KR20220111204A - 세포내 pH 측정을 위한 나노탐침과 이를 이용하여 단일 세포 내의 pH를 측정하기 위한 방법 및 장치 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단일 세포 내의 pH를 측정하는 방법 및 장치와 이를 위한 나노탐침의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 단일 세포 내의 pH를 측정하는 방법은 (a) 광섬유의 테이퍼진 선단에 성장시킨 나노선(nanowire)에 pH에 반응할 수 있는 pH 반응성 형광 물질을 결합하여 형성된 나노탐침을 단일 세포 내에 삽입하는 것, (b) 상기 나노탐침에 상기 광섬유를 통해 광을 입사하는 것, (c) 상기 광에 의해 상기 pH 반응성 형광 물질이 여기되어 형광을 발생시키는 것, (d) 상기 세포의 pH에 따라 상기 형광 물질로부터 발생하는 형광 신호를 상기 광섬유를 통해 획득하는 것, 및 (e) 상기 형광 신호를 분석하여 세포 내의 pH 값을 얻는 것을 포함하여 이루어지고, 상기 나노탐침의 제조 방법은 (a) 나노선 물질 용액을 나노 피펫에 채우고 상기 나노 피펫을 아래로 내려 상기 나노선 물질 용액을 광섬유의 끝단에 접촉시키는 것, (b) 상기 나노 피펫을 상승시켜 상기 광섬유 끝단에 나노선(nanowire)을 성장시키는 것, (c) pH 반응성 형광 물질을 함유하는 수용액을 마이크로 피펫에 채우고 상기 마이크로 피펫을 아래로 내려 상기 나노선의 일부가 상기 수용액에 잠기도록 하는 것, 및 (d) 상기 마이크로 피펫을 상승시켜 pH 반응성 형광 물질로 표지된 나노탐침을 형성하는 것을 포함하여 이루어진다.
Description
본 발명은 단일 세포 내의 pH 측정에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단일 세포 내의 pH를 정확하게 측정할 수 있게 하는 나노탐침과 이를 이용하여 단일 세포 내의 pH를 측정하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
종래에는 세포들이 모두 균질(homogeneous)하다고 여겨 세포를 집단으로(collectively) 분석하였지만, 실제 개개의 세포들은 비균질(heterogeneous)하다는 사실이 최근에 밝혀졌다(Cell Cycle 12, 3640-3649 (2013) 참조). 이에 따라 최근에는 단일 세포의 개별적 특성을 분석하는 기술이 주목받고 있다(Nat. Cell Biol. 20, 1349-1360 (2018) 참조).
세포 특성과 연관된 인자들은 pH, mRNA, 단백질 등으로 다양하다. 그 중에서도 pH는 세포내 단백질 대사에 영향을 미쳐 세포 기능에 직접적인 영향을 주기 때문에 중요한 인자이다(J. Immunol. Methods. 221, 43-57 (1998) 참조). 세포내 pH 측정은 암과 같은 질병을 진단할 수 있는 기준으로 활용된다고도 알려져 있다(Biochemistry. 35, 2811-2817 (1996) 참조).
특히 암세포의 핵은 분열이 빨라 정상 세포의 핵과 pH가 다를 것으로 예상되고 있다(Chem. Soc. Rev. 46, 3830-3852 (2017); 및 Nat. Rev. Cancer. 11, 671677 (2011) 참조). 그러나, 세포 핵은 세포질 내 깊숙이 있을 뿐만 아니라 핵막으로 둘러 쌓여 있어 핵 내부의 pH를 측정하는 것은 매우 어렵다고 알려져 있다. 따라서 단일 세포질의 pH보다 단일 세포 핵 내의 pH를 측정하는 것은 더욱 어려운 기술이다.
이에 종래에는 단일 세포 내의 pH를 측정하기 위해 다음과 같은 방법들이 사용되었다.
먼저, 세포내 pH를 측정하기 위한 나노입자 삽입(Nanoparticle insertion) 기반 기술은 세포 내에 pH에 반응하는 형광 나노물질을 삽입한 후, 세포 외부에서 신호를 분석하여 pH를 측정한다(J. Am. Chem. Soc. 136, 12253-12256 (2014); Anal. Chem. 91, 8383-8389 (2019); 및 Analyst 145, 5768-5775 (2020) 참조). 그러나, 세포내 이물질 삽입으로 인해 자연 상태의 세포 분석이 불가능하고, 세포내 형광 나노물질 삽입의 무작위성 때문에 단일 세포 분석이 매우 어렵다. 또한, 세포내 신호를 세포 밖에서 측정하기에 빛의 산란이 불가피하여 pH 측정의 정확도가 떨어진다. 게다가, 단일 세포의 핵 내에 나노 물질을 삽입하는 것은 거의 불가능하여 핵 내의 pH 측정은 매우 어려운 것으로 알려져 있다.
또 다른 방법은 탐침 삽입(Probe insertion) 기반의 pH 측정 방법으로서, 세포 내로 pH에 반응하는 물질을 포함한 탐침을 삽입하여 세포내 pH를 측정하는 기술이 있다(Sensors Actuators, B Chem. 290, 527-534 (2019); 및 Analyst 145, 4852-4859 (2020) 참조). 이 방법에서는 테이퍼된 유리관(tapered glass capillary) 표면에 pH 반응성 물질을 결합하여 탐침을 제조한다. 따라서 탐침 팁(tip)에서 멀어질수록 탐침 직경이 굵어져서, 세포내 원하는 위치까지 삽입하게 되면 세포를 손상시킬 수 있다. 그리고, 레이저를 세포 외부에서 세포내 탐침을 향해 조사하고 그 반사된 빛을 다시 세포 외부에서 검출하는데, 이때 검출된 빛의 스펙트럼에서 'pH반응성 물질에 의해 발생된 스펙트럼'을 측정하여 세포 내의 pH를 측정하게 된다. 여기서 빛을 세포 외부에서 조사하고, 또 반사된 빛을 세포 외부에서 수신하기 때문에, 빛이 여러 매질을 통과하게 되는 과정에서 빛의 심한 산란이 불가피하여, 정확도가 떨어진다는 문제점이 있다.
이에 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 개발된 것으로, 세포내 삽입 시 세포의 오염 및 손상이 없이 단일 생세포 내의 pH를 실시간으로 정확하게 측정할 수 있는 나노탐침과 이를 이용한 단일 세포 내 pH 측정 방법 및 장치를 제공하는데 그 목적이 있다.
위와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 한 형태에 따르면, 단일 세포 내의 pH를 측정하는 방법은, (a) 광섬유의 테이퍼진 선단에 성장시킨 나노선(nanowire)에 pH에 반응할 수 있는 pH 반응성 형광 물질을 결합하여 형성된 나노탐침을 단일 세포 내에 삽입하는 것; (b) 상기 나노탐침에 상기 광섬유를 통해 광을 입사하는 것; (c) 상기 광에 의해 상기 pH 반응성 형광 물질이 여기되어 형광을 발생시키는 것; (d) 상기 세포의 pH에 따라 상기 형광 물질로부터 발생하는 형광 신호를 상기 광섬유를 통해 획득하는 것; 및 (e) 상기 형광 신호를 분석하여 세포 내의 pH 값을 얻는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 나노탐침의 제조 방법은, (a) 나노선 물질 용액을 나노 피펫에 채우고 상기 나노 피펫을 아래로 내려 상기 나노선 물질 용액을 광섬유의 끝단에 접촉시키는 것; (b) 상기 나노 피펫을 상승시켜 상기 광섬유 끝단에 나노선(nanowire)을 성장시키는 것; (c) pH 반응성 형광 물질을 함유하는 수용액을 마이크로 피펫에 채우고 상기 마이크로 피펫을 아래로 내려 상기 나노선의 일부가 상기 수용액에 잠기도록 하는 것; 및 (d) 상기 마이크로 피펫을 상승시켜 pH 반응성 형광 물질로 표지된 나노탐침을 형성하는 것을 포함하며, 이와 같은 방법에 의해 제조되는 본 발명에 따른 pH 측정을 위한 나노탐침은 광섬유; 상기 광섬유의 일 끝에 나노선 물질 용액이 성장하여 형성된 나노선; 및 상기 나노선의 일부에 표지된 pH 반응성 형광 물질을 포함하여 이루어진다.
본 발명에 있어서, 상기 나노선 물질 용액은 소수성 고분자 용액이며, 이러한 적어도 PVBN3, PVB-alkyne, PVB-COOH로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 광섬유는 테이퍼진 선단을 가지며, 상기 pH 반응성 형광 물질은 상기 나노선과 결합 가능한 작용기를 갖는 플루오레세인 분자 - 여기서, 플루오레세인은 적어도 DBCO-FAM, Azide-FAM, 또는 Amine-FAM으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있음 - 이다. 본 발명에 따르면, 상기 pH 반응성 형광 물질에 의한 상기 나노선의 젖음(또는 표지된) 길이는 100nm 내지 900nm, 바람직하게는 500nm 이하로 제어된다.
본 발명의 또 하나의 형태로서, 단일 세포 내의 pH를 측정하기 위한 장치는, 광섬유의 테이퍼진 선단에 성장시킨 나노선에 pH에 반응할 수 있는 pH 반응성 형광 물질을 결합하여 형성되는 나노탐침; 상기 단일 생세포 내에 상기 나노탐침을 삽입하도록 나노탐침의 3차원 이동제어가 가능한 조작기; 상기 광섬유에 광을 인가하는 광원; 상기 광섬유를 통해 입사된 광을 상기 나노탐침에 전달하고 상기 나노탐침에서 발생된 형광 신호를 추가의 광섬유를 통해 분광계에 전달하도록 광섬유들을 연결하는 광결합기; 및 상기 나노탐침에서 발생된 형광 신호로부터 스펙트럼 데이터를 분석하여 pH 값을 얻는 분광계를 포함하여 이루어진다.
본 발명에 있어서, 상기 나노탐침은 직경이 균일한 것일 수 있다. 상기 나노탐침은 직경이 10nm 내지 900nm, 바람직하게는 400nm 이하이고, 길이가 1μm 내지 10μm, 바람직하게는 5μm 이하이다.
본 발명에 있어서, 상기 광섬유를 통해 입사되는 광은 근적외선 또는 가시광선 영역의 광일 수 있으며, 상기 광은 파장이 300nm 내지 1000nm, 바람직하게는 400nm 내지 700nm 일 수 있다. 상기 광섬유를 통해 입사되는 광의 파장은 나노탐침의 성분, 형태 및 광학적 특성, 검출하고자 하는 표적 분자의 종류, 및 대상 세포의 종류에 따라 선택가능하다.
본 발명의 또 하나의 형태로서, 상기 나노선 물질 용액을 제조하기 위한 방법은, 무수 DMF 용매(0.7mL) 중 PVC(0.014g, 131mmol)와 아지드화 나트륨(0.010g, 220mmol)의 혼합물을 70°C의 호박색 바이알(amber vial) 내에서 섞고 알루미늄 호일로 덮어 빛을 차단하는 단계; 2시간 반응 후, 메탄올(0.5mL)을 첨가하고, 혼합 용액을 10,000rpm에서 1분간 원심분리하여 과량의 미반응 시약을 제거하고 아지드 작용성 폴리머(azide-functionalized polymer)를 침전시키는 단계; 및 얻어진 침전물을 진공 하에 1시간 동안 건조시킨 다음 NMP 용매(50 μL)를 첨가하여 용해시키는 단계를 포함할 수 있다.
국부적인 pH 모니터링을 통해 세포의 이질성과 신진대사를 이해하는 것이 중요함에도 불구하고, 세포와 세포소기관 막 너머의 단일 생세포의 시공간에 따른 pH 모니터링은 도전적인 일이다.
본 발명에서 발명자들은 직접적인 광 통신을 통해 원하는 세포 소기관에서 pH 역학(pH dynamics)의 현장 모니터링을 가능하게 하는 기계적 강도가 높은 나노탐침을 개발하였다. 폴리비닐벤질 아지드 나노선의 한쪽 끝에 플루오레세인(fluorescein)을 화학적으로 라벨링(labelling)함으로써, 생세포 내부의 서로 다른 구획들의 pH 변화를 지속적으로 모니터링하여 특정 세포 소기관의 pH 항상성과 자극에 따른 pH 조절을 성공적으로 관찰하였다.
