KR20220117859A

KR20220117859A - 신규 세라마이드, 그의 제조방법 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20220117859A
Application number: KR1020220086946A
Authority: KR
Inventors: 박장서; 이은옥; 김진욱
Original assignee: 주식회사 엘씨에스바이오텍
Priority date: 2021-02-17
Filing date: 2022-07-14
Publication date: 2022-08-24
Also published as: KR102621498B1; EP4296259A1; WO2022177192A1; KR102423002B1

Abstract

본 명세서에는 신규한 세라마이드, 구체적으로 파이토스핑고신 골격에 양방향으로 지방산쇄를 갖는 구조의 1-O-아실세라마이드, 그 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물, 그것의 피부 장벽 기능 강화 용도, 및 그것을 제조하는 방법이 개시된다.

Description

신규 세라마이드, 그의 제조방법 및 그의 용도{New ceramide, method for preparing the new ceramide and its use}

본 명세서에 개시된 기술은 신규 세라마이드, 그의 제조방법 및 그의 용도에 관한 것이다.

인체 피부장벽 지질의 40~50%를 차지하는 세라마이드는 피부보습 및 보호에 핵심적인 역할을 한다. 세라마이드는 스핑고지질의 대표적인 물질로서 인체의 세포 내에서 다양한 구조적인 역할을 수행함과 동시에 세포가 정상적인 기능을 수행하는데 필요한 중요한 생리활성을 가지고 있다. 모든 스핑고지질은 지방산(예컨대, 팔미트산)과 아미노산(예컨대, 세린)이 중합되어 만들어지는 스핑고이드 골격(Sphingoid backbone)을 가지는 지질류를 일컫는데, 골격의 머리부분(head group)에 결합된 하이드록시 그룹과 아미노 그룹, 그리고 이중결합의 유무에 따라 4종류의 스핑고이드 골격, 즉 다이하이드로스핑고신(dihydrosphingosine), 스핑고신(sphingosine), 파이토스핑고신(phytosphingosine), 6-하이드록시스핑고신(6-hydroxysphingosine)이 존재하는 것으로 보고되고 있다. 세라마이드는 4종류의 스핑고이드 골격의 아미노 그룹에 지방산이 결합된 것을 세라마이드라고 하는데 결합된 지방산의 종류에 따라 여러 가지 클래스로 분류된다. 세라마이드는 분자 구조의 다양성이 높아서 새로운 클래스의 세라마이드가 계속적으로 발견되고 있어 실제 피부에 존재하는 세라마이드는 수백 가지 이상 존재하는 것으로 알려지고 있다. (International Journal of Cosmetic Science, 2017, 39, 366-372) 이러한 다양한 구조와 길이의 세라마이드는 피부장벽을 빈틈없이 메꾸어 주고 서로 잡아주는 역할을 함으로서 인체를 보호한다.

세라마이드는 다양한 피부질환 및 피부 트러블과 가장 밀접한 연관을 가지고 있는 물질로 보고되고 있어, 대부분의 피부 문제에서 세라마이드의 변화가 관찰되고 있다. 최근에는 분석 기술의 발달로 인해 각각의 세라마이드의 변화를 추적할 수 있게 되었다. 즉, 아토피 등 여러 피부질환에서 세라마이드의 전체 함량이 낮아지는 것이 장벽 이상의 원인인 것으로는 일찍이 보고되었다. 최근에는 세라마이드 중에서도 세라마이드 NP, NH, EOS, EOP, ω-하이드록시세라마이드 등은 현저히 감소하는 반면 세라마이드 NS, AP 등은 증가한다는 보고가 있어 개별 세라마이드의 중요성이 점점 더 강조되고 있다.

대한민국 특허공개 제10-2017-0084950 A호

일 측면에서, 본 발명은 신규한 세라마이드를 제공하고자 한다.

일 측면에서, 본 발명은 신규한 1-O-아실세라마이드를 제공하고자 한다.

일 측면에서, 본 발명은 피부 장벽 기능 강화용 조성물을 제공하고자 한다.

일 측면에서, 본 발명은 신규한 1-O-아실세라마이드의 제조방법을 제공하고자 한다.

일 측면에서, 본 발명은, 하기 화학식1의 구조를 갖는 1-O-아실세라마이드, 그 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물이다.

[화학식 1]

상기 식에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 C9-31의 포화 또는 불포화 지방족 사슬이고, n은 10 내지 20의 정수임.

일 측면에서, 본 발명은 상기 1-O-아실세라마이드, 그 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물의 제조방법으로서, 파이토스핑고신 골격의 세라마이드에 지방산을 결합시키는 단계를 포함한다.

일 측면에서, 본 발명은 상기 1-O-아실세라마이드, 그 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물을 유효성분으로 포함하는, 피부 장벽 기능 강화용 조성물이다.

일 측면에서, 본 발명을 이용하면, 신규한 1-O-아실세라마이드를 얻을 수 있다.

일 측면에서, 본 발명을 이용하면, 순도 70% 이상의 고순도의 1-O-아실세라마이드를 얻을 수 있다.

