KR20220113741A - 개별 해마 발작의 영상화 및 반복된 발작의 장기 영향 - Google Patents
개별 해마 발작의 영상화 및 반복된 발작의 장기 영향 Download PDFInfo
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Abstract
복부 해마 점화는 복부 해마 흥분성 회로의 기능적 재구성을 야기시키는 것으로 나타났다. 가장 두드러지는 것은 fMRI에서 증가된 활성화 부피 및 전기생리학에서 증가된 활성화 진폭과 함께, 내측 전전두엽 피질에 대한 연결성이다. 점화 후 불안 증가의 증거가 있다. 단일 발작을 영상화하기 위한 동시 LFP-fMRI를 위한 방법이 제공된다. 개별 발작의 시공간 역학의 영상화는 표적화된 개입을 제공하는 국소 및 이차-전신 발작의 전파 패턴을 특징화할 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 12월 6일자로 출원된 미국 가출원 제62/945,012호를 우선권으로 주장하며, 이러한 문헌은 전문이 모든 목적을 위해 본 명세서에 원용된다.
발작 활동이 의식 또는 심폐 조절과 관련된 중요한 회로를 침범할 때, 사고 또는 사망의 위험이 각각 증가한다. 이러한 발작이 어떻게 발달하고 전파되는 지는 잘 알려져 있지 않지만, 피질 및 피질하 회로 관련 둘 모두의 증거가 있다. 전기생리학 및 광학 영상화와 같은 발작을 기록하는 표준 방법은 공간 적용 범위를 제한하고, 특정 사건과 관련된 뇌 전체 활동의 발전을 포착할 수 없다. 예를 들어, 이전에 이차 전신 발작으로 알려진 국소 내지 양측 긴장성-간대(focal to bilateral tonic-clonic: FBTC) 발작은 치료하기 어렵고 환자의 삶의 질 및 안전성에 상당한 영향을 미친다. fMRI는 뇌 전반에 걸친 정보를 제공하고 인간 및 동물에서 국소 및 전신 발병 발작 둘 모두를 시각화하는 데 사용되었지만, FBTC 발작을 시각화하기 위한 이의 사용은 모션 아티팩트(motion artefact)를 초래하는 관련 운동 활동으로 인해 어렵다.
발작(seizure), 점화(kindling), 및 역치이하 활동(sub-threshold activity) 이면의 관계는 오랫동안 이해하기 어려웠다. 이것은 간질 진단 및 치료에 중요하다. 본 명세서에 제공된 방법론은 간질을 진단하고 치료 결정을 내리는 데 이용될 수 있다. 이는 발작, 점화, 및 역치이하 활동 사이의 구체적인 관계를 최초로 규정할 수 있는 새로운 방법이다.
기능적 및 전기적 신경 회로 변화의 영향을 평가하는 것을 포함하는, 뇌에서 발작과 관련된 사건, 예를 들어, 간질 발작을 모델링하는 사건의 분석을 위한 방법 및 모델이 제공된다. 방법 및 모델은, 예를 들어, 단일 발작의 분석, 역치이하 자극에 의한 촉발, 국소 내지 양측 긴장성-간대(FBTC) 발작의 분석, 흥분성 복부 해마(ventral hippocampal: VH) 네트워크의 분석, 이동성 발작 코어(migrating seizure core)의 분석 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 개체에서 이동성 발작 코어의 확인 및 국소화를 위한 방법 및 모델이 제공된다. 일부 실시형태에서, FBTC 발작을 비제한적으로 포함하는 간질 발작을 치료하기 위한 치료제의 설계를 위한 방법 및 모델이 제공된다. 일부 실시형태에서, 이동성 발작 코어의 확인은 발작 개시 구역의 확인에서 사용된다. 분석 방법은 전기생리학, 예를 들어, 국소 장 전위(local field potential: LFP), 및 기능적 자기 공명 영상화(functional magnetic resonance imaging: fMRI)의 결정을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 모델은 비제한적으로 광유전학적 모델, 및 점화 및 발작 유도를 위한 광유전학적 자극의 사용을 포함할 수 있다. 다른 자극 방법, 예를 들어, 전기, 자기, 약리학적 자극 등이 또한 사용된다. 예를 들어, 해마 영역에서 단일 발작을 발생시키기 위해 적용될 수 있는 자극 방법이 바람직하다. 자극 방법은 역치이하 활동을 포함한다.
본 명세서에 제공된 데이터는 동시 전기생리학 및 기능적 MRI로 분석될 수 있는 점화 및 발작 유도 모델의 사용을 입증한다. 동물 모델에서 동시 LFP-fMRI로 단일 발작을 영상화하기 위해, 동물은 진정되고, 발작의 영상화 동안 움직임을 없애기 위해 속효성 신경근 차단제로 처리될 수 있으며, 이러한 목적을 위한 예시적인 작용제는 비제한적으로 덱스메데토미딘 진정제 및 베쿠로늄을 포함한다. 개별 발작의 영상화를 통해 발작과 관련된 사건은 세세하게 분석될 수 있다. 예를 들어, 해마에서 느린 이동 활동의 코어는 신규한 발작 전파 및 일반화 메커니즘을 제공하는 것으로 나타났다. 모델은 포유동물, 예를 들어, 래트, 마우스 등과 같은 설치류, 비-인간 영장류 등일 수 있는 점화된 동물의 뇌, 예를 들어, 살아있는 동물의 뇌를 포함한다.
일부 실시형태에서, 발작에 대한 광유전학적 점화 모델이 제공되며, 여기서 전자사진 발작(electrographic seizure)은 세포-타입 특이적, 광유전학적 자극에 의해 동물 모델에서 유도되며, 이러한 동물은 이후 연장된 기간에 걸쳐 FBTC 발작의 신뢰성 있는 유도를 제공하며, 여기서, 연장된 기간은 최대 2주, 최대 3주, 최대 4주, 최대 2개월, 최대 3개월, 또는 그 초과일 수 있다. 자극을 위한 광-활성화된 폴리펩타이드는, 예를 들어, CHR2를 비제한적으로 포함하는 채널로돕신(channelrhodopsin)일 수 있다. 광 활성화된 폴리펩타이드는 흥분성 해마 뉴런에서 발현되는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 자극 패러다임은 기저의 기능적 회로 변화를 평가하기 위해, 예를 들어, 대략 10㎐의, 발작을 유발하는 역치 미만의 일련의 짧고 약한 자극을 포함한다. 약 40㎐의 길고 강렬한 자극은 발작 회로 역학을 평가하는 데 사용될 수 있다. 동시 전기생리학 및 fMRI는 복부 해마 및 발작 유도에서 흥분성 뉴런 점화의 효과를 결정하는 데 사용될 수 있다. 단일 유도 발작의 뇌-전체 네트워크 역학의 영상화는 국소 및 FBTC 발작 전파를 보여준다.
본 명세서에서 제공되는 모델은 발작 유도 및 전파에 대한 치료적 개입의 효과가 결정될 수 있는 치료적 개입, 예를 들어, 수술, 약리학적 개입 등의 설계 및 시험에 유용하다. 모델은 또한 간질 동반질환에 대한 약물의 설계에서 유용하며, 예를 들어, 가장 큰 활동 변화는 내측 전전두엽 피질(medial prefrontal cortex: mePFC)에서 발생하며, 이는 복부 해마(ventral hippocampus: vHip)와 mePFC 간의 증가된 흥분성 관계를 나타낸다. vHip-mePFC 회로 기능장애를 표적으로 하도록 설계된 치료법은 불안 및 인지 결함을 포함하는, 간질과 관련된 동반질환을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 발작 전파의 변수는 간질에 대한 외과적 표적화 및 치료법 개발을 안내하는 데 사용된다. 본 명세서의 발견에는 발작을 동반할 수 있고 발작 전에 흔히 관찰되는, 고 진폭 활동의 느린 이동성 코어를 나타내는 것이 포함된다.
일부 실시형태에서, 개선된 간질 수술 방법이 제공된다. 당 분야에 공지된 바와 같이, 이러한 방법은 발작 개시 구역(eizure onset zone: SOZ)이 신뢰성 있게 국소화되는 것을 필요로 한다. 본 명세서에는 이동성 해마 코어가 SOZ 국소화에 영향을 미칠 수 있는 발작 전파를 위한 기본 메커니즘을 제공한다는 것이 제시된다. SOZ는 발작 내내 활성이 아닐 수 있으며; 발작 활동의 영역 패턴은 빠르게 변할 수 있으며; 가장 높은 활동을 갖는 영역은 종종 SOZ가 아니다. 표준 임상 SOZ 확인 방법은, 예를 들어, 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영(single-photon emission computed tomography: SPECT), 전기생리학 등을 포함한다. SOZ를 검출하기 위한 개선된 방법은 SOZ 국소화를 개선하기 위한 이동성 코어의 검출을 반영한다.
도 1: 광유전학적 복부 해마 점화는 해마 부피의 변화 없이 수개월 동안 지속된다. (A) 복부 해마에서 CamKII 세포는 광유전학적 점화(optogenetic kindling)를 위해 표적화되었으며, 자극 및 전기생리학을 위해 옵트로드(optrode)가 이식되었다. 전기생리학을 위해 전극이 동측 내측 전전두엽 피질에 이식되었다. 우측 패널: 복부 해마로의 ChR2-eYFP 발현의 국소화를 갖는 공초점 이미지. (B) 광유전학적 점화를 위해, 래트는 하루에 최대 12회의 자극으로 또는 라신 단계(Racine stage) 5 발작이 관찰될 때까지 격일로 자극되었다. 자극은 점화에 대한 기준에 도달할 때까지 계속되었다: 하루의 처음 3회 자극 내에 단계 5 발작. (C) 래트의 83%(10/12)가 7일까지 점화되었으며, 모두 11일까지 점화되었다. (D) 점화를 겪는 각 래트에서 모든 자극에 대한 행동 점수는 성공적인 점화를 나타낸다. (E) 각 래트가 점화를 획득하기 위해 받은 자극의 총 수. (F) 비-점화 및 점화된 동물에서 전후 해마 부피에는 유의미한 변화가 없다. 좌측 패널: 동측 해마 부피 변화, t-검정(t = -0.385, p = 0.703), 우측 패널: 대측 해마 부피 변화, t-검정(t = -1.361, p = 0.187). (G) 래트의 하위군은 점화 획득 3주 후 및 12주 후에 시험되어 동물이 점화 표현형을 보유하는지를 결정하였다. 래트는 3회 자극받았다. 모든 점화된 동물은 라신 단계 5 발작을 가졌던 반면, 대조군 래트는 점화로 인한 지속적인 변화를 나타내는 임의의 발작-관련 라신 행동(군당 n = 5)을 나타내지 않았다. 모든 데이터는 평균±sem으로 제시되었다. p<0.05의 역치는 통계적 유의성의 결정을 위해 이용되었다.
도 2: 해마-점화는 해마 연결성 및 고조된 불안의 뇌 전반에 걸친 변화를 초래한다. (A) 복부 해마 CamKII 세포는 LFP 기록을 위해 동측 복부 해마(iVHip) 및 동측 내측 전전두엽 피질(iMePFC)에 전극으로의 자극을 위해 표적화되었다. fMRI는 뇌를 가로질러 27개의 슬라이스를 영상화하였다. (B) 동시 LFP-fMRI는 점화 전후 및 비점화 대조군 동물(각 군에서 n = 12)에서 10㎐ VHip 연결성을 평가하기 위해 이용되었다. 각 스캔에 대해, 10㎐에서 전달된 5초 자극이 6 주기 동안 1분마다 1회 제공되었다. (C) p < 0.001에 해당하는 t-역치를 갖는 케이지-메이팅, 연령-메이팅된 대조군(좌측 패널) 및 점화된(우측 패널) 동물에 대한 통계적 t-맵. 대조군에서의 활동은 대부분 iVHip, iDHip, iMePFC, iAmyg 및 iSept로 제한되었지만, 점화된 래트에서의 활동은 이러한 영역을 포함하고 다른 영역으로도 확장됨을 주목한다. (D) 비-점화 및 점화된 래트에서 뇌-전체 영역 활성화 부피. 영역 활성화 부피는 개별 동물에서 정량화되고, 활성화된 영역의 비율로 표현되었다. 부피는 점화된 래트의 가장 큰 평균 부피에서 가장 작은 평균 부피로 분류되었다. 7개 영역은 대조군과 점화된 동물 사이에 유의미하게 상이하였다(다중 비교를 위해 본페로니-홀름(Bonferroni-Holm)의 보정을 사용하여 조정된 p-값을 갖는 t-검정). 가장 큰 효과는 iMePFC에서 관찰되었고, 그 다음으로 cMePFC, iFrAssC, iTeAssC, iOrFrC, iInsC, 및 마지막으로 iStria였다. (E) 비점화 및 점화된 동물에서 10㎐ 자극에 대한 영역 CBV-fMRI 피크 진폭 반응. 비-점화된 동물에서 5개의 가장 큰 활성 영역(ROI 활성의%)은 비-점화된 네트워크에 대한 점화의 영향을 결정하기 위해 선택되었으며, 해석의 용이함을 위해 CBV 진폭이 역전되었다. 점화 후, iMePFC 및 iAmyg에서 진폭의 유의미한 증가가 관찰되었다. 각각의 회색 원은 단일 동물로부터의 데이터를 나타낸다. (F) 점화 전(좌측 패널) 및 점화 후(우측 패널) 단일 래트로부터 iVHip 및 iMePFC에서 동시에 획득된 LFP 반응. 파란색 막대는 10㎐의 광유전학적 자극을 나타낸다. 점화 후 iMePFC LFP 반응의 증가에 주목한다. LFP는 구배-아티팩트 보정되고, 8 내지 12㎐에서 대역통과-필터링되었다. (G) 비-점화 및 점화된 래트에서 LFP 반응의 군 분석. 좌측 패널: 10㎐ 자극에 대한 iVHip LFP 반응은 대조군 및 점화된 동물에서 전후 조건 간에 차이가 없었다(군당 n = 12, F = 0.59, p = 0.81, 2-방향 반복 측정 ANOVA). 우측 패널: 10㎐ 자극에 대한 iMePFC LFP 반응은 대조군 동물과 비교할 때 점화 후 증가되었다(군당 n = 11, F = 5.39, p = 0.031, 2-방향 반복 측정 ANOVA). 사후 분석은 점화 후 6.4±2.6배 증가가 있음을 나타내었다(페어드 t-검정, t = 2.47, p = 0.033). LFP 전력을 추정하기 위해, 자극 동안 LFP 전력과 자극 직전 5초 사이의 비율이 계산되었다. 동물 당 각각의 시점에 대해, 6 내지 18개의 자극 블록의 비율의 중앙값은 시간-의존적 군 효과를 평가하기 위해 사용되었다. 각 블록에 대해, 자극 개시 전 5초에 비해 자극 블록으로부터 정규화된 전력이 계산되었다. 전극 파괴(1마리 대조군) 및 아티팩트 오염(1마리 점화된 군)으로 인해 전전두엽 피질 분석을 위해 2마리의 동물이 제거되었다. 이러한 동물로부터의 데이터는 보충 섹션을 참조한다. (H) fMRI 10주 후에 동물의 서브세트가 불안 및 우울증에 대한 행동 시험을 받았다. (I) 수크로스 선호도 시험. 기준선 측정은 물을 함유하는 2개의 병 중 어느 하나에 대한 선호도가 없음을 나타낸다. 수크로스 물을 함유하는 하나의 병 및 물을 함유하는 다른 병으로의 시험 측정은 둘 모두의 군이 수크로스 용액을 선호하였고 군 사이에 차이가 관찰되지 않았음을 나타낸다(n = 7,8, t-검정, p > 0.05). (J) 강제 수영 시험. 점화 후 군 간에 차이는 관찰되지 않았다(n = 7,8, t-검정, p > 0.05). (K) 오픈 필드 시험. 점화된 래트는 비 점화된 래트보다 오픈 필드의 중심에서 상당히 적은 시간을 보냈는데, 이는 점화 후 증가된 불안 표현형을 나타낸다(t-검정, p = 0.046). 모든 데이터는 평균±sem으로 제시되었다. p < 0.05의 역치는 통계적 유의성의 결정에 사용되었다.
도 3: 점화된 및 비-점화된 래트에서 유도된 발작의 뚜렷한 전파 패턴. (A) 발작이 유도되고, 동시 LFP-fMRI로 평가되었다. 비-점화 및 점화된 동물에서 90초 기준선 후에 발작이 유도되었다(각각 래트당 n = 2 내지 4 및 n = 7,5 래트). (B) 유도된 발작의 발작 지속기간. 점화된 래트의 발작은 비-점화된 래트의 발작보다 유의미하게 더 길었다(t-검정, p < 0.001). (C, D) LFP 및 BOLD 맵에 대한 동등한 시점을 나타내는 숫자로 비점화 래트에서 유도된 단일 발작. (C) 복부 해마 BOLD 반응과 중첩된 LFP 반응. (D) 광유전학적 발작 유도에 대한 뇌-전체 BOLD 반응. 좌측 패널: 브레그마(Bregma)에 대한 좌표를 갖는 팍시노스(Paxinos) 래트 뇌 환추()에 상응하는 뇌 슬라이스. 파란색 원은 발작 유도 부위를 나타낸다. 중간 패널: 발작 유도 동안 및 후 BOLD 활동의 발달. 우측 패널: 실험을 위한 복셀-레벨 최대 강도 투영. 활성은 대부분 동측 반구로 제한된다는 것이 주목된다. (E, F) LFP 및 BOLD 맵에 대한 동등한 시점을 나타내는 숫자를 갖는 점화된 래트에서 유도된 단일 발작. (E) 복부 해마 BOLD 반응과 중첩된 LFP 반응. (F) 광유전학적 발작 유도에 대한 뇌-전체 BOLD 반응. 좌측 패널: 브레그마에 대한 좌표를 갖는 팍시노스 래트 뇌 환추에 상응하는 뇌 슬라이스. 파란색 원은 발작 유도 부위를 나타낸다. 중간 패널: 발작 유도 동안 및 후 BOLD 활동의 진화. 우측 패널: 실험을 위한 복셀-레벨 최대 강도 투영. 활성은 피질로 양측으로 전파됨을 주목한다. BOLD 이미지는 자극 개시 60초 전으로 규정된, 기준선으로 정규화되었다. 모든 이미지는 시각화를 위해±2% 역치로 표시된다.
도 4. 점화된 발작은 점차적으로 피질로 양측으로 전파되는 반면, 비-점화된 발작은 국소화되어 있다. (A) 단일 광유전학적으로 유도된 발작으로부터의 지역 BOLD 활동의 예. 공통 뇌 환추를 이용하여 영역은 44개의 뇌 영역으로 자동적으로 세그먼트화되었다. 파란색 막대는 광유전학적 발작 유도 기간을 나타낸다. (B) 비-점화(7 래트에서 n = 20) 및 점화된 발작(5 래트에서 n = 17)에서 활성화된 영역의 수. 점화된 래트에서의 발작은 비-점화된 동물에서보다 15.5±2.2개 이상의 영역을 활성화시켰다(p < 0.0001). 회색 원은 개별 발작을 나타낸다. (C) 비점화 및 점화된 발작에서 활성화된 영역의 분포. 비교를 위해 각 군의 각 영역은 총 발작 횟수로 정규화되었다(각각 n = 20 및 n = 17). 비-점화된 발작에서, 활성화된 영역은 양측 활성화가 더 흔한 점화된 발작과 달리 대부분 동측 반구에 있었음을 주목한다. 검은색 원은 영역 전파 분석에 대한 신뢰성 있는 개시 시간 추정치를 보장하기 위한 80% 역치를 나타낸다. (D) 비-점화 및 점화된 발작에서 활성의 영역별 전파. 영역은 가장 빠른 것에서 가장 느린 것으로 분류되었고, 흰색 막대는 시각화를 위해 동측 영역을 나타내고, 검은색 막대는 대측 영역을 나타낸다. 좌측 패널: 비-점화된 래트의 발작에서, 활성화된 영역은 동측 반구에서 가장 일관되게 관찰되었다. 우측 패널: 활성이 양쪽 반구로 전파된 점화된 래트에서의 발작과 대조적이다. 특히, 활성은 동측에서 대측 반구로 전파되었다. 빨간색 라벨은 두 군 모두에서 활성화된 영역을 나타낸다. (E) 일반적으로 활성화된 영역에서 개시 시간 비교. iMePFC는 비-점화된 발작보다 점화된 발작에서 1.28±0.46초만큼 유의미하게 더 빠르게 활성화되었다(t = 2.153, p = 0.044, 본페로니 절차와의 다중 비교를 위해 보정됨). p < 0.05의 역치는 통계적 유의성의 결정에 사용되었다.
도 5: 느린 이동성 해마 발작 코어는 비-점화 및 점화된 래트에서 빈번하게 발생하고, 발작 일반화를 위한 주요 메커니즘으로 작용할 수 있다. (A, B) LFP 및 BOLD 맵에 대한 동등한 시점을 나타내는 숫자를 갖는 비점화 래트에서 유도된 단일 발작. (A) 복부 해마 BOLD 반응과 중첩된 LFP 반응. (B) 동측 해마 내에서 BOLD 활동의 전파. 고 진폭 활동은 자극된 VHip에서 시작하고, 해마의 극을 등쪽 영역으로 이동시키고, 시점 8까지, 활성은 VHip 전극에서 더 이상 검출되지 않지만 BOLD 증가는 DHip에서 지속된다는 점을 주목한다. (C, D) LFP 및 BOLD 맵에 대한 해당 시점을 나타내는 숫자를 갖는 점화된 래트에서 유도된 단일 발작. (C) 복부 해마 BOLD 반응과 중첩된 LFP 반응. (D) 동측 해마 내에서 BOLD 활동의 전파. (A, B)와 유사하게, BOLD 및 LFP는 발작 유도 동안 vHip에서 증가하고, 계속 증가한다. 고 진폭 활동은 VHip(시점 3,4)에서 그리고, 이후 극 위로 DHip(시점 5,6)으로 이동한다. (E) 동측 해마의 세그멘트화 환추. 해마는 10개의 슬라이스에 걸쳐 4개의 영역으로 세그먼트화되었다. (F) 복부 해마에서 등 해마로의 활성 전파 시간. 세그먼트화된 영역의 대부분의 복부로부터 대부분의 등쪽까지의 피크 대 피크 활성은 피크 활성이 복부에서 등쪽 해마까지 관찰된 시간을 계산하기 위해 사용되었다. 전파하는 해마 활성은 4/7 비-점화된 래트에서 8/20 발작 및 5/5 점화된 래트에서 15/17 발작에서 관찰되었다(G, H). 비-점화된 및 점화된 동물에서 개별 해마 복셀 시간 경과. 시간 경과는 (A, C)에서 동일한 발작으로부터이고 (E)에서와 같이 세그먼트화된다. 복셀 시간 경과는 가장 복부에서 가장 등쪽으로 분류된다.
도 6: 군 간의 복셀-방식 차이는 점화 후에만 명백하고 전에는 그러하지 않았다. p < 0.001에 상응하는 t-역치를 갖는 점화 후(우측 패널) 및 케이지-메이트 연령-메이팅된 대조군(좌측 패널)에서의 통계적 t-맵.
도 7: 자극 또는 단계 5 발작의 수는 점화 후 활성화를 설명하지 않았다. p < 0.001에 해당하는 t-역치를 갖는 점화 후 활성화 대 자극의 수(좌측 패널) 및 대 5단계 발작의 수(우측 패널)의 통계적 복셀-방식 t-맵.
도 8: 점화 후 복부 해마 10㎐ 자극에 대한 내측 전전두엽 반응의 진폭 증가. 복부 해마 회로로부터의 영역 시계열 데이터.
도 9: 분석에서 제거된 동시 LFP 기록. (A 내지 C) 상단 2개의 패널은 복부 해마 및 동측 내측 전전두엽 피질로부터 fMRI와 동시에 획득된 LFP 기록이다. 하단의 두 패널은 이러한 기록의 확대도이다. 파란색 막대는 광유전학적 자극(7.5㎳ 펄스의 10㎐)을 나타냅니다. (A) 자극의 오프셋 후 파열. 동물은 전기생리학적 및 BOLD 분석으로부터 제거되었다. (B, C) 내측 전전두엽 피질 전극이 파손되어 소음이 기록되었다. 두 동물 모두는 내측 전전두엽 피질 LFP의 분석으로부터 제거되었다.
