KR20220116747A - Chitosan composition having antibacterial lasting effect and manufacturing method thereof - Google Patents

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Abstract

An objective of the present invention is to provide a composition comprising hyaluronic acid, an Aurea helianthus extract, and chitosan to provide a composition having a sustainable antibacterial effect by a stabilized composition. The present invention provides a chitosan mixture composition comprising hyaluronic acid, an Aurea helianthus extract, and chitosan. The present invention provides a method for preparing a chitosan mixture composition, which comprises: a step (a) of mixing hyaluronic acid, an Aurea helianthus extract, and chitosan; a step (b) of dispersing and dissolving a mixture of hyaluronic acid, the Aurea helianthus extract, and chitosan in an organic acid; a step (c) of adding chitosanase; a step (d) of reacting the mixture at 25 to 70℃ until agglomeration caused by chitosan disappears; a step (e) of performing processing at 90 to 100℃ for 5 to 10 minutes; and a step (f) of performing filtering.

Description

항균 지속성 효과를 갖는 키토산 혼합 조성물 및 이의 제조 방법{CHITOSAN COMPOSITION HAVING ANTIBACTERIAL LASTING EFFECT AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}Chitosan mixed composition having an antibacterial long-lasting effect, and a method for manufacturing the same

본 발명은, 항균 지속성 효과를 갖는 키토산 혼합 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a chitosan mixture composition having a long-acting antibacterial effect and a method for preparing the same.

항생제란 통상적으로 항미생물제를 총칭하는 것으로, 특히 세균에 대한 항균작용을 하는 물질, 상세하게는 세균이 세포벽이나 단백질 등을 합성하는 시스템을 저해시킴으로써 뛰어난 항균작용을 하는 물질 또는 이러한 물질로부터 제조된 것을 의미한다. 항생제의 성분은 주로 곰팡이로부터 추출된 것이 주를 이루었으며, 오늘날 세균 감염에 의한 질병 등을 치료하기 위해 많이 사용되고 있다. 가장 대표적인 항생제로는 영국인 의사 알렉산더 플레밍이 1928년에 제조한 페니실린이다. 페니실린 이후에 개발된 대표적인 항생제로는 페니실린 보다 효과가 탁월한 것으로 인정되는 메티실린(methicillin)이 있다. 메티실린은 페니실린의 화학구조를 일부 변경하여 제조한 것이다.Antibiotics are generally a generic term for antimicrobial agents. In particular, substances that have an antibacterial action against bacteria, specifically, substances that have excellent antibacterial action by inhibiting the system in which bacteria synthesize cell walls or proteins, or those prepared from these substances. it means. The components of antibiotics were mainly extracted from fungi, and today, they are widely used to treat diseases caused by bacterial infections. The most common antibiotic is penicillin, manufactured in 1928 by British doctor Alexander Fleming. A representative antibiotic developed after penicillin is methicillin, which is recognized to be more effective than penicillin. Methicillin is manufactured by partially modifying the chemical structure of penicillin.

항생제내성세균이란 특정 항생제에 내성을 보여 약효가 듣지 않는 세균을 말한다. 예를 들어, 상기한 페니실린 의 약효가 전혀 듣지 않는 페니실린 내성 황색포도상구균이 이에 해당된다. 이 외에도, 1961년 최초로 학계에 보고되었으며, 그 후로 전세계적으로 주요 병원내 감염균이 되고 있는 메티실린 내성 황색포도상구균 (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)이 있다. MRSA는 페니실린이나 메티실린의 항생제에도 내성을 나타낼 수 있는 독특한 유전자를 지니고 있는 것으로 밝혀졌다. MRSA는 주로 건강한 사람에게는 감염이 되지 않고, 주로 면역력이 약한 환자나 수술을 마친 환자에게 감염이 되며, 감염이 되는 경우에는 패혈증이나 폐렴을 일으켜 사망케 하는 것으로 보고되어 있다.Antibiotic-resistant bacteria are bacteria that are resistant to certain antibiotics and thus do not work. For example, this includes penicillin-resistant Staphylococcus aureus, which does not work at all with the above-described penicillin efficacy. In addition, there is Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA), which was first reported in the academic world in 1961 and has since become a major nosocomial pathogen worldwide. It has been found that MRSA has a unique gene that can show resistance to antibiotics such as penicillin and methicillin. It has been reported that MRSA mainly does not infect healthy people, but mainly infects patients with weakened immunity or patients who have undergone surgery.

