KR20220108094A - 프라탁신 활성의 정량화 방법 - Google Patents

프라탁신 활성의 정량화 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20220108094A
KR20220108094A KR1020227021394A KR20227021394A KR20220108094A KR 20220108094 A KR20220108094 A KR 20220108094A KR 1020227021394 A KR1020227021394 A KR 1020227021394A KR 20227021394 A KR20227021394 A KR 20227021394A KR 20220108094 A KR20220108094 A KR 20220108094A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fxn
protein
compound
ros
activity
Prior art date
Application number
KR1020227021394A
Other languages
English (en)
Inventor
조안 데이비드 베톤
Original Assignee
라리마 테라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 라리마 테라퓨틱스, 인코포레이티드 filed Critical 라리마 테라퓨틱스, 인코포레이티드
Publication of KR20220108094A publication Critical patent/KR20220108094A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 개시내용은 프라탁신(FXN) 단백질, 예를 들어, FXN 융합 단백질의 활성을 측정하기 위한 방법, 조성물 및 키트를 제공한다. 본 개시내용은 또한 FXN 단백질, 예를 들어 FXN 융합 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다.

Description

프라탁신 활성의 정량화 방법
관련 출원
본 출원은 2019년 11월 25일에 출원된 미국 비정규출원 제62/940,214호에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원에는 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 시퀀스 목록이 포함되어 있으며 전체 내용이 참조로 통합된다. 2020년 11월 24일에 생성된 ASCII 사본의 이름은 130197-01020_SL.txt이며 크기는 8,457바이트이다.
도입
프리드라이히 운동실조증(FRDA)은 프라탁신(FXN)을 암호화하는 유전자의 돌연변이로 인해 발생하는 희귀 유전성 진행성 신경퇴행성 질환이다. 프라탁신(FXN)은 심장, 척수, 간, 췌장 및 골격근에서 가장 높은 수준으로 신체 전체의 세포에서 발견되는 필수 계통 발생적으로 보존된 단백질이다. 프라탁신(FXN)은 핵에서 암호화되고 세포질에서 발현되며 미토콘드리아로 유입되어 성숙한 형태로 처리된다. 인간에서 210개 아미노산의 전장 hFXN (hFXN1-210, 23.1 kDa)은 미토콘드리아 기질 처리 펩티다제(MPP)에 의해 2단계 절단으로 처리되는 아미노 말단에 전형적인 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)을 포함한다. 미토콘드리아 기질로 가져오기 때문이다. 생성된 단백질은 130개 아미노산, 14.2 kDa 성숙한 hFXN 단백질 (hFXN81-210) 이다.
FXN 융합 단백질은 현재 FRDA 환자의 미토콘드리아에서 FXN의 기능적 수준을 회복하기 위한 FXN 대체 요법으로 조사 중이다. FXN 융합 단백질은 전장 hFXN 단백질의 N-말단에 연결된 HIV-TAT 펩티드를 포함한다. FXN 융합 단백질의 작용 기전은 FXN 융합 단백질을 세포로 전달하는 HIV-TAT 펩티드의 세포 투과 능력과 미토콘드리아로의 전위 후 성숙한 hFXN으로의 후속 처리에 의존한다. FXN 융합 단백질은 미국 가출원 제62/891,029호 및 미국 특허출원 제16/942,276호에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
FXN 대체 요법의 개발을 촉진하기 위해 FXN 및 FXN 융합 단백질의 활성을 정확하고 안정적으로 정량화하는 방법이 필요하다. 예를 들어, FXN 융합 단백질을 생산하기 위한 제조 공정의 품질 관리 척도로서 FXN 융합 단백질의 다양한 배치의 활성을 정량화하는 것이 바람직하다. FXN 융합 단백질의 제조된 배치에 대한 적절한 저장 조건을 확인하기 위해 FXN 융합 단백질의 다양한 배치의 활성을 정량화하는 것이 또한 바람직하다. 본 발명은 이러한 충족되지 않은 요구를 다룬다.