일 측면에서, 본 발명을 이용하면, 피부 장벽 기능 강화, 약화된 피부 장벽 기능을 복구 또는 개선, 또는 피부 장벽 기능 저하에 의한 질환의 치료 또는 예방이 가능하다.

일 측면에서, 본 발명을 이용하면 다양한 화장품 및 피부 질환 제제에 사용될 수 있는 우수한 세라마이드를 제공할 수 있다.

도 1 내지 도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 1-O-아실세라마이드의 NMR 데이터이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 1-O-아실세라마이드의 MS 데이터이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 1-O-아실세라마이드의 독성 시험 데이터이다.
도 7 내지 도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 1-O-아실세라마이드의 세라마이드 생합성 유전자 발현에 미치는 영향을 나타내는 실험 데이터이다.

일 측면에서 본 발명은, 하기 화학식1의 구조를 갖는 1-O-아실세라마이드, 그 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물이다.

[화학식 1]

일 구현예에서, 상기 화학식 1의 n은 20 이하, 19 이하, 18 이하, 17 이하, 16 이하, 15 이하, 14 이하, 또는 13 이하일 수 있다. 또한, 일 구현예에서 상기 화학식 1의 n은 10 이상, 11 이상, 또는 12 이상일 수 있다. 일 실시예에서, n은 12일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명은, 하기 화학식2의 구조를 갖는 1-O-아실세라마이드, 그 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물일 수 있다.

[화학식 2]

상기 식에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 C9-31의 포화 또는 불포화 지방족 사슬임.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 세라마이드는 피토스핑고신 골격의 세라마이드, 예컨대, N-스테아로일파이토스핑고신(N-stearoylphytosphingosine), N-올레아노일파이토스핑고신(N-oleanoylphytosphingosine)을 이용할 수 있다. 지금까지 스핑고신(ceramide ENS) 또는 스핑가닌(ceramide ENDS) 기반의 1-O-아실세라마이드는 피부에서 발견되었으나 피토스핑고신(ceramide ENP)는 아직 보고되지 않았다.

1-O-아실세라마이드는 머리부분(head group)의 1번 위치에 있는 하이드록실기(hydroxyl group)에 지방산이 결합된 형태로, 이는 양방향의 지방산 쇄를 가지고 있어 인접한 양쪽의 라멜라층으로 지방산을 펼칠 수 있고, 양쪽의 라멜라층을 잡아주는 역할을 할 수 있다. 이는 피부장벽 세라마이드의 약 5% 정도를 차지하는 것으로 보고되었다. 1-O-아실세라마이드는 피부장벽 라멜라(lamellae)의 주요 구성성분이고, 라멜라와 이웃한 라멜라를 양방향으로 결합시켜주는 링커 또는 커플링 볼트 역할을 하는 세라마이드(Coupling bolt-like Ceramide)이다.

일 구현예에 있어서, 상기 화학식 1의 R1 및 R2는 비분기된 선형의 포화 또는 불포화 지방족 사슬일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 R1은 불포화 지방족 사슬이고, R2는 포화 지방족 사슬일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 R1 및 R2는 탄소수가 C9-31 일 수 있다. 예컨대, C9 이상, C11 이상, C13 이상, C15 이상, 또는 C17 이상일 수 있다. 한편, 예컨대, C31 이하, C29 이하, C27 이하, C25 이하, C23 이하, C21 이하, C19 이하 또는 C17 이하일 수 있다. 예컨대, 상기 탄소수는 C15 내지 C19일 수 있다. 예컨대, 상기 R1 및 R2의 탄소수는 C17일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 R1은 C17의 불포화 지방족 사슬이고, R2는 C17의 포화 지방족 사실일 수 있다. 일 실시예에서, R1COO-는 올레오일이고, R2COO-는 스테아릴일 수 있다.

일 구현예에 있어서, 지방산 R1 또는 R2는 이중 결합의 유무나 수에 상관없이 사용이 가능하다.

일 구현예에 있어서, 상기 1-O-아실세라마이드는, 하기 화학식3의 구조를 갖는, 1-O-아실세라마이드, 그 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물일 수 있다.

[화학식 3]

일 측면에서, 본 발명은 1-O-아실세라마이드, 그 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물의 제조방법이다. 일 구현예에서, 상기 1-O-아실세라마이드는 상기 화학식 1의 화합물일 수 있다.

본 명세서에서 "이성질체"는 특히 광학 이성질체(optical isomers)(예를 들면, 본래 순수한 거울상 이성질체(essentially pure enantiomers), 본래 순수한 부분 입체 이성질체(essentially pure diastereomers) 또는 이들의 혼합물)뿐만 아니라, 형태 이성질체(conformation isomers)(즉, 하나 이상의 화학 결합의 그 각도만 다른 이성질체), 위치 이성질체(position isomers)(특히, 호변이성체(tautomers)) 또는 기하 이성질체(geometric isomers)(예컨대, 시스-트랜스 이성질체)를 포함한다.