중요하게는, 인간 세포 주기 동안, 핵이 휴지기에서는 pH 항상성을 나타내지만 유사분열기(mitotic phase)에서는 pH 변화를 나타내어 핵막에 의한 독립적인 pH 조절에 관여한다는 사실을 처음으로 입증하였다. 나노탐침의 빠르고 정확한 국부 pH 검출·전달(reporting) 기능은 다양한 생세포의 다양한 생물학적 상황에서 세포 거동을 조사하는데 매우 유용하다.
한편, 상술된 특징들에 따르면 본 발명은 다음과 같은 효과를 제공한다.
1) 본 발명에 따른 나노탐침을 이용한 단일 세포 내의 pH를 측정하기 위한 장치를 이용하면, 세포내 삽입 시 세포의 오염 및 손상이 없이, 단일 세포 내부의 위치별로 pH를 정확하게 측정할 수 있다.
2) 본 발명에 따른 pH 측정 장치를 이용하면, 세포내 삽입 시 세포의 오염 및 손상이 없이, 단일 세포 내부에서 시간이나 환경의 변화에 따른 pH의 변화를 실시간으로 측정할 수 있다.
3) 본 발명에 따른 pH 측정 장치를 이용하면, 세포내 삽입 시 세포의 오염 및 손상이 없이, 단일 세포의 세포질과 세포 핵의 pH를 정확하게 측정할 수 있으며, 그 외 세포내 다른 소기관에서의 pH도 정확하게 측정할 수 있음은 물론이다.
4) 본 발명에 따른 pH 측정 장치를 이용하면, 단일 세포의 성장 중에 핵 내부의 pH 변화를 실시간으로 측정할 수 있다.
도 1은 단일 생세포 내에서 시공간에 따른 pH 변화를 검출·전달할 수 있는 나노탐침의 장치 구성도(a), 나노탐침의 전자현미경 사진(b), 및 이러한 나노탐침을 이용한 단일 생세포내 pH 검출을 보여주는 도면(c),
도 2는 PVC(Poly(vinylbenzyl chloride)) 및 PVBN3(Poly(vinylbenzyl azide))의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 그래프,
도 3은 테이퍼진 광섬유의 끝에 PVBN3 나노선을 만드는 단계를 나타낸 도면 및 사진,
도 4는 DBCO 기능화된 플루오레세인(FAM)의 PVBN3 나노선과의 결합 단계를 나타낸 사진,
도 5는 한천 겔에 삽입하여 나노탐침의 기계적 특성 평가를 나타낸 사진,
도 6은 나노선과 테이퍼 광섬유의 접합부에서의 광 손실 평가를 나타낸 사진,
도 7은 국부 pH 변화에 대한 나노탐침의 광학 반응을 나타낸 그래프 및 사진,
도 8은 나노탐침의 광 안정성과 재현성 시험 그래프,
도 9는 살아있는 헬라 세포에 나노탐침과 테이퍼 광섬유 삽입 사이의 세포 생존율을 비교한 사진,
도 10은 삽입된 나노탐침(녹색) 또는 테이퍼진 광섬유(회색)를 각각 세포질 및 핵으로부터 추출한 후 세포 생존율의 히스토그램을 도시한 그래프,
도 11은 세포내 환경을 대상으로 하는 pH 검정 곡선을 획득하기 위한 볼츠만 피팅을 도시한 도면,
도 12는 헬라 생세포 외부와 내부의 나노탐침의 pH 의존성 형광 신호의 조사 결과를 나타낸 사진 및 그래프,
도 13은 나노탐침을 이용한 단일 세포 전체 주기 동안 세포질과 세포핵 내에서의 pH값 모니터링 결과를 나타낸 이미지 및 그래프,
도 14는 유사분열기 동안 단일 헬라 생세포에의 나노탐침의 삽입을 나타내는, 공초점 현미경에 의해 관찰된 명시야 이미지 및 병합(명시야 및 형광) 이미지 사진,
도 15는 pH 측정을 위해 유사분열기(전기부터 세포질 분열까지) 동안 핵-특이적 헥스트 염료(흰색)로 염색된 헬라 세포의, 공초점 현미경으로 관찰된 병합(명시야 및 형광) 이미지 사진,
도 16은 외부 칼슘 이온에 반응하는 세포질 pH 변화를 나타낸 도면 및 사진,
도 17은 과량의 마그네슘 이온(5 mM)으로 처리된 헬라 세포의 세포질 pH의 실시간 측정 결과를 나타낸 사진 및 그래프,
도 18은 과량의 칼슘 이온(a)과 과도한 마그네슘 이온(b)으로 처리된 살아있는 헬라 세포의 병합(명시야 및 형광) 이미지 및 암시야 이미지 사진.
도 2는 PVC(Poly(vinylbenzyl chloride)) 및 PVBN3(Poly(vinylbenzyl azide))의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 그래프,
도 3은 테이퍼진 광섬유의 끝에 PVBN3 나노선을 만드는 단계를 나타낸 도면 및 사진,
도 4는 DBCO 기능화된 플루오레세인(FAM)의 PVBN3 나노선과의 결합 단계를 나타낸 사진,
도 5는 한천 겔에 삽입하여 나노탐침의 기계적 특성 평가를 나타낸 사진,
도 6은 나노선과 테이퍼 광섬유의 접합부에서의 광 손실 평가를 나타낸 사진,
도 7은 국부 pH 변화에 대한 나노탐침의 광학 반응을 나타낸 그래프 및 사진,
도 8은 나노탐침의 광 안정성과 재현성 시험 그래프,
도 9는 살아있는 헬라 세포에 나노탐침과 테이퍼 광섬유 삽입 사이의 세포 생존율을 비교한 사진,
도 10은 삽입된 나노탐침(녹색) 또는 테이퍼진 광섬유(회색)를 각각 세포질 및 핵으로부터 추출한 후 세포 생존율의 히스토그램을 도시한 그래프,
도 11은 세포내 환경을 대상으로 하는 pH 검정 곡선을 획득하기 위한 볼츠만 피팅을 도시한 도면,
도 12는 헬라 생세포 외부와 내부의 나노탐침의 pH 의존성 형광 신호의 조사 결과를 나타낸 사진 및 그래프,
도 13은 나노탐침을 이용한 단일 세포 전체 주기 동안 세포질과 세포핵 내에서의 pH값 모니터링 결과를 나타낸 이미지 및 그래프,
도 14는 유사분열기 동안 단일 헬라 생세포에의 나노탐침의 삽입을 나타내는, 공초점 현미경에 의해 관찰된 명시야 이미지 및 병합(명시야 및 형광) 이미지 사진,
도 15는 pH 측정을 위해 유사분열기(전기부터 세포질 분열까지) 동안 핵-특이적 헥스트 염료(흰색)로 염색된 헬라 세포의, 공초점 현미경으로 관찰된 병합(명시야 및 형광) 이미지 사진,
도 16은 외부 칼슘 이온에 반응하는 세포질 pH 변화를 나타낸 도면 및 사진,
도 17은 과량의 마그네슘 이온(5 mM)으로 처리된 헬라 세포의 세포질 pH의 실시간 측정 결과를 나타낸 사진 및 그래프,
도 18은 과량의 칼슘 이온(a)과 과도한 마그네슘 이온(b)으로 처리된 살아있는 헬라 세포의 병합(명시야 및 형광) 이미지 및 암시야 이미지 사진.
이하 첨부된 도면과 실시예들을 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 아래의 실시예에서는 발명을 설명함에 있어서 필연적인 부분들을 제외하고는 그 도시와 설명을 생략하기로 한다.
세포는 서로 다르다. 동일한 환경에서도 유전적으로 동일한 세포는 개별적 구획화로 인한 생명 활동으로 다양성(cell-to-cell variabilities)(예: 세포 형태, 증식, 성장 및 생존율)을 나타낼 수 있다(Stoeger, T., Battich, N. & Pelkmans, L. Passive Noise Filtering by Cellular Compartmentalization. Cell164, 1151-1161 (2016) 참조). 개별 세포의 다양한 거동을 이해하려면 생세포 내부의 생리적 매개변수(예: pH, 온도 및 산소 수준)의 변화를 측정하고 분석하는 것이 중요하다(Zhang, X. ai et al. Quadruply-labeled serum albumin as a biodegradable nanosensor for simultaneous fluorescence imaging of intracellular pH values, oxygen and temperature. Microchim. Acta 186, (2019) 참조). 특히, 핵, 미토콘드리아, 소포체(endoplasmic reticulum) 및 골지체(Golgi apparatus)처럼 세포소기관들은 때에 따라 생물학적 기능을 수행하므로, 서로 다른 세포소기관의 변화는 시간에 따라 개별적으로 모니터링되어야 한다(Jaworska, A., Malek, K. & Kudelski, A. Intracellular pH - Advantages and pitfalls of surface-enhanced Raman scattering and fluorescence microscopy - A review. Spectrochim. Acta - Part A Mol. Biomol. Spectrosc. 251, 119410 (2021), 및 Han, J. & Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem. Rev. 110, 2709-2728 (2010) 참조). 특히, 세포 대사 및 항상성의 서로 다른 수준으로 인해, 세포마다 시공간에 따른 pH 이질성이 있을 수 있다(Søndergaard, R. V., Henriksen, J. R. & Andresen, T. L. Design, calibration and application of broad-range optical nanosensors for determining intracellular pH. Nat. Protoc. 9, 2841-2858 (2014) 참조). 이론적으로는, 국부 pH는 연속적인 이화작용 또는 동화작용 과정에 의해 세포 분열 동안 변동할 것으로 예측되었으며, 세포 사멸 자극(apoptotic stimuli)에 의해 활성화될 경우, 프로그래밍된 세포 사멸이 미토콘드리아 기능 장애를 일으켜, 세포내 환경의 급격한 산성화로 이어진다(Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y. & Reed, J. C. Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: Early events that modulate caspase activation during apoptosis. Nat. Cell Biol. 2, 318-325 (2000) 참조).
국부적인 pH 변화의 중요성으로 인해, 실시간으로 세포내 pH를 검출·전달할 수 있는 시스템 개발에 대한 광범위한 연구가 진행되었다. 다양한 pH 반응성 분자 프로브(예: 형광 염료, 양자점 및 나노입자)는 전기천공 또는 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 불침투성 세포막을 뚫고 세포내로 들어가 pH 검출에 사용될 수 있다(He, C., Lu, K. & Lin, W. Nanoscale metal-organic frameworks for real-time intracellular pH sensing in live cells. J. Am. Chem. Soc. 136, 12253-12256 (2014); Dennis, A. M., Rhee, W. J., Sotto, D., Dublin, S. N. & Bao, G. Quantum dot-fluorescent protein fret probes for sensing intracellular pH. ACS Nano 6, 2917-2924 (2012); Shen, Y. et al. Organelle-targeting surface-enhanced Raman scattering (SERS) nanosensors for subcellular pH sensing. Nanoscale 10, 1622-1630 (2018); 및 Albertazzi, L., Storti, B., Marchetti, L. & Beltram, F. Delivery and subcellular targeting of dendrimer-based fluorescent pH sensors in living cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 18158-18167 (2010) 참조). 그러나, 자발적인 세포 내 삽입의 특성으로 인해, 프로브를 원하는 위치에 배치하는 것, 특히 막으로 둘러싸인 세포소기관 내부에 배치하는 것은 여전히 기술적인 과제로 남아있다. pH 반응성 형광 단백질은 조작된 세포 내부에 유전적으로 인코딩(encoded)될 수 있지만, pH 반응성 형광 단백질의 발현(expression)과 관련된 정교한 유전자 공학 및 단백질 트래피킹(protein trafficking)에 의한 이후의 수송은 대단히 어렵다(Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998); 및 Palmer, A. E., Qin, Y., Park, J. G. & McCombs, J. E. Design and application of genetically encoded biosensors. Trends Biotechnol. 29, 144-152 (2011) 참조). 대안으로, 나노피펫(Zhang, Y. et al. Spearhead Nanometric Field-Effect Transistor Sensors for Single-Cell Analysis. ACS Nano 10, 3214-3221 (2016); 및 Guo, J. et al. D ynamic single-cell intracellular pH sensing using a SERS-active nanopipette. Analyst 145, 4852-4859 (2020) 참조) 또는 광섬유(Yang, Q. et al. Label-free in situ pH monitoring in a single living cell using an optical nanoprobe. Med. Devices Sensors 3, 1-10 (2020) 참조)가 표적 세포에 직접 삽입되었다. 그러나, 프로브의 크기와 모양을 정확하게 제어하지 않으면, 막에 구멍을 뚫는 것은 세포에 치명적이다. 또한, 나노구조 물질의 표면 변형 및 조작의 어려움으로 인해 pH 검출을 국부화할 수 없었고, 약한 검출 신호는 복잡한 세포 환경에 의해 쉽게 왜곡되었다(Yan, R. et al. Nanowire-based single-cell endoscopy. Nat. Nanotechnol. 7, 191-196 (2011); 및 Lin, L. et al. Real-time tracing the changes in the intracellular pH value during apoptosis by near-infrared ratiometric fluorescence imaging. Chem. Commun. 54, 9071-9074 (2018) 참조). 그러므로, 단일 생세포의 다수의 불투과성 막을 가로질러 세포 내 소기관별로 실시간 pH 모니터링을 가능하게 하는 기술은 여전히 개발이 필요한 상태이다.