따라서, 일부 측면에서 본 개시내용은 FXN 단백질을 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물과 조합하여 분석 혼합물을 생성하는 단계를 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 측정하는 방법을 제공한다. 여기서 FXN 단백질은 환원제의 산화 및 ROS의 생성을 촉진하여, 생성된 ROS의 양이 환원제 및 FXN 단백질이 없는 ROS 검출기 화합물을 포함하는 분석 혼합물에서 생성된 ROS의 양보다 더 많도록 한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 약 7.4 초과의 pH에서 FXN 단백질을 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물과 조합하는 것을 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 측정하는 방법을 제공하고, 이에 의해 분석 혼합물을 생성하고, 여기서 FXN 단백질은 환원제의 산화 및 ROS의 생성을 촉진하여, 생성된 ROS의 양이 환원제 및 FXN 단백질이 없는 ROS 검출기 화합물을 포함하는 분석 혼합물에서 생성된 ROS의 양보다 더 많다.
일부 실시양태에서, 방법은 약 7.9 이상의 pH에서 FXN 단백질을 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물과 조합하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 금속 이온의 부재 하에 FXN 단백질을 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물과 조합하는 것을 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 측정하는 방법을 제공하고, 이에 의해 분석 혼합물을 생성하고, 여기서 FXN 단백질은 환원제의 산화 및 ROS의 생성을 촉진하여, 생성된 ROS의 양이 환원제 및 FXN 단백질이 없는 ROS 검출기 화합물을 포함하는 분석 혼합물에서 생성된 ROS의 양보다 더 많다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 철 이온의 부재 하에 FXN 단백질을 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물과 조합하는 것을 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 측정하는 방법을 제공하고, 이에 의해 분석 혼합물을 생성하고, 여기서 FXN 단백질은 환원제의 산화 및 ROS의 생성을 촉진하여, 생성된 ROS의 양이 환원제 및 FXN 단백질이 없는 ROS 검출기 화합물을 포함하는 분석 혼합물에서 생성된 ROS의 양보다 더 많다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 분석 혼합물의 pH를 약 7.4보다 큰 pH로 조정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 분석 혼합물의 pH를 약 7.9 이상의 pH로 조정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 분석 혼합물에 금속 이온을 첨가하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 금속 이온은 Fe2+ 가 아니다. 일부 실시 양태에서, 금속 이온은 Mn2+, Fe3+, Zn2+, Cu2+ 및 Mg2+ 로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 금속 이온은 Mn2+이다. 다른 실시예에서, 금속은 Fe3+ 이다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 분석 혼합물을 배양하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 분석 혼합물에서 생성된 ROS의 양을 측정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 시간이 지남에 따라 분석 혼합물에서 생성된 ROS의 양을 측정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 규칙적인 시간 간격으로 생성된 ROS의 양을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 분석 혼합물의 인큐베이션 시작 후 약 0.1초 내지 약 10분마다, 예를 들어, 약 0.1초 내지 약 2초마다, 약 1초마다 내지 약 10초마다, 약 5초마다 내지 약 60초마다, 약 30초마다 내지 약 5분마다 또는 약 2분 내지 약 10분마다 생성된 ROS의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 분석 혼합물에서 ROS 생성의 최대 초기 속도(Vi)를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 최대 초기 속도(Ti)까지의 시간을 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 약 7.4 초과의 pH에서 FXN 단백질의 단위 활성을 측정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 FXN 단백질을 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물과 조합하는 것을 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 측정하는 방법을 제공하고, 이에 의해 분석 혼합물을 생성하고; 및 시간 경과에 따라 분석 혼합물에서 생성된 ROS의 양을 측정하고, 여기서 FXN 단백질은 환원제의 산화 및 ROS의 생성을 촉진하여, 생성된 ROS의 양이 환원제 및 FXN 단백질이 없는 ROS 검출기 화합물을 포함하는 분석 혼합물에서 생성된 ROS의 양보다 더 많다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 