이와 같은 기존 화학물질 유래 항생제에 대한 내성을 가진 병원성 미생물로 인한 감염이 증가함에 따라, 최근에는 기존 화학물질 유래 항균제의 경우 부작용과 내성이 문제되어, 천연물 유래 항균 물질에 대한 개발의 요구가 증대되면서, 천연물을 이용한 여러 약품 또는 항생제를 개발하려는 시도가 활발하게 진행되고 있다.As the number of infections caused by pathogenic microorganisms resistant to antibiotics derived from conventional chemicals increases, in recent years, side effects and resistance to existing chemical-derived antibiotics have become a problem. , attempts to develop various drugs or antibiotics using natural products are being actively conducted.

이와 같은 천연물 유래 항균 물질로서, 키토산을 포함하는 조성물이 개발되고 있다. 키토산(Chitosan)은 게, 새우 및 가재와 같은 갑각류 껍질의 주요 성분인 키틴[폴리β-(1→4)-N-아세틸-D-글루코사민]을 탈아세틸화하여 얻어지는 천연 무독성 바이오폴리머이다. 지난 수십 년간 키토산은 항미생물성, 항종양성, 항산화성 및 혈중콜레스테롤 저하 작용과 같은 다양한 생물학적 활성으로 인해 많은 주목을 받아 왔다. 키토산은 또한 수분과 지방 흡수, 유화작용 및 색소 결합 등의 특성을 지닌 것으로 보고되고 있다.As such a natural product-derived antibacterial substance, a composition containing chitosan has been developed. Chitosan is a natural, non-toxic biopolymer obtained by deacetylating chitin [polyβ-(1→4)-N-acetyl-D-glucosamine], a major component of crustacean shells such as crab, shrimp and crayfish. In the past few decades, chitosan has received a lot of attention due to its various biological activities such as antimicrobial, antitumor, antioxidant and blood cholesterol lowering action. Chitosan is also reported to have properties such as water and fat absorption, emulsification and pigment binding.

이와 같은 키토산은 고분자 상태에서 다른 유효 성분들과의 혼합이 매우 어렵기 때문에 분자량이 낮은 형태로 분해되어야 한다. 그러나, 효소를 사용하여 키토산을 분해하면, 키토산을 이루는 글루코사민이 5개 이하로 존재하는 저분자량 형태의 올리고당으로 분해되는 경우가 일반적이다. 이와 같은 매우 저분자량 형태의 올리고당은 유의한 항균 활성을 갖지 못하고, 탄소원 또는 질소원 등의 영양원으로 사용된다. 따라서, 다양한 생리 활성을 갖는 특정 분자량 크기의 키토산을 포함하는 조성물을 제조하기 어렵다는 문제점이 있었다.Such chitosan must be decomposed into a low molecular weight form because it is very difficult to mix with other active ingredients in a polymer state. However, when chitosan is decomposed using an enzyme, it is generally decomposed into low molecular weight oligosaccharides in which five or less glucosamine constituting chitosan are present. Such a very low molecular weight type oligosaccharide does not have significant antibacterial activity and is used as a nutrient source such as a carbon source or a nitrogen source. Therefore, there is a problem in that it is difficult to prepare a composition containing chitosan of a specific molecular weight size having various physiological activities.

등록특허 제10-1120161호Registered Patent No. 10-1120161

본 발명은, 히알루론산, 금화규 추출물 및 키토산을 포함하는 조성물을 제공함으로써, 안정화된 조성물에 의해 지속 가능한 항균 효과를 갖는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a composition having a sustainable antibacterial effect by providing a composition comprising hyaluronic acid, a Geumhwagyu extract and chitosan, and a stabilized composition.

본 발명은, 히알루론산, 금화규 추출물 및 키토산을 포함하는, 키토산 혼합 조성물을 제공한다.The present invention provides a mixed composition of chitosan, comprising hyaluronic acid, Geumhwagyu extract and chitosan.

상기 히알루론산 100중량부에 대해 상기 금화규 추출물 25~200중량부 및 상기 키토산 25~200중량부를 포함하는, 키토산 혼합 조성물을 제공할 수 있다.With respect to 100 parts by weight of the hyaluronic acid, it is possible to provide a chitosan mixture composition comprising 25 to 200 parts by weight of the Geumhwagyu extract and 25 to 200 parts by weight of the chitosan.