본 명세서에서 "본래 순수(essentially pure)"란, 예컨대 거울상 이성질체 또는 부분 이성질체와 관련하여 사용한 경우, 거울상 이성질체 또는 부분 이성질체를 예로 들 수 있는 구체적인 화합물이 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상 또는 약 98% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 99% 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 약 99.5% 이상(w/w) 존재하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 그 염은 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다. 본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능"이란 통상의 의약적 복용량(medicinal dosage)으로 이용할 때 상당한 독성 효과를 피함으로써, 동물, 더 구체적으로는 인간에게 사용할 수 있다는 정부 또는 이에 준하는 규제 기구의 승인을 받을 수 있거나 승인 받거나, 또는 약전에 열거되거나 기타 일반적인 약전으로 인지되는 것을 의미한다.

본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능한 염"은 약학적으로 허용 가능하고 모 화합물(parent compound)의 바람직한 약리 활성을 갖는 본 발명의 일측면에 따른 염을 의미한다.

본 명세서에서 "그의 염"또는 "약학적으로 허용 가능한 염"은 (1) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산으로 형성되거나; 또는 아세트산, 프로파이온산, 헥사노산, 시클로펜테인프로피온산, 글라이콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일) 벤조산, 신남산, 만델산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 1,2-에테인-디설폰산, 2-히드록시에테인설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄퍼설폰산, 4-메틸바이시클로 [2,2,2]-oct-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로파이온산, 트리메틸아세트산, tert-부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가염(acid addition salt); 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 프로톤이 치환될 때 형성되는 염을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 "수화물(hydrate)"은 물이 결합되어 있는 화합물을 의미하며, 물과 화합물 사이에 화학적인 결합력이 없는 내포 화합물을 포함하는 광범위한 개념이다.

본 명세서에서 "용매화물"은 용질의 분자나 이온과 용매의 분자나 이온 사이에 생긴 고차의 화합물을 의미한다.

일 구현예에서, 상기 제조방법은, 파이토스핑고신 골격의 세라마이드에 지방산을 결합시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 지방산을 결합시키는 단계는 파이토스핑고신 골격의 세라마이드에, 지방산, 트리글리세라이드, 또는 지방산 에스터 중 하나 이상인 아실 공여체를 첨가하여 반응시키는 것을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 아실 공여체는, 트리글리세라이드일 수 있다. 또한 상기 트리글리세라이드는 동물, 식물 또는 광물 중 어느 것으로부터 유래된 것도 포함하는 천연 오일, 천연버터, 왁스일 수 있다. 다른 일 측면에서, 천연 오일은, 아르간 오일, 마카다미아 넛오일, 카멜리아 오일, 매도우폼 시드 오일, 로즈 힙 오일, 올리브 오일, 모린가 오일, 바오밥 오일, 그린티 시드 오일, 레드 팜 오일, 마유, 베리 오일, 씨벅손 오일, 해바라기씨 오일, 검은깨 오일 및 에뮤 오일, 쉐어버터, 소이빈 오일, 포도씨 오일, 블랙커런트 오일, 아보카도 오일, 비즈왁스, 칸델리나왁스, 카나우바왁스로부터 선택된 하나 이상의 오일, 버터 또는 왁스일 수 있다.

또한 일 구현예에서 지방산 에스터는 메틸지방산에스터, 에칠지방산에스터 등을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 제조방법은, 세라마이드의 1-OH에 지방산을 결합시키는 방법으로는 한국 특허등록 제10-1816019호(공개 제10-2017-0084950호)에 개시된 방법을 사용할 수 있다. 대안적으로, 일 구현예에서, 효소적인 전환방법을 사용할 수 있다. 예컨대, Candida Antarctica로부터 생산되는 리파아제(E.C. 3.1.1)를 사용하여, 세라마이드의 1번 위치의 하이드록시기에 아실화반응을 유도할 수 있다.

