KR20220121814A - 종양 미세 환경에서 면역 억제를 극복하기 위한 조작된 t 세포 및 종양 침윤성 림프구 - Google Patents

종양 미세 환경에서 면역 억제를 극복하기 위한 조작된 t 세포 및 종양 침윤성 림프구 Download PDF

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KR20220121814A
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cells
til
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사만다 마리 픽스
케이티 레즈바니
패트릭 후
시몬 펀트
소라야 조로 만리케
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더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
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Abstract

본 개시 내용의 실시 형태는 적어도 종양 미세 환경을 우회하는 요법에 관한 것이기 때문에 암 치료를 용이하게 하는 방법 및 조성물을 제공한다. 구체적인 실시 형태에서, 조성물은 형질 전환 성장 인자-베타 수용체 2 및/또는 T 세포-Ig 및 ITIM 도메인 및/또는 CD7 유전자의 발현이 감소되거나 제거되도록 조작되기 때문에 종양 미세 환경의 면역 억제로부터 방어되는 종양 침윤 림프구 및/또는 조작된 T 세포를 이용하는 요법에 사용된다.

Description

종양 미세 환경에서 면역 억제를 극복하기 위한 조작된 T 세포 및 종양 침윤성 림프구
본 출원은 2019년 11월 27일자로 출원된 미국 가출원 US 62/941,670에 대한 우선권을 주장하며, 그 전문은 본 명세서에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체가 본 출원에 참조로 포함된다. 2020년 11월 12일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 UTSC_P1200WO_SL.txt로 명명되며, 3,664 byte의 크기이다.
기술분야
본 개시 내용의 실시 형태는 적어도 세포 생물학, 분자 생물학, 면역학 및 의학 분야에 관한 것이다.
세포 면역 요법은 암 치료에 대해 많은 가능성을 가지고 있다. 그러나, 특정 세포 요법은 암 세포 또는 종양 미세 환경 중의 세포로부터의 억제 신호로 인해 성공이 제한적이다. 예를 들어, 미세 환경 중의 세포 (예를 들어, 조절 T 세포 또는 골수 유래 억제 세포)의 유도는 면역 반응을 억제하고 종양 세포 증식 및 생존을 촉진하는 형질 전환 성장 인자-β (transforming growth factor-β: TGFβ) 및 아데노신과 같은 물질을 방출한다.
따라서, 세포성 면역 요법의 개선된 방법에 대한 충족되지 않은 요구가 있다.
간략한 개요
본 개시 내용의 실시 형태는 입양 세포 요법 암 치료를 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 본 개시 내용은 특히 종양 침윤 림프구 (tumor-infiltrating lymphocyte: TIL) 및 조작된 T 세포가 개시된 각각의 방법 및 조성물의 부재하에서 보다 암 치료에 더 효과적이도록 하는 방법 및 조성물을 제공한다. 구체적인 실시 형태에서, 본 개시 내용은 조작된 TIL 및/또는 조작된 T 세포가 개시된 방법 및 조성물의 부재하에 TIL 및/또는 조작된 T 세포의 사용과 비교하여 종양 미세 환경에서 더 효과적이도록 하는 방법 및 조성물을 제공한다. 특별한 실시 형태에서, 상기 TIL 및/또는 조작된 T 세포는 수여자 개체에 대해 자가이지만, 일부 경우에서, 상기 TIL 및/또는 조작된 T 세포는 수여자 개체에 대해 동종 이계이다.
본 개시 내용은 특히 조작된 TIL 및/또는 조작된 T 세포의 사용과 관련하여 암 면역 요법의 개선에 대한 접근법을 제공한다. 특별한 실시 형태에서, TIL 또는 T 세포에서의 하나 이상의 특정 유전자의 녹아웃 또는 TIL 및/또는 T 세포에서의 하나 이상의 특정 유전자의 녹다운은 종양 미세 환경에서 면역 억제를 극복한다. 구체적인 실시 형태에서, 녹아웃되는 유전자(들)는 조작된 TIL 또는 조작된 T 세포가 종양 미세 환경 내에서 또는 종양 미세 환경으로부터의 하나 이상의 억제 신호를 우회하도록 허용하기 때문에 종양 미세 환경에서 면역 억제를 용이하게 한다. 구체적인 실시 형태에서, 상기 조작된 TIL 및/또는 조작된 T 세포는 형질 전환 성장 인자-베타 수용체 2 (TGFBR2) 및/또는 T 세포-Ig 및 ITIM 도메인 (T-cell-Ig-and-ITIM-domain: TIGIT) 내인성 유전자 및/또는 또는 CD7 및/또는 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (programmed cell death protein 1: PD-1) 및/또는 T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유-3 (T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3: TIM-3)의 발현이 감소되거나 제거된다. 상기 조작된 TIL 및/또는 조작된 T 세포가 세포에서 내인성 유전자를 편집하기 위해 임의의 적합한 수단을 사용하여 조작될 수 있지만, 구체적인 실시 형태에서, CRISPR이 이용된다.
본 개시 내용의 특별한 양태에서에서, 자가 TIL 및/또는 T 세포는 종양을 갖는 개체에 사용되지만, 대안적 실시 형태에서, 상기 개체는 혈액학적 악성 종양을 갖는다. 특정 실시 형태에서, TIL 및/또는 T 세포는 개체 자신의 암 (종양)으로부터 수득되는 것과 같이 암 요법을 필요로 하는 개체로부터 수득된다. 개체는 암에 걸린 것으로 공지될 수 있으며 일부 경우에서는 TIL을 수득하기 위해 암으로부터 세포를 채취할 수 있다. 다른 경우에서, 개체는 암에 걸린 것으로 공지되지 않을 수 있으며, 상기 TIL은 암 진단될 때 (예를 들어, 생검에 의해) 암으로부터 수득된다. 임의의 경우에서, TIL은 개체의 암으로부터 수득되고, 적합한 수의 확장된 TIL로 확장되고, TGFBR2 및/또는 TIGIT 및/또는 CD7 및/또는 PD-1 및/또는 TIM-3의 녹아웃 또는 녹다운을 갖도록 조작되고, 상기 TIL이 원래 수득된 개체에게 다시 전달될 수 있다.
본 개시 내용의 실시 형태는 하기를 포함하는 조성물을 포함한다:
(a) 조작된 종양 침윤 림프구 (TIL)로서, 여기서, 상기 TIL이 (1) 형질 전환 성장 인자-베타 수용체 2 (TGFBR2)의 발현 및/또는 활성의 중단; (2) T 세포-Ig 및 ITIM 도메인 (TIGIT)의 발현 및/또는 활성의 중단; (3) CD7의 발현 및/또는 활성의 중단; (4) PD-1의 발현의 중단; 및 (5) 상기 TIL에 대해 모두 내인성인 TIM-3의 발현의 중단 중 하나 이상을 포함하는, 조작된 종양 침윤 림프구 (TIL); 및/또는
(b) 조작된 T 세포로서, 여기서, 상기 T 세포가 (1) 상기 TIL에 대해 내인성인 형질 전환 성장 인자-베타 수용체 2 (TGFBR2)의 발현 및/또는 활성의 중단; (2) T 세포-Ig 및 ITIM 도메인 (TIGIT)의 발현 및/또는 활성의 중단; (3) CD7의 발현 및/또는 활성의 중단; (4) PD-1의 발현의 중단; 및 (5) 상기 T 세포에 대해 모두 내인성인 TIM-3의 발현의 중단 중 하나 이상을 포함하는, 조작된 T 세포.
구체적인 실시 형태에서, 상기 TIL은 확장된 TIL이다. TGFBR2, TIGIT, CD7, PD-1 및 TIM-3 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성의 중단은 핵산, 펩타이드, 단백질, 소분자 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 각각 TGFBR2, TIGIT, CD7, PD-1 또는 TIM-3에 상응하는 siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 CRISPR에 대한 가이드 RNA를 포함할 수 있다. 구체적인 경우에서, 상기 TIL 및/또는 상기 T 세포는 TGFBR2, TIGIT, CD7, PD-1 및/또는 TIM-3의 발현의 중단을 포함한다. 상기 T 세포는 T 세포 수용체, 키메라 항원 수용체, 케모카인 수용체, 키메라 사이토카인 수용체 또는 이들의 혼합물과 같은 하나 이상의 암 항원을 표적화하는 이종 항원 수용체를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 조성물의 세포 집단이 있는데, 여기서, 상기 집단은 약제학적으로 허용되는 담체 중에 있다.
하나의 실시 형태에서, 본 출원에서 포함되는 세포를 제조하는 방법이 있는데, 여기서, 상기 방법은 TIL 및/또는 T 세포를, (a) Cas9 또는 Cas9를 인코딩하는 핵산; 및 (b), (c), (d) 중 하나 이상; (b) CRISPR에 대한 TGFBR2 가이드 RNA; (c) CRISPR에 대한 TIGIT 가이드 RNA; (d) CRISPR에 대한 CD7 가이드 RNA; (e) CRISPR에 대한 PD-1 가이드 RNA; 또는 (f) CRISPR에 대한 TIM-3 가이드 RNA
로 각각 전기 천공하는 단계를 포함한다. 구체적인 실시 형태에서, 상기 방법은 2개 이상의 전기 천공 단계를 포함하는 것으로 추가로 한정되는데, 여기서, 제1 전기 천공 단계는 상기 TIL 및/또는 T 세포를 TGFBR2 가이드 RNA, TIGIT 가이드 RNA, CD7 가이드 RNA, PD-1 가이드 RNA 또는 TIM-3 가이드 RNA 중 하나 이상에 적용되고, 제2 전기 천공 단계는 상기 TIL 및/또는 T 세포를 상기 제1 전기 천공 단계에서 사용되지 않은 TGFBR2, TIGIT, CD7, PD-1 또는 TIM-3 중 하나 이상에 대한 가이드 RNA에 적용된다. 제3 전기 천공 단계가 제3 유전자를 표적화하기 위해 사용되는 예에서, 상기 제3 전기 천공 단계는 상기 TIL 및/또는 T 세포가 원하는 경우 제4 및 제5 전기 천공 단계를 비롯하여 상기 제1 및 제2 전기 천공 단계 등에서 사용되는 것들 이외의 RNA를 안내하도록 한다. 상기 방법은 상기 TIL 및/또는 T 세포를 확장시키는 적어도 하나의 단계를 추가로 포함한다. 구체적인 경우에서, 상기 TIL 및/또는 T 세포에 대한 확장 단계는 전기 천공 단계 이전에 있고/있거나, 상기 TIL 및/또는 T 세포에 대한 확장 단계는 전기 천공 단계 이후에 있다.
하나의 실시 형태에서, 치료학적 유효량의 본 개시 내용의 조성물을 개체에게 전달하는 단계를 포함하는, 개체에서 암 세포를 사멸시키는 방법이 있다. 상기 암은 혈액학적 암이거나 고형 종양을 포함할 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 상기 TIL 및/또는 T 세포는 상기 개체와 관련하여 동종 이계 또는 자가이다. 상기 방법은 (a) 상기 개체로부터 암 세포를 수득하는 단계; (b) 상기 암 세포로부터 TIL을 확장시켜 확장된 TIL을 생성하는 단계; (c) 상기 확장된 TIL을, (1) 상기 TIL에 대해 내인성인 TGFBR2의 발현 또는 활성이 중단되고/되거나; (2) 조작된 세포를 생성하기 위한 TIGIT의 발현 또는 활성이 중단되고/되거나; (3) CD7의 발현 또는 활성이 중단되고/되거나; (4) PD-1의 발현이 중단되고/되거나; (5) TIM-3의 발현이 중단되도록 조작하는 단계; 및 (d) 유효량의 상기 조작된 세포를 상기 개체에게 투여하는 단계로서 추가로 한정될 수 있다. 상기 방법은 (a) 상기 개체로부터 암 세포를 수득하는 단계; (b) T 세포를 확장시켜 확장된 T 세포를 생성하는 단계; (c) 상기 확장된 T 세포를, (1) 상기 TIL에 대해 내인성인 TGFBR2의 발현 또는 활성이 중단되고/되거나; (2) 조작된 세포를 생성하기 위한 TIGIT의 발현 또는 활성이 중단되고/되거나; (3) CD7의 발현 또는 활성이 중단되고/되거나; (4) PD-1의 발현이 중단되고/되거나; (5) TIM-3의 발현이 중단되도록 조작하는 단계; 및 (d) 유효량의 상기 조작된 세포를 상기 개체에게 투여하는 단계로서 추가로 한정될 수 있다.
일부 경우에서, 상기 개체는 수술, 방사선 치료, 화학 요법, 호르몬 요법, 면역 요법 또는 이들의 조합과 같은 추가의 암 요법을 전달받는다.
상기한 내용은, 후술하는 상세한 설명이 보다 잘 이해될 수 있도록, 본 개시 내용의 특징 및 기술적 이점을 다소 광범위하게 개략적으로 서술하였다. 본 출원의 청구항들의 주제를 형성하는 추가의 특징 및 이점이 이하에서 설명될 것이다. 당해 분야의 통상의 기술자들은, 개시되는 개념 및 구체적인 실시 형태가 본 설계의 동일한 목적을 수행하기 위해 다른 구조를 변형 또는 설계하기 위한 기초로서 용이하게 이용될 수 있다는 것을 인식해야 한다. 또한, 당해 분야의 통상의 기술자들은, 이러한 균등한 구성이 첨부된 청구항들에 기재된 사상 및 범위를 벗어나지 않는다는 것을 이해해야 한다. 추가의 목적 및 이점과 함께 구성 및 조작 방법 모두에 대해 본 출원에 개시된 설계의 특징인 것으로 믿어지는 신규한 특징은 첨부된 도면과 관련하여 고려될 때 하기의 설명으로부터 보다 잘 이해될 것이다. 그러나, 각 도면은 예시 및 설명의 목적으로만 제공되며 본 개시 내용의 범위의 정의로서 의도되지 않는다는 것을 명백하게 이해해야 한다.
본 개시 내용을 보다 완전하게 이해하기 위해, 이하에서는 첨부된 도면과 관련하여 주어진 하기 설명을 참조한다.
도 1: 전기 천공 기반 형질 감염을 사용하는 유전자 편집을 위한 Cas9 리보핵산 단백질 (ribonucleoprotein: RNP) 복합체의 T 세포로의 효율적인 전달. 본 도면은 거의 모든 세포가 전기 천공 후 Cas9 RNP 복합체에 대해 양성이다는 것을 입증한다.
도 2. Cas9 RNP 복합체의 전기 천공 기반 전달의 5일 후 쥐과 동물 T 세포에서 모델 유전자 (Selplg)의 녹아웃.
도 3. Cas9 RNP 복합체의 전기 천공 기반 전달을 사용하는 쥐과 동물 T 세포에서의 TIGIT의 녹아웃. 여기서 제공된 데이터는 RT-PCR에 의해 평가된 RNA 수준에서의 TIGIT 녹아웃을 나타낸다.
도 4. 생체외 확장된 환자 유래 TIL의 형질 감염 효율. 전기 천공에 의한 TIGIT 특이적 RNP 복합체의 전달은 76.5%의 세포 전달 효율을 초래하였다 (양성 세포 퍼센트).
도 5. TIGIT를 표적화하는 Cas9 RNP 복합체에 의한 이전에 확장된 TIL의 형질 감염은 주목할 만한 녹아웃을 초래한다. 대조군 경우 (형질 감염되지 않음) 및 실시예 경우 (TIGIT 특이 RNP로 형질 감염됨)에서 TIGIT에 대해 양성인 총 생 TIL의 백분율이 제공된다.
도 6a~6b. 생체 내에서 풀링된 shRNA 스크리닝을 통해 종양으로의 T 세포 침윤을 조절하는 유전자의 식별. 도 6a. 실험 설계의 개략도. 활성화된 pmel T 세포를 세포 표면 상에 발현된 단백질을 인코딩하는 300개의 유전자를 표적화하는 풀링된 shRNA 라이브러리로 형질 도입하고, 세포를 방사선 조사된 B16 종양 보유 마우스로 입양 전달 (ACT)하였다. ACT 후 7일에, pmel T 세포를 B16 종양과 비장 쌍의 샘플로부터 단리하고, DNA 단리 및 서열 분석을 수행하였다. 도 6b. 밀도 플롯. 밀도 플롯의 화살표는 비장 T 세포 및 참조 (ACT 전에 획득된 샘플)와 비교하여 TIL 집단의 농축된 헤어핀을 나타낸다. 그룹 당 2~3개의 샘플에 대해 분석을 수행하였다. 대표적인 표면 T 세포 스크리닝을 도시한다.
도 7. shRNA 바코드를 기반으로 하는 Cd7 녹다운을 통한 종양 대 비장의 T 세포 침윤의 증진. 비장 및 종양 샘플 (각각 n=6) 모두에서 Cd7을 표적화하는 10개의 상이한 shRNA 작제물 각각에 대한 shRNA 바코드 판독의 수를 도시한다. 대부분의 작제물은 비장 샘플과 비교하는 종양 샘플에서의 농축을 나타낸다.
도 8. 개별 유전자 녹다운을 기반으로 하는 비장 대 종양에서의 Cd7 녹다운 Pmel의 농축. Pmel T 세포를 렌티바이러스 벡터를 함유하는 Cd7 shRNA 또는 비-표적화 대조군 (non-targeting control: NTC) 벡터로 별도로 형질 도입하고, 벡터 발현된 GFP에 대해 FACS 분류하고, 종양 보유 마우스로의 ACT 전에 확장하였다. 총 종양 침윤 면역 림프구 (TIL)를 ACT 후 12일에 종양으로부터 단리하고 계수하였다. Cd7 녹다운 Pmel은 형질 도입되지 않거나 NTC 작제물 형질 도입된 Pmel T 세포와 비교하여 보다 많은 수로 발견되었는데, 이는 shRNA 스크리닝에서 발견된 효과를 확인시켜 준다.
도 9. 다양한 전기 천공 펄스 파라미터 (EH100, EN138, EH115 및 EO115로 표시됨)와 2개의 상이한 양의 Cas9 투입 (5 μg 및 10 μg)을 사용하고 모델 표적으로서 T 세포 수용체 알파 쇄 유전자 (T cell receptor alpha chain gene: TRAC)를 사용하는 환자 유래 TIL에서 CRISPR 유전자 녹아웃의 최적화.
도 10. 환자 유래 TIL에서 TIGIT의 CRISPR 유전자 녹아웃의 최적화. 다양한 가이드 RNA 서열 (TIGIT AA, AB, AC, AD 및 AE로 표시됨)로 TIGIT 녹아웃 처리된 TIL은 감소된 TIGIT 표면 발현을 나타낸다.
도 11. 환자 유래 TIL에서 TGFBR2의 CRISPR 유전자 녹아웃의 최적화. TGFBR2를 표적화하는 가이드 RNA (TGFBR2 AA, AB, AC 및 AD로 표시된 상이한 가이드 RNA 서열)를 사용하여 TIL을 유전적으로 변형하였다.
도 12. TGFBR2의 CRISPR 유전자 녹아웃 처리된 TIL은 외인성 TGF-β 자극의 효과에 대해 내성이 있다. TGFBR2를 표적화하는 가이드 RNA (TGFBR2 AA, AB, AC 및 AD로 표시된 상이한 가이드 RNA 서열)를 사용하여 TIL을 유전적으로 변형하였다.
[표 1] 사람 T 세포에서 TIGIT 및 TGFBR2를 표적화하는데 사용되는 가이드 RNA 서열.
Figure pct00001

도 13. TGFBR2의 CRISPR 유전자 녹아웃 처리된 TIL은 외인성 TGF-β 자극의 효과에 대해 내성이 있다. 변형되지 않은 TIL과 변형된 TIL을 TGF-β의 존재하에 3일 동안 배양하였다. 데이터는 비히클 처리된 TIL에 대한 TGF-β 처리된 (10 ng/ml) TIL의 사이토카인 농도의 배수 변화 (비)로서 표시된다. 데이터는 2명의 독립적인 공여자로부터 단리된 TIL로부터 제시된다.
도 14a~14c. RNP 형질 감염은 활성화된 마우스 CD8+ T 세포에서 고효율의 Cas9/CRISPR 매개성 PD-1 녹아웃을 유도한다. 형질 감염의 6일 후 유세포 측정에 의해 평가된 PD-1 단백질 발현; FMO에 기반하여 결정된 양성 발현 (도 14a). (도 14b) 항-CD3 및 인터루킨 (IL)-2에 의한 시험관내 활성화는 CD8 T 세포 (표적화되지 않은 대조군 RNP로 형질 감염된 대조군 세포, NTC 조건)에서 PD-1의 세포 표면 발현을 상향 조절한다. (도 14c) PD-1을 표적화하는 Cas9/gRNA RNP로 형질 감염된 T 세포, PD-1 KO 조건은 PD-1 발현의 감소를 나타낸다.
본 출원의 명세서에서 사용되는 "한" 또는 "하나"는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본 출원의 청구항(들)에서 사용되는 "한" 또는 "하나"라는 단어는, "~을 포함하는"이라는 단어와 함께 사용될 때, 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본 출원에서 사용되는 "또 다른"은 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다. 또한, "갖는", "포함하는 (including)", "함유하는" 및 "포함하는 (comprising)"이라는 용어는 상호 교환적이며, 당해 분야의 통상의 기술자는 이러한 용어가 개방형 용어라는 것을 인지하고 있다. 구체적인 실시 형태에서, 본 개시 내용의 양태는, 예를 들어, 본 개시 내용의 하나 이상의 서열로 "필수적으로 이루어지"거나 "이루어질" 수 있다. 본 발명의 일부 실시 형태는 본 개시 내용의 하나 이상의 요소, 방법 단계 및/또는 방법으로 이루어지거나 본질적으로 이루어질 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법 또는 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물에 대해 실시될 수 있는 것으로 고려된다. 본 출원의 범위는 본 명세서에 기재되는 공정, 기계, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법들 및 단계들의 특정 실시 형태에 한정하고자 하는 것은 아니다. 본 출원에서 사용되는 "또는" 및 "및/또는"이라는 용어는 서로 조합적으로 또는 배타적으로 다수의 구성 요소를 기재하는데 사용된다. 예를 들어, "x, y 및/또는 z"는 "x" 단독, "y" 단독, "z" 단독, "x, y 및 z", "(x 및 y) 또는 z", "x 또는 (y 및 z)" 또는 "x 또는 y 또는 z"를 지칭할 수 있다. x, y 또는 z는 실시 형태로부터 구체적으로 제외될 수 있는 것으로 구체적으로 고려된다.