규칙적인 시간 간격으로 생성된 ROS의 양을 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 약 0.1초 내지 약 10분마다, 예를 들어, 약 0.1초 내지 약 2초마다, 약 1초 내지 약 10초마다, 약 5초 내지 약 60초마다, 약 30초 내지 약 5분마다 또는 약 2분 내지 약 10분마다 생성된 ROS의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 분석 혼합물에서 ROS 생성의 최대 초기 속도(Vi)를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 최대 초기 속도(Ti)까지의 시간을 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 FXN 단백질의 단위 활성을 결정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 환원제는 유기 화합물이다. 일부 실시양태에서, 환원제는 환원된 퀴논 화합물이다. 일부 실시양태에서, 환원된 퀴논 화합물은 환원된 벤조퀴논 화합물, 환원된 나프토퀴논 화합물 및 환원된 안트라퀴논 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 환원된 퀴논 화합물은 환원된 벤조퀴논 화합물이다. 일부 실시양태에서, 환원된 벤조퀴논 화합물은 히드로퀴논이다.
일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 형광 프로브 또는 화학발광 프로브이다. 일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 슈퍼옥사이드 음이온 검출 시약 또는 과산화수소 검출 시약이다. 일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 코엘렌테라진; 디히드로에티듐; 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF), 루시게닌, 루미놀, 키프리디나 루시페린 아날로그(CLA), 키프리디나 루시페린 메톡시-아날로그(MCLA), 메틸티아졸릴디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT), p-니트로테트라졸륨 블루(NBT), 레독스 센서 레드 CC-1, 2,3-비스-(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-2H-테트라졸륨-5-카복사닐리드(XTT) 및 이의 구조적 변이체 및 유사체로 이루어진 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인 디아세테이트(H2DCF)이다.
일부 실시양태에서, 환원제 및 ROS 검출기 화합물은 동일한 화합물이다. 일부 실시양태에서, 환원제 및 ROS 검출기 화합물은 상이한 화합물이다. 한 실시양태에서, 환원제는 디히드로퀴논이고 ROS 검출기 화합물은 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)이다.
일부 실시양태에서, FXN 단백질은 프라탁신(FXN)이다. 일부 실시양태에서, FXN 단백질은 전장 hFXN 및 세포 투과 펩티드(CPP)를 포함하는 FXN 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, CPP는 세포투과펩타이드 CPP 사이트 2.0 데이터베이스에 열거된 CPP의 군으로부터 선택된 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, CPP는 HIV-TAT, 갈라닌, 마스토파란, 트랜스포탄, 페네트라틴, 폴리아르기닌, VP22, 및 그의 변이체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, CPP는 HIV-TAT 또는 그의 변이체 또는 유도체를 포함한다. 일 실시양태에서, FXN 융합 단백질은 서열 12를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법에 따라 FXN 단백질의 활성을 측정하는 것을 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질을 포함하는 샘플에 대해 품질 관리를 수행하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 FXN 단백질, 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물을 포함하는 FXN 단백질의 활성을 측정하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물의 pH는 약 7.4 초과이다. 일부 실시양태에서, 조성물의 pH는 약 7.9 이상이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 금속 이온을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 금속 이온은 Fe2+ 가 아니다. 일부 실시양태에서, 금속 이온은 Mn2+, Fe3+, Zn2+, Cu2+ 및 Mg2+ 이루어진 군으로부터 선택된다.. 한 실시양태에서, 금속 이온은Fe3+ 이다. 다른 구체예에서, 금속 이온은 Mn2+ 이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 FXN 단백질, 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물을 포함하는 FXN 단백질의 활성을 측정하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물은 금속 이온을 실질적으로 함유하지 않는다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 FXN 단백질, 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물을 포함하는 FXN 단백질의 활성을 측정하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물에는 철 이온이 실질적으로 없다.