하기 단계를 이 순서대로 포함하는, 상기 키토산 혼합 조성물의 제조 방법을 제공할 수 있다: (a) 히알루론산, 금화규 추출물 및 키토산을 혼합하는 단계; (b) 히알루론산, 금화규 추출물 및 키토산의 혼합물을 유기산에 분산 및 용해하는 단계; (c) 키토사나아제를 첨가하는 단계; (d) 25~70℃에서 키토산에 의한 엉김이 없어질 때까지 반응시키는 단계; (e) 90~100℃에서 5~10분간 처리하는 단계; (f) 여과하는 단계.It can provide a method for preparing the chitosan mixture composition, comprising the following steps in this order: (a) mixing hyaluronic acid, Keumhwagyu extract and chitosan; (b) dispersing and dissolving a mixture of hyaluronic acid, Keumhwagyu extract and chitosan in an organic acid; (c) adding chitosanase; (d) reacting at 25 ~ 70 ℃ until the agglomeration by chitosan disappears; (e) treating at 90-100° C. for 5-10 minutes; (f) filtering.

상기 (a) 단계에서, 상기 히알루론산 100중량부에 대해 상기 금화규 추출물 25~200중량부 및 상기 키토산 25~200중량부를 혼합하는, 키토산 혼합 조성물의 제조 방법을 제공할 수 있다.In the step (a), 25 to 200 parts by weight of the Geumhwagyu extract and 25 to 200 parts by weight of the chitosan are mixed with respect to 100 parts by weight of the hyaluronic acid, to provide a method for preparing a chitosan mixture composition.

상기 (b) 단계에서, 상기 유기산은 젖산, 초산, 포름산 및 아스코르브산으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 1종인, 키토산 혼합 조성물의 제조 방법을 제공할 수 있다.In the step (b), the organic acid is any one selected from the group consisting of lactic acid, acetic acid, formic acid and ascorbic acid, it may provide a method for preparing a chitosan mixture composition.

상기 (c) 단계에서, 상기 키토사나아제는 0.1~2.0 Unit/L 첨가되는, 키토산 혼합 조성물의 제조 방법을 제공할 수 있다.In the step (c), the chitosanase is 0.1 ~ 2.0 Unit / L is added, it can provide a method for preparing a chitosan mixture composition.

상기 (f) 단계에서, 0.22~0.45㎛ 크기의 구멍을 갖는 진공 여과 필터로 여과하는, 키토산 혼합 조성물의 제조 방법을 제공할 수 있다.In the step (f), it is possible to provide a method for producing a chitosan mixture composition, which is filtered through a vacuum filter having a hole of 0.22 to 0.45 μm in size.

본 발명의 키토산 혼합 조성물은 항균 지속성 효과가 우수하다.The chitosan mixture composition of the present invention has excellent antibacterial and long-lasting effect.

도 1은 본 발명의 키토산 혼합 조성물을 부직포에 처리하고 48시간 경과시 항균력을 시험한 결과이다. 도 2는 본 발명의 키토산 혼합 조성물을 슬라이드 글라이스에 처리하고 48시간 경과시 항균력을 시험한 결과이다.1 is a result of testing the antimicrobial activity when the chitosan mixture composition of the present invention is treated on a nonwoven fabric and 48 hours have elapsed. 2 is a result of testing the antibacterial activity when the chitosan mixture composition of the present invention is treated on a slide glass and 48 hours have elapsed.

단위로 이루어진 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)이다. 글루쿠론산 및 N-아세틸-D-글루코사민은 β(1→3) 연결되어 있으며, N-아세틸-D-글루코사민 및 글루쿠론산은 β(1→4)로 연결되어 있다. 히알루론산은 안구 유리액, 관절의 윤활액 및 세포외 기질(extracellular matrix)에 풍부하며, 피부의 보습 및 외부로부터의 감염에 대한 피부의 1차 방어벽 역할에 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 본 명세서에서의 히알루론산은 히알루론산 자체와 그것의 염을 모두 포함하는 개념으로, 용어 "히알루론산" 은 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산과 히알루론산 염의 혼합물을 의미한다. 상기 히알루론산 염에는, 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등과 같은 무기염과, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등과 같은 유기염이 포함된다. 경우에 따라서는, 이들의 둘 또는 그 이상의 조합이 사용될 수도 있다.It is a glycosaminoglycan composed of units. Glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine are linked by β (1→3), and N-acetyl-D-glucosamine and glucuronic acid are linked by β (1→4). Hyaluronic acid is abundant in ocular vitreous humor, joint synovial fluid, and extracellular matrix, and is known to help moisturize the skin and act as the skin's primary barrier against infection from the outside. In the present specification, hyaluronic acid is a concept including both hyaluronic acid itself and salts thereof, and the term "hyaluronic acid" means hyaluronic acid, a hyaluronic acid salt, or a mixture of hyaluronic acid and a hyaluronic acid salt. The hyaluronic acid salt includes inorganic salts such as sodium hyaluronate, potassium hyaluronate, calcium hyaluronate, magnesium hyaluronate, zinc hyaluronate, cobalt hyaluronate, and organic salts such as tetrabutylammonium hyaluronate. In some cases, a combination of two or more thereof may be used.