본 명세서 전체에 걸친 "하나의 실시 형태", "한 실시 형태", "특별한 실시 형태", "관련 실시 형태", "특정 실시 형태", "추가적 실시 형태" 또는 "추가의 실시 형태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은, 당해 실시 형태와 관련하여 기재된 특별한 특징, 구조 또는 특성이 본 개시 내용의 적어도 하나의 실시 형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 장소에서의 상기 문구의 출현은 반드시 전부 동일한 실시 형태를 지칭하는 것은 아니다. 또한, 특별한 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시 형태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "치료학적 유효량"이라는 문구는 목적하는 일부 치료학적 효과를 달성하는데, 예를 들어, 대상체에서 암을 치료 (즉, 예방 및/또는 또는 개선)하거나 임의의 의학적 치료에 적용 가능한 합리적 이익/위험 비율로 다른 분자와의 TGF-베타 상호 작용을 직접 또는 간접적으로 억제하는데 효과적인 본 개시 내용의 화합물, 물질 또는 화합물을 포함하는 조성물의 양을 의미한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 치료학적 유효량은 적어도 하나의 증상을 감소시키거나 제거하기에 충분하다. 당해 분야의 통상의 기술자는 암이 완전히 근절되지 않고 부분적으로 개선되더라도 양이 치료학적으로 효과적인 것으로 간주될 수 있다는 것을 인식한다. 예를 들어, 암의 확산이 중단되거나 감소되거나 발병이 지연될 수 있고, 암으로 인한 부작용이 부분적으로 감소되거나 완전히 제거되거나 발병이 지연될 수 있으며, 대상체의 수명이 연장될 수 있고, 대상체가 통증을 덜 경험할 수 있고, 대상체의 삶의 질이 향상될 수 있다.
"약제학적으로 허용되는"이라는 문구는, 타당한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 사람 및 동물의 조직과의 접촉에 사용하기에 적합하고 합리적인 이익/위험 비율에 부합하는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태 (dosage form)를 지칭하도록 본 출원에서 사용된다.
본 출원에서 사용되는 "포유 동물"은 본 발명의 방법을 위한 적절한 대상체이다. 포유 동물은 새끼에게 먹이기 위한 모유를 분비하는 암컷에서 출산, 체모 및 유선을 특징으로 하는, 사람을 비롯한 보다 높은 척추 동물 클래스 포유류의 임의의 구성원일 수 있다. 또한, 포유 동물은 변화하는 기후 조건에도 불구하고 일정한 체온을 유지하는 능력을 특징으로 한다. 포유 동물의 예로는 사람, 고양이, 개, 소, 마우스, 래트, 말, 염소, 양 및 침팬지가 있다. 포유 동물은 "환자", "대상체" 또는 "개체"로서 지칭될 수 있다.
본 출원에 사용되는 유전자의 "파괴"는, 파괴의 부재하의 유전자 산물의 발현 수준과 비교하여, 세포에서 대상 유전자에 의해 인코딩되는 1종 이상의 유전자 산물의 발현의 제거 또는 감소를 지칭한다. 예시적인 유전자 산물은 mRNA 및 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 산물을 포함한다. 일부 경우에서의 파괴는 일시적 또는 가역적이고, 다른 경우에서는 영구적이다. 일부 경우에서의 파괴는, 절단된 또는 비-기능적 산물이 생산될 수 있다는 사실에도 불구하고, 기능적 또는 전장 단백질 또는 mRNA를 생산한다. 본 출원의 일부 실시 형태에서, 유전자 활성 또는 기능은, 발현과 대조적으로, 중단된다. 유전자 파괴는 일반적으로 인위적인 방법에 의해, 즉, 화합물, 분자, 복합체 또는 조성물의 첨가 또는 도입에 의해, 및/또는 DNA 수준에서와 같은 유전자의 핵산 또는 유전자와 관련된 핵산의 파괴에 의해 유도된다. 유전자 과괴를 위한 예시적인 방법으로는 유전자 사일런싱, 녹다운, 녹아웃, 및/또는 유전자 파괴 기술, 예를 들어, 유전자 편집이 포함된다. 이의 예로는 일반적으로 발현의 일시적 감소를 초래하는 RNAi, siRNA, shRNA 및/또는 리보자임과 같은 안티센스 기술 뿐만 아니라, 예를 들어, 파쇄의 유도 및/또는 상동 재조합에 의해 표적화된 유전자 불활성화 또는 파괴를 초래하는 유전자 편집 기술이 포함된다. 이의 예로는 삽입, 돌연변이 및 결실이 포함된다. 파괴는 전형적으로 유전자에 의해 인코딩되는 정상 또는 "야생형" 산물의 발현의 억제 및/또는 완전 부재를 초래한다. 예시적인 이러한 유전자 파괴는 전체 유전자의 결실을 비롯하여 유전자 또는 유전자 일부의 삽입, 프레임 이동 및 미스센스 돌연변이, 결실, 녹인 (knock-in), 녹아웃이다. 이러한 파괴는 코딩 영역에서, 예를 들어, 1종 이상의 엑손에서 일어날 수 있으며, 예를 들어, 정지 코돈의 삽입에 의해 전장 산물, 기능적 산물, 또는 임의의 산물의 생성 불능을 초래한다. 이러한 파괴는 또한 유전자의 전사를 방지하기 위해서 프로모터 또는 인핸서 또는 전사 활성화에 영향을 주는 다른 영역에서의 파괴에 의해 일어날 수 있다. 유전자 파괴에는 상동 재조합에 의한 표적화된 유전자 불활성화를 비롯하여 유전자 표적화가 포함된다.
본 출원에서 사용되는 "조작된"이라는 용어는 세포, 핵산, 폴리펩타이드, 벡터 등을 비롯한 사람의 손에 의해 생성되는 엔터티 (entity)를 지칭한다. 적어도 일부 경우에서, 조작된 엔터티는 합성이며, 본 개시 내용에서 활용되는 방식으로 구성되거나 자연적으로 존재하지 않는 요소를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 용어는 자연에서 발견되지 않는 하나 이상의 분자를 보유하거나 발현하도록 사람의 손에 의해 변형된 세포를 지칭한다.
이종 항원 수용체와 관련하여, 본 출원에서 사용되는 "조작된"이라는 용어는 사람의 손에 의해 생성되고 자연에서 발견되지 않고 이를 발현하는 세포에 대해 내인성이 아닌 항원 수용체를 지칭한다. 상기 수용체는, 예를 들어, 표준 재조합 기술을 통해 합성으로 생성될 수 있다. 상기 용어는 동일한 분자를 포함하여 자연에서 함께 발견되지 않는 성분을 포함하는 융합 단백질의 생성을 포함한다. 그 예로는 T 세포 수용체, 키메라 항원 수용체, 키메라 사이토카인 수용체 등이 포함된다. 본 출원에서 사용되는 "이종"이라는 용어는 수여자와 상이한 세포 유형 또는 상이한 종으로부터 유래되는 것을 지칭한다. 구체적인 경우에서, 이것은 합성되고/되거나 T 세포 또는 TIL로부터 유래되지 않은 유전자 또는 단백질을 지칭한다. 상기 용어는 또한 합성적으로 유도된 유전자 또는 유전자 작제물을 지칭한다. 예를 들어, 사이토카인은 당해 사이토카인을 인코딩하는 핵산 서열을 보유하는 벡터에서 T 세포 또는 TIL에 제공되는 것을 비롯하여 유전자 재조합에 의해서와 같이 합성적으로 유도되었기 때문에 상기 T 세포 또는 TIL에 의해 자연적으로 생산되는 경우에도 상기 T 세포 또는 TIL과 관련하여 이종인 것으로 간주될 수 있다.
본 개시 내용은 암을 앓고 있고 암 치료를 필요로 하는 개체를 위한 세포 요법의 개선에 관한 것이다. 상기 세포는 비자연적이며 사람의 손에 의해 조작되어 세포의 내인성 유전자(들)에 대한 하나 이상의 유전자 변형을 갖는다. 특별한 실시 형태에서, 상기 세포는 종양 침윤 림프구 (TIL) 및/또는 T 세포이다. 특별한 경우에서, 입양 세포 요법의 맥락을 포함하여 이들 세포의 치료학적 기능을 개선하기 위해 TIL 세포 및/또는 T 세포에 대한 억제 수용체를 인코딩하는 유전자의 녹아웃 또는 녹다운이 있다. 본 개시 내용은 상기 세포가 환자의 종양으로부터 단리되고, 적합한 수로 확장되고, 동일한 환자에게 재주입되는 것과 같은 특정 양태에서 TIL 요법 및/또는 T 세포 요법에 대한 개선을 제공한다. 구체적인 실시 형태에서, TGFBR2 및/또는 TIGIT 및/또는 CD7 및/또는 PD-1 및/또는 TIM-3의 녹아웃은 이들 세포가 종양 미세 환경에서 주요 면역 억제 신호를 극복하도록 한다. 적어도 특정한 경우에서, TIL 세포 및/또는 T 세포를 관심 대상의 각 유전자를 표적화하는 Cas9 단백질 및 gRNA로 구성된 Cas9 리보핵산 단백질 (RNP) 복합체로 형질 감염시킴으로써 녹아웃을 수행한다. 본 출원에서 포함되는 바와 같이, 이러한 방법을 사용하여 사람 및 마우스 T 세포 및 TIL 및/또는 T 세포에서 유전자의 효율적인 녹아웃이 존재한다.
I. 조작된 종양 침윤 림프구
본 개시 내용의 실시 형태는 임의의 암의 치료를 위한 하나 이상의 세포 조성물을 제공한다. 상기 세포 조성물은 유전적으로 변형된 TIL (예를 들어, 자연 돌연변이와 대조적으로 사람의 손에 의해 생성된 하나 이상의 내인성 유전자의 발현이 감소됨)을 포함할 수 있으며, 암 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하기 위한 제형을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 저장, 수송 및/또는 전달을 위해 제형화될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.
본 개시 내용의 실시 형태는 이렇게 조작되지 않은 TIL 보다 암 치료에 더 효과적이도록 조작된 TIL을 포함하는 면역 요법을 위한 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 TIL은 (1) 내인성 TGF-베타 수용체 2 (TGFBR2)의 발현이 감소 또는 제거되고/되거나 발현된 단백질의 활성이 감소 또는 제거되고/되거나; (2) 내인성 T 세포-Ig 및 ITIM 도메인 (TIGIT)의 발현이 감소 또는 제거되고/되거나 발현된 단백질의 활성이 감소 또는 제거되고/되거나; (3) 내인성 CD7의 발현이 감소 또는 제거되고/되거나 발현된 단백질의 활성이 감소 또는 제거되고/되거나; (4) 내인성 PD-1의 발현이 감소 또는 제거되고/되거나 발현된 단백질의 활성이 감소 또는 제거되고/되거나; (5) 내인성 TIM-3의 발현이 감소 또는 제거되고/되거나 발현된 단백질의 활성이 감소 또는 제거되도록 조작된다. 이러한 조작은 임의의 적합한 수단에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 상기 TIL은 유전자 편집될 수 있으며, 상기 유전자 편집은 임의의 수단에 의해 일어날 수 있다. 상기 유전자 편집은 일시적일 수 있거나 그렇지 않을 수 있으며; 구체적인 경우에서, 상기 유전자 편집은 영구적이다.
일부 실시 형태에서, 상기 유전자 파괴는 일부 예로서 목적하는 유전자 중 하나 이상의 파괴, 예를 들어, 녹아웃, 삽입, 미스센스 또는 프레임 이동 돌연변이, 예를 들어, 이중 대립 유전자 프레임 이동 돌연변이, 유전자의 전부 또는 일부의 결실, 예를 들어, 하나 이상의 엑손 또는 부분, 및/또는 녹인 (knock-in)에 영향을 미침으로써 수행된다. 특정한 경우에서, 상기 파괴는 DNA 결합 표적화된 뉴클레아제, 예를 들어, 아연 집게 뉴클레아제 (zinc finger nuclease: ZFN) 및 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (transcription activator-like effector nuclease: TALEN), 및 RNA 가이드된 뉴클레아제, 예를 들어, TGFBR2 유전자 또는 이의 일부 또는 TIGIT 유전자 또는 이의 일부 또는 CD7 유전자 또는 이의 일부 또는 PD-1 유전자 또는 이의 일부 또는 TIM-3 유전자 또는 이의 일부의 서열을 표적화하도록 특별히 설계된 CRISPR 관련 뉴클레아제 (CRISPR-associated nuclease: Cas)를 비롯한 서열 특이적 또는 화적화된 뉴클레아제에 의해 영향을 받을 수 있다.
일부 실시 형태에서, TGFBR2 유전자 파괴 및/또는 TIGIT 유전자 파괴 및/또는 CD7 유전자 파괴 및/또는 PD-1 유전자 파괴 및/또는 TIM-3 유전자 파괴는 표적화된 방식을 포함하여 유전자에서 하나 이상의 이중 가닥 파손의 유도 및/또는 하나 이상의 단일 가닥 파손에 의해 수행된다. 일부 실시 형태에서, 상기 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손은 뉴클레아제, 예를 들어, 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 유전자 표적화된 뉴클레아제에 의해 이루어진다. 일부 양태에서, 상기 파손은 유전자의 코딩 영역, 예를 들어, 엑손에서 유도된다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 상기 유도는 코딩 영역의 N-말단 부분 근처에서, 제1 엑손에서, 제2 엑손에서, 또는 후속 엑손에서 일어난다.
일부 실시 형태에서, 유전자 파괴는 안티센스 기법을 사용하여 RNA 간섭 (RNAi), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 (shRNA), 및/또는 리보자임을 사용하여 유전자의 발현을 선택적으로 억제하거나 진압함으로써 달성된다. siRNA 기술은 유전자로부터 전사되는 mRNA의 뉴클레오타이드 서열과 상동인 서열 및 상기 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 서열을 갖는 이중 가닥 RNA 분자를 사용하는 RNAi 기술이다. siRNA는 일반적으로 유전자로부터 전사된 mRNA의 한 영역과 상동/상보적이거나, 상이한 영역과 상동/상보적인 복수의 RNA 분자를 포함하는 siRNA일 수 있다. 일부 양태에서, siRNA는 폴리시스트론성 작제물에 포함된다.
표적 유전자 또는 유전자 산물의 서열 지식을 활용하는 기술을 사용하는 파괴의 경우, TIGIT 핵산 서열의 예는 GenBank® 승인 번호 EU675310에 있으며, 이의 상응하는 단백질은 GenBank® 승인 번호 ACD74757에 있다. TGFBR2 핵산 서열의 하나의 예로는 GenBank® 수탁 번호 NM_001024847에 있으며, 이의 상응하는 단백질 서열의 예는 GenBank® 수탁 번호 NP_001020018에 있다. CD7 핵산 서열의 하나의 예로는 GenBank® 수탁 번호 NM_006137에 있으며, 이의 상응하는 단백질 서열의 예는 GenBank® 수탁 번호 NP_006128에 있다. PD-1 핵산 서열의 하나의 예로는 GenBank® 수탁 번호 L27440에 있으며, 이의 상응하는 단백질 서열의 예는 GenBank® 수탁 번호 AAC41700.1에 있다. TIM-3 핵산 서열의 하나의 예로는 GenBank® 수탁 번호 JX049979에 있으며, 이의 상응하는 단백질 서열의 예는 GenBank® 수탁 번호 AFO66593.1에 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 파괴는 TGFBR2 유전자 또는 TIGIT 유전자 또는 CD7 유전자 또는 PD-1 유전자 또는 TIM-3 유전자에 특이적으로 결합하거나 이와 하이브리드화하는, DNA 표적화 분자, 예를 들어, DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산, 또는 이를 함유하는 복합체, 화합물 또는 조성물을 사용하여 달성된다. 일부 실시 형태에서, 상기 DNA 표적화 분자는 DNA 결합 도메인, 예를 들어, 아연 집게 단백질 (zinc finger protein: ZFP) DNA 결합 도메인, 전사 활성 인자 유사 단백질 (transcription activator-like protein: TAL) 또는 TAL 이펙터 (TAL effector: TALE) DNA 결합 도메인, 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복체 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat: CRISPR) DNA 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제의 DNA 결합 도메인을 포함한다. 아편 집게, TALE 및 CRISPR 시스템 결합 도메인은, 예를 들어, 자연 발생 아연 집게 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 조작 (하나 이상의 아미노산 변경)을 통해 예정된 뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 DNA 결합 단백질 (아연 집게 또는 TALE)은 자연적으로 발생하지 않는 단백질이다. 설계를 위한 합리적 기준은 기존 ZFP 및/또는 TALE 디자인의 정보와 결합 데이터를 저장하는 데이터베이스에서 정보를 처리하기 위한 대체 규칙 및 컴퓨터 알고리즘의 적용을 포함한다.
유전자 변형이 유전자에서 하나 이상의 이중 가닥 파손 및/또는 하나 이상의 단일 가닥 파손의 유도에 의해 수행되는 경우, 상기 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손은 비-상동 말단 접합 (non-homologous end-joining: NHEJ) 또는 상동성 지정 복구 (homology-directed repair: HDR)와 같은 세포 복구 과정을 통해 복구될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 복구 과정은 오류가 발생하기 쉬우며, 유전자의 완전한 녹아웃을 초래할 수 있는 프레임시프트 돌연변이, 예를 들어, 이중 대립 유전자 프레임시프트 돌연변이와 같은 유전자의 파괴를 초래한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 상기 파괴는 결실, 돌연변이 및/또는 삽입을 유도하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 파괴는 조기 정지 코돈의 존재를 초래한다. 일부 양태에서, 삽입, 결실, 전위, 프레임 이동 돌연변이 및/또는 조기 정지 코돈의 존재는 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능의 붕괴를 초래한다.
일부 실시 형태에서, 상기 변경은 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제 (RNA-guided endonuclease: RGEN)를 통한 변경과 같은 하나 이상의 DNA 결합 핵산을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 상기 변경은 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복체 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat: CRISPR) 및 CRISPR 관련 (Cas) 단백질을 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, "CRISPR 시스템"은 Cas 유전자를 인코딩하는 서열, tracr (트랜스 활성화 CRISPR) 서열 (예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr 메이트 (mate) 서열 (내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 tracrRNA 가공된 부분 직접 반복체 및 "직접 반복체" 포함), 가이드 서열 (내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로서 또한 지칭됨) 및/또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사물을 비롯하여 CRISPR 관련 ("Cas") 유전자의 발현 또는 이의 활성의 지시에 관여하는 전사물 및 기타 요소를 통칭하여 지칭한다.
CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 DNA에 서열 특이적으로 결합하는 비-코딩 RNA 분자 (가이드) RNA 및 뉴클레아제 기능성 (예를 들어, 2개의 뉴클레아제 도메인)을 갖는 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9)을 포함할 수 있다. CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 I형, II형 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유도될 수 있으며, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)와 같은 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체로부터 유도될 수 있다.
상기 TIL은 가이드 RNA 및 CRISPR 효소, 또는 CRISPR 효소를 인코딩하는 mRNA에 도입될 수 있다. CRISPR 매개성 파괴의 경우, 상기 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제는 당해 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 상기 TIL에 도입되어 작용제/화학 물질 및 분자 (단백질 및 핵산)의 세포 또는 세포하 구획 내부에 전달을 가능하게 하며, 비제한적인 예로서 리포좀 전달 수단, 중합체성 담체, 화학적 담체, 리포플렉스, 폴리플렉스, 덴드리머, 나노 입자, 에멀젼, 천연 세포내 이입 또는 식세포 작용 경로 뿐만 아니라 전기 천공과 같은 물리적 방법 을 포함하여 사용될 수 있다. 구체적인 양태에서, 전기 천공은 상기 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제, 또는 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 도입하는데 사용된다.
하나의 예시적인 방법에서, 다중 유전자의 CRISPR 녹아웃 방법은 종양을 비롯한 개체의 암으로부터 TIL의 단리를 포함할 수 있다. 자가 목적을 위해 개체로부터 수득될 때, 상기 TIL은 혈액, 골수 등을 비롯한 모든 종류의 생검 또는 일상적인 샘플 수집과 같은 임의의 적합한 방법으로 수득될 수 있다. 상기 TIL이 수여자 개체과 관련하여 동종 이계인 경우, 상기 TIL의 공급원은 보관소로부터, 상업적 공급원으로부터, 새롭게 공여자로부터 유래될 수 있다.
상기 TIL이 확장되는 실시 형태에서, TIL은 IL-2에서의 배양을 통해 종양 단편으로부터 TIL의 초기 확장에 이어서, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 인공 항원 제시 세포의 존재하에 4-1BB/CD137을 통한 추가의 공동 자극의 존재 또는 부재하에 CD3 가교 및 IL-2를 통한 자극을 수반하는 급속 확장 프로토콜과 같은 임의의 적합한 방법에 의해 확장될 수 있다.
확장 이전 또는 이후에, 상기 TIL은 TIGIT 및/또는 TGFBR2 및/또는 CD7 및/또는 PD-1 및/또는 TIM-3의 녹다운 또는 녹아웃을 수행하도록 조작될 수 있다. CRISPR이 활용되는 경우, TIGIT 및/또는 TGFBR2 및/또는 CD7 및/또는 PD-1 및/또는 TIM-3의 조작은 동일한 전기 천공 단계 또는 연속적인 전기 천공 단계에서 일어날 수 있다. 전기 천공 단계가 연속적일 때, TIGIT, TGFBR2, CD7, PD-1 및 TIM-3 중 하나 이상의 녹아웃/녹다운은 각각 이미 녹다운 또는 녹아웃되지 않은 TIGIT, TGFBR2, CD7, PD-1 및 TIM-3 중 하나의 녹아웃/녹다운 이전 또는 이후일 수 있다. TIGIT, TGFBR2, CD7, PD-1 및 TIM-3의 녹아웃/녹다운의 임의의 조합은, 예를 들어, 목적하는 유전자 각각이 조합 2, 3, 4 또는 5의 전기 천공 단계에서 편집되는 경우 임의의 순서로 일어날 수 있다. 단지 하나의 구체적인 예로서, TIGIT 및 TGFBR2는 제1 전기 천공 단계에서 편집될 수 있으며, CD7은 제2 또는 후속 전기 천공 단계 (및 PD-1 및 TIM-3을 포함하는 이의 임의의 조합)에서 편집될 수 있다. 상기 TIL의 CRISPR 편집 후, 이들은, 예를 들어, CD3 가교 및 IL2 자극을 통한 재자극을 통해 추가의 확장 단계에 적용될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.
일부 양태에서, Cas 뉴클레아제 및 gRNA (고정 tracrRNA와 표적 서열에 대해 특이적인 crRNA의 융합 포함)를 TIL에 도입한다. 일반적으로, gRNA의 5' 말단에서의 표적 부위는 상보적 염기쌍을 사용하여 Cas 뉴클레아제를 표적 부위, 예를 들어, TGFBR2 유전자 또는 TIGIT 유전자 또는 CD7 유전자 또는 PD-1 유전자 또는 TIM-3 유전자에 표적화한다. 상기 표적 부위는 전형적으로 NGG 또는 NAG와 같은 프로토스페이서 인접 모티프 (protospacer adjacent motif: PAM) 서열의 바로 5' 위치에 기초하여 선택될 수 있다. 이와 관련하여, gRNA는 가이드 RNA의 처음 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 12, 11 또는 10개의 뉴클레오타이드를 변형하여 표적 DNA 서열에 상응하도록 함으로써 목적하는 서열에 표적화된다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소를 특징으로 한다. 전형적으로, "표적 서열"은, 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계되는 서열을 일반적으로 지칭하며, 여기서, 표적 서열과 가이드 서열 사이의 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 하이브리드화를 유발하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있다면, 완전한 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다.
CRISPR 시스템은 표적 부위에서 이중 가닥 파손 (double stranded break: DSB)을 유도한 후 본 출원에서 논의된 바와 같은 중단 또는 변경을 유도할 수 있다. 다른 실시 형태에서, "니카아제"로 간주되는 Cas9 변이체는 표적 부위에서 단일 가닥을 틈새 도입하는데 사용된다. 쌍을 이룬 니카아제는, 예를 들어, 특이성을 개선하기 위해 사용될 수있으며, 각각은 틈새의 도입시에 5' 오버행이 동시에 도입되도록 한 쌍의 상이한 gRNA 표적화 서열에 의해 지시된다. 다른 실시 형태에서, 촉매적 불활성 Cas9는 유전자 발현에 영향을 미치기 위해 전사 억제 물질 또는 활성화제와 같은 이종 이펙터 도메인에 융합된다.
