안에 p0으로부터 단리된 균주 (n=460)를 기반으로 하여 2개의 독립적인 MCMC 체인을 실행하였다. 각각의 MCMC 체인을 25,000 세대마다 샘플링하였고, 처음 800개의 샘플은 번인(burn-in)으로서 제거하였다. 두 체인에 의해 추론된 전파 맵이 고도로 일치하기 때문에 (도 S2D), p1-p4의 균주 전파가 50,000,000 세대 동안에 MCMC 체인만을 기반으로 하여 추론되었다.
범-게놈 및 핵심-게놈 확인
유전자 코딩 서열은 계=박테리아 및 속=스타필로코커스에 의해 Prokka (v1.11) (Seemann, 2014)을 이용하여 분리주 게놈으로부터 예측되었다. 80% 동일성 임계값에서 Roary pipeline (v3.11.2) (Page et al., 2015)을 사용하여 예측된 유전자 코딩 서열로부터 범- 및 핵심-게놈을 확인하였다. 범-게놈 및 핵심-게놈 축적 곡선을 10 회 반복으로 계산하였다. 분리주 유전자 함량의 클러스터링을 입증하는 계통도 (도 4c)는 보조 유전자 존재-부재 매트릭스를 기반으로 하여 Figtree (v1.4.3) (Rambaut)를 사용하여 플롯팅되었다 (Roary로부터 accessory_binary_genes.fa.newick 출력). 핵심-게놈 정렬 및 SNP-기반 대략-최대-가능성 계통발생은 데이터세트로부터 무작위로 선택된 기준 게놈 (파라미터 -r !)과 함께 Parsnp (v1.2) (Treangen et al., 2014)를 사용하여 구축되었다.
재조합의 예측
상기 기재된 바와 같이 ClonalFrameML (v1.11) (Didelot and Wilson, 2015)를 사용하여 집단-규모 재조합률을 추정하였다. RDP4 (베타 4.97) (Martin et al., 2015)를 이용하여, 게놈-전체 재조합 패턴을 분석하였다. 전체 계통수를 50개의 클러스터로 나누고 (각각의 클러스터 내의 평균 공표형 거리 = 0.004±0.008, R에서 cutree 함수를 이용하여 생성됨), 각각의 클러스터로부터 1개의 분리주를 무작위로 선택함으로써, 50개의 대표적인 대상 분리주를 선택하였다 (선택된 분리주는 표 S1에 명시됨). 이어서, 상기 기재된 바와 같이 Parsnp (v1.2) (Treangen et al., 2014)을 이용하여 50개의 대표적인 대상 분리주에 대해 핵심-게놈 정렬을 수행하였다. 이어서, 재조합 사건을 확인하기 위해 디폴트 파라미터와 함께 6종의 상이한 알고리즘 (RDP (Martin and Rybicki, 2000), GENECONV (Padidam et al., 1999), Bootscan (Martin et al., 2005), Maxchi (Smith, 1992), Chimaera (Posada and Crandall, 2001), 및 3Seq (Lam et al., 2018))를 사용하여 RDP4를 이용하여 정렬을 진행하였다. 최종적으로, 적어도 2종의 방법에 의해 확인된 재조합 사건이 보고되었다. 1) 유사한 게놈 서열 (예컨대 각각의 50개의 클러스터 내에 있는 것들)이 재조합 검출에서 비교적 낮은 파워를 갖고, 2) RDP4가 데이터세트 내에서 모든 삼중 조합물을 비교하여, 재조합 신호를 검출하고, 따라서 게놈 서열의 수와 관련하여 다항식 시간이 걸리기 때문에, 분석은 전체 데이터세트 대신에 50개의 대표적인 분리주를 사용하여 수행되었다.
시스터 분리주 사이의 차등 유전자의 유의성
MUMMER (DNAdiff, v1.3) (Kurtz et al., 2004)를 사용하여 시스터 분리주 사이의 쌍별 뉴클레오티드 차이를 시스터 분리주 사이에서 계산하였다. 차등 유전자는 시스터 분리주의 하위 집합에만 존재하지만 다른 것에는 존재하지 않는 Roary pipeline (v3.11.2) (Page et al., 2015)를 이용하여 확인된 유전자 클러스터로서 정의되었다. 차등 유전자의 유의성 (p-값) (유전자 클러스터가 게놈 불완전성으로 인해 시스터 분리주의 하위 집합에서만 발견되지 않는 가능성)은 해당 하위 집합에서 모든 시스터 분리주가 불완전한 공동 확률과 동일하다. 분리주 게놈의 불완전성은 CheckM (v1.0.12) (Parks et al., 2015)에서 디폴트 계통_wf 작업 흐름을 이용하여 계통-특이적인 마커 유전자의 존재 또는 부재를 기반으로 하여 추정되었다. 생성된 p-값은 벤자미니-호흐베르크 절차에 따라 조정하였다.
파지 및 플라스미드의 예측 및 분석
파지 서열은 PHASTER (Arndt et al., 2016)를 사용하여 초안 게놈으로부터 확인되었다. 이어서, 고도로 유사한 서열을 제거하기 위해 CD-HIT (더 짧은 서열의 정렬 커버리지 임계값=0.9를 갖는 국소 정렬) (Fu et al., 2012; Li and Godzik, 2006)를 사용하여 0.9 DNA 서열 유사성으로 "온전한" 파지로 주석 처리된 서열을 클러스터링하였다. 예측된 파지 서열에 공선형 영역이 결여되어 있기 때문에, 예측된 파지 서열의 계통도는 보조 유전자 존재-부재 매트릭스 (Roary로부터 accessory_binary_genes.fa.newick 출력)를 기반으로 하여 생성되었다.