일부 실시양태에서, 조성물의 pH는 약 7.4 초과이다. 일부 실시양태에서, 조성물의 pH는 약 7.9 이상이다.
일부 실시양태에서, 환원제는 유기 화합물이다. 일부 실시양태에서, 환원제는 환원된 퀴논 화합물이다. 일부 실시양태에서, 환원된 퀴논 화합물은 환원된 벤조퀴논 화합물, 환원된 나프토퀴논 화합물 및 환원된 안트라퀴논 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 환원된 퀴논 화합물은 환원된 벤조퀴논 화합물이다. 일부 실시양태에서, 환원된 벤조퀴논 화합물은 히드로퀴논이다.
일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 형광 프로브 또는 화학발광 프로브이다. 일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 슈퍼옥사이드 음이온 검출 시약 또는 과산화수소 검출 시약이다. 일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 코엘렌테라진; 디히드로에티듐; 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF), 루시게닌, 루미놀, 키프리디나 루시페린 아날로그(CLA), 키프리디나 루시페린 메톡시-아날로그(MCLA), 메틸티아졸릴디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT), p-니트로테트라졸륨 블루(NBT), 레독스 센서 레드 CC-1, 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-술포페닐)-2H-테트라졸륨-5-카복사닐라이드(XTT) 및 구조 변이체 및 이들의 유사체로 이루어진 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)이다.
일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 동일한 화합물이다. 일부 실시양태에서, 환원제 및 ROS 검출기 화합물은 상이한 화합물이다. 한 실시양태에서, 환원제는 디히드로퀴논이고 ROS 검출기 화합물은 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)이다.
일부 실시양태에서, FXN 단백질은 프라탁신(FXN)이다. 일부 실시양태에서, FXN 단백질은 전장 hFXN 및 세포 투과 펩티드(CPP)를 포함하는 FXN 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, CPP는 Database of Cell-Penetrating Peptides CPPsite 2.0에 열거된 CPP의 군으로부터 선택된 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, CPP는 HIV-TAT, 갈라닌, 마스토파란, 트랜스포탄, 페네트라틴, 폴리아르기닌, VP22, 및 그의 변이체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, CPP는 HIV-TAT 또는 그의 변이체 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, FXN 융합 단백질은 서열 12를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 FXN 단백질을 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 FXN 단백질은 약 1000mU/mg의 FXN 단백질 내지 약 6500mU/mg의 FXN 단백질의 범위 내에서 히드로퀴논 환원의 특이적 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 히드로퀴논 환원의 비활성은 약 1200 mU/mg 내지 약 6000 mU/mg 범위 내이다. 일부 실시양태에서, 비활성은 약 1400 mU/mg 내지 약 5900 mU/mg 범위 내이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 환원제, ROS 검출기 화합물 및 환원제, ROS 검출기 화합물 및 FXN 단백질을 조합하기 위한 설명서를 포함하는 FXN 단백질의 활성을 측정하기 위한 키트를 제공하고, 그렇게 함으로써 분석 혼합물을 생성한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 환원제, ROS 검출기 화합물 및 환원제, ROS 검출기 화합물 및 FXN 단백질을 조합하기 위한 설명서를 포함하는 FXN 단백질의 활성을 측정하기 위한 키트를 제공하고, 이에 의해 분석 혼합물을 생성하고; 분석 혼합물에서 FXN 단백질의 Vi를 결정한다.
일부 실시양태에서, 키트는 금속 이온 화합물을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 금속 이온 화합물은 Mn2+, Fe3+, Zn2+, Cu2+ 및 Mg2+로 이루어진 군으로부터 선택된 이온을 포함한다. 한 실시양태에서, 금속 이온 화합물은 Fe3+를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 금속 이온 화합물은 Mn2+를 포함한다.