금화규(Aurea Helianthus)는 진귀한 약용식물로 일년생 초본식물이며 일명 야생부용이라고도 불리워 진다.　금화규의 꽃과 잎은 물론 꽃대와 뿌리에도 콜라겐이 풍부하고 해열, 해독, 항염증, 진통 효과 등 다양한 악성 통증 치료에 이용된다고 한다. 또한 천연 식물성 에스트로겐이 풍부하여 갱년기 증후군을 감소시키거나 연장하는데 도움을 준다. “금화규 추출물”에는 피부의 중요 조직 구성물인 콜라겐을 많이 함유하고 있는 것으로 알려져 있어서 외부로부터의 물리적 영향에 의한 피부 조직의 파괴를 억제하거나 차단해줄 수 있는 식물성 콜라겐과 다당체로 구성된 복합 다당체를 다량 함유하고 있는 것으로 알려져 있다. 본 명세서에서의 “금화규 추출물”은 물, 탄소수 1~4의 저급알코올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 n부탄올 등의 추출용매를 이용하여 추출한 물질을 사용할 수 있으며, 특별히 추출 방법에 제한이 있는 것은 아니다. Aurea Helianthus is a rare medicinal plant, an annual herbaceous plant, also called wild bouillon. The flowers and leaves, as well as the flower stalks and roots of Geumhwagyu are rich in collagen and are said to be used to treat various malignant pains, such as antipyretic, detoxifying, anti-inflammatory, and analgesic effects. It is also rich in natural phytoestrogens, which help reduce or prolong the menopausal syndrome. “Geumhwagyu extract” is known to contain a lot of collagen, which is an important tissue component of the skin. known to be doing As used herein, “Geumhwagyu extract” refers to a material extracted using an extraction solvent such as water, lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms, butylene glycol, propylene glycol, glycerin, hexane, methylene chloride, ethyl acetate, and n-butanol. and there is no particular limitation on the extraction method.

이하에서는, 실험예 및 도면을 참조하여, 히알루론산, 금화규 추출물 및 키토산을 포함하는 조성물 및 이의 제조 방법에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, with reference to the experimental examples and drawings, a composition comprising hyaluronic acid, an extract of Keumhwagyu extract and chitosan and a method for preparing the same will be described in detail.

(a) 히알루론산, 금화규 추출물 및 키토산을 혼합하는 단계;(a) mixing hyaluronic acid, Keumhwagyu extract and chitosan;

히알루론산, 금화규 추출물 및 키토산을 혼합한다. 히알루론산 100중량부에 대해 금화규 추출물 25중량부~200중량부 및 키토산 25중량부~200중량부를 혼합할 수 있다. 회전 교반기를 이용하여 혼합할 수 있으며, 균일한 혼합물을 형성할 수 있도록 충분히 교반한다.Hyaluronic acid, Keumhwagyu extract and chitosan are mixed. With respect to 100 parts by weight of hyaluronic acid, 25 parts by weight to 200 parts by weight of Geumhwagyu extract and 25 parts by weight to 200 parts by weight of chitosan may be mixed. It can be mixed using a rotary stirrer, and it is sufficiently stirred to form a uniform mixture.

(b) 히알루론산, 금화규 추출물 및 키토산의 혼합물을 유기산에 분산 및 용해하는 단계;(b) dispersing and dissolving a mixture of hyaluronic acid, Keumhwagyu extract and chitosan in an organic acid;

효소 반응을 위해 히알루론산, 금화규 추출물 및 키토산의 혼합물을 유기산에 분산 및 용해한다. 상기 유기산은 젖산, 초산, 포름산 및 아스코르브산으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 1종을 사용할 수 있다. 분산 및 용해하는 단계는 실온~70℃에서 수행되며, 특별히 제한되지는 않는다.For the enzymatic reaction, a mixture of hyaluronic acid, Keumhwagyu extract and chitosan is dispersed and dissolved in an organic acid. The organic acid may be any one selected from the group consisting of lactic acid, acetic acid, formic acid and ascorbic acid. The dispersing and dissolving steps are performed at room temperature to 70° C., and are not particularly limited.