본 발명에서 발명자들은 직접 광 통신을 통해 원하는 세포 구획의 pH 변화를 모니터링할 수 있는 기계적 강도가 높고 직경이 충분히 작은 나노탐침을 제작하였다. 본 발명에 따른 폴리비닐벤질아지드(PVBN3) 나노선(nanowire)은 구조적으로 강하고, 세포막 및 세포소기관 막을 관통하기에 충분한 길이이지만, 직경이 작기(200nm 이하) 때문에 세포 손상이나 누설은 무시할 수 있을 정도로 매우 적다. 나노탐침의 끝에 화학적으로 라벨링된(labelled) 고밀도 플루오레세인(Fluorescein)은 국부적인 pH 변화에 신속하게 반응할 수 있으며, 나노탐침을 통해 pH-반응성 광발광(photoluminescence; PL) 신호가 분광계에 직접 전송(<100ms)되어, 광학 손실과 주변 노이즈에 따른 신호 왜곡을 최소화한다. 본 발명에 따른 현장(in-situ) pH 검출 시스템을 사용하여, 단일 생세포 내부의 다양한 구획들의 pH 변화를 지속적으로 모니터링하여 특정 세포소기관의 pH 항상성(organelle-exclusive pH homeostasis) 및 자극에 따른 pH 조절(stimuli-selective pH regulations)과 같은 여러 과학적 정보를 얻을 수 있었다. 특히, 세포 주기 동안 핵이 휴지기에서는 pH 항상성을 나타내지만 유사분열기에서는 pH 변동을 나타내어, 핵막이 독립적으로 pH 조절에 관여한다는 사실을 처음으로 입증하였다. 이것은 단일 생세포의 국부 pH 모니터링으로 세포내의 이벤트들(subcellular events)의 라이브 스트리밍을 가능하게 한 본 발명의 나노탐침의 고유한 기능에 기인한다.
본 발명에서 단일 세포내 pH 측정은, 먼저 pH에 반응할 수 있는 직경이 균일한 나노탐침을 테이퍼진 광섬유(tapered optical fiber)의 선단에 직접 성장시켜 형성하는 것에서부터 시작된다. 이러한 나노탐침은 표면에 pH 반응성 형광 물질을 포함하는 것으로, 나노탐침의 형성 방법은 아래의 실시예에서 도 3을 참조하여 설명된다. 참고로, 여기서 '단일 세포'는 살아있는 단일 생세포와 죽은 단일 세포까지 포함하는 것을 의미한다. 또한, '단일 세포내 pH 측정'은 세포 핵 뿐만 아니라 세포질, 다른 세포내 소기관의 pH 측정까지 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 단일 세포내 pH 측정 방법은 나노탐침을 세포 내로 삽입하여 세포의 pH에 따라 발생하는 형광 신호를 광섬유를 통해 취득하여 직접 분석함으로써 세포 내부의 pH를 정확하게 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 단일 세포내 pH 측정 방법은 세포의 pH가 시간이나 환경에 따라 변화하면, 그에 따른 형광 신호의 변화를 직접 측정함으로써 실시간으로 세포 내의 pH 변화를 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 단일 세포내 pH 측정 방법은 나노탐침의 직경이 충분히 작고 균일하여 세포의 손상이 거의 없으며, 세포 내의 원하는 위치에서 신호를 직접 받음으로써 세포내 위치별로 정확한 pH의 측정이 가능하다.
[실시예]
도 1은 단일 생세포 내에서 시공간에 따른 pH 변화를 검출할 수 있는 나노탐침의 구조의 설계 구성 및 이러한 나노탐침을 이용한 단일 생세포내 pH 검출을 나타낸 것으로, 도 1a는 직접적인 광통신을 통해 실시간으로 세포내 구획의 현장 pH 모니터링을 위한 나노 탐침 시스템의 전체 모식도이다.
나노탐침(Nanoprobe 또는 Nanowire waveguide; 1)은 광섬유(2)의 테이퍼진 선단(3; 도 1b 참조)에 성장시킨 나노선(nanowire)에 pH에 반응할 수 있는 pH 반응성 형광 물질을 결합(도 4a 내지 4g 참조)하여 형성된 것으로, 광원(레이저발생기; 4)으로부터 제1 광섬유(2a)로 입사된 레이저는 광섬유(2)를 통해 나노탐침(1)에 도달된다(하늘색 화살표).
본 실시예에서 광섬유(2)는 광원(4)으로부터 입사되는 광(예: 레이저빔)을 나노탐침(1)에 전달하기 위한 제1 광섬유(2a)와 나노탐침 표면의 형광 물질로부터 발생하는 형광 신호를 분광계(8)로 전달하기 위한 제2 광섬유(2b)로 분기되고, 이들 제1 광섬유(2a)와 제2 광섬유(2b)는 광결합기(fiber coupler;5)를 통해 하나로 결합되어 나노탐침(1)으로 이어진다. 광결합기(5)는 제1 광섬유(2a)로 입사되는 광이 나노탐침(1)에만 전달되도록, 그리고 나노탐침(1) 표면의 형광 물질로부터 발생하는 형광 신호가 분광계(8)로만 전달되도록 광의 진행을 가이드한다.
나노탐침(1)은 3차원 이동제어가 가능한 조작기(manipulator;6, 마이크로미터 해상도)를 이용하여 단일 생세포(7) 내로 삽입된다(도 1c 참조). 생세포 내에 나노탐침을 위치결정(positioning)하는 것은 공초점 형광 현미경(confocal fluorescence microscopy)으로 관찰하면서 3축 미세 조작기(6)로 정밀하게 제어할 수 있다. 이때, 광원(4)으로부터 제1 광섬유(2a)와 광결합기(5)를 통해 나노탐침(1)에 도달한 광(레이저빔)은 소멸파(evanescent wave)를 발생시키고 나노탐침 끝에 있는 pH 반응성 형광 물질을 여기시켜 pH 반응성 형광물질이 광발광(PL) 신호를 방출하게 된다. 이 신호는 나노탐침(1)을 통해 광섬유(2)에 전달된 후, 광통신에 환경 간섭을 받지 않고 광결합기(5)에 의해 제2 광섬유(2b)로 가이드되어 분광계(spectrometer; 8)에 직접 전달된다(녹색 화살표). 이러한 과정을 통해 분광계(8)에서 얻어진 형광의 스펙트럼 데이터로부터 pH 값을 측정하게 되는데, 이 경우 세포 내부(도 1c 참조)에서 나노탐침(1)의 형광신호를 왜곡이 없이 분광계(8)로 직접 측정하기 때문에 정확한 pH 값의 측정이 가능하다.
도 1b는 테이퍼진 광섬유의 끝 부분에 직접 성장된 본 발명의 나노탐침의 전계 방출 주사 전자 현미경 이미지(스케일 바 1μm)를 나타내고, 도 1c는 세포 혹은 세포소기관의 단단한 막을 가로질러 생세포의 국부 pH 모니터링하는 이미지를 나타낸다. 본 발명의 길고 얇은 나노탐침은 기계적으로 견고하면서도 막 침투 과정에서 세포 누출을 유발하지 않으며, 형광 라벨링된 끝단은 현장 pH 검출을 위해 원하는 위치(세포질 또는 핵에서)에 쉽게 도달할 수 있다(삽입도 참조). 세포내 국부적인 양성자(proton) 농도에 따라, PL 신호의 강도가 빠르게 변하며, 이는 나노탐침을 통해 실시간으로 모니터링될 수 있다.
본 발명에서 나노탐침(1)은 세포막 뿐만 아니라 핵막도 관통할 수 있는 것으로, 그러기 때문에 세포질 뿐만 아니라 핵 내의 pH 측정도 가능하다(도 1c 참조; 물론 다른 세포내 소기관의 pH 측정도 가능하다). 또한, 나노탐침(1)은 직경(d; 10nm 내지 900nm, 바람직하게는 400nm 이하)이 충분히 작으므로 세포 손상이 없는 장점이 있다. 또한, 나노탐침(1)은 길이(l; 1μm 내지 10μm, 바람직하게는 5μm 이하)가 충분히 작으므로 세포내 특정 위치로 위치시켜 원하는 위치(세포질, 세포 핵 등)에서 pH 측정이 가능하다. 뿐만 아니라, 나노탐침(1) 표면의 pH 반응성 형광 물질은 양성자(proton)와 순간적인 화학 평형을 이루기 때문에 세포 내에서 시간이나 환경의 변화에 따른 pH 값의 변화를 실시간으로 정확히 측정할 수 있다.
본 발명에서 광섬유(2a)를 통해 입사되는 광원은 레이저 또는 LED 등으로서, 근적외선 또는 가시광선 영역의 광일 수 있고, 바람직하게는 300nm 내지 1000nm 파장의 광일 수 있으며, 더 바람직하게는 400nm 내지 700nm 파장의 광일 수 있다. 하지만, 이용할 수 있는 광의 파장은 이에 한정되지 않으며, 나노탐침(광나노도파관)의 성분, 형태 및 광학적 특성, 검출하고자 하는 표적 분자의 종류, 대상 세포의 종류 등에 따라 임의로 선택될 수 있다.
고분자 나노선의 한쪽 끝에 pH 반응성 형광 염료(Alvarez-Pez, J. M., Ballesteros, L., Talavera, E. & Yguerabide, J. Fluorescein excited-state proton exchange reactions: Nanosecond emission kinetics and correlation with steady-state fluorescence intensity. J. Phys. Chem. A 105, 6320-6332 (2001) 참조) - 여기서, pH 반응성 형광 염료는 나노선과 결합가능한 작용기를 갖는 플루오레세인(DBCO-FAM, Azide-FAM, Amine-FAM 등으로 이루어진 군으로부터 선택 가능) 분자임 - 를 화학적으로 라벨링(labelling)하여, 단일 생세포에서 시간 경과에 따른 국부 pH 현장 모니터링에 적합한 나노탐침을 성공적으로 제조하였다(도 1a). 구체적으로, 폴리비닐벤질아지드(PVBN3) 용액(Mn 52,000g/mol)(도 2)의 증발에 의해, PVBN3 나노선이 테이퍼진 광섬유의 끝 부분에 직접 성장되었으며(도 1b 및 도 3), 광섬유는 1x2 광섬유 커플러에 의해 레이저 소스와 분광계에 연결되었다(아래의「방법」참조). 나노선의 표면이 아지드 작용기(azide moieties)(-N3)로 가득 차 있기 때문에, 일 예로 디벤조사이클로옥틴(DBCO) 기능화된 플루오레세인(FAM)과의 결합으로 나노선의 끝(길이 100nm 내지 900nm, 바람직하게는 500nm 이하)이 카퍼-프리 클릭 반응(copper-free click reaction)을 통해 고밀도 pH 리포터(reporters)로 선택적으로 변환될 수 있었다(도 4). 중요하게는, 본 발명의 나노탐침은 여기 레이저(하늘색 화살표)와 국부화된 플루오레세인으로부터의 PL 신호(녹색 화살표)의 우수한 양방향 광신호 전송경로의 역할을 하였다. PL 신호가 분광계로 직접 전송됨에 따라, 나노탐침 주변 환경에 관계없이 원하는 위치에서의 양성자(proton) 농도에 따라 변하는 PL 스펙트럼의 세기가 실시간으로 측정되었다(도 1 참조).