일 실시예에서 본 발명에 따른 제조방법은, 세라마이드와 아실공여체를 혼합하고 용융시키는 단계; 상기 세라마이드와 아실공여체 용융물을 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명에 따른 제조방법은, 세라마이드와 아실공여체를 혼합하고 용융시키는 단계; 상기 세라마이드와 아실공여체 용융물에 효소를 첨가하고 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명에 따른 제조방법은, 세라마이드와 아실공여체를 혼합하고 용융시키는 단계에서 용매를 사용하는 방법일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 용매는 헥산일 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명에 따른 제조방법은, 세라마이드와 아실공여체를 혼합하고 용융시키는 단계에서 용매를 사용하지 않는 방법일 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명에 따른 제조방법은, 아실공여체 용융물을 반응시키는 단계에서 용매를 사용하는 제조방법일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 용매는 헥산일 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명에 따른 제조방법은, 아실공여체 용융물을 반응시키는 단계에서 용매를 사용하지 않는 제조방법일 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 지방산을 결합시키는 단계는, 파이토스핑고신 골격의 세라마이드에, 아실 공여체를 첨가하고 가온하여 녹인 후 12시간 이상 반응시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 용융 및/또는 반응을 위한 가온은 30℃이상, 40℃이상, 50℃이상, 60℃이상, 70℃이상, 80℃ 이상, 85℃이상, 90℃이상, 95℃이상, 100℃이상, 105℃이상 또는 110℃이상일 수 있다. 예컨대, 상기 가온은 30 내지 120℃, 또는 80 내지 120℃의 온도로 가온하는 것일 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 지방산을 결합시키는 단계는 세라마이드와 지방산을 가온하여 녹인 후 효소를 첨가하는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 효소는 리파아제일 수 있다. 예컨대, 상기 효소는, Lipozyme RM(Novozyme, Denmark, 리파아제(E.C. 3.1.1))일 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 반응 시간은 48시간 이하일 수 있다. 예컨대, 상기 반응 시간은 48시간 이하, 46시간 이하, 44시간 이하, 42시간 이하, 40시간 이하, 38시간 이하, 36시간 이하, 34시간 이하, 32시간 이하, 30 시간 이하, 28시간 이하, 26시간 이하, 24시간 이하, 22시간 이하, 20시간 이하, 18시간 이하, 또는 16시간 이하일 수 있다. 한편, 상기 반응 시간은 예컨대, 10분 이상, 20분 이상, 30분 이상, 40분 이상, 50분 이상, 60분 이상, 80분 이상, 100분 이상, 2시간 이상, 4시간 이상, 6시간 이상, 8시간 이상, 10시간 이상, 12시간 이상, 14시간 이상 또는 15시간 이상일 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명에 따른 제조방법은, 상기 세라마이드와 아실공여체 용융물을 반응시키는 단계에서 반응시간은 10분 ~ 48시간일 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 파이토스핑고신 골격의 세라마이드와 아실 공여체의 반응 당량은 1: 1 내지 3일 수 있다. 예컨대, 상기 반응 당량은 1:1 이상, 1:1.1 이상, 1:1.2 이상, 1:1.3 이상, 1:1.4 이상, 1:1.5 이상, 1:1.6 이상, 1:1.7 이상, 1:1.8 이상, 1:1.9 이상, 또는 1:2.0 이상일 수 있다. 또한, 1:3.0 이하, 1:2.9 이하, 1:2.8 이하, 1:2.7 이하, 1:2.6 이하, 1:2.5 이하, 1:2.4 이하, 1:2.3 이하, 1:2.2 이하, 1:2.1 이하, 또는 1:2.0 이하일 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 효소 첨가량은, 기질인 스핑고지질의 중량이 100중량부일 때, 상기 효소는 5 내지 30중량부일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 효소 첨가량은 기질인 스핑고지질의 중량이 100중량부일 때, 5중량부 이상, 6중량부 이상, 7중량부 이상, 8중량부 이상, 9중량부 이상, 10중량부 이상, 12중량부 이상, 14중량부 이상, 16중량부 이상, 18중량부 이상, 19중량부 이상, 20중량부 이상, 24중량부 이상, 또는 28중량부 이상일 수 있다. 다른 일 실시예에서, 상기 효소 첨가량은 기질인 스핑고지질의 중량이 100중량부일 때, 30중량부 이하, 28중량부 이하, 26중량부 이하, 24중량부 이하, 22중량부 이하, 20중량부 이하, 18중량부 이하, 16중량부 이하, 14중량부 이하, 13중량부 이하, 12중량부 이하, 11중량부 이하, 또는 10중량부 이하일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명은, 상기 1-O-아실세라마이드, 그 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물을 유효성분으로 포함하는, 피부 장벽 기능 강화용 조성물일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명은, 피부 장벽 기능 강화용 조성물을 제조하기 위한, 상기 1-O-아실세라마이드, 그 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물의 용도일 수 있다. 상기 용도는 치료적 용도 또는 비치료적 용도일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명은, 피부 장벽 기능 강화를 위한, 1-O-아실세라마이드, 그 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물일 수 있다. 상기 1-O-아실세라마이드는 앞서 언급한 1-O-아실세라마이드일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명은 피부 장벽 기능 강화를 위한 방법으로서, 1-O-아실세라마이드, 그 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법일 수 있다. 상기 1-O-아실세라마이드는 앞서 언급한 1-O-아실세라마이드일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 조성물은, 약학 조성물, 화장품 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 1-O-아실세라마이드, 그 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물은 피부 장벽 기능 저하에 의한 피부질환의 치료, 개선 또는 예방용으로 사용될 수 있다. 예컨대, 상기 피부 장벽 기능 저하에 의한 피부질환은, 아토피 또는 건선 등을 포함한다.

일 구현예에서, 상기 1-O-아실세라마이드, 그 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물은 질병, 자가면역 또는 외부 자극 등 다양한 원인에 의해 손상된 피부 장벽 기능을 복구 또는 개선하기 위한 용도로 사용될 수 있다. 예컨대, 접촉성 피부염, 알레르기성 피부염, 여드름 등의 질환이나 자외선 또는 미세먼지 등에 의해 손상된 피부 장벽 기능을 복구 또는 개선하기 위한 용도로 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 1-O-아실세라마이드, 그 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물은 0.09mg/kg 내지 1.10mg/kg의 일일 투여량으로 이를 필요로 하는 대상에게 투여될 수 있다. 예컨대, 상기 1-O-아실세라마이드, 그 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물은 일일 투여량 0.09mg/kg 이상, 0.10mg/kg 이상, 0.12mg/kg 이상, 0.14mg/kg 이상, 0.16mg/kg 이상, 0.18mg/kg 이상, 0.20mg/kg 이상, 0.22mg/kg 이상, 0.24mg/kg, 0.26mg/kg 이상, 0.28mg/kg 이상, 0.30mg/kg 이상, 0.32mg/kg 이상, 0.34mg/kg 이상, 0.36mg/kg 이상, 0.38mg/kg 이상, 0.40mg/kg 이상, 0.42mg/kg, 또는 0.44mg/kg 이상일 수 있다. 또한 예컨대, 1.11mg/kg 이하, 1.10mg/kg 이하, 1.05mg/kg 이하, 1.00mg/kg 이하, 0.90mg/kg 이하, 0.80mg/kg 이하, 0.70mg/kg 이하, 0.60mg/kg 이하, 0.50mg/kg 이하, 0.49mg/kg 이하, 0.48mg/kg 이하, 0.47mg/kg 이하, 또는 0.46mg/kg 이하일 수 있다.