혼합 균일도를 높이기 위해 vortex 또는 회전 교반기 등을 사용할 수 있으며, 키토산이 히알루론산 또는 금화규 추출물과 충분한 엉김이 생길 때까지 분산 및 용해한다. 여기서 엉김이란, 물질 간의 전기적, 이온에 의한, 또는 소수성 결합 등에 의해 불균일한 형태로 앙금이 형성되는 것을 의미하며, 형성된 앙금은 어느 정도 시간이 지나면 침전된다.To increase the mixing uniformity, a vortex or a rotary stirrer can be used, and the chitosan is dispersed and dissolved until sufficient agglomeration occurs with hyaluronic acid or Geumhwagyu extract. Here, agglomeration means that sediment is formed in a non-uniform form due to electrical, ion, or hydrophobic bonding between materials, and the formed sediment is precipitated after a certain amount of time.

완전한 수용액 상태가 되도록 하여 효소를 처리하는 방법과 다르게, 기질인 키토산의 효소에 대한 노출을 고분자성 물질 히알루론산이나 금화규 추출물의 농도 변화에 따라 다르게 할 수 있다.Unlike the method of treating the enzyme by making it a complete aqueous solution, the exposure of the substrate, chitosan, to the enzyme can be varied according to the change in the concentration of the high molecular weight substance hyaluronic acid or Geumhwagyu extract.

(c) 키토사나아제를 첨가하는 단계;(c) adding chitosanase;

상기 (b) 단계에서 생성된 반응액에 다당류의 분해 효소로서 키토사나아제를 첨가한다. 첨가하는 키토사나아제의 양은 상기 혼합물에 포함되어 있는 키토산을 충분히 분해할 수 있을 정도면 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 0.1~2.0 Unit/L이다. 키토사나아제에 의해 키토산은 올리고당 형태로 분해된다. 즉, 키토사나아제에 의해 키토산을 구성하는 글루코사민이 약 7~15개 연결된 크기로 분해된다.To the reaction solution produced in step (b) above, chitosanase as an enzyme for decomposing polysaccharides is added. The amount of chitosanase to be added is not particularly limited as long as it can sufficiently decompose chitosan contained in the mixture, and is preferably 0.1 to 2.0 Unit/L. Chitosan is broken down into oligosaccharides by chitosanase. That is, glucosamine constituting chitosan is decomposed into about 7 to 15 connected sizes by chitosanase.

(d) 25~70℃에서 키토산에 의한 엉김이 없어질 때까지 반응시키는 단계;(d) reacting at 25 ~ 70 ℃ until the agglomeration by chitosan disappears;

25~70℃ 사이에서 반응을 유도하고, 키토산에 의한 엉김이 없어질 때까지 반응을 지속하고, 엉김이 생기지 않을 때를 반응 종결점으로 한다. 여기서, 키토산에 의한 엉김은, 키토산과 히알루론산 또는 금화규 추출물과의 엉김을 의미한다. 올리고당 형태로 분해된 키토산은, 키토산에 비해 분자 크기가 작기 때문에, pH에 영향을 받지 않고 수용성이 되어, 효소 반응에 따라 엉김이 풀어질 수 있다.The reaction is induced between 25 and 70°C, the reaction is continued until the agglomeration by chitosan disappears, and the reaction end point is when agglomeration does not occur. Here, agglomeration by chitosan means agglomeration of chitosan and hyaluronic acid or an extract of Keumhwagyu. Since chitosan decomposed into an oligosaccharide form has a smaller molecular size than chitosan, it becomes water-soluble without being affected by pH, so that agglomeration can be released according to an enzymatic reaction.

(e) 90~100℃에서 5~10분간 처리하는 단계;(e) treating at 90-100° C. for 5-10 minutes;

반응 종료 후 90~100℃에서 5~10 분간 처리하여 키토사나아제를 불활성화 시킨다.After completion of the reaction, chitosanase is inactivated by treatment at 90-100° C. for 5-10 minutes.