도 10: 깨어 있는 및 덱스메데토미딘-진정된 래트에서 유도된 발작에서 유사한 전기생리학적 특징. (A, B) 깨어 있고 진정 하에서 유도된 발작 및 동일한 동물로부터의 복부 해마 LFP 기록. 빨간색 화살표는 큰 진폭 스파이크 개시를 나타내고, 삽입도 i) 내지 iii)은 이러한 발작의 확대된 성분이다. 파란색 막대는 광유전학적 자극(7.5㎳ 펄스의 40㎐) 시간을 나타낸다. (C) 깨어 있는 상태 및 진정된 상태의 다른 동물로부터의 전기생리학적 기록의 또 다른 세트. (D) 깨어 있는 상태 및 진정된 상태에서 후방전을 초래하는 자극의 비율에는 차이가 없다. 각 선은 단일 동물을 나타낸다. (E) 깨어있는 상태 및 진정된 상태에서 큰 진폭 스파이크 개시에는 차이가 없다. (F) 진정은 깨어 있는 상태와 비교하여 진정된 상태에서 더 짧은 후방전을 초래하지 않았다.
도 11: 90% 개시를 사용한 비점화 및 점화된 발작에서 활성의 영역 전파. 영역은 가장 빠른 것에서 가장 느린 것으로 분류되었고, 흰색 막대는 시각화를 위해 동측 영역을 나타내고, 검은색 막대는 대측 영역을 나타낸다. 좌측 패널: 비-점화된 래트의 발작에서, 활성화된 영역은 동측 반구에서 가장 일관되게 관찰되었다. 우측 패널: 활성이 양쪽 반구로 전파된 점화된 래트에서의 발작과 대조적이다. 특히, 활성은 동측에서 대측 반구로 전파되었다.
도 12: 0% 개시 빈도를 사용한 비점화 및 점화된 발작에서 활성의 영역 전파. 영역은 가장 빠른 것에서 가장 느린 것으로 분류되었고, 흰색 막대는 시각화를 위해 동측 영역을 나타내고, 검은색 막대는 대측 영역을 나타낸다.
도 13: 비-점화된 동물 및 점화된 동물에서 발작 동안 뚜렷한 영역 교차 상관 패턴. 상부 패널: 비-점화 동물에서 평균된 영역 교차 상관 매트릭스. 하부 패널: 점화된 동물에서 평균 영역 교차 상관 매트릭스.
도 2: 해마-점화는 해마 연결성 및 고조된 불안의 뇌 전반에 걸친 변화를 초래한다. (A) 복부 해마 CamKII 세포는 LFP 기록을 위해 동측 복부 해마(iVHip) 및 동측 내측 전전두엽 피질(iMePFC)에 전극으로의 자극을 위해 표적화되었다. fMRI는 뇌를 가로질러 27개의 슬라이스를 영상화하였다. (B) 동시 LFP-fMRI는 점화 전후 및 비점화 대조군 동물(각 군에서 n = 12)에서 10㎐ VHip 연결성을 평가하기 위해 이용되었다. 각 스캔에 대해, 10㎐에서 전달된 5초 자극이 6 주기 동안 1분마다 1회 제공되었다. (C) p < 0.001에 해당하는 t-역치를 갖는 케이지-메이팅, 연령-메이팅된 대조군(좌측 패널) 및 점화된(우측 패널) 동물에 대한 통계적 t-맵. 대조군에서의 활동은 대부분 iVHip, iDHip, iMePFC, iAmyg 및 iSept로 제한되었지만, 점화된 래트에서의 활동은 이러한 영역을 포함하고 다른 영역으로도 확장됨을 주목한다. (D) 비-점화 및 점화된 래트에서 뇌-전체 영역 활성화 부피. 영역 활성화 부피는 개별 동물에서 정량화되고, 활성화된 영역의 비율로 표현되었다. 부피는 점화된 래트의 가장 큰 평균 부피에서 가장 작은 평균 부피로 분류되었다. 7개 영역은 대조군과 점화된 동물 사이에 유의미하게 상이하였다(다중 비교를 위해 본페로니-홀름(Bonferroni-Holm)의 보정을 사용하여 조정된 p-값을 갖는 t-검정). 가장 큰 효과는 iMePFC에서 관찰되었고, 그 다음으로 cMePFC, iFrAssC, iTeAssC, iOrFrC, iInsC, 및 마지막으로 iStria였다. (E) 비점화 및 점화된 동물에서 10㎐ 자극에 대한 영역 CBV-fMRI 피크 진폭 반응. 비-점화된 동물에서 5개의 가장 큰 활성 영역(ROI 활성의%)은 비-점화된 네트워크에 대한 점화의 영향을 결정하기 위해 선택되었으며, 해석의 용이함을 위해 CBV 진폭이 역전되었다. 점화 후, iMePFC 및 iAmyg에서 진폭의 유의미한 증가가 관찰되었다. 각각의 회색 원은 단일 동물로부터의 데이터를 나타낸다. (F) 점화 전(좌측 패널) 및 점화 후(우측 패널) 단일 래트로부터 iVHip 및 iMePFC에서 동시에 획득된 LFP 반응. 파란색 막대는 10㎐의 광유전학적 자극을 나타낸다. 점화 후 iMePFC LFP 반응의 증가에 주목한다. LFP는 구배-아티팩트 보정되고, 8 내지 12㎐에서 대역통과-필터링되었다. (G) 비-점화 및 점화된 래트에서 LFP 반응의 군 분석. 좌측 패널: 10㎐ 자극에 대한 iVHip LFP 반응은 대조군 및 점화된 동물에서 전후 조건 간에 차이가 없었다(군당 n = 12, F = 0.59, p = 0.81, 2-방향 반복 측정 ANOVA). 우측 패널: 10㎐ 자극에 대한 iMePFC LFP 반응은 대조군 동물과 비교할 때 점화 후 증가되었다(군당 n = 11, F = 5.39, p = 0.031, 2-방향 반복 측정 ANOVA). 사후 분석은 점화 후 6.4±2.6배 증가가 있음을 나타내었다(페어드 t-검정, t = 2.47, p = 0.033). LFP 전력을 추정하기 위해, 자극 동안 LFP 전력과 자극 직전 5초 사이의 비율이 계산되었다. 동물 당 각각의 시점에 대해, 6 내지 18개의 자극 블록의 비율의 중앙값은 시간-의존적 군 효과를 평가하기 위해 사용되었다. 각 블록에 대해, 자극 개시 전 5초에 비해 자극 블록으로부터 정규화된 전력이 계산되었다. 전극 파괴(1마리 대조군) 및 아티팩트 오염(1마리 점화된 군)으로 인해 전전두엽 피질 분석을 위해 2마리의 동물이 제거되었다. 이러한 동물로부터의 데이터는 보충 섹션을 참조한다. (H) fMRI 10주 후에 동물의 서브세트가 불안 및 우울증에 대한 행동 시험을 받았다. (I) 수크로스 선호도 시험. 기준선 측정은 물을 함유하는 2개의 병 중 어느 하나에 대한 선호도가 없음을 나타낸다. 수크로스 물을 함유하는 하나의 병 및 물을 함유하는 다른 병으로의 시험 측정은 둘 모두의 군이 수크로스 용액을 선호하였고 군 사이에 차이가 관찰되지 않았음을 나타낸다(n = 7,8, t-검정, p > 0.05). (J) 강제 수영 시험. 점화 후 군 간에 차이는 관찰되지 않았다(n = 7,8, t-검정, p > 0.05). (K) 오픈 필드 시험. 점화된 래트는 비 점화된 래트보다 오픈 필드의 중심에서 상당히 적은 시간을 보냈는데, 이는 점화 후 증가된 불안 표현형을 나타낸다(t-검정, p = 0.046). 모든 데이터는 평균±sem으로 제시되었다. p < 0.05의 역치는 통계적 유의성의 결정에 사용되었다.
도 3: 점화된 및 비-점화된 래트에서 유도된 발작의 뚜렷한 전파 패턴. (A) 발작이 유도되고, 동시 LFP-fMRI로 평가되었다. 비-점화 및 점화된 동물에서 90초 기준선 후에 발작이 유도되었다(각각 래트당 n = 2 내지 4 및 n = 7,5 래트). (B) 유도된 발작의 발작 지속기간. 점화된 래트의 발작은 비-점화된 래트의 발작보다 유의미하게 더 길었다(t-검정, p < 0.001). (C, D) LFP 및 BOLD 맵에 대한 동등한 시점을 나타내는 숫자로 비점화 래트에서 유도된 단일 발작. (C) 복부 해마 BOLD 반응과 중첩된 LFP 반응. (D) 광유전학적 발작 유도에 대한 뇌-전체 BOLD 반응. 좌측 패널: 브레그마(Bregma)에 대한 좌표를 갖는 팍시노스(Paxinos) 래트 뇌 환추()에 상응하는 뇌 슬라이스. 파란색 원은 발작 유도 부위를 나타낸다. 중간 패널: 발작 유도 동안 및 후 BOLD 활동의 발달. 우측 패널: 실험을 위한 복셀-레벨 최대 강도 투영. 활성은 대부분 동측 반구로 제한된다는 것이 주목된다. (E, F) LFP 및 BOLD 맵에 대한 동등한 시점을 나타내는 숫자를 갖는 점화된 래트에서 유도된 단일 발작. (E) 복부 해마 BOLD 반응과 중첩된 LFP 반응. (F) 광유전학적 발작 유도에 대한 뇌-전체 BOLD 반응. 좌측 패널: 브레그마에 대한 좌표를 갖는 팍시노스 래트 뇌 환추에 상응하는 뇌 슬라이스. 파란색 원은 발작 유도 부위를 나타낸다. 중간 패널: 발작 유도 동안 및 후 BOLD 활동의 진화. 우측 패널: 실험을 위한 복셀-레벨 최대 강도 투영. 활성은 피질로 양측으로 전파됨을 주목한다. BOLD 이미지는 자극 개시 60초 전으로 규정된, 기준선으로 정규화되었다. 모든 이미지는 시각화를 위해±2% 역치로 표시된다.
도 4. 점화된 발작은 점차적으로 피질로 양측으로 전파되는 반면, 비-점화된 발작은 국소화되어 있다. (A) 단일 광유전학적으로 유도된 발작으로부터의 지역 BOLD 활동의 예. 공통 뇌 환추를 이용하여 영역은 44개의 뇌 영역으로 자동적으로 세그먼트화되었다. 파란색 막대는 광유전학적 발작 유도 기간을 나타낸다. (B) 비-점화(7 래트에서 n = 20) 및 점화된 발작(5 래트에서 n = 17)에서 활성화된 영역의 수. 점화된 래트에서의 발작은 비-점화된 동물에서보다 15.5±2.2개 이상의 영역을 활성화시켰다(p < 0.0001). 회색 원은 개별 발작을 나타낸다. (C) 비점화 및 점화된 발작에서 활성화된 영역의 분포. 비교를 위해 각 군의 각 영역은 총 발작 횟수로 정규화되었다(각각 n = 20 및 n = 17). 비-점화된 발작에서, 활성화된 영역은 양측 활성화가 더 흔한 점화된 발작과 달리 대부분 동측 반구에 있었음을 주목한다. 검은색 원은 영역 전파 분석에 대한 신뢰성 있는 개시 시간 추정치를 보장하기 위한 80% 역치를 나타낸다. (D) 비-점화 및 점화된 발작에서 활성의 영역별 전파. 영역은 가장 빠른 것에서 가장 느린 것으로 분류되었고, 흰색 막대는 시각화를 위해 동측 영역을 나타내고, 검은색 막대는 대측 영역을 나타낸다. 좌측 패널: 비-점화된 래트의 발작에서, 활성화된 영역은 동측 반구에서 가장 일관되게 관찰되었다. 우측 패널: 활성이 양쪽 반구로 전파된 점화된 래트에서의 발작과 대조적이다. 특히, 활성은 동측에서 대측 반구로 전파되었다. 빨간색 라벨은 두 군 모두에서 활성화된 영역을 나타낸다. (E) 일반적으로 활성화된 영역에서 개시 시간 비교. iMePFC는 비-점화된 발작보다 점화된 발작에서 1.28±0.46초만큼 유의미하게 더 빠르게 활성화되었다(t = 2.153, p = 0.044, 본페로니 절차와의 다중 비교를 위해 보정됨). p < 0.05의 역치는 통계적 유의성의 결정에 사용되었다.
도 5: 느린 이동성 해마 발작 코어는 비-점화 및 점화된 래트에서 빈번하게 발생하고, 발작 일반화를 위한 주요 메커니즘으로 작용할 수 있다. (A, B) LFP 및 BOLD 맵에 대한 동등한 시점을 나타내는 숫자를 갖는 비점화 래트에서 유도된 단일 발작. (A) 복부 해마 BOLD 반응과 중첩된 LFP 반응. (B) 동측 해마 내에서 BOLD 활동의 전파. 고 진폭 활동은 자극된 VHip에서 시작하고, 해마의 극을 등쪽 영역으로 이동시키고, 시점 8까지, 활성은 VHip 전극에서 더 이상 검출되지 않지만 BOLD 증가는 DHip에서 지속된다는 점을 주목한다. (C, D) LFP 및 BOLD 맵에 대한 해당 시점을 나타내는 숫자를 갖는 점화된 래트에서 유도된 단일 발작. (C) 복부 해마 BOLD 반응과 중첩된 LFP 반응. (D) 동측 해마 내에서 BOLD 활동의 전파. (A, B)와 유사하게, BOLD 및 LFP는 발작 유도 동안 vHip에서 증가하고, 계속 증가한다. 고 진폭 활동은 VHip(시점 3,4)에서 그리고, 이후 극 위로 DHip(시점 5,6)으로 이동한다. (E) 동측 해마의 세그멘트화 환추. 해마는 10개의 슬라이스에 걸쳐 4개의 영역으로 세그먼트화되었다. (F) 복부 해마에서 등 해마로의 활성 전파 시간. 세그먼트화된 영역의 대부분의 복부로부터 대부분의 등쪽까지의 피크 대 피크 활성은 피크 활성이 복부에서 등쪽 해마까지 관찰된 시간을 계산하기 위해 사용되었다. 전파하는 해마 활성은 4/7 비-점화된 래트에서 8/20 발작 및 5/5 점화된 래트에서 15/17 발작에서 관찰되었다(G, H). 비-점화된 및 점화된 동물에서 개별 해마 복셀 시간 경과. 시간 경과는 (A, C)에서 동일한 발작으로부터이고 (E)에서와 같이 세그먼트화된다. 복셀 시간 경과는 가장 복부에서 가장 등쪽으로 분류된다.
도 6: 군 간의 복셀-방식 차이는 점화 후에만 명백하고 전에는 그러하지 않았다. p < 0.001에 상응하는 t-역치를 갖는 점화 후(우측 패널) 및 케이지-메이트 연령-메이팅된 대조군(좌측 패널)에서의 통계적 t-맵.
도 7: 자극 또는 단계 5 발작의 수는 점화 후 활성화를 설명하지 않았다. p < 0.001에 해당하는 t-역치를 갖는 점화 후 활성화 대 자극의 수(좌측 패널) 및 대 5단계 발작의 수(우측 패널)의 통계적 복셀-방식 t-맵.
도 8: 점화 후 복부 해마 10㎐ 자극에 대한 내측 전전두엽 반응의 진폭 증가. 복부 해마 회로로부터의 영역 시계열 데이터.
도 9: 분석에서 제거된 동시 LFP 기록. (A 내지 C) 상단 2개의 패널은 복부 해마 및 동측 내측 전전두엽 피질로부터 fMRI와 동시에 획득된 LFP 기록이다. 하단의 두 패널은 이러한 기록의 확대도이다. 파란색 막대는 광유전학적 자극(7.5㎳ 펄스의 10㎐)을 나타냅니다. (A) 자극의 오프셋 후 파열. 동물은 전기생리학적 및 BOLD 분석으로부터 제거되었다. (B, C) 내측 전전두엽 피질 전극이 파손되어 소음이 기록되었다. 두 동물 모두는 내측 전전두엽 피질 LFP의 분석으로부터 제거되었다.
도 10: 깨어 있는 및 덱스메데토미딘-진정된 래트에서 유도된 발작에서 유사한 전기생리학적 특징. (A, B) 깨어 있고 진정 하에서 유도된 발작 및 동일한 동물로부터의 복부 해마 LFP 기록. 빨간색 화살표는 큰 진폭 스파이크 개시를 나타내고, 삽입도 i) 내지 iii)은 이러한 발작의 확대된 성분이다. 파란색 막대는 광유전학적 자극(7.5㎳ 펄스의 40㎐) 시간을 나타낸다. (C) 깨어 있는 상태 및 진정된 상태의 다른 동물로부터의 전기생리학적 기록의 또 다른 세트. (D) 깨어 있는 상태 및 진정된 상태에서 후방전을 초래하는 자극의 비율에는 차이가 없다. 각 선은 단일 동물을 나타낸다. (E) 깨어있는 상태 및 진정된 상태에서 큰 진폭 스파이크 개시에는 차이가 없다. (F) 진정은 깨어 있는 상태와 비교하여 진정된 상태에서 더 짧은 후방전을 초래하지 않았다.
도 11: 90% 개시를 사용한 비점화 및 점화된 발작에서 활성의 영역 전파. 영역은 가장 빠른 것에서 가장 느린 것으로 분류되었고, 흰색 막대는 시각화를 위해 동측 영역을 나타내고, 검은색 막대는 대측 영역을 나타낸다. 좌측 패널: 비-점화된 래트의 발작에서, 활성화된 영역은 동측 반구에서 가장 일관되게 관찰되었다. 우측 패널: 활성이 양쪽 반구로 전파된 점화된 래트에서의 발작과 대조적이다. 특히, 활성은 동측에서 대측 반구로 전파되었다.
도 12: 0% 개시 빈도를 사용한 비점화 및 점화된 발작에서 활성의 영역 전파. 영역은 가장 빠른 것에서 가장 느린 것으로 분류되었고, 흰색 막대는 시각화를 위해 동측 영역을 나타내고, 검은색 막대는 대측 영역을 나타낸다.
도 13: 비-점화된 동물 및 점화된 동물에서 발작 동안 뚜렷한 영역 교차 상관 패턴. 상부 패널: 비-점화 동물에서 평균된 영역 교차 상관 매트릭스. 하부 패널: 점화된 동물에서 평균 영역 교차 상관 매트릭스.
정의
본 개시내용의 실시형태가 추가로 기술되기 전에, 본 개시내용은 기술되는 특정 실시형태로 제한되지 않으며, 그 자체가 물론 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 기술하기 위한 목적이고, 본 개시내용의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 제한하려는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질은 또한 본 개시내용의 실시형태의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "화합물"에 대한 언급은 단일 화합물뿐만 아니라 2개 이상의 화합물들의 조합을 포함하며, "치환체"에 대한 언급은 단일 치환체뿐만 아니라 2개 이상의 치환체들 등을 포함한다.
본 발명을 기술하고 청구함에 있어서, 특정 용어는 하기에 기술되는 정의에 따라 사용될 것이다. 본 명세서에 제공되는 정의는 상호 배타적인 것으로 의도되지 않는 것으로 인식될 것이다. 따라서, 일부 화학적 모이어티는 하나 초과의 용어의 정의에 속할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 어구 "예를 들어", "예컨대", "~와 같은" 또는 "포함하는"은 보다 일반적인 주제를 추가로 명확히 하는 예를 도입하는 것을 의미한다. 이러한 예는 본 개시내용을 이해하기 위한 보조로서만 제공되며, 어떠한 방식으로든 제한하려는 것은 아니다.
용어 "활성제", "길항제", "저해제", "약물" 및 "약리학적 활성제"는 유기체(인간 또는 동물)에 투여될 때 국소 및/또는 전신 작용에 의해 요망되는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 포함하는 화학 물질 또는 화합물을 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료", "치료하는" 등은 요망되는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 점에서 예방적일 수 있고/있거나 질환에 대한 부분적 또는 완전한 치유 및/또는 질환에 기인하는 부작용의 관점에서 치료적일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서 질환의 임의의 치료를 포함하며, (a) 질환(예를 들어, 원발성 질환과 관련되거나 이에 의해 유발될 수 있는 질환을 포함함)에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질환을 갖는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 발병하는 질환 또는 질환의 증상을 예방하고; (b) 질환을 저해하고, 즉, 이의 발달 정지시키고; (c) 질환을 완화시키고, 즉, 질환의 퇴행을 유발시키는 것을 포함한다.
"치료학적 유효량" 또는 "유효량"은 질환, 병태 또는 장애를 치료하기 위해 포유동물 또는 다른 대상체에게 투여될 때, 질환, 병태, 또는 장애에 대한 치료를 달성하기에 충분한 화합물의 양을 의미한다. "치료학적 유효량"은 화합물, 질환 및 이의 중증도 및 치료될 대상체의 연령, 체중 등에 따라 달라질 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단위 투약 형태"는 인간 및 동물 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 비히클과 관련하여 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 계산된 사전결정된 양의 화합물을 함유한다. 단위 투약 형태에 대한 사양은 사용되는 특정 화합물 및 달성되는 효과, 및 숙주에서 각 화합물과 관련된 약력학에 의존한다.
"약제학적으로 허용 가능한 부형제", "약제학적으로 허용 가능한 희석제", "약제학적으로 허용 가능한 담체" 및 "약제학적으로 허용 가능한 애쥬번트"는 일반적으로 안전하고, 비독성이고, 생물학적으로 또는 달리 요망되지 않는 약학적 조성물을 제조하는데 유용한 부형제, 희석제, 담체, 및 애쥬번트를 의미하고, 수의학적 용도뿐만 아니라 인간 약학적 용도에 허용되는 부형제, 희석제, 담체, 및 애쥬번트를 포함한다. 본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 "약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제, 담체 및 애쥬번트"는 하나 및 하나 초과의 이러한 부형제, 희석제, 담체, 및 애쥬번트 모두를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "약학적 조성물"은 포유동물, 특히 인간과 같은 대상체에 투여하기에 적합한 조성물을 포함하는 것을 의미한다. 일반적으로 "약학적 조성물"은 멸균되고, 바람직하게는 대상체 내에서 바람직하지 않은 반응을 유발할 수 있는 오염물이 존재하지 않는다(예를 들어, 약학적 조성물 내의 화합물(들)은 약학적 등급이다). 약학적 조성물은 경구, 협측, 직장, 비경구, 복강내, 피내, 체강내, 근육내, 피하 등을 포함하는 다수의 상이한 투여 경로를 통해 이를 필요로 하는 대상체 또는 환자에게 투여하도록 설계될 수 있다.
용어 "개체", "숙주", "대상체" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되고, 유인원 및 인간을 포함하는 인간 및 비-인간 영장류; 래트 및 마우스를 포함하는 설치류; 소; 말; 양; 고양이; 개; 조류 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 동물을 지칭한다. "포유동물"은 임의의 포유동물 종의 구성원 또는 구성원들을 의미하고, 일 예로서 개; 고양이; 말; 소; 양; 설치류 등, 및 영장류, 예를 들어, 비-인간 영장류, 및 인간을 포함한다. 비-인간 동물 모델, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 비-인간 영장류, 뮤린, 토끼목 등이 실험 조사를 위해 사용될 수 있다. 적합한 동물 모델은 특히 설치류, 예를 들어, 래트 및 마우스를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "결정하는", "측정하는", "평가하는", 및 "검정하는"은 상호 교환적으로 사용되고, 정량적 및 정성적 결정 둘 모두를 포함한다.
국소 장 전위(LFP)는 통상적으로 미세-전극(금속, 실리콘 또는 유리 마이크로피펫)을 사용하여, 뇌 조직의 세포외 공간에서 기록된 전위이다. LFP는 피질 조직(또는 다른 뇌심부 구조) 내에서 깊이에 따라 기록된다. 포유동물 피질에서 LFP 신호는 수천 개의 뉴런의 활동을 반영하고, 일반적으로, 예를 들어, 감각 처리, 운동 계획, 주의력, 기억, 및 지각의 기초가 되는 네트워크 역학을 연구하는 데 사용된다. LFP 신호는 고밀도 실리콘 기반 미세전극의 개발로 인해 최근 수십 년 동안 중요성이 더욱 증가하여, 전체 뇌 영역에 걸친 수천 개의 위치에서 LFP의 동시 기록을 가능하게 한다. LFP는 단일 단위 스파이크 활동보다 만성 설정에서 더 쉽고 안정적으로 기록되기 때문에 신경보철 장치를 조종하는 데 사용될 수 있다.