본 발명에 따른 나노탐침의 물리적 특성과 광학적 특성은 생세포 내부의 세포내 pH를 검출·전달하는데 매우 적합하였다. 세포 손상을 최소화하는 나노선 직경에 대한 이전 연구(Obataya, I., Nakamura, C., Han, S. W., Nakamura, N. & Miyake, J. Direct insertion of proteins into a living cell using an atomic force microscope with a nanoneedle. Nanobiotechnology 1, 347-352 (2005) 참조)에 기초하여, 본 발명의 Confined-growth method (Je, J. H.; Yang, U.; Oh, S. S.; Yong, M. J.; Kang, B. H. Method of forming micro-or nanowires at predetermined positions of an object using a micro- or nanopipette, US Patent 17,306,220, May 3, 2021 참조)에 의해 정확하게 제어된 200nm 이하의 직경의 나노탐침을 준비하였다(도 1b). 직경이 작음에도 불구하고, PVBN3(E - 1.7 GPa)의 높은 탄성계수(Bicerano, J. Prediction of Polymer Properties, 2nd ed. (Marcel Dekker, New York, 1996) 참조)로 인해 나노탐침은 단단한 막을 쉽게 관통할 수 있었다; 실제 세포막(E - 0.05 GPa)보다 높은 탄성계수(> 0.1 GPa)(Wang, K. et al. Specific membrane capacitance, cytoplasm conductivity and instantaneous Young's modulus of single tumour cells. Sci. Data 4, 1-8 (2017) 참조)를 나타내는 것으로 알려진 한천(agar gel)에 나노탐침을 삽입했을 때, 구조 변형이 관찰되지 않았다(도 5 참조). 중요하게는, 세포 환경의 굴절률(1.37 이하)(Liu, P. Y. et al. Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: Past, present and future. Lab Chip 16, 634-644 (2016) 참조)보다 높은 PVBN3의 굴절률(1.67 이하)(kJames, J., Hanna, J. M. & Subila, K. B. Refractive Index Engineering using Polymer Nanocomposites. (PhD thesis, University of South Brittany, France, 2019) 참조), 및 나노탐침과 테이퍼진 광섬유 사이의 매끄러운 접합을 포함하는, 나노탐침의 고유한 특성들은 현장(in situ) 및 실시간 pH 모니터링에 적합하였다. 접합부에서의 산란은 무시할 수 있을 정도로 매우 적기 때문에(도 6), 플루오레세인의 국부 형광 신호는 쉽게 수집되고 84%보다 큰 효율로 전송되었다(Lee, J. et al. Quantitative Probing of Cu2+ Ions Naturally Present in Single Living Cells. Adv. Mater. 28, 4071-4076 (2016) 참조).
도 2는 PVC(Poly(vinylbenzyl chloride)) 및 PVBN3(Poly(vinylbenzyl azide))의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
상측 패널: DMSO-d6에서 PVC의 1H 스펙트럼. 여기에는 7.30-6.00ppm의 방향족 고리(b), 4.81-4.38ppm의 -CH2Cl(c) 및 1.87-1.04ppm의 PVC 백본의 메틸렌(a)이 포함된다. 하측 패널: DMSO-d6의 PVBN3의 1H 스펙트럼. 여기에는 7.30-6.00ppm의 방향족 고리(b), 4.35-3.80ppm의 -CH2N3(c') 및 1.87-1.04ppm의 메틸렌(a)이 포함된다. -CH2의 4.5ppm(PVC, c)에서 4.2ppm(PVBN3, c')로의 이동은 염화물이 아지드로 치환되었음을 나타내며, PVBN3의 합성이 성공적임을 나타낸다. 모든 1H-NMR 스펙트럼은 실온에서 용매로서 DMSO-d6을 사용하여 500MHz에서 기록되었다. 모든 H-NMR 스펙트럼의 화학적 이동은 BRUKER AVANCE Ascend 500에 의한 DMSO-d6의 잔류 신호(δ2.50)를 기준으로 한다.
도 3은 테이퍼진 광섬유의 끝에 PVBN3 나노선을 만드는 단계를 도시한 것으로, 도 3a는 나노선 제조를 위해 본 출원인이 직접 제작한 장치를 이용하여 테이퍼진 광섬유의 끝에 PVBN3 나노선을 성장시키는 과정을 개략적으로 나타내고 있다.
도 3b는 테이퍼진 광섬유의 끝에 성장된 PVBN3 나노선을 확대하여 나타낸 것으로, 이러한 PVBN3 나노선의 성장 과정은 도 3c 내지 3f를 참조하여 상세히 설명된다. 먼저, 도 3c에 따르면, 나노선 물질 용액, 즉 PVBN3 용액을 유리 나노 피펫에 채우고 나노피펫을 수직으로 내려서 테이퍼진 광섬유의 팁과 접촉시킨다. 본 발명에서 나노선 물질 용액은 바람직하게는 소수성 고분자 용액(예를 들어, PVBN3 , PVB-alkyne, PVB-COOH 등으로 이루어진 군으로부터 선택 가능)이다.
도 3d에 따르면, 나노피펫의 팁은 테이퍼진 광섬유의 팁과 접촉한다. 도 3e에 따르면, 나노피펫을 수직으로 끌어올리면 PVBN3 용액의 용매가 증발함에 따라 테이퍼진 광섬유의 끝단에 성장한 PVBN3 나노선이 형성된다. 도 3f는 테이퍼진 광섬유의 끝에 성장한 자립형(freestanding) PVBN3 나노선을 나타낸다(스케일 바, 10μm).
도 4는 DBCO 기능화된 플루오레세인(FAM)의 PVBN3 나노선에의 결합 과정을 도시한 것으로, 도 4a에 따르면, pH 반응성 형광 염료인 DBCO-FAM 분자를 함유하는 수용액(100 nM)을 상술한 도 3에 따라 테이퍼진 광섬유의 끝단에 성장된 PVBN3 나노선의 표면과 결합(접합)시키는 방법이 개략적으로 도시되어 있다. 보다 구체적으로, 도 4b에 따르면, 유리 마이크로피펫에 DBCO-FAM 분자를 함유하는 수용액(100 nM)을 채운 상태로 유리 마이크로피펫을 PVBN3 나노선을 향해 수직으로 내려 도 4c에 도시된 바와 같이 나노선의 끝단을 유리 마이크로피펫 내의 수용액 속에 담근다. 도 4c에서 DBCO-FAM 분자는 카퍼-프리(copper-free) 클릭 반응(Campbell-Verduyn, L. S. et al. Strain-promoted copper-free 'click' chemistry for 18F radiolabeling of bombesin. Angew. Chemie - Int. Ed. 50, 11117-11120 (2011) 참조)에 의해 PVBN3 나노선의 아지드(azide) 그룹에 결합(접합)된다. 이 상태에서 피펫을 위로 올리면 도 4d에 도시된 바와 같이 FAM으로 표지(FAM-labeled)된 나노탐침이 형성된다(스케일 바, 10μm). 도 4e는 공초점 현미경으로 얻은 테이퍼진 광섬유 상에 성장된 나노탐침의 명시야 이미지, 도 4f는 암시야 이미지, 및 도 4g는 병합 이미지를 각각 나타낸다. 암시야 이미지(도 4f)에서 녹색 형광 신호는 나노탐침의 끝단에서 명확하게 관찰되지만 나노선의 나머지 부분과 테이퍼진 광섬유 표면에서는 형광 신호가 감지되지 않는다. 끝단 형광은, 250 nm의 위치 정확도를 갖는 고정밀 x-y-z 모터 스테이지를 사용하여 나노선의 젖음 깊이(wetting depth)를 정밀하게 조정함으로써, 길이 100nm 내지 900nm, 바람직하게는 500nm 이하로 제어된다.
도 5는 한천 겔에 삽입하여 나노탐침의 기계적 특성 평가를 나타낸 것으로, 도 5a 내지 5c에 따르면, 삽입 공정 전(a), 중간(b), 후(c)의 명시야 이미지가 도시된다. 여기서, 노란색 점선은 한천 겔의 표면을 나타낸다. 이 분석에서 삽입 이후 나노탐침의 변형이 거의 없다는 사실을 확인할 수 있다(스케일 바, 10μm).
도 6은 나노선과 테이퍼 광섬유의 접합부에서의 광 손실 평가를 나타낸 것으로, 도 6a 내지 6b에 따르면, 나노선 유도 레이저 광(473nm)의 명시야 이미지(도 6a) 및 암시야 이미지(도 6b)가 도시된다. 나노탐침의 선단(황색 파선 원)에서는 광산란이 관찰되는 반면, 접착부위(흰색 파선 원)에서는 광산란이 거의 없다(스케일 바, 10μm).
도 7은 국부 pH 변화에 대한 나노탐침의 광학적 반응을 나타낸 것으로, 신속한 pH 변화를 측정할 수 있고, 삽입 시 세포 손상이 무시할 수 있을 정도로 적으며, 복잡한 세포내 환경에서도 pH에 선택적으로 반응하는 나노탐침의 특성을 나타낸다.
도 7a에 따르면, 액적의 pH를 4에서 8로 변경시켰을 때(삽입도 참조), 침지된 나노탐침은 레이저(λ = 473 nm) 여기 시 pH에 따른 PL 스펙트럼 변화를 성공적으로 보였다. 도 7b에 따르면, 시간에 따른 형광 신호(λ = 535 nm)는 pH 변화에 대한 빠른 반응(<100ms)으로 인해 나노탐침에 의해 실시간으로 모니터링되었다. 파란색 화살표와 빨간색 화살표는 각각 산성 및 염기성 용액의 주입 지점을 나타낸다. 도 7c에 따르면, 나노탐침(파란색 화살표, 직경 200nm 이하)은 생세포에 쉽게 삽입될 수 있었지만(위), 테이퍼진 광섬유(빨간색 화살표, 팁 직경 200nm 이하)는 심각한 세포 손상과 누출을 유발하였다(아래). 세포의 생존 여부 확인을 위해, 헬라(HeLa) 세포를 칼세인(calcein)-AM(녹색)과 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)(빨간색)로 염색하였다(스케일 바 10μm). 도 7d에 따르면, pH 5 내지 9 (n=3) 범위에서 니제리신(nigericin) 처리된 세포에서 표준화된 PL 피크 강도(I535/I685)를 측정한 후 볼츠만(Boltzmann) 함수(R2 = 0.9969)로 피팅하여 pH 검정 곡선(빨간색)을 얻었다. pH 7.5(n=3)에서 니제리신을 처리한 헬라 세포에서 측정한 바와 같이, 세포 내부(회색)와 외부(파란색)의 정규화된 PL 피크 강도가 동일하므로 세포내 및 세포외 pH 값이 동일함을 나타낸다(삽입도 참조).
마이크로 광발광 시스템(도 1a)을 사용하여 pH 값이 4에서 8까지의 다양한 용액에서 나노탐침의 pH 반응성을 조사하였다(도 7a). 나노탐침을 서로 다른 pH 액적(완충액, 5μl)에 담글 경우, 레이저 여기(λ = 473nm)시 pH-의존적 PL 스펙트럼이 성공적으로 얻어졌으며, 535nm(I535)에서 PL 피크 강도는 플루오레세인(fluorescein)의 잘 알려진 pH-의존적 특성(Alvarez-Pez, J. M., Ballesteros, L., Talavera, E. & Yguerabide, J. Fluorescein excited-state proton exchange reactions: Nanosecond emission kinetics and correlation with steady-state fluorescence intensity. J. Phys. Chem. A 105, 6320-6332 (2001) 참조)과 일치하여, pH가 증가함에 따라 점진적인 증가를 보였다. 685nm(I685)에서 PL 강도는 pH가 증가함에 따라 무시할 수 있을 정도의 변화를 나타내므로, 나머지 pH 모니터링에 대한 참조 신호로 사용되었다. 중요하게는, 나노탐침은 형광 검출에서 우수한 광안정성과 재현성을 나타냈으며, 18초의 연속 레이저 노출에 대해 PL 피크 강도의 변화가 무시될 만큼 작게 관찰되었고(도 8a), pH 5.0 내지 7.5의 주기적 변화 동안 PL 피크 강도가 가역적으로 변경되었다(도 8b).