플라스미드 후보를 예측하여, 여러 기준을 이용하여 필터링하였다. 먼저, PlasFlow (v1.1) (Krawczyk et al., 2018) (특징으로서 서열 염기 조성을 이용하는 인공 신경망-기반 플라스미드 예측 접근법)를 이용하여 이동성 요소-유사 콘티그를 1482개의 초안 게놈에서 모든 콘티그 (>1kb)로부터 확인하였다. 이어서, 고도로 유사한 콘티그를 제거하기 위해 CD-HIT (더 짧은 서열의 정렬 커버리지 임계값=0.9를 갖는 국소 정렬) (Fu et al., 2012; Li and Godzik, 2006)를 이용하여 이동성 요소-유사 콘티그를 0.9 DNA 서열 유사성으로 클러스터링하였다. 신뢰성을 증가시키기 위해, 본 발명자들은 이 연구에서 적어도 5kb 길이를 갖는 콘티그에 집중하였다. 이어서, 예측된 플라스미드 세그먼트를 스크리닝하여 잠재적인 키메라 서열을 제거하였으며: 먼저, Bowtie2 (v2.3.1) (Langmead and Salzberg, 2012; Langmead et al.)를 사용하여 1482개의 에스. 에피더미디스 분리주의 시퀀싱 리드를 후보 플라스미드 세그먼트에 맵핑하고, Samtools (v1.8, samfile에서 bamfile로 전환 및 분류를 위해 사용됨) (Li et al., 2009) 및 Bedtools (v2.27.0, genomecov 함수) (Quinlan and Hall, 2010)를 사용하여 각각의 후보의 커버리지를 계산하였다. 세그먼트가 해당 분리주에 존재하는지 또는 부재하는지 여부에 따라 비-키메라 플라스미드 세그먼트는 에스. 에피더미디스 분리주에서 커버되는 그의 서열의 0%에 가깝거나 또는 100%에 가까울 가능성이 있다. 단순함을 위해, 분리주의 90% 초과에서 80% 초과 또는 20% 미만인 커버리지 범위를 갖는 후보 플라스미드 세그먼트는 하류 분석을 위해 선택되었다.
예측된 플라스미드 세그먼트과 공지된 플라스미드의 유사성은 먼저 dc-megablast (blastn 2.6.0+) (Altschul et al., 1990; Zhang et al., 2000)를 이용하여 PLSDB 플라스미드 데이터베이스 (2018_12_05 출시) (Galata et al., 2019)에 대해 예측된 플라스미드 세그먼트를 정렬시킨 다음, PLSDB에서 최고-히트 플라스미드에 대한 총 정렬 길이를 계산함으로써 추정되었다. 예측된 플라스미드 세그먼트의 클러스터는 먼저 하위 집단에 걸쳐 그들의 발생률을 기반으로 하여 예측된 플라스미드 세그먼트를 계층적으로 클러스터링하여 검출한 다음 (유클리드 거리에 의해 R에서 "hclust" 함수), R 패키지 dynamicTreeCut (v1.63.1) (Langfelder et al., 2008)에서 "cutreeDynamicTree" 함수를 이용하여 생성된 계통도를 가지치기하였다 ("hybrid" 방법 및 deepSplit=4를 이용함).
대안적으로, 공지된 플라스미드의 세그먼트를 나타내는 콘티그를 확인하기 위해, 본 발명자들은 dc-megablast (blastn 2.6.0+) (Altschul et al., 1990; Zhang et al., 2000)를 사용하여 모든 에스. 에피더미디스 콘티그를 PLSDB 플라스미드 데이터베이스 (2018_12_05 출시) (Galata et al., 2019)에 대해 정렬시켰고, 75% 초과의 정렬 커버리지를 갖는 콘티그를 확인하였다. 이어서, 고도로 유사한 콘티그를 제거하기 위해 CD-HIT (더 짧은 서열의 정렬 커버리지 임계값=0.9를 갖는 국소 정렬) (Fu et al., 2012; Li and Godzik, 2006)을 사용하여 이들 콘티그를 0.9 DNA 서열 유사성으로 클러스터링하였다. 다음으로, Bowtie2 (v2.3.1) (Langmead and Salzberg, 2012; Langmead et al.)를 사용하여 1482개의 에스. 에피더미디스 분리주의 시퀀싱 리드를 콘티그에 맵핑하고, Samtools (v1.8, samfile에서 bamfile로 전환 및 분류를 위해 사용됨) (Li et al., 2009) 및 Bedtools (v2.27.0, genomecov 함수) (Quinlan and Hall, 2010)을 사용하여 각각의 콘티그의 커버리지를 계산하였다. 분리주에서 80% 초과의 커버리지 범위를 갖는 예측된 플라스미드 콘티그는 해당 분리주에 존재하는 것으로 고려되었다.
COG 카테고리 및 KEGG 모듈의 주석
민감도의 우선순위를 지정하기 위해 디폴트 옵션과 함께 eggNOG-mapper (v4.5.1) (Huerta-Cepas et al., 2016)를 사용하여 COG 기능적 카테고리를 주석 처리하였다. HMMER 웹 서버 (Potter et al., 2018)를 이용하여 Pfam 데이터베이스 (El-Gebali et al., 2019)를 검색하고, ECPred (Dalkiran et al., 2018)를 사용하여 효소 EC 번호 예측을 수행함으로써 주석 처리되지 않은 발샅 유전자에 대한 추가의 분석을 수행하였다. KEGG 모듈을 주석 처리하고, 모듈 표현을 계산하기 위해, 유전자 서열을 먼저 다운로드된 원핵생물 KEGG 유전자 데이터베이스 (2015-08-31 출시) (10-9의 e-값 임계값 및 0.5의 서열 동일성 컷오프를 갖는 UBLAST (Edgar, 2010))에 대해 정렬시켰다. 다음으로, 다운로드된 KEGG 유전자 데이터베이스에 포함된 ko_genes.list 맵핑 파일을 사용하여 KEGG 오르토로그 번호 (KO 번호)를 유전자 서열에 대해 할당하였다. 최종적으로, KEGG 모듈의 표현은 ko_module.list 맵핑 파일을 기반으로 하여 주어진 게놈에서 발견된 각각의 KEGG 모듈에서 KO의 비율에 의해 제공되었다. 대상체 또는 피부 부위 사이에서 차등 발생률을 갖는 KO는 ANOVA를 이용하여 확인되었고, p 값은 무제한 순열을 이용하여 추정되었고, 벤자미니-호흐베르크 절차에 따라 조정되었다.