(f) 여과하는 단계;(f) filtering;

반응물을 여과 필터로 여과하여 키토산 혼합 조성물을 제조한다. 여과 필터는 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 0.22~0.45 um 진공 여과 필터로 여과한다.The reactant is filtered through a filtration filter to prepare a chitosan mixture composition. The filtration filter is not particularly limited, and it is preferably filtered with a 0.22-0.45 um vacuum filtration filter.

상기와 같은 단계를 거쳐 제조된 키토산 혼합 조성물은, 60% 이상의 에탄올과 혼합하여 액상 또는 스프레이용 소독제, 세정제 등으로 사용할 수 있다.The chitosan mixture composition prepared through the above steps can be mixed with 60% or more of ethanol and used as a liquid or spray disinfectant, detergent, and the like.

또한, 상기 키토산 혼합 조성물은 수딩 겔(soothing gel) 제조에 사용될 수 있다. In addition, the chitosan mixture composition can be used to prepare a soothing gel (soothing gel).

실험예 1. Experimental Example 1.

상기 키토산 혼합 조성물의 제조 방법에 따라 제조된 키토산 혼합 조성물의 항균력을 시험하였다. 구체적인 제조 방법은 다음과 같다.The antimicrobial activity of the chitosan mixed composition prepared according to the method for preparing the chitosan mixed composition was tested. A specific manufacturing method is as follows.

2%(w/v) 농도의 금화규 추출물 1ml(밍지chu에서 구입한 금화규를 증류수에 넣고 실온에서 2시간 추출후, 13,000rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 상층액 1ml 취함), 2%(w/v) 농도의 히알루론산 용액(KOLON Life Science, Inc.에서 구입) 1ml 및 2%(w/v) 농도의 수용성 키토산(속초물산에서 구입) 1ml를 혼합한다.2% (w/v) concentration of gold hwagyu extract 1ml (Pour gold hwagyu purchased from Mingjichu in distilled water, extract at room temperature for 2 hours, centrifuge at 13,000 rpm for 5 minutes to take 1 ml of the supernatant), 2% ( w/v) concentration of hyaluronic acid solution (purchased from KOLON Life Science, Inc.) 1ml and 2% (w/v) concentration of water-soluble chitosan (purchased from Sokcho Mulsan) 1ml are mixed.

히알루론산, 금화규 추출물 및 키토산의 혼합물을 유기산으로서 0.5% 젖산 27ml에 첨가하여 교반함으로써, 분산 및 용해시킨다. 추가로 키토사나아제(Sigma Aldrich에서 구입) 0.01 unit/2uL를 첨가하고, 37℃에서 키토산에 의한 엉김이 없어질 때까지 반응을 계속한다.A mixture of hyaluronic acid, Keumhwagyu extract and chitosan as an organic acid was added to 27 ml of 0.5% lactic acid and stirred to disperse and dissolve. In addition, 0.01 unit/2uL of chitosanase (purchased from Sigma Aldrich) is added, and the reaction is continued at 37° C. until the agglomeration by chitosan disappears.

반응 종료 후, 생성된 반응액을 원심 분리(13,000rpm, 5분)하여 상층액 25ml를 취하여 반응 원액으로 한다.After completion of the reaction, the resulting reaction solution is centrifuged (13,000 rpm, 5 minutes), and 25 ml of the supernatant is taken as a reaction stock solution.

반응원액과 에탄올을 3:7(부피비)로 혼합하여 제조된 혼합액을 이용하여 시험하였다.The test was conducted using a mixture prepared by mixing the reaction stock solution and ethanol at a ratio of 3:7 (volume ratio).

멸균된 부직포에 미산성 차아염소산수(HOCl), 70% 에탄올, 5 ppm 이산화염소수(ClO2) 등 여러 종류의 살균 소독제와 상기와 같이 제조된 혼합액을 각각 처리하여 상온에서 48시간 건조 후, MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)를 1×106 cfu/mL 농도로 상기 부직포에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한다.The sterilized non-woven fabric was treated with several types of sterilizing disinfectants such as non-acidic hypochlorous acid (HOCl), 70% ethanol, and 5 ppm chlorine dioxide (ClO 2 ) and the mixed solution prepared as above, and dried at room temperature for 48 hours. Inoculate the nonwoven fabric with MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus ) at a concentration of 1×10 6 cfu/mL and incubate at 37° C. for 24 hours.