상기 표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드와 같은 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 상기 표적 서열은 세포의 소기관내와 같은 세포의 핵 또는 세포질에 위치할 수 있다. 일반적으로, 표적 서열을 포함하는 표적화 유전자좌로의 재조합을 위해 사용될 수 있는 서열 또는 주형은 "편집 주형" 또는 "편집 폴리뉴클레오타이드" 또는 "편집 서열"로서 지칭된다. 일부 양태에서, 외인성 주형 폴리 뉴클레오타이드는 편집 주형으로서 지칭될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 재조합은 상동성 재조합이다.
전형적으로, 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서, CRISPR 복합체 (표적 서열에 하이브리드화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체를 형성하는 가이드 서열 포함)의 형성은 표적 서열의 내부 또는 근처 (예를 들어, 표적 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 또는 그 이상의 염기쌍 이내)의 1개 또는 2개의 가닥의 절단을 초래한다. 야생형 tracr 서열의 전부 또는 일부를 포함하거나 이로 이루어질 수 있는 tracr 서열 (예를 들어, 야생형 tracr 서열의 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드)은 또한, 예를 들어, 가이드 서열에 작동 가능하게 연결된 tracr 메이트 서열의 전부 또는 일부에 대해 tracr 서열의 적어도 일부를 따라 하이브리드화함으로써 CRISPR 복합체의 일부를 형성할 수 있다. 상기 tracr 서열은 CRISPR 복합체의 하이브리드화 및 이의 형성에 참여하기에 충분한 tracr 메이트 서열에 대한 상보성, 예를 들어, 최적으로 정렬될 때 tracr 메이트 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 상보성을 갖는다.
CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 구동시키는 하나 이상의 벡터가 세포 내로 도입됨으로써, CRISPR 시스템의 요소의 발현은 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 지시할 수 있다. 구성 요소는 또한 단백질 및/또는 RNA로서 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas 효소, tracr 메이트 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열은 각각 별개의 벡터 상의 개별 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안으로, 동일하거나 상이한 조절 요소로부터 발현된 2개 이상의 요소는 단일 벡터로 조합될 수 있으며, 하나 이상의 추가의 벡터는 제1 벡터에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 구성 요소를 제공한다. 상기 벡터는 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열 ("클로닝 부위"로도 또한 지칭됨)과 같은 하나 이상의 삽입 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 삽입 부위는 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소의 업스트림 및/또는 다운스트림에 위치한다. 다수의 상이한 가이드 서열이 사용될 때, 단일 발현 작제물을 사용하여 CRISPR 활성을 세포 내의 다수의 상이한 상응하는 표적 서열에 표적화할 수 있다.
벡터는 Cas 단백질과 같은 CRISPR 효소를 인코딩하는 효소 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함할 수 있다. Cas 단백질의 비제한적인 예로는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csn1 및 Csx12로도 또한 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4, 이들의 동족체, 또는 이들의 변형 버전이 포함된다. 이러한 효소는 공지되어 있으며; 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 (S. pyogenes) Cas9 단백질의 아미노산 서열은 수탁 번호 Q99ZW2로 SwissProt 데이터베이스에서 발견될 수 있다.
CRISPR 효소는 Cas9 (예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코커스 뉴모니아에 (S. pneumonia) 유래)일 수 있다. CRISPR 효소는 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보체 내와 같은 표적 서열의 위치에 1개 또는 2개의 가닥의 절단을 지시할 수 있다. 상기 벡터가 상응하는 야생형 효소에 대해 돌연변이되는 CRISPR 효소를 인코딩함으로써, 돌연변이된 CRISPR 효소는 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오타이드의 1개 또는 2개의 가닥을 절단하는 능력이 결여될 수 있다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 유래의 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인에 있는 아스파테이트-투-알라닌 치환 (D10A)은 Cas9를 2개의 가닥을 절단하는 뉴클레아제로부터 나카아제 (단일 가닥을 절단함)로 전환한다. Integrated DNA Technologies, Inc.와 같이 오프-표적화 편집이 감소하도록 돌연변이된 CRISPR 효소를 사용할 수 있다. 일부 실시 형태에서, Cas9 니카아제는 DNA 표적의 센스 및 안티센스 가닥을 각각 표적화하는 가이드 서열(들), 예를 들어, 2개의 가이드 서열과 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 조합은 2개의 가닥이 틈새 도입되고 NHEJ 또는 HDR을 유도하는데 사용되도록 한다.
일부 실시 형태에서, CRISPR 효소를 인코딩하는 효소 코딩 서열은 진핵 세포와 같은 특정 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된다. 진핵 세포는 사람, 마우스, 래트, 래빗, 개 또는 비사람 영장류를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 포유 동물과 같은 특정 유기체의 세포이거나 이러한 유기체로부터 유래될 수있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 본래 아미노산 서열을 유지하면서 본래 서열 중 적어도 하나의 코돈을 해당 숙주 세포의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체하여 관심 대상 숙주 세포에서 증진된 발현을 위해 핵산 서열을 변형하는 과정을 지칭한다. 다양한 종들은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 코돈 편향 (유기체들 사이의 코돈 사용법의 차이)은 결국 그 중에서도 번역되는 코돈의 특성 및 특정 운반 RNA (tRNA) 분자의 이용 가능성에 의존하는 것으로 여겨지는 전령 RNA (mRNA)의 번역 효율성과 종종 상관 관계가 있다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩타이드 합성에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈의 반영이다. 따라서, 유전자는 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 코돈 최적화를 기반으로 조정될 수 있다.
일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 하이브리드화되고 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 지시하기에 충분한 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과의 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 일부 실시 형태에서, 가이드 서열과 이에 상응하는 표적 서열 사이의 상보성의 정도는, 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬될 때, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상이다.
최적 정렬은 서열 정렬을 위한 임의의 적합한 알고리즘의 사용에 의해 결정될 수 있으며, 이의 비제한적인 예로는 Smith-Waterman 알고리즘, Needleman-Wunsch 알고리즘, Burrows-Wheeler 변환 기반 알고리즘 (예를 들어, Burrows Wheeler Aligner), Clustal W, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Calif.), SOAP (soap.genomics.org.cn에서 이용 가능) 및 Maq (maq.sourceforge.net에서 이용 가능)이 포함된다.
CRISPR 효소는 1종 이상의 이종 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질의 일부일 수 있다. CRISPR 효소 융합 단백질은 임의의 추가의 단백질 서열 및, 임의로, 임의의 2개의 도메인들 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예로는 제한 없이 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열 및 다음 활성들 중 하나 이상을 갖는 단백질 도메인을 포함한다: 메틸라아제 활성, 데메틸라아제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성. 에피토프 태그의 비제한적인 예로는 히스티딘 (His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌 (influenza hemagglutinin: HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신 (Trx) 태그가 포함된다. 리포터 유전자의 예로는 글루타티온-5-트랜스퍼라아제 (glutathione-5- transferase: GST), 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase: HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 (chloramphenicol acetyltransferase: CAT) 베타갈락토시다아제, 베타-글루쿠로니다아제, 루시퍼라아제, 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein: GFP), HcRed, DsRed, 시안 형광 단백질 (cyan fluorescent protein: CFP), 황색 형광 단백질 (yellow fluorescent protein: YFP), 및 자가 형광 단백질을 포함하는 청색 형광 단백질 (blue fluorescent protein: BFP)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. CRISPR 효소는 말토오스 결합 단백질 (maltose binding protein: MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인 (DBD) 융합, GAL4A DNA 결합 도메인 융합 및 단순 헤르페스 바이러스 (herpes simplex virus: HSV) BP16 단백질 융합을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, DNA 분자에 결합하거나 다른 세포 분자에 결합하는 단백질 또는 단백질의 단편을 인코딩하는 유전자 서열에 융합될 수 있다. CRISPR 효소를 포함하는 융합 단백질의 일부를 형성할 수 있는 추가의 도메인은 본 출원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원공개 US 2011/0059502에 기재되어 있다.
일부 실시 형태에서, TGFBR2 및/또는 TIGIT 유전자 및/또는 CD7 유전자 및/또는 PD-1 유전자 및/또는 TIM-3 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능의 변경은 이에 상응하는 유전자를 파괴함으로써 수행된다. 일부 양태에서, 상기 유전자는 이의 발현이 유전자 변형의 부재 또는 변형에 영향을 미치도록 도입된 성분의 부재하의 발현과 비교하여 적어도 약 20, 30 또는 40%, 일반적으로는 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%까지 감소되도록 변형된다.
특별한 실시 형태에서, TGFBR2, TIGIT, CD7, PD-1 및 TIM-3 중 하나 이상의 발현 감소에 추가하여, 상기 TIL을 사람의 손에 의해 추가로 변형시킬 수 있다.
일부 실시 형태에서, 조작된 TIL을 생성하기 위한 방법 이전 또는 동안의 TIL은 하나 이상의 마커에 대한 음성 또는 양성 선택에 의해 농축에 적용된다.
II. 조작된 T 세포
본 개시 내용의 실시 형태는 임의의 암의 치료를 위한 하나 이상의 T 세포 조성물을 제공한다. 상기 세포 조성물은 유전적으로 변형된 T 세포 (예를 들어, 자연 돌연변이와 대조적으로 사람의 손에 의해 생성된 하나 이상의 내인성 유전자의 발현이 감소됨)을 포함할 수 있으며, 암 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하기 위한 제형을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 저장, 수송 및/또는 전달을 위해 제형화될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.
특정 실시 형태에서, 상기 T 세포는 하나 이상의 내인성 유전자의 발현이 감소되거나 발현되지 않도록 변형된다. 특별한 실시 형태에서, 상기 T 세포는 조작된 TCR, CAR, 키메라 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체, 이들의 조합 등과 같은 하나 이상의 이종 항원 수용체를 발현하도록 조작된다. 상기 이종 항원 수용체는 사람의 손에 의해 합성적으로 생산된다. 특별한 실시 형태에서, 상기 T 세포는 하나 이상의 암 항원에 대해 항원 특이성을 갖는 CAR 및/또는 TCR을 발현하도록 변형된다. 예를 들어, 상이한 항원에 대한 다중 CAR 및/또는 TCR은 상기 T 세포에 첨가될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 T 세포는 CRISPR를 사용하는 것과 같이 특정 유전자좌에서 CAR 또는 TCR의 녹인 (knock-in)에 의해 CAR 또는 TCR을 발현하도록 조작된다. 일부 실시 형태에서, 상기 T 세포는 하나 이상의 내인성 유전자의 발현이 감소되도록 조작되며, 하나 이상의 이종 항원 수용체를 발현하도록 조작된다.
일부 실시 형태에서, 상기 T 세포는 혈액, 골수, 림프액, 제대 및/또는 림프 기관으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 상기 세포는 사람 세포이다. 상기 세포는 전형적으로 대상체로부터 직접 단리되고/되거나 대상체로부터 단리되고 동결된 것들과 같은 일차 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 T 세포 또는 다른 세포 유형의 하나 이상의 서브 세트, 예를 들어, 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 이의 하위 집단, 예를 들어, 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화 가능성, 확장, 재순환, 국소화 및/또는 지속 능력, 항원 특이성, 항원 수용체의 유형, 특정 기관 또는 구획에서의 존재, 마커 또는 사이토카인 분비 프로파일 및/또는 분화 정도에 의해 정의된 것들을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 대상체로부터 세포를 단리하고, 이를 제조, 가공, 배양, 조작하여 합성 항원 수용체 (예를 들어, 비-본래의 TCR)를 발현시키고, 이를 조작하여 TGRBR2, TIGIT, CD7, PD-1 및/또는 TIM-3의 발현을 감소 또는 제거하고, 냉동 보존 전후에 동일한 대상체 및/또는 상이한 대상체 내로 이를 재도입하는 것을 포함한다. 이러한 단계들은 특정 순서로 일어날 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 예를 들어, T 세포는 합성 항원 수용체를 발현하도록 유전자 편집된 세포를 조작함으로써 내인성 유전자(들)이 유전자 편집되도록 조작될 수 있다.
특별한 실시 형태에서, 다음을 포함하는 특정 CRISPR 핵산 시약을 T 세포에서 사용할 수 있다 (또한 표 1 참조):
TGFBR2 (엑손 5) GACGGCTGAGGAGCGGAAGA(gRNA1) (서열 번호 11)
TGTGGAGGTGAGCAATCCCC(gRNA2) (서열 번호 12)
마우스 서열의 예:
Mm.Cas9.TGFBR2.1.AA: ACGGCCACGCAGACTTCATG (서열 번호 13)
Mm.Cas9.TGFBR2.1.AB: GGACTTCTGGTTGTCGCAAG (서열 번호 14)
T 세포 (예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포)의 하위 유형 및 하위 집단 중에서, 나이브 T (naive T: TN) 세포, 이펙터 T (effector T: TEFF) 세포, 기억 T 세포 및 이들의 하위 유형, 예를 들어, 줄기 세포 기억 T (stem cell memory T: TSCM), 중심 기억 T (central memory T: TCM), 이펙터 기억 T (effector memory T: TEM), 또는 말단 분화 이펙터 기억 T 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 점막 관련 불변 T (mucosa-associated invariant T: MAIT) 세포, 자연 발생 및 적응성 조절 T (regulatory T: Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예를 들어, TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포 및 델타/감마 T 세포가 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 조작된 T 세포 집단 중 하나 이상은 특이적 마커, 예를 들어, 표면 마커에 대해 양성이거나 특이적 마커에 대해 음성인 세포가 농축되거나 고갈된다. 일부 경우에서, 이러한 마커는 T 세포의 특정 집단 (예를 들어, 비-기억 세포) 상에서 존재하지 않거나 상대적으로 낮은 수준으로 발현되지만 T 세포의 다른 특정 집단 (예를 들어, 기억 세포) 상에서 존재하거나 생대적으로 보다 높은 수준으로 발현되는 것들이다.
일부 실시 형태에서, T 세포는 비-T 세포, 예를 들어, B 세포, 단핵구 또는 다른 백혈구, 예를 들어, CD14 상에서 발현되는 마커의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 양태에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계는 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포독성 T 세포를 분리하는데 사용된다. 이러한 CD4+ 및 CD8+ 집단은 하나 이상의 나이브, 기억 및/또는 이펙터 T 세포 하위 집단 상에서 발현되거나 상대적으로 보다 높은 정도로 발현되는 마커에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해 하위 집단으로 추가로 분류될 수 있다.
일부 실시 형태에서, CD8+ T 세포는, 예를 들어, 각각의 하위 집단과 관련된 표면 항원을 기준으로 하는 양성 또는 음성 선택에 의해 나이브, 중심 기억, 이펙터 기억 및/또는 중심 기억 줄기 세포가 추가로 농축되거나 고갈된다. 일부 실시 형태에서, 중심 기억 T (TCM) 세포의 농축은 일부 양태에서 이러한 하위 집단에서 특히 강력한 투여 후 장기간 생존, 확장 및/또는 생착을 개선시키는 것과 같이 효능을 증가시키기 위해 수행된다.
일부 실시 형태에서, 상기 조작된 T 세포는 T 세포이다. 이러한 방법에서, 종양 샘플은 암 치료를 필요로 하는 개체로부터 수득되며, 단일 세포 현탁액은 수득될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 상기 단일 세포 현탁액은 임의의 적합한 방식으로, 예를 들어, 기계적으로 (예를 들어, gentleMACSTM Dissociator, Miltenyi Biotec, Auburn, Calif.를 사용하여 종양을 분해함) 또는 효소적으로 (예를 들어, 콜라게나아제 또는 DNase) 수득될 수 있다. 종양 효소 분해물의 단일 세포 현탁액은 하나 이상의 특정 인터루킨, 예를 들어, IL-2와 함께 배양될 수 있다.
상기 배양된 T 세포는 풀링되고 신속하게 확장될 수 있다. 신속한 확장은 약 10 내지 약 14일의 기간에 걸쳐 적어도 약 50배 (예를 들어, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100배 또는 그 이상)의 항원 특이적 T 세포 수의 증가를 제공한다. 보다 바람직하게, 신속한 확장은 약 10일 내지 약 14일의 기간에 걸쳐 적어도 약 200배 (예를 들어, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900배 또는 그 이상)의 증가를 제공한다.
확장은 당해 분야에 공지된 바와 같은 임의의 다수의 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 피더 (feeder) 림프구와 IL-2 또는 IL-15의 존재하에 비특이적 T 세포 수용체 자극을 사용하여 신속하게 확장될 수 있다. 상기 비특이적 T 세포 수용체 자극은 약 30 ng/ml의 OKT3, 마우스 단클론 항-CD3 항체 (Ortho-McNeil®, Raritan, N.J.로부터 입수 가능)를 포함할 수 있다. 대안으로, T 세포는, T 세포 성장 인자, 예를 들어, 300 IU/ml IL-2 또는 IL-15, 바람직하게는 IL-2의 존재하에 사람 백혈구 항원 A2 (human leukocyte antigen A2: HLA-A2) 결합 펩타이드와 같은 벡터로부터 임의로 발현될 수 있는, 암의 하나 이상의 항원 (이의 항원성 부분, 예를 들어, 에피토프(들) 또는 세포 포함)에 의한 시험관내 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 자극에 의해 신속하게 확장될 수 있다. 상기 시험관내 유도 T 세포는 HLA-A2 발현 항원 제시 세포에 펄스된 암의 동일한 항원(들)으로 재자극함으로써 신속하게 확장된다. 대안으로, 상기 T 세포는, 예를 들어, 방사선 조사된 자가 림프구 또는 방사선 조사된 HLA-A2+ 동종 이계 림프구 및 IL-2로 재자극될 수 있다.
하나 이상의 이종 항원 수용체 및 TGFBR2, TIGIT, CD7, PD-1 및 TIM-3 중 하나 이상의 발현 감소를 갖는 것에 추가하여, 상기 T 세포는 T 세포의 성장과 활성화를 촉진하는 하나 이상의 T 세포 성장 인자를 발현하도록 변형될 수 있다. 적합한 T 세포 성장 인자는, 예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-12를 포함한다. 적합한 변형 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001]; 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994]을 참조한다. 특별한 양태에서, 변형된 자가 T 세포는 T 세포 성장 인자를 높은 수준으로 발현한다. IL-12의 것과 같은 T 세포 성장 인자 코딩 서열은 T 세포 성장 인자 코딩 서열에 대한 작동 가능한 연결이 고수준 발현을 촉진하는 프로모터와 마찬가지로 당해 분야에서 용이하게 입수 가능하다.
A. T 세포 수용체
일부 실시 형태에서, 조작된 이종 항원 수용체는 재조합 TCR 및/또는 자연 발생 T 세포로부터 클로닝된 TCR을 포함한다. "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 가변 α 및 β 쇄 (각각 TCRα 및 TCRβ로서도 또한 공지됨) 또는 가변 γ 및 δ 쇄 (각각 TCRγ 및 TCRδ로서도 또한 공지됨)를 함유하고 MHC 수용체에 결합된 항원 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, TCR은 αβ 형태이다.
전형적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 이들을 발현하는 T 세포는 특유의 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포의 표면 상에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로, TCR은 T 세포 (또는 T 림프구)의 표면 상에서 발견되며, 여기서, 이것은 일반적으로 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 역할을 담당한다. 일부 실시 형태에서, TCR은 또한 불변 도메인, 막관통 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 함유할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Janeway et al, 1997] 참조). 예를 들어, 일부 양태에서, TCR의 각 쇄는 하나의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 막 관통 영역 및 C-말단의 짧은 세포질 꼬리를 보유할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCR은 신호 전달을 매개하는데 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 연관된다. 달리 명시되지 않는다면, "TCR"이라는 용어는 이의 기능적 TCR 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 용어는 또한 αβ 형태 또는 γδ 형태의 TCR을 비롯하여 온전한 또는 전장 TCR을 포함한다.
따라서, 본 출원의 목적상, TCR에 대한 언급은 임의의 TCR 또는 기능성 단편, 예를 들어, MHC 분자, 즉, MHC-펩타이드 복합체에 결합된 특정 항원성 펩타이드에 결합하는 TCR의 항원 결합 부분을 포함한다. 상호 교환적으로 사용될 수 있는 TCR의 "항원 결합 부분" 또는 항원 결합 단편"은, TCR의 구조적 도메인의 일부를 함유하지만 완전한 TCR이 결합하는 항원 (예를 들어, MHC-펩타이드 복합체)에 결합하는 분자를 지칭한다. 일부 경우에서, 항원 결합 부분은 TCR의 가변 도메인, 예를 들어, 특정 MHC-펩타이드 복합체에 대한 결합을 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한 TCR의 가변 α 쇄 및 가변 β 쇄와 같은 TCR의 가변 도메인을 함유하며, 여기서, 일반적으로, 각각의 쇄는 3개의 상보성 결정 영역을 함유한다.
일부 실시 형태에서, TCR 쇄의 가변 도메인들은, TCR 분자의 결합 부위를 형성함으로써 항원 인식을 부여하고 펩타이드 특이성을 결정하는, 면역글로불린과 유사한 루프 또는 상보성 결정 영역 (complementarity determining region: CDR)을 형성하기 위해 연합한다. 전형적으로, 면역글로불린 처럼, CDR은 프레임워크 영역 (FR)에 의해 분리된다 (예를 들어, 문헌 [Jores et al., 1990]; [Chothia et al., 1988]; [Lefranc et al., 2003] 참조). 일부 실시 형태에서, CDR3은 가공된 항원을 인식하는 역할을 하는 주요 CDR이지만, 알파 쇄의 CDR1은 또한 항원성 펩타이드의 N-말단부와 상호 작용하는 것으로 나타난 반면, 베타 쇄의 CDR1은 펩타이드의 C-말단부와 상호 작용한다. CDR2는 MHC 분자를 인식하는 것으로 생각된다. 일부 실시 형태에서, β 쇄의 가변 영역은 초가변 (HV4) 영역을 추가로 함유할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 TCR 쇄는 불변 도메인을 함유한다. 예를 들어, 면역글로불린 처럼, TCR 쇄 (예를 들어, α 쇄, β 쇄)의 세포외 부분은 N-말단에서 2개의 면역글로불린 도메인, 가변 도메인 (예를 들어, Va 또는 Vp; 전형적으로 Kabat 넘버링 (문헌 [Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.])을 기준으로 1 내지 116번 아미노산), 및 세포막에 인접한 하나의 불변 도메인 (예를 들어, α 쇄 불변 도메인 또는 Ca, 전형적으로 Kabat를 기준으로 117 내지 259번 아미노산, β 쇄 불변 도메인 또는 Cp, 전형적으로 Kabat를 기준으로 117 내지 295번 아미노산)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에서, 2개의 쇄에 의해 형성되는 TCR의 세포외 부분은 CDR을 함유하는 2개의 막 근위 불변 도메인 및 2개의 막 원위 가변 도메인을 함유한다. TCR 도메인의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 형성하는 짧은 연결 서열을 함유하여, 2개의 쇄 사이를 연결한다. 일부 실시 형태에서, TCR은 TCR이 불변 도메인에서 2개의 디설파이드 결합을 함유하도록 α 및 β 쇄 각각에서 추가의 시스테인 잔기를 가질 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 TCR 쇄는 막 관통 도메인을 함유할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 막 관통 도메인은 양으로 하전되어 있다. 일부 경우에서, TCR 쇄는 세포질 꼬리를 함유한다. 일부 경우에서, 상기 구조는 TCR이 CD3과 같은 다른 분자와 연합할 수 있게 한다. 예를 들어, 막 관통 영역을 갖는 불변 도메인을 함유하는 TCR은 세포막에 단백질을 고정시키고 CD3 신호 전달 장치 또는 복합체의 불변 서브 유닛과 연합할 수 있다.