본 발명의 일측면은 1-O-아실세라마이드, 그 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물을 포함하는 화장품 조성물을 제공한다. 상기 화장품 조성물은 화장품학 또는 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소 적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 멀티 에멀젼, 현탁액, 마이크로 에멀젼, 마이크로 캡슐, 미세 과립구, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제, 포말(foam), 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 또는 패치 형태로 사용될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

상기 화장품 조성물은 상기한 물질 이외에 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 함유하는 것도 무방하며, 본 발명의 유효 성분 이외에 다른 성분을 기타 화장품 조성물의 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 화장품 조성물은 상기 유효 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장품 조성물에 배합되는 다른 성분을 포함할 수 있고, 이의 예로서 유지 성분, 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 안정화제, 증점제, 글리세린, pH 조절제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다. 상기 화장품 조성물에 포함될 수 있는 기타 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니고, 또한 상기 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 가능하다.

상기 화장품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 비누형 제제, 유연 화장수, 영양 화장수, 에센스, 영양 크림, 마사지 크림, 팩, 젤, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더, 립스틱, 패치, 분무제, 아이 크림, 아이 에센스, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌져, 모발 샴푸, 모발 컨디셔닝, 모발 트리트먼트, 모발 에센스, 모발 로션, 두피 헤어토닉, 두피 에센스, 헤어젤, 헤어 스프레이, 헤어팩, 바디 로션, 바디 크림, 바디 오일 및 바디 에센스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일측면은 1-O-아실세라마이드, 그 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물 조성물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 이러한 약학 조성물은 유효 성분 이외에 방부제, 안정화제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제, 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오즈 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 또는 폴리에틸렌 글리콜) 또는 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로오즈 또는 폴리비닐피롤리딘) 등의 약제학적 보조제 또는 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있다. 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 또는 감미제 등의 다른 약제학적 첨가제를 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 또는 비경구 투여제 형태로 제형화할 수 있다. 상기 비경구 투여제는 예를 들어, 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제(坐劑), 패치, 주사제 등의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일측면에 따른 상기 약학 조성물은 경구, 비경구 예를 들어 경피, 정맥 등으로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 각 투여법에 적합한 제형 및 기준에 준한다. 특히, 정맥 주사의 경우 이에 적합하지 못 한 모든 첨가물을 배제하며, 조성물 자체의 순도 또한 매우 높게 제조된다.

상기 유효 성분의 적용량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 질환, 병리 상태, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있다.

이하, 실시예, 비교예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예, 비교예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 실시예, 비교예 및 실험예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1) 스핑고리피드와 아실 공여체의 반응

아래의 표와 같이 스핑고지질 일정량에 아실 공여체를 1당량몰로 첨가하고 100~110℃로 가온하여 녹인 후 24시간 반응시켜 신규 세라마이드 반응물을 얻었다. 반응으로 얻은 신규 세라마이드 반응물을 분석하여 1-O-아실세라마이드의 함량을 계산하여 1-O-아실세라마이드 전환율을 계산하였다. 아래의 표에서와 같이 효소가 없는 상태에서는 1-O-아실세라마이드로의 전환율이 5~10% 수준으로 낮게 나타났다. 아실공여체로 지방산을 사용한 경우와 트리글리세라이드 형태를 사용한 경우에서 전환율에 큰 차이가 없이 나타났다.

스핑고리피드	아실 공여체	온도(℃)	전환율(%)
N-Oleoylphytosphingosine	스테아릭 산	100	5
N-Oleoylphytosphingosine	트리스테아린	105	5
Complex ceramide NP (C16 ~ C24 ceramide NP)	스테아릭산	100	10
Phytosphingosine	스테아릭 산	100	5
Phytosphingosine	트리스테아린	105	5

실시예 2) 효소에 의한 스핑고리피드와 아실 공여체의 반응아래의 표와 같이 올레오일피토스핑고신(N-oleoylphytosphingosine, ceramide NP)에 각각의 아실공여체를 1당량몰로 첨가하고 90℃로 가온하여 녹인 후 Lipozyme RM(Novozyme, Denmark, 리파아제(E.C. 3.1.1))을 스핑고지질의 중량을 100중량부로 할 때 5중량부의 양으로 첨가한 후 24시간 반응하여 전환율을 확인하였다. 표의 결과와 같이 아실 공여체에 따라 1-O-아실세라마이드로의 전환율에 차이가 있었으며, 24시간 기준으로 Triglyceride 형태의 아실 공여체가 65%로 가장 높은 전환율을 보였다.

