KR20220116507A - 섬유증을 평가하고 치료하는 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
스태필로코커스 네팔렌시스(Staphylococcus nepalensis)는 폐 상피 세포의 아폽토시스를 유도하는, 다양한 스태필로코커스에서 보존된 펩티드인 코리신을 분비한다. 따라서, 환자의 생물학적 시료에서 코르신의 존재를 검출하는 방법 및 장치, 및 섬유증을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 환자를 치료하기 위한, 항체와 같은 약학적 조성물 및 방법이 개시된다.
Description
교차 참조
본 출원은 그 내용이 전체로 본원에 포함된, 2019년 12월 17일에 제출된 미국특허출원 제62/948,983호에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 일반적으로 폐섬유증의 급성 악화(acute exacerbation)를 유도하는 것으로 확인된 스태필로코커스 아폽토시스-촉진성 펩티드(pro-apoptotic peptide) (본원에서 "코리신(corisin)"으로 지칭됨), 및 환자에서 섬유증을 진단 또는 평가하는 방법, 키트, 및 장치, 및 특발성 폐섬유증과 같은, 섬유증을 개선 또는 치료하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
특발성 폐섬유증 (IPF)은 미확인 병인의 만성 치명적 질환이다; 그러나, 폐포 상피 세포의 아폽토시스가 질병 진행에 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이 난치성 질환은 폐에서 스태필로코커스 및 스트렙토코커스의 증가된 양과 연관되나, 발병에서 그들의 역할은 파악하기 어려운 것으로 남아있다.
IPF는 만성적이고, 진행성이며, 치명적인 임상적 결과를 특징으로 하는 특발성 간질성 폐렴(interstitial pneumonitis)의 가장 빈번한 형태이다. NPL1 및 NPL2를 참조한다(표시 "NLP"에 의해 본원에서 식별된 모든 비-특허 문헌 문서(Non-Patent Literature Documents)에 대한 완전한 인용이 본 명세서의 말미에 제공된다). IPF의 예후는 다수의 다른 종류의 악성종양에서보다 더 나쁘고, 이 질환의 진단 후 환자의 기대 여명은 단지 2 내지 3년이다. NPL3 및 NPL4를 참조한다. 폐 상피 세포의 반복적 손상 및/또는 아폽토시스, 섬유증 촉진성(profibrotic) 인자들의 과다 분비, 및 세포외 매트릭스-생산 근섬유아세포의 증가된 폐 동원(recruitment)이 질병 발병에서 중요한 역할을 수행한다. NPL2 및 NPL5를 참조한다.
NPL6은 폐 마이크로비옴(microbiome)이 IPF에서 원인적 역할을 수행하고, 증가된 폐 박테리아 부담(bacterial burden)이 상기 질병의 급성 악화 및 높은 사망률과 연관된다는 것을 시사한다. NPL7에 기재된 바와 같이, 스태필로코커스 및 스트렙토코커스 속의 폐 미생물의 상대적 풍부함이 또한 IPF의 임상적 진행의 가속과 연관되었다. 그러나, 폐섬유증의 발병에서 이러한 박테리아의 역할은 불명확한 것으로 남아있다. 섬유성 조직과 연관된 박테리아를 배양하는 능력 및 그들의 표현형 특징의 규명이 IPF의 발병에 관련된 개체를 명확하게 파악하는데 있어서, 이상적일 것이다; 그러나, 발병과 관련된 박테리아 단리물(bacterial isolate)의 보다 이전의 보고는 없는 것으로 사료된다.
NPL8 및 NPL9에서, IPF 환자 및 폐섬유증을 갖는 TGF(transforming growth factor)β1 형질전환(TG) 마우스로부터의 폐섬유증 조직은 호염성 박테리아의 농축(enrichment)을 특징으로 한다는 것이 입증되었다. NPL4는 이러한 관찰을 구체화한다.
발명의 요약
NPL8 및 NPL9의 결과는 본 발명자들이 섬유증 조직은 염분성 미세환경(salty microenvironment)이고, 폐섬유증 조직의 고염(hypersaline) 조건이 IPF 발병 및 그의 급성 악화에서 역할을 하는 인자들을 분비하는 박테리아의 증식을 촉진한다는 가정을 수립하게 했다.
본원에 기재된 전개 및 이해를 가져온 본 발명자들의 연구에서, 본 발명자들은 TGFβ1 TG 마우스로부터 기원한 폐섬유증 조직 시료로부터 스태필로코커스 스트레인을 농축시키기 위해 호염성 배지를 사용했다. 그 결과, 본 발명자들은 박테리아 스트레인 중 하나, 즉, 스태필로코커스 네팔렌시스 (S. nepalensis) 스트레인 CNDG의 배양물 상층액이 폐 상피 세포의 아폽토시스를 유도하는 아폽토시스-촉진성 펩티드를 포함한다는 것을 밝혔다.
본 발명자들은 또한 본원에서 "코리신"으로 표시된, 이 아폽토시스-촉진성 펩티드가 스태필로코커스 속의 다양한 일원들에서 보존된 트랜스글리코실라아제의 성분이고, 확립된 폐섬유증을 갖는 마우스에 코리신 또는 코리신-코딩 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG를 기관내 주입(intratracheal instillation)하면 폐섬유증의 급성 악화를 초래한다는 것을 밝혔다.
또한, 급성 악화를 갖는 인간 IPF 환자에서 코리신의 증가된 검출을 수행하고, 이 결과들을 질병 악화가 없는 환자와 비교하는 것에 의해, 본 발명자들은 아폽토시스-촉진성 펩티드를 운반하고, 방출(shed)하는 박테리아가 폐섬유증의 급성 악화에 관련되는 것으로 결론지었다.
보다 구체적으로, 본 발명자들은 스태필로코커스 네팔렌시스가 폐 상피 세포의 아폽토시스를 유도하기 위해, 다양한 스태필로코커스에서 보존된 펩티드인 코리신을 분비한다는 것을 밝혔다. 마우스에서 이 질환은 코리신의 폐내 주입(intrapulmonary instillation) 후 또는 코리신-보유 스태필로코커스 네팔렌시스의 폐 주사 후, 미처리 마우스 또는 코리신이 결핍된 박테리아에 의해 감염된 마우스 대비 급성 악화를 보인다. 상응하게, 폐 코리신 수준은 질병 악화가 없는 환자 대비, 급성 악화를 갖는 인간 IPF 환자에서 유의성있게 증가된다. 이는 코리신을 방출하는 박테리아가 IPF의 급성 악화와 관련된다는 결론을 가져왔고, 폐섬유증에서 스태필로코커스의 상승 및 폐섬유증의 악화 단계와 스태필로코커스의 연관에 대한 분자적 기반에 대한 이해를 제공한다.
이러한 전개 및 이해에 근거하여, 본 발명자들은 본 교시의 하기 양태들을 개발했다.
본 교시의 일 양태에서, 환자의 생물학적 시료에서 코리신의 존재를 검출하는 것을 포함하고, 바람직하게는 인 비트로에서 수행되는 검출인 것인 방법, 키트, 및 장치가 개시된다. 상기 코리신은 예를 들면, 본원에 개시된 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 또는 서열번호 13 중 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 방법, 키트, 및/또는 장치는 환자에서 특발성 폐섬유증 (IPF), 간경화증, 신장 섬유증, 낭포성 섬유증, 골수 섬유증, 및/또는 유방 섬유증과 같은 섬유증의 평가 및/또는 진단에서 이용될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 방법, 키트, 및/또는 장치는 특발성 폐섬유증 (IPF)의 검출 및/또는 평가에서 이용될 수 있다.
그러한 방법, 키트, 또는 장치에서, 코리신은 질량 분광분석법, 웨스턴 블롯팅, 및/또는 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 검출될 수 있고, 바람직하게는 인 비트로에서, 코리신의 항체로의 결합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 항체는, 예를 들면, 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 또는 서열번호 13의 아미노산 서열 중 하나를 인식 (결합)할 수 있다.
본 교시의 또 다른 양태에서, 코리신에 결합하는 항체가 개시된다.상기 항체는 본원에 개시된, 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 또는 서열번호 13의 아미노산 서열 중 하나를 인식 (결합)할 수 있고, 다중클론 항체일 수 있다.
상기 항체는 섬유증을 갖거나, 또는 섬유증을 갖거나 또는 발병할 것으로 의심되는 환자에서 섬유증의 예방, 개선 및/또는 치료에서 약제로 이용될 수 있다. 예를 들면, 상기 항체는 필요로 하는 환자에게 투여될 약제로서의 용도를 위한 약학적 조성물로 제공될 수 있다.
그러한 약학적 조성물은 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 첨가제, 염, 및/또는 부형제, 예를 들면, 보존제, 사카라이드, 가용화제, 안정화제, 담체, 희석제, 벌킹제(bulking agent), pH 완충제, 등장화제(tonicifying agents), 항미생물제, 습윤제, 및/또는 유화제를 바람직하게는 중량 기준 0.005% 내지 99%, 예를 들면, 중량 기준 0.5% 내지 98%의 양(예를 들면, 2개 이상이 존재하는 경우, 합쳐진 양)으로 포함할 수 있다.
상기 항체는 특발성 폐섬유증 (IPF), 간경화증, 신장 섬유증, 낭포성 섬유증, 골수 섬유증, 및/또는 유방 섬유증의 예방, 개선 및/또는 치료에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 항체는 특발성 폐섬유증 (IPF)의 예방, 개선 및/또는 치료에서 사용될 수 있다. 상기 항체는 중화 항체, 예를 들면, 섬유증을 앓는 환자의 폐 또는 기타 조직에서 코리신의 부정적 효과를 차단 또는 억제하는 항체일 수 있다.
본 교시의 추가적 양태에서, 섬유증의 치료를 필요로 하는 환자에서 섬유증을 치료하는 방법은 전술된 항체의 치료 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 항체는 상기 환자의 한쪽 폐 또는 양쪽 폐에 투여될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 상기 항체는 복강내로 또는 기관내 주입(intratracheal instillation)에 의해, 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 상기 항체의 투여는 바람직하게는 적어도 상기 개체에서 섬유증의 중증도를 감소시킨다.
모든 진단 및/또는 평가의 방법은 바람직하게는 전술 또는 후술되는 섬유증의 타입들과 같은, 섬유증을 갖거나, 또는 섬유증을 갖거나 또는 발병할 것으로 의심되는 환자로부터 추출되거나, 수집되거나, 수득된 생물학적 시료에 대해 인 비트로에서 수행된다는 것에 주목한다.
본 교시의 다른 목적, 양태, 구체예, 및 장점들이 도면 및 첨부된 청구항을 고려하여 하기의 상세한 설명을 읽으면 당업자에게 자명해질 것이다.
본 교시의 또 다른 양태에서, 섬유증을 갖거나, 또는 섬유증을 갖거나 발병할 것으로 의심되는 개체를 평가하거나 진단하는 방법은 상기 개체로부터 수집되거나, 회수되거나, 수득되거나, 또는 그와 등가에 의한 것인 인 비트로 생물학적 시료를 받는 단계; 및 상기 인 비트로 생물학적 시료에 존재하는 코리신의 양을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 그러한 방법은 상기 인 비트로 생물학적 시료 중 코리신의 검출된 양을 하나 이상의 미리 결정된 역치(predetermined thresholds)와 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다. 미리 결정된 역치는 예를 들면, 건강한 개체에 일반적으로 (정상적으로) 존재하는 코리신의 수준에 근거하여, 설정될 수 있다.
상기 생물학적 시료는 상기 개체의 한쪽 폐 또는 양쪽 폐로부터 수집될 수 있다.
상기 생물학적 시료는 예를 들면, 객담, 기관지 분비물(bronchial secretion), 흉막 삼출액(pleural effusion), 기관지폐포 세척액 (bronchoalveolar lavage fluid: BALF), 및 기관지 또는 폐로부터 수집된 조직일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 혈액 또는 기관지폐포 세척액 (BALF)일 수 있다.
이러한 방법들에서, 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 또는 서열번호 13의 아미노산 서열 중 하나의 검출이 바람직하게는 코리신의 검출로 기능한다.
이러한 방법들에서, 상기 환자는 특발성 폐섬유증 (IPF), 간경화증, 신장 섬유증, 낭포성 섬유증, 골수 섬유증, 및/또는 유방 섬유증을 갖거나, 또는 갖거나 발병할 것으로 의심될 수 있다. 특히, 본 발명의 방법은 특발성 폐섬유증 (IPF)을 갖는 환자에서의 사용을 위해 유리하다.
상기 코리신은 질량 분광분석법, 웨스턴 블롯팅, 또는 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해, 예를 들면, 항체, 예를 들면, 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 또는 서열번호 13의 아미노산 서열 중 하나를 인식하는 항체에 결합된 코리신을 검출하거나, 예를 들면, 항체에 결합된 코리신 (예를 들면, 기질에 결합된 항체)에 표지된 항체를 결합시키는 것에 의해 검출될 수 있다. 그러한 방법을 수행하기 위한 키트는 그러한 항체 및 생물학적 시료 중 코리신의 검출을 달성하는 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다.
본 교시의 또 다른 양태에서, 환자에서 섬유증의 치료에서 사용하기 위한 약학적 조성물이 개시된다. 상기 약학적 조성물은 바람직하게는 상기 환자의 폐에서 코리신을 중화시키고 및/또는 상기 환자의 폐에서 코리신의 양을 감소시킬 수 있는 코리신-억제제를 포함한다.
상기 코리신-억제제는 예를 들면, 소분자(small molecule), 코리신의 길항제, 또는 코리신에 대한 항체일 수 있다. 상기 코리신-억제제는 예를 들면, 코리신에 결합하거나, 코리신을 분해하거나, 또는 코리신의 생산을 차단 또는 억제하는 것에 의해 작용할 수 있다.
상기 코리신-억제제는 특발성 폐섬유증 (IPF), 간경화증, 신장 섬유증, 낭포성 섬유증, 골수 섬유증, 및/또는 유방 섬유증, 특히, 특발성 폐섬유증 (IPF)을 갖거나, 또는 갖거나 발병할 것으로 의심되는 환자를 치료하기 위해 이용될 수 있다.
본 교시의 또 다른 양태에서, 코리신 수용체 단백질을 확인(identify)하는 방법은 상피 세포의 표면에 존재하는 코리신-결합 단백질을 찾는 단계를 포함할 수 있다.
본 교시의 또 다른 양태에서, 코리신 수용체 단백질을 확인하는 방법은 상피 세포의 표면에 존재하는 결합 단백질 중 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 또는 서열번호 13의 아미노산 서열 중 하나를 찾는 단계를 포함한다.
본 교시를 가져온 연구의 결과, 그의 검토, 및 본 연구에서 사용된 구체적인 방법이 하기에서 제공된다.
결과
섬유증 폐조직은 염분성 미세환경(salty microenvironment)이다
TGFβ1 (transforming growth factor)이 IPF의 가장 중요한 매개체(mediator)인 것으로 간주된다. 따라서, 하기에 상세하게 기술되는 실험에서, 본 발명자들은 이전에, 예를 들면, NPL8, NPL1O, NPL11 및 NPL12에 보고된 바와 같이, 인간 TGFβ1의 폐 과발현에 의해 유도된 폐섬유증을 갖는 형질전환 (TG) 마우스를 이용했다. 인간에서의 IPF 질환과 유사하게, 이러한 TGFβ1 TG 마우스는 현저한 진행성 상처형성(scarring) 과정, 치명적 결과, 및 전형적인 폐 조직병리학적 소견(미만 콜라겐 침착(diffuse collagen deposition), 봉소상 낭종(honeycomb cysts), 섬유아세포 병소-유사 영역(fibroblast foci-like areas))을 특징으로 하는 폐섬유증을 자발적으로 발병한다. NPL8 및 NPL11을 참조한다. 대조군으로서, 본 발명자들은 인간 형질전환 유전자를 발현하나, 그 단백질은 발현하지 않는, 섬유증이 없는 TGFβ1 TG 마우스의 계통을 이용했다. NPL8 및 NPL13을 참조한다.
폐섬유증 조직이 염분성 미세환경이라는 가설을 분석하기 위해, 본 발명자들은 CT(computed tomography)-기반 섬유증 점수(도 9a 및 9b 참조)에 따라 TGFβ1 TG 마우스와 야생형 (WT) 마우스를 그룹으로 배정하는 것에 의해, 섬유증이 있는 TGFβ1 TG 마우스로부터 폐섬유증 조직의 Na+ 함량을 측정했다 (NPL8 참조).
보다 구체적으로, 도 9a는 하기에 기술된 방법에 따라 수득된 CT(computed tomography) 이미지를 보여준다: 1점: 정상 소견(normal findings); 2점: 중간(intermediate); 3점; 경증 섬유증(mild fibrosis); 4점: 중간; 5점, 중등증 섬유증(moderate fibrosis); 6점: 중간; 및 7점: 중증 섬유증. 6명의 호흡기내과 의사의 평균 점수를 개별적인 마우스의 CT 점수로 채택하였다.
도 9b는 하기에서 기술된 방법에 따라 측정된 Ashcroft 섬유증 점수 및 히드록시프롤린 함량을 보여준다. 20 내지 25 g의 체중을 갖는 10주령 마우스를 실험에서 사용했다. N=23 마리의 마우스. CT 점수는 Ashcroft 점수 (r=0.78; p<0.0001) 및 폐의 히드록시프롤린 함량 (r=0.84; p<0.0001)과 유의성있게 상관관계를 가졌다. 통계적 분석을 피어슨 상관관계 (Pearson-product moment correlation)에 따라 수행했다.
이 실험의 결과, 본 발명자들은 폐섬유증이 없는 TG 마우스 및 WT 마우스 대비 폐섬유증이 있는 TGFβ1 TG 마우스로부터의 폐 조직에 Na+의 훨씬 더 높은 농도가 있다는 것을 발견했다 (도 1a-1c 참조). 이러한 관찰은 폐섬유증 조직이 염분성 미세환경이라는 것을 입증했다.
폐섬유증 조직의 비정상적 면역 반응
본 발명자들은 섬유증이 없는 WT 마우스, 폐섬유증이 없는 TGFβ1 TG 마우스, 및 섬유증이 있는 TGFβ1 TG 마우스 각각으로부터 페 면역 세포를 분리하고 그룹들간에 세포의 비율을 비교했다. 본 발명자들은 WT 마우스 및 폐섬유증이 없는 TGFβ1 TG 마우스 대비 폐섬유증이 있는 TGFβ1 TG 마우스에서 단핵세포/대식세포 및 조절 (CD4+CD25+) T 세포의 비율에서 유의성 있는 증가를 발견했다 (도 10a 및 10b 및 하기 표 1 참조). 전체 T 세포의 비율은 그룹들 간에 다르지 않았으나, B 세포의 비율은 WT 마우스 및 폐섬유증이 없는 TGFβ1 TG 마우스 대비 폐섬유증이 있는 TGFβ1 TG 마우스에서 상당히 감소했다 (도 IOc 및 10d 참조). 이러한 관찰은 폐섬유증 조직에서 손상된 면역 반응의 증거를 제공했다.
보다 구체적으로, 도 10a-10d는 각각, 하기에서 더 기술되는 방법에서와 같이 특이적 항체를 이용한 유동 세포분석에 의해 계수된, 야생형 (WT) 마우스 (n=4), 섬유증이 있는 TGFβ1 형질전환 (TG) 마우스 (n=4) 및 섬유증이 없는 TGFβ1 형질전환 (TG) 마우스 (n=4)로부터의 폐섬유증 조직 중 단핵세포/대식세포, CD4CD25 세포, T 세포 및 B 세포의 비율을 보여준다. 막대는 평균 ± S.D.를 나타낸다. 통계적 분석은 ANOVA 및 Tukey 검정을 이용하여 수행했다. *p<0.05, **p<0.01.