일반적으로, CD3은 포유 동물의 3개의 특유의 쇄 (γ, δ 및 ε) 및 ζ 쇄를 보유할 수 있는 다중 단백질 복합체이다. 예를 들어, 포유 동물에서, 상기 복합체는 CD3γ 쇄, CD3δ 쇄, 2개의 CD3ε 쇄, 및 CD3ζ 쇄의 동종 이량체를 함유할 수 있다. CD3γ 쇄, CD3δ 쇄 및 CD3ε 쇄는 단일 면역글로불린 도메인을 함유하는 면역글로불린 수퍼패밀리의 높은 관련 세포 표면 단백질이다. CD3γ 쇄, CD3δ 쇄 및 CD3ε 쇄의 막 관통 영역은 음으로 하전되어 있으며, 이는 이러한 쇄들이 양으로 하전된 T 세포 수용체 쇄와 연합하도록 하는 특징이다. CD3γ 쇄, CD3δ 쇄 및 CD3ε 쇄의 세포내 꼬리 각각은 면역 수용체 타이로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 공지된 단일의 보존된 모티프를 함유하는 반면, 각각의 CD3ζ 쇄는 3개를 갖는다. 일반적으로, ITAM은 TCR 복합체의 신호 전달 능력에 관여한다. 이러한 보조 분자들은 음으로 하전된 막 관통 영역을 가지며 신호를 TCR로부터 세포로 전파하는 역할을 수행한다. CD3 쇄 및 ζ 쇄는 TCR과 함께 T 세포 수용체 복합체로서 공지된 것을 형성한다.
일부 실시 형태에서, TCR은 2개의 쇄 α 및 β (또는 임의로 γ 및 δ)의 이종이량체일 수 있거나, 이것은 단일쇄 TCR 작제물일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 TCR은, 예를 들어, 디설파이드 결합 또는 다설파이드 결합들에 의해 연결된 2개의 별개의 쇄 (α 및 β 쇄 또는 γ 및 δ 쇄)를 함유하는 이종 이량체이다. 일부 실시 형태에서, 표적 항원 (예를 들어, 암 항원)에 대한 TCR을 동정하고 세포에 도입한다. 일부 실시 형태에서, TCR을 인코딩하는 핵산은, 예를 들어, 공중에게 이용 가능한 TCR DNA 서열의 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 의해 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCR은 생물학적 공급원으로부터, 예를 들어, T 세포 (예를 들어, 세포독성 T 세포), T 세포 하이브리도마 또는 다른 공중에게 이용 가능한 공급원과 같은 세포로부터 수득된다. 일부 실시 형태에서, T 세포는 생체내 단리된 세포로부터 수득될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 높은 친화성 T 세포 클론은 환자 및 단리된 TCR로부터 단리될 수 있다. 일부 실시 형태에서, T 세포는 배양된 T 세포 하이브리도마 또는 클론일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표적 항원에 대한 TCR 클론은 사람 면역계 유전자 (예를 들어, 사람 백혈구 항원 시스템 또는 HLA)로 조작된 형질 전환 마우스에서 생성되었다. 예를 들어, 종양 항원 (예를 들어, 문헌 [Parkhurst et al., 2009] 및 [Cohen et al., 2005] 참조)을 참조한다. 일부 실시 형태에서, 파지 디스플레이를 사용하여 표적 항원에 대한 TCR을 단리한다 (예를 들어, 문헌 [Varela-Rohena et al., 2008] 및 [Li, 2005] 참조). 일부 실시 형태에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분은 TCR의 서열에 대한 지식으로부터 합성으로 생성될 수 있다.
B. 키메라 항원 수용체 (CAR)
일부 실시 형태에서, 상기 T 세포는 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 세포외 항원 인식 도메인을 포함하는 하나 이상의 CAR을 발현하도록 조작된다. 일부 실시 형태에서, 상기 항원은 세포 표면 상에서 발현되는 단백질이다. 일부 실시 형태에서, CAR은 TCR 유사 CAR이며, 상기 항원은 가공된 펩타이드 항원, 예를 들어, TCR과 같이 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자의 맥락에서 세포 표면 상에서 인식되는 세포내 단백질의 펩타이드 항원이다.
일부 실시 형태에서, CAR은 a) 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인, b) 막 관통 도메인 및 c) 구체적인 실시 형태에서, 항원에 결합하는 scFvs인, 하나 이상의 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다.
CAR 및 재조합 TCR을 비롯한 예시적 항원 수용체 뿐만 아니라, 수용체를 조작하고 세포에 도입하기 위한 방법은, 예를 들어, 국제공개공보 WO 2000/14257, WO 2013/126726, WO 2012/129514, WO 2014/031687, WO 2013/166321, WO 2013/071154, WO 2013/123061, 미국 출원공개 US 2002/131960, US 2013/287748, US 2013/0149337, 미국 특허 US 6,451,995, US 7,446,190, US 8,252,592, US 8,339,645, US 8,398,282, US 7,446,179, US 6,410,319, US 7,070,995, US 7,265,209, US 7,354,762, US 7,446,191, US 8,324,353 및 US 8,479,118, 유럽 특허 출원 EP 2537416에 기재된 것들, 및/또는 문헌 [Sadelain et al., 2013]; [Davila et al., 2013]; [Turtle et al., 2012]; [Wu et al., 2012]에 기재된 것들을 포함한다. 일부 양태에서, 유전자 조작된 항원 수용체로는 미국 특허 US 7,446,190에 기재된 바와 같은 CAR 및 국제공개공보 WO 2014/055668 A1에 기재된 것들이 포함된다.
일부 실시 형태에서, 상기 CAR은 활성화 또는 자극 CAR, 공동 자극 CAR (국제공개공보 WO 2014/055668 참조) 및/또는 억제 CAR (iCAR, 문헌 [Fedorov et al., 2013] 참조)을 포함한다. CAR은 일반적으로 일부 양태에서는 링커들 및/또는 막 관통 도메인(들)을 통해 하나 이상의 세포내 신호 전달 성분에 연결된 세포외 항원 (또는 리간드) 결합 도메인을 포함한다. 이러한 분자들은 전형적으로 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공동 자극 수용체와 조합된 이러한 수용체를 통한 신호, 및/또는 공동 자극 수용체 단독을 통한 신호를 모방하거나 근사한다.
본 개시 내용의 특정 실시 형태는 일부 경우에서 세포내 신호 전달 도메인, 막관통 도메인 및 하나 이상의 신호 전달 모티프를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는, 면역원성을 감소시키기 위해 사람화된 CAR (hCAR)을 비롯하여 항원 특이적 CAR 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 비롯한 핵산의 용도에 관한 것이다. 특정 실시 형태에서, CAR은 하나 이상의 항원들 사이의 공유된 공간을 포함하는 에피토프를 인식할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 결합 영역은 단클론 항체의 상보성 결정 영역, 단클론 항체의 가변 영역 및/또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 특이성은 수용체에 결합하는 펩타이드 (예를 들어, 사이토카인)로부터 유래한다.
사람 CAR 핵산은 사람 환자에 대한 세포 면역 요법을 증진시키는데 사용되는 사람 유전자일 수 있는 것으로 고려된다. 구체적인 실시 형태에서, 본 개시 내용은 전장 CAR cDNA 또는 코딩 영역을 포함한다. 항원 결합 영역 또는 도메인은 본 출원에 참조로 포함되는 미국 특허 US 7,109,304에 기재된 것들과 같은 특정 사람 단클론 항체로부터 유래된 단일 쇄 가변 단편 (scFv)의 VH 및 VL 쇄의 단편을 포함할 수 있다. 상기 단편은 또한 사람 항원 특이적 항체의 다수의 상이한 항원 결합 도메인일 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서, 상기 단편은 사람 세포에서 발현을 위한 사람 코돈 용법에 최적화된 서열에 의해 인코딩된 항원 특이적 scFv이다.
정렬은 디아바디 또는 다량체와 같은 다량체일 수 있다. 상기 다량체는 경쇄 및 중쇄의 가변 부분의 교차 페어링에 의해 디아바디로 형성될 가능성이 높다. 작제물의 힌지 부분은, 완전히 결실된 것에서부터, 제1 시스테인이 유지된 것, 세린 보다는 오히려 프롤린 치환, 제1 시스테인까지 절단된 것까지, 여러 대체물을 가질 수 있다. Fc 부분은 결실될 수 있다. 안정하고/하거나 이량체화하는 임의의 단백질은 이러한 목적을 제공할 수 있다. Fc 도메인, 예를 들어, 사람 면역글로불린 유래의 CH2 또는 CH3 도메인 중 단지 하나를 사용할 수 있다. 또한, 이량체화를 개선시키기 위해 변형된 사람 면역글로불린의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 사용할 수 있다. 또한 단지 면역글로불린의 힌지 부분을 사용할 수 있다. 또한 CD8알파의 일부를 사용할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 CAR 핵산은 막 관통 도메인 및 변형된 CD28 세포내 신호 전달 도메인과 같은 다른 공동 자극 수용체를 인코딩하는 서열을 포함한다. 다른 공동 자극 수용체로는 CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10, DAP12 및 4-1BB (CD137) 중 하나 이상이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. CD3zeta에 의해 개시된 원발성 신호에 추가하여, 사람 CAR에 삽입된 사람 공동 자극 수용체에 의해 제공된 추가의 신호는 T 세포의 완전한 활성화에 중요하며, 입양 면역 요법의 생체내 지속성 및 치료학적 성공의 개선을 보조할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입양 요법에 의해 표적화되는 특정 세포 유형에서 발현되는 항원, 예를 들어, 암 마커 및/또는 약화된 반응을 유도하도록 의도되는 항원, 예를 들어, 정상 또는 비-질병 세포 유형 상에 발현되는 항원과 같은 특정 항원 (또는 마커 또는 리간드)에 대한 특이성을 갖는 CAR이 작제된다. 따라서, CAR은 전형적으로 이의 세포외 부분에서 하나 이상의 항원 결합 분자, 예를 들어, 하나 이상의 항원 결합 단편, 도메인 또는 부분, 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인 및/또는 항체 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, CAR은 단클론 항체 (mAb)의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL)로부터 유래된 단일 쇄 항체 단편 (scFv)와 같은 항체 분자의 항원 결합 부분 또는 부분들을 포함한다.
키메라 항원 수용체의 특정 실시 형태에서, 수용체의 항원 특이적 부분 (항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인으로서 지칭될 수 있음)은 종양 관련 항원 또는 병원체 특이적 항원 결합 도메인을 포함한다. 항원은 덱틴-1과 같은 패턴 인식 수용체에 의해 인식되는 탄수화물 항원을 포함한다. 종양 관련 항원은 종양 세포의 세포 표면 상에서 발현되는 한 임의의 종류일 수 있다. 종양 관련 항원의 예시적 실시 형태로는 CD19, CD20, 암배아 항원, 알파 태아 단백질, CA-125, MUC-1, CD56, EGFR, c-Met, AKT, Her2, Her3, 상피 종양 항원, 흑색종 관련 항원, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras 등이 포함된다. 특정 실시 형태에서, 상기 CAR은 하나 이상의 사이토카인과 공동 발현되어, 예를 들어, 낮은 양의 종양 관련 항원이 있을 때 지속성을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, CAR은 IL-7, IL-2, IL-15, IL-12, IL-18, IL-21 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 사이토카인과 공동 발현될 수 있다.
키메라 수용체를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임의 서열은 게놈 DNA 공급원, cDNA 공급원으로부터 수득될 수 있거나, 합성될수 있거나 (예를 들어, PCR을 통해), 이의 조합일 수 있다. 게놈 DNA의 크기 및 인트론의 수에 따라, 인트론이 mRNA를 안정화시키는 것으로 밝혀켰기 때문에, cDNA 또는 이의 조합을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, mRNA를 안정화시키기 위해 내인성 또는 외인성 비-코딩 영역을 사용하는 것이 추가로 유리할 수 있다.
키메라 작제물은 네이키드 (naked) DNA로서 또는 적합한 벡터로 면역 세포 내에 도입될 수 있는 것으로 고려된다. 네이키드 DNA를 사용하는 전기 천공에 의해 세포를 안정하게 형질 감염시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 US 6,410,319를 참조한다. 네이키드 DNA는 일반적으로 발현을 위한 적당한 배향으로 플라스미드 발현 벡터 내에 함유된 키메라 수용체를 인코딩하는 DNA를 지칭한다.
대안으로, 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터)를 사용하여 키메라 작제물을 면역 세포 내에 도입할 수 있다. 본 개시 내용의 방법에 따라 사용하기에 적합한 벡터는 면역 세포에서 비복제성이다. 예를 들어, HIV, SV40, EBV, HSV 또는 BPV를 기반으로 하는 벡터와 같은, 세포에 유지되는 바이러스의 카피 수가 세포의 생존력을 유지하기에 충분히 낮은 바이러스를 기반으로 하는 다수의 벡터가 공지되어 있다.
일부 양태에서, 항원 특이적 결합 또는 인식 성분은 하나 이상의 막관통 및 세포내 신호 전달 도메인에 연결된다. 일부 실시 형태에서, CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 막 관통 도메인을 포함한다. 하나의 실시 형태에서, 자연적으로 CAR 내 도메인 중 하나와 연합된 막 관통 도메인이 사용된다. 일부 경우에서, 상기 막 관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호 작용을 최소화하기 위해 이러한 도메인이 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막 관통 도메인에 결합하는 것을 방지하도록 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형된다.
일부 실시 형태에서는 막관통 도메인이 천연으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래한다. 상기 공급원이 천연인 경우, 일부 양태에서는 도메인이 임의의 막결합 또는 막 관통 단백질로부터 유래한다. 막 관통 영역으로는 T 세포 수용체, CD28, CD3 제타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD3 델타, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD154, ICOS/CD278, GITR/CD357, NKG2D 및 DAP 분자의 알파, 베타 또는 제타 쇄 (즉, 이들의 적어도 막 관통 영역(들) 포함)로부터 유래된 것들이 포함된다. 대안으로, 일부 실시 형태에서는 막 관통 도메인이 합성이다. 일부 양태에서, 합성 막 관통 도메인은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기들을 포함한다. 일부 양태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛은 합성 막관통 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다.
특정 실시 형태에서, T 세포를 유전적으로 변형시키기 위해 본 출원에서 기재된 플랫폼 기술은 (i) 전기 천공 장치 (예를 들어, 뉴클레오펙터)를 사용하는 비-바이러스 유전자 전달, (ii) 엔도도메인 (예를 들어, CD28/CD3-ζ, CD137/CD3-ζ 또는 다른 조합)을 통해 신호를 전달하는 CAR, (iii) 항원 인식 도메인을 세포 표면에 연결하는 다양한 길이의 세포외 도메인을 갖는 CAR, 및 일부 경우에는 (iv) CAR+ 면역 세포를 강력하고 수적으로 확장시킬 수 있도록 K562로부터 유래된 인공 항원 제시 세포 (artificial antigen presenting cell: aAPC)를 포함한다 (문헌 [Singh et al., 2008]; [Singh et al., 2011]).
C. 항원
유전적으로 조작된 이종 항원 수용체에 의해 표적화된 항원들 중에서, 입양 세포 요법을 통해 표적화되는 질환, 병태 또는 세포 유형의 맥락에서 발현되는 것들이 있다. 질환 및 병태 중에서, 혈액학적 암, 면역계의 암, 예를 들어, 림프종, 백혈병 및/또는 골수종, 예를 들어, B, T 및 골수성 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종을 포함한 암 및 종양을 비롯한 증식성, 신생물성 및 악성 질환 및 장애가 있다. 일부 실시 형태에서, 항원은, 정상 또는 비표적화된 세포 또는 조직과 비교하여, 질환 또는 병태의 세포, 예를 들어, 종양 또는 병원성 세포 상에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 실시 형태에서, 항원은 정상 세포 상에서 발현되고/되거나 조작된 세포 상에서 발현된다.
임의의 적합한 항원은 본 방법에서 표적화될 수 있다. 상기 항원은 특정 암 세포와 관련될 수 있지만, 일부 경우에서, 비-암성 세포와 관련되지 않는다. 예시적인 항원으로는 감염체, 자가/자기 항원, 종양/암 관련 항원 및 종양 신생 항원으로부터의 항원 분자가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다 (문헌 [Linnemann et al., 2015]). 특별한 양태에서, 상기 항원으로는 CD19, EBNA, CD123, HER2, CA-125, TRAIL/DR4, CD20, 암배아 항원, 알파 태아 단백질, CD56, AKT, Her3, 상피 종양 항원, CD319 (CS1), ROR1, 폴레이트 결합 단백질, HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, CD5, CD23, CD30, HERV-K, IL-11R알파, 카파 쇄, 람다 쇄, CSPG4, CD33, CD47, CLL-1, U5snRNP200, CD200, BAFF-R, BCMA, CD99, p53, 돌연변이된 p53, Ras, 돌연변이된 Ras, c-Myc, 세포질 세린/트레오닌 키나아제 (예를 들어, A-Raf, B-Raf 및 C-Raf, 사이클린 의존적 키나아제), MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MART-1, 흑색종 관련 항원, BAGE, DAM-6, -10, GAGE-1, -2, -8, GAGE-3, -4, -5, -6, -7B, NA88-A, MC1R, mda-7, gp75, Gp100, PSA, PSM, 타이로시나아제, 타이로시나아제 관련 단백질, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC2, 포스포이노시타이드 3-키나아제 (Phosphoinositide 3-kinase: PI3K), TRK 수용체, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, 윌름스 종양 항원 (WT1), AFP, -카테닌/m, 카스파아제-8/m, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HAGE, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, BCR-ABL, 인터페론 조절 인자 4 (IRF4), ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RAR, 종양 관련 칼슘 신호 전달 인자 1 (Tumor-associated calcium signal transducer 1: TACSTD1), TACSTD2, 수용체 타이로신 키나아제 (예를 들어, 상피 성장 인자 수용체 (Epidermal Growth Factor receptor: EGFR) (특히, EGFRvIII), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (platelet derived growth factor receptor: PDGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (vascular endothelial growth factor receptor: VEGFR)), VEGFR2, 세포질 타이로신 키나아제 (예를 들어, src 계열, syk-ZAP70 계열), 인테그린 연결 키나아제 (integrin-linked kinase: ILK), 신호 전달 인자 및 전사 활성 인자 (signal transducer and activator of transcription) STAT3, STATS, 및 STATE, 저산소증 유발 인자 (hypoxia inducible factor: HIF) (예를 들어, HIF-1 및 HIF-2), 핵 인자-카파 B (NF-B), 노치 수용체 (예를 들어, 노치 1-4), NY ESO 1, c-Met, 라파마이신의 포유 동물 표적 (mammalian targets of rapamycin: mTOR), WNT, 세포외 신호 조절 키나아제 (extracellular signal-regulated kinase: ERK), 및 이의 조절 서브 유닛, PMSA, PR-3, MDM2, 메소텔린, 신세포 암종-5T4, SM22-알파, 탄산 무수화 효소 I (carbonic anhydrases I: CAI) 및 IX (CAIX) (G250으로도 또한 공지됨), STEAD, TEL/AML1, GD2, 프로테이나아제3, hTERT, 육종 전위 변곡점, EphA2, ML-IAP, EpCAM, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, 폴리시알산, MYCN, RhoC, GD3, 푸코실 GM1, 메소텔린 (mesothelian), PSCA, sLe, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, RGsS, SAGE, SART3, STn, PAX5, OY-TES1, 정자 단백질 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, 레구메인, TIE2, Page4, MAD-CT-1, FAP, MAD-CT-2, fos 관련 항원 1, CBX2, CLDN6, SPANX, TPTE, ACTL8, ANKRD30A, CDKN2A, MAD2L1, CTAG1B, SUNC1 및 LRRN1이 포함된다.
항원들의 서열은 당해 분야, 예를 들어, GenBank® 데이터 베이스에서 공지되어 있으며, 다음 예를 포함한다: CD19 (수탁 번호 NG_007275.1), EBNA (수탁 번호 NG_002392.2), WT1 (수탁 번호 NG_009272.1), CD123 (수탁 번호 NC_000023.11), NY-ESO (수탁 번호 NC_000023.11), EGFRvIII (수탁 번호 NG_007726.3), MUC1 (수탁 번호 NG_029383.1), HER2 (수탁 번호 NG_007503.1), CA-125 (수탁 번호 NG_055257.1), WT1 (수탁 번호 NG_009272.1), Mage-A3 (수탁 번호 NG_013244.1), Mage-A4 (수탁 번호 NG_013245.1), Mage-A10 (수탁 번호 NC_000023.11), TRAIL/DR4 (수탁 번호 NC_000003.12) 및/또는 CEA (수탁 번호 NC_000019.10).
종양 관련 항원은 전립선암, 유방암, 결장직장암, 폐암, 췌장암, 신암, 중피종 암, 난소암, 간암, 뇌암, 골암, 위암, 비장암, 고환암, 자궁 경부암, 항문암, 담낭암, 갑상선암 또는 흑색종 암으로부터 유래될 수 있다. 예시적인 종양 관련 항원 또는 종양 세포 유래 항원으로는 MAGE 1, 3, 및 MAGE 4 (또는 국제공개공보 WO 99/40188에 개시된 것들과 같은 다른 MAGE 항원); PRAME; BAGE; RAGE, Lage (NY ESO 1로도 또한 공지됨); SAGE; 및 HAGE 또는 GAGE가 포함된다. 종양 항원의 이러한 비제한적인 예들은 흑색종, 폐 암종, 육종 및 방광 암종과 같은 광범위한 종양 유형에서 발현된다. 예를 들어, 미국 특허 US 6,544,518을 참조한다. 전립선암 종양 관련 항원으로는, 예를 들어, 전립선 특이적 막 항원 (prostate specific membrane antigen: PSMA), 전립선 특이적 항원 (prostate-specific antigen: PSA), 전립선 산성 포스페이트, NKX3.1, 및 전립선의 6개 막 관통 상피 항원 (six-transmembrane epithelial antigen of the prostate: STEAP)이 포함된다.
기타 종양 관련 항원으로는 Plu-1, HASH-1, HasH-2, Cripto 및 Criptin이 포함된다. 추가로, 종양 항원은 다수의 암 치료에 유용한, 전장 고나도트로핀 호르몬 방출 호르몬 (GnRH)과 같은 자가 펩타이드 호르몬, 짧은 10개 아미노산 길이의 펩타이드일 수 있다.
종양 항원으로는 HER-2/neu 발현과 같은 종양 관련 항원 발현을 특징으로 하는 암에서 유래된 종양 항원이 포함된다. 관심 대상 종양 관련 항원은 계통 특이적 종양 항원, 예를 들어, 멜라닌 세포 흑색종 계통 항원 MART-1/Melan-A, gp100, gp75, mda-7, 타이로시나아제 및 타이로시나아제 관련 단백질을 포함한다.