이후 배양된 세균을 LB(Luria broth) Agar plate에 도말하여 세균의 증식 유무를 확인한 결과를 도 1에 나타낸다.Thereafter, the cultured bacteria were smeared on an LB (Luria broth) Agar plate, and the results of confirming the proliferation of the bacteria are shown in FIG. 1 .

도 1에 나타낸 바와 같이, 부직포에 본 발명의 키토산 혼합 조성물이 처리된 실험군에서 세균이 관찰되지 않은 것에 비해, 다른 실험군에서는 세균의 증식이 감소되는 것을 확인할 수 없었다. 즉, 본 발명의 키토산 혼합 조성물이 처리된 실험군에서 매우 유의적인 항균 지속성을 나타내었음이 확인되었다.As shown in Figure 1, compared to that in the experimental group treated with the chitosan mixture composition of the present invention on the nonwoven fabric, bacteria were not observed, it could not be confirmed that the proliferation of bacteria was reduced in the other experimental groups. That is, it was confirmed that the chitosan mixture composition of the present invention exhibited very significant antibacterial persistence in the treated experimental group.

실험예 2. Experimental Example 2.

상기 실험예 1에서 사용한 키토산 혼합 조성물을 이용하여, 유리 표면에서의 항균 지속성을 관찰하였다. 유리 표면에 키토산 혼합 조성물을 처리하고 48시간 후 처리 표면의 항균력을, JIS Z 2801/IOS 22196 Measurement of Antibacterial Activity on Plastics Surfaces (Plastics)에 따라 시험하였다.Using the chitosan mixture composition used in Experimental Example 1, antibacterial persistence on the glass surface was observed. After 48 hours of treating the glass surface with the chitosan mixture composition, the antibacterial activity of the treated surface was tested according to JIS Z 2801/IOS 22196 Measurement of Antibacterial Activity on Plastics Surfaces (Plastics).

슬라이드 글라스 위에 미산성 차아염소산수(HOCl), 70% 에탄올, 5 ppm 이산화염소수(ClO2) 등 여러 종류의 살균 소독제와 본 발명의 키토산 혼합 조성물을 각각 처리하여 36℃에서 24시간 건조 후, 여기에 MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) 를 1×106 cfu/mL 농도로 처리한 다음, 커버 글라스를 덮고 36℃에서 24시간 배양 후 현미경으로 관찰한 결과를 도 2에 나타낸다.On a slide glass, several types of sterilizing and disinfecting agents such as non-acidic hypochlorous acid (HOCl), 70% ethanol, and 5 ppm chlorine dioxide (ClO 2 ) and the chitosan mixture composition of the present invention were treated, respectively, and dried at 36 ° C for 24 hours. Here, MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus ) was treated at a concentration of 1×10 6 cfu/mL, covered with a cover glass, incubated at 36° C. for 24 hours, and observed under a microscope at FIG. 2 .

도 2에 나타낸 바와 같이, 슬라이드 글라스에 본 발명의 키토산 혼합 조성물이 처리된 실험군에서 세균이 관찰되지 않은 것에 비해, 다른 실험군에서는 세균의 증식이 감소되는 것을 확인할 수 없었다. 즉, 본 발명의 키토산 혼합 조성물이 처리된 실험군에서 매우 유의적인 항균 지속성을 나타내었음이 확인되었다.As shown in FIG. 2 , compared to that no bacteria were observed in the experimental group treated with the chitosan mixture composition of the present invention on the slide glass, it could not be confirmed that the proliferation of bacteria was reduced in the other experimental groups. That is, it was confirmed that the chitosan mixture composition of the present invention exhibited very significant antibacterial persistence in the treated experimental group.