소듐, 면역 세포, 섬유증 마커, 및 소듐 채널
섬유증 마커 (결합 조직 성장 인자(Ctgf), 피브로넥틴 1, 콜라겐 I) 및 섬유증-촉진성 사이토카인 (TGFβ1, TNF(tumor necrosis factor)-α, 인터페론-γ), 케모카인 (MCP(monocyte chemoattractant protein)-1), 혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF), 또는 유도성 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase: iNOS)의 폐 조직 상대적 mRNA 발현이 WT 마우스 및 폐섬유증이 없는 TGFβ1 TG 마우스 대비 폐섬유증이 있는 TGFβ1 TG 마우스에서 유의하게 증가했다 (하기 표 2 참조).
그러나, 클로라이드 (chloride) (Cftr(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)) 채널 및 소듐 (Scnnγ, Scnnβ) 채널은 WT 마우스 및 폐섬유증이 없는 TGFβ1 TG 마우스 대비 폐섬유증이 있는 TGFβ1 TG 마우스에서 유의하게 감소했다 (하기 표 2 참조). 따라서, 본 발명자들은 모든 WT 마우스 및 섬유증이 있는 TGFβ1 TG 및 섬유증이 없는 TGFβ1 TG 마우스에서 변수간 상관관계를 평가했다.
결과로서, 본 발명자들은 소듐의 조직 수준은 클로라이드 및 소듐 채널의 mRNA 발현 및 B 세포의 개수와 역으로 및 유의성있게 상관관계를 갖는다는 것을 확인했다. 대조적으로, 조직 소듐 수준은 섬유증 인자(fibrotic factor), 섬유증-촉진성(pro-fibrotic) 사이토카인, 및 단핵세포/대식세포 및 조절 T 세포의 개수와 비례적으로 및 유의성있게 상관관계를 가졌다 (도 11 참조).
보다 구체적으로, 폐 조직에서 소듐의 농도, 섬유증 인자, 섬유증-촉진성 사이토카인, 케모카인, 혈관신생 인자(angiogenic factor)의 발현 및 면역 세포의 비율을 야생형 (WT) 마우스 (n=4), 섬유증이 있는 TGFβ1 형질전환 (TG) 마우스 (n=4) 및 섬유증이 없는 TGFβ1 형질전환 (TG) 마우스 (n=4)로부터의 폐 조직에서 평가했다. 스피어만 상관 (Spearman correlation) r 값이 도 11에 도시된다. Ctfr, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator; Scnnlα, sodium channel epithelial 1α subunit; Scnn1β, sodium channel epithelial 1β subunit; Scnn1γ, sodium channel epithelial 1γ subunit; TNFα, tumor necrosis factorα; IFNγ, interferonγ; Ctgf, connective tissue growth factor; mTGFβ1, mouse transforming growth factor β1; Vegf, vascular epithelial growth factor; iNOS, inducible nitric oxide synthase; Mcp-1, monocyte chemoattractant protein-1; αSMA, αsmooth muscle actin; Fnl, fibronectin 1; Collαl, collagen lαl. 통계적 분석은 스피어만 상관관계에 의해 수행했다. *p<0.05.
이러한 발견은 조직 섬유화의 과정에서 염분성 미세환경의 유해한 역할 및 면역 반응의 조절에서 조직 소듐 수준의 관련의 증거는 제공한다. 또한 NPL14를 참조한다.
섬유증 폐 조직으로부터의 박테리아의 증식
섬유증 조직이 염분성 미세환경이라는 것을 확인한 후, 본 발명자들은 고염(hypersaline) 배양 배지가 인 비보 섬유증 조직 조건을 가장 잘 모사하고, 따라서, 질병 발병에 관련된 미생물의 증식에 유리할 것으로 가정했다.
따라서, 본 발명자들은 TGFβ1 TG 및 WT 마우스로부터의 폐섬유증 조직 시료를 8% NaCl을 함유하는 배지에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다(도 2a 및 2b 참조). TGFβ1 TG 마우스로부터의 폐섬유증 시료로 접종된 배지에서 박테리아 증식이 검출되었으나, WT 마우스로부터의 시료로 접종된 배지에서는 검출되지 않았다. 그 후, 본 발명자들은 박테리아 콜로니를 단리하기 위해 획선 접종(steak plating)을 수행하고, 위상차 현미경을 이용하여, 스태필로코커스 종과 맞는 박테리아 형태를 관찰했다 (도 2c 참조). PCR (polymerase chain reaction)에 의해 증폭된 16S rRNA 유전자의 시퀀싱에 의해 박테리아 스트레인의 실체를 확인했다.
그러나, 전체 게놈 서열의 결정은 콜로니 중 하나 (스트레인 8)가 스태필로코커스 네팔렌시스의 스트레인에 해당하고, 또 다른 콜로니 (스트레인 6)는 스태필로코커스 종의 혼합물이라는 것을 보여주었다. 스트레인 6 및 스트레인 8로 표시된 배양물의 전체 게놈 서열을 수탁 번호 PRJNA544423로 Genbank 데이터베이스에 기탁했다.
스트레인 8의 실체를 더 확인하기 위해, 본 발명자들은 그의 전체 게놈 서열을 Genbank 데이터베이스에 있는 다른 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인의 전체 게놈 서열과 비교했고, 스트레인 JS9, SNUC4337, DSM15150, JS11, 및 JS1에 대해, 동일성이 각각 99.52%, 99.61%, 99.60%, 99.53% 및 99.50%이었다. 따라서, 스트레인 8의 순도 및 그의 다른 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인에 대한 매우 높은 게놈 상동성에 근거하여, 스트레인 8의 박테리아를 CNDG의 스트레인 명칭(designation)을 갖는 스태필로코커스 네팔렌시스로 명명했다.
배양물 상층액에 의해 유도된 폐 세포의 아폽토시스
질병 발병에서 이러한 섬유증 조직-유래 박테리아 단리물의 잠재적 관련성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 박테리아 배양물 상층액의 존재 하에 NHBE(normal human bronchial epithelial) 세포 및 A549 폐포 상피 세포를 배양하고 세포 생존율을 평가했다. 스태필로코커스 네팔렌시스 CNDG 및 혼합된 박테리아로부터의 상층액의 존재 하에 배양된 세포들은 대조군 배지에서 배양된 세포 대비 상당한 수준의 아폽토시스, 카스파아제-3 활성화 및 DNA 단편화(fragmentation)를 보였다 (도 2d-2g 참조).
가장 높은 아폽토시스 활성을 갖는 배양물 상층액
혼합된 스태필로코커스 (스태필로코커스의 혼합물) (스트레인 6; 도 3a-3d 참조) 및 스태필로코커스 네팔렌시스 CNDG (스트레인 8; 도 3e-3h 참조)로부터의 배양물 상층액을 Sephadex 컬럼을 이용하여 수개의 분획으로 분리하고, 단백질 농도의 피크는 MTT 분석의 세포 생존력의 최저점(nadir) 및 세포 주기 분석의 서브-G1 분획 피크와 잘 일치했다.
아폽토시스는 박테리아 배지 염 농도에 의존적이다
본 발명자들은 0%, 2% 또는 8% NaCl을 함유한 배지에서 스태필로코커스 네팔렌시스 CNDG 및 혼합된 스태필로코커스 종을 배양하고, 배양물 상층액을 이용하여 유동 세포분석법에 의해 아폽토시스를 평가했다. 본 발명자들은 아폽토시스 활성이 인 비트로에서 두 단리물 모두를 배양하기 위해 소모된 배지의 염 농도에 유의성 있게 의존적이라는 것을 확인했다 (도 3i, 3j 및 3k 참조).
아폽토시스 인자는 열-안정성, 저분자량 펩티드이다
박테리아로부터의 배양물 상층액을 85℃에서 15분 동안 인큐베이션시키고 1/10 희석물로 A549 폐포 상피 세포에 대한 그의 아폽토시스-촉진 활성을 평가했다. 스태필로코커스 네팔렌시스 CNDG 및 혼합된 스태필로코커스로부터의 배양물 상층액의 아폽토시스 활성은 가열 후 안정적으로 유지되었고, 비가열 배양물 상층액보다 훨씬 더 강했다 (도 12a-12d 참조). 아폽토시스-촉진성 인자의 실체에 대한 이해를 얻기 위해, 본 발명자들은 박테리아 상층액의 단백질을 저분자량 (<10 kDa) 및 고분자량 (>10 kDa) 단백질로 분획화하고, 실험을 반복하고, 저분자량 단백질을 가진 분획이 고분자량 단백질을 가진 분획 대비 강력하고 상당한 아폽토시스 활성을 갖는다는 것을 확인했다 (도 4a, 4b, 4c, 12a 및 12b).
보다 구체적으로, 도 12a 및 12b는 PI 및 아넥신 V에 의한 염색 후 A549 세포의 유동 세포분석법을 수행했다는 것을 보여준다. 각 그룹은 n=3이었다. 막대는 평균 ± S.D.를 나타낸다. 통계적 분석은 ANOVA 및 Newman-Keuls 검정에 의해 수행했다. *p<0.001, vs 배지; †p<0.05 vs 스태필로코커스 네팔렌시스 (스트레인 CNDG) 또는 스트레인 6으로부터의 비가열 상층액.
또한, 도 12c 및 12d는 배지 또는 스태필로코커스의 혼합물 또는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 상층액의 존재 하에 A549 폐포 상피 세포를 자극한 후 웨스턴 블롯팅에 의해 평가된 배양물 상층액에 의해 카스파아제-3의 활성화를 보여준다. 각 그룹은 n=3이었다. 막대는 평균 ± S.D.를 나타낸다. 통계적 분석은 ANOVA 및 Newman-Keuls 검정을 이용하여 수행했다. *p<0.05 vs 배지.
이러한 관찰은 아폽토시스-유도 인자는 저분자량의 단백질이고, 섬유증 조직으로부터 농축된 박테리아에 의해 분비되는 이러한 가용성 인자들이 폐 상피 세포의 운명(fate)을 봉인(seal)시키는 것에 의해 폐섬유증의 메카니즘에 기여한다는 증거를 제공했다.
아폽토시스-촉진성 펩티드의 확인
본 발명자들은 그 후 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 배양물 상층액으로부터 가용성 아폽토시스-촉진성 인자를 정제했다. 상층액 중 단백질의 연속적 추출을 헥산, 물, 에틸 아세테이트, 에탄올에서 수행하고, 옥타데실-실란 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 및 Sep-Pak를 이용한 분획화 및 뒤이어 HPLC (high-performance liquid chromatography) (도 13 참조)를 수행하여 생물학적 활성 단백질을 분리했다 (도 14 및 15 참조). 프로테이나아제 K에 의해 시료를 처리한 후 생물학적 활성이 상당히 감소했다 (도 16a, 16b 및 16c 참조). 시료의 겔 전기영동 후, 실버 염색이 2 kDa의 겉보기 (apparent) 분자량을 갖는 단백질/펩티드를 보여주었다 (도 17 참조).
보다 구체적으로, 배양물 상층액의 분획화는 하기에 기재된 방법에 따라 수행했다. A549 폐포 상피 세포에 대한 분획의 아폽토시스-촉진 활성을 유동 세포분석법에 따라 평가하고, 도 13에서 생리활성 (+) 또는 생리활성 부재 (-)로 표시한다. 도 14는 A549 폐포 상피 세포에 대한 각 분획의 아폽토시스-촉진 활성을 보여준다. 도 15는 각 분획의 존재 하에 48시간 동안 배양된 A549 폐포 상피 세포에 대한 각 분획의 아폽토시스-촉진 활성을 보여준다. 아폽토시스를 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) 분석에 의해 평가했고, 이때, DAPI는 4'6-디아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole)의 약자이다. 2회의 실험으로부터의 대표적인 현미경 사진(microphotograph)이 도시된다. 스케일 막대는 100 ㎛를 나타낸다.
스태필로코커스 네팔렌시스로부터의 배양물 상층액 및 그 배양물 상층액의 에탄올, 메탄올, 또는 아세토니트릴 분획을 37℃에서 200 ㎍/ml의 프로테이나아제 K(PK)의 존재 하에 인큐베이션시키고, 1/10 희석물로 A549 폐포 상피 세포의 배양 배지에 첨가했다. 각 그룹은 n=3을 가졌다. 도 16a, 16b 및 16c는 요오드화 프로피디움 (PI) 및 아넥신 V에 의한 염색 후 수행된 A549 폐포 상피 세포의 유동 세포분석 결과를 보여준다. 막대는 평균 ± S.D.를 나타낸다. 통계적 분석은 ANOVA 및 Tukey 검정을 이용하여 수행했다. *p<0.01. PK는 프로테이나아제 K의 약자이다.
생물학적 활성을 갖는 HPLC 분획(분획 3) 5 마이크로그램을 15% SDS (sodium dodecyl sulfate) 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하고 상용 키트를 이용하여 실버-염색을 수행했다. 유사한 결과를 갖는 3회의 실험으로부터의 대표적인 현미경 사진이 도 17에 도시된다.
뒤이어, 본 발명자들은 질량 분광분석에 의해 펩티드를 분석하고, 그의 폐쇄 게놈 서열 데이터 (closed genome sequence data) (Genbank Accession number PRJNA544423)에 근거하여, 스태필로코커스 네팔렌시스 CNDG 단백질 서열의 커스텀 데이터베이스(custom database)에 대해 원시 데이터(raw data)를 비교했다. 질량 분광분석은 배양물 상층액 중 정제된 생물학적 활성과 일치하는, 1.94 kDa의 분자량에 해당하는 19개 아미노산 잔기 (IVMPESSGNPNAVNPAGYR - 서열번호 1)의 펩티드를 확인했다. 본 발명자들은 이 새롭게 발견된 펩티드를 "코리신"으로 명명했다. 상동성 검색은 코리신 서열이 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 트랜스클리코실라아제 351 IsaA (MW: 25.6 kDa)의 세그먼트에 해당한다는 것을 밝혔다.
코리신의 구조 예측 및 아폽토시스 활성
상동성 모델링 서버 (homology modelling server) (swissmodel.expasy.org)를 이용한 구조적 정렬은 코리신이 엔도-타입 막-결합 용해성 뮤레인 트랜스글리코실라아제 A (an endo-type membrane-bound lytic murein transglycosylase A)의 세그먼트에 대해 46.88% 동일성을 공유한다는 것을 보여주었다 (도 5a-5c 참조). 따라서, 본 발명자들은 2개의 상업적 제조사 (Peptide Institute, Osaka, Japan 및 ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 합성 코리신 펩티드 (즉, 추론된 아미노산 서열을 갖는 펩티드)의 제조를 요청했다. 그 후, 이 합성 코리신 펩티드 각각을 A549 폐포 상피 세포를 처리하기 위해 이용했다.
2개의 합성 코리신 펩티드 모두 A549 폐포 상피 세포에서 용량 의존적 방식으로 스태필로코커스 단리물 상층액의 아폽토시스-촉진 효과를 재현했다 (도 5d, 5e, 18a 및 18b 참조). 합성 코리신의 아폽토시스 활성은 동일한 단백질 농도의 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG 및 혼합된 스태필로코커스 (스트레인 6)로부터의 상층액보다 훨씬 더 강력했다 (도 18c-18e 참조).
보다 구체적으로, 도 18a 및 18b는 코리신의 다양한 농도를 포함하는 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양한 후 A549 폐포 상피 세포의 유동 세포분석을 보여준다. 각 그룹은 n=3이었다. 막대는 평균 ± S.D.를 나타낸다. 통계적 분석은 ANOVA 및 Tukey 검정을 이용하여 수행했다. *p<0.001 vs 대조군 (0 ㎍/ml); †p<0.001 vs 0.5 ㎍/ml의 코리신.
도 18c-18e는 코리신 (5 또는 10 ㎍/ml), 혼합된 스태필로코커스 또는 스트레인 6으로부터의 상층액 단백질 (10 또는 100 ㎍/ml), 또는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG 또는 스트레인 8 (10 또는 100 ㎍/ml)의 다양한 농도를 포함하는 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양한 후 A549 폐포 상피 세포의 유동 세포분석을 보여준다. 각 그룹은 n=3이었다. 또한, 막대는 평균 ± S.D.를 나타낸다. 통계적 분석은 ANOVA 및 Tukey 검정을 이용하여 수행했다. ‡p<0.05 vs 식염수 또는 스크램블 펩티드 (scrambled peptide); §p<0.001 vs 혼합된 스태필로코커스 또는 스태필로코커스 네팔렌시스로부터의 상층액 단백질 (10 및 100 ㎍/ml).
정상 인간 기관지 상피 세포도 카스파아제-3의 증가된 절단 및 감소된 Akt 활성화와 함께(도 19c-19e 참조), 코리신의 존재 하에 상당히 증진된 아폽토시스를 보였으나, 스크램블 아미노산 서열로 구성된 합성 펩티드의 존재 하에서는 그렇지 않았다 (도 19a-19b 참조).
보다 구체적으로, 도 19a-19b는 10 μM의 코리신 또는 그의 스크램블 서열을 포함하는 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양한 후, 정상 인간 기관지 상피 (NHBE) 세포의 유동 세포분석을 보여준다. 각 그룹은 n=4였다. 막대는 평균 ± S.D.를 나타낸다. 통계적 분석은 ANOVA 및 Tukey 검정을 이용하여 수행했다. *p<0.001.
도 19c는 코리신 또는 스크램블 펩티드로 처리된 NHBE 세포의 용해물의 웨스턴 블롯팅을 보여준다. 각 처리 그룹은 n=4였다. 각 처리 그룹의 대표적인 블롯이 표시된다.
도 19d 및 19e는 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 밀도측정에 의해 정량된 웨스턴 블롯 막 밴드의 강도를 보여준다. 각 처리 그룹은 n=4였다. 막대는 평균 ± S.D.를 나타낸다. 통계적 분석은 단측(one-tailed) Mann-Whitney U 검정에 의해 수행했다. *p<0.05.
A549 폐포 상피 세포를 이용한 추가적인 실험에서, 합성 코리신의 아폽토시스-촉진 활성은, 배양물 상층액에서 관찰된 바와 같이 열-내성인 것으로 관찰되었고 (도 20a-20b 참조), TEM에 의한 관찰은 코리신의 아폽토시스 특성을 확인했다 (도 5f 참조). 그러나, 코리신은 폐 섬유아세포, 혈관 내피 세포, 또는 림프구 세포주에 대해 아폽토시스 활성을 보이지 않았다 (도 21a-21f 참조).
보다 구체적으로, 합성 코리신 (5 mM; Peptide Institute Incorporation) 또는 스크램블 펩티드 (5 μM; Peptide Institute Incorporation)를 85℃에서 15분 동안 인큐베이션하고, 그 후, A549 폐포 상피 세포의 배양 배지에 48시간 동안 첨가했다. 도 20a-20b는 PI 및 아넥신 V에 의한 염색 후에 수행된 A549 폐포 상피 세포의 유동 세포분석을 보여준다. 각 처리 그룹은 n=3이었다. 막대는 평균 ± S.D.를 나타낸다. 통계적 분석은 ANOVA 및 Newman-Keuls 검정을 이용하여 수행했다. *p<0.001 vs 비가열 또는 가열 스크램블 펩티드.