항원은 종양 세포에서 돌연변이된 유전자로부터 또는 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 상이한 수준으로 전사되는 유전자로부터 유래된 에피토프 영역 또는 에피토프 펩타이드, 예를 들어, 텔로머라아제 효소, 서바이빈, 메소텔린, 돌연변이된 ras, bcr/abl 재배열, Her2/neu, 돌연변이된 또는 야생형 p53, 시토크롬 P450 1B1, 및 비정상적으로 발현된 인트론 서열, 예를 들어, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제-V; 흑색종 및 B-세포 림프종에서 특유의 이디오타입을 생성하는 면역글로불린 유전자의 클론 재정렬; 종양 바이러스 과정으로부터 유래된 에피토프 영역 또는 에피토프 펩타이드를 포함하는 종양 항원, 예를 들어, 사람 파필로마 바이러스 단백질 E6 및 E7; 엡스타인 바 바이러스 단백질 LMP2; 종양 선택적 발현을 갖는 비돌연변이된 종양 태아성 단백질, 예를 들어, 암배아 항원 및 알파-태아 단백질을 포함할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 항원은 병원성 미생물로부터 또는 기회 감염성 병원성 미생물 (본 출원에서 감염 질환 미생물로서도 또한 불림), 예를 들어, 바이러스, 진균, 기생충 및 세균으로부터 수득되거나 유래된다. 특정 실시 형태에서, 이러한 미생물로부터 유래된 항원은 전장 단백질을 포함한다.
이의 항원이 본 출원에서 기재된 방법에서 사용하기 위해 고려되는 예시적인 병원체로는 사람 면역 결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus: HIV), 단순 헤르페스 바이러스 (herpes simplex virus: HSV), 호흡기 세포 융합 바이러스 (respiratory syncytial virus: RSV), 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus: CMV), 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus: EBV), 인플루엔자 A, B 및 C, 수포성 구내염 바이러스 (vesicular stomatitis virus: VSV), 폴리오마바이러스 (예를 들어, BK 바이러스 및 JC 바이러스), 아데노바이러스, 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스 (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: MRSA)를 비롯한 스태필로코커스 종, 및 스트렙토코커스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae)를 비롯한 스트렙토코커스 종이 포함된다. 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 본 출원에서 기재된 바와 같은 항원으로서 사용하기 위해 이들 및 다른 병원성 미생물로부터 유래된 단백질 및 당해 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, 간행물 및 공개 데이터베이스, 예를 들어, GENBANK®, SWISS-PROT® 및 TREMBL®에서 확인될 수 있다.
사람 면역 결핍 바이러스 (HIV)로부터 유래된 항원은 HIV 비리온 구조 단백질 (예를 들어, gp120, gp41, p17, p24), 프로테아제, 역전사 효소, 또는 tat, rev, nef, vif, vpr 및 vpu로 인코딩된 HIV 단백질 중 임의의 것을 포함한다.
단순 헤르페스 바이러스 (예를 들어, HSV 1 및 HSV2)로부터 유래된 항원은 HSV 후기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 후기 유전자 그룹은 대부분 비리온 입자를 형성하는 단백질을 인코딩한다. 이러한 단백질은, 각각 본 출원에서 기재된 바와 같은 항원으로서 사용될 수 있는, 바이러스 캡시드 UL6, UL18, UL35, UL38 및 주요 캡시드 단백질 UL19, UL45 및 UL27을 형성하는 (UL) 중 5개의 단백질을 포함한다. 본 출원에서 항원으로서 사용하기 위해 고려되는 다른 예시적인 HSV 단백질로는 ICP27 (H1, H2), 당단백질 B (gB) 및 당단백질 D (gD) 단백질이 포함된다. HSV 게놈은 적어도 74개의 유전자를 포함하며, 각각은 항원으로서 잠재적으로 사용될 수 있는 단백질을 인코딩한다.
사이토메갈로바이러스 (CMV)로부터 유래된 항원으로는 CMV 구조 단백질, 바이러스 복제의 급초기 및 초기 중에 발현되는 바이러스 항원, 당단백질 I 및 III, 캡시드 단백질, 피막 단백질, 저급 기질 단백질 pp65 (ppUL83), p52 (ppUL44), IE1 및 1E2 (UL123 및 UL122), UL128~UL150 유래의 유전자 클러스터로부터 수득된 단백질 산물 (문헌 [Rykman, et al., 2006]), 외피성 당단백질 B (gB), gH, gN 및 pp150이 포함된다. 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 본 출원에서 기재된 항원으로서 사용하기 위한 CMV 단백질은 GenBank®, SWISS-PROT® 및 TREMBL®과 같은 공개 데이터베이스에서 확인될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Bennekov et al., 2004], [Loewendorf et al., 2010], [Marschall et al., 2009] 참조).
특정 실시 형태에서 사용하기 위해 고려되는 엡스타인-바 바이러스 (EBV)로부터 유래된 항원으로는 EBV 용균 단백질 gp350 및 gp110, 엡스타인-바 핵 항원 (Epstein-Ban nuclear antigen: EBNA)-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA-선도 단백질 (EBNALP)을 비롯한 잠복기 감염 중에 생산된 EBV 단백질, 및 잠재성 막 단백질(latent membrane protein: LMP)-1, LMP-2A 및 LMP-2B가 포함된다 (예를 들어, 문헌 [Lockey et al., 2008] 참조).
본 출원에서 사용하기 위해 고려되는 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV)로부터 유래된 항원으로는 RSV 게놈에 의해 인코딩되는 11개의 단백질 또는 이들의 항원 단편 중 임의의 것이 포함된다: NS1, NS2, N (뉴클레오캡시드 단백질), M (기질 단백질) SH, G 및 F (바이러스 피막 단백질), M2 (제2 기질 단백질), M2-1 (연장 인자), M2-2 (전사 조절), RNA 폴리머라아제 및 인단백질 P.
사용하기 위해 고려되는 수포성 구내염 바이러스 (VSV)로부터 유래된 항원으로는 VSV 게놈에 의해 인코딩되는 5개의 주요 단백질 또는 이들의 항원 단편 중 임의의 것이 포함된다: 거대 단백질 (L), 당단백질 (G), 핵단백질 (N), 인단백질 (P) 및 기질 단백질 (M) (예를 들어, 문헌 [Rieder et al., 1999] 참조).
특정 실시 형태에서 사용하기 위해 고려되는 인플루엔자 바이러스로부터 유래되는 항원으로는 헤마글루티닌 (HA), 뉴라미니다아제 (NA), 핵단백질 (NP), 기질 단백질 M1 및 M2, NS1, NS2 (NEP), PA, PB1, PB1-F2 및 PB2가 포함된다.
또한, 예시적인 바이러스 항원으로는 아데노바이러스 폴리펩타이드, 알파바이러스 폴리펩타이드, 칼리시바이러스 폴리펩타이드 (예를 들어, 칼리시바이러스 캡시드 항원), 코로나바이러스 폴리펩타이드, 디스템퍼 바이러스 폴리펩타이드, 에볼라 바이러스 폴리펩타이드, 엔테로바이러스 폴리펩타이드, 플라비바이러스 폴리펩타이드, 간염 바이러스 (AE) 폴리펩타이드 (B형 간염 코어 또는 표면 항원, C형 간염 바이러스 E1 또는 E2 당단백질, 코어 또는 비구조 단백질), 헤르페스바이러스 폴리펩타이드 (단순 헤르페스 바이러스 바이러스 또는 수두 대상포진 바이러스 당단백질 포함), 전염성 복막염 바이러스 폴리펩타이드, 백혈병 바이러스 폴리펩타이드, 마르부르크 바이러스 폴리펩타이드, 오르토믹소바이러스 폴리펩타이드, 유두종 바이러스 폴리펩타이드, 파라인플루엔자 바이러스 폴리펩타이드 (예를 들어, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제 폴리펩타이드), 파라믹소바이러스 폴리펩타이드, 파보바이러스 폴리펩타이드, 페스티바이러스 폴리펩타이드, 피코르나 바이러스 폴리펩타이드 (예를 들어, 폴리오바이러스 캡시드 폴리펩타이드), 폭스 바이러스 폴리펩타이드 (예를 들어, 백시니아 바이러스 폴리펩타이드), 광견병 바이러스 폴리펩타이드 (예를 들어, 광견병 바이러스 당단백질 G), 레오바이러스 폴리펩타이드, 레트로바이러스 폴리펩타이드 및 로타바이러스 폴리펩타이드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
특정 실시 형태에서, 상기 항원은 세균 항원일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 관심 대상 세균 항원은 분비된 폴리펩타이드일 수 있다. 다른 특정 실시 형태에서, 세균 항원은 세균의 외부 세포 표면 상에 노출된 폴리펩타이드의 부분 또는 부분들을 가지는 항원을 포함한다.
사용하기 위해 고려되는 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스 (MRSA)를 비롯한 스태필로코커스 종으로부터 유래된 항원으로는 병독성 조절 인자, 예를 들어, Agr 시스템, Sar 및 Sae, Arl 시스템, Sar 동족체 (Rot, MgrA, SarS, SarR, SarT, SarU, SarV, SarX, SarZ 및 TcaR), Srr 시스템 및 TRAP가 포함된다. 항원의 역할을 할 수 있는 다른 스태필로코커스 단백질로는 Clp 단백질, HtrA, MsrR, 아코니타아제, CcpA, SvrA, Msa, CfvA 및 CfvB가 포함된다 (예를 들어, 문헌 [Staphylococcus: Molecular Genetics, 2008 Caister Academic Press, Ed. Jodi Lindsay] 참조). 2종의 스태필로코커스 아우레우스 (N315 및 Mu50)에 대한 게놈은 서열 분석되었으며, 예를 들어, PATRIC (문헌 [PATRIC: The VBI PathoSystems Resource Integration Center, Snyder et al., 2007])에서 공개적으로 이용 가능하다. 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 항원으로서 사용하기 위한 스태필로코커스 단백질은 또한 다른 공개 데이터베이스, 예를 들어, GenBank®, Swiss-Prot® 및 TrEMBL®에서 확인될 수 있다.
본 출원에서 기재된 특정 실시 형태에서 사용하기 위해 고려되는 스트렙토코커스 뉴모니아에로부터 유래된 항원으로는 뉴몰리신, PspA, 콜린 결합 단백질 A (choline-binding protein A: CbpA), NanA, NanB, SpnHL, PavA, LytA, Pht 및 필린 단백질 (RrgA; RrgB; RrgC)이 포함된다. 스트렙토코커스 뉴모니아에의 항원성 단백질은 또한 당해 분야에 공지되어 있으며, 일부 실시 형태에서 항원으로서 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Zysk et al., 2000] 참조). 스트렙토코커스 뉴모니아의 병독성 균주의 완전한 게놈 서열은 서열 분석되었으며, 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 본 출원에서 사용하기 위한 스트렙토코커스 뉴모니아 단백질은 또한 다른 공개 데이터베이스, 예를 들어, GENBANK®, SWISS-PROT® 및 TREMBL®에서 확인될 수 있다. 본 개시 내용에 따른 항원에 대한 특별한 관심 대상 단백질은 뉴모코커스의 표면에서 노출되는 것으로 예상되는 병독성 인자 및 단백질을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Frolet et al., 2010] 참조).
항원으로서 사용될 수 있는 세균 항원의 예로는 액티노마이세스 (Actinomyces) 폴리펩타이드, 바실러스 (Bacillus) 폴리펩타이드, 박테로이데스 (Bacteroides) 폴리펩타이드, 보르데텔라 (Bordetella) 폴리펩타이드, 바르토넬라 (Bartonella) 폴리펩타이드, 보렐리아 (Borrelia) 폴리펩타이드 (예를 들어, 보렐리아 부르그도르페리 (B. burgdorferi) OspA), 브루셀라 (Brucella) 폴리펩타이드, 캄필로박터 (Campylobacter) 폴리펩타이드, 카프노사이토파가 (Capnocytophaga) 폴리펩타이드, 클라미디아 (Chlamydia) 폴리펩타이드, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 폴리펩타이드, 콕시엘라 (Coxiella) 폴리펩타이드, 더마토필러스 (Dermatophilus) 폴리펩타이드, 엔테로코커스 (Enterococcus) 폴리펩타이드, 에를리히아 (Ehrlichia) 폴리펩타이드, 에세리키아 (Escherichia) 폴리펩타이드, 프란시셀라 (Francisella) 폴리펩타이드, 푸소박테리움 (Fusobacterium) 폴리펩타이드, 헤모바르토넬라 (Haemobartonella) 폴리펩타이드, 헤모필러스 (Haemophilus) 폴리펩타이드 (예를 들어, b형 헤모필러스 인플루엔자 (H. influenzae) 외막 단백질), 헬리코박터 (Helicobacter) 폴리펩타이드, 클렙시엘라 (Klebsiella) 폴리펩타이드, L형 세균 폴리펩타이드, 렙토스피라 (Leptospira) 폴리펩타이드, 리스테리아 (Listeria) 폴리펩타이드, 마이코박테리아 (Mycobacteria) 폴리펩타이드, 마이코플라스마 (Mycoplasma) 폴리펩타이드, 나이세리아 (Neisseria) 폴리펩타이드, 네오리케차 (Neorickettsia) 폴리펩타이드, 노카르디아 (Nocardia) 폴리펩타이드, 파스퇴렐라 (Pasteurella) 폴리펩타이드, 펩토코커스 (Peptococcus) 폴리펩타이드, 펩토스트렙토코커스 (Peptostreptococcus) 폴리펩타이드, 뉴모코커스 (Pneumococcus) 폴리펩타이드 (즉, 스트렙토코커스 뉴모니아에 폴리펩타이드), 프로테우스 (Proteus) 폴리펩타이드, 슈도모나스 (Pseudomonas) 폴리펩타이드, 리케차 (Rickettsia) 폴리펩타이드, 로칼리마에아 (Rochalimaea) 폴리펩타이드, 살모넬라 (Salmonella) 폴리펩타이드, 시겔라 (Shigella) 폴리펩타이드, 스태필로코커스 (Staphylococcus) 폴리펩타이드, A군 스트렙토코커스 (streptococcus) 폴리펩타이드 (예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 (S. pyogenes) M 단백질), B군 스트렙토코커스 아갈락티아에 (S. agalactiae) 폴리펩타이드, 트레포네마 (Treponema) 폴리펩타이드 및 여시니아 (Yersinia) 폴리펩타이드 (예를 들어, 여시니아 페스티스 (Y. pestis) F1 및 V 항원)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
진균 항원의 예로는 압시디아 (Absidia) 폴리펩타이드, 아크레모늄 (Acremonium) 폴리펩타이드, 알터나리아 (Alternaria) 폴리펩타이드, 아스퍼질러스 (Aspergillus) 폴리펩타이드, 바시디오볼루스 (Basidiobolus) 폴리펩타이드, 비폴라리스 (Bipolaris) 폴리펩타이드, 블라스토마이세스 (Blastomyces) 폴리펩타이드, 칸디다 (Candida) 폴리펩타이드, 콕시디오이데스 (Coccidioides) 폴리펩타이드, 코니디오볼루스 (Conidiobolus) 폴리펩타이드, 크립토코커스 (Cryptococcus) 폴리펩타이드, 쿠르발라리아 (Curvalaria) 폴리펩타이드, 에피더모파이톤 (Epidermophyton) 폴리펩타이드, 엑소피알라 (Exophiala) 폴리펩타이드, 게오트리쿰 (Geotrichum) 폴리펩타이드, 히스토플라스마 (Histoplasma) 폴리펩타이드, 마두렐라 (Madurella) 폴리펩타이드, 말라세지아 (Malassezia) 폴리펩타이드, 마이크로스포룸 (Microsporum) 폴리펩타이드, 모닐리엘라 (Moniliella) 폴리펩타이드, 모르티에렐라 (Mortierella) 폴리펩타이드, 무코르 (Mucor) 폴리펩타이드, 패실로마이세스 (Paecilomyces) 폴리펩타이드, 페니실리움 (Penicillium) 폴리펩타이드, 피알레모니움 (Phialemonium) 폴리펩타이드, 피알로포라 (Phialophora) 폴리펩타이드, 프로토테카 (Prototheca) 폴리펩타이드, 슈달레세리아 (Pseudallescheria) 폴리펩타이드, 슈도마이크로도키움 (Pseudomicrodochium) 폴리펩타이드, 피시움 (Pythium) 폴리펩타이드, 리노스포리듐 (Rhinosporidium) 폴리펩타이드, 리조푸스 (Rhizopus) 폴리펩타이드, 스콜레코바시디움 (Scolecobasidium) 폴리펩타이드, 스포로트릭스 (Sporothrix) 폴리펩타이드, 스템파일리움 (Stemphylium) 폴리펩타이드, 트리코파이톤 (Trichophyton) 폴리펩타이드, 트리코스포론 (Trichosporon) 폴리펩타이드 및 자일로히파 (Xylohypha) 폴리펩타이드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
원생 기생충 항원의 예로는 바베시아 (Babesia) 폴리펩타이드, 발란티디움 (Balantidium) 폴리펩타이드, 베스노이티아 (Besnoitia) 폴리펩타이드, 크립토스포리디움 (Cryptosporidium) 폴리펩타이드, 에이메리아 (Eimeria) 폴리펩타이드, 엔세팔리토준 (Encephalitozoon) 폴리펩타이드, 엔타모에바 (Entamoeba) 폴리펩타이드, 지아르디아 (Giardia) 폴리펩타이드, 함몬디아 (Hammondia) 폴리펩타이드, 헤파토준 (Hepatozoon) 폴리펩타이드, 이소스포라 (Isospora) 폴리펩타이드, 라이슈마니아 (Leishmania) 폴리펩타이드, 마이크로스포리디아 (Microsporidia) 폴리펩타이드, 네오스포라 (Neospora) 폴리펩타이드, 노세마 (Nosema) 폴리펩타이드, 펜타트리코모나스 (Pentatrichomonas) 폴리펩타이드, 플라스모디움 (Plasmodium) 폴리펩타이드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 연충 기생충 항원의 예로는 아칸토케일로네마 (Acanthocheilonema) 폴리펩타이드, 아엘루로스트롱질루스 (Aelurostrongylus) 폴리펩타이드, 안실로스토마 (Ancylostoma) 폴리펩타이드, 안지오스트롱질루스 (Angiostrongylus) 폴리펩타이드, 아스카리스 (Ascaris) 폴리펩타이드, 브루기아 (Brugia) 폴리펩타이드, 부노스토뭄 (Bunostomum) 폴리펩타이드, 카필라리아 (Capillaria) 폴리펩타이드, 차베르티아 (Chabertia) 폴리펩타이드, 쿠페리아 (Cooperia) 폴리펩타이드, 크레노소마 (Crenosoma) 폴리펩타이드, 딕티오카울루스 (Dictyocaulus) 폴리펩타이드, 디옥토파임 (Dioctophyme) 폴리펩타이드, 디페탈로네마 (Dipetalonema) 폴리펩타이드, 디파일로보트리움 (Diphyllobothrium) 폴리펩타이드, 디플라이디움 (Diplydium) 폴리펩타이드, 디로필라리아 (Dirofilaria) 폴리펩타이드, 드라쿤쿨루스 (Dracunculus) 폴리펩타이드, 엔테로비우스 (Enterobius) 폴리펩타이드, 필라로이데스 (Filaroides) 폴리펩타이드, 헤몬쿠스 (Haemonchus) 폴리펩타이드, 라고킬라스카리스 (Lagochilascaris) 폴리펩타이드, 로아 (Loa) 폴리펩타이드 폴리펩타이드, 만소넬라 (Mansonella) 폴리펩타이드, 무엘레리우스 (Muellerius) 폴리펩타이드, 나노파이터스 (Nanophyetus) 폴리펩타이드, 네카토르 (Necator) 폴리펩타이드, 네마토디루스 (Nematodirus) 폴리펩타이드, 외소파고스토뭄 (Oesophagostomum) 폴리펩타이드, 온코세르카 (Onchocerca) 폴리펩타이드, 오피스토르키스 (Opisthorchis) 폴리펩타이드, 오스테르타기아 (Ostertagia) 폴리펩타이드, 파라필라리아 (Parafilaria) 폴리펩타이드, 파라고니무스 (Paragonimus) 폴리펩타이드, 파라스카리스 (Parascaris) 폴리펩타이드, 파이살로프테라 (Physaloptera) 폴리펩타이드, 프로토스트롱질루스 (Protostrongylus) 폴리펩타이드, 세타리아 (Setaria) 폴리펩타이드, 스피로세르카 (Spirocerca) 폴리펩타이드, 스피로메트라 (Spirometra) 폴리펩타이드, 스테파노필라리아 (Stephanofilaria) 폴리펩타이드, 스트롱질로이데스 (Strongyloides) 폴리펩타이드, 스트롱질루스 (Strongylus) 폴리펩타이드, 텔라지아 (Thelazia) 폴리펩타이드, 톡사스카리스 (Toxascaris) 폴리펩타이드, 톡소카라 (Toxocara) 폴리펩타이드, 트리키넬라 (Trichinella) 폴리펩타이드, 트리코스트롱질루스 (Trichostrongylus) 폴리펩타이드, 트리쿠리스 (Trichuris) 폴리펩타이드, 운시나리아 (Uncinaria) 및 우케레리아 (Wuchereria) 폴리펩타이드 (예를 들어, 플라스모디움 팔시파룸 포자소체 (P. falciparum circumsporozoite: PfCSP)), 포자소체 표면 단백질 2 (P. falciparum sporozoite surface protein 2: PfSSP2), 간 상태 항원 1의 카복시 말단 (P. falciparum carboxyl terminus of liver state antigen 1: PfLSA1 c-말단) 및 외수송 단백질 1 (P. falciparum exported protein 1: PfExp-1), 뉴모시스티스 (Pneumocystis) 폴리펩타이드, 사코시스티스 (Sarcocystis) 폴리펩타이드, 시스토소마 (Schistosoma) 폴리펩타이드, 테일레리아 (Theileria) 폴리펩타이드, 톡소플라스마 (Toxoplasma) 폴리펩타이드, 트립파노소마 (Trypanosoma) 폴리펩타이드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
외부 기생충 항원의 예로는 벼룩; 진드기, 예를 들어, 참 진드기 및 물렁 진드기; 파리, 예를 들어, 깔따구, 모기, 모래파리, 먹파리, 말파리, 뿔파리, 사슴파리, 체체파리, 침파리, 구더기증 유발 파리 및 각다귀; 개미; 거미, 이; 진드기; 및 노린재, 예를 들어, 빈대 및 침노린재 유래의 폴리펩타이드 (알러지원 뿐만 아니라 항원 포함)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
III. 본 개시 내용의 방법
본 개시 내용의 실시 형태는, 요법의 적어도 일부로서 TIL 및/또는 T 세포를 사용함으로써, 혈액학적 악성 종양 또는 고형 종양을 비롯한 적어도 암을 포함하여 임의의 종류의 의학적 병태를 치료 또는 예방하는 개선된 면역 요법 방법을 포함한다. 혈액학적 악성 종양으로는 적어도 골수암, T 또는 B 세포 악성 종양, 백혈병, 림프종, 모세포종, 골수종 등이 포함된다. 구체적인 예로는 적어도 급성 골수성 백혈병, B 세포 급성 림프아구성 백혈병, T 세포 급성 림프아구성 백혈병, 골수 이형성 증후군, 만성 림프구성 백혈병/소림프구 림프종, 여포성 림프종, 림프 형질 세포성 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 외투 세포 림프종, 모발상 세포성 백혈병, 형질 세포 골수종 또는 다발성 골수종, 성숙 T/NK 신생물 등이 포함된다. 고형 종양의 예로는 뇌, 폐, 유방, 전립선, 췌장, 위, 항문, 두경부, 뼈, 피부, 간, 신장, 갑상선, 고환, 난소, 자궁 내막, 담낭, 복막, 자궁 경부, 결장, 직장, 외음부, 비장, 이들의 조합 등의 종양이 포함된다.