나노탐침을 통한 PL 스펙트럼은 매우 짧은 시간(<100ms) 내에 pH 변화에 반응하였다(도 7b). 예를 들어, pH 7.5의 나노선을 담근 액적을 pH 6.8로 빠르게 변화(산성화)시켰을 때(도 7b, 파란색 화살표), PL 피크 강도는 100ms 이내의 시간 사이에 급격히 감소하였다. 반대로, 이 약산성 액적을 염기성 완충용액과 빠르게 혼합하면, PL 피크 강도가 급격히 증가하여 최종 pH가 7.2임을 보여주었다(도 7b, 빨간색 화살표). 플루오레세인이 양성자, H+과 순간적으로 반응(Alvarez-Pez, J. M., Ballesteros, L., Talavera, E. & Yguerabide, J. Fluorescein excited-state proton exchange reactions: Nanosecond emission kinetics and correlation with steady-state fluorescence intensity. J. Phys. Chem. A 105, 6320-6332 (2001) 참조)함에 따라, pH 반응성 거동의 속도 결정 단계(rate-determining step)가 액적에서의 양성자 확산(proton diffusion)이 될 것이라는 것은 잘 알려져 있다. 세포내 유체의 양성자 확산 속도가 완충 용액의 양성자 확산 속도와 크게 다르지 않다는 점(Zaniboni, M. et al. Intracellular proton mobility and buffering power in cardiac ventricular myocytes from rat, rabbit, and guinea pig. Am. J. Physiol. - Hear. Circ. Physiol. 285, 1236-1246 (2003) 참조)을 고려하면, pH 변화에 대한 빠른 형광 반응은 본 발명의 나노 탐침 시스템이 다양한 세포내 환경에서도 실시간으로 pH 변화를 모니터링할 수 있음을 의미한다.
생세포내 pH 모니터링을 위한 나노탐침의 적용 가능성
본 발명의 나노탐침이 생세포에 주입되었을 때, 나노탐침을 깊게 주입했음에도 세포가 심하게 손상되지 않았다(도 7c). 세포 생존 여부의 실시간 관찰을 위해, 헬라 세포를 생세포와 죽은 세포에서 각각 녹색 및 적색 형광을 방출하는 칼세인(calcein)-AM 및 프로피디움 요오드화물(propidium iodide;PI)로 염색하였다. 미세 직경(200nm 이하)과 균일한 구조(도 1b)로 인해, 본 발명의 나노탐침은 삽입 및 추출 후 10분 동안에 세포에 손상을 일으키지 않았다(도 7c, 상측 패널). 중요하게는, 적색 형광 신호가 측정되지 않으므로, 발명자들은 나노선 삽입 중 또는 추출 후에도 PI 염료가 세포내 공간에 들어가지 않는다는 것을 발견하여 세포막이 잘 보존되었음을 확인하였다(도 7c 및 도 9). 더욱이, 세포 형태는 추출 후에도 분명히 영향을 받지 않았으며, 이는 본 발명의 pH 검출 시스템이 막 파열 및 변형을 유발하지 않음을 의미한다.
반대로, 전형적인 원뿔 모양의 테이퍼진 광섬유(팁 직경: 200nm 이하)의 삽입은 삽입 지점에서 세포내 액 누출과 함께 막 파열로 인한 세포 사멸로 이어졌다(도 7c, 하측 패널 및 도 9). 나노탐침과 테이퍼진 광섬유를 헬라 세포의 세포질과 핵에 삽입하여 세포 생존율을 비교했을 때, 본 발명의 나노탐침이 테이퍼진 광섬유(세포질에서 33%(n=20), 핵에서 25%(n=20)) 보다 확실히 더 높은 세포 생존율(세포질에서 100%(n=20), 핵에서 100%(n=20))을 보였다(도 10). 발명자들은 나노 탐침 시스템 삽입 시 세포 생존률이 바이오센싱(bio-sensing) 프로브를 위한 캐리어로 사용되는 기존 시스템들보다 높다는 점을 확인하였다(표 1 참조).
| 유형 | 세포 생존율 | 비고 |
| 나노탐침 | 100% | 본 발명 |
| 테이퍼진 광섬유 팁들 | 33% | |
| 테이퍼진 광섬유 팁들 | 42% | Yan, R. etal.Nanowire-basedsingle-cellendoscopy.Nat.Nanotechnol.7, 191-196 (2011) 참조 |
| bPEI (Branched polyethylenimine) | 66% | Arif, M., Tripathi, S. K., Gupta, K. C. & Kumar, P. Self-assembled amphiphilic phosphopyridoxyl-polyethylenimine polymers exhibit high cell viability and gene transfection efficiency in vitro and in vivo. J.Mater.Chem.B1, 4020-4031 (2013) 참조 |
| 리포펙타민( Lipofectamine) | 36% | |
| 실리카 나노입자(Silica nanoparticle) | 90% | Wang, L. etal. A novel cell-penetrating Janus nanoprobe for ratiometric fluorescence detection of pH in living cells. Talanta209, 120436 (2020) 참조 |
| PS-co-PNIPAM 히드로겔(hydrogel) | 85% | Liu, H. etal. Dual-emission hydrogel nanoparticles with linear and reversible luminescence-response to pH for intracellular fluorescent probes. Talanta 211, 120755 (2020) 참조 |
| GO 글리코시트(glycosheets) | 65% | Ji, D. K. etal. Targeted Intracellular Production of Reactive Oxygen Species by a 2D Molybdenum Disulfide Glycosheet. Adv. Mater .28, 9356-9363 (2016) 참조 |
다음으로, 발명자들은 나노탐침을 통한 pH 모니터링이 복잡한 세포 환경 속에서도 높은 정확도를 보장한다는 것을 검증했다(도 7d). 세포내 pH를 체계적으로 조작하기 위해, 헬라 세포를 K+/H+-이온원 니제리신(ionophore nigericin)(Llopis, J., McCaffery, J. M., Miyawaki, A., Farquhar, M. G. & Tsien, R. Y. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 6803-6808 (1998) 참조)을 포함하는 다양한 pH 값(pH 5-9)의 고칼륨 완충 용액에서 배양하였다. 이렇게 니제리신 처리된 특정 pH 값의 헬라 세포 내에서 형광 신호 강도 비율(I535/I685)을 측정하여, 발명자들은 세포내 pH 모니터링을 위한 pH 검정 곡선을 성공적으로 얻었다(도 7d의 빨간색 선 및 도 11). 이 곡선으로부터, 발명자들은 본 발명의 나노탐침의 검출 가능한 범위(pH 6.5-7.5)가 생세포의 생리학적 pH 검출·전달에 완벽하게 적합함을 확인하였다(Jaworska, A., Malek, K. & Kudelski, A. Intracellular pH - Advantages and pitfalls of surface-enhanced Raman scattering and fluorescence microscopy - A review. Spectrochim. Acta - Part A Mol. Biomol. Spectrosc. 251, 119410 (2021) 참조). 흥미롭게도, 본 발명의 나노탐침은, 동일한 pH 7.5 상황의 생세포 내부와 외부에서 주변 환경에 관계없이 거의 동일한 PL 강도가 측정되었으며(도 7d의 우측 삽입도 및 도 12 a,b,d); 3개의 실험 그룹(pH 7, 7.5 및 8)에서 헬라 세포 내부 및 외부에서 얻은 PL 강도 역시 거의 동일하였다(도 12 c,e). 이 관찰에서, 본 발명의 나노탐침은 다양한 이온, 단백질, 및 대사 산물(Ellis, R. J. Macromolecular crowding: An important but neglected aspect of the intracellular environment. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 114-119 (2001) 참조)을 포함하는 복잡한 세포 환경에서도 pH 변화에 정확하게 반응할 수 있음을 시사한다.
도 8은 나노탐침의 광 안정성과 재현성 시험 결과를 나타낸 것으로, 도 8a에 따르면, 버퍼 액적(1x PBS, pH 7.4)에 담긴 나노탐침에 대한 연속 레이저 노출(473nm) 동안에 PL 피크 강도(I/I0)의 시간에 따른 변화가 무시될 만큼 거의 없었다. 여기서, I0는 t=0에서의 PL 피크 강도이다. 도 8b는 산성 액적(1x PBS, pH 5.0) 및 염기성 액적(1x PBS, pH 7.5)에서 번갈아 측정된 결과이다. pH가 5.0(청색)과 7.5(적색) 사이에서 주기적으로 변동(n=3)하는 것으로부터 나노탐침의 재현성이 우수함을 알 수 있었다.
도 9는 살아있는 헬라 세포에 나노탐침과 테이퍼 광섬유 삽입 사이의 세포 생존 여부를 비교한 것으로, 살아있는 세포와 죽은 세포의 지표로서, 세포를 칼세인-AM(녹색 형광)과 요오드화 프로피듐(적색 형광)으로 염색하였다. 도 9a 내지 9b는 나노탐침(a) 또는 테이퍼진 광섬유(b)의 삽입 및 추출 시의 병합된 (명시야 및 형광) 이미지를 나타낸다(스케일 바, 10μm).
도 10은 삽입된 나노탐침(녹색) 또는 테이퍼진 광섬유(회색)를 각각 세포질 및 핵으로부터 추출한 후 세포 생존율의 히스토그램(n=20)을 도시한 것으로, 헬라 세포는 죽은 세포의 지표로서 요오드화 프로피듐 염료로 염색되었다. 세포의 생존율은 적색 형광 신호가 없는 생세포의 수에 기초한다.
도 11은 세포내 환경을 대상으로 하는 pH 검정곡선(pH calibration curve)을 획득하기 위한 볼츠만 피팅을 도시한 것으로, 도 11a는 pH 검정곡선의 볼츠만 방정식이고, 도 11b는 니게리신 처리된(nigericin-treated) 헬라 세포의 pH 값의 함수로서 강도 비(I535/I685)의 볼츠만 피팅 곡선(왼쪽 그래프), 및 각 매개변수의 값(오른쪽 표)을 나타낸다.
도 12는 헬라 생세포 외부와 내부의 나노탐침의 pH 의존성 형광 신호의 조사 결과를 도시한 것으로, 도 12a 내지 12b는 각각 헬라 세포의 외부(a) 및 내부(b)의 나노선 삽입 부위의 명시야 이미지(고정 pH: 7.5)를 나타내고, 도 12c 내지 12e는 다양한 pH(7.0-8.0)에서 니게리신 처리된 헬라 세포의 외부(검은색 선) 및 내부(빨간색 선)에서 측정된 나노탐침의 PL 스펙트럼을 나타낸다(스케일 바, 10μm).
도 13은 나노탐침을 이용한 단일 세포 전체 주기 동안 세포질과 세포핵 내에서의 pH값을 모니터링한 결과를 도시한 것으로, 도 13a에 따르면, 나노탐침은 훽스트(Hoechst) 염료로 염색된 헬라 생세포의 세포질(위)과 핵(아래)에 삽입되었다(스케일 바 10μm). 도 13b는 세포질 pH(n=15)와 핵 pH(n=29) 간 비교도이다. 도 13c는 개별 헬라 세포에 대한 세포 주기 단계의 식별 과정을 도시한 것으로, 훽스트(Hoechst) 염료가 생세포의 핵을 특이적으로 염색(1단계)할 때, 본 발명의 자동 이미지 분할 알고리즘을 사용하여 모든 세포에 대해 핵의 순 형광 강도를 계산하고(2단계), DNA 히스토그램을 준비하여 헬라 세포의 세포 주기를 프로파일링하며(3단계), 세포 이미지에 대한 컬러 매핑(colour mapping)을 통해 각 세포의 상태를 식별하였다(4단계)(스케일 바 50μm). 도 13d는 각 세포 주기 단계에 대해 측정된 핵 pH를 보여준다. 세포 주기 단계의 도식(상단)으로서, 훽스트 염색 세포의 암시야 및 병합된(명시야 + 형광) 이미지(중간), 및 핵 pH 값(하단)이 세포 주기 단계별로 표시된다. G1 및 S/G2상은 유사한 pH 값들(G1상: 6.91±0.03(n=14), S/G2상: 6.92±0.03(n=15))을 나타냈으며, 전기(prophase), 중기(metaphase), 말기(telophase), 및 세포질분열에서의 핵 pH 값은 조위 곡선(tidal curve)을 나타냈다(전기: 6.97±0.05(n=10); 중기: 7.01±0.05(n=10); 말기: 7.05±0.03(n=12); 세포질분열: 6.98±0.03(n=16))(스케일 바 10μm).