병독성 인자 및 ABR 유전자의 주석
기대값 (e-값) 임계값 10-9를 갖는 UBLAST (USEARCH v8.0.1517) (Edgar, 2010)를 사용하여, 4종의 페놀-가용성 모듈 ([Otto et al. (2004)]를 기반으로 하는 서열)이 첨가된 VFDB (Chen et al., 2016)에서 스타필로코커스-특이적인 유전자에 대한 유전자 서열을 블라스팅함으로써 공지된 병독성 인자를 주석 처리하였다. 저품질 모드 및 플라스미드 데이터-유형을 갖는 CARD 데이터베이스 (v3.0.1) (Jia et al., 2017)를 기반으로 하여 내성 유전자 확인자 (RGI, v4.2.2)를 사용하여 ABR 유전자를 주석 처리하였다. 공지된 플라스미드에서 ABR 유전자의 상동체의 존재는 dc-megablast (blastn 2.6.0+) (Altschul et al., 1990; Zhang et al., 2000)를 사용하여 유전자를 PLSDB 플라스미드 데이터베이스 (2018_12_05 출시) (Galata et al., 2019)에 대해 정렬시키고, 최고-히트 정렬을 확인함으로써 추정되었다. 유전자 길이에 걸쳐 70% 초과의 서열 동일성 및 75% 초과의 커버리지를 갖는 유전자는 공지된 플라스미드에서 상동체를 갖는 것으로 고려되었다.
BGC의 주석
BGC는 디폴트 파라미터와 함께 antiSMASH (Weber et al., 2015)를 사용하여 확인되었다.
선택된 항생제 및 분리주의 MIC 시험
적절한 스톡 농도의 선택된 항생제를 TSB 배지에서 제조하였다. 일련의 희석액을 96-웰 세포 배양물 플레이트에서 TSB 배지를 사용하여 제조하였다. 선택된 에스. 에피더미디스 분리주의 밤샘 배양물을 TSB 배지에 희석하고, 약 ~105 세포를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 진탕기에서 37℃에서 18 시간 동안 인큐베이션하고, OD600을 측정하여 세포의 성장을 결정하였다.
agr 서열의 주석 및 검증
[Olson et al. (2014)]에 기재된 바와 같이 agr 서열의 3종의 정통적인 유형에 대해 대상 분리주 (Prokka v1.11 (Seemann, 2014)를 이용하여 예측됨)에서 모든 유전자를 블라스팅함으로써 agr 유전자 (agrA, agrB, agrC, 및 agrD)를 주석 처리하였다. 구체적으로, 균주 NIHLM095 (GCF_000276545.1), NIHLM061 (GCF_000276445.1), 및 NIHLM037 (GCF_000276325.1)에서 주석 처리된 agr 유전자 서열을 각각 agr 유형 I, II, 및 III에 대한 기준 서열로서 사용하였다. agrABCD 오페론을 1) [Olson et al. (2014)]에 기재된 바와 같이 AIP가 3종의 AIP 유형 중 하나와 동일한 경우에는, 3종의 정통적인 agr 유형 중 하나에 할당하고, 2) agrB 및 agrC 유전자가 AIP와 동일한 agr 유형에 대해 최고 서열 유사성을 갖는 경우에는, 동시에 할당하였다. 확인된 agr 유전자 서열을 최고 매칭을 기반으로 하여 3종의 유형 중 하나에 할당하였다. AgrC 단백질의 이차 구조는 디폴트 옵션과 함께 Jpred 4 웹 서버 (Drozdetskiy et al., 2015)를 이용하여 예측되었다.
정방향 프라이머가 S_epi_dupagrC_66-F (TACGATTGTAATCCCTTCTGC, 정방향, 서열식별번호: 8)로 대체된 0644를 제외하고는, 모든 분리주에 대해 프라이머 S_epi_dupagrC_uni-F (CTGGAATTATAATCCTTTCTGC, 정방향, 서열식별번호(SEQ ID NO): 6) 및 S_epi_dupagrC_uni-R (GTAATCTGAAAGAGTGGTGAG, 역방향, 서열식별번호: 7)를 갖는 생어 시퀀싱을 이용하여 agrC 유전자에서 막횡단 돌연변이를 5개의 선택된 분리주 (분리주 ID=644, 700, 1026, 1203, 및 1523, 도 7b에 도시된 5종의 돌연변이 패턴을 나타냄)에서 검증하였다. ~640 bp의 생성물을 정제하고, 생어-시퀀싱하였다.
퍼시픽 바이오사이언시즈(Pacific Biosciences) SMRT 시퀀싱을 위해, 제조자의 프로토콜에 따라 젠일루트(GenElute) 박테리아 게놈 DNA 키트 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))를 사용하여 리소스타핀 (시그마-알드리치)이 첨가된 0.5 ml의 밤샘 배양물로부터 펠렛화된 박테리아 세포로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 메가럽터(Megaruptor) (디아제노드(Diagenode))를 사용하여 DNA를 전단시켜, 6-8 kbp의 평균 크기를 갖는 단편을 생성하고, 0.45x AMPure 비드에 대한 결합에 의해 추가로 정제하였다. 바코드 스마트벨(SMRTbell) 어댑터 (팩바이오)를 갖는 스마트벨 템플릿 키트 (팩바이오)를 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 제조하였다. 세퀄(Sequel) 시스템 상에서 단일 SMRT 세포를 시퀀싱하기 위해 생성된 라이브러리를 풀링하였다.