스핑고지질	아실 공여체	전환율(%)
Oleoyl phytosphingosine	Methyl stearate	27
	Ethyl stearate	36
	Stearic acid	35
	Tristearine	65

실시예 3) 용매의 영향아래의 그림과 같이 올레오일피토스핑고신(N-oleoylphytosphingosine, ceramide NP) 일정량에 아실 공여체로 트리글리세라이드 형태의 트리스테아린을 1.5당량몰로 첨가하고 2.5배 부피의 용매를 첨가하여 가온하여 녹인 후 Lipozyme RM(Novozyme, Denmark, 리파아제(E.C. 3.1.1))을 스핑고지질의 중량을 100중량부로 할 때 5중량부의 양으로 첨가한 후 24시간 반응하여 전환율을 확인하였다. 아래의 표에서와 같이 용매가 첨가된 경우는 첨가되지 않은 경우에 비해 24시간 기준으로 볼 때 1-O-아실세라마이드로의 전환이 낮게 나타났으며, 용매에 따라서는 반응이 거의 일어나지 않는 경우도 보였다.

스핑고리피드	아실 공여체	용매	용매량	온도(℃)	전환율(%)
Oleoylphytosphingosine	Tristearine			90	63
	Tristearine	tert-amyl alcohol	2.5배	90	2
	Tristearine	Hexane	2.5배	55	56

실시예 4) 반응시간에 따른 반응율 추이아래의 표와 같이 올레오일피토스핑고신(N-oleoylphytosphingosine, ceramide NP) 일정량에 아실 공여체를 1.5당량몰로 첨가하고 10배 부피의 Hexane에 용해시킨 후 Lipozyme RM(Novozyme, Denmark, 리파아제(E.C. 3.1.1))을 스핑고지질 100중량부에 대해 5중량부의 양으로 첨가한 후 반응하며 시간별로 전환율을 확인하였다. 트리스테아린의 경우는 16시간 후부터는 반응이 진행되면서 전환율이 거의 변화가 없는 반면, 스테아릭산의 경우는 시간이 경과하면서 전환율이 감소하는 것으로 보아 1-O-아실세라마이드 생성후에 추가로 반응이 진행되어 부반응물이 생성되는 것을 알수 있었다.

스핑고리피드	아실 공여체	반응시간(hr)	전환율(%)
Oleoyl phytosphingosine	Tristearine	16	53
		24	56
		48	56
		72	58
	Stearic acid	16	62
		24	63
		48	58
		72	54

실시예 5) 아실 공여체 양의 영향아래의 표와 같이 올레오일피토스핑고신(N-oleoylphytosphingosine, ceramide NP) 일정량에 아실 공여체를 아래 표의 양으로 첨가하고 10배 부피의 Hexane에 용해시킨 후 Lipozyme RM(Novozyme, Denmark, 리파아제(E.C. 3.1.1))을 스핑고지질 100 중량부일 때 5중량부의 함량으로 첨가한 후 24시간 반응하며 전환율을 확인하였다. 아래의 표에서와 같이 아실 공여량이 증가할수록 1-O-아실세라마이드의 전환율은 증가하는 것으로 나타났다.

스핑고리피드	아실 공여체	아실 공여체 양(당량)	전환율(%)
Oleoyl phytosphingosine	Tristearine	1	45
		1.5	56
		2	69
		2.5	68

실시예 6) 효소양에 따른 전환율 검사아래의 표와 같이 올레오일피토스핑고신(N-oleoylphytosphingosine, ceramide NP)과 스테아로일피토스핑고신(N-stearoylphytosphingosine, ceramide NP) 일정량에 아실 공여체를 1.5당량 첨가하고 10배 부피의 Hexane에 용해시킨 후 Lipozyme RM(Novozyme, Denmark, 리파아제(E.C. 3.1.1))을 첨가하고 90℃로 가온한 후 1시간 반응하며 1-O-아실세라마이드의 전환율을 확인하였다. 아래의 표에서와 같이 효소량이 기질인 스핑고리피드 100중량부에 대해 10중량부까지 증가하는 동안 1-O-아실세라마이드 전환율은 증가하지만 그 이상의 효소 농도에서는 1-O-아실세라마이드 의 증가량이 크게 늘어나지 않았다.