본 발명의 나노탐침은 실시간으로 다른 세포소기관의 국부 pH를 모니터링할 수 있기 때문에, 발명자들은 단일 생세포 내의 세포질 및 핵에 대한 pH값 측정을 성공적으로 시연할 수 있었다(도 13a 내지 13b). 중요한 세포 기능(예: DNA 복제, 유전자 발현 및 후성유전적 조절(epigenetic modulation)(Francastel, C., Sch
beler, D., Martin, D. I. K. & Groudine, M. Nuclear compartmentalization and gene activity. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 137-143 (2000); 및 Nakamura, A. & Tsukiji, S. Ratiometric fluorescence imaging of nuclear pH in living cells using Hoechst-tagged fluorescein. Bioorganic Med. Chem. Lett. 27, 3127-3130 (2017) 참조)에 있어 핵 pH의 중요성에도 불구하고, 핵 내부 pH를 직접 측정(determination)하는 것은 대단히 어려웠는데(Casey, J. R., Grinstein, S. & Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010) 참조), 주 이유는 세포 내 두 개의 막인 세포막과 핵막이 존재하기 때문이다. 핵막에 존재하는 큰 직경(120nm 이하)의 핵공으로 인해, 많은 연구들이 핵의 pH가 세포질의 pH와 동일하다고 가정하였다(Casey, J. R., Grinstein, S. & Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010); 및 Fabre, E. & Hurt, E. C. Nfuclear transport. Current Opinion in Cell Biology vol. 6 (EMBL, Heidelberg, 1994) 참조). 그러나, 지난 10년 동안의 최근 연구 결과는 핵 구획이 핵 구획의 자체 내부 pH를 제어할 수 있어 핵 pH를 세포질 pH와 다르게 만들 수 있다고 제안되고 있다(Sherman, T. A., Rongali, S. C., Matthews, T. A., Pfeiffer, J. & Nehrke, K. Identification of a nuclear carbonic anhydrase in Caenorhabditis elegans. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 808-817 (2012); Santos, J. M., Mart
nez-Zaguilαn, R., Facanha, A. R., Hussain, F. & Sennoune, S. R. Vacuolar H+-ATPase in the nuclear membranes regulates nucleo-cytosolic proton gradients. Am. J. Physiol. - Cell Physiol. 311, C547-C558 (2016); 및 Nakamura, A. & Tsukiji, S. Ratiometric fluorescence imaging of nuclear pH in living cells using Hoechst-tagged fluorescein. Bioorganic Med. Chem. Lett. 27, 3127-3130 (2017) 참조). 이 논란의 여지가 있는 문제에 답하기 위해, 발명자들은 단일 헬라 생세포의 원하는 위치에 나노탐침을 삽입하여 핵과 세포질의 pH 값을 별도로 측정하였다(도 13a). 결과적으로, 발명자들은 핵 pH(6.92±0.04, n=29)가 세포질 pH(7.11±0.05, n=15)보다 유의미하게 낮음을 발견하였으며(도 13b), 이것은 세포 구획마다 별도의 pH 조절 기능에 의해 핵과 세포질 사이에 pH 구배가 있을 수 있음을 의미한다.
핵막이 견고함에도 누출 없이 나노탐침에 의해 쉽게 관통되었기 때문에, 발명자들은 전체 인간 세포 주기에 걸쳐 핵 pH 변화를 직접 모니터링할 수 있었다. 이를 위해 사전에, 개별 헬라 세포의 세포 주기 상태를 확인하는 것이 필요하였다(도 13c 내지 도 13d)(Rloukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C. & Misteli, T. Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy. Nat. Protoc. 10, 334-348 (2015) 참조). 원칙적으로, 세포 분열이 진행됨에 따라 핵 내부의 총 DNA 양이 변하는데, 총 DNA 양을 정량화하면 세포 분열의 세포 주기 단계를 결정할 수 있다. 상세하게는, 발명자들은 먼저 핵 내부의 DNA에 특이적으로 결합하여 청색 형광 신호를 방출하는 훽스트(Hoechst) 염료로 세포를 염색하였고(1단계), 자동 영상 분석(핵 분할(nuclei segmentation))을 통해 각 세포의 DNA 함량을 측정하였는데, 여기서 총 형광 강도는 여러 핵에 대해 계산되었다(도 13c 및 방법 참조). 마지막으로 DNA 히스토그램을 기반으로 세포 이미지에 컬러 매핑하여 세포 주기 단계가 식별되었다(4단계). 분석을 통해, 발명자들은 개별 헬라 세포의 세포 주기 단계(G1, S 및 G2/M)를 확인하고, 이어서 각 단계의 비율(G1, 73.9%, S, 11.1%, G2/M, 15.0%)을 얻었으며, 각 단계의 비율은 알려진 헬라 세포의 특성과 잘 일치하였다(G1, 72.1%; S, 12.6%; G2/M, 12%)(Athukorala, Y., Trang, S., Kwok, C. & Yuan, Y. V. Antiproliferative and antioxidant activities and mycosporine-Like amino acid profiles of wild-Harvested and cultivated edible canadian marine red macroalgae. Molecules 21, (2016) 참조).
각 세포 주기 단계의 평가(도 13c)를 기반으로, 발명자들은 세포 분열 중 핵 pH 변화를 측정하여 휴지기의 pH 항상성과 유사분열기의 pH 변동을 발견하였다(도 13d). 구체적으로, G1 및 S/G2 단계의 헬라 세포는 유사한 pH 값을 나타내었다(G1 단계: 6.91±0.03(n=14); S/G2 단계: 6.92±0.03(n=15), 도 13d, 파란색 박스). 이전에, 여러 연구에서 휴지기 동안 세포질은 ATP 합성/가수분해 및 산화환원 진동과 같은 여러 가지 이유로 pH 변동을 나타내는 것으로 보고되었다(Da Veiga Moreira, J. et al. Cell cycle progression is regulated by intertwined redox oscillators. Theor. Biol. Med. Model. 12, 1-14 (2015); 및 DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G. & Thompson, C. B. The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation. Cell Metab. 7, 11-20 (2008) 참조). 이전과는 다르게, 발명자들은 핵이 G1 및 S/G2 단계에서 pH 변동없이 pH를 보존한다는 것을 분명히 관찰했으며, 이는 아마도 핵막의 pH 조절 기능 때문이라 여겨진다. 휴지기의 이 핵 pH 항상성은 출아 효모(budding yeast)의 핵 pH 변화를 조사한 이전 발견(Zhao, H. et al. Dynamic imaging of cellular pH and redox homeostasis with a genetically encoded dual-functional biosensor, pHaROS, in yeast. J. Biol. Chem. 294, 15768-15780 (2019) 참조)과 일치한다. 놀랍게도, 헬라 세포가 전기(prophase)에 들어갔을 경우, 핵 pH는 세포가 말기(telophase)에 도달할 때까지 계속 소폭 증가했다(전기: 6.97±0.05(n=10), 중기: 7.01±0.05(n=10), 말기: 7.05±0.03(n=12), 도 13d, 노란색 박스, 및 도 14 내지 도 15). 유사분열기 동안, 핵 pH 항상성의 일시적인 파괴는 핵막의 붕괴와 관련이 있을 수 있어(Cooper GM. The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition. (Sunderland (MA), Sinauer Associates, 2000) 참조), 일시적으로 핵의 pH 조절 능력을 방해할 수 있다. 그러나, 세포가 유사분열기의 말기에 세포질분열 단계에 도달함에 따라, 핵 pH는 원래의 pH 값(세포질분열: 6.98±0.03(n=16))으로 되돌아갔으며, 이는 분열된 세포 핵막의 재구성이 원래의 pH 항상성의 회복으로 이어질 것임을 시사한다. 발명자들은 전체 세포 주기 동안 pH를 직접 모니터링함으로써, 핵이 자체 pH 조절 기능을 가진다는 것을 분명히 확인하였다.
도 14는 공초점 현미경으로 관찰된, 유사분열기 동안 단일 헬라 생세포에의 나노탐침의 삽입에 대한 명시야 이미지(상측 패널) 및 병합(명시야 및 형광, 하측 패널) 이미지를 나타낸다(스케일 바, 10μm).
도 15는 pH 측정을 위해 유사분열기(전기부터 세포질 분열까지) 동안 핵-특이적 헥스트 염료(흰색)로 염색된 헬라 세포의, 공초점 현미경으로 관찰된 병합(명시야 및 형광) 이미지들을 나타낸다(스케일 바, 10μm).
도 16은 외부 칼슘 이온에 반응하는 세포질 pH 변화를 도시한 것으로, 이온 스트레스에 대한 실시간 세포질 pH 모니터링 결과를 나타낸다. 도 16a는 과량의 칼슘 이온 존재 시 세포내 산성화의 개략도로서. 일반적으로 고농도의 칼슘 이온은 아데노신 3인산염(ATPs) 및 활성산소종(ROS)의 과잉 생산을 포함하여 세포에 악영향을 일으켜 pH 항상성에 영향을 미친다. 도 16b 내지 16c에 따르면, 외부 칼슘 이온 스트레스에 따른 서로 다른 세포 반응이 세포질 pH 변화에 의해 측정되었다(n=3). 명시야 이미지의 노란색 삼각형은 pH 측정을 위해 본 발명의 나노탐침이 삽입된 위치를 나타낸다. 빨간색 화살표와 파란색 화살표는 각각 외부 Ca2+ 스트레스의 도입 지점 및 제거 지점을 나타낸다(스케일 바 10μm).
또한, 발명자들은 외부 2가 이온 스트레스를 제공하여 단일 헬라 생세포의 세포질 pH 역학을 조사한 결과, 개별 세포들이 실제로 이온에 따라 서로 다르게 반응함을 확인하였다(도 16). 과량의 칼슘(5mM)을 세포 배양 배지에 첨가한 경우, 높은 세포외 Ca2+에 의해 유도된 세포내 산성화의 결과로 세포질 pH가 30분 이내에 현저하게 감소했다(7.17±0.02 - 6.97±0.04)(도 16b). 흥미롭게도, Ca2+가 Mg2+로 대체되었을 경우 pH 변화는 미미했다(7.09±0.01 - 7.08±0.01)(도 17). 세포외 배지에 과량의 Ca2+가 존재하면 활성 산소 종(ROS)의 생성, ATP 수준을 증가시킴에 따른 미토콘드리아 기능 장애, 및 심지어 세포 사멸 및 괴사를 통한 세포 사멸을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다(McGinnis, K. M., Wang, K. K. W. & Gnegy, M. E. Alterations of extracellular calcium elicit selective modes of cell death and protease activation in SH-SY5Y human neuroblastoma cells. J. Neurochem. 72, 1853-1863 (1999); 및 Voccoli, V., Tonazzini, I., Signore, G., Caleo, M. & Cecchini, M. Role of extracellular calcium and mitochondrial oxygen species in psychosine-induced oligodendrocyte cell death. Cell Death Dis. 5, 1-10 (2014) 참조). 따라서, 헬라 세포의 Ca2+ 의존성 세포내 산성화는 높은 세포외 Ca2+의 부작용에 의해 발생하는 것으로 간주되었으며, 이는 칼슘 이온 처리에 따른 세포 생존율 조사에 의해 추가로 뒷받침되었다(도 18a). 더욱이, 본 발명의 마그네슘 처리 실험은 세포가 세포외 Mg2+ 농도의 증가에 내성이 있음을 보여주었으며, 이전 결과(Libako, P. et al. Blocking the rise of intracellular calcium inhibits the growth of cells cultured in different concentrations of magnesium. Magnes. Res. 25, 12-20 (2012) 참조)와 일치하여 Ca2+ 자극과 달리 세포 오작동이나 세포 사멸이 없었다(도 17 및 도 18b).
중요하게는, 헬라 생세포는 외부 이온 스트레스가 제거되었을 때 원래의 pH 상태를 회복하였다(도 16c). pH 항상성의 회복을 관찰하기 위해, 발명자들은 30분 동안 과량의 Ca2+ (5mM)으로 헬라 세포를 배양한 다음, 배지의 Ca2+ 농도를 정상 범위(1.8mM)로 빠르게 조정하였다. 이 과정에서 발명자들은 3개의 개별 세포에서 세포질 pH 변화를 모니터링했다. 이전의 Ca2+ 의존성 세포내 산성화에서 관찰된 바와 같이(도 16b), 처음 30분 동안 높은 세포외 Ca2+는 헬라 세포의 세포질을 산성으로 유도했다(7.10±0.02 - 6.99±0.02). 놀랍게도, 세포외 Ca2+ 스트레스를 제거한 후(도 16c, 파란색 화살표), 세포는 점차 고유한 중성 pH(6.99±0.02 - 7.09±0.02)를 회복했는데, 이는 헬라 생세포의 세포질 pH 항상성이 이전에 이온 스트레스에 의해 야기되었던 pH 조절의 상실로부터 성공적으로 회복되었음을 의미한다. 외부 이온 스트레스에 대한 헬라 세포의 전반적인 경향은 유사했지만, pH로 표현된 헬라 세포의 개별 반응이 크기, 형태, 이웃 세포 및 분할 단계와 같은 세포 간 차이처럼 이질적이었다는 것은 흥미로운 점이다(K
ltz, D. Molecular and evolutionary basis of the cellular stress response. Annu. Rev. Physiol. 67, 225-257(2005) 참조).