도 20c는 합성 코리신 (5 μM) 또는 스크램블 펩티드를 85℃에서 15분 동안 인큐베이션한 후, A549 폐포 상피 세포의 배양 배지에 48시간 동안 첨가하고, 절단된 카스파아제-3, β-액틴, 전체 Akt (total Akt), p-Akt (phosphorylated Akt)의 웨스턴 블롯팅을 위해 세포를 수집하고 준비한 별개의 실험을 보여준다. 각 처리 그룹은 n=3이었다. 각 처리 그룹의 대표적인 블롯이 표시된다.
도 20d 및 20e는 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 밀도측정에 의해 정량된 웨스턴 블롯 막 밴드의 강도를 보여준다. 각 처리 그룹은 n=3이었다. 막대는 평균 ± S.D.를 나타낸다. 통계적 분석은 ANOVA 및 Newman-Keuls 검정을 이용하여 수행했다. *p<0.01 vs 식염수.
도 21a 및 21b는 10 ㎍/ml 코르신을 포함하는 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양한 후 HFL1 폐 섬유아세포의 유동 세포분석을 보여준다. 각 그룹은 n=4였다.
도 21c 및 21d는 10 ㎍/ml 코르신을 포함하는 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양한 후 인간 제대정맥 내피 세포 (HUVEC)의 유동 세포분석을 보여준다. 각 그룹은 n=4였다.
도 21e 및 21f는 10 ㎍/ml 코르신을 포함하는 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양한 후 인간 Jurkat T 세포의 유동 세포분석을 보여준다. 각 처리 그룹은 n=4였다. 막대는 평균 ± S.D.를 나타낸다. 통계적 분석은 ANOVA 및 Tukey 검정을 이용하여 수행했다.
항-코리신 항체는 코리신-유도 아폽토시스를 억제한다
본 발명자들은 하기에 기술된 방법을 이용하여 코리신에 대한 다중클론 항체를 개발했다. 상기 다중클론 항체는 마우스 폐 조직 및 스태필로코커스 네팔렌시스의 배양물 상층액에서 코르신을 검출할 수 있었다 (도 22a-22b 참조).
보다 구체적으로, 5 마이크로그램의 WT 마우스 및 TGFβ1 TG 마우스로부터 준비된 폐 조직 균질물 (도 22a), 및 여러 부피(volume)의, 트리클로로아세트산에 의한 침전에 의해 농축된 스태필로코커스 네팔렌시스로부터의 배양물 상층액 (도 22b)을 5-15% 구배 SDS 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하고, 항-코리신 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행했다. 유사한 결과를 갖는 2회의 실험으로부터의 대표적인 현미경 사진이 도 22a 및 22b에 도시된다. 합성 코리신을 대조군으로 이용했다. MW는 kDa 단위의 분자량(molecular weight)의 약어이다. 화살표는 코리신의 밴드를 나타낸다.
본 발명자들은 식염수, 대조군 래빗 IgG, 또는 래빗 항-코르신 IgG의 존재 하에 A549 폐포 상피 세포를 코리신 또는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG로부터의 배양물 상층액으로 자극하고, 유동 세포분석법에 의해 아폽토시스 세포(apoptotic cell)를 평가했다. 본 발명자들은 대조군 IgG 대비 다중클론 항-코리신 항체의 존재시 합성 코리신 (도 23a-23b 참조) 및 스태필로코커스 네팔렌시스의 배양물 상층액 (도 23c-23d 참조)에 의해 유도된 폐 상피 세포 아폽토시스의 유의한 억제를 확인했다.
보다 구체적으로, A549 폐포 상피 세포 (2 x 105개 세포/웰)를 식염수 (식염수/코리신), 10 ㎍/ml 대조군 래빗 IgG (대조군 IgG/코리신) 또는 10 ㎍/ml 래빗 항-코리신 IgG(항-코리신 IgG/코리신)의 존재 하에 12-웰 플레이트에서 배양하고 5 mM 코리신으로 48시간 동안 자극했다. 식염수의 존재 하에 배양하고 식염수 (식염수/식염수), 대조군 래빗 IgG (대조군 IgG/식염수) 또는 래빗 항-코리신 IgG(항-코리신 IgG/식염수)로 처리된 세포를 대조군으로 이용했다. 각 처리 그룹은 n=3이었다(3배수). 결과가 도 23a 및 23b에 도시된다. 막대는 평균 ± S.D.를 나타낸다. 통계적 분석은 ANOVA 및 Tukey 검정을 이용하여 수행했다. *p<0.001.
또한, 12-웰 플레이트에서 배양된 A549 폐포 상피 세포를 식염수 (식염수/스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 상층액), 10 ㎍/ml 대조군 래빗 IgG (대조군 IgG/스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 상층액) 또는 10 ㎍/ml rabbit 항-코리신 IgG (항-코리신 IgG/스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 상층액)의 존재 하에 48시간 동안 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 배양물 상층액의 1/10 희석물로 자극했다. 배지에서 배양되고, 식염수 (식염수/배지), 대조군 래빗 IgG (대조군 IgG/배지) 또는 래빗 항-코리신 IgG (항-코리신 IgG/배지)로 처리된 세포를 대조군으로 이용했다. 각 처리 그룹은 n=3이었다. PI 및 아넥신 V에 의한 염색 후에 A549 세포의 유동 세포분석을 수행했다. 결과가 도 23c 및 23d에 도시된다. 또한, 막대는 평균 ± S.D.를 나타낸다. 통계적 분석은 ANOVA 및 Tukey 검정을 이용하여 수행했다. *p<0.001.
전장 트랜스글리코실라아제는 아폽토시스 활성을 갖지 않는다
본 발명자들은 A549 세포에 대한 아폽토시스 활성을 평가하기 위해 대장균 세포에서 발현된, 6-히스티딘-태그 (His-tagged) 또는 태그-프리 (His-태그가 절단됨) 재조합 전장 트랜스글리코실라아제 351을 제조했다. 비가열 또는 가열 재조합 His-태그 트랜스글리코실라아제 351 (도 24a-24b 참조) 및 태그-프리 재조합 트랜스글리코실라아제 351 (도 24c-24e)은 폐 세포에서 아폽토시스를 유도하지 못했고, 그에 의해 생물학적 활성을 위한 폴리펩티드 가공 및 코리신 방출의 필요에 대한 증거를 제공했다.
보다 구체적으로, 도 24a 및 24b는 10 ㎍/ml의 코리신, 비가열 또는 가열 Hig-태그 재조합 트랜스글리코실라아제를 포함하는 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양한 후 A549 폐포 상피 세포의 유동 세포분석을 보여준다. 각 처리 그룹은 n=3이었다. 막대는 평균 ± S.D.를 나타낸다. 통계적 분석은 ANOVA 및 Tukey 검정을 이용하여 수행했다. *p<0.001.
도 24c는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG로부터의 트롬빈-처리 또는 트롬빈-미처리 His-태그 재조합 트랜스글리코실라아제 351의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 (10-20%)을 이용한 겔 전기영동 및 실버-염색의 결과를 보여준다. 유사한 결과를 갖는 2회의 실험으로부터의 대표적인 현미경 사진이 도시된다.
도 24d 및 24e는 10 ㎍/ml 코리신, Hig-태그 또는 태그-프리 재조합 트랜스글리코실라아제를 포함하는 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양한 후 A549 폐포 상피 세포의 유동 세포분석을 보여준다. 각 처리 그룹은 n=3이었다. 막대는 평균 ± S.D.를 나타낸다. 통계적 분석은 ANOVA 및 Tukey 검정을 이용하여 수행했다. *p<0.001.
코리신은 hTGFβ1 TG 마우스에서 폐섬유증을 악화시킨다
코리신이 인 비보에서 폐섬유증 질환을 악화시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 TGFβ1 TG 마우스를 폐섬유증의 일치하는(matched) 수준을 갖는 3개의 그룹으로 분리하고(도 25a 및 25b 참조) 그들을 2일 동안 1일 1회 기관내 경로에 의해 식염수, 스크램블 펩티드 또는 코리신으로 처리하고, 3일차에 안락사시켰다 (도 6a 참조).
코리신을 투여받은 TGFβ1 TG 마우스는 대조군 마우스 대비 폐에서 대식세포, 림프구, 및 호중구의 증가된 침윤, 증가된 콜라겐 침착, 및 염증성 사이토카인 및 케모카인의 농도, 및 상피 세포의 아폽토시스 증가를 보여서 (도 6b-6g 참조), 인 비보에서 코리신의 아폽토시스-촉진 활성의 유해한 효과를 입증했다.
보다 구체적으로, 도 25a 및 25b는 각각 하기 방법에서 기술된 바와 같이 수행된 식염수 (n=5), 스크램블 펩티드 (n=4) 또는 코리신 (n=5)에 의한 처리 전 WT 마우스 (n=3) 및 TGFβ1 TG 마우스의 CT (computed tomography) 이미지 및 CT 섬유증 평가를 보여준다. 막대는 평균 ± S.D.를 나타낸다. 통계적 분석은 ANOVA 및 Tukey 검정을 이용하여 수행했다. *p<0.05. TGFβ1 TG/SAL, TGFβ1 TG/스크램블 펩티드, 및 TGFβ1 TG/코리신 그룹간 통계적 차이는 없었다 (p=0.9).
스태필로코커스 네팔렌시스 주입은 폐섬유증을 악화시킨다
본 발명자들은 코리신 서열을 포함하는 트랜스글리코실라아제를 발현하는 박테리아도 폐섬유증을 악화시키는지 여부를 인 비보에서 평가했다. 이를 위해, 본 발명자들은 코리신 서열을 포함하는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG, 또는 음성 대조군으로서 스태필로코커스 에피더미디스 [ATCC14990]를 매칭되는 폐섬유증 CT 점수를 갖는 3개의 그룹으로 분리된 무균 TGFβ1 TG 마우스에 기관내로 투여했다 (도 26a 및 26b 참조).
이 전에, 인 비보 실험에서, 본 발명자들은 인 비트로에서 스태필로코커스 에피더미디스로부터의 트랜스글리코실라아제의 "코리신 위치(corisin position)"에 해당하는 펩티드 서열을 갖는 합성 펩티드(IIARESNGQLHARNASGAA - 서열번호 2)가 폐 상피 세포에 대해 아폽토시스-촉진 효과를 갖지 않는다는 것을 입증했다(도 27a 및 27b 참조). 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG가 주입된 TGFβ1 마우스는 스태필로코커스 에피더미디스를 투여받은 마우스 대비 폐 방사선 소견의 유의한 악화 (도 28a 및 28b 참조), 유의성있게 증가된 호중구 침윤, 및 증진된 폐포 상피 세포 아폽토시스를 보였고 (도 7a-7d 참조), 그에 의해 폐섬유증의 급성 악화에서 아폽토시스-촉진성 펩티드의 역할을 더 확증했다.
보다 구체적으로, 도 26a 및 26b는 각각 하기 방법에서 더 기재된 바와 같이, 스태필로코커스 네팔렌시스 (n=6), 스태필로코커스 에피더미디스 (n=6) 또는 식염수 (n=4)의 기관내 주입 전 TGFβ1 TG 마우스의 CT (computed tomogrphy) 이미지 및 CT 섬유증 평가를 보여준다. 도 26b에서 막대는 평균 ± S.D.를 나타낸다. 통계적 분석은 ANOVA 및 Tukey 검정을 이용하여 수행했다. 마우스 그룹들 간에 통계적 차이가 없었다 (p=0.5).
도 27a 및 27b는 10 μM의 스태필로코커스 네팔렌시스 CNDG로 스트레인으로부터의 트랜스글리코실리아제 세그먼트 (코리신)의 서열을 포함하는 합성 펩티드 (IVMPESSGNPNAVNPAGYR - 서열번호 l), 그의 스크램블 펩티드 (NRVYNGPAASPVSEGMPIN - 서열번호 3) 또는 스태필로코커스 에피더미디스 (ATCC 14990)의 트랜스글리코실라아제 세그먼트의 합성 펩티드 (IIARESNGQLHARNASGAA - 서열번호 2)를 포함하는 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양 후 A549 폐포 상피 세포의 유동 세포 분석을 보여준다. 각 처리 그룹은 n=3이었다(3배수). 도 27b에서 막대는 평균 ± S.D.를 나타낸다. 통계적 분석은 ANOVA 및 Tukey 검정을 이용하여 수행했다. *p<0.001.
도 28a 및 28b는 각각, 하기 방법에서 더 기재된 바와 같이, 무균 TGFβ1 TG 마우스에서 식염수 (n=4), 스태필로코커스 에피더미디스 (n=6) 또는 스태필로코커스 네팔렌시스 (n=6)의 기관내 주입 전과 후에 수행된 TGFβ1 TG 마우스의 CT (computed tomography) 이미지 및 CT 섬유증 평가를 보여준다. 도 28a에서 막대는 평균 ± S.D.를 나타낸다. 통계적 분석은 양측(two-tailed) Mann-Whitney U 검정에 의해 수행했다. *p<0.05.
마우스 및 인간 환자의 폐에서 코리신의 검출
본 발명자들은 섬유증이 없는 WT 마우스, 섬유증이 있는 TGFβ1 TG 마우스 및 섬유증이 없는 TGFβ1 TG 마우스에서 코리신의 존재를 분석했다. 본 발명자들은 WT 마우스 및 섬유증이 없는 TGFβ1 TG 마우스 대비 폐섬유증이 있는 TGFβ1 TG 마우스에서 유의성있게 증가된 코리신의 수준을 확인했다 (도 8a 및 8b 참조).
이러한 소견의 임상적 관련성을 명확하게 하기 위해, 본 발명자들은 또한 인간 IPF 환자에서 코리신을 평가했다. 이를 위해, 본 발명자들은 34명의 IPF 환자 및 8명의 건강한 남성 대조군으로부터의 BALF(bronchoalveolar lavage fluids)를 수집했다. IPF 환자의 특징이 하기 표 3에 기술된다.
BALF (bronchoalveolar lavage fluid) 중 코리신의 수준은 건강한 대조군 대비 안정한 질환(stable disease) 또는 급성 악화를 갖는 IPF 환자에서 유의성있게 증가했다 (도 8c 및 8d 참조). BALF 코리신 수준은 또한 안정한 질환을 갖는 환자 대비 급성 악화를 갖는 IPF 환자에서 유의성있게 상승되었다 (또한, 도 8c 및 8d 참조). 남성 (50.6 ± 4.9 ㎍/ml)과 여성 (58.8 ± 10.7 ㎍/ml) 간 코리신의 수준의 차이는 통계적으로 유의성이 없었다(p=0.07). 코리신 수준은 또한 환자의 연령과 유의성있게 상관되지 않았다 (r=0.1, p=0.5). 이러한 결과는 IPF에서 코리신의 임상적 관련성의 증거를 제공한다.
아폽토시스 상피 세포의 급격한 증가가 급성 악화를 갖는 IPF 환자의 폐에서 일어난다. NPL15 및 NPL16을 참조한다. 본원의 결과는 박테리아-유래 아폽토시스-촉진성 코리신의 과도한 분비가 이러한 치명적 질환 합병증에 기여할 것이라는 증거를 제공한다.
계통발생적 분석은 코리신의 보존을 보여준다
상이한 박테리아에 의해 발현되는 트랜스글리코실라아제의 진화적 관계를 밝히기 위해, 본 발명자들은 하기에서 더 기술될 바와 같이, 공개적으로 이용가능한 데이터베이스 (www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)에서 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 게놈에서 확인된 6개의 트랜스글리코실라아제 및 그의 상동체(homolog)의 아미노산 서열에 근거하여 계통수를 작성했다.
계통수의 위상구조(topology)는 선조 서열(ancestral sequence)에 근접한 트랜스글리코실라아제의 유도체가 2개의 IsaA 클러스터 (IsaA-1 및 IsaA-2)로 분리되고, IsaA-1 관련 서열로부터, SceD 일원들로 명명된 단백질들(SceD-1, SceD-2, SceD-3, SceD-4)이 진화한 것 같다는 것을 보여준다 (도 29a-29d 참조). IsaA와 SceD 아미노산 서열의 다중 정렬은 일반적으로 아폽토시스-촉진성 코리신을 나타내는 아미노산 잔기들의 보존을 밝혀서, 그들의 기능적 중요성을 부각시켰다 (도 30a, 30b 및 30c 참조).
스태필로코커스 자일로서스(Staphylococcus xylosus), 스태필로코커스 코니, 및 스태필로코커스 네팔렌시스로부터의 코리신 상동성 트랜스글리코실라아제의 아미노산 서열 동일성은 100%였다. 또한, 이러한 스태필로코커스는 IsaA-1 및 IsaA-2 클러스터의 다른 일원들로부터의 트랜스글리코실라아제의 해당하는 코리신 영역과 98% 초과의 동일성을 공유했고, SceD 클러스터의 일원들의 해당하는 영역과 60% 동일성을 공유했다 (도 30a, 30b 및 30c 참조). 트랜스글리코실라아제 주위에 클러스터링된 유전자들의 게놈 컨텍스트 (신테니(synteny))는 스태필로코커스 코니와 스태필로코커스 네팔렌시스에서 보존되는 경향이 있었다 (도 31a 참조).
구체적으로, 도 30a-30c는 예를 들면, 본 교시의 문맥에서 용어 "코리신"으로 간주되거나 그의 범위 내에 속하는 것으로 인정되는 하기 아미노산 서열들을 보여준다:
IVMPESGGNPNAVNPAGYR (서열번호 4),
IIMPESGGNPNIVNPYGYS (서열번호 5),
IVMPESGGNPNAVNPYGYR (서열번호 6),
IVLPESSGNPNAVNPAGYR (서열번호 7),
IVLPESSGNPNAVNELGYR (서열번호 8),
IVMPESGGNPNAVNELGYR (서열번호 9),
IVMPESSGNPNAVNELGYR (서열번호 10),
IVMPESSGNPDAVNELGYR (서열번호 11),
IAQRESGGDLKAVNPSSGA (서열번호 12), 및
IAERESGGDLKAVNPSSGA (서열번호 13).
코리신-코딩 유전자의 수평적 유전자 전달(horizontal gene transfer)
서열 정렬 및 비교 게놈 분석은 기도 질환에 관련된, 스트렙토코커스의 병원성 스트레인, 즉, 스트렙토코커스 뉴모니애 스트레인 N이 코리신과 거의 동일한 (단일 아미노산 변화) 펩티드 서열을 갖는 트랜스글리코실라아제 (COE35810)를 포함한다는 것을 보여주었다.
이 박테리아의 게놈의 추가적인 조사는 코리신-함유 폴리펩티드의 제2 상동체를 밝혔다 (도 30a, 30b, 및 30c).
코리신-폴리펩티드 서열이 다양한 스태필로코커스 종들에서만 고도로 보존되기 때문에, 스트렙토코커스 뉴모니애 스트레인 N이 코리신-코딩 유전자를 어떻게 획득했는지를 이해하기 위해, 본 발명자들은 Genbank 데이터베이스에서 검색을 수행하고 폴리펩티드 (COE35810)가 스태필로코커스 와르네리의 상이한 스트레인들 (WP_002467055, WP_050969398, WP_126403073, 및 WP 107532308)에서의 트랜스글리코실라아제와 98-100% 동일성을 갖는다는 것을 발견했다 (도 31b 및 31c 참조). 상기 폴리펩티드의 N-말단 영역에서 아미노산 중 1개 또는 2개의 변화에도 불구하고, 이 트랜스글리코실라아제 내에서 코리신 펩티드 서열은 불변이다.
본 발명자들은 스태필로코커스 와르네리 스트레인과 비교하여 스트렙토코커스 뉴모니애 스트레인 N에서 이 유전자들의 게놈 컨텍스트를 더 조사하고, 주석의 일부 차이에도 불구하고, 신테니(synteny)의 명확한 보존을 발견했다 (도 31d 참조).