스핑고리피드	아실 공여체	효소양(중량부)	전환율(%)
N-Oleoylphytosphingosine	Stearic acid	5	63
		10	74
		20	76
N-Stearoylphytosphingosine	Stearic acid	5	48
		10	68
		20	76

실시예 7) 1-O-아실세라마이드의 구조 분석

반응에서 얻은 1-O-아실세라마이드를 분리정제하여 MS 확인으로 분자량을 확인하였고 (MW: 882.82) NMR 확인하여 1번 hydroxyl group에 아실 체인이 결합한 것을 확인하였다(도 1 내지 도 5)

실시예 8) 1-O-아실세라마이드의 세라마이드 생합성에 미치는 영향 분석

세포독성실험

인체 피부각질세포(Human Epidermal Keratinocyte, neonatal (HEKn), Thermo Fisher Scientific, USA)를 96well plate에 7x10³cell로 넣은 후 37℃, 5% CO₂ 통기 조건에서 24시간 배양하였다. 그 다음에 최종 부피가 100ul가 되도록 1-O-아실세라마이드 시료를 처리하였다. 1-O-아실세라마이드를 처리한 96well plate를 37℃, 5% CO₂ 통기 조건에서 추가로 24시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 PBS(phosphate buffered saline)로 1회 세척하고 배지와 동량의 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide or MTT) solution을 넣었다. 37℃에서 90분간 incubation시켰다. MTT solution을 제거 한 후 Stop solution (Dimethyl sulfoxide) 100ul를 첨가하여 상온에서 20분간 방치하였다. 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 6에 나타나 있다.

도 6에 나타나 있는 바와 같이, 1-C-acylceramide는 농도에 따라 세포에 독성을 보이고 있다. 이는 일반적으로 세라마이드나 피토스핑고신이 나타내는 독성의 범위와 유사한 수준으로 나타났다.

세포 배양 및 RNA 추출

인간의 피부각질세포(Human Epidermal Keratinocyte, neonatal (HEKn), Thermo Fisher Scientific, USA)를 12well plate에 각 well 당 1x10⁵cell로 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ 통기 조건에서 24시간 배양하였다. 상기 실시예에서 제조한 1-O-acylcermide를 각각 0.1, 0.5, 1uM의 농도 별로 처리한 후 37℃, 5% CO₂ 통기 조건에서 24시간 추가 배양하였다. 배지를 제거하고 PBS buffer로 1회 세척 후 NucleoSpin RNA Plus kit (Germany)를 사용하여 RNA을 추출하였다. 조건은 350ul LBP (lysate buffer)를 각 well에 넣고 scraper로 긁어 NucleoSpin gDNA Removal Column (yellow ring)에 cell lysate을 회수한 후 11,000g에서 30초동안 원심 분리하였다. 회수된 용액에 100ul BS (Binding Solution)를 넣어 mixing 후 NucleoSpin RNA Plus Column (blue ring)으로 옮겨 11,000g에서 15초동안 원심 분리하였다. 컬럼에 200ul Buffer WB1 (washing buffer)를 넣고 11,000g에서 15초동안 원심 분리하여 세척하고, 600ul Buffer WB2 (washing buffer)를 또 첨가하여 11,000g에서 15초동안 원심 분리하여 세척하였다. 마지막으로 250ul Buffer WB2 (washing buffer)를 넣고 11,000g에서 2분동안 원심 분리하여 세척하였다. 위에 각 단계는 남아 있는 단백질, 지질 및 DNA을 제거하는 작업이다. 20ul RNase-free H₂O 를 넣고 11,000g에서 1분동안 원심 분리하였다. (2회) 추출한 RNA를 멸균된 microtube에 모아 RNA을 정량 한다. RNA는 260nm와 280nm에서 흡광도를 측정하고 RNA 양을 계산하였다. 이때 Blank로 RNase free water를 사용하였다.

RNA에서 cDNA로 합성

RNA 보정값+DEPC water 보정값 (total 11ul)에 oligo-dT primer 1ul를 넣어 원심분리로 모은 후 65℃에서 5분간 heating한다. 식히면서 원심분리 후 각 시료당 Buffer 4ul + dNTP mix 2ul + RNase inhibitor 1ul + RNA transcriptase 1ul (total 20ul) 넣고 상온에서 5분간 방치 한 후 42℃에서 1시간동안 효소반응을 시켰다. 70℃에서 5분간 효소 stop반응을 시켰다.

RT-PCR

RT-PCR 혼합액은 다음과 같다; 합성된 cDNA 2ul + primer mix (10uM) 0.5ul + TB Green® Premix Ex Taq 12.5ul에 나머지는 증류수로 채워서 총 부피 25ul로 제조하였고, 운행 조건은 95℃초 1회 가열한 후 95℃-5초, 60℃초 단계로 40회 순환하였다. 이 때 사용된 프라이머 서열은 표 1로 표기하였다. RT-PCR을 통해 얻어진 값은 식(1)과 식(2)을 이용하여 수치화한 후 정량 분석하였다.