도 17은 과량의 마그네슘 이온(5 mM)으로 처리된 헬라 세포의 세포질 pH의 실시간 측정 결과를 나타낸 것으로, 단일 헬라 세포(n=3)를 추적하여 얻은 명시야 이미지(상측 패널)와 측정된 pH 변화(하측 그래프)를 보여준다. 상측 패널의 노란색 삼각형은 나노탐침의 삽입 위치를 보여준다. 빨간색 화살표는 매체를 정상 마그네슘 농도(1.8 mM)에서 높은 마그네슘 농도(5 mM)로 교체하는 지점을 나타낸다(스케일 바, 10μm).
도 18a 내지 18b는 과량의 칼슘 이온(a)과 과량의 마그네슘 이온(b)으로 처리된 살아있는 헬라 세포의 병합(명시야 및 형광) 이미지 및 암시야 이미지를 나타낸 것으로, 두 분석 모두 헬라 세포를 칼세인-AM과 요오드화 프로피듐으로 전염색하여 세포 생존율을 분석하였다(스케일 바, 100μm). 이로부터 칼슘 이온 처리가 헬라 세포에 스트레스를 주어 생존율을 떨어뜨리지만, 마그네슘 이온 처리는 헬라 세포의 생존율에 영향을 주지 않는다는 사실을 확인할 수 있었다.
결론
본 발명에서 국부 pH 검출·전달 기능을 갖춘 나노탐침을 활용하여, 발명자들은 단일 생세포에서 세포 손상 및 누출을 일으키지 않고 세포소기관 및 세포질에 성공적으로 액세스(access)하여 pH 변화를 모니터링할 수 있었다. 비투과성의 세포막과 핵막을 넘어서, 본 발명의 현장 pH 모니터링은 세포내 소기관막의 역할에 대한 근본적인 이해를 제공할 수 있다는 점에서 중요하다. 세포질(7.11±0.05)과 핵(6.92±0.04) 사이의 pH 차이를 관찰한 결과, 핵막에 의해 세포 활동이 상이한 pH 변화를 나타낼 수 있음이 확인되었다(Sherman, T. A., Rongali, S. C., Matthews, T. A., Pfeiffer, J. & Nehrke, K. Identification of a nuclear carbonic anhydrase in Caenorhabditis elegans. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 808-817 (2012); Santos, J. M., Mart
nez-Zaguilαn, R., Facanha, A. R., Hussain, F. & Sennoune, S. R. Vacuolar H+-ATPase in the nuclear membranes regulates nucleo-cytosolic proton gradients. Am. J. Physiol. - Cell Physiol. 311, C547-C558 (2016); 및 Nakamura, A. & Tsukiji, S. Ratiometric fluorescence imaging of nuclear pH in living cells using Hoechst-tagged fluorescein. Bioorganic Med. Chem. Lett. 27, 3127-3130 (2017) 참조). 특히, 세포 성장 및 핵 분열 과정에서의 pH 항상성 및 변동은 분해되기 전의 핵막이 세포내 pH 유지 및 핵 수송에 관여하여 생분자 합성을 촉진(Cooper GM. The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition. (Sunderland (MA), Sinauer Associates, 2000); 및 Demaurex, N. pH homeostasis of cellular organelles. News Physiol. Sci. 17, 1-5 (2002) 참조)한다는 점을 보여준다. 발명자들이 아는 한, 이것은 특히 인간 세포의 분열하는 핵에서도 독립적인 pH 조절 기능이 존재한다는 최초의 직접적인 증거이다.
외부 이온 자극에 대한 서로 다른 세포 반응에서 관찰된 바와 같이, 본 발명의 국부 pH 모니터링 나노탐침은 다양한 흥미로운 조건에서 개별 세포의 삶을 연구하는데 널리 적용될 수 있다. 예를 들어, 다양한 세포 거동(예: 분화, 세포 신호 또는 통신, 프로그래밍된 세포 사멸) 동안 세포소기관의 pH 변화를 실시간으로 검출하게 되면 소기관막에 따른 생물학적 과정을 이해하는데 활용될 수 있다(Jaworska, A., Malek, K. & Kudelski, A. Intracellular pH - Advantages and pitfalls of surface-enhanced Raman scattering and fluorescence microscopy - A review. Spectrochim. Acta - Part A Mol. Biomol. Spectrosc. 251, 119410 (2021); 및 Han, J. & Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem. Rev. 110, 2709-2728 (2010) 참조).
방법
시약 및 재료:
폴리(비닐벤질 클로라이드)(PVC, Mn = 55,000g/mol), 아지드화 나트륨(sodium azide), N,N-디메틸포름아미드(DMF), 1-메틸-2-피롤리디논(NMP), 메탄올, 디메틸 설폭사이드-d6(DMSO-d6) , 한천 분말(agar powder), 10X 인산완충식염수(PBS), 수산화나트륨, 염산(37%), 프로피디움 요오드화물, 칼세인-AM, 및 니제리신 나트륨염은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입했다. 5'-DBCO-T5-FAM-3'은 바이오니아(대전, 한국)에서 합성하였다. HEPES(pH 7.5) 완충액(1 M), 염화칼륨, 이염화칼슘(CaCl2) 및 이염화마그네슘(MgCl2)은 BioPrince(춘천, 한국)에서 구입했다. 훽스트(Hoechst) 33342(10 mg/ml) 용액은 Biotium(Fremont, CA)에서 구입했다. 나노피펫 제작을 위한 유리 모세관(BF-100-50-10)은 Sutter Instrument(Novato, CA)에서 구입했다.
나노탐침의 제작:
무수 DMF 용매(0.7mL) 중 PVC(0.014g, 131mmol)와 아지드화 나트륨(0.010g, 220mmol)의 혼합물을 70°C의 호박색 바이알(amber vial)에서 섞고 알루미늄 호일로 덮어 빛을 차단했다. 2시간 반응 후, 메탄올(0.5mL)을 첨가하고, 혼합 용액을 10,000rpm에서 1분간 원심분리(Mini microcentrifuge, Labogene)하여 과량의 미반응 시약을 제거하고 아지드 작용성 폴리머(azide-functionalized polymer)를 침전시켰다. 마지막으로, 얻어진 침전물을 진공 하에 1시간 동안 건조시킨 다음 NMP 용매(50 μL)를 첨가하여 용해시켰다. PVBN3의 성공적인 합성은 1H NMR 분광법으로 확인되었다(도 2). 나노선 제작을 위해 P-97 마이크로피펫 풀러(Sutter Instrument)를 이용하여 유리 나노피펫을 가공하였고, P-2000 레이저 기반 마이크로피펫 풀러(Sutter Instrument)를 이용하여 테이퍼진 광섬유를 제작하였다. 그 후, 유리 나노피펫과 테이퍼진 광섬유의 위치는 250nm 이하(Kohzu Precision)의 위치 정확도로 x-y-z 스테핑 모터 스테이지에 의해 정밀하게 제어되었다. 나노선 제작을 위해 NMP의 PVBN3 용액을 1.0 wt% 농도로 채운 유리 나노피펫을 수직 방향으로 내려서 테이퍼진 광섬유의 끝 부분에 닿게 하였다. 나노피펫을 수직 방향으로 올리면 빠른 용매 증발에 의해 테이퍼진 광섬유의 끝 부분에 PVBN3 나노선이 형성되어 독립형(freestanding) PVBN3 나노선을 형성하였다. 나노선 제작은 2축 CCD 카메라(INFINITY 1-2C, Lumenera Camera), 대물렌즈(100x Plan Apo 무한 보정 대물 렌즈, Mitutoyo), 및 노란색 LED 조명기(정밀 LED 스포트라이트, 590nm, Mightex)로 구성된 자체 광학 이미징 시스템을 사용하여 실시간으로 모니터링되었다.
나노선에 대한 플루오레세인의 접합:
DBCO 플루오레세인(FAM)을 PVBN3 나노탐침에 접합하기 위해 유리 마이크로피펫을 DBCO-FAM 분자 함유 수용액(100nM)으로 채웠다. 유리 마이크로피펫을 수직 방향으로 내려 10분동안 나노선을 담그면 DBCO-FAM 분자가 클릭 반응에 의해 PVBN3 나노선의 아지드기에 접합되었다. 나노선과 DBCO-FAM 분자 함유 용액 사이의 접촉 면적을 조정하여 나노탐침의 FAM-라벨링된 영역을 제어할 수 있었다. pH 측정 분석 전에 나노탐침을 1x PBS 용액으로 2회 세척하였다.
나노탐침을 통한 형광 신호(PL 스펙트럼) 측정:
나노탐침의 끝에서부터 DBCO 플루오레세인 신호(PL 스펙트럼)를 여기시키기 위해 컴퓨터 제어 셔터와 결합된 연속 레이저(473nm 청색 고체 레이저, MBL-III-473, Uniotech)를 광섬유 및 1x2 광학 커플러(협대역 광섬유 커플러, 532±15 nm, 50:50 분할, Thorlab)를 통해 나노탐침에 주입하였다. 모든 PL 스펙트럼은 분광계(Avaspec-ULS2048L-EVO, Avantes)로 기록되었다.
세포 배양 실험:
헬라 세포는 한국 세포주 은행에서 얻었다. 세포는 적절한 조건(37℃ 온도 및 5% CO2 대기) 하에서 35mm 배양접시(SPL Life Sciences)에 10% 소태아혈청(FBS, Gibco), 100U/ml 페니실린(Welgene), 및 100㎍/ml 스트렙토마이신(Welgene)이 보충된 Dulbecco의 변형된 이글 배지(Eagle's medium)(DMEM, Welgene)에서 배양되었다. 세포 실험을 준비할 때, 헬라 세포를 이틀 동안 배양하였다.
세포 생존율 분석:
세포 생존율을 분석하기 위해 헬라 세포를 37℃에서 15분 동안 칼세인-AM 및 프로피디움 요오드화물 염료와 함께 사전 배양하였다. 헬라 세포에 대한 나노탐침 및 테이퍼진 광섬유의 삽입 효과를 조사하기 위해, 둘 다 헬라 세포의 세포질 또는 핵에 1분 동안 삽입한 후 추출하였다. 이 과정 후 10x 대물렌즈(0.4 개구수, HC PL APO 10x, Leica)를 이용하여 공초점 현미경(STELLARIS 5, Leica)으로 녹색형광(515 nm)과 적색형광(636 nm)을 관찰하여 세포생존율을 평가하였다. 세포 생존율 히스토그램 조사에서, 세포를 세포 배양 조건에서 3시간 동안 배양한 다음 공초점 현미경으로 이미지화하였다.
검정 곡선을 얻기 위한 세포 내 pH 조작:
배양된 헬라 세포를 다양한 pH 값(5-9)에서 새로 준비된 DMEM 및 니제리신 완충액(10mM HEPES, 10mM NaCl, 130mM KCl, 1mM MgCl2)으로 두 번 세척하였다. 다음으로, 발명자들은 15-25분 동안 37℃에서 세척된 세포에 15 μM 니제리신을 첨가하였다. 서로 다른 pH 의존성 형광 신호(5-9)에 의존하는 형광 신호 강도 비율(intensity ratio)의 S자형(sigmoidal) 증가에 기초하여, pH 검정 곡선은 IUPAC 정의에 의해 계산된 측정 데이터(R2 = 0.9969), 매우 우수한 감도(18.722(I535/I685)/pH 단위), 및 검출 해상도(0.0365 pH 단위)와 좋은 상관관계를 갖는 볼츠만 피팅(Boltzmann fitting)에 의해 얻어졌다.