상기 암은 구체적으로는 다음과 같은 조직학적 유형일 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 신생물, 악성; 암종; 암종, 미분화형; 거대 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두상 암종; 편평 세포 암종; 림프 상피 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두상 이행 세포 암종; 선암종; 가스트린종, 악성; 담관 암종; 간 세포 암종; 조합된 간 세포 암종 및 담관 암종; 섬유주 선암종; 선양 낭성 암종; 선종 폴립 내의 선암종; 선암종, 가족성 대장 폴립증; 고형 암종; 카르시노이드 종양, 악성; 기관세지-폐포성 선암종; 유두상 선암종; 혐색소성 암종; 호산성 암종; 호산성 선암종; 호염구 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두상 및 여포성 선암종; 비캡슐화 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속 기관 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 귀지 선암종; 점액표피양 암종; 낭선암종; 유두상 낭선암종; 유두상 장액 낭선암종; 점액성 낭선암종; 점액성 선암종; 인환 세포 암종; 침윤성 유관 암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 파제트병, 유선; 세엽 세포 암종; 선편평 세포 암종; 선암종 w/편평 세포 화생; 흉선종, 악성; 난소 기질 종양, 악성; 난포막종, 악성; 과립막 세포 종양, 악성; 남성 모세포종, 악성; 세르톨리 세포 암종; 라이디히 세포 종양, 악성; 지질 세포 종양, 악성; 부신경절종, 악성; 유방외 부신경절종, 악성; 크롬친화세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 표재 확장성 흑색종; 흑점 악성 흑색종; 말단 흑자 흑색종; 결절성 흑색종; 거대 착색 모반 내의 악성 흑색종; 상피모양 세포 흑색종; 청색 모반, 악성; 육종; 섬유육종; 섬유질 조직구종, 악성; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포성 횡문근육종; 기질 육종; 혼합 종양, 악성; 뮬레리안 혼합 종양; 신아세포종; 간모세포종; 암육종; 간엽세포종, 악성; 브레너 종양, 악성; 엽상 종양, 악성; 활막 육종; 중피종, 악성; 미분화배세포종; 배아 암종; 기형종, 악성; 난소 갑상선종, 악성; 융모막 암종; 중신종, 악성; 혈관육종; 혈관내피종, 악성; 카포시 육종; 혈관주위세포종, 악성; 림프관육종; 골육종; 피질주위 골육종; 연골육종; 연골모세포종, 악성; 간엽 연골육종; 골의 거대 세포 종양; 유잉 육종; 치원성 종양, 악성; 법랑아세포성 치아육종; 사기질모세포종, 악성; 법랑아세포성 섬유육종; 송과체종, 악성; 척색종; 신경아교종, 악성; 뇌실막세포종; 별아교세포종; 원형질 별아교세포종; 원섬유성 별아교세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 희소돌기아교세포종; 희소돌기모세포종; 원시 신경외배엽성; 소뇌 육종; 신경절신경교세포종; 신경교세포종; 망막모세포종; 후각 신경인성 종양; 수막종, 악성; 신경섬유육종; 신경집종, 악성; 과립 세포 종양, 악성; 악성 림프종; 호지킨 질환; 호지킨; 파라육아종; 악성 림프종, 소림프구성; 악성 림프종, 대세포, 확산; 악성 림프종, 여포성; 균상식육종; 다른 특정 비-호지킨 림프종; B-세포 림프종; 저등급/여포성 비-호지킨 림프종 (non-Hodgkin's lymphoma: NHL); 소림프구 (small lymphocytic: SL) NHL; 중간 등급/여포성 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아구성 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소 비-분할 세포 NHL; 큰 부피 질병 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS 관련 림프종; 발덴스트룀 거대글로불린혈증; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프양 백혈병; 형질 세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단구성 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵모구성 백혈병; 골수 육종; 모발 세포 백혈병; 만성 림프구성 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia: CLL); 급성 림프아구성 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia: ALL); 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia: AML); 및 만성 골수아구성 백혈병.
본 개시 내용의 방법은 암을 치료하기 위한 TIL (확장 여부에 관계 없이) 및/또는 T 세포 (확장 여부에 관계 없이)를 포함하는 입양 세포 요법을 비롯한 면역 요법을 포함하는데, 여기서, 상기 면역 요법은 방출된 억제성 TGF-베타 (예를 들어, 암 세포로부터)를 억제하거나, TGF-베타와 인테그린 사이의 관계와 같은 관련 상호 작용을 억제하거나, 면역 세포에 결합하는 TGF-베타의 능력을 억제함 (상기 세포에서 이의 수용체를 녹아웃시킴)으로써 면역 요법에 대한 보다 큰 효능을 가능하게 하도록 개선된다. TIL 및/또는 T 세포의 이러한 변형은 암 치료에서 보다 큰 효능을 가능하게 한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용은 유효량의 본 개시 내용의 TIL 및/또는 T 세포를 투여하는 단계를 포함하는 면역 요법 방법을 제공하는데, 여기서, 상기 TIL 및/또는 T 세포는 특별히 변형된다. 하나의 실시 형태에서, 의학적 질환 또는 장애는 수여자에서 면역 반응을 유도하는 적어도 특정 TIL 및/또는 T 세포에 의해 치료된다. 본 개시 내용의 특정 실시 형태에서, 임의의 암은 면역 반응을 유도하는 특정 TIL 및/또는 T 세포 집단의 전달에 의해 치료된다. 상기 TIL 및/또는 T 세포가 목적하는 항원을 표적화할 수 있는 이종 항원 수용체와 같은 분자를 포함할 때, 유효량의 항원 특이적 세포 요법을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암의 진행을 치료하거나 지연시키는 방법이 본 출원에서 제공된다.
본 개시 내용의 특별한 실시 형태에서, 유효량의 TIL 및/또는 T 세포는 이를 필요로 하는 개체, 예를 들어, 임의의 종류의 암을 앓고 있는 개체에게 전달된다. 그 다음, 상기 세포는 상기 암 세포를 공격하도록 개체의 면역계를 증진시킨다. 일부 경우에서, 상기 개체는 1회 이상의 용량의 상기 TIL 및/또는 조작된 T 세포를 제공받는다. 상기 개체가 2회 이상의 용량의 상기 TIL 및/또는 조작된 T 세포를 제공받는 경우, 투여 사이의 기간은 개체에서 증식을 위한 시간을 허용하기에 충분해야 하며, 특정 실시 형태에서, 용량 사이의 기간은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 이상일 수 있다. 연속 용량은 서로 양이 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. 일부 경우에서, 상기 연속 용량은 시간 경과에 따라 감소하거나 시간 경과에 따라 증가한다.
본 개시 내용의 방법은 TGFBR2 및/또는 TIGIT 및/또는 CD7 및/또는 PD-1 및/또는 TIM-3의 녹아웃을 위해 조작된 TIL 및/또는 T 세포를 포함하는 유효량의 조성물의 전달을 포함한다. 일부 경우에서, 다중 세포 집단이 있는데, 여기서, 단일 TIL 및/또는 단일 T 세포 각각은 TGFBR2 및 TIGIT 및 CD7 및 PD-1 및 TIM-3의 녹아웃을 갖는 반면, 다른 경우에서, 상기 집단은 TGFBR2 녹아웃 및/또는 TIGIT 녹아웃 및/또는 CD7 녹아웃 및/또는 PD-1 녹아웃 및/또는 TIM-3 녹아웃된 TIL 세포 및/또는 T 세포의 혼합물이다. 2개 이상의 구성 요소의 전달 순서가 바람직한 경우, 상기 순서는 상기 전달이 치료학적으로 유효한 한 임의의 종류일 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, TIL 세포 및/또는 하나 이상의 목적하는 유전자의 녹아웃을 포함하는 T 세포의 전달은 제2 요법이 초기 TIL 및/또는 조작된 T 세포 단계의 부재 보다 더 효과적이도록 제2 요법 전에 일어난다.
조작된 TIL 및 조작된 T 세포 모두가 이를 필요로 하는 개체에게 투여되는 실시 형태에서, 상기 조작된 TIL 및 조작된 T 세포는 동일한 제형에 있을 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 상기 조작된 TIL 및 조작된 T 세포가 동일한 제형에 있는 경우, 이들은 양이 실질적으로 동일할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 조작된 TIL 및 조작된 T 세포에 대해 사용되는 특정 비율이 있을 수 있다. 구체적인 경우에서, 상기 비율은 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:250, 1:1000, 1:10000 및 이들 사이에서 도출 가능한 비율일 수 있다. 상기 조작된 TIL 및 조작된 T 세포가 동일한 제형에 있지 않은 경우, 이들은 동시에 개체에게 투여될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 이들이 동시에 개체에게 투여되는지 여부에 관계 없이, 이들은 동일한 투여 경로에 의해 전달될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 구체적인 경우에서, 상기 조작된 TIL 및 조작된 T 세포는 동일한 제형에 있는 것을 포함하여 정맥내로 투여된다. 이들이 별개로 투여되는 경우, 임의의 순서일 수 있다. 개별 투여의 경우, 상기 투여 사이의 기간은 임의의 적합한 기간, 예를 들어, 1~60초 이내, 1~60분 이내, 1~7일 이내, 1~4주 이내, 1~12 개월 이내 또는 그 이상 및 이들 사이에서 유도 가능한 임의의 기간일 수 있다.
조작된 TIL 및 조작된 T 세포 모두가 개체에게 투여되는 일부 실시 형태에서, 이들의 집합적 영향은 개체에서 암의 치료와 관련하여 상가적이거나 상승적일 수 있다.
IV. 약제학적 조성물
본 개시 내용의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 중에 용해되거나 분산된 TGFBR2 및/또는 TIGIT 및/또는 CD7 및/또는 PD-1 및/또는 TIM-3 (및/또는 동일한 생체 외에서 또는 생체 내에서 생성하기 위한 시약)의 발현이 변형된 조작된 TIL 및 조작된 T 세포를 유효량으로 포함한다. "약제학적 또는 약리학적으로 허용되는"이라는 문구는, 적절한 경우, 예를 들어, 사람과 같은 동물에게 투여될 때 불리한 알러지성 또는 기타 유해 반응을 생성하지 않는 분자 엔터티 (entity) 및 조성물을 지칭한다. 조작된 TIL 및/또는 조작된 T 세포 (및/또는 동일한 생체 외에서 또는 생체 내에서 생성하기 위한 시약)를 포함하는 약제학적 조성물의 제조는 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed. Lippincott Williams and Wilkins, 2005]에 예시되는 바와 같이 본 개시 내용에 비추어 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지될 것이다. 또한, 동물 (예를 들어, 사람) 투여의 경우, 제제는 FDA 생물학적 표준 사무국 (FDA Office of Biological Standards)에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 하는 것으로 이해될 것이다.
본 출원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"로는, 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 바와 같이 (예를 들어, 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329] 참조), 임의의 모든 용매, 분산매, 코팅, 계면 활성제, 산화 방지제, 보존제 (예를 들어, 항균제, 항진균제), 등장화제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미료, 향미제, 염료, 기타 물질 및 이들의 조합이 포함된다. 지금까지 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 상용 가능하지 않는 것을 제외하고는, 약제학적 조성물 중 이의 용도가 고려된다.
상기 약제학적 조성물은 담체가 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되는지 여부 및 주사와 같은 투여 경로를 위해 멸균될 필요가 있는지 여부에 따라 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 본 출원에서 개시된 조성물은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이 정맥내로, 진피내로, 경피로, 척수강내로, 동맥내로, 복강내로, 비강내로, 질내로, 직장내로, 국소로, 근육내로, 피하로, 점막으로, 경구로, 국소로, 국부로, 흡입으로 (예를 들어, 에어로졸 흡입), 주사로, 주입으로, 연속 주입으로, 국부화된 관류 수영 표적 세포에 의해 직접적으로, 카테터를 통해, 세척을 통해, 크림으로, 지질 조성물 (예를 들어, 리포좀)로 또는 다른 방법으로, 상기의 것들의 임의의 조합으로 투여될 수 있다.
상기 조작된 TIL 및/또는 조작된 T 세포 (및/또는 동일한 생체 외에서 또는 생체 내에서 생성하기 위한 시약)는 유리 염기, 중성, 양성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염으로는 산 부가 염, 예를 들어, 단백질성 조성물의 유리 아미노기로 형성되는 것들 또는, 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산과 같은 유기산으로 형성되는 것들이 포함된다. 유리 카복실기로 형성된 염은 또한, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화 제2철과 같은 무기 염기; 또는, 예를 들어, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 제형화시, 용액은 치료학적으로 유효한 양으로 투여 제형과 상용 가능한 방식으로 투여될 것이다. 상기 제형은 비경구 투여용으로 제형화된 것, 예를 들어, 폐로의 전달을 위한 주사 용액 또는 에어로졸, 또는 영양 (alimentary) 투여용으로 제형화된 것, 예를 들어, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 투여 형태로 용이하게 투여된다.
또한, 본 개시 내용에 따르면, 투여에 적합한 본 개시 내용의 조성물은 불활성 희석제의 존재 또는 부재하에 약제학적으로 허용되는 담체 중에 제공될 수 있다. 담체는 동화 가능해야 하며, 액체, 반고체, 즉, 페이스트 또는 고체 담체를 포함한다. 지금까지 임의의 통상적인 매질, 제제, 희석제 또는 담체가 수여자 또는 이에 함유된 조성물의 치료학적 효과에 유해한 것을 제외하고는, 본 발명의 방법을 실시하는데 사용하기 위한 투여 가능한 조성물 중에 사용하는 것이 적절하다. 담체 또는 희석제의 예로는 지방, 오일, 물, 식염수, 지질, 리포좀, 수지, 결합제, 충전제 등, 또는 이들의 조합이 포함된다. 상기 조성물은 또한 하나 이상의 성분의 산화를 지연시키기 위해 다양한 산화 방지제를 포함할 수 있다. 추가적으로, 미생물 작용의 방지는 보존제, 예를 들어, 파라벤 (예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 이들의 조합을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 항균제 및 항진균제에 의해 이루어질 수 있다.
본 개시 내용에 따르면, 상기 조성물은 임의의 편리하고 실제적인 방식, 즉, 용액화, 현탁화, 유화, 혼합, 캡슐화, 흡수 등으로 담체와 조합된다. 이러한 절차는 당해 분야의 통상의 기술자들에게 일상적이다.
본 개시 내용의 구체적인 실시 형태에서, 상기 조성물은 반고체 또는 고체 담체와 조합되거나 철저하게 혼합된다. 상기 혼합은 분쇄와 같은 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 안정화제가 또한 치료학적 활성의 손실, 즉, 위에서의 변성으로부터 상기 조성물을 보호하기 위해 혼합 공정에서 첨가될 수 있다. 상기 조성물에 사용하기 위한 안정화제의 예로는 완충제, 아미노산, 예를 들어, 글리신 및 라이신, 탄수화물, 예를 들어, 덱스트로오스, 만노오스, 갈락토오스, 프럭토오스, 락토오스, 수크로오스, 말토오스, 소르비톨, 만니톨을 포함한다.
추가의 실시 형태에서, 본 개시 내용은 상기 조작된 TIL 및/또는 조작된 T 세포 (및/또는 동일한 생체 외에서 또는 생체 내에서 생성하기 위한 시약), 및 임의로 수성 용매를 포함하는 약제학적 지질 비히클 조성물의 용도에 관한 것일 수 있다. 본 출원에서 사용되는 "지질"이라는 용어는 특징적으로 물에 불용성이고 유기 용매로 추출 가능한 임의의 광범위한 물질을 포함하는 것으로 정의될 것이다. 이러한 광범위한 클래스의 화합물은 당해 분야의 통상의 기술자들에게 널리 공지되어 있으며, "지질"이라는 용어는 본 출원에서 사용되는 바와 같이 임의의 특정 구조에 한정되는 것이 아니다. 그 예로는 장쇄 지방족 탄화수소 및 이의 유도체를 함유하는 화합물이 포함된다. 지질은 자연 발생적이거나 합성 (즉, 사람에 의해 설계 또는 생산됨)될 수 있다. 그러나, 지질은 일반적으로 생물학적 물질이다. 생물학적 지질은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 중성 지방, 인지질, 포스포글리세라이드, 스테로이드, 테르펜, 라이소지질, 글리코스핑고지질, 당지질, 설파티드, 에테르 및 에스테르 결합된 지방산 및 중합성 지질을 갖는 지질, 및 이들의 조합을 포함한다. 물론, 지질로서 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 본 출원에서 구체적으로 기재된 것들 이외의 화합물도 또한 본 발명의 조성물 및 방법에 포함된다.
당해 분야의 통상의 기술자는 지질 비히클 중에 조성물을 분산시키기 위해 사용될 수 있는 기술의 범위에 익숙할 것이다. 예를 들어, 상기 조작된 TIL 및/또는 조작된 T 세포 (및/또는 생체 외에서 또는 생체 내에서 동일한 생성시키기 위한 시약)는 지질을 함유하는 용액 중에 분산되거나, 지질과 함께 용해되거나, 지질로 유화되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 결합되거나, 지질과 공유적으로 결합되거나, 지질 중에 현탁액으로서 함유되거나, 미셀 또는 리포좀에 함유되거나 또는 이와 복합체 형성되거나, 달리 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지된 임의의 수단에 의해 지질 또는 지질 구조와 결합될 수 있다. 상기 분산은 리포좀의 형성을 초래할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.
동물 환자에게 투여되는 본 개시 내용의 조성물의 실제 투약량은 물리학적 및 생리학적 인자들, 예를 들어, 체중, 병태의 중증도, 치료되는 질환의 유형, 이전 또는 동시의 치료학적 개입, 환자의 특발증 및 투여 경로에 의해 결정될 수 있다. 투약량 및 투여 경로에 따라, 바람직한 투약량 및/또는 유효량의 투여의 수는 대상체의 반응에 따라 달라질 수 있다. 투여 담당 진료 의사는 임의의 경우에서 조성물 중 활성 성분(들)의 농도 및 개별 대상체에 대한 적절한 용량(들)을 결정할 것이다.
특정 실시 형태에서, 약제학적 조성물은, 예를 들어, 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 상기 활성 화합물은 단위의 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는, 예를 들어, 약 25% 내지 약 60%, 및 본 출원에서 유도 가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 당연히, 각각의 치료학적으로 유용한 조성물 중 활성 화합물(들)의 양은 적합한 투약량이 화합물의 임의의 소정의 단위 용량에서 수득되는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체 이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 유통 기한 뿐만 아니라 다른 약리학적 고려사항과 같은 요인들은 이러한 약제학적 제형을 제조하는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 고려될 것이며, 이와 같이, 다양한 투약량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 8~150 x109개 세포의 용량을 이용할 수 있다. 다른 비제한적인 예에서, 용량은 또한 투여 당 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중으로부터 약 1000 mg/kg/체중 또는 그 이상까지 및 본 출원에서 유도 가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본 출원에서 열거된 수치로부터 유도 가능한 범위의 비제한적인 예에서, 상기에서 기재된 수치에 기초하여, 약 5 mg/kg/체중 내지 약 100 mg/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중 등의 범위가 투여될 수 있다.
A. 영양 조성물 및 제형
본 개시 내용의 일부 실시 형태에서, 상기 조작된 TIL 및/또는 조작된 T 세포 (및/또는 동일한 생체 외에서 또는 생체 내에서 생성하기 위한 시약)는 소화 경로 (alimentary route)를 통해 투여되도록 제형화된다. 소화 경로는 조성물이 소화관과 직접 접촉하는 모든 가능한 투여 경로를 포함한다. 구체적으로, 본 출원에서 개시된 약제학적 조성물은 경구로, 협측으로, 직장으로 또는 설하로 투여될 수 있다. 이와 같이, 이러한 조성물은 불활성 희석제 또는 동화 가능한 식용 담체와 함께 제형화될 수 있거나, 경질 또는 연질 셸 젤라틴 캡슐 중에 포함될 수 있거나, 정제로 압축될 수 있거나, 다이어트 식품에 직접 혼입될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 상기 활성 화합물은 부형제와 혼입될 수 있고, 섭취 가능한 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다 (문헌 [Mathiowitz et al., 1997]; [Hwang et al., 1998], 미국 특허 US 5,641,515, US 5,580,579 및 US 5,792,451, 각각 전문이 본 출원에 참조로 포함됨). 상기 정제, 트로키, 환제, 캡슐 등은 또한 다음을 함유할 수 있다: 결합제, 예를 들어, 트라가칸트 검, 아카시아, 옥수수 전분, 젤라틴 또는 이들의 조합; 부형제, 예를 들어, 이칼슘 포스페이트, 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카보네이트 또는 이들의 조합; 붕해제, 예를 들어, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 또는 이들의 조합; 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트; 감미료, 예를 들어, 수크로오스, 락토오스, 사카린 또는 이들의 조합; 향미제, 예를 들어, 페퍼민트, 윈터그린 오일, 체리 향료, 오렌지 향료 등. 투여 단위 형태가 캡슐일 때, 이는 상기 유형의 물질에 추가하여 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 기타 물질이 코팅으로서 존재하거나 투여 단위의 물리적 형태를 달리 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제 또는 캡슐은 셸락, 당 또는 둘 다로 코팅될 수 있다. 상기 투여 형태가 캡슐일 때, 이는 상기 유형의 물질에 추가하여 액체 담체와 같은 담체를 함유할 수 있다. 젤라틴 캡슐, 정제 또는 환제는 장용 코팅될 수 있다. 장용 코팅은 pH가 산성인 위 또는 위장관에서 조성물의 변성을 방지한다. 예를 들어, 미국 특허 US 5,629,001을 참조한다. 소장에 도달하면, 내부의 염기성 pH는 코팅을 용해시키고 조성물이 방출되어 특수 세포, 예를 들어, 상피 장 세포 및 피터 패치 (Peyer's patch) M 세포에 의해 흡수되도록 한다. 엘릭시르 시럽은 감미제로서 활성 화합물 수크로오스, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤, 체리 또는 오렌지 향과 같은 향료 및 염료를 함유할 수 있다. 물론, 임의의 투여 단위 형태를 제조하는데 사용되는 임의의 물질은 사용량에서 약제학적으로 순수하고 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 상기 활성 화합물은 지효성 제제 및 제형 내로 혼입될 수 있다.