따라서, 본 발명자들은 스트렙토코커스 뉴모니애 스트레인 N에서 트랜스글리코실라아제 유전자 및 그와 연관된 다른 유전자들이 스태필로코커스 와르네리 스트레인 또는 관련된 종으로부터 획득되었다는 가설을 세웠다. 중요하게, 또다른 병원성 박테리아의 스트레인이 인간 폐에 서식하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 마이코박테리움 [마이코박테로이데스] 앱세서스(Mycobacterium [Mycobacteroides] abscessus)는 트랜스글리코실라아제의 변이체 (SKT99287)를 갖는다 (포함한다). 스트렙토코커스 뉴모니애 스트레인 N에 대해 전술된 바와 같은 유사한 분석에 근거하여, 본 발명자들은 전달이 스태필로코커스 호미니스 또는 관련된 종으로부터 이루어진 것으로 추론했다 (도 31e 및 31f 참조). 그 후, 본 발명자들은 스트렙토코커스 뉴모니애의 트랜스글리코실라아제로부터의 합성 코리신 (스태필로코커스 네팔렌시스 유도체로부터 1개의 아미노산 변화를 포함함)도 A549 폐포 상피 세포의 아폽토시스를 유도한다는 것을 확인한 실험을 수행했다 (도 30a-30c, 32a 및 32b 참조).
보다 구체적으로, 도 32a 및 32b는 5 μM의 스태필로코커스 네팔렌시스 (스트레인 CNDG) 트랜스글리코실라아제 351로부터의 합성 코리신 (IVMPESSGNPNAVNPAGYR), 그의 스크램블 펩티드 (NRVYNGPAASPVSEGMPIN) 또는 스트렙토코커스 뉴모니애 스트레인 N 트랜스글리코실라아제 (COE35810 및 COE6725)로부터의 합성 펩티드 (IVMPESGGNPNAVNPAGYR)를 포함하는 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양한 후, A549 폐포 상피 세포의 유동 세포분석을 보여준다. 각 그룹은 n=3이었다. 도 32b에서 막대는 평균 ± S.D.를 나타낸다. 통계적 분석은 ANOVA 및 Tukey 검정을 이용하여 수행했다. *p<0.001.
이러한 관찰로부터, 스태필로코커스 네팔렌시스 트랜스글리코실라아제 351에 매우 높은 상동성을 갖는 트랜스글리코실라아제를 코딩하는 유전자를 갖는 비-스태필로코커스 개체는 폐-연관된(lung-associated) 것이고, 그에 의해 폐에 서식하는 스태필로코커스 스트레인으로부터의 수평적 유전자 전달의 케이스의 증거를 제공하는 것으로 결론짓는다.
검토
TGFβ1 (transforming growth factor)는 세포외 매트릭스(ECM) 합성, 근섬유아세포의 활성화, 분화, 및 이동, 상피-간엽 세포 전환(epithelial-to-mesenchymal transition), 및 섬유증-촉진성 인자의 생산 및 폐포 상피 세포의 아폽토시스에 대한 그의 강한 자극 활성 때문에, 폐섬유증의 발병에서 중추적 역할을 갖는 다면발현성 사이토카인이다. NPL17 및 NPL18을 참조한다. TGFβ1을 과발현하는 TG 마우스에서 폐섬유증의 발병이 조직 섬유증에서 이 사이토카인의 중요한 역할에 대한 POC (proof-of-concept)이다. NPL11을 참조한다. 또한, TGFβ1은 선천성 및 적응성 면역계를 직접적으로 억제하여, 증진된 감염에 대한 숙주 감수성을 초래하는 것에 의해 폐섬유증의 악화를 촉진할 수 있다. NPL19, NPL20 및 NPL21을 참조한다.
NPL22, NPL23 및 NPL24는 높은 염 농도가 항미생물성 펩티드의 활성을 억제하는 것에 의해 또는 면역 세포의 집단을 변화시키는 것에 의해 숙주 방어 메카니즘을 손상시킨다는 것을 보여주었다. 따라서, TGFβ1은 또한 세포외 공간에서 염의 축적을 지지하는 것에 의해 숙주 면역 반응에 간접적으로 영향을 미칠 수 있다. NPL25 및 NPL26을 참조한다. 염의 비정상적 세포외 저장이 상피 소듐 및 클로라이드 채널의 표면 발현의 TGFβ1-매개 음성 조절로부터 유발되어, 폐포 공기 공간(alveolar airspace)으로부터 상피를 통한 Na+ 및 Cl- 이온의 감소된 수송을 초래할 수 있다. NPL27-NPL29를 참조한다.
이러한 발견과 일치하게, 본 개시에서 보여진 바와 같이, 본 발명자들은 폐 조직에서 WT 마우스 대비 폐섬유증이 있는 TGFβ1 TG 마우스에서 소듐 수준의 유의한 증가, 소듐 수준과 섬유증 마커 및 섬유증-촉진성 사이토카인의 유의한 양의 상관관계, 및 소듐 수준과 림프구 개수 및 소듐 및 클로라이드 채널의 유의한 음의 상관관계를 확인했다.
여러 세포 막 소듐 및 클로라이드 수송체의 발현이 IPF 환자로부터의 폐포 상피 세포에서 상당히 변화된다는 것을 보여주는 최근의 단일-세포 RNA 시퀀싱 연구는 이온 경막 수송(ion transmembrane trafficking)이 폐섬유증에서 교란되고, 이 섬유증 질환에서 염의 축적을 지지한다는 것을 시사했다. NPL30을 참조한다. 본 발명자들은 섬유증이 없는 TGFβ1 TG 마우스와 WT 마우스 간에 폐 소듐 수준에서 차이를 발견하지 못했기 때문에, 소듐 저장은 섬유증 매트릭스(fibrotic matrix)의 존재를 요구하는 것으로 보인다. 이와 관련하여, 이전의 연구들은 소듐이 섬유증 조직의 세포외 매트릭스에 풍부한, 음전하를 띤 글리코사미노글리칸에 결합하는 것에 의해 삼투적 비활성(osmotically inactive) 형태로 세포외 공간에 저장된다는 것을 보여주었다. NPL31-NPL35를 참조한다.
전체적으로, 이러한 관찰들은 섬유증 조직이 비정상적인 면역 및 치료 반응을 갖는 염분성 미세환경이라는 것을 시사한다(도 33의 모델 참조).
보다 구체적으로, TGF (transforming growth factor) β1은 이온 수송체의 세포 표면 발현을 하향조절하는 것에 의해 세포외 염 농도를 증가시킬 수 있고, 염분성 미세환경은 폐포 상피 세포의 아폽토시스를 유도하는 코리신을 분비하는 스태필로코커스의 증식을 촉진한다. 상피 세포의 과다한 아폽토시스 및/또는 활성화가 폐섬유증의 급성 악화에 기여한다. 이전 연구에 의한 IPF 환자의 폐에서 호염성 박테리아의 확인이 이러한 소견을 뒷받침한다. NPL8 및 NPL9을 참조한다.
급성 악화는 IPF의 파괴적인 합병증이다. NPL36을 참조한다. IPF로 사망하는 환자의 거의 50%는 급성 악화의 과거 이력을 갖고, 이전의 급성 악화를 갖는 환자의 기대 여명은 3 내지 4개월에 불과하다. NPL37-NPL41을 참조한다.
IPF의 급성 악화에 대한 최적 치료법이 현재는 없다. NPL36을 참조한다. 2016년에 국제 워킹 그룹(international working group)은 이 합병증을 유발된(triggered) (확인된(identified) 사건: 시술-후(post-procedure), 약물 독성, 감염, 흡인) 급성 악화 또는 특발성 (미확인 유발 사건(unidentified inciting event)) 급성 악화로 분류할 것을 제안했다. Id. 급성 악화와 폐 마이크로비옴, 및 숙주 면역억제 상태를 연관시키는 최근 데이터, 및 항생제 요법의 예방 효과를 보여주는 후향적 연구는 급성 악화의 발병 및 폐섬유증의 진행에서 감염의 역할을 시사한다.
NPL7 및 NPL42-NPL45를 참조한다. 또한, 코-트리목사졸(co-trimoxazole)로 처리된 진행성 IPF 환자에서 증상 및 운동 능력의 개선을 보여주는 이중-맹검, 랜덤화, 플라시보-제어 연구 (double-blind, randomized, placebo-controlled study), 및 코-트리목사졸로 처리된 IPF 환자에서 더 나은 삶의 질 및 기도 감염의 감소와 함께 사망률의 유의한 감소를 보여주는 후속 이중맹검 추적 및 다기관 연구 (double-blind follow-up and multicenter study)는 폐섬유증에서 박테리아의 발병에서의 역할을 지지한다. NPL46 및 NPL47을 참조한다.
NPL7은 스태필로코커스 및 스트렙토코커스 속의 박테리아가 IPF 환자의 임상적 결과를 악화시킨다는 것을 보여주어, 질병 진행 및 발병에서 그들의 관련을 시사했다. 섬유증 폐에서 스태필로코커스 또는 스트렙토코커스 속의 상대적 풍부 (abundance) 및 IPF 환자에서 숙주 면역 반응과의 유의한 상관관계를 보여주는 연구가 또한 폐섬유증의 발병에서 이 박테리아 속의 기여를 지지한다. NPL6, NPL42 및 NPL48-NPL52를 참조한다. 그러나, 정확한 메카니즘은 여전히 불명확하다.
본 개시를 초래한 연구에서, 본 발명자들은 염분성 배양 배지가 인 비보 염분성 섬유증 조직을 모사하고, 따라서, 폐섬유증의 발병에 관련된 박테리아의 증식을 촉진할 것이라는 가설을 수립했다. 본 발명자들은 진행된 섬유증 (advanced fibrosis)을 갖는 hTGFβ1 TG 마우스로부터의 섬유증 조직이 접종된 고염(hypersaline) 배지에서 스태필로코커스 속의 박테리아의 증식을 검출했고, 순수한 박테리아 배양물의 전체 게놈 서열은 박테리아가 본 발명자들이 "스트레인 CNDG"로 분류한 스태필로코커스 네팔렌시스에 일치한다는 것을 보여주었다. 이 박테리아의 배양물 상층액은 폐포 상피 세포의 아폽토시스를 유도했고, 후속 크로마토그래피, 질량 분광분석법, 및 유전자 서열 분석은 아폽토시스가 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG로부터의 트랜스글리코실라아제 351의 세그먼트에 해당하는, 본 발명자들이 "코리신"으로 지칭하는 펩티드에 의해 유도되었다는 것을 보여준다. 고-염 조건에서 배양된 박테리아로부터의 상층액의 더 높은 아폽토시스 활성은 박테리아 증식의 염-의존적 촉진 또는 유사한 조건에서 스태필로코커스 아우레우스에서 발현이 증진된 것으로 보고되었된 관련된 단백질인, 코리신-함유 트랜스글리코실라아제의 증가된 박테리아 발현 때문일 수 있다. NPL53을 참조한다.
추가적인 실험에서, 본 발명자들은 진행성 폐섬유증을 갖는 hTGFβ1 TG 마우스 및 IPF를 가진 환자로부터의 폐에서 상기 펩티드를 검출했고, 합성 코리신 또는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 기관내 주입이 폐포 상피 세포의 광범위한 아폽토시스와 함께 폐섬유증의 급성 악화를 유도한다는 것을 발견했다 (도 33의 모델 참조). 폐포 상피 세포의 가속된 아폽토시스가 폐섬유증에서 급성 악화의 발병에서 중심적 역할을 수행한다. NPL16 및 NPL54를 참조한다. 따라서, 이러한 관찰에 근거하여, 코리신이 특발성 폐섬유증을 가진 환자에서 급성 악화를 유발하는 것으로 보이는 미생물 인자들에서 강력한 후보로 나타나고 있다.
본 발명자들은 코리신의 서열이 막-결합 용해성 트랜스글리코실라아제(membrane-bound lytic transglycosylase) 중 영역과 높은 상동성을 갖는다는 것을 발견했다. 용해성 트랜스글리코실라아제는 박테리아 세포벽의 펩티도글리칸 성분을 절단하는 것으로 보고된 박테리아 효소이고 (NPL55 참조), 또한, 기타 필수적인 세포 기능, 예를 들면, 세포벽 합성, 리모델링, 항생제에 대한 내성, 분비 시스템(secretion system)의 삽입, 편모 조립, 병독성 인자(virulence factor)의 분비, 포자형성 및 발아를 수행한다(Id.). 트랜스글리코실라아제는 박테리아에 편재하고, 개별적인 종은 임의의 일원의 상실 또는 불활성화의 경우에 보완하기 위해 기능적 중복(functional redundancy)을 갖는 복수의 트랜스글리코실라아제를 생산할 수 있다. NPL56 및 NPL57을 참조한다.
본원에 기재된 결과에서, 완전한 게놈 서열은 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG가 6개의 트랜스글리코실라아제를 생산하고, 이들 중 IsaA-1 클러스터의 일원인 트랜스글리코실라아제 351이 코리신 서열을 갖는다(포함한다)는 것을 보여주었다. 전장 트랜스글리코실라아제 351은 폐 상피 세포의 아폽토시스를 유도하지 않아서, 코리신 펩티드가 전장 단백질로부터 방출된 후에만 활성이라는 증거를 제공했다. 이 펩티드 방출(shedding)의 메카니즘은 알려지지 않았으나, 트랜스글리코실라아제 351을 둘러싼 펩티다아제의 존재를 보여주는 스태필로코커스 네팔렌시스 CNDG 스트레인의 게놈 컨텍스트는 그들이 치명적인 펩티드의 분비에 관련될 수 있다는 증거를 제공한다.
본 발명자들은, 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG 외에, 코리신에 유사한 서열이 기타 스태필로코커스 종, 및 스트렙토코커스 뉴모니애 및 마이코박테리움 앱세서스의 스트레인을 포함한, 정상 폐 또는 섬유증 폐에 서식하는 미생물 군집의 일부 일원들로부터의 여러 트랜스글리코실라아제에서 고도로 보존된다는 것을 발견했다. NPL51 및 NPL58-60을 참조한다. 이러한 관찰은 광범위하게 다양한 박테리아가 폐섬유증에서 코리신의 출처일 수 있다는 증거를 제공한다.
본 개시가 스태필로코커스의 스트레인에서 IsaA 상동체로부터 유래된 펩티드의 병원성에 대한 최초의 보고서인 것으로 사료되나, 상동성 단백질 (즉, IsaA 및 SceD)이 병독성에 관련된 스태필로코커스 아우레우스에서 보고되었다는 것이 주목된다. NPL53을 참조한다. NPL53에서 스태필로코커스 아우레우스 IsaA는 도 30a, 30b 및 30c에 표시된 정렬에서 YP_501340에 해당하고, 동일한 보고서에서 SceD는 SceD-1 내지 SceD-4 폴리펩티드의 것들에 유사한 코리신의 변이체를 갖는다 (Id). 따라서, 관련되나, 스태필로코커스 아우레우스에서 규명된 트랜스글리코실라아제는 본 연구에서 규명된 스태필로코커스 네팔렌시스 트랜스글리코실라아제와 상당히 다르다. 그러나, 스태필로코커스 아우레우스가 고도로 보존된 코리신 서열을 갖는 비규명(uncharacterized) IsaA 트랜스글리코실라아제를 갖는다는 것이 주목되며(도 29a-29d, IsaA-2, SUK04795.1), 이는 본 개시에서 기술된 코리신 가공과 유사한 메카니즘이 스태필로코커스 아우레우스에 존재한다는 것을 시사할 수 있다.
스트렙토코커스 뉴모니애 및 스태필로코커스 종은 또한 빈번하게 IPF 환자에서 높은 입원 사망률(in-hospital mortality rate)을 갖는 폐 감염을 유발한다. NPL20, NPL58 및 NPL61을 참조한다. 폐포 세포 아폽토시스가 IPF의 발병 및 악화에서 중심적 역할을 수행한다는 증가하는 증거를 고려할 때 (NPL62 참조), 치명적 펩티드의 방출이 미생물 감염의 합병증을 가진 환자에서 기능성 폐 폐포 세포의 상실 및 나쁜 임상적 결과에 대한 중요한 기여를 구성하는 것으로 가정하는 것이 합리적이다.
박테리아 병독성 및 침윤성(invasiveness)에 더 기여할 수 있는 또 다른 메카니즘은 박테리아 유전자의 수평적 전달이다. NPL63을 참조한다. 여기서 본 발명자들은 스트렙토코커스 뉴모니애, 마이코박테리움 [마이코박테리오데스] 앱세서스 및 여러 스태필로코커스 종의 스트레인들이 코리신 서열을 포함하는 트랜스글리코실라아제의 고도로 유사한 게놈 컨텍스트 (신테니) 및 서열 상동성을 공유한다는 것을 발견했고, 이는 이 병독성 인자의 획득에서 수평적 유전자 전달의 관련의 증거를 제공한다. 스태필로코커스 및 스트렙토코커스 속은 인간 미생물 균총(microbiota)의 흔한 일원이다.
NPL64를 참조한다. 따라서, 본 연구에서 확인된 코리신 관련 펩티드가 다른 부위 또는 기관, 예를 들면, 신장 및 간으로부터의 인간 세포에 대한 유사한 아폽토시스 효과를 갖는 것으로 결정되는 경우, 이러한 박테리아에 의한 감염증에 대한 견해는 재-평가를 필요로 할 것이다.
IPF의 발병에서 폐 미생물 집단의 참여를 나타내는 증가되는 증거를 고려할 때, 질병 악화자(disease exacerbator)로서 코리신의 확인은 섬유증 질환에서 아폽토시스의 역할을 입증하고, IPF에서 신규한 진단 마커 및 치료 표적을 제공하고, 기관 섬유증에서 마이크로비옴의 역할을 연구하는 새로운 길을 연다.
도 1a는 9 마리의 야생형 (WT) 마우스, 6 마리의 섬유증이 없는 TGFβ1 TG 마우스, 및 6마리의 섬유증을 가진 TGFβ1 TG 마우스의 흉부 CT (computed tomography) 이미지를 보여주고; 도 1b는 이 마우스들의 CT 점수를 보여주며; 도 1c는 마이크로파 분석/유도결합 플라즈마 질량 분석법(inductively coupled plasma mass spectrometry: ICP-MS)에 의해 측정된 이 마우스들의 폐 조직 중 식염수 (saline) 함량을 보여준다.
도 2a 및 2b는 각각 야생형 (WT) 마우스 (n = 3) 및 TGFβ1 형질전환 (TG) 마우스 (n = 8)의 CT 이미지 및 CT 섬유증 점수(fibrosis scoring)를 보여준다.
도 2c는 고염(hypersaline) 배양 배지에서 48시간 동안 배양 후 야생형 (WT) 마우스 (n = 3) 및 TGFβ1 형질전환 (TG) 마우스 (n = 8)로부터 무균 조건 하에 절제된 섬유증 폐 조직을 보여준다. 박테리아 콜리니의 분석을 TEM(transmission electron microscope)에 의해 수행했다. 스케일 막대는 100 nm를 나타낸다.
도 2d는 스태필로코커스(Staphylococcus spp.)의 혼합물 (스트레인 6; n = 9), 스태필로코커스 네팔렌시스(Staphylococcus nepalensis) 스트레인 CNDG (n = 9), 또는 대조군 배지 (n = 9)의 1/10 희석된 소모된(spent) 배양물 상층액을 포함하는 DMEM 배지에서 48시간 배양된 A549 폐포 상피 세포의 유동 세포 분석을 보여준다.