자기 공명 영상(MRI)은 신경물리적 사건을 분석하는 데 사용된다. 특히, MRI는 신경물리적 사건과 관련하여 뇌의 기능적으로 상관된 영역(해부학적 네트워크)을 분석하는 데 사용될 수 있다. 상관 패턴은 신경물리적 사건의 시간적 및/또는 공간적 상관 관계를 나타낼 수 있다. 관심 MRI 기술은 기능적 MRI(fMRI)이다. fMRI로, 이미지 콘트라스트의 시간적 변화는 적합한 MR 영상 스캐닝 시퀀스에 의해 표시된다. 기능적 MRI(fMRI)는 신경 활동의 변화로 인한 뇌의 신호 변화를 측정한다. 뇌는 저해상도이지만 빠른 속도로 스캔된다(통상적으로, 2 내지 3초마다 1회). 신경 활동의 증가는 T*2 변화를 통해 MR 신호의 변화를 야기한다. 이러한 메커니즘은 혈액-산소-수준 의존성(BOLD) 효과로 지칭된다. 증가된 신경 활동은 산소에 대한 요구를 증가시키며, 혈관계는 실제로 이를 과잉 보상하여, 탈산소화된 헤모글로빈에 비해 산소화된 헤모글로빈의 양을 증가시킨다. 탈산소화된 헤모글로빈이 MR 신호를 감쇠시키기 때문에, 혈관 반응은 신경 활동과 관련된 신호 증가를 초래한다. BOLD 효과는 또한 신경 조직 내의 정맥 혈관계의 고해상도 3D 맵의 생성을 가능하게 한다.
BOLD 신호가 인간 대상체에서 신경과학 연구에 사용되는 가장 일반적인 방법이지만, MR 영상화의 유연한 특성은 신호를 혈액 공급의 다른 양태에 민감하게 하는 수단을 제공한다. 대안적인 기술은 동맥 스핀 라벨링(ASL)을 사용하거나 뇌 혈류(CBF) 및 뇌 혈액 부피(CBV)에 의해 MRI 신호의 가중치를 부여한다. CBV 방법은 현재 인간 임상 시험 중에 있는 한 부류의 MRI 조영제의 주사를 필요로 한다. 이러한 방법이 전임상 연구에서 BOLD 기술보다 훨씬 더 민감한 것으로 나타났기 때문에, 이러한 것은 임상 적용에서 fMRI의 역할을 잠재적으로 확장할 수 있다. CBF 방법은 검출 감도의 상당한 손실에도 불구하고 BOLD 신호보다 더 많은 정량적 정보를 제공한다.
간질. 간질은 시간이 지남에 따라 반복되는 발작을 특징으로 하는 뇌 장애이다. 간질의 타입은 전신 간질, 예를 들어, 아동기 결핍 간질, 청소년 근간대성 간질, 각성시 대발작을 갖는 간질, 웨스트 증후군(West syndrome), 레녹스-가스토 증후군(Lennox-Gastaut syndrome), 부분 간질, 예를 들어, 측두엽 간질, 전두엽 간질, 아동기의 양성 국소 간질을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
간질중첩증(SE). 간질중첩증(SE)는, 예를 들어, 경련성 간질중첩증, 예를 들어, 초기 간질중첩증, 확립된 간질중첩증, 불응성 간질중첩증, 초-불응성 간질중첩증; 비-경련성 간질중첩증, 예를 들어, 전신성 간질중첩증, 복합 부분 간질중첩증; 전신성 주기적 간질성 방전; 및 주기적 편측성 간질형 방전을 포함할 수 있다. 경련성 간질중첩증은 경련성 간질중첩증 발작의 존재를 특징으로 하며, 초기 간질중첩증, 확립된 간질중첩증, 불응성 간질중첩증, 초-불응성 간질중첩증을 포함할 수 있다. 조기 간질 지속증은 1차 요법으로 치료된다. 확립된 간질 지속증은 1차 요법에 의한 치료에도 불구하고 지속되는 간질 지속성 발작을 특징으로 하고, 2차 요법이 투여된다. 불응성 간질 지속증은 1차 및 2차 요법으로의 치료에도 불구하고 지속되는 간질 지속 상태 발작을 특징으로 하고, 전신 마취제가 일반적으로 투여된다. 초불응성 간질 지속증은 1차 요법, 2차 요법, 및 전신 마취제로 24시간 이상 치료함에도 불구하고 지속되는 간질중첩증 발작을 특징으로 한다.
비-경련성 간질중첩증은, 예를 들어, 국소 비-경련성 간질중첩증, 예를 들어, 복합 부분 비-경련성 간질중첩증, 단순 부분 비-경련성 간질중첩증, 미세 비-경련성 간질중첩증; 전신성 비-경련성 간질중첩증, 예를 들어, 후기 발병 부재 비-경련성 간질중첩증, 비전형적 부재 비-경련성 간질중첩증, 또는 전형적인 부재 비-경련성 간질중첩증을 포함할 수 있다.
발작. 발작은 뇌에서 비정상적인 전기적 활동의 에피소드 후에 발생하는 신체적 발견 또는 행동의 변화이다. 용어 "발작"은 종종 "경련"과 상호교환적으로 사용된다. 경련은 사람의 신체가 빠르고 제어할 수 없을 정도로 떨리는 경우입니다. 경련 동안, 사람의 근육은 반복적으로 수축 및 이완된다. 행동 및 뇌 활동의 타입에 따라, 발작은 전신 및 부분(국소 또는 국부라고도 함)의 두 가지 광범위한 카테고리로 나누어진다. 발작 타입을 분류하면 의사가 환자에게 간질이 있는 지의 여부를 진단하는 데 도움이 된다.
전신 발작은 전체 뇌에 걸친 전기 충격에 의해 생성되는 반면, 부분 발작은 뇌의 비교적 작은 부분에서 전기 충격에 의해 (적어도 초기에) 생성된다. 발작을 발생시키는 뇌의 부분은 때때로 중심(focus)이라고 불린다.
전신 발작에는 여러 타입이 있다. 가장 흔하고 극적이며 따라서 가장 잘 알려진 것은 대발작이라고도 하는 전신 경련이다. 이러한 타입의 발작에서, 환자는 의식을 잃고 대개 쓰러진다. 의식 상실 후 30 내지 60초 동안 전신 경직(발작의 "긴장" 단계라 함), 이어서 30 내지 60초 동안 격렬한 경련("간대성" 단계)이 뒤따르고, 그 후 환자는 깊은 수면("발작후" 또는 발작 후 단계)이 뒤따른다. 대발작 동안, 혀 깨물기 및 요실금과 같은 부상 및 사고가 발생할 수 있다.
결핍 발작은 증상이 거의 또는 전혀 없이 짧은 의식 상실(단 몇 초)을 일으킨다. 대부분의 경우 아동인 환자는 통상적으로 활동을 중단하고 멍하니 응시한다. 이러한 발작은 갑자기 시작되고 끝나고, 하루에 여러 번 발생할 수 있다. 환자는 대개 "시간 손실"을 인지할 수 있다는 점을 제외하고는 자신이 발작을 하고 있다는 것을 인지하지 못한다.
근간대성 발작은 대개 신체의 양쪽에 산발적인 반사(jerk)로 구성된다. 환자는 때때로 반사를 짧은 전기 충격으로 설명한다. 폭력적일 때, 이러한 발작은 물건을 떨어뜨리거나 비자발적으로 던질 수 있다.
간대 발작은 동시에 신체의 양쪽을 포함하는 반복적이고 리드미컬한 반사이다.
긴장성 발작은 근육의 경직을 특징으로 한다.
긴장성 발작은 특히 팔과 다리에서 갑작스럽고 일반적인 근육긴장도의 상실로 구성되며, 이는 종종 낙상을 초래한다.
국소 내지 양측 강직-간대(FBTC) 발작은 뇌의 한 영역에서 시작하고, 이후에, 긴장-간대 발작으로서 뇌의 양쪽으로 퍼진다.
발작 중증도를 평가할 때, 종종 발작-관련 행동을 분류하기 위해 척도가 사용된다. 라신 척도는 이러한 행동을 기술하기 위해 가장 널리 사용되는 척도이다. 라신 척도는 5개의 단계를 포함하고, 각 단계는 하기와 같이 분류된다: 단계 1: 입 및 안면 간대; 단계 2: 단계 1 + 머리 끄덕임; 단계 3: 단계 2 + 앞다리 간헐성 경련; 단계 4: 단계 3 + 양육; 단계 5: 단계 4 + 반복된 양육 및 낙상.
본 명세서에서 사용되는 용어 "점화" 또는 "점화 모델"은 발작이 반복적으로 유도된 후 유도된 발작의 지속기간 및 행동 관련이 증가하는 발작 및 간질의 발달을 위해 널리 사용되는 모델을 지칭한다. 이러한 모델에서, 실험 동물은 대개 전기 또는 화학 물질로 반복적으로 자극되어 발작을 유도한다. 이러한 첫 번째 자극 후에 발생하는 발작은 짧은 시간 지속되고, 반복된 자극으로 인한 발작과 비교하여 소량의 행동 효과를 동반하거나 행동 효과를 동반하지 않는다. 추가 발작과 함께, 수반되는 행동은, 예를 들어, 초기 자극의 동결에서 후기 자극의 경련으로 진행하는 것을 강화한다. 지속기간의 연장 및 행동 동반의 강화는 결국 반복된 자극 후에 안정기에 도달한다(예를 들어, 문헌[Bertram, E., (2007) Epilepsia 48 (Supplement 2): 65-74] 참조).
점화는 전기자극, 광유전학, 화학적 처리 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 여러 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 광유전학이 점화에 사용될 때, 광-활성화 가능한 단백질이 관심 표적 세포에서 발현된다. 사용될 수 있는 광-활성화 가능한 단백질은 ChR2, VChR1, C1V1 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 광-활성화 가능한 단백질의 발현은 Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II(CaMKII) 프로모터를 사용하여 관심 뉴런에 표적화된다. 일부 실시형태에서, 광-활성화 가능한 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 해마로 전달된다.
동물은 하루에 최대 12회의 자극까지 또는 단계 5 운동 발작이 나타날 때까지 자극될 수 있고, 최대 12일의 자극까지 격일로 자극될 수 있다. 일부 실시형태에서, 동물은 점화가 달성될 때까지 하루에 12회 미만, 예를 들어, 11 내지 9회, 9 내지 7회, 7 내지 5회, 5 내지 3회 또는 3회 미만으로 자극된다. 자극은 최대 12일 동안 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 동물은 점화를 달성하기 위해 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1일 동안 자극된다. 자극간 간격은 15분일 수 있다. 단계 5 운동 발작이 당일의 처음 3회 자극 내에서 관찰되는 경우 개체는 점화된 것으로 간주될 수 있다.
발작 개시 구역. 발작 개시 구역은 간질 발생 구역과 대조적으로, 임상 발작이 발생하는 피질의 구역이며, 이는 간질 발작의 발생에 필수적인 피질의 구역이다. 발작 개시 구역은 일반적으로 두피 또는 침습적 EEG 기술에 의해 국소화된다. 발작 개시 구역의 위치는 또한 발작성 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT)에 의해 결정될 수 있다. 이는 대개 후방전을 생성할 수 있는 스파이크를 생성하는 자극성 구역의 부분이다. 이러한 것들은 주요 기능 피질을 침입할 때 임상 발작 증상을 일으키기에 충분한 강도를 갖는 반복적인 스파이크로 구성된다. 침습성 피질 표면 전극은 뇌의 극히 제한된 영역으로부터의 활동을 기록한다. 거리 및 절연 장벽을 제거함으로써, 각각의 전극은 그러한 전극에 의해서만 덮인 피질 구역을 기록한다. 따라서, 침습성 전극은 본질적으로 후방전의 검출에 매우 민감하지만, 이러한 것들이 발작 개시 구역을 직접 덮는 경우에만 발작 기원을 정확하게 규정할 수 있을 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "신경 활동"은 뉴런의 전기적 활성(예를 들어, 뉴런의 막 전위의 변화)뿐만 아니라 하나 이상의 뉴런의 전기적 활성의 간접적인 측정을 지칭할 수 있다. 따라서, 신경 활동은, 예를 들어, 기능적 자기 공명 영상화에서 혈액 산소화 수준 의존성(BOLD) 신호에 의해 측정하는 경우, 전기장 전위의 변화, 세포내 이온 농도의 변화(예를 들어, 세포내 칼슘 농도), 및 뉴런의 전기적 활성에 의해 유도된 자기 공명의 변화를 지칭할 수 있다.
발작 모델
본 명세서에서는 특히 효과의 미세한 구별을 위해 단일 발작의 영상화에 의해, 발작과 관련된 뇌 회로 및 영역 관계를 생체내에서 분석하기 위한 방법 및 모델이 제공된다. 본 개시내용의 방법은 발작의 효과를 영상화하기 위해 필요에 따라 임의의 수의 적합한 뉴런 자극 및 뉴런 활성 측정 프로토콜의 조합을 사용할 수 있다. 방법 및 모델은, 예를 들어, 단일 발작의 분석, 국소 내지 양측 긴장-간대(FBTC) 발작의 분석, 흥분성 복부 해마(VH) 네트워크의 분석 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에 제공된 모델은 일반적으로 점화된 동물 모델을 사용한다. 점화는 특정 뇌 영역에서 전기 자극에 의한 후방전 유도가 반복될 때 발작 감수성의 점진적인 향상을 유발하는 발작-유도 가소성 현상을 지칭한다. 궁극적으로, 이는 자발적 발작의 출현 및 영구적인 간질 상태의 확립으로 절정에 이른다. 점화는 광유전학적 또는 전기 자극으로 확립될 수 있다.
동물 모델에서 동시 LFP-fMRI로 단일 발작을 영상화하기 위해, 동물은 진정되고, 발작의 영상화 동안 움직임을 없애기 위해 속효성 신경근 차단제로 처리될 수 있으며, 이러한 목적을 위한 예시적인 작용제는 비제한적으로 덱스메데토미딘 진정제 및 베쿠로늄을 포함한다. 개별 발작의 영상화를 통해 해마에서 느린 이동 활동의 코어는 신규한 발작 전파 및 일반화 메커니즘을 제공하는 것으로 나타났으며; FBTC 발작의 전파가 영상화될 수 있다.
발작은 점화된 동물에서 전기 자극, 예를 들어, 전기충격 전뇌 자극 프로토콜, 단일-유발 간질 후방전; 화학경련제, 예를 들어, 필로카르핀, 파상풍 독소, PTZ, 카인산(kainic acid), 플루오로틸(flurothyl) 등, 유체 충돌 손상, 고강도 음향 자극으로 유도될 수 있다. 일부 실시형태에서, 광유전학적 자극이 바람직하다.
일 실시형태에서, 개체의 뇌의 특정 영역은 조합된 전기생리학, 예를 들어, 뇌의 상이한 영역의 국소 장 전위(LFP) 및 기능적 자기 공명 영상(fMRI) 스캐닝과 함께 자극되어 뇌의 발작 전파 구역과 다른 영역 간의 기능적 연결을 결정하고 발작의 움직임을 영상화한다. 분석에 적합한 프로토콜은 전기생리학; 신경 활동의 광-유도 조절; 뇌파검사(EEG) 기록; 기능적 영상화 및 행동 분석을 포함한다. 전기생리학은 단일 전극, 다중 전극, 및/또는 전계 전위 기록을 포함할 수 있다. 신경 활동의 광-유도 조절은 본 명세서에 추가로 기술된 바와 같은, 임의의 적합한 광유전학적 방법을 포함할 수 있다. 기능적 영상화는 fMRI, 및 유전적으로 인코딩된 지표(예를 들어, 칼슘 지표, 전압 지표 등)를 사용하는 임의의 기능적 영상화 프로토콜을 포함할 수 있다. 행동 분석은 각성, 기억(예를 들어, 수중 미로 검정), 컨디셔닝(예를 들어, 공포 컨디셔닝), 감각 반응(예를 들어, 시각, 체성감각, 청각, 미각 및 후각 신호에 대한 반응)에 대한 행동 검정과 같은 임의의 적합한 행동 검정을 포함할 수 있다.
fMRI와 같은 일부 프로토콜은 신경 활동을 나타내는 비침습성, 뇌 전체 측정을 제공한다. 전기생리학과 같은 일부 프로토콜은 신경 활동의 세포 분해능 및 신속한 측정뿐만 아니라 신경 활동의 세포 분해능 및 신속한 제어를 제공한다. 광유전학과 같은 일부 프로토콜은 규정된 뉴런 군에서 활동 전위 발사의 공간-표적화 및 시간-규정된 제어를 제공한다.
일부 실시형태에서, 점화된 동물에서 단일 발작으로부터의 유도 및 전파에 의해 개체에서 이동성 발작 코어의 특정 확인 및 국소화를 위한 방법이 제공되며, 이는 발작 개시 구역을 결정하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 점화된 동물에서 단일 발작으로부터 유도 및 증식에 의해 개체에서 FBTC 발작의 특정 확인 및 국소화를 위한 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 발작에 대한 광유전학적 점화 모델이 제공되며, 여기서 전자사진 발작(electrographic seizure)은 세포-타입 특이적, 광유전학적 자극에 의해 동물 모델에서 유도되며, 이러한 동물은 이후 연장된 기간에 걸쳐 FBTC 발작의 신뢰성 있는 유도를 제공하며, 여기서, 연장된 기간은 최대 2주, 최대 3주, 최대 4주, 최대 2개월, 최대 3개월, 또는 그 초과일 수 있다. 자극을 위한 광-활성화된 폴리펩타이드는, 예를 들어, CHR2를 비제한적으로 포함하는 채널로돕신일 수 있다. 광 활성화된 폴리펩타이드는 흥분성 해마 뉴런에서 발현되는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 자극 패러다임은 기저의 기능적 회로 변화를 평가하기 위해, 예를 들어, 대략 10㎐의, 발작을 유발하는 역치 미만의 일련의 짧고 약한 자극을 포함한다. 약 40㎐의 길고 강렬한 자극은 발작 회로 역학을 평가하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 발작에 대한 광유전학적 점화 모델이 제공되며, 여기서 전자사진 발작은 세포-타입 특이적, 광유전학적 자극에 의해 동물 모델에서 유도되며, 이러한 동물은 이후 연장된 기간에 걸쳐 FBTC 발작의 신뢰성 있는 유도를 제공하며, 여기서, 연장된 기간은 최대 2주, 최대 3주, 최대 4주, 최대 2개월, 최대 3개월, 또는 그 초과일 수 있다. 자극 패러다임은 기저 기능 회로 변화를 평가하기 위해, 예를 들어, 대략 8 내지 12㎐, 예를 들어, 약 10㎐의, 발작을 유발하는 역치 미만의 일련의 짧고 약한 자극을 포함한다. 발작 회로 역학을 평가하기 위해 약 35 내지 45㎐, 예를 들어, 약 40㎐의 길고 강렬한 자극이 사용될 수 있다. 동시 전기생리학 및 fMRI는 복부 해마에서 흥분성 뉴런의 점화 효과를 결정하는 데 사용될 수 있다. 단일 유도 발작의 영상화 뇌-전체 네트워크 역학은 국소 및 FBTC 발작 전파를 보여준다. 일부 실시형태에서, 이러한 발작 전파의 변수는 간질에 대한 외과적 표적화 및 치료법 개발을 안내하는 데 사용된다. 발견에는 발작을 동반할 수 있고 발작 전에 흔히 관찰되는 고 진폭 활동의 느린 이동성 코어의 표시가 포함된다. 동물 모델은 치료적 개입, 예를 들어, 수술, 약리학적 치료법 등의 설계 및 시험에 유용하며, 여기서, 발작 전파에 대한 치료적 개입의 효과가 결정될 수 있다. 동물 모델은 또한 간질 동반질환에 대한 약물의 설계에 유용하며, 예를 들어, 가장 큰 활성 변화는 내측 전전두엽 피질(mePFC)에서 발생하며, 이는 복부 해마(vHip)와 mePFC 간의 증가된 흥분성 관계를 나타낸다. vHip-mePFC 회로 기능장애를 표적으로 하도록 설계된 치료법은 불안 및 인지 결함을 포함하는, 간질과 관련된 동반질환을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 동물 모델은 점화된다. 점화는 전기자극, 광유전학, 화학적 처리 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다수의 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 광유전학이 점화에 사용될 때, 광-활성화 가능한 단백질은 관심 표적 세포에서 발현될 수 있다. 사용될 수 있는 광-활성화 가능한 단백질은 ChR2, VChR1, C1V1 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 광-활성화 가능한 단백질은 Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II(CaMKII) 프로모터를 사용하여 관심 뉴런에 표적화된다. 일부 실시형태에서, 광-활성화 가능한 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 해마로 전달된다.
점화를 달성하기 위해, 개체는 7.5㎳의 펄스폭으로 적어도 30㎐의 광에 의해 자극될 수 있다. 일부 실시형태에서, 개체는 30㎐ 초과로 자극된다. 예를 들어, 30 내지 35㎐, 35 내지 40㎐, 40 내지 45㎐, 45 내지 50㎐ 또는 50㎐ 초과이다. 점화를 달성하기 위해, 개체는 하루에 최대 12회까지 자극될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 점화가 달성될 때까지 하루에 12회 미만, 예를 들어, 11 내지 9회, 9 내지 7회, 7 내지 5회, 5 내지 3회, 또는 3회 미만으로 자극될 수 있다. 자극은 최대 12일 동안 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 개체는 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1일 동안 자극될 수 있다.
기능적 신경 회로 변화를 조사하기 위해, 개체는 적어도 1㎐의 광 펄스로 자극될 수 있다. 일부 실시형태에서, 개체는 1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 15 또는 15 내지 20㎐와 같은 1㎐ 초과의 광 펄스로 자극될 수 있다.
발작 신경 회로 변화를 조사하기 위해, 개체는 적어도 30㎐의 광 펄스로 자극될 수 있다. 일부 실시형태에서, 개체는 30㎐ 초과의 광 펄스, 예컨대, 30 내지 35, 35 내지 40, 40 내지 45, 45 내지 50 또는 50㎐ 초과로 자극될 수 있다.
일부 실시형태에서, 작용제는 발작의 지속기간 또는 중증도가 감소되는 경우 발작의 표적화된 개입에 효과적인 것으로 결정된다. 일부 실시형태에서, 발작의 중증도는 라신 척도를 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 작용제는 발작 중증도가 라신 척도에서 적어도 1 단계만큼 감소하는 경우 표적화된 개입에 효과적인 것으로 결정된다. 예를 들어, 발작 중증도는 라신 단계 5에서 단계 4로 감소된다. 일부 실시형태에서, 발작 중증도는 2 단계, 3 단계, 4 단계만큼 감소되거나 발작이 모두 함께 중단된다.
광유전학적 자극
상기 기술된 바와 같이, 단일 발작의 검출 및 이로부터 유래된 전기생리학에 유용한 동물 모델은, 예를 들어, 점화 및 발작 유도를 위해 광유전학적 자극을 이용할 수 있고, 여기서 점화 및 발작 유도에 관여하는 뉴런은 광-활성화된 폴리펩타이드를 작동 가능하게 발현한다.
광-활성화된 폴리펩타이드를 활성화시키기 위해 사용되는 광 자극은, 예를 들어, 주파수, 펄스폭, 듀티 사이클, 파장, 강도 등을 특징으로 하는 광 펄스를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 광 자극은 2개 이상의 상이한 세트의 광 펄스를 포함하며, 여기서, 광 펄스의 각 세트는 광 펄스의 상이한 시간 패턴을 특징으로 한다. 시간적 패턴은 주파수, 기간(즉, 광 자극의 총 지속기간), 펄스폭, 듀티 사이클 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 적합한 파라미터를 특징으로 할 수 있다.
광 펄스는 임의의 적합한 주파수를 가질 수 있다. 일부 경우에, 광 펄스의 세트는 광 자극의 지속기간 전반에 걸쳐 지속되는 단일 펄스의 광을 함유한다. 일부 경우에, 한 세트의 광 펄스는 0.1㎐ 이상, 예를 들어, 0.5㎐ 이상, 1㎐ 이상, 5㎐ 이상, 10㎐ 이상, 20㎐ 이상, 30㎐ 이상, 40㎐ 이상, 50㎐ 이상, 또는 60㎐ 이상, 또는 70㎐ 이상, 또는 80㎐ 이상, 또는 90㎐ 이상, 또는 100㎐ 이상의 주파수를 가지고, 100,000㎐ 이하, 예를 들어, 10,000㎐ 이하, 1,000㎐ 이하, 500㎐ 이하, 400㎐ 이하, 300㎐ 이하, 200㎐ 이하, 100㎐ 이하의 주파수를 갖는다. 일부 실시형태에서, 광 펄스는 0.1 내지 100,000㎐, 예를 들어, 1 내지 10,000㎐, 1 내지 1,000㎐(5 내지 500㎐, 또는 10 내지 100㎐ 포함) 범위의 주파수를 갖는다.