정족수 감지 간섭의 분석
정족수 감지에 대한 천연 집단에서 agr 유형의 혼합물의 효과를 결정하기 위해, 동일한 대상체에서 동일한 피부 부위에서 발견되는 (p0에서 오른손 검지) 상이한 agr 유형의 6개의 분리주 (유형 I의 경우 분리주 71 및 73, 유형 II의 경우 72 및 74, 및 유형 III의 경우 78 및 79)를 선택하여, 천연 집단에서의 분리주 조성물을 시뮬레이션하였다. 6개의 분리주를 개별적으로 성장시키고, 이들 배양물의 상청액을 혼합하여, 천연 발생 집단을 시뮬레이션하였다. 분리주의 상대적인 풍부성의 영향을 설명하기 위해, 하기 집단 상청액을 생성하였다: 1) 균일 혼합물 상청액: 각각의 6개의 분리주로부터의 밤샘 배양물을 회전시키고, 멸균 여과하고, 균등한 부피로 혼합하였고, 2) 단일 agr 유형이 우세한 집단 상청액: 각각의 6개의 분리주로부터의 밤샘 배양물을 회전시키고, 멸균 여과하고, 혼합하여, 균등하게 우세한 agr 유형 분리주 상청액이 최종 부피의 80%를 구성하고, 나머지 4개의 분리주로부터의 상청액이 최종 부피의 20%를 구성하도록 하였다). 다음으로, 3종의 agr 유형을 나타내는 3개의 분리주 (유형 I의 경우 분리주 71, 유형 II의 경우 72, 및 유형 III의 경우 78)에서 ecp의 발현 수준을 자가 및 집단 상청액에 노출되었을 때 RT-qPCR을 사용하여 결정하였다. 추가로, 전체 유전자 발현에 대한 agr 유형 혼합물의 효과를 설명하기 위해, 본 발명자들은 자가 상청액, 상청액 없음, 및 균일 혼합물 상청액에서 성장한 무작위로 선택된 분리주 (분리주 71)에 대해 RNA-seq를 수행하였다. 대조군으로서, 자가 상청액을 집단 혼합물에서 해당 agr 유형의 농도로 희석하였다.
새로 확인된 유형 IV agr이 정통적인 agr 유형 (유형 I-III)의 정족수 감지를 방해할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 유형 I-III의 agr 분리주를 유형 IV 소비 배지 상청액 (분리주 0644로부터)의 존재하에 또는 임의의 상청액을 첨가하지 않고 별도로 성장시켰다. 반대로, 유형 IV agr의 정족수 감지에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 조건을 시험하기 위해, agr 유형 IV 분리주 (분리주 0644)를 각각 유형 I-III 상청액의 존재하에, 추가의 상청액 없이, 또는 자가-상청액과 함께 성장시켰다. 성장 검정 후에, ecp의 발현 수준을 RT-qPCR을 사용하여 결정하였다.
모든 RT-qPCR 및 RNA-seq 실험에 대한 성장 검정은 하기와 같이 수행되었다: 각각의 agr 유형 I-IV (분리주 71, 72, 78, 및 0644) 중 1개의 분리주를 밤새 개별적으로 성장시키고, TSB에서 1/100으로 다시 희석하고, ~ 0.8의 OD600까지 성장시키고, 0.05의 출발 OD600까지 10 부피% 상청액과 함께 TSB에서 희석하였다. 상청액 대조군은 100% 신선한 TSB에서 성장시키지 않았다. 샘플링은 검정 시작시에 수행되었으며: 분취량을 회전시키고, 트리졸(Trizol)에 재현탁시키고, 0-시간 시점 동안 RNA 추출 전에 -80 C로 냉동시켰다. 배양물을 37℃에서 4 시간 동안 성장시키고, 상기 기재된 바와 같이 샘플링을 다시 수행였다. 실험은 생물학적 삼중으로 수행되었다.
RNA 추출, RT-qPCR 및 RNA-seq
배양물을 0.1mm 유리 비드에 의한 비드 비팅을 통해 트리졸에서 기계적으로 용해시키고, 퀴아젠(Qiagen) RNeasy 키트를 사용하여 트리졸/클로로포름의 조합물 및 온-컬럼 단리를 이용하여 RNA를 단리하였다. 간략히, 클로로포름을 용해물에 첨가하고, 회전시키고, 유기 층의 RNA를 세척 (RW1 및 RPE 완충제, 키트 지침에 따라) 및 RNeasy 컬럼 상에서 용리 전에 70% 에탄올로 연화처리하였다. 키트 지침에 따라, 온-컬럼 DNAase를 퀴아젠 RNase-무함유 DNase 키트와 함께 수행하였다. RNA 농도는 큐빗(Qubit)을 통해 측정하고, 품질은 애질런트 테이프세이션(Agilent Tapestation)을 통해 평가하였다. RT-qPCR 실험을 위해, RNA를 정상화시키고, cDNA로 역전사시켰다 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 고용량 cDNA 역전사 키트). 키트 지침에 따라 표적 유전자로서 ecp 및 내부 대조군으로서 ftsZ를 사용하여 SYBR 파워 업 키트를 이용하여 RT-qPCR을 수행하였다. RNA-seq 실험의 경우, 일루미나 키트에 대해 키트 지침에 따라 NEBNext rRNA 고갈 키트 (박테리아) (사전 출시) 및 NEBNext 울트라 II 디렉셔널 RNA 라이브러리 제조 키트를 사용하여 시퀀싱을 위해 RNA를 제조하고, 400 만 내지 950 만개의 리드 깊이로 일루미나 NextSeq 상에서 시퀀싱하였다.
전사체 수준의 비교
RT-qPCR의 경우, 각각의 성장 검정을 생물학적 삼중으로 병렬로 수행하였다. RT-qPCR 결과는 비교 Ct 분석 방법 (Schmittgen and Livak, 2008)을 이용하여 분석하였다. 먼저, 기술적 복제물 (동일한 cDNA 샘플로부터의 qPCR 복제물; 균일하게 혼합된 배양물의 경우 n=2 및 불균일하게 혼합된 실험의 경우 n=3)의 Ct 값을 평균하였다. 이어서, 4-시간 시점의 dCt 값으로부터 0-시간 시점의 dCt을 차감함으로써 ddCt 값을 각각의 샘플에 대해 계산하였고, 상대적인 정량화 값은 ddCt 값으로부터 유래되었다 (2-ddCt). 통계적 유의성은 웰치 t-검사를 이용하여 ddCt 값에 대해 시험되었다.