도 2e는 스태필로코커스(Staphylococcus spp.)의 혼합물 (스트레인 6; n = 8), 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG (n = 8), 또는 대조군 배지 (n = 4)의 1/10 희석된 소모된 배양물 상층액을 포함하는 DMEM 배지에서 48시간 배양된 정상 인간 기관지 상피 세포(hNBEC)의 유동 세포 분석을 보여준다.
도 2f 및 2g는 배지 (n = 6) 또는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 상층액 (n = 6)의 존재 하에 A549 폐포 상피 세포의 배양 후 TUNEL 분석을 보여준다. 스케일 막대는 20 ㎛을 나타낸다.
도 3a는 Sephadex G25 컬럼을 이용한 겔 여과 후 스태필로코커스의 혼합물의 배양물 상층액으로부터의 분획(fraction)의 흡광도를 보여주고; 도 3b는 스태필로코커스의 혼합물의 배양물 상층액으로 A549 폐포 상피 세포를 처리한 후 세포 생존력을 보여주며 (각 분획 n = 3); 도 3c는 스태필로코커스의 혼합물의 배양물 상층액으로 A549 세포를 처리한 후 서브-G1기(sub-G1 phase)에 있는 세포를 보여준다.
도 3d는 스태필로코커스의 혼합물의 배양물 상층액에 의한 처리 후 서브-G1기에 있는 A549 세포들의 대표적인 히스토그램을 보여준다.
도 3e는 겔 여과 후 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 배양물 상층액으로부터의 분획의 흡광도를 보여주고; 도 3f는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 배양물 상층액으로 A549 세포를 처리한 후 세포 생존력을 보여주며 (각 분획 n = 3); 도 3g는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 배양물 상층액으로 A549 세포를 처리한 후 서브-G1기에 있는 세포를 보여준다.
도 3h는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 배양물 상층액에 의한 처리 후 서브-G1기에 있는 A549 세포들의 대표적인 히스토그램을 보여준다. (1 mL의 각 시료를 Sephadex G25 컬럼에 적용했다. 용리된 물질을 2 ml 분획으로 수집하고 280 nm에서 흡광도를 측정했다. 상용 세포 계수 키트(cell counting kit)를 이용하여 세포 생존력을 평가하고, 서브-G1기에 있는 세포의 비율을 유동 세포 분석에 의해 평가했다.)
도 3i, 3j, 및 3k는 박테리아를 2% 또는 8% 염을 함유하는 배지에서 배양하고, 스태필로코커스의 혼합물 (n = 9), 스태필로코커스 네팔렌시스 CNDG 스트레인 (n = 9) 또는 배지 (n = 9)의 배양물 상층액을 원심분리에 의해 준비하고, 각각 1/10 희석물로 A549 폐포 상피 세포의 배양 배지에 첨가했다는 것을 보여준다. PI(propidium iodide) 및 아넥신 V에 의한 염색 후 A549 세포의 유동 세포 분석을 수행했다.
도 4a, 4b, 및 4c는 박테리아로부터의 배양물 상층액을 여과에 의해 <10 kDa의 분획 및 >10 kDa의 분획으로 분리하고, 1/10 희석물로 각 분획을 A549 폐포 상피 세포에 첨가하여, 유동 세포 분석에 의해 아폽토시스를 결정했다는 것을 보여준다.
도 5a-5c는 코리신의 구조적 정렬 분석을 보여주고; 도 5d 및 5e는 증가되는 농도의 아폽토시스-촉진성 펩티드(pro-apoptotic peptide)를 함유한 DMEM 배지에서 48 시간 배양 후 수행된 A549 폐포 상피 세포의 유동 세포 분석의 결과로, 합성 코리신 펩티드가 용량 의존적 방식으로 스태필로코커스 단리물 상층액(staphylococcal isolate supernatant)의 아폽토시스 촉진 효과를 나타냈다는 것을 보여주며; 도 5f는 식염수 또는 코리신으로 각각 처리된 A549 폐포 상피 세포의 전자현미경 이미지를 보여준다.
도 6a는 식염수, 스크램블(scrambed) 펩티드 또는 코리신에 의해 마우스를 처리하는 일정을 보여준다.
도 6b는 3 마리의 식염수로 처리된 WT 마우스 (WT/SAL), 5 마리의 식염수로 처리된 TGFβ1 TG 마우스 (TGFβ1 TG/SAL), 4 마리의 스크램블 펩티드로 처리된 TGFβ1 TG 마우스 (TGFβ1 TG/스크램블 펩티드) 및 4 마리의 코리신으로 처리된 TGFβ1 TG 마우스 (TGFβ1 TG/코리신)에 대한 BALF(기관지 폐포 세척액) 세포의 계수를 보여주며, 스케일 막대는 100 ㎛를 나타낸다.
도 6c 및 6d는 WinROOF 소프트웨어에 의한 콜라겐 면적의 정량을 보여주며, 스케일 막대는 100 ㎛을 나타낸다.
도 6e는 TGFβ1, MCP(monocyte chemoattractant protein)-l 및 콜라겐 I의 농도가 효소 면역분석법에 의해 측정되었고, WT/SAL 그룹은 n = 3, TGFβ1 TG/SAL 및 TGFβ1 TG/코리신 그룹은 n = 5이며, TGFβ1 TG/스크램블 펩티드는 n =4였다는 것을 보여준다.
도 6f 및 6g는 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick-End Labeling)을 통한 염색에 의해 평가된 DNA 단편화(fragmentation)를 보여주고, 스케일 막대는 50 ㎛를 나타내고, WT/SAL 그룹은 n = 3, TGFβ1 TG/SAL 및 TGFβ1 TG/코리신 그룹은 n = 5이며, TGFβ1 TG/scr 펩티드는 n = 4였다.
도 7a 및 7b는 식염수 또는 각 박테리아의 기관내 주입 (intratracheal instillation) 후 제2일차에 계수되고 Giemsa에 의해 염색된 BALF (bronchoalveolar lavage fluid) 중 세포의 개수를 보여주고, 스케일 막대는 100 ㎛을 나타낸다.
도 7a 및 7b는 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick-End Labeling)을 통한 염색 및 이미지 WinROOF 소프트웨어를 이용한 정량에 의해 평가된 DNA 단편화를 보여준다.
도 8a 및 8b는 각각 4 마리의 WT 마우스 및 4 마리의 TGFβ1 TG 마우스로부터의 폐 조직 중 코리신의 웨스턴 블롯팅의 사진 및 코르신 대 β-액틴의 개별적인 비율을 보여준다. 정량화는 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 수행되었다.
도 8c는 8명의 건강한 대조군, 및 안정한 특발성 폐섬유증(IPF)을 갖는 34명의 환자에 대해 경쟁적 효소 면역 분석법(competitive enzyme immune assay)을 이용하여 측정된 코리신 수준을 보여준다.
도 8d는 급성 악화의 전 및 후에 14명의 IPF 환자에서 코리신의 BALF 수준의 분석을 보여준다.
도 9a 및 9b는 폐 방사선 소견(radiological findings) 및 CT 점수와 Ashcroft 섬유증 점수 및 폐의 히드록시프롤린 함량의 상관관계에 대한 점수산정(scoring) 기준을 보여준다.
도 10a-10d는 폐섬유증 조직의 비정상적 면역 반응을 보여주고, 각각 3가지 상이한 방식으로 처리된 마우스의 폐섬유증 조직 중 단핵세포/대식세포, CD4Cd25 세포, T 세포 및 B 세포의 비율을 보여준다.
도 11은 소듐 수준이 폐섬유증 조직 중 면역 세포의 개수, 섬유증 마커 및 소듐 채널의 발현과 상관관계를 갖는다는 것을 보여준다.
도 12a-12d는 박테리아로부터의 배양물 상층액 중 아폽토시스-촉진성 인자가 열-안정성이라는 것을 보여준다.
도 13은 시료 분획화 단계 및 각 분획의 생리 활성을 기술하는 개략도이다.
도 14는 스태필로코커스 네팔렌시스로부터의 박테리아 상층액의 분획화에 의해 수득된, 각 분획의 A549 폐포 상피 세포에 대한 아폽토시스-촉진 활성을 보여준다.
도 15는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 배양물 상층액의 에탄올 분획, 메탄올 분획, 및 아세토니트릴 분획이 폐 상피 세포의 아폽토시스를 유도했다는 것을 보여준다.
도 16a, 16b, 및 16c는 배양된 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 상층액으로부터 수득된 분획의 아폽토시스-촉진 활성이 프로테이나아제 K 처리에 민감하다는 것을 보여준다.
도 17은 아폽토시스-촉진 활성을 보인 분획의 실버 염색의 사진이다.
도 18a-18e는 다른 제조사에 의해 제조된 합성 코리신 펩티드가 폐포 상피 세포의 용량-의존적 아폽토시스를 유도했고, 코리신의 아폽토시스 활성이 동일 농도의 상층액 단백질보다 훨씬 더 강력했다는 것을 보여준다.
도 19a-19e는 아폽토시스-촉진성 펩티드 (코리신)가 정상 인간 기관지 상피 세포의 아폽토시스를 유도하나, 그의 스크램블 서열은 그렇지 않았다는 것을 보여준다.
도 20a-20e는 합성 아폽토시스-촉진성 펩티드 (코리신)이 열안정성이라는 것을 보여준다.
도 21a-21f는 아폽토시스성 펩티드 (코리신)가 섬유아세포, 혈관 내피 세포, 또는 T 세포의 아폽토시스를 유도하지 않는다는 것을 보여준다.
도 22a 및 22b는 각각 코리신 항체를 이용하여, 마우스 폐 조직 시료 및 스태필로코커스 네팔렌시스의 배양물 상층액의 웨스턴 블롯팅에서 관찰된 코리신의 상응하는 분자량에서의 밴드를 보여준다.
도 23a-23d는 코리신에 대한 항체가 코리신의 아폽토시스-촉진 활성 및 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 상층액의 아폽토시스-촉진 활성을 억제한다는 것을 보여준다.
도 24a-24e는 코리신 서열을 포함하는 전장 트랜스글리코실라아제 351이 아폽토시스 활성을 갖지 않는다는 것을 보여준다.
도 25a 및 25b는 각각 코리신, 스크램블 펩티드, 또는 식염수의 기관내 주입을 위해 이용된 마우스의 CT 이미지 및 소견을 보여준다.
도 26a 및 26b는 각각 스태필로코커스 네팔렌시스, 스태필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis) 또는 식염수의 기관내 주입을 위해 이용된 마우스의 CT 이미지 및 소견을 보여준다.
도 27a 및 27b는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG로부터의 트랜스글리코실라아제 세그먼트(코리신)를 포함하는 합성 펩티드는 폐포 상피 세포의 아폽토시스를 유도하나, 그의 스크램블 펩티드, 또는 스태필로코커스 에피더미디스로부터의 트랜스글리코실라아제 세그먼트의 서열을 포함하는 합성 펩티드는 아폽토시스를 유도하지 않는다는 것을 보여준다.
도 28a 및 28b는 스태필로코커스 네팔렌시스의 기관내 주입 후 무균(germ-free) TGFβ1 TG 마우스에서 방사선 소견의 악화를 보여준다.
도 29a-29d는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG 트랜스글리코실라아제 및 스태필로코커스 속의 그들의 동족(relatives)의 계통발생 분석을 보여준다.
도 30a, 30b, 및 30c는 스태필로코커스 및 스트렙토코커스의 여러 종에서 트랜스글리코실라아제의 아폽토시스-촉진성 세그먼트의 보존된 서열의 다중 서열 정렬을 보여준다. 도 30a 내지 30c에 표시된 코리신은 예를 들면, IVMPESGGNPNAVNPAGYR (서열번호 4), IIMPESGGNPNIVNPYGYS (서열번호 5), IVMPESGGNPNAVNPYGYR (서열번호 6), IVLPESSGNPNAVNPAGYR (서열번호 7), IVLPESSGNPNAVNELGYR (서열번호 8), IVMPESGGNPNAVNELGYR (서열번호 9), IVMPESSGNPNAVNELGYR (서열번호 10), IVMPESSGNPDAVNELGYR (서열번호 11), I AQRESGGDLKAVNPSSGA (서열번호 12), 및 IAERESGGDLKAVNPSSGA (서열번호 13)를 포함하고, 이들은 본 교시의 하나 이상의 양태에서 사용될 수 있다.
도 31a-31f는 스태필로코커스 및 스트렙토코커스의 여러 종에서 트랜스글리코실라아제의 아폽토시스-촉진성 세그먼트의 보존된 서열에 대한 게놈 컨텍스트(genomic context) 및 다중 서열 정렬을 보여준다; 보다 구체적으로, 도 31a는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 SNUC 4025 및 스태필로코커스 코니 아종 코니(Staphylococcus cohnii subspecies cohnii)에서 펩티드 IVMPESSGNPNAVNPAGYR (서열번호 1) 또는 그의 유도체를 포함하는 트랜스글리코실라아제의 게놈 컨텍스트를 보여주고; 도 31b는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)가 코리신과 거의 동일한 펩티드 서열을 갖는 트랜스글리코실라아제 (COE35810 및 COE67256)를 포함한다는 것을 보여주며; 도 31c는 정렬에서 쿼리(query) 서열 및 서브젝트 서열이 각각 스트렙토코커스 뉴모니애 스트레인 N 및 스태필로코커스 와르네리(S. pneumoniae strain N and S. warneri)로부터 유래한다는 것을 보여주고 (상보적 뉴클레오티드 서열은 COE67256 및 스태필로코커스 와르네리(Staphylococcus warneri) 스트레인 SWO, 스트레인 SGI, 스트레인 NCTC 11044, 스트레인 NCTC7291, 및 스트레인 22.1에서 높은 동일성의 단백질(highly identical protein)을 코딩함); 도 31d는 스트렙토코커스 뉴모니애 스트레인 N 및 스태필로코커스 와르네리에서 코리신 서열 또는 그의 유도체를 포함하는 트랜스글리코실라아제의 게놈 컨텍스트를 보여주며; 도 31e는 신생(emerging) 병원체 마이코박테리움 [마이코박테로이데스] 앱세서스(Mycobacterium [Mycobacteroides] abscessus)의 스트레인의 게놈이 스태필로코커스 호미니스 (Staphylococcus hominis)의 트랜스글리코실라아제 (WP_049379270)와 거의 동일한 트랜스글리코실라아제 (SKT99287)를 갖는다는 것을 보여주고; 도 31f는 마이코박테리움 [마이코박테로이데스] 앱세서스 및 스태필로코커스 호미니스에서 코리신 서열 또는 그의 유도체를 포함하는 트랜스글리코실라아제의 게놈 컨텍스트를 보여준다.
도 32a 및 32b는 스트렙토코커스 뉴모니애 스트레인 N 트랜스글리코실라아제로부터의 합성 펩티드가 아폽토시스-촉진 활성을 갖는다는 것을 보여준다.
도 33은 본 명세서에 개시된 연구, 특히, 특발성 폐섬유증 (IPF)의 발병에 대한 코리신의 기여에 기반하여 개발된 섬유증 조직의 모델이다.
도 34a-34c는 도 12a (도 34a), 도 19a (도 34b), 및 도 20a (도 34c)에 기재된 실험에서 이용된 유동 세포분석 게이팅(gating) 전략을 보여주고, SSC는 측면 산란 검출기(side scatter)를 의미하고, FSC는 전면 산란 검출기 (forward scatter)를 의미한다.
도 2a 및 2b는 각각 야생형 (WT) 마우스 (n = 3) 및 TGFβ1 형질전환 (TG) 마우스 (n = 8)의 CT 이미지 및 CT 섬유증 점수(fibrosis scoring)를 보여준다.
도 2c는 고염(hypersaline) 배양 배지에서 48시간 동안 배양 후 야생형 (WT) 마우스 (n = 3) 및 TGFβ1 형질전환 (TG) 마우스 (n = 8)로부터 무균 조건 하에 절제된 섬유증 폐 조직을 보여준다. 박테리아 콜리니의 분석을 TEM(transmission electron microscope)에 의해 수행했다. 스케일 막대는 100 nm를 나타낸다.
도 2d는 스태필로코커스(Staphylococcus spp.)의 혼합물 (스트레인 6; n = 9), 스태필로코커스 네팔렌시스(Staphylococcus nepalensis) 스트레인 CNDG (n = 9), 또는 대조군 배지 (n = 9)의 1/10 희석된 소모된(spent) 배양물 상층액을 포함하는 DMEM 배지에서 48시간 배양된 A549 폐포 상피 세포의 유동 세포 분석을 보여준다.
도 2e는 스태필로코커스(Staphylococcus spp.)의 혼합물 (스트레인 6; n = 8), 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG (n = 8), 또는 대조군 배지 (n = 4)의 1/10 희석된 소모된 배양물 상층액을 포함하는 DMEM 배지에서 48시간 배양된 정상 인간 기관지 상피 세포(hNBEC)의 유동 세포 분석을 보여준다.
도 2f 및 2g는 배지 (n = 6) 또는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 상층액 (n = 6)의 존재 하에 A549 폐포 상피 세포의 배양 후 TUNEL 분석을 보여준다. 스케일 막대는 20 ㎛을 나타낸다.
도 3a는 Sephadex G25 컬럼을 이용한 겔 여과 후 스태필로코커스의 혼합물의 배양물 상층액으로부터의 분획(fraction)의 흡광도를 보여주고; 도 3b는 스태필로코커스의 혼합물의 배양물 상층액으로 A549 폐포 상피 세포를 처리한 후 세포 생존력을 보여주며 (각 분획 n = 3); 도 3c는 스태필로코커스의 혼합물의 배양물 상층액으로 A549 세포를 처리한 후 서브-G1기(sub-G1 phase)에 있는 세포를 보여준다.
도 3d는 스태필로코커스의 혼합물의 배양물 상층액에 의한 처리 후 서브-G1기에 있는 A549 세포들의 대표적인 히스토그램을 보여준다.
도 3e는 겔 여과 후 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 배양물 상층액으로부터의 분획의 흡광도를 보여주고; 도 3f는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 배양물 상층액으로 A549 세포를 처리한 후 세포 생존력을 보여주며 (각 분획 n = 3); 도 3g는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 배양물 상층액으로 A549 세포를 처리한 후 서브-G1기에 있는 세포를 보여준다.
도 3h는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 배양물 상층액에 의한 처리 후 서브-G1기에 있는 A549 세포들의 대표적인 히스토그램을 보여준다. (1 mL의 각 시료를 Sephadex G25 컬럼에 적용했다. 용리된 물질을 2 ml 분획으로 수집하고 280 nm에서 흡광도를 측정했다. 상용 세포 계수 키트(cell counting kit)를 이용하여 세포 생존력을 평가하고, 서브-G1기에 있는 세포의 비율을 유동 세포 분석에 의해 평가했다.)
도 3i, 3j, 및 3k는 박테리아를 2% 또는 8% 염을 함유하는 배지에서 배양하고, 스태필로코커스의 혼합물 (n = 9), 스태필로코커스 네팔렌시스 CNDG 스트레인 (n = 9) 또는 배지 (n = 9)의 배양물 상층액을 원심분리에 의해 준비하고, 각각 1/10 희석물로 A549 폐포 상피 세포의 배양 배지에 첨가했다는 것을 보여준다. PI(propidium iodide) 및 아넥신 V에 의한 염색 후 A549 세포의 유동 세포 분석을 수행했다.
도 4a, 4b, 및 4c는 박테리아로부터의 배양물 상층액을 여과에 의해 <10 kDa의 분획 및 >10 kDa의 분획으로 분리하고, 1/10 희석물로 각 분획을 A549 폐포 상피 세포에 첨가하여, 유동 세포 분석에 의해 아폽토시스를 결정했다는 것을 보여준다.