예를 들어, 발작을 유발시키기 위한 역치 미만의 일련의 짧고 약한 자극은, 예를 들어, 대략 약 1㎐ 내지 약 15㎐, 약 5㎐ 내지 약 15㎐로 전달될 수 있고, 대략 10㎐에 적용될 수 있고, 기저 기능적 회로 변화를 평가하기 위해 적용될 수 있다. 약 25 내지 약 50㎐, 약 35 내지 약 45㎐의 길고 강렬한 자극이 전달될 수 있으며, 예를 들어, 대략 약 40㎐가 발작 회로 역학을 평가하는 데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 2개의 세트의 광 펄스는 상이한 펄스폭, 예를 들어, 짧거나 긴 것과 같은 상이한 파라미터 값을 갖는 것을 특징으로 한다. 광 펄스는 임의의 적합한 펄스폭을 가질 수 있다. 일부 경우에, 펄스폭은 0.1㎳ 이상, 예를 들어, 0.5㎳ 이상, 1㎳ 이상, 3㎳ 이상, 5㎳ 이상, 7.5㎳ 이상, 10㎳ 이상(15㎳ 이상을 포함함), 또는 20㎳ 이상, 또는 25㎳ 이상, 또는 30㎳ 이상, 또는 35㎳ 이상, 또는 40㎳ 이상, 또는 45㎳ 이상, 또는 50㎳ 이상이고, 500㎳ 이하, 예를 들어, 100㎳ 이하, 90㎳ 이하, 80㎳ 이하, 70㎳ 이하, 60㎳ 이하, 50㎳ 이하, 45㎳ 이하, 40㎳ 이하, 35㎳ 이하, 30㎳ 또는 25㎳ 이하(20㎳ 이하를 포함함)이다. 일부 실시형태에서, 펄스폭은 1 내지 60㎳, 또는 1 내지 50㎳, 또는 1 내지 30㎳를 포함하여 0.1 내지 500㎳, 예를 들어, 0.5 내지 100㎳, 1 내지 80㎳의 범위이다.
뇌의 영역에 광 펄스를 전달하는 광섬유의 팁에서 측정된 광 펄스의 평균 전력은 임의의 적합한 전력일 수 있다. 일부 경우에, 전력은 0.1㎽ 이상, 예를 들어, 0.5㎽ 이상, 1㎽ 이상, 1.5㎽ 이상, 예를 들어, 2㎽ 이상, 또는 2.5㎽ 이상, 또는 3㎽ 이상, 또는 3.5㎽이다. 이상, 또는 4㎽ 이상, 또는 4.5㎽ 이상, 또는 5㎽ 이상이고, 1,000㎽ 이하, 예를 들어, 500㎽ 이하, 250㎽ 이하, 100㎽ 이하, 50㎽ 이하, 40㎽ 이하, 30㎽ 이하, 20㎽ 이하, 15㎽ 이하(10㎽ 이하를 포함함), 또는 5㎽ 이하일 수 있다. 일부 실시형태에서, 전력은 0.1 내지 1,000㎽, 예를 들어, 0.5 내지 100㎽, 0.5 내지 50㎽, 1 내지 20㎽(1 내지 10㎽를 포함함), 또는 1 내지 5㎽의 범위이다.
광 펄스의 파장 및 강도는 다양할 수 있고, 광-활성화된 폴리펩타이드의 활성화 파장, 뇌 영역의 광학적 투명도, 조명될 뇌의 요망되는 부피 등에 의존할 수 있다.
광 펄스에 의해 조명된 뇌 영역의 부피는 임의의 적합한 부피일 수 있다. 일부 경우에, 조명된 부피는 0.001㎣ 이상, 예를 들어, 0.005㎣ 이상, 0.001㎣ 이상, 0.005㎣ 이상, 0.01㎣ 이상, 0.05㎣ 이상(0.1㎣ 이상 포함)이고, 100㎣ 이하, 예를 들어, 50㎣ 이하, 20㎣ 이하, 10㎣ 이하, 5㎣ 이하, 1㎣ 이하(0.1㎣ 이하를 포함함)이다. 특정 경우에, 조명된 부피는 0.001 내지 100㎣, 예를 들어, 0.005 내지 20㎣, 0.01 내지 10㎣, 0.01 내지 5㎣(0.05 내지 1㎣를 포함함)의 범위이다.
광유전학적 자극은 임의의 적합한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 적합한 방법은, 예를 들어, 미국특허 제8,834,546호에 기술되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조로서 포함된다. 광에 의해 활성이 조절되는 뇌의 적합한 영역의 뉴런은 광-활성화된 폴리펩타이드를 발현시키기 위한 편리한 방법을 이용하여 변형될 수 있다. 일부 경우에, 뇌 영역의 뉴런은 광-활성화된 폴리펩타이드를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 일부 경우에, 뉴런은 광-활성화된 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 함유하는 바이러스 벡터, 예를 들어, 아데노-관련 바이러스 벡터를 사용하여 유전적으로 변형될 수 있다. 바이러스 벡터는 세포 타입, 시기, 유도제의 존재 등에 따라 광-활성화된 폴리펩타이드의 발현을 제어하기 위해 임의의 적합한 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 재조합 부위 등)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 광-활성화된 폴리펩타이드의 세포 타입-특이적 발현은 재조합 시스템, 예를 들어, Cre-Lox 재조합, Flp-FRT 재조합 등을 사용함으로써 달성될 수 있다. 재조합을 이용한 유전자의 세포 타입-특이적 발현은, 예를 들어, 문헌[Fenno et al. al., Nat Methods, 2014 July; 11(7):763; 및 Gompf et al., Front Behav Neurosci. 2015 July 2; 9:152]에 기술되어 있으며, 이러한 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함된다.
적합한 뉴런-특이적 제어 서열은 복부 해마 CAMKII 뉴런을 표적화하기 위한 Ca++-칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II(CaMKIIa) 프로모터의 알파 서브유닛을 비제한적으로 포함한다(예를 들어, 문헌[Mayford et al. (1996) Proc Natl. Acad. Sicence. USA 93:13250] 참조).
일부 경우에, 광-활성화된 펩타이드를 함유하는 뉴런을 갖는 뇌 영역은 하나 이상의 광섬유를 사용하여 조명된다. 광섬유는 적합한 광 소스, 예를 들어, 레이저 또는 발광 다이오드(LED) 광원으로부터 방출된 광을 뇌의 영역으로 지향시키도록 임의의 적합한 방식으로 구성될 수 있다. 광섬유는 임의의 적합한 광섬유일 수 있다. 일부 경우에, 광섬유는 다중모드 광섬유이다. 광섬유는 코어 직경을 정의하는 코어를 포함할 수 있으며, 여기서, 광원으로부터의 광은 코어를 통해 통과한다. 광섬유는 임의의 적합한 코어 직경을 가질 수 있다. 일부 경우에, 광섬유의 코어 직경은 10㎛ 이상, 예를 들어, 20㎛ 이상, 30㎛ 이상, 40㎛ 이상, 50㎛ 이상, 60㎛ 이상(80㎛ 이상을 포함함)이고, 1,000㎛ 이하, 예를 들어, 500㎛ 이하, 200㎛ 이하, 100㎛ 이하(70㎛ 이하를 포함함)이다. 일부 실시형태에서, 광섬유의 코어 직경은 40 내지 100㎛를 포함하여 10 내지 1,000㎛, 예를 들어, 20 내지 500㎛, 30 내지 200㎛의 범위이다.
뇌의 표적 영역에 이식되는 광섬유 단부는 광섬유를 통해 전달되는 광 자극으로 뇌의 영역을 조명하기에 적합한 임의의 적합한 구성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 광섬유는 광섬유의 원위 단부에 또는 그 부근에 부착 디바이스를 포함하며, 여기서 광섬유의 원위 단부는 대상체에 삽입된 단부에 상응한다. 일부 경우에, 부착 디바이스는 광섬유에 연결되고 대상체의 두개골과 같은 대상체에 대한 광섬유의 부착을 용이하게 하도록 구성된다. 임의의 적합한 부착 디바이스가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 부착 디바이스는 페룰, 예를 들어, 금속, 세라믹 또는 플라스틱 페룰을 포함한다. 페룰은 광섬유를 고정하고 부착하기 위한 임의의 적합한 치수를 가질 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 뇌의 영역을 조명하는 데 사용되는 다양한 광학 구성요소를 제어 및/또는 조정하기 위해 임의의 적합한 전자 구성요소를 사용하여 수행될 수 있다. 광학 구성요소(예를 들어, 광원, 광섬유, 렌즈, 대물렌즈, 거울 등)은, 예를 들어, 광 펄스로 뇌의 영역을 조명하는 광원을 조정하기 위해 제어기에 의해 제어될 수 있다. 제어기는 광 펄스의 주파수, 펄스폭, 듀티 사이클, 파장, 강도 등과 같은(그러나 이들로 제한되지 않음) 광 펄스와 관련된 하나 이상의 파라미터를 제어하는 광원용 드라이버를 포함할 수 있다. 제어기는 광원의 구성요소(예를 들어, 시준기, 셔터, 필터 휠, 이동식 거울, 렌즈 등)과 통신할 수 있다.
다수의 광-활성화된 폴리펩타이드는 예를 들어, 광-활성화된 이온 채널 또는 광-활성화된 이온 펌프를 포함하는 광유전학적 용도를 위해 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Repina et al. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2017 Jun 7; 8: 13-39; WO2014144409A1호; US 10,220,092호; US 10,371,776호; PCT/US2011/028893호; WO/2013/093463호; WO/2017/210664호; WO/2017/015395호; WO/2019/092564호; WO/2017/100058호 참조], 각각이 본 명세서에 참조로서 구체적으로 포함된다. 광-활성화된 폴리펩타이드는, 예를 들어, 청색광; 녹색광; 황색광; 오렌지색광; 적색광을 포함하는, 상이한 파장의 광에 의해 활성화된다. 광 활성화된 폴리펩타이드는 다양한 서열, 예를 들어, 세포 원형질막으로의 단백질의 수송을 향상시키는 트래피킹 신호(ts)의 부가를 포함하는, 신호 펩타이드, 소포체(ER) 배출 신호, 막 트래피킹 신호, 및/또는 N-말단 골지 배출 신호 등에 융합될 수 있다.
관심 광-활성화된 폴리펩타이드는, 예를 들어, 단백질의 망막 결합 포켓의 주요 위치에서 특이적 아미노산 치환을 가질 수 있는 단계 기능 옵신(SFO)6 단백질 또는 안정화된 단계 기능 옵신(SSFO) 단백질을 포함한다. 예를 들어, WO 2010/056970호가 참조되며, 이의 개시 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, C123A; C123S; D151A 등를 선택적으로 포함하는 볼복스 카르테리(Volvox carteri)로부터 유래된 양이온 채널(VChR1)일 수 있다. 광-활성화된 양이온 채널 단백질은 볼복스 카르테리의 VChR1 단백질 및 클라미도모나스 레인하르티(Chlamydomonas reinhardti)로부터의 ChR1 단백질로부터 유래된 C1V1 키메라 단백질일 수 있으며, 여기서 단백질은 E122 또는 E162에서 아미노산 치환을 선택적으로 갖는 ChR1의 제1 및 제2 막횡단 나선으로 대체된 적어도 제1 및 제2 막횡단 나선을 갖는 VChR1의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 광-활성화된 양이온 채널 단백질은 클라미도모나스 레인하르티로부터의 ChR1 및 ChR2 단백질로부터 유래된 C1C2 키메라 단백질이며, 여기서 단백질은 광에 반응성이고, 세포가 광으로 조명될 때 세포에서 탈분극 전류를 매개할 수 있다. 일부 실시형태에서, 탈분극 광-활성화된 폴리펩타이드는 클라미도모나스 레인하르드티로부터 유래된 탈분극 광-활성화된 폴리펩타이드의 적색 이동된 변이체이고; 이는 "ReaChR 폴리펩타이드" 또는 "ReaChR 단백질" 또는 "ReaChR"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 탈분극 광-활성화된 폴리펩타이드는 쉐르펠리아 듀비아(Scherffelia dubia)로부터 유래된 SdChR 폴리펩타이드이며, 여기서 SdChR 폴리펩타이드는 세포가 광으로 조명될 때 세포막을 가로질러 양이온을 수송할 수 있다. 일부 실시형태에서, 탈분극 광-활성화된 폴리펩타이드는 클라미도모나스 녹티가마(Chlamydomonas noctigama)로부터 유래된 CnChR1이며, 여기서 CnChR1 폴리펩타이드는 세포가 광으로 조명될 때 세포막을 가로질러 양이온을 수송할 수 있다. 일부 실시형태에서, 광-활성화된 양이온 채널 단백질은 클로로모나스 서브디비사(Chloromonas subdivisa)의 CsChR 단백질 및 클라미도모나스 녹티가마로부터의 CnChR1 단백질로부터 유래된 CsChrimson 키메라 단백질이며, 여기서 단백질의 N 말단은 CsChR의 잔기 1 내지 73의 아미노산 서열, 이어서 CnChR1의 아미노산 서열의 잔기 79 내지 350을 포함하고; 광에 반응적이고; 세포가 광으로 조명될 때 세포에서 탈분극 전류를 매개할 수 있다. 일부 실시형태에서, 탈분극 광-활성화된 폴리펩타이드는, 예를 들어, 스티게오클로니움 헬베티쿰(Stigeoclonium helveticum)으로부터 유래된 ShChR1일 수 있으며, 여기서 ShChR1 폴리펩타이드는 세포가 광으로 조명될 때 세포막을 가로질러 양이온을 수송할 수 있다.
일부 실시형태에서, 탈분극 광-활성화된 폴리펩타이드는 클라미도모나스 레인하르티(CHR1, 및 특히 CHR2)로부터 유래되며, 여기서 상기 폴리펩타이드는 세포가 광으로 조명될 때 세포막을 가로질러 양이온을 수송할 수 있고; 세포가 광으로 조명될 때 세포에서 탈분극 전류를 매개할 수 있다. 일부 실시형태에서, EYFP에 융합된 CaMKIIa-유래된 인간화 채널로돕신 CHR2 H134R 돌연변이체는 광유전학적 활성화를 위해 사용된다. 클라미도모나스 레인하르티로부터 유래된 광-활성화된 양이온 채널 단백질을 활성화시키기 위해 사용되는 광은 약 460 내지 약 495 nm의 파장을 가질 수 있거나 약 480 nm의 파장을 가질 수 있다. 광-활성화된 양이온 채널 단백질은 추가적으로 광에 대한 민감성을 증가 또는 감소시키고/시키거나, 특정 파장의 광에 대한 민감성을 증가 또는 감소시키고/시키거나, 세포의 원형질막의 분극 상태를 조절하는 광-활성화된 양이온 채널 단백질의 능력을 증가 또는 감소시키기 위해 천연 아미노산 서열에 도입된 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 추가적으로, 광-활성화된 양이온 채널 단백질은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 및/또는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 천연 아미노산 서열에 도입된 치환, 결실, 및/또는 삽입을 함유하는 광-활성화된 양성자 펌프 단백질은 적합하게는 세포막을 가로질러 양이온을 수송하는 능력을 보유한다. 단백질은 다양한 아미노산 치환, 예를 들어, H134R; T159C; L132C; E123A 중 하나 이상 등을 포함할 수 있다. 단백질은 형광 단백질, 예를 들어, 황색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 녹색 형광 단백질 또는 시안 형광 단백질을 추가로 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
약물 설계
뇌 영역에 걸친 발작의 효과를 분석하고, 그 정보에 기초하여, 바람직하지 않은 독성을 최소화하면서 발작 유도 및 전파를 다루기에 최적인 적절한 약물 후보 및 치료 방식을 선택함으로써 치료법을 최적화하기 위한 방법이 제공된다. 치료는 효과적인 활성을 제공하면서 바람직하지 않은 독성을 최소화하는 치료를 위한 선택에 의해 최적화된다.
본 명세서에 제공된 모델은 발작 유도 및 전파에 대한 치료적 개입의 효과가 결정될 수 있는 치료적 개입, 예를 들어, 수술, 약리학적 요법 등의 설계 및 시험에 유용하다. 모델은 또한 간질 동반질환에 대한 약물의 설계에서 유용하며, 예를 들어, 가장 큰 활성 변화는 내측 전전두엽 피질(mePFC)에서 발생하며, 이는 복부 해마(vHip)와 mePFC 간의 증가된 흥분성 관계를 나타낸다. vHip-mePFC 회로 기능장애를 표적으로 하도록 설계된 치료법은 불안 및 인지 결함을 포함하는, 간질과 관련된 동반질환을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 발작 전파의 변수는 간질에 대한 외과적 표적화 및 치료법 개발을 안내하는 데 사용된다. 본 명세서의 발견에는 발작을 동반할 수 있고 발작 전에 흔히 관찰되는, 고 진폭 활동의 느린 이동성 코어를 나타내는 것이 포함된다.
일부 실시형태에서, 복부 해마(vHip)와 mePFC 사이의 흥분성 관계를 감소시키는 능력에 대해 치료적 개입이 시험된다. 본 명세서에 개시된 방법은 또한 뇌의 뉴런 및 영역에 대한 작용제의 효과를 분석하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 시험 화합물에 대한 노출 후 흥분성 관계의 변화 분석은 개체에 대한 시험 화합물의 효과(들)를 분석하기 위해 수행될 수 있다. 이러한 분석은 다양한 목적에, 예를 들어, 항-간질 치료법의 개발에서 유용할 수 있다.
파라미터는 세포, 조직 및 유기체, 특히 정확하게 측정될 수 있는 성분의 정량 가능한 특성이다. 파라미터는, 예를 들어, 전기생리학적 방전의 부위 또는 부위들, 강도, 지속기간, 속도 등일 수 있고, fMRI, LFP 등에 의해 영상화될 수 있다. 판독은 단일 결정된 값을 포함할 수 있거나, 평균, 중간 값 또는 분산 등을 포함할 수 있다. 특징적으로, 다수의 측정으로부터의 파라미터에 대해 파라미터 판독 값의 범위가 얻어질 것이다. 변동성이 예상되며, 각각의 시험 파라미터 세트에 대한 값의 범위는 단일 값을 제공하기 위해 사용되는 일반적인 통계적 방법과 함께 표준 통계적 방법을 사용하여 얻어질 것이다.
관심 후보 작용제는 약물 설계를 위한 생물학적 활성제로서, 주로 유기금속 분자, 무기 분자, 유전자 서열 등을 포함할 수 있는 다수의 화학적 부류, 주로 유기 분자를 포함한다. 또한 수술, 심부 뇌 자극, 광유전학 등과 같은 치료적 개입이 관심 대상이다. 본 발명의 중요한 양태는 바람직한 생물학적 반응 기능을 갖는 후보 치료법을 평가하는 것이다.
약리학적 활성 약물, 유전적으로 활성인 분자 등이 포함된다. 관심 화합물은 화학요법제, 항염증제, 호르몬 또는 호르몬 길항제, 이온 채널 조절제, 및 신경활성제를 포함한다. 본 발명에 적합한 약학적 제제의 예시는 문헌["The Pharmacological Basis of Therapeutics," Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y., (1996), Ninth edition, under the sections: Drugs Acting at Synaptic and Neuroeffector Junctional Sites; Drugs Acting on the Central Nervous System; Autacoids: Drug Therapy of Inflammation; Water, Salts and Ions; 등]에 기술된다.
시험 화합물은 상기 기술된 모든 부류의 분자를 포함하고, 알려지지 않은 함량의 샘플을 추가로 포함할 수 있다. 식물과 같은 천연 공급원으로부터 유래된 자연 발생 화합물의 복합 혼합물이 관심의 대상이다. 많은 샘플이 용액 중의 화합물을 포함할 것이지만, 적합한 용매에 용해될 수 있는 고체 샘플이 또한 검정될 수 있다. 관심 샘플은 환경 샘플, 예를 들어, 지하수, 해수, 광산 폐기물 등; 생물학적 샘플, 예를 들어, 작물로부터 제조된 용해물, 조직 샘플 등; 제조 샘플, 예를 들어, 의약품 제조 동안의 시간 경과뿐만 아니라 분석을 위해 제조된 화합물의 라이브러리; 등을 포함한다. 관심 샘플은 잠재적 치료 가치에 대해 평가되는 화합물, 즉, 약물 후보를 포함한다.
용어 샘플은 또한 추가적인 성분, 예를 들어, 이온 강도, pH, 총 단백질 농도 등에 영향을 미치는 성분이 첨가된 상기 기술된 유체를 포함한다. 또한, 샘플은 적어도 부분적인 분획화 또는 농축을 달성하도록 처리될 수 있다. 생물학적 샘플은, 화합물의 분해를 감소시키기 위해 주의를 기울이는 경우, 예를 들어, 질소, 동결, 또는 이들의 조합 하에서 저장될 수 있다. 사용된 샘플의 부피는 측정 가능한 검출을 가능하게 하기에 충분하며, 대개 약 0.1:1 내지 1㎖의 생물학적 샘플이 충분하다.
후보 제제를 포함하는 화합물은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함하는 매우 다양한 공급원으로부터 수득된다. 예를 들어, 무작위화된 올리고뉴클레오타이드 및 올리고펩타이드의 발현을 포함하는, 생체분자를 포함하는 매우 다양한 유기 화합물의 무작위 및 유도된 합성을 위해 수많은 수단이 이용 가능하다. 대안적으로, 박테리아, 진균, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물의 라이브러리가 이용 가능하거나 용이하게 생산된다. 추가적으로, 천연 또는 합성적으로 생산된 라이브러리 및 화합물은 통상적인 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 용이하게 개질되고, 조합 라이브러리를 생산하는 데 사용될 수 있다. 공지된 약리학적 제제는 구조적 유사체를 생산하기 위해 아실화, 알킬화, 에스터화, 아마이드화 등과 같은 유도된 또는 무작위 화학적 개질을 거칠 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전적 작용제"는 유전자 작용제를 세포에 첨가함으로써 본 발명의 스크리닝 검정에서 작용제가 시험되는 폴리뉴클레오타이드 및 이의 유사체를 지칭한다. 유전자 작용제의 도입은 세포의 총 유전적 조성의 변경을 초래한다. 본 명세서에서 사용되는 유전자 작용제는 단백질의 발현을 초래하고, 하나 이상의 표적 경로에 대한 이의 효과에 대해 평가되고 있다. DNA와 같은 유전자 작용제는 일반적으로 염색체로의 서열의 통합을 통해 세포의 게놈에 실험적으로 도입된 변화를 초래한다. 유전적 변화는 또한 일시적일 수 있으며, 여기서 외인성 서열은 통합되지 않지만 에피솜 제제로서 유지된다. 관심 유전자를 포함하고 역전사되고 숙주 세포의 게놈에 삽입되는 RNA 바이러스가 사용될 수 있다. 유전자 작용제(폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드)는 또한 시험관내에서 합성되고, 관심 세포로의 작용제의 전달을 촉진하는 모이어티(예를 들어, 안테나피디아 16-아미노산 "Penetratin-1 펩타이드, Qbiogene으로부터 입수 가능함)에 접합에 의해 세포에 전달될 수 있다. 유전자 작용제의 효과는 세포에서 다른 생성물의 증가 및/또는 감소에 대한 가능성과 함께 세포에서 특정 유전자 생성물의 발현을 증가시키는 것이다.
일부 예에서, 공지되거나 알려지지 않은 활성의 화학 작용제가 동물에게 투여되며, 발작 유도, 전파 및 움직임에 대한 효과가 평가된다. 이러한 화학적 작용제는 경로를 활성화시키고, 경로를 저해하는 등의 역할을 할 수 있으며, 여기서, 관심 있는 경로 이외의 경로를 조절하는 데 관심이 있고, 천연 인자를 사용하는 것보다 화학적 작용제가 더 편리할 수 있다. 화학적 작용제는 편리하게는 용액, 또는 용이하게 용해되는 형태로 첨가되고, 당 분야에 공지된 바와 같이 다양한 방식으로, 예를 들어, 경구로, 피하로, 캐뉼라 등에 의해 동물에게 투여될 수 있다. 바람직한 화학적 작용제 제형은 생물학적 활성 화합물 및 생리학적으로 허용되는 담체, 예를 들어, 물, 생리 식염수 등으로 필수적으로 구성된다.