RNA-seq의 경우, 성장 검정은 생물학적 삼중으로 병렬로 수행하였다. 분리주 71의 유전자 코딩 서열을 먼저 RAST를 사용하여 주석 처리한 후, 시퀀싱 리드를 매우 민감한 모드하에 Bowtie2 (v2.3.1) (Langmead and Salzberg, 2012; Langmead et al.)를 사용하여 유전자 서열에 대해 정렬하였다. 고유하게 맵핑된 리드만을 포함하도록 출력 sam 파일을 필터링하고 (Samtools v1.8 (Li et al., 2009)에서 옵션 "-q 1"), bam 파일로 변환시키고, 분류하고, Samtools (v1.8) (Li et al., 2009)을 사용하여 인덱싱하였다. 각각의 유전자에 대해 정렬된 리드의 미가공 카운트를 디폴트 인수와 함께 featureCounts (v1.5.2) (Liao et al., 2014)를 사용하여 계산하였다. 표준 차등 발현 분석 워크플루오를 이용하여 R에서 DESeq2 패키지 (Love et al., 2014) (벤자미니-호흐베르크 조정된 p-값 < 0.05)를 사용하여 차등 발현된 유전자를 확인하였다. DESeq2 결과를 기반으로 하여, 차등 풍부한 KEGG 경로는 결과적으로 GAGE 패키지 (v2.28.2) (Luo et al., 2009)를 사용하여 추론되고, Pathview 패키지 (v1.18.2) (Luo and Brouwer, 2013)를 사용하여 시각화되었다.
mWGS 품질 필터링 및 분류학적 프로파일링
시퀀싱 어댑터 및 저품질 베이스는 디폴트 파라미터와 함께 각각 scythe (v0.994) (Buffalo) 및 sickle (v1.33) (Joshi and Fass)를 사용하여 mWGS 리드로부터 제거되었다. "매우-민감한" 모드하에 Bowtie2 (v2.3.1) (Langmead and Salzberg, 2012; Langmead et al.)를 사용하여 모든 시퀀싱 리드를 hg19 인간 기준 게놈에 대해 맵핑함으로써 숙주 리드를 제거하였다. 맵핑되지 않은 리드 (즉, 미생물 리드)를 사용하여, MetaPhlAn2 (Segata et al., 2012; Truong et al., 2015)를 사용하여 샘플에서 미생물 종의 상대적인 풍부성 프로파일을 추정하였다.
mWGS 어셈블리 및 유전자 예측
메타게놈 유전자는 (Zhou et al., 2019)로부터 유래된 방법을 이용하여 mWGS 샘플로부터 예측되었다. 모든 피부 마이크로바이옴 샘플로부터의 mWGS 리드를 풀링하고, 디폴트 파라미터와 함께 MEGAHIT (v1.0.6) (Li et al., 2015, 2016)를 사용하여 새로 조립하였다. 생성된 콘티그를 길이로 필터링한 후 (1kb 이상의 콘티그가 유지됨), "메타" 모드하에 prodigal (v2.6.3) (Hyatt et al., 2010)를 사용하여 유전자를 콘티그로부터 예측하였다. UCLUST (USEARCH v8.0.1517에서 cluster_fast 알고리즘, 유전자 서열을 길이로 분류하고, 전체 정렬을 수행한 다음, 말단 갭을 트리밍한 후, 서열 동일성을 계산함 (Edgar, 2010))를 사용하여 예측된 유전자를 90% DNA 서열 동일성으로 클러스터링하여, 중복 유전자 서열을 제거하였다. 다음으로, e-값 임계값 10-9와 함께 UBLAST (USEARCH v8.0.1517 (Edgar, 2010))을 사용하여 예측된 메타게놈 유전자를 에스. 에피더미디스 범-게놈에 대해 블라스팅하고, 임의의 에스. 에피더미디스 유전자에 대해 DNA 서열 동일성 >95%를 갖는 메타게놈 유전자을 제거하여, 502,145개의 비-에스. 에피더미디스 메타게놈 유전자의 카탈로그를 생성하였다.
마이크로바이옴 샘플에서 메타게놈 유전자의 커버리지를 추정하기 위해, Bowtie2 (v2.3.1) (Langmead and Salzberg, 2012; Langmead et al.)를 사용하여 mWGS 리드를 메타게놈 유전자에 맵핑하고, Samtools (v1.8, samfile에서 bamfile로 전환 및 분류를 위해 사용됨) (Li et al., 2009) 및 Bedtools (v2.27.0, genomecov 함수) (Quinlan and Hall, 2010)를 사용하여 커버리지를 계산하였다.
마이크로바이옴 특징과 에스. 에피더미디스 유전자 발생률 사이의 선형 연관성
0.0001 미만의 평균 상대 풍부성을 갖는 마이크로바이옴 종, 및 샘플링된 mWGS 리드당 염기당 0.000001 리드 미만의 평균 커버리지를 리드를 갖는 메타게놈 유전자를 하류 분석으로부터 제외시켰다. 다음으로, 마이크로바이옴 종 및 유전자를 변동성 (0.05 미만의 변동 계수를 갖는 제외된 특징) 및 희소성 (샘플의 20% 초과에서 0이 아닌 풍부성/커버리지를 갖는 제외된 특징)을 기반으로 하여 추가로 필터링하였다. 유사하게, 0.05 미만의 변동 계수 또는 샘플의 20% 초과에서 0이 아닌 풍부성/커버리지를 갖는 에스. 에피더미디스 유전자는 분석에 사용하지 않았다.
이어서, 본 발명자들은 주성분 분석 (R에서 prcomp)을 이용하여 마이크로바이옴 종 풍부성 프로파일 및 마이크로바이옴 유전자 커버리지 프로파일의 차원을 감소시켰으며: 종 풍부성 프로파일에서 변동의 82%를 설명하는 처음 3개의 주성분, 및 유전자 커버리지 프로파일에서 변동의 90%를 설명하는 처음 2개의 주성분을 이용하여, 각각 마이크로바이옴 종 및 유전자 조성을 나타내었다. 다음으로, 에스. 에피더미디스 유전자 함량의 발생률 (즉, 상기 유전자를 보유하는 에스. 에피더미디스 분리주의 비율)에 대한 마이크로바이옴 종 조성물, 또는 마이크로바이옴 유전자 커버리지의 영향을 각각 선형 모델을 이용하여 별도로 모델링하였다:
Figure pct00002
여기서, y는 주어진 유전자의 관찰된 발생률이고, PCi는 i번째 주성분이고 (마이크로바이옴 종의 경우 n=3 주성분 및 마이크로바이옴 유전자의 경우 n=2 주성분 중에서), P는 대상체를 나타내고, S는 피부 부위를 나타내고, T는 샘플링 시점을 나타내고, x는 상호작용 효과를 나타내고, ε는 잔류 오차이다. (주성분의 조정된 부분 R2의) p-값은 관찰된 에스. 에피더미디스 유전자 발생률의 무제한 순열, 대상체내 제한된 순열, 및 대상체x부위 내에서 제한된 순열을 이용하여 추정된 후, 벤자미니-호흐베르크 절차하에 조정되었다. 최종적으로, 모든 순열 시험하에 유의한 에스. 에피더미디스 유전자가 보고되었다.