나노탐침을 단일 헬라 세포에 삽입하기 위한 구성:
세포 실험 전에, 배양된 헬라 세포를 새로 준비된 DMEM으로 두 번 세척하였다. 단일 헬라 세포 내부의 나노탐침의 삽입 부위를 정밀하게 제어하기 위해, x-y-z 미세조작기(위치 정확도: 250 nm, Kohzu Precision), 모터 컨트롤러(SC-210, Kohzu Precision) 및 컴퓨터로 구성된 자체 미세 광발광 구성을 사용하여 나노탐침을 정확하게 위치시켰다. 삽입하는 동안, 나노탐침의 위치는 10x 대물렌즈(0.4 개구수, HC PL APO 10x, Leica) 및 CCD 카메라를 구비한 공초점 현미경(STELLARIS 5, Leica)으로 모니터링되었다. 나노탐침을 세포 내부의 원하는 위치에 위치시키면서 실시간으로 PL 스펙트럼을 수집하였다.
개별 헬라 세포의 세포 주기 상태 식별:
헬라 세포에서 DNA를 특이적으로 염색하기 위하여, 먼저 희석된 훽스트(Hoechst) 33342 용액(10 μg/ml)을 준비한 다음 배양된 세포와 15분 동안 혼합하였다(세포 배양 조건에서). 염색된 세포의 이미지는 2048 x 2048 픽셀에서 공초점 현미경으로 획득하였다. 핵분할을 위한 MATLAB 기반 영상처리 알고리즘을 적용하여 각 세포의 핵형광 강도를 계산하였다. 구체적으로, 알고리즘은 가우스 필터링(Gaussian filtering)을 사용하여 원시 이미지로부터 노이즈를 제거하고 적응 임계값을 설정하여 필터링된 이미지를 이진화하도록 설계되었다. 그런 다음, 열림 및 닫힘 알고리즘을 적용하여 거친 가장자리를 매끄럽게 함으로써 바이너리 이미지를 분할하였다. 개별 핵 분할의 식별 오류를 최소화하기 위해, 작은 바이너리 노이즈 클러스터와 이미지 프로세스의 경계 영역 주변의 핵이 자동으로 제거되었다. 자동으로 분할된 이미지에 기초하여, 각 핵의 분할된 영역 내 형광 강도를 수집하였다. 형광 강도 데이터로부터, 개별 세포가 시각적으로 선택된 컷오프(Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C. & Misteli, T. Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy. Nat. Protoc. 10, 334-348 (2015) 참조)에 의해 서로 다른 세포 주기 단계(G1, S, G2/M)로 분류된 DNA 히스토그램을 도식하였다. 여기에서, 각 단계 내의 세포의 비율은 오리진(Origin) 소프트웨어(버전 8.5)를 사용하여 자동으로 계산되었다. 영상에서 각 세포의 위상은 DNA 히스토그램에 기초하여 서로 다른 색상의 세포 영상에 컬러 매핑(color mapping)함으로써 G상, S상, 및 G2/M상으로 구분하였다.
세포 주기 동안 핵 pH 변화의 측정:
배양된 헬라 세포를 새로 준비된 DMEM으로 두 번 세척하고 훽스트(Hoechst) 염료 함유 완충액(DMEM 중 10μg/ml)과 함께 15분 동안 배양하였다. 배지를 새로운 DMEM 완충액으로 교체한 후, 각 세포 주기 단계에서 단일 헬라 생세포에 나노탐침을 삽입하고 공초점 현미경으로 이미징하여 핵 pH를 측정하였다.
이상 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 지금까지 설명한 내용들은 본 발명의 바람직한 실시예들 중 그 일부를 예시한 정도에 불과하며, 아래에 첨부된 청구범위에 나타날 수 있는 것을 제외하고는 상술한 내용에 의해 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명은 이와 동일한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이하의 청구범위에 기재된 범위 내에서 발명의 기술적 사상과 요지를 벗어나지 않으면서 균등물의 많은 변화, 수정 및 대체가 이루어질 수 있음을 이해하여야 할 것이다.
1 : 나노탐침
2 : 광섬유
2a : 제1 광섬유
2b : 제2 광섬유
3 : 테이퍼진 선단
4 : 광원
5 : 광결합기(fiber coupler)
6 : 조작기(manipulator)
7 : 단일 생세포
8 : 분광계
2 : 광섬유
2a : 제1 광섬유
2b : 제2 광섬유
3 : 테이퍼진 선단
4 : 광원
5 : 광결합기(fiber coupler)
6 : 조작기(manipulator)
7 : 단일 생세포
8 : 분광계
Claims (29)
- 나노탐침을 제조하는 방법으로서,
(a) 나노선 물질 용액을 나노 피펫에 채우고 상기 나노 피펫을 아래로 내려 상기 나노선 물질 용액을 광섬유의 끝단에 접촉시키는 것;
(b) 상기 나노 피펫을 상승시켜 상기 광섬유 끝단에 나노선(nanowire)을 성장시키는 것;
(c) pH 반응성 형광 물질을 함유하는 수용액을 마이크로 피펫에 채우고 상기 마이크로 피펫을 아래로 내려 상기 나노선의 일부가 상기 수용액에 잠기도록 하는 것; 및
(d) 상기 마이크로 피펫을 상승시켜 pH 반응성 형광 물질로 표지된 나노탐침을 형성하는 것을 포함하는, 나노탐침 제조 방법. - 제 1항에 있어서,
상기 나노선 물질 용액은 소수성 고분자 용액인, 나노탐침 제조 방법. - 제 2항에 있어서,
상기 소수성 고분자 용액은 적어도 PVBN3, PVB-alkyne, PVB-COOH로 이루어진 군으로부터 선택되는, 나노탐침 제조 방법. - 제 1항에 있어서,
상기 광섬유는 테이퍼진 선단을 갖는, 나노탐침 제조 방법. - 제 1항에 있어서,
상기 pH 반응성 형광 물질은 상기 나노선과 결합 가능한 작용기를 갖는 플루오레세인 분자인, 나노탐침 제조 방법. - 제 5항에 있어서,
상기 플루오레세인은 적어도 DBCO-FAM, Azide-FAM, Amine-FAM으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 나노탐침 제조 방법. - 제 1항에 있어서,
상기 pH 반응성 형광 물질에 의한 상기 나노선의 젖음(또는 표지된) 길이는 100 내지 900nm로 제어되는, 나노탐침 제조 방법. - 제 1항에 있어서,
상기 pH 반응성 형광 물질에 의한 상기 나노선의 젖음(또는 표지된) 길이는 100 내지 500nm로 제어되는, 나노탐침 제조 방법. - pH 측정을 위한 나노탐침으로서,
광섬유;
상기 광섬유의 일 끝에 나노선 물질 용액이 성장하여 형성된 나노선; 및
상기 나노선의 일부에 표지된 pH 반응성 형광 물질을 포함하는, 나노탐침. - 제 9항에 있어서,
상기 나노선 물질 용액은 소수성 고분자 용액인, 나노탐침. - 제 10항에 있어서,
상기 소수성 고분자 용액은 적어도 PVBN3, PVB-alkyne, PVB-COOH로 이루어진 군으로부터 선택되는, 나노탐침. - 제 9항에 있어서,
상기 광섬유의 일 끝은 테이퍼진 선단을 갖는, 나노탐침. - 제 9항에 있어서,
상기 pH 반응성 형광 물질은 상기 나노선과 결합 가능한 작용기를 갖는 플루오레세인 분자인, 나노탐침. - 제 13항에 있어서,
상기 플루오레세인은 적어도 DBCO-FAM, Azide-FAM, Amine-FAM으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 나노탐침. - 제 9항에 있어서,
상기 pH 반응성 형광 물질에 의한 상기 나노선의 젖음(또는 표지된) 길이는 100 내지 900nm로 제어되는, 나노탐침. - 제 9항에 있어서,
상기 pH 반응성 형광 물질에 의한 상기 나노선의 젖음(또는 표지된) 길이는 100 내지 500nm로 제어되는, 나노탐침. - 제 9항에 있어서,
상기 나노탐침은 직경이 균일한 것을 특징으로 하는, 나노탐침. - 제 9항에 있어서,
상기 나노탐침은 직경이 10nm 내지 900nm인 것을 특징으로 하는, 나노탐침. - 제 9항에 있어서,
상기 나노탐침은 직경이 10nm 내지 400nm인 것을 특징으로 하는, 나노탐침. - 제 9항에 있어서,
상기 나노탐침은 길이가 1μm 내지 10μm인 것을 특징으로 하는, 나노탐침. - 제 9항에 있어서,
상기 나노탐침은 길이가 1μm 내지 5μm인 것을 특징으로 하는, 나노탐침. - 단일 세포 내의 pH를 측정하는 방법으로서,
(a) 광섬유의 테이퍼진 선단에 성장시킨 나노선(nanowire)에 pH에 반응할 수 있는 pH 반응성 형광 물질을 결합하여 형성된 나노탐침을 단일 세포 내에 삽입하는 것;
(b) 상기 나노탐침에 상기 광섬유를 통해 광을 입사하는 것;
(c) 상기 광에 의해 상기 pH 반응성 형광 물질이 여기되어 형광을 발생시키는 것;
(d) 상기 세포의 pH에 따라 상기 형광 물질로부터 발생하는 형광 신호를 상기 광섬유를 통해 획득하는 것; 및
(e) 상기 형광 신호를 분석하여 세포 내의 pH 값을 얻는 것을 포함하는, 단일 세포 내의 pH 측정 방법. - 제 22항에 있어서,
상기 광섬유를 통해 취득된 형광 신호는 광결합기를 경유하여 분광계에 전달되는 것을 특징으로 하는, 단일 세포 내의 pH 측정 방법. - 제 22항에 있어서,
상기 pH 값의 측정은 상기 분광계에서의 형광의 스펙트럼 데이터로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 단일 세포 내의 pH 측정 방법. - 제 22항에 있어서,
상기 광섬유를 통해 입사되는 광은 근적외선 또는 가시광선 영역의 광인 것을 특징으로 하는, 단일 세포 내의 pH 측정 방법. - 제 22항에 있어서,
상기 광섬유를 통해 입사되는 광은 300nm 내지 1000nm 파장인 것을 특징으로 하는, 단일 세포 내의 pH 측정 방법. - 제 22항에 있어서,
상기 광섬유를 통해 입사되는 광은 400nm 내지 700nm 파장인 것을 특징으로 하는, 단일 세포 내의 pH 측정 방법. - 단일 세포 내의 pH를 측정하기 위한 장치로서,
광섬유의 테이퍼진 선단에 성장시킨 나노선에 pH에 반응할 수 있는 pH 반응성 형광 물질을 결합하여 형성되는 나노탐침;
상기 단일 생세포 내에 상기 나노탐침을 삽입하도록 나노탐침의 3차원 이동제어가 가능한 조작기;
상기 광섬유에 광을 인가하는 광원;
상기 광섬유를 통해 입사된 광을 상기 나노탐침에 전달하고 상기 나노탐침에서 발생된 형광 신호를 추가의 광섬유를 통해 분광계에 전달하도록 광섬유들을 연결하는 광결합기; 및
상기 나노탐침에서 발생된 형광 신호로부터 스펙트럼 데이터를 분석하여 pH 값을 얻는 분광계를 포함하는, 단일 세포내 pH 측정 장치. - 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 나노선 물질 용액을 제조하는 방법으로서,
무수 DMF 용매(0.7mL) 중 PVC(0.014g, 131mmol)와 아지드화 나트륨(0.010g, 220mmol)의 혼합물을 70°C의 호박색 바이알(amber vial) 내에서 섞고 알루미늄 호일로 덮어 빛을 차단하는 단계;
2시간 반응 후, 메탄올(0.5mL)을 첨가하고, 혼합 용액을 10,000rpm에서 1분간 원심분리하여 과량의 미반응 시약을 제거하고 아지드 작용성 폴리머(azide-functionalized polymer)를 침전시키는 단계; 및
얻어진 침전물을 진공 하에 1시간 동안 건조시킨 다음 NMP 용매(50 μL)를 첨가하여 용해시키는 단계를 포함하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US17/588,571 US20220244278A1 (en) | 2021-02-01 | 2022-01-31 | NANO-PROBE FOR MEASURING pH IN SINGLE CELLS, AND METHOD AND APPARATUS FOR MEASURING pH IN SINGLE CELLS USING THE SAME |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20210014230 | 2021-02-01 | ||
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| KR20220111204A true KR20220111204A (ko) | 2022-08-09 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022164262A1 (ko) | 2022-08-04 |
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