결론conclusion

본 발명에 따르면, 키토산의 수용액 상태에서의 무작위 효소 반응에 따른 매우 저분자로의 전환을 방지하고, 보다 항균력이 우수한 분자 크기 조절을 위해, 키토산에 히알루론산과 금화규 추출물을 일정 농도로 혼합하고, 균일도 높은 물질간의 혼합물에 효소(키토사나아제)를 처리하는 과정을 통해 선택적 가수분해가 이루어지도록 하였다. 이를 통해 혼합물의 엉김 현상이 완화되고, 수용성 상태로 되었을 때 반응을 종결함으로써 반응 종결점 확인이 매우 편리하며, 또한 키토산의 가수분해를 조절할 수 있다. 상기 실험을 통해 제조된 키토산 혼합 조성물이 항균제나 상처 치료용 등으로 활용 가능할 수 있음을 확인하였다. 상기 실험예 1 및 2에서 제시한 것처럼 다른 종류의 처리법에 비해 매우 유의적이고 효과적인 항균 활성을 확인하였다. 따라서 항균제, 소독제, 화장품 등 다양한 제품 개발의 주원료 또는 첨가제로 사용될 수 있다.According to the present invention, hyaluronic acid and Geumhwagyu extract are mixed with chitosan at a certain concentration to prevent conversion of chitosan to a very low molecule due to a random enzymatic reaction in an aqueous solution state and to control the molecular size with better antibacterial activity, Selective hydrolysis was made through the process of treating an enzyme (chitosanase) in a mixture between substances with high uniformity. Through this, the agglomeration of the mixture is alleviated, and it is very convenient to check the end point of the reaction by terminating the reaction when it is in a water-soluble state, and it is also possible to control the hydrolysis of chitosan. It was confirmed that the chitosan mixture composition prepared through the above experiment can be used as an antibacterial agent or for wound treatment. As shown in Experimental Examples 1 and 2, a very significant and effective antibacterial activity was confirmed compared to other types of treatment. Therefore, it can be used as a main raw material or additive for the development of various products such as antibacterial agents, disinfectants, and cosmetics.

Claims (7)

히알루론산, 금화규 추출물 및 키토산을 포함하는, 키토산 혼합 조성물.A chitosan mixed composition comprising hyaluronic acid, an extract of Keumhwagyu extract and chitosan. 제 1 항에 있어서,상기 히알루론산 100중량부에 대해 상기 금화규 추출물 25~200중량부 및 상기 키토산 25~200중량부를 포함하는, 키토산 혼합 조성물.The chitosan mixture composition according to claim 1, comprising 25 to 200 parts by weight of the Geumhwagyu extract and 25 to 200 parts by weight of the chitosan with respect to 100 parts by weight of the hyaluronic acid. 하기 단계를 이 순서대로 포함하는, 제 1 항의 키토산 혼합 조성물의 제조 방법:(a) 히알루론산, 금화규 추출물 및 키토산을 혼합하는 단계;(b) 히알루론산, 금화규 추출물 및 키토산의 혼합물을 유기산에 분산 및 용해하는 단계;(c) 키토사나아제를 첨가하는 단계;(d) 25~70℃에서 키토산에 의한 엉김이 없어질 때까지 반응시키는 단계;(e) 90~100℃에서 5~10분간 처리하는 단계;(f) 여과하는 단계.A method for preparing the chitosan mixture composition of claim 1, comprising the following steps in this order: (a) mixing hyaluronic acid, a gold-silver extract, and chitosan; Dispersing and dissolving in; (c) adding chitosanase; (d) reacting at 25 to 70 ° C. until the agglomeration by chitosan disappears; (e) 5 to 10 at 90 to 100 ° C. Minute treatment; (f) filtration. 제 3 항에 있어서,상기 (a) 단계에서, 상기 히알루론산 100중량부에 대해 상기 금화규 추출물 25~200중량부 및 상기 키토산 25~200중량부를 혼합하는, 키토산 혼합 조성물의 제조 방법.The method of claim 3, wherein in step (a), 25 to 200 parts by weight of the Geumhwagyu extract and 25 to 200 parts by weight of the chitosan are mixed with respect to 100 parts by weight of the hyaluronic acid. 제 3 항에 있어서,상기 (b) 단계에서, 상기 유기산은 젖산, 초산, 포름산 및 아스코르브산으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 1종인, 키토산 혼합 조성물의 제조 방법.The method of claim 3, wherein in step (b), the organic acid is any one selected from the group consisting of lactic acid, acetic acid, formic acid and ascorbic acid. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,상기 (c) 단계에서, 상기 키토사나아제는 0.1~2.0 Unit/L 첨가되는, 키토산 혼합 조성물의 제조 방법.According to claim 3 or 4, In the step (c), the chitosanase is 0.1 ~ 2.0 Unit / L is added, the method for producing a chitosan mixture composition. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,상기 (f) 단계에서, 0.22~0.45㎛ 크기의 구멍을 갖는 진공 여과 필터로 여과하는, 키토산 혼합 조성물의 제조 방법.According to claim 3 or 4, In the step (f), filtration with a vacuum filtration filter having a hole of 0.22 ~ 0.45㎛ size, the method for producing a chitosan mixture composition.
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