경구 투여의 경우, 본 개시 내용의 조성물은 대안으로 구강 세정제, 치약, 협측 정제, 경구 스프레이 또는 설하 경구 투여 제형의 형태로 하나 이상의 부형제와 혼입될 수 있다. 예를 들어, 구강 세정제는 붕산 나트륨 용액 (Dobell's Solution)과 같은 적절한 용매 중에 활성 성분을 필요한 양으로 혼입하여 제조될 수 있다. 대안으로, 상기 활성 성분은 붕산 나트륨, 글리세린 및 칼륨 바이카보네이트을 함유하는 것과 같은 경구 용액 내에 혼입되거나, 치약 중에 분산되거나, 물, 결합제, 연마제, 향미제, 발포제 및 습윤제를 포함할 수 있는 조성물에 치료학적 유효량으로 첨가될 수 있다. 대안으로, 상기 조성물은 혀 아래에 놓이거나 그렇지 않으면 구강 내에서 용해될 수 있는 정제 또는 용액 형태로 제조될 수 있다.
다른 소화 투여 경로에 적합한 추가의 제형은 좌제를 포함한다. 좌제는 다양한 무게와 형상의 고형 투여 형태이며, 일반적으로 직장 내로 삽입하기 위해 약으로 사용된다. 삽입 후, 좌제는 공동 유체 중에 연화되거나 녹거나 용해된다. 일반적으로, 좌제의 경우, 통상적인 담체는, 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜, 트리글리세라이드 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 좌제는, 예를 들어, 약 0.5% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 2%의 범위의 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다.
B. 비경구 조성물 및 제형
추가의 실시 형태에서, 조성물은 비경구 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 "비경구"라는 용어는 소화관을 우회하는 경로를 포함한다. 구체적으로, 본 출원에서 개시된 약제학적 조성물은, 예를 들어, 정맥내로, 진피내로, 근육내로, 동맥내로, 경막내로, 피하로 또는 복강내로 투여될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다 (미국 특허 US 6,613,308; US 5,466,468; US 5,543,158; US 5,641,51; 및 US 5,399,363, 각각 전문이 본 출원에 참조로 구체적으로 포함됨).
유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면 활성제와 적합하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산물은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물로 및 오일로 제조될 수 있다. 통상적인 보관 및 사용 조건하에, 이러한 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유한다. 주사용으로 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액 또는 분산물과, 멸균 주사용 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다 (미국 특허 US 5,466,468, 전문이 본 출원에 참조로 구체적으로 포함됨). 모든 경우에서, 상기 형태는 멸균되어야 하며, 용이한 주사 가능성이 존재하는 정도로 유동성이 있어야 한다. 상기 조성물은 제조 및 저장 조건하에 안정해야 하며, 미생물, 예를 들어, 세균 및 진균의 오염 작용에 대해서 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (즉, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적절한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산물의 경우에서 요구된 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면 활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 및 티메로살 등에 의하여 달성될 수 있다. 다수의 경우, 등장화제, 예를 들어, 당류 또는 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 흡수 연장은 흡수 지연제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 중에 사용하여 달성될 수 있다.
수용액 중의 비경구 투여의 경우, 예를 들어, 상기 용액은 필요한 경우 적합하게 완충되어야 하며, 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코오스와 등장성이 되어야 한다. 이러한 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시 내용에 비추어 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 1회 투약량을 등장성 NaCl 용액에 용해시키고, 피하 주입액을 첨가하거나 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다 (예를 들어, 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580] 참조). 투약량의 약간의 변화는 치료될 대상체의 병태에 따라 필연적으로 발생할 것이다. 투여 담당자는 임의의 경우에서 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다. 또한, 사람 투여의 경우, 제제는 FDA 생물학적 표준 사무국 (FDA Office of Biologics standards)에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다.
멸균 주사액은 활성 화합물을 필요에 따라 상기에서 열거된 다양한 기타 성분과 함께 적당한 용매 중에 요구되는 양으로 혼입한 후 여과 멸균하여 제조된다. 일반적으로, 분산물은 다양한 멸균 활성 성분을 기본 분산매와 상기에서 열거된 것들로부터 요구되는 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 및 이의 이전에 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다. 분말 조성물은 안정화제의 존재 또는 부재하에, 예를 들어, 물 또는 식염수와 같은 액체 담체와 조합된다.
C. 기타 약제학적 조성물 및 제형
본 발명의 다른 바람직한 실시 형태에서, 상기 활성 화합물 조작된 TIL 및/또는 조작된 T 세포 (및/또는 동일한 생체 외에서 또는 생체 내에서 생성하기 위한 시)는 다양한 기타 경로, 예를 들어, 국소 (즉, 경피) 투여, 점막 투여 (비강, 질 등) 및/또는 흡입을 통한 투여를 위해 제형화될 수 있다.
국소 투여를 위한 약제학적 조성물은 연고, 페이스트, 크림 또는 분말과 같은 의약 적용을 위해 제형화된 활성 화합물을 포함할 수 있다. 연고는 국소 적용을 위한 모든 유성, 흡착, 에멀젼 및 수용성 기반 조성물을 포함하는 반면, 크림 및 로션은 에멀젼 베이스만을 포함하는 조성물이다. 국소 투여되는 약물은 피부를 통한 활성 성분의 흡착을 용이하게 하기 위해 침투 촉진제를 함유할 수 있다. 적합한 침투 촉진제는 글리세린, 알코올, 알킬 메틸 설폭사이드, 피롤리돈 및 루아로카프람을 포함한다. 국소 도포용 조성물의 가능한 베이스는 폴리에틸렌 글리콜, 라놀린, 콜드 크림 및 바셀린 뿐만 아니라 임의의 다른 적합한 흡수, 에멀젼 또는 수용성 연고 베이스를 포함한다. 국소 제제는 또한 활성 성분을 보존하고 균질한 혼합물을 제공하기 위해 필요에 따라 유화제, 겔화제 및 항미생물 보존제를 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 경피 투여는 또한 "패치"의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 패치는 하나 이상의 활성 물질을 미리 결정된 속도로 고정 기간에 걸쳐 연속적인 방식으로 공급할 수 있다.
특정 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 점안제, 비강내 스프레이, 흡입 및/또는 기타 에어로졸 전달 비히클에 의해 전달될 수 있다. 비강 에어로졸 스프레이를 통해 폐에 조성물을 직접 전달하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 US 5,756,353 및 US 5,804,212 (각각 전문이 본 출원에 참조로 구체적으로 포함됨)에 기재되어 있다. 마찬가지로, 비강내 마이크로입자 수지 (문헌 [Takenaga et al., 1998]) 및 리소포스파티딜-글리세롤 화합물 (미국 특허 US 5,725,871, 전문이 구체적으로 본 출원에 참조로 포함됨)을 사용하는 약물의 전달은 또한 제약 분야에 널리 공지되어 있다. 마찬가지로, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지체 매트릭스 형태의 경점막 약물 전달은 미국 특허 US 5,780,045 (전문이 구체적으로 본 출원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
에어로졸이라는 용어는 액화 또는 가압 가스 추진제에 분산된 액체 입자의 미세하게 분할된 고체의 콜로이드 시스템을 지칭한다. 흡입을 위한 본 발명의 대표적인 에어로졸은 액체 추진제 또는 액체 추진제와 적절한 용매의 혼합물 중의 활성 성분의 현탁액으로 이루어질 것이다. 적합한 추진제로는 탄화수소 및 탄화수소 에테르가 포함된다. 적합한 용기는 추진제의 압력 요구 사항에 따라 달라질 것이다. 에어로졸 투여는 대상체의 연령, 체중, 증상의 중증도 및 반응에 따라 달라질 것이다.
V. 조합 요법
특정 실시 형태에서, 본 실시 형태의 조성물 및 방법은 조작된 TIL 및/또는 조작된 T 세포를 포함하는 조성물에 부가적인 암 요법을 포함한다. 상기 추가의 요법은 방사선 요법, 수술 (예를 들어, 종양 절제술 및 유방 절제술), 화학 요법, 유전자 요법, DNA 요법, 바이러스 요법, RNA 요법, 면역 요법 (본 출원의 것 이외), 골수 이식, 나노 요법, 단클론 항체 요법, 호르몬 요법 또는 상기한 것들의 조합일 수 있다. 상기 추가의 요법은 아쥬반트 (adjuvant) 또는 네오아쥬반트 (neoadjuvant) 요법의 형태일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 추가의 요법은 하나 이상의 소분자 효소 억제제 및/또는 하나 이상의 항전이제의 투여이다. 일부 실시 형태에서, 상기 추가의 요법은 부작용 제한제 (side-effect limiting agent) (예를 들어, 치료의 부작용의 발생 및/또는 중증도를 감소시키는 제제, 예를 들어, 항구역제 등)의 투여이다. 일부 실시 형태에서, 상기 추가의 요법은 방사선 요법이다. 일부 실시 형태에서, 상기 추가의 요법은 수술이다. 일부 실시 형태에서, 상기 추가의 요법은 방사선 요법과 수술의 조합이다. 일부 실시 형태에서, 상기 추가의 요법은 감마선 조사이다. 일부 실시 형태에서, 상기 추가의 요법은 PBK/AKT/mTOR 경로를 표적화하는 요법, HSP90 억제제, 튜불린 억제제, 아폽토시스 억제제 및/또는 화학 예방제(들)이다. 상기 추가의 요법은 당해 분야에 공지된 화학 요법제 중 하나 이상일 수 있다.
면역 세포 요법 (본 개시 내용의 TIL 요법 및/또는 조작된 T 세포 요법에 추가함)은 면역 체크포인트 요법과 같은 추가의 암 요법에 대하여 이전에, 동안에, 이후에 또는 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 동시 내지 수분, 수일, 수주의 범위의 간격으로 이루어질 수 있다. 면역 세포 요법이 본 개시 내용의 조성물(들)과 완전히 별개로 환자에게 제공되는 실시 형태에서, 2개의 화합물이 여전히 환자에게 유리하게 조합된 효과를 발휘할 수 있도록, 상당한 기간이 각각의 전달 시간 사이에 경과하지 않았다는 것을 일반적으로 보장할 것이다. 이러한 경우, 환자에게 면역 치료 요법 및 상기 개시된 조성물을 서로 약 12 내지 24 또는 72시간 이내에, 보다 구체적으로는 서로 약 6~12시간 이내에 제공할 수 있는 것으로 고려된다. 일부 상황에서, 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)가 각각의 투여 사이에 경과하는 경우, 치료 기간을 유의미하게 연장하는 것이 바람직할 수 있다.
환자에 대한 본 실시 형태의 임의의 화합물 또는 세포 요법의 투여는, 존재하는 경우, 제제의 독성을 고려하여 이러한 화합물의 투여에 대한 일반적인 프로토콜을 따를 것이다. 따라서, 일부 실시 형태에서는 조합 요법에 기인할 수 있는 독성을 모니터링하는 단계가 존재한다.
A. 화학 요법
매우 다양한 화학 요법제가 본 실시 형태에 따라 사용될 수 있다. "화학 요법"이라는 용어는 암을 치료하기 위한 약물의 사용을 지칭한다. "화학 요법제"는 암 치료에 투여되는 화합물 또는 조성물을 함축하기 위해 사용된다. 이러한 제제 또는 약물은 세포 내에서의 이들의 활성 방식, 예를 들어, 이들이 세포 주기에 영향을 미치는지 여부 및 단계에 의해 분류된다. 대안으로, 제제는 DNA를 직접 가교하는 능력, DNA에 삽입되는 능력, 또는 핵산 합성에 영향을 미침으로써 염색체 및 유사 분열을 유도하는 능력에 기초하여 특성화될 수 있다.
화학 요법제의 예로는 알킬화제, 예를 들어, 티오테파 및 사이클로포스파마이드; 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어, 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올멜라민을 비롯한 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 바이젤레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히, 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드 및 우라실 머스타드; 나이트로스우레아, 예를 들어, 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님무스틴; 항생제, 예를 들어, 에네다인 항생제 (예를 들어, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마lI 및 칼리키아마이신 오메가I1); 다이네마이신 A를 포함하는 다이네마이신; 비스포스포네이트, 예를 들어, 클로드로네이트; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네다인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라르니신 (authrarnycin), 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라르니신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴 및 조루비신; 항-대사 물질, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 프테로프테린 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈 및 플록스우리딘; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄 및 테스토락톤; 항-부신, 예를 들어, 미토탄 및 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예를 들어, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 나이트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK다당류 복합체; 라족산; 라이족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드 ("Ara-C"); 사이클로포스파마이드; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 백금 배위 착물, 예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드 (VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포사이드; 데다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (예를 들어, CPT-11); 토포아이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어, 레티노산; 카페시타빈; 카보플라틴, 프로카바진, 플리코마이신, 겜시타빈, 나벨빈, 파르네실-단백질 트랜스퍼라아제 억제제, 트랜스플라티눔, 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
B. 방사선 요법
DNA 손상을 초래하고 광범위하게 사용되는 다른 인자는 γ선, X선으로서 흔히 공지된 것 및/또는 방사선 동위 원소의 종양 세포로의 유도된 전달을 포함한다. 다른 형태의 DNA 손상 인자, 예를 들어, 마이크로파, 양성자 빔 조사 (미국 특허 US 5,760,395 및 US 4,870,287) 및 UV 조사도 또한 고려된다. 이러한 인자 모두는 DNA의 전구체, DNA의 복제 및 복구, 및 염색체의 조립 및 유지에 대한 광범위한 의미의 손상에 영향을 미칠 수 있다. X선에 대한 선량 범위는 장기간 동안 (3 내지 4주) 동안의 50 내지 200 뢴트겐의 1일 선량으로부터 2000 내지 6000 뢴트겐의 1회 선량까지의 범위이다. 방사선 동위 원소의 선량 범위는 매우 다양하며, 동위 원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 유형, 및 신생 세포에 의한 흡수에 좌우된다.
C. 면역 요법
통상의 기술자는 추가의 면역 요법 (개시된 조작된 TIL 세포 요법 및/또는 조작된 T 세포 요법 이외)이 본 실시 형태의 방법과 조합으로 또는 함께 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 암 치료의 맥락에서, 면역 요법제는 일반적으로 암 세포를 표적화하고 파괴하기 위한 면역 이펙터 세포 및 분자의 사용에 의존한다. 리툭시맙 (리툭산®)은 이러한 예이다. 상기 면역 이펙터는, 예를 들어, 종양 세포의 표면 상의 일부 마커에 대해 특이적인 항체이다. 상기 항체 단독은 요법의 이펙터의 역할을 할 수 있거나, 세포 사멸에 실제로 영향을 미치기 위해 다른 세포를 동원할 수 있다. 상기 항체는 또한 약물 또는 독소 (화학 요법제, 방사성 핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 컨쥬게이션될 수 있으며, 표적화제의 역할을 할 수 있다. 대안으로, 상기 이펙터는 종양 세포 표적과 직접적으로 또는 간접적으로 상호 작용하는 표면 분자를 운반하는 림프구일 수 있다. 다양한 이펙터 세포는 TGFBR2 및/또는 TIGIT의 녹다운 또는 녹아웃을 갖는 것 이외에 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.
항체-약물 컨쥬게이트는 암 요법의 발달에 대한 돌파구 접근법으로서 나타났다. 항체-약물 컨쥬게이트 (antibody-drug conjugate: ADC)는 세포 사멸 약물과 공유적으로 연결되는 단클론 항체 (MAb)를 포함한다. 이러한 접근법은 항원 표적에 대한 MAb의 높은 특이성을 매우 강력한 세포독성 약물과 조합하여, 페이로드 (약물)를 농축된 수준의 항원을 갖는 종양 세포에 전달하는 "무장한 (armed)" MAb를 생성한다. 약물의 표적화된 전달은 또한 정상 조직에서의 노출을 최소화하여 독성을 감소시키고 치료 지수를 개선시킨다. 2개의 ADC 약물, 즉, 2011년의 ADCETRIS® (브렌툭시맙 베도틴) 및 2013년의 KADCYLA® (트라스투주맙 엠탄신 또는 T-DM1)의 FDA 승인은 본 접근법을 입증하였다. 현재 30개 초과의 ADC 약물 후보가 암 치료에 대한 임상 시험의 다양한 단계에 있다 (문헌 [Leal et al., 2014]). 항체 조작 및 링커-페이로드 최적화가 점점 더 성숙해짐에 따라, 신규한 ADC의 발견 및 개발은 이러한 접근법 및 표적화 MAb의 생성에 적합한 신규한 표적의 확인 및 검증에 점점 더 의존한다. ADC 표적에 대한 2개의 기준은 종양 세포에서의 발현 및 강력한 내재화의 상향 조절된/높은 수준이다.
면역 요법의 하나의 양태에서, 종양 세포는 표적화를 잘 받아 들이는 일부 마커, 즉, 다른 세포의 대부분에 존재하지 않는 일부 마커를 보유해야 한다. 다수의 종양 마커가 존재하며, 이들 중 임의의 것은 본 실시 형태의 맥락에서 표적화에 적합할 수 있다. 흔한 종양 마커로는 CD20, 암배아 항원, 타이로시나아제 (p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erb B 및 p155가 포함된다. 면역 요법의 대안적인 양태는 면역 자극 효과와 항암 효과를 조합하는 것이다. 다음을 포함하는 면역 자극 분자도 또한 존재한다: 사이토카인, 예를 들어, IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN, 케모카인, 예를 들어, MIP-1, MCP-1, IL-8, 및 성장 인자, 예를 들어, FLT3 리간드.
현재 연구 중이거나 사용 중인 면역 요법의 예로는 면역 아쥬반트, 예를 들어, 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis), 플라소모디움 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 디니트로클로로벤젠 및 방향족 화합물 (미국 특허 US 5,801,005 및 US 5,739,169; 문헌 [Hui and Hashimoto, 1998], [Christodoulides et al., 1998]); 사이토카인 요법, 예를 들어, 임의의 종류의 터페론, IL-1, GM-CSF 및 TNF (문헌 [Bukowski et al., 1998], [Davidson et al., 1998], [Hellstrand et al., 1998]); 유전자 요법, 예를 들어, TNF, IL-1, IL-2 및 p53 (문헌 [Qin et al., 1998], [Austin-Ward and Villaseca, 1998], 미국 특허 US 5,830,880 및 US 5,846,945); 및 단클론 항체, 예를 들어, 항-CD20, 항-강글리오사이드 GM2 및 항-p185 (문헌 [Hollander, 2012], [Hanibuchi et al., 1998], 미국 특허 US 5,824,311)가 있다. 1종 이상의 항암 요법이 본 출원에서 기재된 항체 요법과 함께 이용될 수 있는 것으로 고려된다.
일부 실시 형태에서, 상기 면역 요법은 면역 체크포인트 억제제이다. 면역 체크포인트는 신호 (예를 들어, 공동 자극 분자)를 높이거나 신호를 낮춘다. 면역 체크포인트 차단에 의해 표적화될 수 있는 억제 면역 체크포인트로는 아데노신 A2A 수용체 (adenosine A2A receptor: A2AR), B7-H3 (CD276으로도 또한 공지됨), B 및 T 림프구 감쇠자 (B and T lymphocyte attenuator: BTLA), 세포독성 T 림프구 관련 단백질 4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4: CTLA-4, CD152로도 또한 공지됨), 인돌아민 2,3-디옥시게나아제 (indoleamine 2,3-dioxygenase: IDO), 살해 세포 면역글로불린 (killer-cell immunoglobulin: KIR), 림프구 활성화 유전자-3 (lymphocyte activation gene-3: LAG3), 프로그램된 사멸 1 (programmed death 1: PD-1), T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3 (T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3: TIM-3) 및 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제 인자 (V-domain Ig suppressor of T cell activation: VISTA)가 포함된다. 특히, 상기 면역 체크포인트 억제제는 PD-1 축 및/또는 CTLA-4를 표적화한다.
D. 수술
암을 갖는 사람 중 대략 60%는 예방, 진단 또는 병기 결정 (staging), 근치 및 완화 수술을 비롯한 일부 유형의 수술을 받을 것이다. 근치 수술은, 모두 또는 일부의 암성 조직이 물리적으로 제거되고, 절개되고/되거나 파괴되는 절제를 포함하며, 본 발명의 실시 형태의 치료, 화학 요법, 방사선 요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역 요법 및/또는 대체 요법과 같은 다른 요법과 함께 사용될 수 있다. 종양 절제는 적어도 일부의 종양의 물리적 제거를 지칭한다. 종양 절제에 추가하여, 수술 치료로는 레이저 수술, 냉동 수술, 전기 수술 및 현미경 제어 수술 (모스 수술)이 포함된다.
일부 또는 모든 암성 세포, 조직 또는 종양의 절개시, 공동이 체내에 형성될 수 있다. 치료는 관류, 직접 주사, 또는 추가의 항암 요법에 의한 부위의 국소 적용에 의해 달성될 수 있다. 이러한 치료는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 마다, 또는 1, 2, 3, 4 및 5주 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 마다 반복될 수 있다. 이러한 치료는 또한 투약량을 다양하게 할 수 있다.
E. 기타 제제
기타 제제가 치료제의 치료학적 효능을 개선하기 위해 본 발명의 실시 형태의 특정 양태와 조합하여 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 이러한 추가의 제제로는 세포 표면 수용체와 GAP 결합의 상향 조절에 영향을 미치는 제제, 세포 증식 억제 및 분화 제제, 세포 접착 억제제, 아폽토시스 유발제에 대한 과다 증식성 세포의 감수성을 증가시키는 제제, 또는 다른 생물학적 제제가 포함된다. GAP 결합 수의 증가에 의한 세포간 신호 전달의 증가는 인접하는 과다 증식성 세포 집단에 대한 항-과다 증식성 효과를 증가시킬 것이다. 다른 실시 형태에서, 세포 증식 억제 또는 분화 제제는 치료제의 항-과다 증식성 효능을 개선하기 위해 본 발명의 실시 형태의 특정 양태와 조합하여 사용될 수 있다. 세포 접착 억제제는 본 발명의 실시 형태의 효능을 개선하는 것으로 고려된다. 세포 접착 억제제의 예로는 초점 접착 키나아제 (focal adhesion kinase: FAK) 억제제 및 로바스타틴이 있다. 아폽토시스에 대한 과다 증식성 세포의 감수성을 증가시키는 기타 제제, 예를 들어, 항체 c225가 치료 효능을 개선하기 위해 본 발명의 실시 형태의 특정 양태와 조합하여 사용될 수 있는 것으로 추가로 고려된다.
VI. 본 개시 내용의 키트
본 명세서에 기재된 임의의 조성물은 키트에 포함될 수 있다. 비제한적인 예에서, TIL 및/또는 T 세포 (및/또는 이를 생성하기 위한 시약) 및 이들은 본 개시 내용의 키트의 적합한 용기 수단에 포함될 수 있다.
조작된 TIL 및/또는 조작된 T 세포 및/또는 이를 생성하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하는 제조 물품 또는 키트가 본 출원에서 제공된다. 상기 TIL 및/또는 T 세포는 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있으며, 구체적인 실시 형태에서, 상기 TIL 및/또는 T 세포는 본 출원에 포함된 방법에 의해 생성되었다. 구체적인 실시 형태에서, 상기 TIL 및/또는 T 세포는 이미 유전자 편집되었으며, 예를 들어, 하나 이상의 이종 항원 수용체를 발현하기 위해 추가로 변형될 수 있도록 상기 키트에 제공될 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 상기 TIL 및/또는 T 세포는 하나 이상의 이종 항원 수용체를 발현하도록 변형되었으며, 예를 들어, 유전자 편집되도록 추가로 변형될 수 있도록 상기 키트에 제공될 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 상기 TIL 및/또는 T 세포를 생성하기 위한 하나 이상의 시약, 예를 들어, 특정 유전자를 표적화하는 시약, 이종 항원 수용체 (또는 상기 이종 항원 수용체를 생성하기 위한 하나 이상의 시약) 또는 이들의 조합을 포함하는 시약이 상기 키트에 제공된다. 일반적인 실시 형태에서, 상기 시약은 DNA 또는 RNA, 단백질, 배지, 완충액, 염, 보조 인자 등을 포함하는 핵산을 포함할 수 있다. 구체적인 경우에서, 상기 키트는 목적하는 특정 유전자를 표적화하기 위한 하나 이상의 CRISPR 관련 시약을 포함한다.