도 5a-5c는 코리신의 구조적 정렬 분석을 보여주고; 도 5d 및 5e는 증가되는 농도의 아폽토시스-촉진성 펩티드(pro-apoptotic peptide)를 함유한 DMEM 배지에서 48 시간 배양 후 수행된 A549 폐포 상피 세포의 유동 세포 분석의 결과로, 합성 코리신 펩티드가 용량 의존적 방식으로 스태필로코커스 단리물 상층액(staphylococcal isolate supernatant)의 아폽토시스 촉진 효과를 나타냈다는 것을 보여주며; 도 5f는 식염수 또는 코리신으로 각각 처리된 A549 폐포 상피 세포의 전자현미경 이미지를 보여준다.
도 6a는 식염수, 스크램블(scrambed) 펩티드 또는 코리신에 의해 마우스를 처리하는 일정을 보여준다.
도 6b는 3 마리의 식염수로 처리된 WT 마우스 (WT/SAL), 5 마리의 식염수로 처리된 TGFβ1 TG 마우스 (TGFβ1 TG/SAL), 4 마리의 스크램블 펩티드로 처리된 TGFβ1 TG 마우스 (TGFβ1 TG/스크램블 펩티드) 및 4 마리의 코리신으로 처리된 TGFβ1 TG 마우스 (TGFβ1 TG/코리신)에 대한 BALF(기관지 폐포 세척액) 세포의 계수를 보여주며, 스케일 막대는 100 ㎛를 나타낸다.
도 6c 및 6d는 WinROOF 소프트웨어에 의한 콜라겐 면적의 정량을 보여주며, 스케일 막대는 100 ㎛을 나타낸다.
도 6e는 TGFβ1, MCP(monocyte chemoattractant protein)-l 및 콜라겐 I의 농도가 효소 면역분석법에 의해 측정되었고, WT/SAL 그룹은 n = 3, TGFβ1 TG/SAL 및 TGFβ1 TG/코리신 그룹은 n = 5이며, TGFβ1 TG/스크램블 펩티드는 n =4였다는 것을 보여준다.
도 6f 및 6g는 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick-End Labeling)을 통한 염색에 의해 평가된 DNA 단편화(fragmentation)를 보여주고, 스케일 막대는 50 ㎛를 나타내고, WT/SAL 그룹은 n = 3, TGFβ1 TG/SAL 및 TGFβ1 TG/코리신 그룹은 n = 5이며, TGFβ1 TG/scr 펩티드는 n = 4였다.
도 7a 및 7b는 식염수 또는 각 박테리아의 기관내 주입 (intratracheal instillation) 후 제2일차에 계수되고 Giemsa에 의해 염색된 BALF (bronchoalveolar lavage fluid) 중 세포의 개수를 보여주고, 스케일 막대는 100 ㎛을 나타낸다.
도 7a 및 7b는 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick-End Labeling)을 통한 염색 및 이미지 WinROOF 소프트웨어를 이용한 정량에 의해 평가된 DNA 단편화를 보여준다.
도 8a 및 8b는 각각 4 마리의 WT 마우스 및 4 마리의 TGFβ1 TG 마우스로부터의 폐 조직 중 코리신의 웨스턴 블롯팅의 사진 및 코르신 대 β-액틴의 개별적인 비율을 보여준다. 정량화는 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 수행되었다.
도 8c는 8명의 건강한 대조군, 및 안정한 특발성 폐섬유증(IPF)을 갖는 34명의 환자에 대해 경쟁적 효소 면역 분석법(competitive enzyme immune assay)을 이용하여 측정된 코리신 수준을 보여준다.
도 8d는 급성 악화의 전 및 후에 14명의 IPF 환자에서 코리신의 BALF 수준의 분석을 보여준다.
도 9a 및 9b는 폐 방사선 소견(radiological findings) 및 CT 점수와 Ashcroft 섬유증 점수 및 폐의 히드록시프롤린 함량의 상관관계에 대한 점수산정(scoring) 기준을 보여준다.
도 10a-10d는 폐섬유증 조직의 비정상적 면역 반응을 보여주고, 각각 3가지 상이한 방식으로 처리된 마우스의 폐섬유증 조직 중 단핵세포/대식세포, CD4Cd25 세포, T 세포 및 B 세포의 비율을 보여준다.
도 11은 소듐 수준이 폐섬유증 조직 중 면역 세포의 개수, 섬유증 마커 및 소듐 채널의 발현과 상관관계를 갖는다는 것을 보여준다.
도 12a-12d는 박테리아로부터의 배양물 상층액 중 아폽토시스-촉진성 인자가 열-안정성이라는 것을 보여준다.
도 13은 시료 분획화 단계 및 각 분획의 생리 활성을 기술하는 개략도이다.
도 14는 스태필로코커스 네팔렌시스로부터의 박테리아 상층액의 분획화에 의해 수득된, 각 분획의 A549 폐포 상피 세포에 대한 아폽토시스-촉진 활성을 보여준다.
도 15는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 배양물 상층액의 에탄올 분획, 메탄올 분획, 및 아세토니트릴 분획이 폐 상피 세포의 아폽토시스를 유도했다는 것을 보여준다.
도 16a, 16b, 및 16c는 배양된 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 상층액으로부터 수득된 분획의 아폽토시스-촉진 활성이 프로테이나아제 K 처리에 민감하다는 것을 보여준다.
도 17은 아폽토시스-촉진 활성을 보인 분획의 실버 염색의 사진이다.
도 18a-18e는 다른 제조사에 의해 제조된 합성 코리신 펩티드가 폐포 상피 세포의 용량-의존적 아폽토시스를 유도했고, 코리신의 아폽토시스 활성이 동일 농도의 상층액 단백질보다 훨씬 더 강력했다는 것을 보여준다.
도 19a-19e는 아폽토시스-촉진성 펩티드 (코리신)가 정상 인간 기관지 상피 세포의 아폽토시스를 유도하나, 그의 스크램블 서열은 그렇지 않았다는 것을 보여준다.
도 20a-20e는 합성 아폽토시스-촉진성 펩티드 (코리신)이 열안정성이라는 것을 보여준다.
도 21a-21f는 아폽토시스성 펩티드 (코리신)가 섬유아세포, 혈관 내피 세포, 또는 T 세포의 아폽토시스를 유도하지 않는다는 것을 보여준다.
도 22a 및 22b는 각각 코리신 항체를 이용하여, 마우스 폐 조직 시료 및 스태필로코커스 네팔렌시스의 배양물 상층액의 웨스턴 블롯팅에서 관찰된 코리신의 상응하는 분자량에서의 밴드를 보여준다.
도 23a-23d는 코리신에 대한 항체가 코리신의 아폽토시스-촉진 활성 및 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 상층액의 아폽토시스-촉진 활성을 억제한다는 것을 보여준다.
도 24a-24e는 코리신 서열을 포함하는 전장 트랜스글리코실라아제 351이 아폽토시스 활성을 갖지 않는다는 것을 보여준다.
도 25a 및 25b는 각각 코리신, 스크램블 펩티드, 또는 식염수의 기관내 주입을 위해 이용된 마우스의 CT 이미지 및 소견을 보여준다.
도 26a 및 26b는 각각 스태필로코커스 네팔렌시스, 스태필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis) 또는 식염수의 기관내 주입을 위해 이용된 마우스의 CT 이미지 및 소견을 보여준다.
도 27a 및 27b는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG로부터의 트랜스글리코실라아제 세그먼트(코리신)를 포함하는 합성 펩티드는 폐포 상피 세포의 아폽토시스를 유도하나, 그의 스크램블 펩티드, 또는 스태필로코커스 에피더미디스로부터의 트랜스글리코실라아제 세그먼트의 서열을 포함하는 합성 펩티드는 아폽토시스를 유도하지 않는다는 것을 보여준다.
도 28a 및 28b는 스태필로코커스 네팔렌시스의 기관내 주입 후 무균(germ-free) TGFβ1 TG 마우스에서 방사선 소견의 악화를 보여준다.
도 29a-29d는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG 트랜스글리코실라아제 및 스태필로코커스 속의 그들의 동족(relatives)의 계통발생 분석을 보여준다.
도 30a, 30b, 및 30c는 스태필로코커스 및 스트렙토코커스의 여러 종에서 트랜스글리코실라아제의 아폽토시스-촉진성 세그먼트의 보존된 서열의 다중 서열 정렬을 보여준다. 도 30a 내지 30c에 표시된 코리신은 예를 들면, IVMPESGGNPNAVNPAGYR (서열번호 4), IIMPESGGNPNIVNPYGYS (서열번호 5), IVMPESGGNPNAVNPYGYR (서열번호 6), IVLPESSGNPNAVNPAGYR (서열번호 7), IVLPESSGNPNAVNELGYR (서열번호 8), IVMPESGGNPNAVNELGYR (서열번호 9), IVMPESSGNPNAVNELGYR (서열번호 10), IVMPESSGNPDAVNELGYR (서열번호 11), I AQRESGGDLKAVNPSSGA (서열번호 12), 및 IAERESGGDLKAVNPSSGA (서열번호 13)를 포함하고, 이들은 본 교시의 하나 이상의 양태에서 사용될 수 있다.
도 31a-31f는 스태필로코커스 및 스트렙토코커스의 여러 종에서 트랜스글리코실라아제의 아폽토시스-촉진성 세그먼트의 보존된 서열에 대한 게놈 컨텍스트(genomic context) 및 다중 서열 정렬을 보여준다; 보다 구체적으로, 도 31a는 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 SNUC 4025 및 스태필로코커스 코니 아종 코니(Staphylococcus cohnii subspecies cohnii)에서 펩티드 IVMPESSGNPNAVNPAGYR (서열번호 1) 또는 그의 유도체를 포함하는 트랜스글리코실라아제의 게놈 컨텍스트를 보여주고; 도 31b는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)가 코리신과 거의 동일한 펩티드 서열을 갖는 트랜스글리코실라아제 (COE35810 및 COE67256)를 포함한다는 것을 보여주며; 도 31c는 정렬에서 쿼리(query) 서열 및 서브젝트 서열이 각각 스트렙토코커스 뉴모니애 스트레인 N 및 스태필로코커스 와르네리(S. pneumoniae strain N and S. warneri)로부터 유래한다는 것을 보여주고 (상보적 뉴클레오티드 서열은 COE67256 및 스태필로코커스 와르네리(Staphylococcus warneri) 스트레인 SWO, 스트레인 SGI, 스트레인 NCTC 11044, 스트레인 NCTC7291, 및 스트레인 22.1에서 높은 동일성의 단백질(highly identical protein)을 코딩함); 도 31d는 스트렙토코커스 뉴모니애 스트레인 N 및 스태필로코커스 와르네리에서 코리신 서열 또는 그의 유도체를 포함하는 트랜스글리코실라아제의 게놈 컨텍스트를 보여주며; 도 31e는 신생(emerging) 병원체 마이코박테리움 [마이코박테로이데스] 앱세서스(Mycobacterium [Mycobacteroides] abscessus)의 스트레인의 게놈이 스태필로코커스 호미니스 (Staphylococcus hominis)의 트랜스글리코실라아제 (WP_049379270)와 거의 동일한 트랜스글리코실라아제 (SKT99287)를 갖는다는 것을 보여주고; 도 31f는 마이코박테리움 [마이코박테로이데스] 앱세서스 및 스태필로코커스 호미니스에서 코리신 서열 또는 그의 유도체를 포함하는 트랜스글리코실라아제의 게놈 컨텍스트를 보여준다.
도 32a 및 32b는 스트렙토코커스 뉴모니애 스트레인 N 트랜스글리코실라아제로부터의 합성 펩티드가 아폽토시스-촉진 활성을 갖는다는 것을 보여준다.
도 33은 본 명세서에 개시된 연구, 특히, 특발성 폐섬유증 (IPF)의 발병에 대한 코리신의 기여에 기반하여 개발된 섬유증 조직의 모델이다.
도 34a-34c는 도 12a (도 34a), 도 19a (도 34b), 및 도 20a (도 34c)에 기재된 실험에서 이용된 유동 세포분석 게이팅(gating) 전략을 보여주고, SSC는 측면 산란 검출기(side scatter)를 의미하고, FSC는 전면 산란 검출기 (forward scatter)를 의미한다.
방법
시약
인간 폐 상피 세포주 A549 및 고염 배지 (ATCC 배지 1097, 2168)는 ATCC (American Type Culture Collection) (Manassas, VA)로부터 수득하고, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)은 Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO)로부터 수득하며, FBS (fetal bovine serum)는 Bio Whittaker (Walkersville, MD)로부터 수득했다. L-글루타민, 페니실린, 및 스트렙토마이신은 Invitrogen (Carlsbad, CA)으로부터 수득했다. NHBE (Normal human bronchial epithelial) 세포는 Clonetics (Walkersville, MD)로부터 수득했다. 합성 펩티드는 Peptide Institute Incorporation (Osaka, Japan) 및 ThermoFisher Scientific (Waltham, MA, USA)에 의해 제조되고 제공되었다.
개체
본원에 기술된 연구는 안정한 특발성 폐섬유증을 갖는 34명의 일본인 환자들 (IPF; 평균 연령: 71.7 - 6.6세, 남성: 29명, 여성: 5명) 및 8명의 건강한 일본인 남성 자원자 (38.3 ± 6.1세)를 포함했다. 전술된 표 3은 환자의 특징을 기술한다. 특발성 폐섬유증의 진단은 NPL65 및 NPL66에 따른 국제적 기준에 따라 수행했다. 미국 흉부학회 (Americal Thoracic Society)의 가이드라인에 따라 기관지내시경 연구를 수행하고, BALF (bronchoalveolar lavage fluid) 시료를 34명의 IPF 환자 및 8명의 건강한 자원자 전원으로부터 수집했다. NPL65를 참조한다. 34명의 참여 IPF 환자 중 14명으로부터 질병의 급성 악화 동안 BALF 시료를 입수했다. 무균 튜브 내로 수집된 비가공 BALF (bronchoalveolar lavage fluid)의 분량을 분석할 때까지 -80℃에서 보관했다.
동물
본 발명자들은 이전에 규명된 인간 TGFβ1의 잠재형(latent form)의 폐-특이적 과발현을 갖는 C57BL/6J 배경인 형질전환 (TG) 마우스를 이용했다. NPL8 및 NPL11을 참조한다. 이러한 TGFβ1 TG 마우스는 10주령부터 자발적으로 폐섬유증을 발병했고, 인간에서의 폐섬유증과 유사성을 보였다. Id C57BL/6J 야생형 (WT) 마우스를 대조군으로 이용했다. 실험 중 일부에서, 폐섬유증이 없는 TGFβ1 TG 마우스를 대조군으로 이용했다; 그러나, 인간 TGFβ1 형질전환 유전자 양성이나 표현형 (폐섬유증)이 없이 태어난 마우스의 수는 극도로 부족하거나 드물고, 따라서, 모든 실험에 이들을 포함시키는 것은 매우 어려웠다. 모든 마우스를 미에 대학교(Mie University)의 실험 동물 시설에서 12-h 명/암 주기 하에 특정한 무균(pathogen-free) 환경에서 유지시켰다. 표준 PCR 분석, 마우스의 꼬리로부터 단리된 DNA, 및 NPL11에 기술된 프라이머쌍 (보충 표 5)을 이용하여, TG 마우스의 유전형분석(genotyping)을 수행했다.
CT (Computed tomography)
본 발명자들은 마이크로-CT (LathetaLCT-200, Hitachi A1 oka Medical, Tokyo, Japan)를 이용하여 마우스의 흉부의 방사선 평가를 수행했다. 마우스는 마취제로 이소플루란 흡입을 투여받았고, NPL67에 따라 데이터 획득을 위해 엎드린 위치로 배치되었다. 처리 그룹에 맹검인 호흡기 질환의 전문가 6명이 하기 기준에 근거하여 흉부 CT 소견을 평가했다: 1점, 정상 소견; 2점, 중간 소견; 3점, 경미한 폐섬유증; 4점, 중간 소견; 5점, 중등증(moderate) 폐섬유증; 6점, 중간 소견; 및 7점, 진행(advanced) 폐섬유증. NPL67을 참조한다. 본 발명자들은 CT 소견을 검증하기 위해 Ashcroft 폐섬유증 점수 및 폐의 히드록시프롤린 함량을 이용했다 (도 9b).
마우스에서 폐섬유증의 평가
깊은 마취 하에, 본 발명자들은 생화학적 분석 및 세포 계수를 위해 BALF (bronchoalveolar lavage fluid)를 수집했다. 요약하면, BALF는 NPL68에 따라, 기관(trachea)에 20-게이지 바늘을 이용하여 캐뉼라를 삽입하고 식염수를 폐에 주입하는 것에 의해 수행했다. 시료를 원심분리하고, 상층액을 분석할 때까지 -80℃에 보관했다. 세포 펠렛을 생리적 식염수 용액에 재현탁시키고, 세포의 개수를 계수했다. 세포 계수를 위해 ChemoMetec (Allerod, Denmark)의 뉴클레오카운터(nucleocounter)를 이용하고, 상이한(differential) 세포들을 계수하기 위해 세포를 May-Griinwald-Giemsa (Merck, Darmstadt, Germany)로 염색했다. 마우스를 마취제 과잉 투여에 의해 희생시키고, 폐를 절제하여 포르말린에 고정시키고, 파라핀에 포매하고, 헤마톡실린 & 에오신 염색을 위해 준비했다. Ashcroft 기준에 근거하여 폐섬유증의 중증도를 정량했다. NPL67을 참조한다. BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA)으로부터의 상용 효소 면역분석법 키트를 이용하여 측정했다.
윤리 진술서(Ethical statement)
임상 연구에 참가하는 모든 개체들은 서면 고지 동의서를 제출했고, 연구 프로토콜은 미에 대학교 (Mie University) (허가 No: H2019064, 일자: 25/04/2019), 마추사카 시립 병원 (Matsusaka Municipal Hospital)(허가 일자: 11/06/2014), 및 추오 의료원 (Chuo Medical Center) (허가 No 2014-6, 일자: 02/09/2014)의 임상 연구 윤리 위원회 (Ethical Committees for Clinical Investigation)의 허가를 받고 헬싱키 선언의 원칙(Principles of the Declaration of Helsinki)에 따라 수행했다. 재조합 DNA 실험 안전성 위원회 (Recombinant DNA Experiment Safety Committee) (허가 No: 1-614 (henkol); 일자: 2013/15/12; 허가 No: 1-708, 일자: 13/02/2019) 및 미에 대학교의 동물 연구 위원회 (Committee for Animal Investigation of Mie University)는 실험 프로토콜을 허가했고 (허가 No: 25-20-henl-sail, 일자: 23/07/2015; 허가 No: 29-23, 일자: 15/-01/2019) 및 모든 절차는 미국 국립보건원 (U.S. National Institute of Health)에 의해 발표된 실험 동물의 국제적으로 허가된 원칙에 따라 수행했다.
인 비트로 배양을 위한 폐 샘플링
무균 조건 하에, 본 발명자들은 과량의 펜토바르비탈의 복강내 주사에 의한 마우스의 안락사 후에 폐의 좌엽 및 우엽을 절제하고, 조직을 무균 튜브 내에 넣고, 사용할 때까지 즉시 -80℃에 보관했다.