재귀적 분할 트리 모델을 이용하는 에스. 에피더미디스 유전자 발생률 예측
본 발명자들은 마이크로바이옴/피부 부위 특징과 에스. 에피더미디스 유전자 발생률 사이의 잠재적으로 비-선형 관계를 추출하기 위해 재귀적 분할 트리 모델 (R 패키지 rpart v4.1.15 (Therneau and Atkinson, 2019)에서 실시됨)을 사용하였다 (도 13e).
본 발명자들의 데이터세트에 대한 하나의 한계는 약 10개의 에스. 에피더미디스 분리주만이 대상체당 피부 부위당 샘플링되었다는 것이며, 따라서 이 비교적 작은 샘플을 기반으로 하여 추정된 유전자 발생률은 근사할 수 있지만, 샘플 위치에서 실제 유전자 발생률을 정확하게 반영하지 못한다. 따라서, 유전자 발생률의 수치 값을 예측하기 위해 회귀 트리를 훈련시키는 대신에, 본 발명자들은 유전자 발생률을 4개의 수준으로 분류하고 (발생함 - 유전자 발생률 ∈[0.75, 1], 발생할 가능성 - 유전자 발생률 ∈[0.5, 0.75), 부재할 가능성 - 유전자 발생률 ∈[0.25, 0.5), 및 부재함 - 유전자 발생률 ∈[0, 0.25)), 발생률 수준을 예측하기 위해 분류 트리를 훈련시켰다. 발생률 수준의 표현을 균형화하기 위해, 본 발명자들은 샘플에 걸쳐 4개의 모든 발생률 수준을 나타낸 에스. 에피더미디스 유전자만을 고려하였다.
특징 벡터는 마이크로바이옴 종 풍부성, 마이크로바이옴 유전자 커버리지, 및 피부 부위 사양을 기반으로 하여 생성되었다 (도 13e). 마이크로바이옴 종 및 유전자 프로파일을 이전의 섹션에 기재된 바와 같이 풍부성/커버리지 및 변동성을 기반으로 하여 필터링하였지만, 유의성 검사를 수행하지 않았기 때문에 희소성을 기반으로 스크리닝되지 않았다. 이어서, 마이크로바이옴 유전자 프로파일은 마이크로바이옴 종 프로파일과 동일한 최대 및 최소 값을 공유하도록 비례적으로 재조정되었다. 다음으로, 마이크로바이옴 종 및 유전자 프로파일을 합한 후, 주성분 분석 (R에서 prcomp)을 이용하여 차원 감소시켰다. 주어진 샘플에 대해, 본 발명자들은 15개의 특징 벡터를 생성하였고, 각각 1) 샘플링된 피부 부위, 및 2) 상위 x 주성분 (x=1, 2, …, 15)을 함유하였으며, 이는 마이크로바이옴 특징에서 변동의 37% - 90%를 설명한다 (도 13e).
데이터세트를 훈련 세트 (p0, p1, p2, 및 p4로부터 무작위로 선택된 샘플의 80%), 검증 세트 (p0, p1, p2, 및 p4로부터 샘플의 나머지 20%), 및 시험 세트 (p3으로부터의 모든 샘플)로 나누었다. 주어진 에스. 에피더미디스 유전자에 대해, 15개의 재귀적 분할 트리 모델을 각각 15개의 특징 벡터를 기반으로 하여 훈련시켰고, 그들의 예측 가능성 (정확한 예측을 할 확률)을 기반으로 하여 평가하였다:
Figure pct00003
여기서, l은 4개의 수준의 발생률을 나타내고, Il은 수준 l이 관찰된 발생률 수준인 경우 1이고, 다른 경우에는 0인 지표 변수이다. Prl은 수준 l의 확률이고: 사전 예측 가능성의 경우, Prl은 훈련 세트에서 수준 l의 관찰된 빈도와 동일하고; 사후 예측 가능성의 경우, Prl은 predict.rpart 함수에 의해 주어진 수준 l의 "클래스 확률"과 동일하다. 주어진 에스. 에피더미디스 유전자의 경우, 검증 세트를 기반으로 하여 최고 사후 예측 가능성을 나타내는 최고의 모델은 하류 분석을 위해 선택되었다. 피부 부위 사양으로 인한 예측 가능성 및 마이크로바이옴 데이터의 포함으로 인한 예측 가능성을 분리하기 위해, 본 발명자들은 특징으로서 피부 부위 사양만을 사용하여 유사한 접근법으로 (즉, 임의의 마이크로바이옴 특징은 포함하지 않음) 재귀적 분할 트리 모델의 추가의 세트를 훈련시켰다. 공지된 플라스미드에서 에스. 에피더미디스 유전자의 상동체의 존재는 dc-megablast (blastn 2.6.0+) (Altschul et al., 1990; Zhang et al., 2000)를 사용하여 유전자를 PLSDB 플라스미드 데이터베이스 (2018_12_05 출시) (Galata et al., 2019)에 대해 정렬시키고, 최고-히트 정렬을 확인함으로써 추정되었다. 유전자 길이에 걸쳐 70% 초과의 서열 동일성 및 75% 초과의 커버리지를 갖는 유전자는 공지된 플라스미드에서 상동체를 갖는 것으로 고려되었다.
정량화 및 통계적 분석
공표형 거리는 R 패키지 ape (v5.3) (Paradis and Schliep, 2019)에서 "cophenetic.phylo" 함수를 이용하여 계산되었다. 필로우 균일성 지수 (J)는 다음과 같이 주어졌다:
Figure pct00004
여기서, H는 R 패키지 vegan (v2.5.3) (Oksanen et al., 2018)을 사용하여 계산된 섀년(Shannon) 다양성 지수이고, S는 클래스의 총 수이다 (발생률 수준의 경우에는, S=4). FST는 하기를 이용하여 계산되었다:
Figure pct00005
여기서 π사이 및 π내는 각각 하위 집단 사이의 및 하위 집단 내의 쌍별 유전자 함량 차이의 평균을 나타낸다 (에스. 에피더미디스 분리주의 쌍 중 하나의 분리주에서만 존재하는 유전자의 평균 비율).