일 실시형태에서, 개체의 뇌의 특정 영역은 조합된 전기생리학, 예를 들어, 뇌의 상이한 영역의 국소 장 전위(LFP) 및 기능적 자기 공명 영상(fMRI) 스캐닝과 함께 자극되어 뇌의 발작 전파 구역과 다른 영역 간의 기능적 연결을 결정하고 발작의 움직임을 영상화한다. 동물은, 예를 들어, 덱스메데토미딘으로 진정될 수 있고; 및 동시 LFP-fMRI로 발작의 영상화 동안 움직임을 없애기 위해 단기-작용하는 신경근 차단제, 예를 들어, 베쿠로늄으로 처리된다.
분석에 적합한 프로토콜은 전기생리학; 신경 활동의 광-유도 조절; 뇌파검사(EEG) 기록; 기능적 영상화 및 행동 분석을 포함한다. 전기생리학은 단일 전극, 다중 전극, 및/또는 전계 전위 기록을 포함할 수 있다. 신경 활동의 광-유도 조절은 본 명세서에 추가로 기술된 바와 같은, 임의의 적합한 광유전학적 방법을 포함할 수 있다. 기능적 영상화는 fMRI, 및 유전적으로 인코딩된 지표(예를 들어, 칼슘 지표, 전압 지표 등)를 사용하는 임의의 기능적 영상화 프로토콜을 포함할 수 있다. 행동 분석은 각성, 기억(예를 들어, 수중 미로 검정), 컨디셔닝(예를 들어, 공포 컨디셔닝), 감각 반응(예를 들어, 시각, 체성감각, 청각, 미각 및 후각 신호에 대한 반응)에 대한 행동 검정과 같은 임의의 적합한 행동 검정을 포함할 수 있다.
본 명세서에 제공된 모델은 발작 유도 및 전파에 대한 치료적 개입의 효과가 결정될 수 있는 치료적 개입, 예를 들어, 수술, 약리학적 개입(약물 요법) 등의 설계 및 시험에 유용하다. 모델은 또한 간질 동반질환에 대한 약물의 설계에서 유용하며, 예를 들어, 가장 큰 활성 변화는 내측 전전두엽 피질(mePFC)에서 발생하며, 이는 복부 해마(vHip)와 mePFC 간의 증가된 흥분성 관계를 나타낸다. vHip-mePFC 회로 기능장애를 표적으로 하도록 설계된 치료법은 불안 및 인지 결함을 포함하는, 간질과 관련된 동반질환을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 발작 전파의 변수는 간질에 대한 외과적 표적화 및 치료법 개발을 안내하는 데 사용된다. 본 명세서의 발견에는 발작을 동반할 수 있고 발작 전에 흔히 관찰되는, 고 진폭 활동의 느린 이동성 코어를 나타내는 것이 포함된다.
평가될 수 있는 특정 발견은, 예를 들어, 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT)에 의한 발작 개시 구역(SOZ) 국소화, 전기생리학 등을 포함하며, 여기서 국소화는 이동성 발작 코어의 위치 및 이동성 코어의 크기, 속도, 지속기간 및/또는 위치에 대한 작용제의 효과를 검출한다. 고 진폭 활동의 느리게 이동하는 코어는 자극된 해마에서 발견되며, 이는 일부 경우에, 발작 일반화에 앞서서 유일하게 검출 가능한 활성이며, 이는 신규한 발작 일반화 메커니즘을 가리킨다. 이동성 코어의 전파 속도는 비-점화된 동물에서 평균 0.117 ㎜/s 및 점화된 동물에서 0.107 ㎜/s의 범위였다. 활성은 iVHip에서 iDHip으로 이동한 다음, 동측 피질, 대측 해마, 및 최종적으로 대측 피질로 전파된다.
FBTC 발작의 유도 및 전파, 예를 들어, 발작의 크기, 속도, 지속기간 및/또는 위치에 대한 작용제의 효과. 점화된 발작은 지속적으로 양측으로 활성화된 반면, 비-점화된 발작은 동측 반구를 우선적으로 활성화시킨다는 것이 밝혀졌다. 발작 일반화를 위한 중요한 노드로서 연루된 영역인 mThal은 피질의 많은 영역보다 늦게 활성화되었다. mThal 활성화는 구체적으로 분석될 수 있다.
공지된 항간질 약물, 예를 들어, 가바펜틴, 토피라메이트, 라모트리진, 레베티라세탐, 스티리펜톨, 및 루피나미드, 옥스카르바제핀, 라코사미드, 페람파넬 등과 비교될 수 있다.
시험 작용제 및 기준 작용제로부터 수득된 측정치의 비교는 적합한 추론 프로토콜, AI 시스템, 통계적 비교 등을 사용하여 달성될 수 있다. 데이터를 기준 결과의 데이터베이스와 비교된다. 참조 결과의 데이터베이스가 컴파일될 수 있다. 모든 기준 및 시험 패턴에 대해, 통상적으로 데이터 매트릭스가 생성되며, 여기서 데이터 매트릭스의 각 포인트는 파라미터로부터의 판독에 상응하며, 여기서 각 파라미터에 대한 데이터는 반복 측정, 예를 들어, 동일한 타입의 다중 개별 발작 등으로부터 유래될 수 있다. 데이터 포인트는 파라미터의 특성에 따라 정량적, 반-정량적, 또는 정성적일 수 있다. 판독은 평균(mean, average), 중앙값 또는 분산 또는 측정과 관련된 다른 통계적으로 또는 수학적으로 유도된 값일 수 있다. 파라미터 판독 정보는 대응하는 기준 판독과의 직접 비교에 의해 추가로 정제될 수 있다. 동일한 조건 하에 각각의 파라미터에 대해 수득된 절대값은 살아있는 생물학적 시스템에 고유한 가변성을 나타낼 것이고, 또한 개별 세포 가변성뿐만 아니라 개체들 간에 고유한 가변성을 반영할 것이다.
분류 규칙은 다수의 반복된 실험으로부터 수득된 훈련 데이터(즉, 데이터 매트릭스)의 세트로부터 구성된다. 분류 규칙은 반복된 참조 패턴을 정확하게 식별하고 별개의 참조 패턴을 성공적으로 구별함에 따라 선택된다. 분류 규칙-학습 알고리즘은 결정 트리 방법, 통계적 방법, 나이브 베이지안 알고리즘(naive Bayesian algorithm) 등을 포함할 수 있다. 지식 데이터베이스는 신규한 시험 작용제가 효과적으로 식별되고 분류될 수 있도록 충분히 복잡할 것이다. 충분히 포괄하는 분류 패턴 세트를 생성하기 위한 여러 접근법 및 이들을 구별하기 위한 충분히 강력한 수학적/통계적 방법이 이를 달성할 수 있다.
비약리학적 치료 설계
상당수의 환자는 항간질 약물로 치료한 후에도 발작을 일으키며, 이는 외과적 치료 및 신경조절 요법을 간질의 관리에 유용하게 만든다. 이러한 문서는 약물-내성 간질에 대한 그러한 두 가지 치료 방식의 현재 상태를 검토한다. 수술 및 수술 변형의 효과는 더 큰 효능을 제공하기 위해 본 명세서에 기술된 모델에서 시험될 수 있다.
수술 방식은 간질, 특히 근심 측두엽 간질(mesial temporal lobe epilepsy: MTLE)에 대한 절제 수술을 포함한다. 그러나, 간질 초점의 통상적인 국소화 및 절제는 유리한 결과를 달성하기에 충분하지 않고, 이동성 발작 코어의 부위 및 경로를 결정함으로써 이익을 얻을 수 있다. 절제 수술 후 발작 결과는 자기 공명 영상(MRI) 병변의 존재 또는 부재, 관련 병변의 병리학적 기질, 간질 초점의 확장 및 위치, 및 수술을 위한 환자의 선택 기준에 의해 영향을 받는다.
병변의 분리는 간질 수술에 특유한 개념이다. 주변 피질 및 다운스트림 중뇌로부터 간질발생 피질의 완전한 분리는 병원성 병변이 제자리에 남아 있는 경우에도 간질 발작을 제어하기에 충분하다. 반구절개술, 전전두엽 분리, 및 후방 분리가 사용될 수 있다. 이러한 분리된 절차는 광범위한 절제와 관련된 외과적 합병증을 감소시킨다.
경막하 전극에 의한 EEG의 두개내 기록, 및 심부 전극은 외과적 목적을 위해 이동성 발작 코어의 위치를 식별하는 데 사용될 수 있다. 무프레임 정위 네비게이션 시스템의 사용은 두 타입의 전극을 동시에 정확하게 이식할 수 있게 한다. 스파이크 및 날카로운 파동은 통상적인 EEG에서 간질발생 마커로 간주되지만, 발작성 직류(DC) 이동 및 고주파수 진동(HFO)은 또한 광대역 EEG에서 간질 유발 마커와 관련이 있다. HFO는 대개 80㎐보다 높은 진동 활성으로 정의된다. 간질 발작이 전통적으로 과동기 뉴런 활동으로 특징지어지지만, 단일 뉴런의 발작성 점화 패턴의 조사는 발작 개시 및 확산 동안의 뉴런 스파이크 활성이 과동기성이 아니라 매우 이질적임을 밝혀내었다. 그리고 본 명세서에 도시된 바와 같이, 발작의 발생을 위한 정적 코어는 존재하지 않는다.
비-외과적 개입은, 예를 들어, 미주 신경 자극; 다양한 영역에 대한 심부 뇌 자극(deep brain stimulation: DBS), 폐쇄 루프 반응성 자극, 및 삼차 신경 자극을 포함한다. 미주 신경 자극(vagus nerve stimulation: VNS) 치료법은 좌측 경부 미주 신경(VN)을 만성적으로 및 간헐적으로 자극하여 대뇌 피질을 안정화시키고 발작을 완화시키는 구심성 신경 자극을 생성한다.
간질에 대한 두개내 신경자극은, 예를 들어, DBS에 대한 다양한 표적, 예를 들어, 시상의 중심 정중 핵, 해마, 시상하 핵, 좌뇌, 미상 핵, 유방체, 및 소뇌를 포함한다. 폐쇄-루프 전기 자극 시스템은 발작의 검출된 시작에 반응하는 발작 초점 또는 다른 위치에 전기 자극을 제공함으로써 발작을 없앨 것으로 예상된다.
컴퓨터 양태
계산 시스템(예를 들어, 컴퓨터)은 하나 이상의 제어기를 통해 자극을 제어 및/또는 조정하고, 뇌 영역의 스캐닝으로부터 데이터를 분석하기 위해 본 개시내용의 방법에서 사용될 수 있다. 계산 유닛은 측정된 이미지를 분석하기 위한 임의의 적합한 구성요소들을 포함할 수 있다. 따라서, 계산 유닛은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 프로세서; 컴퓨터 판독 가능 매체와 같은 비일시적 컴퓨터 판독 가능 메모리; 키보드, 마우스, 터치스크린 등과 같은 입력 디바이스; 모니터, 스크린, 스피커 등과 같은 출력 디바이스; 유선 또는 무선 네트워크 인터페이스와 같은 네트워크 인터페이스; 등.
fMRI, LFP 등과 같은 측정으로부터의 미가공 데이터는 컴퓨터-기반 시스템에서 분석되고 저장될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "컴퓨터-기반 시스템"은 본 발명의 정보를 분석하기 위해 사용되는 하드웨어 수단, 소프트웨어 수단, 및 데이터 저장 수단을 지칭한다. 본 발명의 컴퓨터-기반 시스템의 최소 하드웨어는 중앙 처리 유닛(CPU), 입력 수단, 출력 수단, 및 데이터 저장 수단을 포함한다. 당업자는 현재 이용 가능한 컴퓨터-기반 시스템 중 임의의 하나가 본 발명에 사용하기에 적합하다는 것을 쉽게 인식할 수 있다. 데이터 저장 수단은 상기 기술된 바와 같은 본 정보의 기록을 포함하는 임의의 제작물, 또는 이러한 제작물에 액세스할 수 있는 메모리 액세스 수단을 포함할 수 있다.
입력 및 출력 수단을 위한 다양한 구조적 포맷이 컴퓨터-기반 시스템에서 정보를 입력 및 출력하는 데 사용될 수 있다. 이러한 제시는 당업자에게 유사성의 순위를 제공하고 시험 데이터에 포함된 유사성의 정도를 식별한다.
분석은 하드웨어 또는 소프트웨어, 또는 둘 모두의 조합으로 구현될 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 기계-판독 가능한 저장 매체가 제공되며, 매체는 상기 데이터를 사용하기 위한 명령어로 프로그래밍된 기계를 사용할 때, 본 발명의 데이터세트 및 데이터 비교를 나타낼 수 있는 기계 판독 가능한 데이터로 인코딩된 데이터 저장 자료를 포함한다. 이러한 데이터는 약물 발견, 세포 성분들 간의 상호작용 분석 등과 같은 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 프로세서, 데이터 저장 시스템(휘발성 및 비휘발성 메모리 및/또는 저장 요소를 포함함), 적어도 하나의 입력 디바이스, 및 적어도 하나의 출력 디바이스를 포함하는 프로그램 가능한 컴퓨터에서 실행되는 컴퓨터 프로그램으로 구현된다. 프로그램 코드는 상기 기술된 기능을 수행하고 출력 정보를 생성하기 위해 입력 데이터에 적용된다. 출력 정보는 공지된 방식으로 하나 이상의 출력 디바이스에 적용된다. 컴퓨터는, 예를 들어, 퍼스널 컴퓨터, 마이크로컴퓨터, 또는 통상적인 설계의 워크스테이션일 수 있다.
각각의 프로그램은 컴퓨터 시스템과 통신하기 위해 높은 수준의 절차적 또는 객체 지향 프로그래밍 언어로 구현될 수 있다. 그러나, 프로그램은 원하는 경우 어셈블리 또는 기계어로 구현될 수 있다. 임의의 경우에, 언어는 컴파일되거나 해석된 언어일 수 있다. 이러한 각각의 컴퓨터 프로그램은 저장 매체 또는 디바이스가 본 명세서에 기술된 절차를 수행하기 위해 컴퓨터에 의해 판독될 때 컴퓨터를 구성 및 작동시키기 위해 범용 또는 특수 목적의 프로그램 가능한 컴퓨터에 의해 판독 가능한 저장 매체 또는 디바이스(예를 들어, ROM 또는 자기 디스켓)에 저장될 수 있다. 시스템은 또한 컴퓨터 프로그램으로 구성된 컴퓨터-판독 가능한 저장 매체로서 구현되는 것으로 간주될 수 있으며, 여기서 그렇게 구성된 저장 매체는 컴퓨터가 본 명세서에 기술된 기능을 수행하기 위해 특정하고 사전 규정된 방식으로 작동하게 한다. 입력 및 출력 수단을 위한 다양한 구조적 포맷이 본 발명의 컴퓨터-기반 시스템에서 정보를 입력 및 출력하는 데 사용될 수 있다.
컴퓨터, 시퀀스, 및 다른, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 수집된 데이터를 저장 및/또는 전송하는 방법이 본 명세서에 추가로 제공된다. 소프트웨어 및 저장 디바이스를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 컴퓨터 또는 컴퓨터 액세서리가 본 발명을 실시하는 데 이용될 수 있다. 시퀀스 또는 다른 데이터(예를 들어, 면역 레퍼토리 분석 결과)는 사용자에 의해 직접 또는 간접적으로 컴퓨터에 입력될 수 있다. 추가적으로, DNA를 시퀀싱하거나 DNA를 분석하거나 면역 레퍼토리 데이터를 분석하는 데 사용될 수 있는 임의의 디바이스는 데이터가 컴퓨터 및/또는 컴퓨터-호환성 저장 디바이스로 전송되도록 컴퓨터에 연결될 수 있다. 데이터는 컴퓨터 또는 적합한 저장 디바이스(예를 들어, CD)에 저장될 수 있다. 데이터는 또한 당 분야에 널리 공지된 방법(예를 들어, 인터넷, 우편, 항공 우편)을 통해 컴퓨터로부터 다른 컴퓨터 또는 데이터 수집 지점으로 전송될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기술된 방법에 의해 수집된 데이터는 임의의 지점 또는 지리적 위치에서 수집되고 임의의 다른 지리적 위치로 전송될 수 있다.
실험
점화 전 및 후에 개별 해마 발작을 영상화함으로써 발작 네트워크를 해부함
이러한 연구에서, 본 발명자는 간질 연구 및 항간질 약물 개발에 사용되는 FBTC 발작을 유도하기 위한 기술을 수정함으로써 간질 발생의 새로운 점화 모델을 개발하고 활용하였다. 세포-타입 특이적, 광유전학적 자극을 사용하여 전자사진 발작을 반복적으로 유도함으로써, 본 발명자는 FBTC 발작이 나타나고 그 후 수개월 동안 신뢰성 있게 유도될 수 있음을 발견하였다. 본 발명자는 이후에 인간 간질에서 가장 일반적으로 영향을 받는 영역인 복부 해마에서 흥분성 뉴런 점화의 영향을 조사하기 위해 동시 전기생리학 및 fMRI를 사용하였다. 본 발명자는 점화에 의해 변경된 기저 해마 회로를 관찰하고, 점화, 기저 회로, 및 행동 사이의 관계를 조사하기 위해 두 가지 일반적인 간질-관련 동반질환인 불안 및 우울증에 대한 시험을 수행하였다. 본 발명자는 점화된 동물에서 국소 및 처음으로 FBTC 발작 전파를 나타내기 위해 단일 유도 발작의 뇌 전체 네트워크 역학을 직접적으로 영상화하였다. 그렇게 함으로써, 본 발명자는 발작 메커니즘, 외과적 표적화 및 치료법 개발에 대한 이해에 중요한 의미를 갖는 발작의 주요 특징을 확인하였다.
복부 해마의 광유전학적 점화. 점화는 신경 회로를 리모델링하기 위해 활성을 이용한다. 본 발명자는 새로운 점화 방법을 개발하고, 자발적 발작이 인간 및 동물 모델에서 흔히 시작되는 영역인 복부 해마(VHip)의 반복된 광유전학적 자극의 영향을 조사하였다. 본 발명자는 래트에서 복부 해마 CAMKII 뉴런을 표적화하였다(도 1A,B). 성공적인 점화는 당일 처음 3회 자극 내에 유발된 전신 운동 발작(라신 단계 5)을 특징으로 하였다.
모든 래트는 자극 11일까지 점화 기준에 도달하였고, 83%(12마리 래트 중 10마리)는 7일까지 점화 기준에 도달하였다(도 1C). 필요한 자극의 평균 수는 53.6(범위: 29 내지 117, 도 1D)이었으며, 경련성 발작의 평균 수(라신 단계 3 내지 5)는 6.75(범위: 2 내지 13)이었으며, 전신 발작의 평균 수(라신 단계 5)는 2.9였다(범위: 1 내지 9). 동물 당 각 자극에 대한 행동 점수의 시각화는 도 1E를 참조한다.
점화는 다른 일반적인 간질 모델과 달리 최소한의 세포 손실과 관련이 있다. 세포 손실을 평가하기 위해, 본 발명자는 점화 전 및 후 및 비-점화 대조군 래트에서 상응하는 시점에 해부학적 MRI를 기초로 하여 해마 부피를 측정하였다. 다른 점화 모델과 일치하여, 본 발명자는 어느 한 반구에서도 임의의 명백한 해마 부피 변화를 감지하지 못했다(도 1F). 부피 변화는 동측 및 대측 해마에서 각각 점화된 대 비-점화된 것에 대해 0.63±0.82% 대 0.14±0.96%, p = 0.7, 및 1.37±1.22% 대 -1.03±1.27%, p = 0.19였다.
점화 모델의 주요 특징은 일단 동물이 점화되면, 효과가 명백히 영구적이어서 운동 발작이 쉽게 유발된다는 것이다. 본 발명자의 새로운 점화 절차가 지속적인 점화 상태를 초래했는지를 확인하기 위해, 본 발명자는 점화 후 3주 및 12주에 및 비-점화된 대조군(두 군 모두에 대해 n = 5)에서 래트의 서브세트를 평가하였다. 운동 발작(라신 단계 5)은 점화된 래트 및 둘 모두의 시점에서만 관찰된 반면, 비-점화된 래트는 어느 한 시점에서 임의의 명백한 발작 행동(라신 단계 0)을 나타내지 않았다(도 1G). 종합하면, 본 발명자는 이러한 광유전학적 점화 절차가 기존 점화 방법과 공통된 주요 특징을 나타내고, 회로 리모델링 및 FBTC 발작에 대한 본 발명자의 조사를 위한 새로운 플랫폼을 제공한다는 것을 보여준다.
광범위한 복부 해마 회로 리모델링 및 점화 후 불안 상승. 점화는 국소 구조적 및 기능적 리모델링을 유도하지만, 어떤 다운스트림 영역이 영향을 받는지는 불분명하다. 본 발명자는 10㎐에서 VHip CAMKII 뉴런을 자극함으로써 이러한 문제를 해결하고 동시 국소 장 전위(LFP) 및 대뇌 혈액 부피(CBV)-fMRI를 사용하여 점화 유무에 관계없이 뇌 전체의 반응을 평가하였다. 뇌 전체의 반응을 시각화하기 위해, 본 발명자는 자극 동안 유의하게 조절된 복셀을 식별하기 위해 표준 일반 선형 모델 방법을 사용하여 fMRI 활성화 맵을 생성하였다. 비-점화된 래트에서, 자극은 동측 반구의 다음 영역에 주로 국소화된 활성을 초래하였다: 등쪽 해마(DHip), VHip, 중격(Sept), 편도체(Amyg) 및 내측 전전두 피질(MePFC)(도 2C, 좌측 패널). 대조적으로, 점화된 래트에서, 동일한 자극은 이러한 영역을 넘어 확장되고 대측 반구의 영역을 포함하는 활성을 초래하였다(도 2C, 우측 패널, 상이한 시점에서의 군 비교를 위해 도 6 참조). 점화된 래트에서, 본 발명자는 점화 절차의 개인차가 영역 활동 패턴의 차이를 초래하는지의 여부를 시험하였다. 그러나, 점화에 대한 자극의 수 또는 단계 5 운동 발작의 수를 퇴행 인자로 포함하는 것은 소음 수준을 넘어서는 임의의 유의미한 복셀-방식 관계를 산출하지 못하였다(도 7).
본 발명자는 뇌를 44개의 개별 영역으로 세그먼트화하고 이들의 활성화 부피를 정량화함으로써 비-점화된 래트와 점화된 래트 사이의 뇌 전체의 차이를 조사하였다(도 2D). 본 발명자는 다중 비교를 위한 조정 후 비-점화된 군과 점화된 군 간에 상이한 7개의 뇌 영역을 발견하였다: 동측 MePFC(27.2±9.0% 대 83.3±9.0%, p = 0.011), 대측 MePFC(1.4±0.7% 대 29.2±7.3%, p = 0.033), 동측 전두엽 연관 피질(iFrAssC)(0.24±0.24% 대 27.1±5.6%, p = 0.004), 동측 측두엽 연관 피질(iTeAssC)(0.34±0.34% 대 26.7±4.8%, p = 0.0006), 동측 안와전두 피질(iOrFrC)(1.4±0.7% 대 23.8±3.9%, p = 0.0005), 동측 섬도 피질(iInsC)(0.2±0.18% 대 13.0±2.7%, p = 0.0047), 및 동측 선조체(iSria)(2.6±0.9% 대 14.8±2.7%, p = 0.011). 특히, iVHip 또는 iDHip에서는 유의미한 차이가 관찰되지 않았다(17.3±3.0% 대 27.8±3.1%, p = 0.684, 10.1±2.9% 대 24.4±5.9%, p = 0.994).
본 발명자는 다음으로 군 사이의 영역 CBV-fMRI 진폭을 비교함으로써 점화가 비-점화된 복부 해마 회로에 어떻게 영향을 미치는지를 조사하였다(도 2E). 본 발명자는 비교를 위해 비-점화된 군에서 가장 큰 활성화 부피를 갖는 5개의 ROI를 선택하였다(도 2C, 좌측 패널, ROI 시계열에 대해서는 도 8 참조). 다중 비교 보정 후, 본 발명자는 iVHip(2.1±0.3% 대 3.1±0.4%, p = 0.122), iSept(1.6±0.3% 대 2.5±.3%, p = 0.082), 또는 iDHip(0.8±0.2% 대 1.2±0.2%, p = 0.178)에서 CBV-fMRI 반응의 진폭의 차이를 검출하지 않았다. 그러나, iMePFC(1.3±0.3% 대 4.2±0.6%, p = 0.0023), 및 iAmyg(1.1±0.3% 대 3.0±0.4%, p = 0.0023)에서 강력한 차이가 관찰되었다. 이러한 데이터는 점화가 비-점화된 복부 해마 회로의 특정의 다운스트림 영역의 반응을 강화시켰다는 것을 나타낸다.