폐 조직 Na+의 측정
본 발명자들은 폐섬유증이 있거나 또는 없는 TGFβ1 마우스 및 WT 마우스로부터 폐를 제거했다. 마이크로파 분석/ICP-MS (inductively coupled plasma mass spectrometry), 마이크로파 회화 시스템 (microwave ashing system) ETHOS-TC (Milestone General) 및 ICP-MS 시스템 7700x (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 이용하여 조직 소듐 함량을 측정하기 위해 시료를 Shimadzu Techno-Research, Incorporation (Kyoto, Japan)에 보냈다. NPL69 및 NPL70을 참조한다. 결과가 도 1c에 표시된다.
폐 조직 면역 세포의 평가
폐 면역 세포를 단리하기 위해, 마취제 과량에 의한 마우스 희생 후, 본 발명자들은 가위로 마우스를 절개하고 2-3 mm 조각으로 자르고, 0.5 mg/ml 콜라게나아제 용액 중에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 스테인레스 스틸 메쉬를 통해 여과시켰다. 폐 세포를 분리하고 등장성 33% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 용액을 이용하여 정제했다. 그 후, 본 발명자들은 하기 표 4에 기술된 항체를 이용하여 유동 세포분석법에 의해 폐 면역 세포를 검출했다.
마우스에서 아폽토시스-촉진성 코리신의 효과 평가
CT 점수에 의해 평가된 폐섬유증의 일치하는 등급 (수준)을 갖는 TGFβ1 TG 마우스 (각각 n=5 또는 n=4)의 3개의 그룹에 1일차 및 2일차에 코리신 또는 스크램블 펩티드 또는 0.9% NaCl 용액의 기관내 주입을 수행하고 3일차에 희생시켜 폐 염증 및 섬유증의 변화를 평가했다. 0.9% NaCl 용액으로 처리된 폐섬유증이 없는 WT 마우스 (n=3)를 대조군으로 이용했다.
스태필로코커스 네팔렌시스의 기관내 주입
본 발명자들은 반코마이신 (0.5 mg/ml), 네오마이신 (1 mg/ml), 암피실린 (1 mg/ml), 메트로니다졸 (1 mg/ml) 및 겐타마이신 (1 mg/ml)을 포함하는 항생제의 칵테일을 포함하는 용액 200 ㎕를 경구 위관 영양에 의해 3개의 그룹의 TGFβ1 TG 마우스에 4일 동안 1일 1회 투여했다. 모든 마우스는 CT 점수에 의해 평가된 폐섬유증의 일치된 등급을 가졌다. 5일차에, 한 그룹의 마우스에 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG 또는 스태필로코커스 에피더미디스 ATCC14990의 1 x 108 cfu (colony forming units) (75 ㎕)의 기관내 주입을 투여하고, 2일 후에 희생시켰다. 0.9% NaCl 용액으로 처리된 무균 TGFβ1 TG 마우스를 대조군으로 이용했다.
박테리아 단리, 배양, 및 소모된(spent) 배지 제조
폐섬유증이 있는 TGFβ1 TG 마우스 및 WT 마우스로부터의 폐를 인 비트로 미생물 배양을 위해 이용했다. 폐 조직 시료를 PBS로 세척하고 ATCC 배지 1097 (8% NaCl)에 접종하고 증식이 보일 때까지 220 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 배양했다. ATCC 배지 1097 아가 플레이트에 액체 배지-배양된 개체를 플레이팅하는 것에 의해 박테리아 콜로니를 단리했다. 각각의 단일 콜로니를 액체 ATCC 배지 1097 (8% NaCl)에 접종하고, 37℃, 220 rpm에서 24시간 동안 배양했다. 배양물을 4,000 rpm으로 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하고, 결과적으로 수득된 상층액을 MILLEXGP 필터 유닛 (0.22㎛, Millipore)을 통해 여과시켜서 잔여 세포를 제거하고 소모된 박테리아 배지로 이용했다.
위상차 현미경
본 발명자들은 NPL71에 따라, 지수 증식기에 있는 단일 콜로니로부터 박테리아 세포를 회수하고, 4℃에서 밤새 고정액(fixative)에 침지시키고, 위상차 현미경 (Frederick Seitz Materials Research Lab, UIUC)을 이용하여 현미경 사진을 수집했다.
게놈 DNA 시퀀싱 및 게놈 각주(genome annotation)
Oxford Nanopore Sequencing과 Illumina Miseq 나노 시퀀싱의 조합으로 게놈 시퀀싱을 수행하여 완전한 Qscore로 6.3 Gb 및 1.6 백만개 (2x250) 뉴클레오티드를 생성시켰다. 요약하면, 박테리아 스트레인으로부터의 게놈 DNA (400 ng)를 Rapid Barcoding 라이브러리 키트 SQK- RAD004를 이용하여 Nanopore 라이브러리로 전환시켰다. 라이브러리를 GridlON 시퀀서에서 48시간 동안 SpotON R9.4.1 FLO-MINI 06 플로우셀(flowcell)에서 시퀀싱했다. Guppy 1.4.3으로 염기-검출(base-calling)을 수행하고, Porechops 0.2.3으로 역다중화(demultiplexing)를 수행했다. 리드(read)의 대다수는 길이가 6 kb 내지 30 kb이었으나, 94 kb 까지의 리드도 수득되었다. Kapa Biosystems (Roche)로부터의 Hyper Library 구축 키트를 이용하여 샷컨 게놈 라이브러리(shotgun genome library)를 제조하는 것에 의해 Illumina Miseq 시퀀싱을 수행했다. 상기 라이브러리를 qPCR에 의해 정량하고 MiSeq 500-사이클 시퀀싱 키트 버전 2를 이용하여 단편의 각 말단으로부터 251회의 사이클 동안 하나의 MiSeq Nano 플로우셀에서 시퀀싱했다. bcl2fastq v2.20 Conversion Software (Illumina)를 이용하여 Fastq 파일을 생성하고 역다중화시켰다.
주로, 가장 우수한 전체 조립(best overall assembly)을 찾기 위한 상이한 조립 전략을 이용하여 품질을 평가하기 위해, 하기와 같이 4개의 조립을 수행하는 작업흐름(workflow)을 개발했다. Oxford Nanopore 데이터의 초기 조립을 Canu (NPL72)를 이용하여 수행하고, 뒤이어 Nanopolish (NPL73) 및 Pilon (Illumina MiSeq 리드를 이용함 - NPL74)을 이용하여 폴리싱(polish)하고, 최종적으로 Circlator (NPL75)를 이용하여 게놈을 재-배향시켰다. SPAdes (NPL76)를 이용하여 또 다른 하이브리드 게놈 조립을 수행하고, 뒤이어 Circlator를 이용하여 게놈을 재배향시켰다. 하이브리드 게놈 조립을 또한 Unicycler를 이용하여 수행했다 (NPL77). Unicycler를 이용하여 최종 하이브리드 게놈 조립을 생성시켰고, 전술된 Canu 조립이 조립 백본이었다.
BUSCO (NPL78) 및 QUAST (NPL79)를 이용하여 모든 조립을 품질-평가했고, MUMmer를 이용하여 적절한 기준 게놈에 비교했다. NPL80을 참조한다. 조립은 툴 Prokka를 이용한 주석 수행(annotation run)으로 이어졌다(NPL81). 평가 후에, 가장 우수한 전체 조립을 전체 조립 측정기준(metrics)과 함께 가장 좋은 전체 BUSCO 점수를 이용하여 결정했다.
아폽토시스 인자의 분자량의 평가
진탕하면서 37℃에서 Halomonas 배지 (8% NaCl, 0.75% 카사미노산, 0.5% 프로테오스 펩톤, 0.1% 효모 추출물, 0.3% 소듐 시트레이트, 2% 황산마그네슘 7수화물, 0.05% 제2인산칼륨(potassium phosphate dibasic), 0.05% 황산 제2철 암모늄 6수화물 (ammonium iron (II) sulfate hexahydrate))에서 증식된 배양물로부터 박테리아 배양물 상층액을 준비했다. 박테리아 세포를 원심분리 (17,000 x g, 4℃에서 10분간) 및 0.2 ㎛ 필터 (Coming)를 통한 여과에 의해 제거했다. 상층액을 Ultracel-lOK 필터 (Amicon)에 의한 한외여과에 의해 고분자량 (HMW) 및 저분자량 (LMW) 분획으로 크기 분획화키고, 분량(aliquot)으로 분주하고 -20℃에서 동결시켰다. 일부 실험에서, 박테리아 배양물 상층액을 크기 분획화 전에 열-처리했다 (85℃, 15 분). 동일한 부피의 상층액을 17.5% 트리시딘(Tricine)-SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 분리하고, Daiichi 2-D Silver Staining Kit (Daiichi, Tokyo, Japan)를 이용하여 실버-염색시켰다.
세포 배양
A549 및 NHBE 세포를 37℃에서 가습된(humidified) 5% CO2 대기에서 10% FCS(fetal calf serum), 0.03% (w/v) L-글루타민, 100 IU/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양했다. A549 세포가 일차 NHBE 세포 (NPL82, NPL83)보다 더 높은 잠재적 증식을 갖고 폐포 타입 II 세포의 표현형을 모사하고; 또한, 이러한 일차 세포들은 통상적으로 표현형을 쉽게 바꾸거나, 또는 짧은 배양 기간 후에 노화되기 때문에 본 발명자들은 대부분의 실험에서 A549 세포주를 이용했다.
박테리아 배양물 상층액 (2 리터)을 연속적으로 n-헥산과 물, 및 에틸 아세테이트와 물 (각각 2L, 2회)에 분배시켰다 (도 13). 농축된 단백질을 감압 하에 더 농축시키고, 에탄올로 추출했다(각각 2 리터, 2회). 에탄올-가용성 부분(ethanol-soluble portion) (7.96 g)을 옥타데실 실란 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (5%; 10%, 20%, 50% 메탄올 및 메탄올, 각 0.5 리터)에 의해 분획화시켜서 42개의 분획을 얻었다 (분획(fraction) 1~42). 분획 42 (185.3 mg의 단백질)를 Sep-Pak (80% 아세토니트릴, 메탄올, 및 클로로포름)에 의해 더 분리시켰다. 분획 42-80% 아세토니트릴 (75.6 mg의 단백질)을 역상 HPLC (C8, 80% 메탄올)에 의해 분리하여 22개의 분획을 수득했다 (분획 42-80% 아세토니트릴-l~22).
질량 분광분석법(Mass spectrometry)
건조된 시료를 5% 아세토니트릴 (ACN) 중 0.1% 포름산에 현탁시키고, 2 ㎍의 펩티드를 Thermo UltiMate 3000 UHPLC 시스템에 주입했다. 15 cm Acclaim PepMap 100 C18 컬럼을 이용하여 물 중 0.1% FA (A) 및 ACN 중 0.1% FA (B)의 이동상으로 시료 펩티드의 역상 분리(reversed phase separation)를 달성했다. 펩티드를 300 ㎕/분의 유속으로 60분 동안 2% B부터 35% B의 구배 및 뒤이은 5분 동안 35%부터 50% B의 구배를 이용하여 용리시켰다. UHPLC 시스템을 데이터 의존적 모드로 작동되는 Thermo Orbitrap Q-Exactive HFX (Biopharma Option) 질량 분광분석기에 온라인으로 커플링시켰다. 300 내지 1,500 m/z (120,000 resolution)의 전구체 스캔(precursor scan) 후 3 s의 최대 사이클 시간 동안 가장 풍부한 전구체의 CID (collision induced dissociation)를 수행했다 (3e4 AGC, 35% NCE, 1.6 m/z 단리 창(isolation window), 60 s 동적 배제 창(dynamic exclusion window)).
원시 데이터를 스태필로코커스 네팔렌시스 CNDG 게놈 DNA의 단백질 라이브러리 및 폴리펩티드를 코딩하는 대형 및 소형 플라스미드를 포함하는 커스텀 데이터베이스(총 3,541개의 단백질 서열)에 대해 Mascot 1.6을 이용하여 분석했다. 어떠한 효소도 특정되지 않았다. 펩티드 질량 공차(mass tolerance) 및 단편 질량 공차를 각각 10 ppm 및 0.1 Da으로 설정했다. 변수 변형(variable modifications)은 메티오닌 잔기의 산화를 포함했다 (보충 정보(Supplementary Information)의 질량 분광분석 데이터 참조).
아폽토시스 분석
A549 및 NBHE 세포 (4 x 105개 세포/웰)를 12-웰 플레이트에 접종하고, 컨플루언시 전(sub-confluency)까지 배양하고, 세척하고, 각 박테리아 상층액 10%를 포함하는 무혈청 배지에서 48시간 동안 배양했다. 비-접종 고염 배지를 대조군으로 이용했다. 세포를 플루오레세인-표지 아넥신 V 및 요오드화 프로피디움으로 염색한 후(FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit with PI, Biolegend, San Diego, CA) 유동 세포분석법 (FACScan, BD Biosciences, Oxford, UK)에 의해 아폽토시스에 대해 분석했다. 실험에서 이용된 유동 세포측정법 게이팅 전략이 도 34a-34c에 기술된다. 생리적 조건 하에, 포스파티딜콜린은 외부에 노출되고, 포스파티딜세린 (PS)은 세포막의 지질 이중층의 내부 표면에 위치한다. NPL84를 참조한다. 아폽토시스 동안, PS는 원형질막의 세포질 쪽으로부터 세포 표면으로 이행된다. Id. 아넥신 V는 Ca2+-의존적 방식으로 포스파티딜세린으로의 결합에 대해 강한 친화도를 보이고, 따라서, 일반적으로 아폽토시스의 검출을 위한 프로브로 이용된다 (NPL85 참조).
웨스턴 블롯팅
웨스턴 블롯 분석을 위해 세포를 얼음-냉각 PBS로 2회 세척하고, 프로테아제/포스파타아제 억제제 (1 mM 오르토반테이트, 50 mM β-글리세로포스페이트, 10 mM 소듐 피로포스페이트, 5 ㎍/mL 류펩틴, 2 ㎍/mL 아프로티닌, 5 mM 소듐 플루오리드)가 보충된 RIPA (radioimmunoprecipitation assay) 완충액 (10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 0.1 % 소듐 데옥시콜레이트, 0.1 % SDS, 140 mM NaCl, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오리드)에 용해시켰다. 현탁액을 원심분리하고 (17,000 x g, 4℃에서 10분), Pierce BCA 단백질 분석 키트 (Thermo Fisher Scientific Incorporation, Waltham, MA)를 이용하여 단백질 함량을 결정했다. 세포 용해물 (cellular lysate) 단백질의 동량을 Laemmli 시료 완충액과 혼합하고, SDS-PAGE에 의해 분리시켰다. 그 후, 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔로부터 니트로셀룰로오스 막으로 전기영동에 의해 이동시킨 후 항-포스포-Akt, 항-Akt, 항-절단 카스파아제-3 또는 항-β-액틴 항체 (Cell Signaling, Danvers, MA)를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행했다. NPL67 참조. 밴드의 강도는 공유 NIH imageJ 프로그램 (Wayne Rasband, NIH, Research Service Branch)을 이용하여 밀도 측정에 의해 정량했다.
면역조직화학
TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick-End Labeling)의 염색을 Alexa Fluor 594 염소 항-래빗 IgG 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 포함한 슬로우-페이드 골드-안티페이드 시약(slow-fade gold-antifade reagent)을 이용하거나, 또는 ApopTag 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제 (Merck Millipore, Burlington, MA), 항-디곡시게닌-퍼옥시다아제, 및 3,3'-디아미노벤지딘을 사용하는 것에 의해 Biopathology Institute Corporation (Kunisaki, Oita, Japan)에서 수행했다. 아폽토시스 면적의 정량화는 WinROOF 소프트웨어 (Mitani Corporation, Tokyo, Japan)를 이용하여 수행하고, 각각의 개별 마우스에 대해 값들을 평균했다.
유전자 발현의 평가
본 발명자들은 Sepasol RNA-I Super G 시약 (Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan)을 이용하여 세포 또는 폐 조직으로부터 총 RNA를 추출하고, 올리고-dT 프라이머 및 ReverTra Ace Reverse Transcriptase (Toyobo Life Science Department, Osaka, Japan)를 이용하여 2 ㎍의 총 RNA로부터 cDNA를 합성하고, 하기 표 5에 기재된 프라이머를 이용하여 표준 PCR을 수행했다.
PCR은 94℃에서 30초의 변성, 65℃에서 30초의 어닐링, 72℃에서 1분의 신장의 사이클을 유전자에 따라 26회 내지 35회 사이클 및 뒤이은 72℃에서 5분간 추가적 연장(extension)으로 수행했다. NPL67을 참조한다. mRNA의 발현을 GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) mRNA 발현에 대해 정규화시켰다.
아폽토시스 세포의 TEM (Transmission electron microscopy)
A549 세포 (10 x 104개 세포/ml)를 콜라겐-코팅 8-웰 챔버 슬라이드(BD Bioscience, San Jose, CA)에 플레이팅하고, 세미-컨플루언시(semi-confluent)까지 배양했다. 세포를 6시간 동안 혈청-고갈(serum-starved)시키고, 16시간 동안 아폽토시스-촉진성 펩티드 (5 mM)로 자극했다. 세포를 실온에서 2시간 동안 0.1M 소듐 카코딜레이트 완충액 (pH 7.4) 중 2% 신선한 포름알데히드 및 2.5% 글루타르알데히드로 고정시켰다. 0.1M 카코딜레이트 완충액 (pH 7.4)으로 세척한 후에, 이들을 4℃에서 2시간 동안 동일한 완충액 중 1% Os04로 고정시켰다(postfix). 시료를 증류수로 세정하고, 1% 우라닐 아세테이트 수용액으로 실온에서 2시간 동안 또는 밤새 염색시키고, 에탄올 및 프로필렌 옥시드로 탈수시키고, 에폰 (Epon 812 수지, Nakalai)에 포매시켰다. 글래스로부터 세포를 제거한 후, 초박막 절편(ultra-thin section) (94 nm)을 절단하고, 우라닐 아세테이트 및 레이놀드 시트르산 납(Reynolds's lead citrate)으로 염색하고, 전사 전자 현미경 (JEM-1010, JEOL, Tokyo, Japan)으로 관찰했다.
세포 주기 분석 및 세포 생존력 분석
본 발명자들은 박테리아 상층액 분획의 존재 또는 부재 하에 48시간 동안 세포를 배양한 후 유동 세포분석법에 의해 DNA 함량/세포 주기 분석을 수행했다. 상기 세포들을 요오드화 프로피디움으로 처리한 후 세포 주기 분포를 평가했다. 상용 세포 계수 키트(cell counting kit) (Dojindo, Tokyo, Japan)를 이용하여 세포 생존력 분석을 수행했다. Sephadex G25 컬럼을 이용한 겔 여과 후에, 분석에서 이용된 시료들을 분획화시켰다.
스태필로코커스 네팔렌시스 IsaA 트랜스글리코실라아제의 발현
스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG 트랜스글리코실라아제 351 및 트랜스글리코실라아제 531을 코딩하는 유전자를 대장균 최적화 코돈을 이용하여 합성하고, 증폭시켜 말단 A를 첨가하고, TA-클로닝 벡터 pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI)에 클로닝시켰다. 그 후, 유전자들을 절제하고, 변형된 pET28a 벡터에 클로닝시키고, 대장균 BL21 DE3 세포에 형질전환키시고, 6-히스티딘 태그 (His-태그) 단백질로서 발현시키고, 정제했다. NPL86을 참조한다.
아폽토시스-촉진성 펩티드에 대한 항체의 제조
Eurofms Genomics (Tokyo, Japan)에서 서열 NH2-C+IVMPESSGNPNAVNPAGYR-COOH (서열번호 1)를 이용하여 아폽토시스-촉진성 펩티드 (코리신)에 대한 단백질 A 정제된 래빗 다중클론 항체를 제조하였다.