모든 유의성 검사는 달리 명시되지 않는다면 표준 라이브러리에 의해 R (v3.2.3)로 수행되었다. 하티건(Hartigan) 딥 테스트는 실시된 선형 보간 방법을 통해 추정된 p 값을 갖는 R 패키지 diptest (v0.75.7) (Maechler, 2016)를 사용하여 수행되었다. PERMANOVA는 공변량으로서 대상체, 피부 부위, 및 그들의 상호작용 용어를 사용하여 R 패키지 vegan (v2.5.3) (Oksanen et al., 2018)에서 "adonis" 함수를 사용하여 수행되었다. 거짓 발견율에 대한 조정은 벤자미니-호흐베르크 절차 (방법="BH"에 의한 R 함수 p.adjust)에 따라 수행되었다.
p2에서 agr 유형 III 및 p4에서 유형 II의 과소 표현을 시험하기 위해, 본 발명자들은 두 대상체에서 agr 유형의 샘플링이 베르누이안(Bernoullian)인 것으로 가정한 귀무 가설을 모델링하였고, 성공률은 모든 1482개의 대상 분리주 중에서 agr 유형의 전체 빈도에 의해 주어지고, 흔적의 수는 대상체로부터 샘플링된 에스. 에피더미디스 분리주의 총 수에 의해 주어졌다. 따라서, p-값은 누적 이항 분포 함수로 제공될 수 있다:
Figure pct00006
여기서, k는 관심 agr 유형을 갖는 대상체에서 에스. 에피더미디스 분리주의 관찰된 수이고, n은 대상체로부터 샘플링된 에스. 에피더미디스 분리주의 총 수이고, f는 모든 1482개의 대상 분리주에서 관심 agr 유형의 전체 빈도이다.
순열은 사용자 지정 R 스크립트를 사용하여 실시되었다. 간략히, 선형 모델의 경우, 시험 통계를 먼저 관찰로부터 계산한 후, 총 적어도 1000개의 순열 (달리 명시되지 않는다면)이 종속 변수를 섞음으로써 생성되었다. 이어서, p-값은 관찰된 시험 통계에 비해 더 큰 시험 통계를 생성하는 순열의 생성으로서 표현되었다. ANOVA의 경우, F 통계는 순열에서의 시험 통계로서 사용되었다. 마이크로바이옴 특징과 에스. 에피더미디스 유전자 발생률 사이의 연관성을 시험하기 위해 사용된 일반화된 선형 모델의 경우, 조정된 부분 R2가 시험 통계로서 사용되었다. 선형 모델 이외의 경우, 순열은 데이터의 표지를 재분포시킴으로써 생성되었다. 구체적으로, 에스. 에피더미디스 유전자 함량에서 시간적 변동의 유의성을 시험하기 위해, 동일한 대상체의 동일한 피부 부위로부터 샘플링된 대상 분리주 (즉, 동일한 하위 집단) 사이에서 시점을 재할당함으로써 순열이 생성된 반면에, 시험 통계는 시점에 걸쳐 공유된 범-게놈의 비율에 의해 주어졌다.
데이터 및 코드 입수가능성
현재 연구 동안에 생성되고/거나 분석된 데이터세트, 뿐만 아니라 데이터를 분석하기 위한 사용자 지정 코드는 합당한 요청에 따라 상응하는 저자로부터 입수할 수 있다. 게놈은 바이오프로젝트(BioProject) PRJNA559376 및 PRJNA558989하에 SRA에서 진뱅크(Genbank) 및 메타게놈 서열 리드에 기탁될 것이다.
참고문헌
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
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본원에 개시된 모든 문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용된 주제와 관련하여 참고로 포함되며, 일부 경우에는 문헌 전체를 포함할 수 있다.
본 명세서 및 청구항에서 사용된 단수 형태는 문맥상 달리 명확하게 나타내지 않는다면 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 문맥상 달리 명확하게 나타내지 않는다면, 1개 초과의 단계 또는 작용을 포함하는 본원에서 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계들 및 작용들의 순서는 방법의 단계들 또는 작용들이 인용된 순서로 반드시 제한되는 것이 아님을 이해해야 한다.
청구항 뿐만 아니라 상기 명세서에서, "포함하는", "보유하는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "구성된" 등과 같은 모든 전환어는 개방형인 것으로 이해되어야 하며, 즉, 포함하지만 그로 제한되지 않음을 의미한다. 미국 특허청 특허 심사 매뉴얼 섹션 2111.03에 제시된 바와 같이, "이루어지는" 및 "본질적으로 이루어지는"과 같은 전환어만이 각각 폐쇄형 또는 반폐쇄형 전환어이다.
수치 값 앞에 있는 용어 "약" 및 "실질적으로"는 인용된 수치 값의 ±10%를 의미한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 범위의 상한 및 하한 사이의 각각의 값은 본원에서 구체적으로 고려되고 기재된다.