상기 결과는 iVHip에서의 광유전학적 점화가 fMRI에 의해 측정한 경우, 광유전학적 iVHip 자극 동안 iMePFC에서 보다 광범위한(도 2D) 및 강렬한(도 2E) 활성을 초래한다는 것을 나타낸다. 본 발명자는 다음으로 상응하는 LFP 신호 변화가 있는지를 결정하기 위해 동시에 획득된 LFP를 분석하였다. 점화 후, iMePFC에서 LFP에 의해 측정된 반응의 명백한 증가가 있었다(도 2F). 본 발명자는 5초 자극 동안 밴드 파워(band power)를 자극 개시 전 5초의 밴드 파워로 나눈 값을 계산함으로써 이러한 반응을 정량화하였다. 본 발명자는 점화 전 및 후 및 비-점화된 군과 점화된 군 사이를 비교하기 위해 이 메트릭을 사용하였다. 본 발명자는 iVHip에서 어떠한 명백한 차이도 검출하지 못하였다(도 2G 좌측 패널, p = 0.81, 군당 n = 12, 2-방향 반복 측정 ANOVA). 그러나, iMePFC에서, 본 발명자는 군과 시간 사이에 유의미한 상호작용을 발견하였다(도 2G 우측 패널, p = 0.031, 군당 n = 11. iMePFC 기록을 위한 동물의 감소된 수는 전극 고장으로 인한 것임(도 9 참조)). 추가 분석은 점화 후 LFP 진폭에서 6.4±2.6배 증가가 있음을 나타내었다(p = 0.033, 페어드 t-검정). fMRI 반응과 함께, 이는 점화가 iMePFC에 대한 iVHip의 연결성을 증가시켰음을 시사한다.
점화된 동물에서, 본 발명자는 iMePFC 반응에 중대한 변화가 있으며, 전반적으로 상승된 뇌 반응이 있음을 발견하였지만, 이러한 변화가 행동에 임의의 장기적인 결과를 갖는 지는 불분명하였다. 복부 해마가 정서적 및 정동적 행동을 조절하기 때문에, 본 발명자는 복부 해마 점화가 논쟁의 여지가 있는 기계적 기원을 갖는 가장 흔한 간질 동반질환 중 2개인 불안과 우울증을 증가시켰는지 조사하였다. 전기 편도체 점화 후 불안 및 우울증 둘 모두가 검출되었다. 본 발명자는 동물의 서브세트에서 점화 후 12주(두 번째 fMRI 시점 후 10주)에 행동 시험을 수행함으로써 불안 및 우울증에 대한 본 발명의 광유전학적 점화의 장기 행동 영향을 조사하였다(도 2H). 본 발명자는 우울증을 평가하기 위해 강제 수영 및 수크로스 선호도 시험(도 2I 및 J; 각각) 및 불안을 평가하기 위해 공개 필드 시험을 사용한다. 어느 우울증 시험도 비-점화된 동물과 점화된 동물 사이에 분명한 차이가 있음을 나타내지 않았다. 강제 수영 시험의 경우, 평균 부동성 점수는 비-점화된 대조군에서 36.3±0.99 및 점화된 래트에서 34.1±1.89였다(도 2I, p = 0.303, t-검정). 수크로스 선호도 시험의 경우, 비-점화된 래트가 점화된 래트와 다르다는 증거는 없었다(도 2J, 군과 습관화/수크로스 시험 기간 사이에 유의미한 상호작용 없음, F = 0.48 p = 0.499, 2-방향 반복 측정 ANOVA, 평균 추정치는 비-점화 및 점화에 대해 각각 96.2±0.9% 대 83.9±12.8%였다). 두 군 모두 시험 기간 동안 수크로스 물이 도입되었을 때 소비된 액체의 총 부피를 증가시켰다(비-점화된 래트 32.3±8.0㎖, p = 0.005 및 점화된 래트 24.7±6.9㎖, p = 0.011, 페어드 t-검정). 대조적으로, 점화된 동물에서 증가된 불안 표현형에 대한 증거가 존재하였다. 점화된 동물은 비-점화된 래트와 비교할 때 개방 필드 경기장의 중심에서 더 적은 시간을 보냈다(도 2K, 12.5±1.5% 대 8.0±1.4% 중심 시간, p=0.046, 비-점화 대조군 대 점화된 래트, t-검정, 각각 n = 8 및 7). 중요하게는, 동물의 두 군 모두 5분 시험 기간 동안 유사한 거리를 이동하였다(2446±153㎝ 대 2203±197㎝, p = 0.98). 본 발명자는 복부 해마 점화가 우울증이 아닌 상승된 불안을 초래하였음을 발견하였으며, 이는 반복된 비정상적인 활동이 불안을 초래하는 기저 회로 변화로 이어질 수 있다는 가설을 뒷받침한다.
상기 실험은 광유전학적 복부 해마 점화가 오픈 필드 시험에 의해 측정된 증가된 iVHip-iMePFC 연결성 및 증가된 불안을 초래함을 보여준다. 특히, 이전 연구에서, Vhip와 MePFC 사이의 증가된 세타 커플링은 정상 설치류가 안전한 영역에 배치되었을 때와 비교하여 불안 유발 영역(오픈 필드)에 배치되었을 때 관찰되었다. 다른 연구에서, Arch가 Vhip에 주사되고 광섬유가 MePFC에 이식될 때, 불안 유발 환경에 배치된 정상 동물의 불안-반응은 Vhip 입력을 억제함으로써 폐지될 수 있었다. 이는 불안이 간질의 가장 흔한 동반질환 중 하나라는 맥락에서 흥미롭다. 본 발명자의 연구는 간질에서 관찰되는 불안에 대한 강력한 기반으로서 해마에서 시작된 점화에 의해 야기된 iVHip-iMePFC 연결성 변화를 확립한다.
비-점화된 래트 및 점화된 래트에서 동시 LFP-fMRI를 사용한 단일 발작의 뇌 전체 영상. fMRI는 뇌 전반에 걸친 정보를 제공하고, 인간 및 동물에서 국소 및 전신 발병 발작 둘 모두를 시각화하는 데 사용되었지만, FBTC 발작을 시각화하기 위한 이의 사용은 동작 아티팩트를 초래하는 관련 운동 활동으로 인해 문제가 되었다. 진정제 또는 마취는 통상적으로 동물 fMRI가 운동을 제한하는 데 필요하지만, 이들의 사용은 발작 활동 및 결국 관련 운동 활동에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명자는 이전에 영상화를 위한 본 발명자의 덱스메데토미딘-진정 프로토콜에 따라 발작을 신뢰성 있게 유도할 수 있고 발작이 깨어 있고 진정된 상태에서 유사한 전기생리학적 특성을 유지한다는 것을 입증하였다(각성 및 진정 상태에서 비점화 발작 동안 동물내 전기생리학에 대한 도 10). 덱스메데토미딘-진정제 하에 점화된 동물에서 발작이 유도될 때, 깨어 있는 동물에서의 발작을 연상시키는 상동형 발작 행동이 나타났으며, 이는 운동 발작 회로가 진정 하에 활성화되었음을 나타낸다. 따라서, 본 발명자는 동시 LFP-fMRI로 발작의 영상화 동안 움직임을 없애기 위해 덱스메데토미딘 진정제 및 통합된 단기-작용하는 신경근 차단제인 베쿠로늄을 기반한 프로토콜을 개발하였다(도 3A). 예상된 바와 같이, iVHip LFP로부터 추정된 발작 지속기간은 비-점화된 동물에 비해 점화된 동물에서 더 길었다(도 3B, 66.2±6.7s 대 35.4±5.17 s; 각각, p = 0.001).
점화된 동물 및 비-점화된 동물 둘 모두에서, iVHip BOLD 신호 증가는 발작-관련 iVHip LFP 진폭 증가에 상응하여, BOLD가 국소 발작 활동을 성공적으로 포착하였음을 보여준다(도 3C,E). 도 3은 비-점화된 동물 및 점화된 동물로부터 활성 전파를 포착하는 선택된 시점을 갖는 단일 발작의 예를 도시한 것이다. 스캔 기간 동안 복셀-방식 최대 강도 투영(MIP)은 발작 동안 활성화된 영역의 요약을 제공한다(도 3D,F). 이러한 MIP 활성 패턴은 2-데옥시글루코스와 같은 말단 방법을 사용하여 국소 및 전신 발작에 대해 보고된 것과 현저한 유사성을 갖는다.
비-점화된 동물로부터의 발작의 예에서(도 3C,D), 10㎐ iVHip 역치이하 자극 네트워크를 연상시키는 복부 해마 회로에서 초기 활성 버스트가 존재하고(도 2), 이어서 동측 등쪽 해마로 전파하는 활성 및 발작 후 효과와 관련된 후속 음성 BOLD 반응이 뒤따랐다.
점화된 동물로부터의 단일 발작의 예에서(도 3E, F), 현재 피질에서 검출된 활성과 함께 스캔 전반에 걸쳐 BOLD 활동을 갖는 영역이 실질적으로 더 많았다(도 3F). 중요하게는, BOLD 활동이 해마에서 동측 피질로 전파된 다음 대측 피질로 전파되는 것이 관찰되었으며(도 3E 시점 5 내지 7), 이는 처음으로 전체 뇌에 걸친 국소 내지 이차-전신 발작에 대한 발작 전파 역학을 명확하게 보여준다.
비-점화된 및 점화된 발작 둘 모두의 경우, BOLD 활동은 일단 활동이 iVHip으로부터 멀리 전파되면 iVHip LFP에서 검출된 발작 활동의 끝을 넘어 지속되었으며(도 3C,D 시점 9 내지 10, 및 도 3E,F 시점 8 내지 12), 이는 국소 전기 기록이 발작 지속기간을 과소평가할 수 있는 방법을 명확하게 보여준다.
비-점화된 및 점화된 동물에서 뚜렷한 뇌 전체 전파 역학. 본 발명자는 다음으로 지역 발병 시간을 계산하여 비-점화된 및 점화된 발작의 지역 BOLD 전파 패턴을 비교하였다(각각, 7마리의 비-점화된 래트로부터 n = 20, 점화된 5마리의 래트로부터 n = 17). 1마리의 비-점화된 래트 및 2마리의 점화된 래트가 머리 캡을 잃어 영상화될 수 없었다. 뇌 환추를 사용하여, 44개의 ROI에 대한 평균 지역 반응을 세그먼트화하고, 각 발작에 대해 계산하였다(도 4A 단일 발작으로부터의 지역 역학). 개시 시간은 BOLD 활동이 처음으로 60초 전-자극 기준선 초과의 4 표준 편차를 초과하는 시간으로 정의되었으며, 이러한 시간 후 후속 10초 중 적어도 5초 동안 활동이 역치 이상으로 유지되어야 한다는 추가 제약이 있다. 본 발명자는 활성화된 ROI의 수를 비교하였고, 비-점화된 래트에서보다 점화된 군의 발작에 더 많은 영역이 관련되어 있음을 발견하였다(도 4B, 23.4±2.0 영역 대 38.8±1.0 영역, n = 20 대 17, 대조군 대 점화됨, p < 0.0001).
다음으로, 본 발명자는 수정된 레이더 플롯을 사용하여 비-점화된 및 점화된 발작에서 영역 활성화의 빈도를 조사하였다(도 4C). 데이터 세트의 이러한 시각화는 비-점화된 발작이 우선적으로 동측 반구를 활성화시킨 반면, 점화된 발작이 양측에서 일관되게 활성화되었음을 보여준다.
활성 전파를 조사하기 위한 평균 영역 개시 시간을 계산하기 위해, 발작의 적어도 80%에서 활성이었던 영역만이 사용되었다(도 4C, 비-점화된 발작 n = 16 내지 20 및 점화된 발작 n = 14 내지 17, 80% 역치가 신뢰할 수 있는 개시 시간 추정치를 얻기 위해 사용됨). 각각 90% 및 0% 역치에 대해 도 11, 12 참조). 비-점화된 발작에서, 8개 영역이 발작의 적어도 80%에서 활성화되었고, 이는 모두 동측 반구에서 발생하였다(도 4D, 좌측 패널, 영역은 가장 빠른 것에서 가장 느린 것으로 분류함: iPiriC, iMePFC, iOrFrC, iVHip, iSept, iInsulC, 동측 내후각 피질(iEntC), iTeAssC. 점화된 발작의 경우, 양쪽 반구의 38개 영역이 발작의 적어도 80%에서 활성화되었다(도 4D, 우측 패널). 또한, 동측에서 대측 반구로의 명확한 전파 패턴이 있었다: 가장 빠른 개시 시간을 갖는 처음 20개 영역 중, 18개 영역이 동측 반구에 있었다. 나머지 18개 영역 중, 14개는 대측 반구에 있었다(각 군에 대한 상호 상관 영역 분석에 대해서는 도 13 참조). 특히, 발작 일반화를 위한 중요한 노드로서 연루된 영역인 mThal은 피질의 많은 영역보다 늦게 활성화되었으며, 이는 mThal 활성화가 발작 일반화의 다운스트림을 시사한다.
본 발명자는 이후에 비-점화된 군과 점화된 군 사이에서 8개의 일반적으로 활성인 영역의 영역 개시 시간을 비교하였다(도 4E). 본 발명자는 비-점화된 발작(4.1±0.34 s, Holm의 조정된 p = 0.044)에 비해 점화된(2.8±0.26s)에서 iMePFC에서의 더 빠른 개시 시간을 검출한 반면, 다른 영역에서는 일관된 차이가 관찰되지 않았다(모두에 대해 p > 0.3). 다른 영역, 비점화 대 점화): iVHip (4.2±0.43s 대 4.4±0.76s), iOrFrC (4.2±0.51s 대 3.0±0.21s), iSept(4.6±0.62s 대 7.1±1.34s), iInsC(7.1±3.94s 대 6.9±2.33s), 동측 이상 피질(iPiriC)(3.4±0.32s 대 3.4±0.33s), iEntC(9.8±3.06s 대 9.7±5.7s), 및 iTeAssC(10.8±2.14s 대 8.6±3.46s).
해마에서의 고 진폭 활동의 이동성 코어 및 발작 일반화에서의 역할. 발작 동안, 본 발명자는 자극된 해마에서 서서히 이동하는 고진폭 활동의 코어를 종종 관찰하였고, 이는 일부 경우에, 발작 일반화에 선행하는 유일한 검출 가능한 활성이며, 이는 신규한 발작 일반화 메커니즘을 가리킨다. 이동성 코어는 비-점화 및 점화된 동물 군 둘 모두에서 동측 해마에서 관찰되었으며, 이는 코어가 점화-유발 회로 재구성의 유무에 관계없이 형성될 수 있음을 시사하며, 래트의 75%(9/12)에서 모든 발작의 62%(23/37)가 발생하였다. 이러한 숫자의 분석은 이러한 코어가 비-점화된 대조군 래트(4/7마리의 비-점화된 래트에서 8/20 발작)에 비해 점화된 래트(5/5마리의 점화된 래트로부터 15/17의 발작)에서 더 빈번하게 관찰되었음을 나타낸다. 이동성 코어의 예는 비-점화된 동물에서 도 5A,B, 및 점화된 동물에서 도 5C,D에 도시되어 있다.
코어의 이동 특성을 감안할 때, 본 발명자는 다음으로 해마를 복부에서 등쪽으로 4개 영역으로 나누고 피크에서 피크까지의 시간을 계산함으로써 두 군에서 이의 전파 속도를 추정하였다(도 5E, G, H). 이동성 코어의 전파 속도는 비-점화된 및 점화된 군에서 유사하였으며(도 5F), 비-점화된 래트에서 0.117 ㎜/s 및 점화된 래트에서 0.107 ㎜/s의 평균 속도를 갖는다.
비-점화된 래트 및 비-점화된 래트의 발작에서 이동하는 해마 활동은 유사성을 공유했지만, 반대쪽 해마로의 이동은 점화된 래트에서만 관찰되었다. 이동성 코어를 갖는 발작에서, iDHip에서 cDHip로 전파하는 활성이 비-점화된 발작에서 0%(0/8) 및 점화된 발작에서 53%(8/15)로 관찰되었다(4/5 래트로부터).
빠르게 일반화되는 대부분의 발작이 광범위한 활동을 일으키지만(도 3F), 본 발명자는 이동하는 해마 활성이 피질 활성화 전에 뇌에서 유일한 명백한 반응인 몇 가지 발작(2마리의 점화된 래트로부터 3회의 발작)을 확인하였고, 이는 코어가 발작 일반화에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다(도 5I, J). 활성은 iVHip에서 iDHip로 이동한 다음(시점 2 내지 5), 동측 피질(6), 대측 해마(7 내지 8), 및 최종적으로 대측 피질(9)로 전파된다.
본 발명자는 국소 및 FBTC 발작 역학 및 이러한 발작이 나타나는 기저 기능 장애 네트워크의 뇌 전체 영상을 입증하였다. 첫째, 본 발명자는 FBTC 발작을 신뢰성 있게 생성하기 위해 해마 점화의 새로운 광유전학적 모델을 개발하였다. 그런 다음 본 발명자는 두 가지 자극 패러다임을 사용하여 복부 해마 회로 역학의 뇌 전체 조사를 수행하였다: 기저 기능 회로 변화를 평가하기 위한 짧고 약한 10㎐ 자극, 및 발작 회로 역학을 평가하기 위한 길고 강렬한 40㎐ 자극. 본 발명자는 점화가 mePFC에서 가장 큰 활성 변화를 갖는 자극된 복부 해마 회로의 만성적이고 광범위한 재구성을 초래한다는 것을 발견하였다. 불안 행동은 점화 후 상승하였다. 다음으로, 본 발명자는 개별 국소 및 FBTC 발작의 뇌 전체 역학을 영상화하여 이들의 뚜렷한 전파 패턴을 밝히며, 본 발명자는 종종 발작을 수반하는 고 진폭 활동의 느린 이동성 코어를 확인하였다. 중요하게는, 3회의 점화된 FBTC 발작에서, 이러한 코어는 발작 일반화 전에 뇌에서 유일한 활성이었으며, 이는 이러한 코어가 기본적인 발작 전파 메커니즘이고, 발작 일반화에서 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.
본 발명자들이 관찰한 복부 해마 회로에 대한 지속적이고 광범위한 점화-유도된 변화는 반복된 비정상적 활성 후에 특정 회로가 기능적으로 어떻게 재구성되는지를 입증한다. 따라서, 이는 기저 회로에 대한 반복된 간질 또는 발작 활동의 영향을 연구하는 유용한 동물 모델이다. 또한, 재구성된 회로는 함께 고려하면 가장 흔한 간질 동반질환 중 하나인 불안에 대한 감작된 회로의 출현을 나타내는 고조된 불안과 관련되었다. 본 발명자는 뇌에서 가장 큰 활성 변화가 mePFC에서 있음을 발견하였으며, 이는 vHip과 mePFC 사이에 증가된 흥분성 관계가 있음을 시사한다. 특히, 이러한 영역은 동물이 불안 완화 환경에 들어갈 때 증가된 세타-커플링을 나타내는 불안 회로의 3개 노드 중 2개이며, 세타 커플링이 중단될 때 관련 불안 행동이 폐지되었다. vHip-mePFC 회로 기능장애는 간질 환자 및 다른 해마 점화 모델에서 관찰되었으며, 회로 기능장애는 또 다른 일반적인 간질 동반질환인 인지 결핍과 관련이 있다. 종합하면, 이러한 데이터는 vHip-mePFC 회로 기능장애를 표적으로 하는 치료법의 개발이 간질과 관련된 가장 흔한 동반질환의 일부를 감소시킬 수 있고, 발작 자체보다 삶의 질에 잠재적으로 훨씬 더 큰 영향을 미칠 수 있는 병태에 대한 효과적인 치료를 가능하게 할 수 있음을 나타낸다.
발작 전파를 위한 기본 메커니즘으로서 이동성 해마 코어는 발작 개시 영역(SOZ)이 신뢰성 있게 국소화되어야 하는 간질 수술에 중요한 의미를 갖는다. 본 발명자의 단일 발작 데이터는 알려진 SOZ인 복부 해마를 가지고, 이동성 코어가 SOZ 국소화에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지를 보여준다(도 3D,F 및 5J). 이러한 데이터로부터, 본 발명자는 SOZ가 발작 내내 활성이 아니었으며, 발작 활성의 영역 패턴이 빠르게 변할 수 있으며, 가장 높은 활성을 갖는 영역이 종종 SOZ가 아님을 발견하였다. 이는 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT) 및 전기생리학과 같은 표준 임상 SOZ 식별 방법에 직접적인 영향을 미친다. SPECT는 발작이 시작될 때 수동으로 주사되는 단기 방사성 혈류 추적자를 사용하며, 이에 따라, 주사가 지연되면 SOZ에서 임의의 활성을 검출하지 못할 수 있다. 전기생리학은 발작 동안 전기적 활동을 매핑하기 위해 전극을 사용하고, 우수한 시간적 분해능을 제공하면서, SOZ의 오분류로 이어질 수 있는 위치 및 방향 바이어스를 갖는다. 위치 편향의 예는 발작 활성이 SOZ에 이식된 전극으로부터 멀리 전파되고, 발작 활성이 뇌의 다른 곳에서 진행되는 동안, 발작이 해당 전극에서 더 이상 검출되지 않은 단일 발작 데이터에 도시되어 있다(도 3D,F 및 5J). 유사하게, 전극이 이동성 발작 코어의 경로에 배치되는 경우, 발작 활성 개시는 개시보다는 전파를 반영할 것이다. 따라서, 이동성 코어를 검출할 수 있는 방법을 개발하는 것은 간질 수술에 대한 SOZ 국소화를 개선하는 데 도움이 될 수 있다.
이동성 해마 코어의 기초가 되는 메커니즘은 불분명하며, 본 발명자는 이러한 현상이 해마 외측에서 발생하는 지 여부는 알 수 없다. 그러나, 내인성 해마 회로는 비-점화된 래트뿐만 아니라 점화된 래트에서도 관찰되었기 때문에 이러한 코어를 지지하기에 충분하였다. 대략 0.1 ㎜/s로 이동하는, 유사한 속도로 전파되는 발작 활성이 인간 및 동물에서 보고되었으며, 이온 확산 및 저해 제한이 잠재적인 주요 메커니즘으로 지적된다. 흥미롭게도, 최근의 증거는 간질과 관련된 갑작스러운 예상치 못한 사망(sudden unexpected death associated with epilepsy: SUDEP)에 대한 주요 메커니즘으로서 느린 전파 활성을 내포하고 있으며, 이러한 활성이 이동성 해마 코어와 동일한 기본 메커니즘을 공유하는지 결정하기 위해 추가 연구가 필요하다.
발작이 해마 밖으로 전파될 때, 활성은 공지된 축삭 경로를 따랐고, 따라서 시냅스 메커니즘을 연루시켰다. 도 5J는 발작 활성이 동측에서 대측 해마로 전파되는 시냅스 전달을 통한 전파의 예이다. 시냅스 발작 전파 메커니즘은 활성이 인접 영역으로 비선택적으로 전파되기 보다는 특정 영역으로 전파된 국소 피질 발작의 마우스 모델에서 관찰되었다. 이러한 메커니즘을 표적으로 하는 치료법의 개발은 효능을 향상시킬 수 있다.
약어. 'i' 동측, 'c' 대측, 'ChR2' 채널로돕신2, 'Amyg' 편도체, 'AudC' 청각 피질, 'CingC' 대상 피질, 'DHip' 등 해마, 'DLThal' 배측 시상, '피질 내측 'FrAssC' 전두엽 연합 피질, 'Hypo' 시상하부, 'InsulC' 섬 피질, 'MDThal' 중등측 시상, 'mePFC' 내측 전전두엽 피질, 'MotorC' 운동 피질, 'OrFrC' 안와전두 피질', '피질', 'Parietal PiriC' 이상형 피질, 'ReplC' 후장 피질, 'Sept' 중격, 'SomC' 체성감각 피질, 'Sria' 선조체, 'TeAssC' 측두 연합 피질, 'VHip' 복부 해마, 'VisC' 시각 피질.