표적 펩티드에 대한 해당하는 분자량의 밴드를 마우스 폐 조직 시료 및 스태필로코커스 네팔렌시스 스트레인 CNDG의 배양물 상층액의 웨스턴 블롯팅에서 관찰할 수 있다 (도 22a 및 22b).
조직 및 체액 중 코리신 검출 및 측정
폐 조직에서 웨스턴 블롯팅을 위해 정제된 항-코리신 IgG 항체를 1/1000 희석으로 사용했다. 본 발명자들은 경쟁적 효소 면역 분석(competitive enzyme immune assay)을 이용하여 체액 중 코리신의 농도를 측정했다. 요약하면, 트랜스글리코실라아제 351로부터의 정제된 코리신을 PBS (phosphate-buffered saline) 중 2 ㎍/ml의 최종 농도로 96-웰 플레이트에 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 차단(blocking) 및 적절한 세척 후에, 표준, 시료, 및 5 ng/ml의 항-코리신을 웰에 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 그 후, 상기 웰을 세척하고, 2차 항체로서, 5 ㎍/mL 인간 IgG를 포함하는 PBS 용액 중 호스래디쉬 퍼옥시다아제-접합 염소 항-래빗 IgG (R&D System)를 첨가했다. 적절한 세척 및 인큐베이션 후에, 발색을 위해 기질 용액을 첨가하고 450 nm에서 흡광도를 판독했다. 펩티드의 여러 농도를 이용하여 작성된 표준 곡선으로부터 값들을 외삽시켰다.
계통발생적 분석
5개의 트랜스글리코실라아제 폴리펩티드 (CNDG_8p_00351, CNDG_8p_00513, CNDG_8p_00157, CNDG_8p_00159, 및 CNDG_8p_00845)를 이용하여 상동성 단백질을 찾기 위해 Genbank 단백질 데이터베이스 (ncbi.nlm.nih.gov/protein/)를 검색했다. 단백질 서열을 MUSCLE (Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation) 프로그램으로 정렬시키고, 정렬을 이용하여 1,000개 레플리케이트(replicate)의 부트스트랩(bootstrap)에 의한 NJ(neighbor joining) 방법에 근거하여 계통수를 작성했다. 이러한 모든 프로그램은 Geneious Prime 2016 버전 (www.geneious.com)에서 이용가능하다.
보다 구체적으로, 도 29에 도시된 계통수는 NJ 방법에 의해 작성되었다. 1,000개의 레플리케이트로 부트스트랩을 수행했다. 이 계통수 중 GenBank 수탁 번호는 하기와 같다: CLUSTER IsaA-1 ■ [WP_112369066.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 아를레타애(S. arlettae)), WP_061853755.1 (가상의(hypothetical) 단백질, 스태필로코커스 클루시(S. kloosii)), WP_107393111.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 아우리쿨라리스(S. auricularis)), WP_049409534.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 페텐코페리(S. pettenkoferi)), WP_103371985.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 아르겐시스(S. argensis)), WP_046466985.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 파스테우리(S. pasteuri)), COE35810.1 (트랜스글리코실라아제, 스트렙토코커스 뉴모니애), WP_002467055.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 와르네리(S. warneri)), WP_050969684.1 (트랜스글리코실라아제, 스트렙토코커스 뉴모니애 타입 N), WP 002449188.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 호미니스(S. hominis)), WP_103166037.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 데브리에세이 (S. devriesei)), WP_053024542.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 헤모리티쿠스(S. haemolyticus)), WP_103328722.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 페트라시(S. petrasii)), WP_126565453.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 카르노서스(S. carnosus)), WP_107511677.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 갈리나룸(S. gallinarum)), WP_069823097.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 숙시누스(S. succinus)), WP_069833173.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 에쿠오룸(S. equorum)), WP_057513458.1 (가상의 단백질, S. sp. NAM3COL9), WP_002506616.1 (가상의 단백질, S. sp. 0.182), WP_107552346.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 자일로서스(S. xylosus)), WP_069827045.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 사프로피티쿠스 (S. saprophyticus)), WP_099091381.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 에다피쿠스 (S. edaphicus)), WP_073344326.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 코니), WP_119487699.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 네팔렌시스(S. nepalensis)), CNDG_8p_00351 (추정적(putative) 트랜스글리코실라아제 IsaA-1, 스태필로코커스 네팔렌시스)] CLUSTER IsaA-2 ■ [SUK04795.1 SceA (스태필로코커스 아우레우스(S. aureus)), WP 105995336.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 아그네티스(S. agnetis)), WP_105986821.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 크로모게네스(S. chromogenes)), WP_009384111.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 마실리엔시스(S. massiliensis)), WP_126510217.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 에피더미디스(S. epidermidis)), WP_049407882.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 펠텐코페리), WP 103371892.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 아르겐시스), WP 061853631.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 클루시), WP_107376802.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 아를레타애), WP_022791177.1 LysM 펩티도글리칸-결합 도메인-함유 단백질 (바이셀라 할로톨레란스 (Weissella halotolerans)), WP 105993143.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 시뮬란스(S. simulans)), WP_114602723.1 (가상의 단백질, S. sp. EZ-P03), WP 095089569.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 스테파노비시 (S. stepanovicii)), WP_0 17000663.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 렌투스 (S. lentus)), WP_119634381.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 플레우레티(S. fleurettii)), WP_126476519.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 쉴레이페리(S. schleiferi)), WP_107573021.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 시우리(S. sciuri)), WP 069822945.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 숙시누스), WP_1 19484130.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 갈리나룸), WP 099090334.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 에다피쿠스), WP_107558872.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 자일로서스), WP_069995535.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 사프로피티쿠스(S. saprophyticus)), WP 057513315.1 (가상의 단백질, S. sp. NAM3COL9), WP_069817445.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 에쿠오룸), WP_107384366.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 코니 (S. cohnii)), CNDG_8p_00513 (추정적 트랜스글리코실라아제 IsaA-2, 스태필로코커스 네팔렌시스), WP 096808504.1 (가상의 단백질, 스태필로코커스 네팔렌시스)] CLUSTER SceD-1 ■ [WP 101118359.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 숙시누스), WP_107530874.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 자일로서스), WP_011302117.1 (트랜스글리코실라아제 SceD 1 (스태필로코커스 사프로피티쿠스), WP_105873943.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 코니), WP_107644182.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 네팔렌시스), CNDG_8p_00157 (추정적 트랜스글리코실라아제 SceD-1, 스태필로코커스 네팔렌시스), WP_071564462.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 에쿠오룸)] CLUSTER SceD-2 ■ [WP_070812670.1 (트랜스글리코실라아제, S. sp. HMSC034G07), WP_119486153.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 갈리나룸), WP_047504891.1 (트랜스글리코실라아제, S. sp. ZWU0021), WP_057513650.1 (트랜스글리코실라아제, S. sp. NAM3COL9), WP_096808177.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 네팔렌시스), CNDG_8p_00159 (추정적 트랜스글리코실라아제 SceD-2, 스태필로코커스 네팔렌시스)] CLUSTER SceD-3 ■ [WP 107564333.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 숙시누스), WP_115347167.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 사프로피티쿠스), WP_107557548.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 자일로서스), WP 099091190.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 에다피쿠스), WP_064263215.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 코니), CNDG_8p_00161 (추정적 트랜스글리코실라아제 SceD-3, 스태필로코커스 네팔렌시스), WP_107644349.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 네팔렌시스)] CLUSTER SceD-4 ■ [WP_119569949.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 숙시누스), WP_107385877.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 코니), CNDG_8p_00845 (추정적 트랜스글리코실라아제 SceD-4, 스태필로코커스 네팔렌시스), WP 096808795.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 네팔렌시스)]. WP 050969685.1 (트랜스글리코실라아제, 스트렙토코커스 뉴모니애 타입 N), YP_501340.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 아우레우스 아종 아우레우스 (S. aureus sub sp. aureus) ISCTC 8325), WP_046206716.1 (트랜스글리코실라아제, 스태필로코커스 코니 아종 코리 (S. cohnii subs cohnii)).
통계적 분석
달리 특정되지 않으면, 데이터는 평균 ± 평균의 표준편차 (S.D.)로 기재된다. 2개의 변수간 통계적 차이는 Mann-Whitney U 검정에 의해 평가하고, 3개 이상의 변수간 차이는 사후 분석(post-hoc analysis)을 위한 Tukey 검정을 이용한 분산분석(analysis of varaiance)에 의해 평가했다. 0.05 미만의 P 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주했다. 본 발명자들은 GraphPad Prism vs 7 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)을 이용하여 통계 분석을 수행했다.
본 개시의 추가적 구체예는 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다:
1. 표적 물질로서 코리신을 검출하는 단계를 포함하는, 섬유증을 평가하는 방법.
2. 전술된 구체예 1에 있어서, 코리신 중 19개 아미노산의 서열 (IVMPESSGNPNAVNPAGYR-서열번호 1)이 검출되는 것인 방법.
3. 전술된 구체예 1 또는 2에 있어서, 상기 섬유증은 특발성 폐섬유증 (IPF), 간경화증, 신장 섬유증, 낭포성 섬유증, 골수 섬유증, 및/또는 유방 섬유증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
4. 코리신에 결합하고, 섬유증을 예방 및/또는 치료하는 항체.
5. 전술된 구체예 5에 있어서, 상기 항체는 19개 아미노산의 서열 (IVMPESSGNPNAVNPAGYR-서열번호 1)을 인식하는 것인 항체.
6. 전술된 구체예 4 또는 5에 있어서, 상기 항체는 다중클론 항체인 것인 항체.
7. 상피 세포의 표면에 존재하는 코리신-결합 단백질을 찾는 단계를 포함하는, 코리신 수용체 단백질을 확인하는 방법.
8. 상피 세포의 표면에 존재하는 결합 단백질의 19개 아미노산의 서열 (IVMPESSGNPNAVNPAGYR-서열번호 1)을 찾는 찾는 단계를 포함하는, 코리신 수용체 단백질을 확인하는 방법.
전술된 설명에서 언급된 비-특허 문헌 (“NPL”)
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SEQUENCE LISTING
<110> Mie University
THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF ILLINOIS
<120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVALUATING AND TREATING FIBROSIS
<130> MIE011_JTEK
<150> US 62948983
<151> 2019-12-17
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> Staphylococcus cohnii
<400> 1
Ile Val Met Pro Glu Ser Ser Gly Asn Pro Asn Ala Val Asn Pro Ala
1 5 10 15
Gly Tyr Arg
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> Staphylococcus epidermidis
<400> 2
Ile Ile Ala Arg Glu Ser Asn Gly Gln Leu His Ala Arg Asn Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Ala
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> Staphylococcus epidermidis
<400> 3
Asn Arg Val Tyr Asn Gly Pro Ala Ala Ser Pro Val Ser Glu Gly Met
1 5 10 15
Pro Ile Asn
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> Staphylococcus warneri
<400> 4
Ile Val Met Pro Glu Ser Gly Gly Asn Pro Asn Ala Val Asn Pro Ala
1 5 10 15
Gly Tyr Arg
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> Staphylococcus pettenkoferi
<400> 5
Ile Ile Met Pro Glu Ser Gly Gly Asn Pro Asn Ile Val Asn Pro Tyr
1 5 10 15
Gly Tyr Ser
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> Staphylococcus petrasii
<400> 6
Ile Val Met Pro Glu Ser Gly Gly Asn Pro Asn Ala Val Asn Pro Tyr
1 5 10 15
Gly Tyr Arg
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> Staphylococcus saprophyticus
<400> 7
Ile Val Leu Pro Glu Ser Ser Gly Asn Pro Asn Ala Val Asn Pro Ala
1 5 10 15
Gly Tyr Arg
<210> 8
<211> 19
<212> PRT
<213> Staphylococcus gallinarum
<400> 8
Ile Val Leu Pro Glu Ser Ser Gly Asn Pro Asn Ala Val Asn Glu Leu
1 5 10 15
Gly Tyr Arg
<210> 9
<211> 19
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 9
Ile Val Met Pro Glu Ser Gly Gly Asn Pro Asn Ala Val Asn Glu Leu
1 5 10 15
Gly Tyr Arg
<210> 10
<211> 19
<212> PRT
<213> Staphylococcus schleiferi
<400> 10
Ile Val Met Pro Glu Ser Ser Gly Asn Pro Asn Ala Val Asn Glu Leu
1 5 10 15
Gly Tyr Arg
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> Staphylococcus pettenkoferi
<400> 11
Ile Val Met Pro Glu Ser Ser Gly Asn Pro Asp Ala Val Asn Glu Leu
1 5 10 15
Gly Tyr Arg
<210> 12
<211> 19
<212> PRT
<213> Staphylococcus nepalensis
<400> 12
Ile Ala Gln Arg Glu Ser Gly Gly Asp Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser
1 5 10 15
Ser Gly Ala
<210> 13
<211> 19
<212> PRT
<213> Staphylococcus equorum
<400> 13
Ile Ala Glu Arg Glu Ser Gly Gly Asp Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser
1 5 10 15
Ser Gly Ala
Claims (45)
- 환자의 생물학적 시료에서 코리신의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 코리신은 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 및 서열번호 13으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 방법은 상기 환자에서 섬유증의 평가에서 이용되는 것인 방법.
- 청구항 3에 있어서, 상기 섬유증은 특발성 폐섬유증 (IPF), 간경화증, 신장 섬유증, 낭포성 섬유증, 골수 섬유증, 및 유방 섬유증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 청구항 3에 있어서, 상기 섬유증은 특발성 폐섬유증 (IPF)인 것인 방법.
- 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코리신은 질량 분광분석법, 웨스턴 블롯팅, 및 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 검출되는 것인 방법.
- 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코리신은 항체로의 결합에 의해 검출되는 것인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 및 서열번호 13으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 인식하는 것인 방법.
- 코리신에 결합하는 항체.
- 청구항 9에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 및 서열번호 13으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 인식하는 것인 항체.
- 청구항 9 또는 10에 있어서, 상기 항체는 다중클론 항체인 것인 항체.
- 청구항 9 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 섬유증을 갖거나, 섬유증을 갖거나 또는 발병할 것으로 의심되는 개체에서 섬유증의 예방, 개선 및/또는 치료에서의 용도를 위한 것인 항체.
- 청구항 12에 있어서, 상기 섬유증은 특발성 폐섬유증 (IPF), 간경화증, 신장 섬유증, 낭포성 섬유증, 골수 섬유증, 및 유방 섬유증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 항체.
- 청구항 12에 있어서, 상기 섬유증은 특발성 폐섬유증 (IPF)인 것인 항체.
- 청구항 9 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 중화 항체인 것인 항체.
- 청구항 9 내지 15 중 어느 한 항의 항체의 치료 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 섬유증의 치료를 필요로 하는 환자에서 섬유증을 치료하는 방법.
- 청구항 16에 있어서, 상기 항체는 상기 환자의 한쪽 폐 또는 양쪽 폐에 투여되는 것인 방법.
- 청구항 16 또는 17에 있어서, 상기 항체는 복강내로 또는 기관내 주입에 의해, 또는 흡입에 의해 투여되는 것인 방법.
- 청구항 16 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 투여는 상기 개체에서 섬유증의 중증도를 감소시키는 것인 방법.
- 섬유증을 갖거나 또는 섬유증을 갖거나 발병할 것으로 의심되는 개체의 평가에서 이용하는 방법으로서, 상기 방법은
상기 개체로부터 수집된 인 비트로 생물학적 시료를 받는 단계; 및
상기 인 비트로 생물학적 시료에 존재하는 코리신의 양을 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법. - 청구항 20에 있어서, 상기 인 비트로 생물학적 시료 중 코리신의 검출된 양을 하나 이상의 미리 결정된 역치와 비교하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 청구항 20 또는 21에 있어서, 상기 인 비트로 생물학적 시료는 상기 개체의 한쪽 폐 또는 양쪽 폐로부터 수집되는 것인 방법.
- 청구항 20 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인 비트로 생물학적 시료는 객담, 기관지 분비물(bronchial secretion), 흉막 삼출액(pleural effusion), 기관지폐포 세척액 (BALF), 및 기관지 또는 폐로부터 수집된 조직으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 청구항 20 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인 비트로 생물학적 시료는 혈액 또는 기관지폐포 세척액 (BALF)인 것인 방법.
- 청구항 20 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코리신은 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 및 서열번호 13으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
- 청구항 20 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섬유증은 특발성 폐섬유증 (IPF), 간경화증, 신장 섬유증, 낭포성 섬유증, 골수 섬유증, 및 유방 섬유증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 청구항 20 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섬유증은 특발성 폐섬유증 (IPF)인 것인 방법.
- 청구항 20 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코리신은 질량 분광분석법, 웨스턴 블롯팅, 및 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 검출되는 것인 방법.
- 청구항 20 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 코리신은 항체로의 결합에 의해 검출되는 것인 방법.
- 청구항 29에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 및 서열번호 13으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 인식하는 것인 방법.
- 환자에서 섬유증의 치료에서 사용하기 위한 약학적 조성물로서, 상기 약학적 조성물은 상기 환자의 폐에서 코리신의 적어도 일부를 중화시키고 및/또는 상기 환자의 폐에서 코리신의 양을 감소시키는 코리신-억제제를 포함하는 것인 약학적 조성물.
- 청구항 31에 있어서, 상기 코리신-억제제는 소분자, 코리신의 길항제, 또는 코리신에 대한 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
- 청구항 31 또는 32에 있어서, 상기 섬유증은 특발성 폐섬유증 (IPF), 간경화증, 신장 섬유증, 낭포성 섬유증, 골수 섬유증, 및 유방 섬유증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
- 청구항 31 또는 32에 있어서, 상기 섬유증은 특발성 폐섬유증 (IPF)인 것인 약학적 조성물.
- 청구항 31 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 첨가제, 염, 또는 부형제를 더 포함하는 것인 약학적 조성물.
- 상피 세포의 표면에 존재하는 코리신-결합 단백질을 찾는 단계를 포함하는, 코리신 수용체 단백질을 확인하는 방법.
- 상피 세포의 표면에 존재하는 결합 단백질 중 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 및 서열번호 13으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 찾는 단계를 포함하는, 코리신 수용체 단백질을 확인하는 방법.
- 청구항 1 내지 8, 20 내지 30, 또는 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코리신은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
- 청구항 8, 16, 또는 30 중 어느 한 항, 또는 청구항 9 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 인식하는 것인 방법 또는 항체.
- 청구항 1 내지 8, 20 내지 30, 36 또는 37 중 어느 한 항에 따른 방법의 수행에서 사용하기 위한 키트 또는 장치.
- 환자에서 섬유증의 치료에서 사용하기 위한 약학적 조성물로서, 상기 약학적 조성물은
청구항 9 내지 15 중 어느 한 항의 항체 및
하나 이상의 약학적으로 허용가능한 첨가제, 염, 또는 부형제를 포함하는 것인 약학적 조성물. - 청구항 31 내지 35 또는 41 중 어느 한 항의 약학적 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 환자에서 섬유증을 치료하는 방법.
- 청구항 42에 있어서, 상기 약학적 조성물은 상기 환자의 한쪽 폐 또는 양쪽 폐에 투여되는 것인 방법.
- 청구항 42 또는 43에 있어서, 상기 약학적 조성물은 복강내로 또는 기관내 주입에 의해, 또는 흡입에 의해 투여되는 것인 방법.
- 청구항 42 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물의 투여는 상기 개체에서 섬유증의 중증도를 감소시키는 것인 방법.
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