키트의 구성성분은 수성 배지 중에 또는 동결건조된 형태로 포장될 수 있다. 키트의 용기 수단으로는 일반적으로 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기, 또는 하나 이상의 구성성분이 배치될 수 있는 다른 용기 수단, 바람직하게는 적절하게 분취될 수 있는 다른 용기 수단 중 적어도 하나가 포함된다. 키트 내에 1개 초과의 구성성분이 존재하는 경우, 키트는 일반적으로 추가의 구성성분이 별도로 배치될 수 있는 제2, 제3 또는 다른 추가의 용기들을 포함할 수 있다. 그러나, 성분들을 다양하게 조합하여 하나의 바이알에 포함시킬 수도 있다. 본 개시 내용의 키트는 또한 전형적으로 상업적 판매를 위해 긴밀하게 밀폐되게 조작된 TIL 및/또는 조작된 T 세포 (및/또는 이를 생성하기 위한 시약)를 포함하기 위한 수단 및 임의의 기타 시약 용기를 포함할 것이다. 이러한 용기들로는 원하는 바이알들을 보존하는 사출 성형 또는 취입 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
상기 키트의 구성 요소가 하나 및/또는 그 이상의 액체 용액으로 제공될 때, 상기 액체 용액은 수용액이며, 멸균 수용액이 특히 고려된다. 상기 조성물은 또한 주사 가능한 조성물로 제형화될 수 있다. 이러한 경우, 용기 수단은 그 자체가 주사기, 피펫 및/또는 이와 유사한 기타 장치일 수 있으며, 이로 인해, 상기 제형을 신체의 감염 부위에 적용하고/하거나, 동물에게 주사하고/하거나, 심지어 상기 키트의 다른 구성 요소에 적용하고/하거나 이와 혼합할 수 있다.
그러나, 키트의 구성성분들은 건조 분말로 제공될 수도 있다. 시약 및/또는 구성성분들이 건조 분말로 제공되는 경우, 분말은 적절한 용매를 첨가하여 재구성될 수 있다. 용매는 또한 또 다른 용기 수단에 제공될 수 있는 것으로 고려된다.
용기의 수 및/또는 유형에 관계 없이, 본 개시 내용의 키트는 또한 동물의 체내에 최종 조성물의 주사/투여 및/또는 배치를 보조하기 위한 기구를 포함할 수 있고/있거나 이와 함께 포장될 수 있다. 이러한 기구는 주사기, 피펫, 집게 및/또는 이러한 의학적으로 승인된 전달 비히클일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 시약 또는 기구 또는 용기는 생체외 사용을 위한 키트에 포함된다.
실시예
하기 실시예들은 본 발명의 바람직한 실시 형태를 입증하기 위해 포함된다. 당해 분야의 통상의 기술자라면, 하기 실시예들에 개시되는 기술들이 본 발명의 실시에서 잘 기능하도록 본 발명자들에 의해 밝혀진 기술들을 나타내기 때문에, 발명의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있다는 것을 인식해야 한다. 그러나, 당해 분야의 통상의 기술자라면, 본 개시 내용을 고려하여, 수많은 변경이 개시된 구체적인 실시 형태에서 이루어질 수 있으며 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고도 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 수득할 수 있다는 것을 인식해야 한다.
실시예 1
종양 미세 환경에서 면역 억제를 극복하기 위한 종양 침윤 림프구내 유전자의 녹아웃
본 실시예는 종양 미세 환경에서 증진된 활성을 제공하기 위해 TIL에서의 유전자 편집을 입증한다. 구체적인 방법에서, 상기 TIL을 TIL에서 하나 이상의 특정 내인성 유전자에 대해 녹아웃시킨다. 상기 실시예는 특정 gRNA 종과 복합체 형성된 Cas9 단백질의 전달을 사용하여 쥐과 동물 T 세포 및 사람 TIL을 포함한 면역 세포에서 CRISPR 유전자 편집을 효율적으로 수행할 수 있다는 입증을 제공한다. 이러한 접근법은 TGFBR2 및/또는 TIGIT 및/또는 CD7의 발현이 감소되거나 제거된 TIL을 생성하는데 사용된다. 초기 연구로서, 도 1은 하나의 예로서 전기 천공 기반 형질 감염을 사용하는 유전자 편집을 위해 Cas9 RNP 복합체 (Alt-R S.p. Cas9 뉴클레아제 V3, Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA - ATTOTM 550, 및 Selplg 유전자에 대해 특이적인 2개의 별개 crRNA (AA 및 AB로 명명)로 구성됨)를 T 세포 내로 효율적으로 전달하는 것을 도시한 것이며, 여기서, Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA - ATTOTM 550은 형질 감염된 세포의 형광 추적에 사용되었다. 달성된 형질 감염 효율은 이러한 기술을 사용하여 마우스 CD8+ T 세포에서 >97%이었다 (즉, 세포의 >97%는 전기 천공 후 24 시간에 RNP 복합체에 대해 양성임). 상기 방법은 Selplg 유전자를 표적화하는 2개의 별개의 crRNA 종 (AA 및 AB로 명명)을 함유하는 Cas9 RNP 복합체 (도 2)의 전기 천공 기반 전달 후 5 일째에 쥐과 동물 T 세포에서 유전자의 90% 녹아웃이 있었던 모델 유전자 (셀렉틴 P 리간드; Selpg)에 적용되었다.
상기 방법은 예로서 쥐과 동물 T 세포에서 관심 대상 유전자를 녹아웃시키는데 사용되었다. 도 3은 Cas9 RNP 복합체의 전기 천공 기반 전달을 사용하여 쥐과 동물 T 세포에서 TIGIT를 녹아웃시키는 능력을 나타낸 것이다. 거기서 제공된 데이터는 RT-PCR에 의해 평가된 RNA 수준에서의 TIGIT 녹아웃을 나타낸다. 도 4에서, 본 발명자들은 TIL의 효율적인 조작을 나타냈다. TIGIT의 녹아웃은 생체외 확장된 환자 유래 TIL에서 >75%의 형질 감염 효율로 달성된다. 전기 천공에 의한 TIGIT 특이적 RNP 복합체의 전달은 76.5%의 세포 전달 효율을 초래하였다 (양성 세포 퍼센트). 마지막으로, TIGIT를 표적화하는 Cas9 RNP 복합체에 의한 이전에 확장된 TIL의 형질 감염은 주목할 만한 녹아웃을 초래한다. 대조군 경우 (형질 감염되지 않음) 및 실시예 경우 (TIGIT 특이 RNP로 형질 감염됨)에서 TIGIT에 대해 양성인 총 생 TIL의 백분율이 여기서 도시된다. 특별한 실시 형태에서, 상기에서 기재된 방법은, 예를 들어, TGF-베타 R2와 같은 TIL에서 상이한 유전자를 녹아웃시키는데 사용된다.
도 6a~6b는 생체 내에서 풀링된 shRNA 스크리닝을 통해 종양으로의 T 세포 침윤을 조절하는 유전자의 식별을 도시한 것이다. 도 6a. 실험 설계의 개략도. 활성화된 pmel T 세포를 세포 표면 상에 발현된 단백질을 인코딩하는 300개의 유전자를 표적화하는 풀링된 shRNA 라이브러리로 형질 도입하고, 세포를 방사선 조사된 B16 종양 보유 마우스로 입양 전달 (ACT)하였다. ACT 후 7일에, pmel T 세포를 B16 종양과 비장 쌍의 샘플로부터 단리하고, DNA 단리 및 서열 분석을 수행하였다. 도 6b. 밀도 플롯. 밀도 플롯의 화살표는 비장 T 세포 및 참조 (ACT 전에 획득된 샘플)와 비교하여 TIL 집단의 농축된 헤어핀을 나타낸다. 그룹 당 2~3개의 샘플에 대해 분석을 수행하였다. 대표적인 표면 T 세포 스크리닝을 도시한다.
도 7은 shRNA 바코드를 기반으로 하는 Cd7 녹다운을 통한 종양 대 비장의 T 세포 침윤의 증진을 도시한 것이다. 비장 및 종양 샘플 (각각 n=6) 모두에서 Cd7을 표적화하는 10개의 상이한 shRNA 작제물 각각에 대한 shRNA 바코드 판독의 수를 도시한다. 대부분의 작제물은 비장 샘플과 비교하는 종양 샘플에서의 농축을 나타낸다.
도 8은 개별 유전자 녹다운을 기반으로 하는 비장 대 종양에서의 Cd7 녹다운 Pmel의 농축을 도시한 것이다. Pmel T 세포를 렌티바이러스 벡터를 함유하는 Cd7 shRNA 또는 비-표적화 대조군 (non-targeting control: NTC) 벡터로 별도로 형질 도입하고, 벡터 발현된 GFP에 대해 FACS 분류하고, 종양 보유 마우스로의 ACT 전에 확장하였다. 총 종양 침윤 면역 림프구 (TIL)를 ACT 후 12일에 종양으로부터 단리하고 계수하였다. Cd7 녹다운 Pmel은 형질 도입되지 않거나 NTC 작제물 형질 도입된 Pmel T 세포와 비교하여 보다 많은 수로 발견되었는데, 이는 shRNA 스크리닝에서 발견된 효과를 확인시켜 준다.
Pmel T 세포를 렌티바이러스 벡터를 함유하는 Cd7 shRNA 또는 비-표적화 대조군 (non-targeting control: NTC) 벡터로 별도로 형질 도입하고, 벡터 발현된 mCherry에 대해 FACS 분류하고, 종양 보유 마우스로의 ACT 전에 확장하였다. ACT 전날, Cd7 shRNA 형질 도입된 Pmel T 세포는 93.9% mCherry를 발현하였으며, mCherry 및 생/사 유세포 측정 분석으로 분석될 때 95.1% 생존하였다. qRT-PCR 분석은 NTC-형질 도입된 Pmel T 세포와 비교하여 Cd7 mRNA 발현이 84% 감소된 것으로 확인하였다.
모델 표적으로서 T 세포 수용체 알파 쇄 유전자 (T cell receptor alpha chain gene: TRAC)를 사용하여 CRISPR 유전자 녹아웃을 환자 유래 TIL에서 최적화하였다 (도 9). 여러 상이한 전기 천공 펄스 파라미터 (EH100, EN138, EH115 및 EO115로 표시됨)와 2개의 상이한 양의 Cas9 투입 (5 μg 및 10 μg)에 걸쳐 알파 베타 T 세포 수용체의 강력한 (>90%) 제거를 달성하였다. 이러한 데이터는 임상적 관련 형질 감염 프로토콜을 사용하여 사람 T 세포에서 강력한 CRISPR 유전자 편집을 입증한다.
도 10은 환자 유래 TIL에서 TIGIT의 CRISPR 유전자 녹아웃의 최적화에 관한 것이다. 변형되지 않은 TIL은 TIGIT 표면 발현에 대해 94.3% 양성을 나타낸다. 다양한 가이드 RNA 서열 (TIGIT AA, AB, AC, AD 및 AE로 표시됨)로 TIGIT 녹아웃 처리된 TIL은 감소된 TIGIT 표면 발현을 나타낸다. "TIGIT AB" 및 "TIGIT AC" (예시로서만)로서 식별된 가이드 RNA 서열의 사용은 CRISPR 유전자 편집 후 TIGIT 표면 발현에 대해 양성으로 남아 있는 <2%의 세포로 가장 강력한 녹아웃 효율을 나타낸다.
도 11은 환자 유래 TIL에서 TGFBR2의 CRISPR 유전자 녹아웃의 최적화를 입증한다. TGFBR2를 표적화하는 가이드 RNA (예를 들어, TGFBR2 AA, AB, AC 및 AD로 표시된 상이한 가이드 RNA 서열)를 사용하여 TIL을 유전적으로 변형하였다. 유전적으로 변형된 TIL은 Cas9 모조물로 형질 감염된 TIL과 비교하여 CRISPR 컷사이트에서 실질적으로 더 낮은 수준의 야생형 TGFBR2 서열을 특징으로 한다. "TGFBR2 AC" 및 "TGFBR2 AD"로서 식별된 가이드 RNA에 의한 유전자 변형은 야생형 DNA의 가장 강력한 제거를 나타낸다.
TGFBR2의 CRISPR 유전자 녹아웃 처리된 TIL은 외인성 TGF-β 자극의 효과에 대해 내성이 있다 (도 12). 변형되지 않은 TIL은 외인성 TGF-β에 노출될 때 높은 수준의 인산화된 SMAD-2 및 SMAD-3을 발현한다. 대조적으로, TGFBR2를 제거하기 위해 CRISPR 유전자 편집 처리된 TIL은 TGF-β 유도된 SMAD 인산화에 상대적으로 내성이 있다. TGFBR2를 표적화하는 가이드 RNA (예를 들어, TGFBR2 AA, AB, AC 및 AD로 표시된 상이한 가이드 RNA 서열)를 사용하여 TIL을 유전적으로 변형하였다. "TGFBR2 AC" 및 "TGFBR2 AD"로 명명된 가이드 RNA로 변형된 TIL은 SMAD 인산화에 대한 가장 강력한 내성을 나타냈다. 이러한 결과는 여러 독립적인 환자 유래 TIL 계통에서 재현 가능하였다.
도면의 표 1은 사람 T 세포에서 TIGIT 및 TGFBR2를 표적화하는데 사용되는 가이드 RNA 서열의 예를 제공한다. 통합 DNA 기술 (IDT) 웹 도구를 사용하여 가이드 RNA를 설계하였다.
도 13에서, TGFBR2의 CRISPR 유전자 녹아웃 처리된 TIL은 외인성 TGF-β 자극의 효과에 대해 내성이 있다. 변형되지 않은 TIL은 3일 동안 TGF-β의 존재하에 배양될 때 감소된 수준의 여러 전염증성 사이토카인을 분비한다 (<1.0의 TGF-β:비히클 처리된 세포로부터 사이토카인 농도의 배수 변화에 의해 입증됨). 대조적으로, TGFBR2를 표적화하는 가이드 RNA (TGFBR2 AC 및 AD로 표시되는 상이한 가이드 RNA 서열)를 사용하여 유전적으로 변형된 TIL은 TGF-β의 존재 또는 부재하에 배양될 때 거의 동일한 양의 전염증성 사이토카인을 분비한다 (약 1.0의 TGF-β:비히클 배수 변화로 입증됨). 데이터는 비히클 처리된 TIL에 대한 TGF-β 처리된 (10 ng/ml) TIL의 사이토카인 농도의 배수 변화 (비)로서 표시된다. 데이터는 2명의 독립적인 공여자로부터 단리된 TIL로부터 제시된다.
도 14에서, RNP 형질 감염은 활성화된 마우스 CD8+ T 세포에서 고효율의 Cas9/CRISPR 매개성 PD-1 녹아웃을 유도한다. (도 14b) 항-CD3 및 IL-2에 의한 시험관내 활성화는 CD8 T 세포 (표적화되지 않은 대조군 RNP로 형질 감염된 대조군 세포, NTC 조건)에서 PD-1의 세포 표면 발현을 상향 조절한다. (도 14c) PD-1을 표적화하는 Cas9/gRNA RNP로 형질 감염된 T 세포, PD-1 KO 조건은 NTC 발현과 비교하여 97% 녹아웃 효율에 해당하는 PD-1 발현의 감소를 나타낸다. 형질 감염의 6일 후 유세포 측정에 의해 평가된 PD-1 단백질 발현; FMO에 기반하여 결정된 양성 발현 (도 14a).
참고 문헌
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본 개시 내용 및 이의 이점이 상세하게 설명되었지만, 첨부된 청구들에 의해 정의되는 바와 같은 본 설계의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변경, 대체 및 변형이 본 명세서에서 이루어질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 더욱이, 본 출원의 범위는 본 명세서에 기재되는 공정, 기계, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법들 및 단계들의 특정 실시 형태에 한정하려는 것은 아니다. 당해 분야의 통상의 기술자는 본 개시 내용으로부터 용이하게 인식할 것이기 때문에, 본 명세서에 기재된 상응하는 실시 형태와 동일한 결과를 실질적으로 달성하거나 동일한 기능을 실질적으로 수행하는 현재 존재하거나 나중에 개발되는 공정, 기계, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법들 또는 단계들이, 본 개시 내용에 따라 이용될 수 있다. 따라서, 첨부된 청구항들은 이러한 공정, 기계, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법들 또는 단계들을 청구 범위내에 포함시키고자 한다.
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Claims (34)

  1. 하기를 포함하는 조성물:
    (a) 조작된 종양 침윤 림프구 (tumor-infiltrating lymphocyte: TIL)로서, 여기서, 상기 TIL이 (1) 형질 전환 성장 인자-베타 수용체 2 (transforming growth factor-beta receptor: TGFBR2)의 발현 및/또는 활성의 중단; (2) T 세포-Ig 및 ITIM 도메인 (T-cell-Ig-and-ITIM-domain: TIGIT)의 발현 및/또는 활성의 중단; (3) 상기 TIL에 대해 모두 내인성인 CD7의 발현 및/또는 활성의 중단; (4) 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (programmed cell death protein 1: PD-1)의 발현의 중단; 및 (5) T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유-3 (T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3: TIM-3)의 발현의 중단 중 하나 이상을 포함하는, 조작된 종양 침윤 림프구 (TIL); 및/또는
    (b) 조작된 T 세포로서, 여기서, 상기 T 세포가 (1) 상기 TIL에 대해 내인성인 형질 전환 성장 인자-베타 수용체 2 (TGFBR2)의 발현 및/또는 활성의 중단; (2) T 세포-Ig 및 ITIM 도메인 (TIGIT)의 발현 및/또는 활성의 중단; (3) CD7의 발현 및/또는 활성의 중단; (4) PD-1의 발현의 중단; 및 (5) 상기 T 세포에 대해 모두 내인성인 TIM-3의 발현의 중단 중 하나 이상을 포함하는, 조작된 T 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 TIL이 확장된 TIL이고/이거나, 상기 T 세포가 확장된 T 세포인, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, TGFBR2, TIGIT, CD7, PD-1 및 TIM-3 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성의 중단이 핵산, 펩타이드, 단백질, 소분자 또는 이들의 조합을 포함하는, 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 핵산이 각각 TGFBR2, TIGIT, CD7, PD-1 및 TIM-3에 상응하는 siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 CRISPR에 대한 가이드 RNA를 포함하는, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL이 TGFBR2의 발현의 중단을 포함하는, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL이 TIGIT의 발현의 중단을 포함하는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL이 CD7의 발현의 중단을 포함하는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL이 PD-1의 발현의 중단을 포함하는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL이 TIM-3의 발현의 중단을 포함하는, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포가 TGFBR2의 발현의 중단을 포함하는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포가 TIGIT의 발현의 중단을 포함하는, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포가 CD7의 발현의 중단을 포함하는, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포가 PD-1의 발현의 중단을 포함하는, 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포가 TIM-3의 발현의 중단을 포함하는, 조성물.
  15. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제10항, 제11항, 제12항, 제13항 또는 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL 또는 T 세포가 하나 이상의 암 항원을 표적화하는 하나 이상의 이종 항원 수용체를 포함하는, 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 이종 항원 수용체가 T 세포 수용체, 키메라 항원 수용체, 케모카인 수용체, 키메라 사이토카인 수용체 또는 이들의 혼합물인, 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 조성물의 세포 집단.
  18. 제17항의 집단을 포함하는 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 집단이 약제학적으로 허용되는 담체 중에 있는, 조성물.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 TIL 및/또는 T 세포를,
    (a) Cas9 또는 Cas9를 인코딩하는 핵산; 및 (b), (c), (d), (e) 및 (f) 중 하나 이상;
    (b) CRISPR에 대한 하나 이상의 TGFBR2 가이드 RNA;
    (c) CRISPR에 대한 하나 이상의 TIGIT 가이드 RNA; 또는
    (d) CRISPR에 대한 하나 이상의 CD7 가이드 RNA;
    (e) CRISPR에 대한 하나 이상의 PD-1 가이드 RNA; 및
    (f) CRISPR에 대한 하나 이상의 TIM-3 가이드 RNA
    로 각각 전기 천공하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제18항에 있어서, 2개 이상의 전기 천공 단계를 포함하는 것으로 추가로 한정되며, 여기서, 제1 전기 천공 단계가 상기 TIL 및/또는 조작된 T 세포를 TGFBR2 가이드 RNA, TIGIT 가이드 RNA, CD7 가이드 RNA, PD-1 가이드 RNA 및 TIM-3 가이드 RNA 중 하나 이상에 적용되고, 제2 전기 천공 단계가 상기 TIL 및/또는 조작된 T 세포를 상기 제1 전기 천공 단계에서 사용되지 않은 TGFBR2, TIGIT, CD7, PD-1 및 TIM-3 중 하나 이상에 대한 가이드 RNA에 적용되는, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 TIL 및/또는 T 세포를 확장시키는 적어도 하나의 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 TIL 및/또는 T 세포에 대한 확장 단계가 전기 천공 단계 이전에 있는, 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 TIL 및/또는 T 세포에 대한 확장 단계가 전기 천공 단계 이후에 있는, 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포 또는 TIL을 변형시켜 하나 이상의 이종 항원 수용체를 발현시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 이종 항원 수용체가 T 세포 수용체, 키메라 항원 수용체, 케모카인 수용체, 키메라 사이토카인 수용체 또는 이들의 혼합물인, 방법
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 이종 항원 수용체가 개체의 암 세포 상의 암 항원을 표적화하도록 맞춤화되는, 방법.
  28. 치료학적 유효량의 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 조성물을 개체에게 전달하는 단계를 포함하는, 개체에서 암 세포를 사멸시키는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 암이 혈액학적 암이거나 고형 종양을 포함하는, 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 TIL 및/또는 T 세포가 상기 개체에 대해 동종 이계인, 방법.
  31. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 TIL 및/또는 T 세포가 상기 개체에 대해 자가인, 방법.
  32. 제28항, 제29항 또는 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 개체부터 암 세포를 수득하는 단계;
    (b) 상기 암 세포로부터 TIL을 확장시켜 확장된 TIL을 생성하는 단계;
    (c) 상기 확장된 TIL을, (1) 상기 TIL에 대해 내인성인 TGFBR2의 발현 또는 활성이 중단되고/되거나; (2) 상기 TIL에 대해 내인성인 TIGIT의 발현 또는 활성이 중단되고/되거나; (3) 상기 TIL에 대해 내인성인 CD7의 발현 또는 활성이 중단되고/되거나; (4) 상기 TIL에 대해 내인성인 PD-1의 발현 또는 활성이 중단되고/되거나; (5) 상기 TIL에 대해 내인성인 TIM-3의 발현 또는 활성이 중단되도록 조작하는 단계; 및
    (d) 유효량의 상기 조작된 세포를 상기 개체에게 투여하는 단계
    로서 추가로 한정되는, 방법.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 추가의 암 요법을 전달받는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 추가의 암 요법이 수술, 방사선 치료, 화학 요법, 호르몬 요법, 면역 요법 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
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