물질 및 방법
실험 설계. 25마리의 성체 수컷 스프라그-둘리(Sprague-Dawley) 래트(Charles River Laboratories)에 AAV-5-CAMKIIa-hChR2(H134R)-eYFP를 우복부 해마에 주사하고 MRI-호환성 옵트로드를 이식하여 동시 자극 및 전기생리학적 기록 및 동측 해마를 가능하게 하였다. 내측 전전두엽 피질에 전기생리학적 기록을 위한 MRI-호환성 전극(REF Ben 전극 페이퍼 및 해마 페이퍼)을 이식하였다. 수술 후 적어도 6주 후에, 래트를 점화 후 해마 회로 변화를 조사하기 위해 동시 LFP-광유전학적 fMRI(ofMRI)를 사용하여 영상화하였다. 동물을 무작위로 2개의 군으로 나누었다: 실험 점화 군 및 대조군(각각 n=12, n=13). ofMRI로부터 적어도 1주일 후에, 점화 군은 점화를 겪었고, 모든 래트를 1 내지 2주 후에 LFP-ofMRI로 다시 영상화하였다. 래트의 서브세트(군당 n=5)를 LFP-ofMRI 후 대략 1개월 후에 다시 재시험하여 점화된 효과의 지속성을 평가하였다. 나머지 동물(n=7, n=8)을 이후 급성 발작 효과를 최소화하고 점화의 장기적인 결과를 평가하기 위해 LFP-ofMRI 후 10주 동안 수크로스 선호도 시험, 오픈 필드 시험 및 이후 강제 수영 시험을 이용하여 우울증 및 불안의 증거에 대해 시험하였다. 각 행동 시험을 일주일 간격으로 수행하였다. 행동 시험 종료 후 적어도 일주일 후에, 발작 회로의 특성을 조사하기 위해 LFP-ofMRI로 발작을 영상화하였다.
바이러스 주입 및 옵트로드 및 전극의 이식을 위한 외과적 절차. 축산 및 실험 프로토콜은 국립 보건원(NIH) 및 스탠포드 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 지침을 엄격히 따랐다. 동물을 환경적으로 제어된 조건, 즉, 임의로 제공된 음식 및 물과 함께 12-시간 명암 주기 하에 수용하였다.
간략하게는, 래트를 순수한 산소 중 5% 아이소플루란을 사용하여 마취시킨 다음, 수술 절차의 기간 내내 2 내지 3%로 유지하였다. 2㎕의 AAV-5-CAMKIIa-hChR2(H134R)-eYFP를 해밀턴 주사기에 부착된 33-게이지 바늘을 사용하여 우복부 해마(경막으로부터 AP: -5.6㎜, LR: 5.7㎜, DV:6㎜)에 주사하였다. 주사기 펌프(Micro 4, World Precision Instruments, FL)를 사용하여 일정한 속도(150 nl/분)의 투여를 보장하였다. 전술한 바와 같이(Duffy et al., 2015), 0.22 개구수, 105㎛ 직경의 단계-지수 멀티모달 광섬유(ThorLabs, Newton, NJ)로 구성된 MRI 호환 가능한 탄소 섬유 옵트로드를, 전극의 첨단 및 섬유가 주사 부위 바로 위에 존재하도록 삽입하였다. 이식 전에, 광 투과율이 80% 초과이고 뇌로의 광 투과율이 대략 이러한 값인 것으로 가정되었는지를 확인하기 위해 옵트로드를 체크하였다. 단일 황동 스크류를 소뇌 위에 삽입하여 치과용 시멘트를 고정시키고, 또한 접지 및 기준 전극의 역할을 하였다. 탄소 섬유 전극을 우측 내측 전전두엽 피질에 이식하였다(10° 각도로 경막으로부터 AP: +3.24㎜, LR: +1.25㎜, DV: -3.4㎜). 마지막으로, 전극 와이어를 DF13 커넥터(Hirose, 일본 소재)에 납땜하고, 모든 성분을 광-경화성 치과용 시멘트를 사용하여 두개골에 고정시켰다. 부프레노르핀 지속 방출(1 ㎎/㎏, sc)을 절차로 인한 통증 및 불편함을 완화시키기 위해 수술 전에 제공하였다. 리도카인(4%) 및 부피바카인(0.25%)의 국소 투여를 또한 수술 전 및 후에 제공하였다. 바이러스-유도된 단백질 발현을 위한 시간을 허용하기 위해, 수술 절차 후 적어도 6주 후에 실험을 수행하였다.
광유전학적 점화. 12마리의 래트를 하기 절차를 사용하여 점화시키고, 이들의 홈 케이지에서 동시 비디오 LFP 기록을 사용하여 전체적으로 모니터링하였다. 동물을 광섬유 및 전기 회전 조인트(Doric Lenses)를 통해 473 nm(청색광) 다이오드-펌핑된 고체-상태 레이저(Laserglow Technologies, 캐나다 토론토 소재) 및 16 채널 BrainAmp ExG MR 증폭기(Brain Products, 독일 소재)에 연결하였다. 비디오를 Logitech C920 HD Pro 웹캠을 사용하여 기록하였다.
라신 척도를 사용하여 평가한 경우 행동 발작의 부재 하에 전자사진 발작을 유도하기 위해 단계별 방식으로 자극 강도를 점진적으로 증가시킴으로써 각각의 개별 동물에 대해 후방전 역치를 먼저 평가하였다. 1㎽에서 7.5㎳의 펄스폭으로 40㎐ 자극의 10s 트레인(train)으로 시작하여, 전력은 최대 20㎽까지 1분의 자극간 간격(ISI)으로 한 번에 1㎽ 증가하였다. 후방전이 관찰되지 않으면, 지속기간을 2.5초만큼 증가시키고 전력을 1㎽로 재설정하였다.
후방전 역치를 설정한 후, 점화를 시작하였다. 동물을 하루에 최대 12회의 자극까지 또는 단계 5 운동 발작이 나타날 때까지 자극하고, 최대 12일의 자극까지 격일로 자극하였다. 자극간 간격은 15분이었다. 단계 5 운동 발작이 당일의 처음 3회 자극 내에 관찰되는 경우 동물을 점화시킨 것으로 간주하였다.
동일한 점화된 기준을 이용하여, 점화 후 3주 및 12주에 15분의 ISI로 3회 자극함으로써 동물의 서브세트(5마리의 연령-매칭된 평행 대조군 및 5마리 점화 래트)에서 점화의 영속성을 평가하였다.
복부 해마 연결성을 평가하기 위한 동시 LFP-ofMRI 데이터 획득. 복부 해마 연결성을 평가하기 위해, 복부 해마에서 CAMKIIα 세포를 광유전학적 자극을 사용하여 10㎐에서 자극하고 동시 LFP-fMRI를 사용하여 평가하였다. Stanford Center for Innovation in Vivo Imaging(SCi3)에서 7T 수평-보어 시스템(Bruker BioSpec 70/30)을 사용하여 데이터 획득을 수행하였다. RF 수신기로서 20㎜ 단일-루프 표면 코일을 갖는 RF 여기를 위해 86㎜ 직경의 2-채널 부피 코일을 사용하였다. 덱스메데토미딘의 볼루스(0.1 ㎎/㎏, sc)를 사용하여 래트를 진정시킨 후, 측면 꼬리 정맥에 삽입된 캐뉼러를 통해 연속 주입(0.05 ㎎/㎏, iv)하였다. 페라헴의 단일 볼루스(15 ㎎/㎏, iv)를 향상된 대조 대 잡음비(Mandeville et al., 1998) 및 미세혈관 민감도(Zhao et al., 2006)를 위해 대뇌 혈액 부피(CBV) 가중 영상화에 사용되었으며, 이러한 기술은 BOLD fMRI와 비교하여 제공된다. fMRI 획득을 하기 획득 파라미터를 갖는 4-샷 세그먼트화된 나선 판독을 사용하여 조영제 주입 대략 15분 후에 수행하였다: TR = 0.75㎳, TE = 9㎳, 플립 각도 = 30, 시야 = 32×32㎜, 매트릭스 = 70×70, 슬라이스 두께 = 0.6㎜, 슬라이스 수 = 30, 반복 횟수 = 130, 더미 스캔 수 = 4. 광유전학적 자극을 위해, 자극을 위해 10㎐, 7.5㎳ 펄스폭으로 5초 온(on) 및 55초 오프(off)를 포함하는 블록 설계를 사용하였다. 각 세션의 종료 시에, 덱스메데토미딘의 효과를 역전시키기 위해 아티파마졸(0.5 ㎎/㎏, sc)을 제공하였다. fMRI에 추가하여, 해마 부피의 평가를 위해 하기 파라미터를 갖는 해부(빠른 스핀 에코) 스캔을 획득하였다: TR = 4755㎳, TEeff = 29.9㎳, RARE 인자 = 8, 시야 = 30×30㎜, 매트릭스 = 256×256, 슬라이스 두께 = 0.6㎜. 해마 부피를 평가하기 위해, 각 동물에 대한 동측 및 대측 반구에서 해마 부피를 수동으로 그렸다. 기준선 및 점화 후 측정은 비-점화된 동물 및 점화된 동물에서 이루어졌고, 동물 부피 내에서 각 해마 부피를 이의 기준선으로 표준화함으로써 평가하였다. 명백한 해마 부피 손실이 점화와 관련이 있는지를 결정하기 위해 독립적인 t-검정을 사용하여 각 반구에 대한 두 군 간의 차이를 평가하였다.
발작 회로 역학을 영상화하기 위한 동시 LFP-ofMRI 데이터 획득. 비-점화된(n=7) 및 점화된 동물(n=5)에서 뇌-전체 발작 회로 역학을 평가하기 위해, 본 발명자는 복부 해마 CAMKIIα 세포의 광유전학적 자극과 동시 LFP-fMRI를 사용하였다. 3마리의 동물은 이식물의 손실로 인해 영상화될 수 없었다(비점화 n=1, 점화 n=2). 상기 기술된 바와 같이 미리-결정된 후방전 역치에서 7.5㎳ 펄스폭을 갖는 40㎐ 펄스 열을 사용하여 발작을 유도하였다. 덱스메데토미딘 진정 프로토콜 하의 운동 발작은 유의미한 움직임을 초래하기 때문에, 동물을 마비시키고 발작 LFP-ofMRI를 위해 환기시켰다. 5% 아이소플루란을 사용하여 마취를 유도하고 2 내지 3% 아이소플루란을 사용하여 유지한 다음, 약물 주입을 위해 래트에 캐뉼러를 삽입하였다. 그 후, 동물에 캐뉼러 삽입하고, 덱스메데토미딘의 볼루스(0.1 ㎎/㎏, sc)를 삽입하였다. 절차의 나머지 동안, 아이소플루란을 서서히 철회하고, 덱스메데토미딘(0.05 ㎎/㎏, iv) 및 베쿠로늄 브로마이드(7.5 ㎎/㎏)의 연속 주입을 사용하여 진정 및 마비를 유지하였다. 데이터 획득을 상기 기술된 바와 같이 MRI 시스템을 사용하여 수행하였다. fMRI의 경우, 하기 파라미터를 갖는 1-샷 EPI 판독을 사용하여 데이터를 획득하였다: TR=1s, TE=16㎳, 플립 각도 = 30, 시야 = 32×32㎜, 매트릭스 = 70×70, 슬라이스 두께 = 0.6㎜, 반복 횟수 = 480, 더미 스캔 횟수 = 4. 영상화 시작 90초 후에 발작 유도를 시작하였다. 각 세션의 종료 시에, 덱스메데토미딘의 효과를 역전시키기 위해 아티파마졸(0.5 ㎎/㎏, sc)을 제공하였다.
동시 LFP 기록 및 처리. fMRI 데이터 획득과 동시에 LFP 기록을 1000㎐의 저역 통과 필터 및 5000㎐의 샘플링 레이트(sampling rate)를 갖는 16 채널 BrainAmp ExG MR 증폭기(Brain Products, 독일 소재)를 사용하여 수행하였다. 주성분 분석(Liu et al., 2012)을 이용하여 Liu 등에 의해 구현된 방법을 사용하여 구배 아티팩트를 제거하였다.
fMRI 전처리 및 분석. 모든 fMRI 데이터를 SPM12를 사용하여 전처리하였고, 10㎐ 복부 해마 활성 데이터를 SPM12를 사용하여 분석하였다. 전처리를 위해, 절반-최대치에서 전폭에서 0.5㎜의 가우스 커널을 사용하여 데이터를 먼저 평활화하고 6-파라미터 강성 등록을 사용하여 운동을 보정하였다. 이미지를 수동 뇌 마스킹을 거친 다음 SPM에서 구현된 12-파라미터 아핀 등록을 사용하여 공통 공간에 정렬하였다. 이중 감마 기본 세트 함수를 자극 블록에 대한 신호 컨볼루션(signal convolution)에 사용하였다. 일반 선형 모델(GLM)을 사용하여 통계적 활성화 맵을 생성하였다. 영역 분석을 위해, 44개 영역을 산출한 공통 뇌 환추를 사용하여 뇌를 자동으로 세그먼트화한 후 개별 동물에 대해 활성화 부피 및 평균 시간 과정을 계산하였다.
fMRI 발작 전파 분석. 각각의 발작 fMRI에 대해, 관심 영역 수준에서 발작 전파를 결정하였다. 스캔을 뇌 환추에 등록하고, 0.1㎐에서 저역 통과 필터링하고, 상기 언급된 뇌 환추를 사용하여 개별 영역으로 세그먼트화하였다. 제공된 영역 내의 모든 복셀로부터 평균 시간 과정을 계산하였다. 신호가 기준선으로부터 4개의 표준 편차에 도달한 시간(자극 개시 전 60초)을 결정함으로써 각 영역에 대한 개시 시간을 계산하였으며, 추가적엔 제한은 이러한 신호가 후속 10초의 적어도 5회 동안 이러한 기준선을 지속해야 한다는 것이다.
해마 연결성과 발작 유도 사이의 관계. 해마 연결성과 해당 네트워크에서 유도된 발작 사이의 관계를 조사하기 위해, 본 발명자는 10㎐ 비-발작 자극 동안 활성화된 영역을 고려하여 발작 유도 동안 영역이 활성화되었을 조건부 확률을 계산하였다.
10㎐ 해마 연결성 데이터의 경우, 상기 언급된 절차를 사용하여 단일 대상체 복셀 수준 맵을 생성하고 P<0.001로 역치를 지정하였다.
각 동물에 대한 광유전학적 발작 유도와 관련된 네트워크를 결정하기 위해, 본 발명자는 유도 기간의 처음 10초 동안 복셀이 활성화된 백분율을 계산하였다. 먼저, 최대 퍼센트 BOLD 변화를 복셀 수준에서 결정하였다. 다음으로, 각각의 유도에 대한 이미지를 먼저 클래스내 분산을 최소화하는 역치를 적용함으로써 Otsu의 방법을 사용하여 이진화한 다음, 동물 내에서 발작에 걸쳐 활성화된 복셀의 백분율을 계산하여 발작의 광유전학적 유도와 관련된 네트워크 변화의 평가를 가능하게 하는 맵을 생성하였다. 군 분석을 위해, 맵을 군 내에서 평균화하여 광유전학적 발작 유도와 관련된 네트워크의 맵을 제공하였다.
단일 대상체 10㎐ 해마 연결성 맵 및 단일 대상체 발작 유도 네트워크 맵 둘 모두를 사용하여, 본 발명자는 영역이 10㎐ 자극 동안 활성인 경우 발작 유도 동안 활성인 영역의 조건부 확률을 평가하기 시작하였다. 먼저, 모든 데이터를 44개 영역 뇌 환추를 사용하여 44개 영역으로 자동적으로 세그먼트화하였다. 다음으로, 본 발명자는 뇌 영역이 활성인지 여부를 결정하기 위해 두 데이터 세트 모두에 대해 5% 활성화 부피 역치를 사용하였다. 그 후, 본 발명자는 비-점화된 및 점화된 군에 대한 영역 수준에서 조건부 확률을 계산하였다.
수크로스 선호도 시험. 2개의 담수병을 개별적으로 수용된 래트(8마리의 대조군 및 7마리의 점화 래트)의 홈 케이지에 4일 동안 배치하고, 래트를 병에 적응시키고 위치에 대한 선호도를 감소시키기 위해 이들의 위치를 매일 교체하였다. 물병을 매일 칭량하였다(오전 9시 내지 10시). 순응 기간 후, 2개의 담수병(하나는 물로 채워지고 다른 하나는 5% w/v 수크로스 물로 채워짐)을 케이지에 배치시켰다. 물병의 계량하고, 4일 동안 매일(오전 9시 내지 10시) 위치를 바꾸었다. 연구 기간 동안 물병의 식별을 블라인드 처리하였다. 매일 마시는 물의 부피 및 물과 수크로스 물 사이의 비율을 무쾌감증을 평가하는 데 사용하였다.
오픈 필드 테스트. 동물(8마리의 대조군 및 7마리의 점화 래트)의 식별을 이러한 절차에 대해 블라인딩하고, 데이터 처리의 완료 후에만 나타났다. 래트를 맞춤형 챔버(1 m × 1 m × 0.3 m)에 개별적으로 배치하고 Logitech C920 HD Pro 웹캠으로 기록하였다. 자동 추적을 Viewer3 소프트웨어(Biobserve GmbH, 독일 소재)를 사용하여 기록의 처음 5분 동안 오프라인으로 수행하였다. 이동한 거리 및 경기장의 가장자리에서 떨어져서 보낸 시간을 불안을 평가하는 데 사용하였다.
강제 수영 시험. 동물(8마리의 대조군 및 7마리의 점화 래트)의 식별을 이러한 절차에 대해 블라인딩하고, 데이터 처리의 완료 후에만 나타났다. 래트를 23 내지 25℃의 물로 약 60㎝ 높이까지 채워진 맞춤형 실린더(30㎝ 직경, 90㎝ 높이)에 개별적으로 배치시켰다. 시험 전날 10분 사전 시험을 수행하였다. Logitech C920 HD Pro 웹캠을 사용하여 시험 기간(5분) 동안 동물을 기록하였다. 동물을 타월-건조시키고 그들의 홈 케이지로 돌려보냈다. 모든 데이터를 오프라인으로 분석하였다. 동물은 각각의 5초 에포크(epoch)에서 지배적인 행동이 평가된 변형된 FST 점수 시스템을 사용하여 부동성 및 수영 및 등반에 대해 점수를 매겼다(Slattery and Cryan 2012). 부동성 점수를 사용하여 행동 절망을 평가하였다.
통계 분석. 값은 평균±sem으로 제시된다. 다중 비교를 위한 p-값의 조정을 위한 홀름 본페로니(Holm's Bonferroni) 방법을 지시된 경우에 사용하였다. 통계 분석을 SPSS 21 또는 맞춤형 MATLAB 스크립트를 사용하여 수행하였다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 설정되었다.
실시예 2
기능장애 뇌 네트워크가 어떻게 발작을 일으키고 이들의 전파 및 종결에 영향을 미치는지 이해하는 것은 간질 연구의 중심 목표이고, 발작 및 간질과 관련된 동반질환의 표적 치료의 개발에 영향을 미칠 수 있다. 여기에서, 본 발명자는 반복된 해마 발작(점화) 전 및 한 주 후에 흥분성 복부 해마(VH) 네트워크를 조사하며, 이는 래트에서 광유전학적 자극을 갖는 동시 전기생리학과 기능적 MRI와 함께 만성 네트워크 변화를 초래하는 절차이다. 본 발명자는 또한 국소, 및 국소 내지 양측 강직-간대 발작을 밝히기 위해 단일 발작의 뇌 전체 네트워크 역학을 직접적을 영상화한다. 본 발명자는 또한 두 가지 일반적인 간질-관련 동반질환인 불안 및 우울증에 대한 시험을 수행한다. 마지막으로, 본 발명자는 대상체 내 데이터에 기초로 하여 해마 네트워크와 얻어진 발작 역학 사이의 관계에 대해 보고한다. 점화 후 흥분성 VH 네트워크 활동의 광범위한 증가가 검출되었다. 가장 큰 변화는 mPFC에서 검출되었다(점화 후 LFP 밴드파워의 6.4배 및 활성화 부피의 56% 증가). VH-전전두엽 피질 회로가 불안 및 우울증과 연관되기 때문에, 본 발명자는 점화된 래트가 더 불안하다는 것을 시험하고 발견하였다(n=7,8, p=0.046). 발작 영상화의 경우, 점화된 래트에서 발작 지속기간은 비-점화된 래트보다 30.7±8.4초(p=0.001) 더 길었고, 15.5±2.2 이상의 ROI가 활성화되었다(p<0.001). 증식 네트워크 분석은 활성이 대조군에서 동측으로 유지되는 반면 점화된 래트에서의 활성이 양측 피질로 점차 전파됨을 나타내었다. mPFC는 더 빠르게 활성화되었다. 발작 일반화4와 관련된 영역인 중등측 시상은 점화된 래트에서만 활성이었다. 다음으로, 본 발명자는 VH 네트워크와 발작 네트워크 사이의 선형 관계를 조사하였고, 점화된 래트에서 77%에 비해 대조군에서 95%의 가변성이 설명되었음을 발견하였다(p<0.001, p=0.05, n=7,5). 마지막으로, 본 발명자는 발작 관여에 대한 VH 네트워크 활성의 양성 예측 값을 조사하였고, 일관되게 활성화된 ROI에서 대조군(3개의 ROI, n=7)에서 0.86±0.08 및 점화된 래트에서 0.89±0.07(14개의 ROI, n=5)임을 발견하였으며, 이는 VH 활성을 평가하는 것이 발작 경로에 대해 신뢰성 있게 영향을 미친다는 것을 시사한다. 종합하면, 이러한 결과는 해마 발작 전파의 기초가 되는 뇌-전체의 흥분성 VH 네트워크 및 이러한 네트워크에 대한 반복된 발작의 장기간 영향을 나타낸다.
여기에서, 본 발명자는 반복된 해마 발작(점화) 전 및 한 주 후에 흥분성 복부 해마(VH) 네트워크를 조사하며, 이는 래트에서 광유전학적 자극을 갖는 동시 전기생리학과 기능적 MRI와 함께 만성 네트워크 변화를 초래하는 절차이다. 본 발명자는 또한 국소, 및 국소 내지 양측 강직-간대 발작을 밝히기 위해 단일 발작의 뇌 전체 네트워크 역학을 직접적을 영상화한다. 본 발명자는 또한 두 가지 일반적인 간질-관련 동반질환인 불안 및 우울증에 대한 시험을 수행한다. 마지막으로, 본 발명자는 대상체 내 데이터에 기초로 하여 해마 네트워크와 얻어진 발작 역학 사이의 관계에 대해 보고한다.
광유전학적 점화. 12마리의 래트 중 10마리(83%)가 자극 7일째에 점화된 기준에 도달하였으며, 모든 래트가 11일째에 점화되었다. 점화에 필요한 자극의 평균 수는 53.6(범위 29 내지 117)이었고, 경련성 발작의 평균 수(라신 단계 3 내지 5)는 6.75(범위 2 내지 13)였으며, 평균 전신 발작 횟수(라신 단계 5)는 2.9(범위 1 내지 9)이었다. ChR2-eYFP에 의한 복부 해마의 성공적인 표적화는 형광 현미경으로 확인되었다.
점화는 최소 세포 손실과 관련이 있으므로, 본 발명자는 점화 전후 및 병렬 대조군 비-점화된 래트에서 스캐닝 세션에서 획득된 해부학적 MR 스캔으로부터 해마 부피를 측정함으로써 임의의 명백한 해마 부피 손실을 검출할 수 있는지 시험하였다. 점화된 동물을 비-점화된 동물과 비교할 때 대측 해마의 동측 어느 쪽에서도 해마 부피의 유의미한 차이는 검출되지 않았으며(도 1F, 0.63±0.82% 대 0.14±0.96%, p=0.7, 및 1.37±1.22% 대 -1.03±1.27%, p=0.19, 각각 동측 및 대측 해마에서 점화된 대 비-점화, 평균±sem), 이는 점화가 실질적인 세포 손실을 초래하지 않는다는 가설을 뒷받침한다.
점화의 만성 효과를 확인하기 위해, 점화 3주 및 12주 후에 래트의 서브세트를 재시험하였다(점화 및 비점화 둘 모두에 대해 n=5). 5마리의 점화된 래트 모두는 점화의 지속성을 나타내는 두 시점 모두에서 라신 단계 5 발작을 가진 반면, 비-점화된 래트는 어느 시점에서도 명백한 발작 행동을 나타내지 않았다.