SEQUENCE LISTING <110> The Jackson Laboratory <120> BACTERIAL ADMIXTURES <130> J0227.70084WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/967,310 <151> 2020-01-29 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 46 <212> PRT <213> Staphylococcus epidermidis <400> 1 Met Glu Asn Ile Phe Asn Leu Phe Ile Lys Phe Phe Thr Thr Ile Leu 1 5 10 15 Glu Phe Ile Gly Thr Val Ala Gly Asp Ser Val Cys Ala Ser Tyr Phe 20 25 30 Asp Glu Pro Glu Val Pro Glu Glu Leu Thr Lys Leu Tyr Glu 35 40 45 <210> 2 <211> 46 <212> PRT <213> Staphylococcus epidermidis <400> 2 Met Asn Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Ile Phe Ser Asn Phe Met 1 5 10 15 Ala Val Ile Gly Asn Ala Ser Lys Tyr Asn Pro Cys Ser Asn Tyr Leu 20 25 30 Asp Glu Pro Gln Val Pro Glu Glu Leu Thr Lys Leu Asp Glu 35 40 45 <210> 3 <211> 46 <212> PRT <213> Staphylococcus epidermidis <400> 3 Met Asn Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Leu Phe Ser Asn Phe Met 1 5 10 15 Ala Val Ile Gly Asn Ala Ala Lys Tyr Asn Pro Cys Ala Ser Tyr Leu 20 25 30 Asp Glu Pro Gln Val Pro Glu Glu Leu Thr Lys Leu Asp Glu 35 40 45 <210> 4 <211> 46 <212> PRT <213> Staphylococcus epidermidis <400> 4 Met Asn Leu Leu Gly Gly Leu Phe Leu Lys Ile Phe Ser Asn Phe Met 1 5 10 15 Ala Val Ile Gly Asn Ala Ala Lys Tyr Asn Pro Cys Ala Ser Tyr Leu 20 25 30 Asp Glu Pro Gln Val Pro Glu Glu Leu Thr Lys Leu Asp Glu 35 40 45 <210> 5 <211> 46 <212> PRT <213> Staphylococcus epidermidis <400> 5 Met Asn Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Ile Phe Ser Asn Phe Met 1 5 10 15 Ala Val Ile Gly Asn Ala Ser Lys Tyr Asn Pro Cys Val Met Tyr Leu 20 25 30 Asp Glu Pro Gln Val Pro Glu Glu Leu Thr Lys Leu Asp Glu 35 40 45 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 ctggaattat aatcctttct gc 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 gtaatctgaa agagtggtga g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 tacgattgta atcccttctg c 21

Claims (21)

  1. (a) 스타필로코커스 (에스.) 에피더미디스 유형 I 세포, 에스. 에피더미디스 유형 II 세포, 에스. 에피더미디스 유형 III 세포, 에스. 에피더미디스 유형 IIIb 세포, 및 에스. 에피더미디스 유형 IV 세포로부터 선택된 적어도 2종의 박테리아 세포 유형을 포함하는 세포의 혼합물; 및 (b) 합성 부형제를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 합성 부형제가 희석제, 증점제, 습윤제, 보존제, 중화제, 보조유화제, 밀폐제, 및 향료로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  3. 스타필로코커스 (에스.) 에피더미디스 유형 I 세포, 에스. 에피더미디스 유형 II 세포, 에스. 에피더미디스 유형 III 세포, 에스. 에피더미디스 유형 IIIb 세포, 및 에스. 에피더미디스 유형 IV 세포로부터 선택된 적어도 2종의 박테리아 세포 유형을 포함하는 세포의 혼합물을 포함하는 조성물이며, 에스. 에피더미디스 세포 유형 중 적어도 1종은 유전자 조작되는 것인 조성물.
  4. 스타필로코커스 (에스.) 에피더미디스 유형 I 세포, 에스. 에피더미디스 유형 II 세포, 에스. 에피더미디스 유형 III 세포, 에스. 에피더미디스 유형 IIIb 세포, 및 에스. 에피더미디스 유형 IV 세포로부터 선택된 적어도 2종의 세포 유형을 포함하는 세포의 혼합물이며, 혼합물은 국소 전달을 위한 부형제와 함께 제형화되는 것인 세포의 혼합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물의 세포가 집합적으로 대조군에 비해 질소 호흡 유전자, 우레아제 활성 유전자, 탄수화물 대사 유전자, 철 흡수 유전자, 황 대사 유전자, 및 병독성 인자 유전자로부터 선택된 유전자의 발현 수준을 변형시킬 수 있는 것인 조성물 또는 혼합물.
  6. 제5항에 있어서, 질소 호흡 유전자가 에스. 에피더미디스 narT, nreC, nreB, narX, narH, narG, sumT, nasE 및 nasD로부터 선택되는 것인 조성물 또는 혼합물.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 우레아제 활성 유전자가 에스. 에피더미디스 ureA, ureB, ureC, ureD, ureE 및 ureF로부터 선택되는 것인 조성물 또는 혼합물.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 탄수화물 대사 유전자가 에스. 에피더미디스 FruB, GlmS, Fba, Tkt, Tpi, Gap, GapB, Pgi, Pgk, Eno, PepcK, CitB, CitC, OgdH, Sucla2, SdhA, CitG, Mdh1, PckA, LDH, PDH, ScaD, PflB, Fdh 및 BdhA로부터 선택되는 것인 조성물 또는 혼합물.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 철 흡수 유전자가 에스. 에피더미디스 fecD, feuC, fecE 및 yclQ로부터 선택되는 것인 조성물 또는 혼합물.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 황 대사 유전자가 에스. 에피더미디스 cysH, cysJ, cysI, sirC, sat 및 cysC로부터 선택되는 것인 조성물 또는 혼합물.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 병독성 인자 유전자가 에스. 에피더미디스 icaA, icaB, icaC, icaD, icaR, atl, atlE, ebh, ebhA, ebp, geh, gehD, hlb, lip, nuc, psmB, sdrF, sdrH, se2319, sspA 및 sspB로부터 선택되는 것인 조성물 또는 혼합물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자의 발현 수준이 1.5 배 내지 12 배만큼 감소되는 것인 조성물 또는 혼합물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 스타필로코커스 에피더미디스 세포 유형 중 적어도 1종이 유전자 조작되는 것인 조성물 또는 혼합물.
  14. 대상체에게 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물 또는 혼합물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 피부 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 피부 질환이 모낭염, 종기, 부스럼, 농가진, 농창, 봉와직염, 아토피성 피부염, 옴, 탈모성 모낭염, 및 니트레토 증후군으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 대상체에게 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 혼합물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 피부 질환의 위험을 감소시키는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 피부 질환이 재발성 피부 질환인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 재발성 질환이 아토피성 피부염인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 피부 질환이 모낭염, 종기, 부스럼, 농가진, 농창, 봉와직염, 아토피성 피부염, 옴, 탈모성 모낭염, 및 니트레토 증후군으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 국소 투여인 방법.
  21. 대상체에게 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물 또는 혼합물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 혈류 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
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KR20220133262A (ko) 박테리아 혼합물
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