……………………식 (1)

…………………식 (2)

Name	sequence	Sequence Listing No.
GAPDH (F)	GAGTCAACGGATTTGGTCGT	SEO ID NO: 1
GAPDH (R)	TTGATTTTGGAGGGATCTCG	SEO ID NO: 2
SPTLC-1 (F)	GCGCGCTACTTGGAGAAAGA	SEO ID NO: 3
SPTLC-1 (R)	TGTTCCACCGTGACCACAAC	SEO ID NO: 4
SPTLC-2 (F)	AGCCGCCAAAGTCCTTGAG	SEO ID NO: 5
SPTLC-2 (R)	CTTGTCCAGGTTTCCAATTTCC	SEO ID NO: 6
CER3 (F)	ACATTCCACAAGGCAACCATTG	SEO ID NO: 7
CER3 (R)	CTCTTGATTCCGCCGACTCC	SEO ID NO: 8

사용한 프라이머 서열인 SPTLC-1과 SPTLC-2는 세라마이드 생합성 경로에서 율속단계(rate limiting step)에 해당하는 serine-palmitoyltransferase로 이 효소에 의해 serine과 palmitoyl CoA의 축합반응이 일어나면서 스핑고이드 골격이 생성되어 세라마이드가 합성되는 일련의 생합성 반응이 진행되게 된다. 본 실시예를 통해 1-O-아실세라마이드는 serine-palmitoyltransferase의 발현을 2배가량 증가시킴으로서 피부세포에서 세라마이드의 de novo synthesis(생합성)을 촉진시켜 피부장벽의 항상성을 유지시켜주는 역할을 수행할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 세라마이드 합성에 관여하는 ceramide synthase3의 활성이 증가하는 것으로 보아 피부에서 세라마이드의 합성을 촉진하는 효과를 가질 것으로 기대된다.

<110> LCS Biotech Co., Ltd. <120> New ceramide, method for preparing the new ceramide and its use <130> 21p037ind <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH (F) <400> 1 gagtcaacgg atttggtcgt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH (R) <400> 2 ttgattttgg agggatctcg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPTLC-1 (F) <400> 3 gcgcgctact tggagaaaga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPTLC-1 (R) <400> 4 tgttccaccg tgaccacaac 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPTLC-2 (F) <400> 5 agccgccaaa gtccttgag 19 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPTLC-2 (R) <400> 6 cttgtccagg tttccaattt cc 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CER3 (F) <400> 7 acattccaca aggcaaccat tg 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CER3 (R) <400> 8 ctcttgattc cgccgactcc 20

Claims

하기 화학식1의 구조를 갖는 1-O-아실세라마이드, 그 입체 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물을 유효성분으로 포함하는 피부 보호용 조성물.
[화학식 1]

상기 식에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 C9-31의 포화 또는 불포화 지방족 사슬이고, n은 10 내지 20의 정수임.
하기 화학식1의 구조를 갖는 1-O-아실세라마이드, 그 입체 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물을 유효성분으로 포함하는 피부 세라마이드 생합성 증진용 조성물.
[화학식 1]

상기 식에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 C9-31의 포화 또는 불포화 지방족 사슬이고, n은 10 내지 20의 정수임.
하기 화학식1의 구조를 갖는 1-O-아실세라마이드, 그 입체 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽 기능 개선용 조성물.
[화학식 1]

상기 식에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 C9-31의 포화 또는 불포화 지방족 사슬이고, n은 10 내지 20의 정수임.
하기 화학식1의 구조를 갖는 1-O-아실세라마이드, 그 입체 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽 기능 저하에 의한 피부 질환 개선, 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]

상기 식에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 C9-31의 포화 또는 불포화 지방족 사슬이고, n은 10 내지 20의 정수임.
하기 화학식1의 구조를 갖는 1-O-아실세라마이드, 그 입체 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽 기능 저하에 의한 피부 질환 개선 또는 예방용 화장품 조성물.
[화학식 1]

상기 식에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 C9-31의 포화 또는 불포화 지방족 사슬이고, n은 10 내지 20의 정수임.
하기 화학식1의 구조를 갖는 1-O-아실세라마이드, 그 입체 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽 기능 저하에 의한 피부 질환 개선 또는 예방용 식품 조성물.
[화학식 1]

상기 식에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 C9-31의 포화 또는 불포화 지방족 사슬이고, n은 10 내지 20의 정수임.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은, 세린-팔미토일트랜스퍼라아제(serine-palmitoyltransferase)의 발현을 증가시킴으로써 피부세포에서 세라마이드의 생합성을 증진시키는 것인, 조성물.
제7항에 있어서, 상기 조성물은, 세린-팔미토일트랜스퍼라아제(serine-palmitoyltransferase)의 발현이 저하된 대상에게 투여 또는 제공하기 위한 것인, 조성물.
제7항에 있어서, 상기 세린-팔미토일트랜스퍼라아제는 SPTLC-1 및 SPTLC-2인, 조성물.
제7항에 있어서, 상기 조성물은 세린-팔미토일트랜스퍼라아제 발현 증가와 함께, 세라마이드 신타아제(ceramide synthase) 활성을 증가시킴으로써, 피부세포에서 세라마이드의 생합성을 증진시키는 것인, 조성물.
제10항에 있어서, 상기 세라마이드 신타아제(ceramide synthase)는 CERS3인, 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 비분기된 선형의 포화 또는 불포화 지방족 사슬인, 조성물.
12항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 탄소수가 C13 내지 C21인, 조성물.
제13항에 있어서, 상기 1-O-아실세라마이드는, 하기 화학식3의 구조를 갖는, 피부 세라마이드 생합성 증진용 조성물.
[화학식 3]
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1-O-아실세라마이드, 그 입체 이성질체, 그 염, 그 용매화물 또는 그 수화물은 0.09mg/kg 내지 1.10mg/kg의 일일 투여량으로 투여되는 것인, 조성물.