점화 유무와 함께 복부 해마의 10㎐ 광유전학적 자극에 대한 국소 및 뇌-전체 반응 및 불안 및 우울증에 대한 점화의 영향. 비-점화된 래트에서, 10㎐ 광유전학적 자극은 동측 반구 및 등측 및 복부 해마, 중격, 편도 및 내측 전전두 피질에 주로 국소화된 CBV 활성을 초래하였다. 대조적으로, 점화된 래트에서, 동일한 자극은 이러한 영역을 넘어 확장되고 대측 반구의 영역을 포함하는 활성을 초래하였다. 뇌에 걸친 개별 영역의 활성 부피를 비교할 때, 본 발명자는 본페로니-홀름(Bonferroni-Holm) 방법과 함께 다중 비교에 따른 하기 7개 영역에서 2 래트 군 간의 일정한 부피 차이를 발견하였다: 동측 전두 연합 피질(0.24±0.24% 대 27.1± 5.6%, p=0.004), 시간 연관 피질(0.34±0.34% 대 26.7±4.8%, p=0.0006), 안와전두 피질(1.4±0.7% 대 23.8±3.9%, p=0.0005), 섬 피질(0.2±0.18% 대 13.0±2.7%, p=0.0047), 및 마지막으로 선조체(2.6±0.9% 대 14.8±2.7%, p=0.011). 동측 복부 또는 등쪽 해마에서 활성인 ROI의%는 군 간에 유의미하게 상이하지 않았다(17.3±3.0% 대 27.8±3.1%, p=0.684, 10.1±2.9% 대 24.4±5.9%, p=0.994).
다음으로, 본 발명자는 광유전학적 자극에 대한 fMRI 반응의 진폭을 조사함으로써 비-점화된 래트에서 활성 영역이 점화된 래트에서 어떻게 변화하는지를 조사하였다. 본 발명자는 복부 또는 등쪽 해마(비-점화된 대 점화된 평균±sem, 다중 비교를 위한 본페로니-홀름 방법으로 조정된 p-값)에서 반응 증폭의 차이를 감지하지 못하였다: VHip(2.1± 0.3% 대 3.1±0.4%, p = 0.122), dHip(0.8±0.2% 대 1.2±0.2%, p=0.178). 그러나, mePFC(1.3±0.3%, 4.2±0.6%, p=0.0023), 격막(1.6±.3%, 2.5±.3%, p=0.082), 편도체(1.1±0.3%, 3.0±0.4%, p=0.0023)에서 강력한 차이가 관찰되었다.
본 발명자가 fMRI와 동시에 iMePFC 및 iVHip에서 국소 장 전위(LFP)를 측정하였기 때문에, 본 발명자는 이러한 영역에서 상보적인 LFP 반응이 존재하는지를 조사하였다. 점화 후, iMePFC에서 시각적으로 명백한 증가가 있었다. 본 발명자는 자극 개시 전 5초에서 밴드파워로 정규화된 5초 자극 동안 밴드파워 반응을 계산함으로써 이러한 변화를 정량화하고, 점화 전 및 후 반응을 비점화 래트의 반응과 비교하였다. 본 발명자는 복부 해마에서 어떠한 명확한 차이도 검출하지 못하였다(비-점화 및 점화된 래트에서 각각 F=0.59, p=0.81, n=13 및 12, 2-방향 반복 측정 ANOVA로 분석됨). 그러나, 내측 전전두엽 피질에서, 본 발명자는 군과 시간 사이에 유의미한 상호작용을 발견하였다(군 당 F=5.39, p=0.031, n=11). 사후 분석은 점화 후 6.4±2.6배(평균±sem) 증가가 있음을 나타내었다(페어드 t-검정, t=2.47, p = 0.033). 이는 fMRI 반응과 함께 점화가 내측 전전두엽 피질에 대한 복부 해마의 연결성을 증가시켰음을 시사한다.
내측 전전두엽 피질 회로에 대한 복부 해마가 불안의 표현과 관련이 있기 때문에, 본 발명자는 점화 절차가 동물의 서브세트에서 장기 행동 장애를 초래하는지를 조사하였다. 본 발명자는 간질과 관련된 가장 흔한 두 가지 정서적 동반질환인 불안과 우울증을 모두 시험하였다. 우울증의 경우, 동물은 강제 수영 및 수크로스 선호도 시험을 거쳤다. 어느 시험도 비-점화된 동물과 점화된 동물 사이에 분명한 차이가 있음을 나타내지 않았다. 강제 수영 시험의 경우, 비-점화된 대조군 대 점화된 래트에서 36.3±0.99 부동 점수 대 34.1±1.89 부동 점수(평균±sem), t-검정으로부터 계산된 p 값은 0.303이었다. 수크로스 선호도 시험의 경우, 본 발명자는 비-점화된 래트가 점화된 래트와 다르다는 증거를 발견하지 못하였다(F=0.48 p =0.499, 2-방향 반복 측정 ANOVA, 비-점화 및 점화 각각에 대해 평균 추정치는 96.2±0.9% 대 83.9±12.8%임). 두 군 모두는 시험 기간 동안 수크로스 물이 도입되었을 때 소비된 액체의 총 부피를 증가시켰다(비-점화된 래트 32.3±8.0ml, p=0.005 및 점화된 래트 24.7±6.9ml, p=0.011, 페어드 t-검정). 본 발명자는 점화된 동물이 비-점화된 래트와 비교할 때 오픈 필드 경기장의 중심에서 더 적은 시간을 보낸다는 것을 발견하였으며, 이는 해마 점화의 결과로서 불안이 증가함을 시사하는 것이다(중심에 있는 시간 12.5±1.5% 대 8.0±1.4%, p=0.046, 평균±sem. 비-점화된 대조군 대 점화된 래트에서, t-검정, 각각 n=8 및 7). 중요하게는, 동물의 두 군 모두는 5분 시험 기간 동안 유사한 거리를 이동하였다(2446±153㎝ 대 2203±197㎝, p=0.98).
비-점화 및 점화된 래트에서 동시 LFP-fMRI를 사용한 단일 발작의 영상화. 점화된 동물에서 유도된 발작은 깨어 있는 점화된 동물에서 관찰된 것을 연상시키는 상동 행동으로부터의 덱스메데토미딘 진정 하에 MRI 상의 유의한 모션 아티팩트와 관련이 있다. 따라서, 본 발명자는 덱스메데토미딘 진정을 기초로 한 프로토콜을 개발하였고, 발작의 영상화 동안 움직임을 없애기 위해 속효성 신경근 차단제인 베쿠로늄을 도입하였다.
점화된 동물 및 비-점화된 동물 둘 모두에서, 본 발명자는 fMRI로 동시에 획득된 동측 복부 해마에서 LFP를 사용하여 광유전학적 자극의 중단 후 발작의 출현을 확인하였다. 중요하게는, 동측 복부 해마 BOLD 신호는 LFP의 것과 유사한 궤적을 따랐으며, 이는 BOLD가 발작 반응을 포착하였음을 나타낸다. LFP를 갖는 비-점화된 및 점화된 동물로부터의 단일 발작의 예 및 LFP의 시점에 해당하는 정규화된 BOLD 변화의 단일 1s 프레임의 예. 비-점화된 동물로부터의 발작에서, 10㎐ 네트워크를 연상시키는 복부 해마 회로에서 활동의 초기 버스트가 있고, 이어서 동측 해마에서의 활동의 전파 및 후속 음성 BOLD 반응이 있다. 스캔 기간에 걸친 복셀-방식 최대 강도 투영(MIP)은 높은 진폭 활동의 네트워크를 나타내었다.
점화된 동물로부터의 단일 발작에서, 이제 피질에서 양측으로 검출된 활성으로 스캔 전반에 걸쳐 BOLD 활동을 갖는 영역이 실질적으로 더 많았는데, 이는 발작이 초기 발작 초점으로부터 일반화되었음을 나타낸다. 중요하게는, BOLD 활동은 초기 해마 네트워크에서 동측 피질로 전파된 다음 대측 피질로 전파되었는데, 이는 처음으로 전체 뇌에 걸쳐 국소 내지 이차-전신 발작에 대한 발작 전파 역학을 나타낸다. 발작의 MIP는 이러한 실험에 대한 높은 진폭 활동을 요약한 것이다. 특히, 비-점화된 및 점화된 발작 둘 모두에 대해 BOLD 활동은 LFP에서 검출된 발작 활동의 종료를 넘어 지속되었다.
비-점화된 동물 및 점화된 동물에서의 발작 전파. 본 발명자는 다음으로 비-점화 및 점화된 래트에서 유도된 발작에서 BOLD 활동 전파를 정량화하였다(각각 7마리의 래트로부터 n=20, 5마리의 래트로부터 n=17. 비-점화된 군 및 점화된 군의 1마리 및 2마리 래트는 헤드 캡을 상실하였고 이러한 실험에 사용할 수 없었음). 전파를 포착하기 위해, 본 발명자는 자동화된 세그먼트화 환추를 이용한 영역 분석을 이용하여 44의 ROI를 얻었다. 영역 수준에서 시계열의 예는 도 4A에 제시되어 있다. 전파를 결정하기 위해, 본 발명자는 자극 개시 전에 활성이 처음으로 60초 기준선 초과의 4개의 표준 편차에 도달하는 시간으로 영역 개시를 규정하며, 이러한 시간 후 후속 10초 중 5초 동안 활성이 역치 초과로 유지되어야 한다. 이러한 절차가 비-점화된 군과 점화된 군을 구별할 수 있는지를 확인하기 위해, 본 발명자는 두 군 사이에서 검출된 ROI의 수를 비교하였고, 비-점화된 래트보다 점화된 군의 발작에서 더 많은 영역이 일관되게 활성화되었음을 확인하였다(23.4± 2.0 영역 대 38.8±1.0 영역, n=20 대 17, 대조군 대 점화된 평균±sem, p<0.0001).
다음으로, 본 발명자는 모든 비-점화된 및 점화된 발작에서 44개 영역에서의 활성 분포를 조사하였다. 중간 축을 따라 2개의 반구의 거울로의 레이더 플롯의 배열은 점화된 래트에서 발작이 본질적으로 일관되게 양측인 반면, 비-점화된 래트는 활성화된 영역의 서브세트를 형성하며, 이러한 ROI는 우선적으로 동측 반구에서 나타났다. 발병 시간의 신뢰할 수 있는 추정을 위해, 본 발명자는 각 발작 군의 적어도 80%에서 활성화된 영역만을 사용하였다(비-점화된 및 점화된 발작에서 n=16-20, n=14-17, 90% 및 0%의 역치로부터 계산된 개시에 대한 보충 수치 참조).
각 군에서 ROI 개시 시간을 가장 빠른 것에서 가장 느린 것으로 분류하고 동측 및 대측 반구에 대해 칼라-코딩하였다. 비-점화된 동물에서, 8의 ROI가 추정되었다(iPiriC, IMePFC, iOrFrC, iVHip, iSept, iInsulC, iEntC, iTeAssC). 특히, 모든 영역은 동측 반구로부터의 것이었다. 점화된 발작의 경우, 대측 반구에서 활성화가 검출되기 전에 동측 반구가 먼저 활성화된 것이 명백한 38개 영역에서 활성이 검출되었다. 이러한 ROI는 비-점화된 래트에서 발견된 8개를 포함한다. 가장 빠른 개시 시간을 갖는 처음 20개 영역 중, 18개 영역이 동측 반구에 있었다. 나머지 18개 영역 중, 14개는 대측 반구에 있었다. 다음으로, 본 발명자는 비-점화된 뇌에서 일관되게 활성화된 8개 영역의 2개 군 사이의 개시 시간을 비교하였고, 동측 mPFC가 대조군보다 점화된 뇌에서 더 빠르게 활성화되었고(4.1±0.34초 대 2.8±0.26초, 비-점화된 대조군 대 점화됨, 홀름 조정된 p=0.044), 다른 영역에 대해서는 차이가 발견되지 않았다(홀름 조정된 p-값 > 0.3): 동측 복부 해마(4.2± 0.43s 대 4.4±0.76s), 안와전두 (4.2±0.51s 대 3.0±0.21s), 격막(4.6±0.62s 대 7.1±1.34s), 섬(7.1±3.94s 대 6.9±2.33s), 이상형(3.4±0.32s 대 3.4±0.33s), 내비강(9.8±3.06s 대 9.7±5.7s), 및 시간적 연관 피질(10.8±2.14s 대 8.6±3.46s).
10㎐ 복부 해마 자극의 기능적 네트워크와 광유전학적 발작 유도 동안의 관계. 본 발명자는 발작 및 비-발작 유도 자극 둘 모두가 복부 해마 회로를 활성화시켰기 때문에 광유전학적 발작 유도 동안 초기 회로 활성화가 10㎐ 복부 해마 자극에서와 유사한 영역을 모집하였다고 가정하였다. 두 네트워크 사이의 관계를 평가하기 위해, 본 발명자는 10㎐ 자극에서 활성이었다는 점을 감안할 때 발작 유도 네트워크에서 ROI가 활성화될 조건부 확률을 계산하였다.
각 발작에 대한 발작 유도 네트워크를 추정하기 위해, 본 발명자는 초기 10초 발작 유도 기간 동안 복셀-방식 최대 강도 값을 발견하였다. 복셀이 활성인 지의 여부를 결정하기 위해, 이미지를 이후 클래스내 분산을 최소화하는 Otsu의 방법을 사용하여 이진화하였다(비-점화된 군에 대한 평균 임역치는 2.49±0.17%이고, 점화된 군에 대한 평균 역치는 3.0±0.19%임, 평균±sem, t-검정 p=0.32). 본 발명자가 각 동물에서 2 내지 4회 발작이 있기 때문에, 본 발명자는 각 복셀이 활성화된 빈도를 계산한 다음 군 비교를 위해 발작의 수로 정규화하였다. 마지막으로, 본 발명자는 비교를 위해 발작 유도 네트워크를 생성하기 위해 군 수준에서 각 복셀에 대한 평균 활성화를 계산하였다. 시각적으로, 발작 유도 네트워크와 군 수준에서 역치이하 자극의 네트워크 사이에는 명백하고 현저한 유사성이 있었다. 본 발명자는 세그먼트화 환추를 사용하여 두 군 모두에서 ROI 활성화 부피를 정량화하고, 점화된 군의 가장 큰 것에서 가장 작은 것으로 부피를 분류하였다. 다중 비교 보정 후, 본 발명자는 임의의 ROI에 대해 어떠한 유의미한 차이도 검출하지 못했지만, 이는 본 발명자가 가진 적은 수의 동물 및 관련된 다중 비교의 수 때문일 수 있다. 본 발명자는 두 군 사이의 활성 복셀의 수를 조사하였고, 비-점화된 래트의 것보다 점화된 래트의 유도 네트워크에 더 많은 활성 복셀이 있음을 발견하였고, 이는 점화 후 발작 유도 네트워크가 더 크다는 가설을 뒷받침한다 (점화된 래트 및 비-점화된 래트에서 각각 3562±636 복셀 대 1784±347 복셀, t=2.64, p=0.025).
영상화 절차 및 자극 패러다임의 상이한 혈관 감도는 복셀 수준에서 네트워크를 비교하기 어렵게 하며, 따라서, 본 발명자는 조건부 확률의 계산을 위해 ROI 방식을 취하였다. 10㎐ 자극 네트워크 및 발작 유도 네트워크 둘 모두에 대해, 본 발명자는 5% 활성화 부피 역치를 사용하여 ROI가 활성인 지의 여부를 결정하였다. 이러한 모델의 견고성을 확인하기 위해, 본 발명자는 10㎐ 네트워크와 광유전학적 발작 유도 네트워크의 두 실험 군 사이의 활성화된 ROIS의 수를 비교하였고, 본 발명자가 군 사이의 유의미한 차이를 검출할 수 있음을 발견하였다(10㎐의 경우 비-점화된 = 5.6±1.4 ROI 대 점화된 = 16.8±2.6 ROI, t=4.10, p=0.002, 발작 유도의 경우 비-점화된 = 20.6±2.1 ROI 대 점화된 = 30.8±3.4 ROI, t=2.69, p=0.023).
본 발명자는 두 네트워크 사이의 관계를 조사하기 위해 개별 동물의 상응하는 10㎐ 네트워크에서 활성이었다는 점을 감안할 때 발작 유도 네트워크에서 ROI가 활성일 확률을 계산하였다. 조건부 확률의 분포는 가장 큰 것에서 가장 작은 것까지 및 또한 가장 일관된 것에서 가장 적은 것까지 10㎐ 네트워크에서의 활성화의 일관성에 의해 분류되었다. 비-점화 군에서, iVHip 및 iSept는 10㎐ 네트워크에서 및 유사하게 발작 유도 네트워크에서 가장 일관되게 활성이었다. iMePFC 및 iAmyg는 10㎐에서 지속적으로 활성인 다음 세트의 영역이었으며(4/7 동물에서 관찰됨), 이러한 ROI는 또한 후속 발작 유도에서 활성이었다. 점화된 래트에서, iVHip, iMePFC, iOrbFrC, iFrAssC, iSept, iStria, iTeAssC 및 iAmyg는 10㎐ 네트워크에서 활성이었고 또한 후속 발작 유도에서도 활성이었다.
전반적으로, 비-점화된 동물에서 평균 조건부 확률은 0.76±0.11이었고, 점화된 동물에서 0.89±0.05였으며, 이는 10㎐ 네트워크에서의 국소 활성화가 이전 스캔 12주 후에 발작 유도 동안 활성화된 네트워크의 활성화와 유사했음을 나타낸다. 또한, 이는 초기 활성이 발작 유도와 관련이 있으며 후속 활성이 이러한 네트워크의 활성화로부터 발생한다는 가설을 뒷받침한다.
동측 해마 활성 전파. 발작 유도 후, 본 발명자는 높은 진폭의 활성 클러스터가 수초에 걸쳐 iVHip에서 iDHip로 이동한 동물의 하위집단에서 동측 해마에서 현저한 현상을 관찰하였다. 본 발명자는 이러한 현상을 나타내는 발작에서 이러한 것을 특성화하고자 하였다(비-점화된 래트로부터 4마리 동물에서 8회 발작, 및 5마리의 점화된 래트로부터 15회 발작).
iVHip LFP 반응은 iVHip으로부터의 BOLD 신호와 중첩되며, 시점은 상응하는 fMRI로 강조된다. fMRI의 경우, 본 발명자는 시각화를 위해 iVHip 및 iDHip으로 2개의 슬라이스만 강조 표시합니다. 비-점화된 동물에서, 활성은 iVHip에서 시작하고, 점차적으로 iDHip로 극까지 이동한다. 활성은 전기사진술 발작의 종료 후에도 지속된다. 점화된 래트에서, 활성이 극 위로 이동함에 따라 유사한 패턴이 발생한다. 이러한 경우에, iDHip에 도달한 후, 활성은 겉보기에 대측 DHip로 넘어간다. 이러한 발작은 상이한 동물로부터 해마내 전파가 또한 명백한 것에 주목한다.
해마내 전파를 추가로 특성화하기 위해, 동측 해마를 가장 복부에서 가장 등쪽으로 4개의 영역으로 세그먼트화하였다. 본 발명자는 전파 시간을 추정하기 위해 가장 등쪽 및 대부분의 복부 영역에서 피크 대 피크 반응을 정량화하였고, 비-점화된 래트에서 평균 차이가 42.9초(범위 0 내지 66초)이고 점화된 래트에서 46.9초(범위 0 내지 118초)이었다. 이는 0.07 ㎜/s 내지 0.117 ㎜/s의 전파 속도로 해석된다.
물질 및 방법은 실시예 1에 기재된 바와 같다.
Claims (35)
- 뇌 발작(brain seizure)과 관련된 사건(event)의 분석을 위한 모델로서,
자극 시, 기능적 및 신경 회로 변화를 나타내는 신경 사건(neural event)을 제공하고; 단일 발작으로 인한 신경 사건의 분석을 가능하게 하는 점화된 동물 뇌(kindled animal brain)를 포함하는, 모델. - 제1항에 있어서, 상기 신경 사건의 분석이 전기생리학 및 자기 공명 영상(magnetic resonance imaging: MRI) 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는, 모델.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 신경 사건의 분석이 전기생리학 및 기능적 자기 공명 영상화(functional magnetic resonance imaging: fMRI)의 동시 측정으로 수행되는, 모델.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극이 전기적 자극이고, 관심 영역에 표적화되는, 모델.
- 제5항에 있어서, 상기 관심 영역이 해마인, 모델.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능적 및 신경 회로 변화를 나타내는 신경 사건이 국소 내지 양측 긴장성-간대(focal to bilateral tonic-clonic: FBTC) 발작, 흥분성 복부 해마(ventral hippocampal: VH) 네트워크의 변화, 역치이하 자극(sub-threhold stimulus)에 의해 촉발된 변화, 및 이동성 발작 코어(migrating seizure core)의 유도 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 기능적 및 신경 회로 변화를 나타내는 신경 사건을 제공하는 자극이 전기 자극인, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 전기 자극이 광유전학(optogenetics)에 의해 전달되는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 동물 뇌가 광 활성화 가능한 폴리펩타이드를 포함하도록 유전적으로 조작된 뉴런을 포함하는, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 광-활성화 가능한 폴리펩타이드가 채널로돕신(channelrhodopsin)인, 모델.
- 제10항에 있어서, 상기 채널로돕신이 흥분성 해마 뉴런에서 발현되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 모델.
- 제11항에 있어서, 상기 프로모터가 칼모듈린-의존성 키나제 II 알파(calmodulin-dependent kinase II alpha; CaMKIIα) 프로모터인, 모델.
- 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 사건을 제공하는 자극이 발작을 촉발시키는 역치 미만인, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 자극이 약 5㎐ 내지 약 15㎐인, 모델.
- 제13항에 있어서, 상기 자극이 기저 기능 회로 변화(underlying functional circuit change)를 평가하기 위해 적용되는, 방법.
- 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극이 발작을 촉발시키기에 충분한, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 자극이 약 35㎐ 내지 약 45㎐인, 모델.
- 제16항에 있어서, 상기 자극이 발작 회로 역학(seizure circuit dynamics)을 평가하기 위해 적용되는, 모델.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 이동성 발작 코어가 식별되는, 모델.
- 제19항에 있어서, 상기 이동성 발작 코어가 발작 삽입 구역(seizure inset zone)의 국소화에서 사용되는, 모델.
- 제20항에 있어서, SOZ가 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영(single-photon emission computed tomography: SPECT)에 의해 영상화되는, 모델.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 점화(kindling)가 전기자극, 광유전학 또는 화학적 처리를 이용하여 달성되는, 모델.
- 제22항에 있어서, 광유전학적 점화(optogenetic kindling)가,
a. 표적 뉴런에 광-활성화 가능한 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 뇌의 제1 영역으로 전달하는 것;
b. 점화를 유도하기에 충분한 주파수 및 펄스폭으로 상기 뇌의 제1 영역을 반복적으로 조명하는 것; 및
c. 단계 b를 여러 날의 과정에 걸쳐 반복하는 단계에 의해 수행되는 것
에 의해 수행되는, 모델. - 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물이 진정되고, 발작의 영상화 동안 움직임을 없애기 위해 속효성 신경근 차단제(short-acting neuromuscular blocker)로 처리되는, 모델.
- 제24항에 있어서, 상기 동물이 덱스메데토미딘(dexmedetomidine)으로 진정되고, 베쿠로늄(vecuronium)으로 차단되는, 모델.
- 간질(epilepsy)에 대한 치료적 개입을 개발하기 위한 방법으로서,
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 모델을 치료적 개입으로 치료하는 단계, 및 기능적 및 신경 회로 변화를 나타내는 신경 사건에 대한 효과를 결정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제26항에 있어서, 상기 치료적 개입이 외과적 치료적 개입인, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 치료적 개입이 전기적 치료적 개입인, 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 치료적 개입이 심부 뇌 자극(deep brain stimulation)을 포함하는, 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 치료적 개입이 약리학적 치료적 개입인, 방법.
- 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 사건이 발작을 포함하는, 방법.
- 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 사건이 이동성 발작 코어를 포함하는, 방법.
- 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 사건이 간질 동반질환(epileptic comorbidity)을 포함하는, 방법.
- 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 사건이 국소 내지 양측 긴장성-간대(FBTC) 발작을 포함하는, 방법.
- 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 사건이 흥분성 복부 해마(VH) 네트워크에서의 변경을 포함하는, 방법.
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