일부 실시양태에서, 환원제는 유기 화합물이다. 일부 실시양태에서, 환원제는 환원된 퀴논 화합물이다. 일부 실시양태에서, 환원된 퀴논 화합물은 환원된 벤조퀴논 화합물, 환원된 나프토퀴논 화합물 및 환원된 안트라퀴논 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 환원된 퀴논 화합물은 환원된 벤조퀴논 화합물이다. 일부 실시양태에서, 환원된 벤조퀴논 화합물은 히드로퀴논이다.
일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 형광 프로브 또는 화학발광 프로브이다. 일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 슈퍼옥사이드 음이온 검출 시약 또는 과산화수소 검출 시약이다. 일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 코엘렌테라진; 디히드로에티듐; 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF), 루시게닌, 루미놀, 키프리디나 루시페린 아날로그(CLA), 키프리디나 루시페린 메톡시-아날로그(MCLA), 메틸티아졸릴디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT), p-니트로테트라졸륨 블루(NBT), 레독스 센서 레드 CC-1, 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-술포페닐)-2H-테트라졸륨-5-카복사닐라이드(XTT) 및 이들의 구조 변이체 및 이들의 유사체로 이루어진 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)이다.
일부 실시양태에서, 환원제 및 ROS 검출기 화합물은 동일한 화합물이다. 일부 실시양태에서, 환원제 및 ROS 검출기 화합물은 상이한 화합물이다. 일부 실시양태에서, 환원제는 디히드로퀴논이고 ROS 검출기 화합물은 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은: (i) FXN 단백질을 시험 화합물, 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물과 조합하여 분석 혼합물을 생성하고, 여기서 FXN 단백질은 환원제의 산화 및 ROS의 생성을 촉진하는 단계; (ii) 시험 화합물의 존재 하에 생성된 ROS의 양을 측정하는 단계; (iii) 시험 화합물의 존재 하에 생성된 ROS의 양을 시험 화합물의 부재 하에 생성된 ROS의 양과 비교하는 단계; 및 (iv) 시험 화합물의 존재 하에 생성된 ROS의 양이 시험 화합물의 부재 하에 생성된 ROS의 양과 다를 때 FXN 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물로서 시험 화합물을 확인하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 분석 혼합물(assay mixture)을 인큐베이션하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (ii)는 시간 경과에 따라 분석 혼합물에서 생성된 ROS의 양을 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (ii)는 규칙적인 시간 간격으로 생성된 ROS의 양을 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (ii)는 0.1초마다 내지 10분마다, 예를 들어, 약 0.1초마다 내지 약 2초마다, 약 1초마다 내지 약 10초마다, 약 5초마다 내지 약 60초마다, 약 30초마다 내지 약 5분마다 또는 약 2분마다 내지 약 10분마다 생성된 ROS의 양을 측정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 분석 혼합물에서 ROS 생성의 최대 초기 속도(Vi)를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 최대 초기 속도(Ti)까지의 시간을 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 FXN 단백질의 단위 활성을 결정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 시험 화합물의 존재 하에 FXN 단백질의 Vi를 시험 화합물의 부재 하에 FXN 단백질의 Vi와 비교하는 단계; 및 시험 화합물의 존재 하에 FXN 단백질의 Vi가 시험 화합물의 부재 하에 FXN 단백질의 Vi와 상이할 때 FXN 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물로서 시험 화합물을 확인하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 확인하는 것을 포함하고, 상기 방법은: (i) FXN 단백질을 시험 화합물, 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물과 조합하여 분석 혼합물을 생성하고, 여기서 FXN 단백질은 환원제의 산화 및 ROS의 생성을 촉진하는 단계; (ii) 시험 화합물의 존재 하에 생성된 ROS의 양을 측정하고 FXN 단백질의 Vi를 결정하는 단계; (iii) 시험 화합물의 존재 하에 FXN 단백질의 Vi를 시험 화합물의 부재 하에 FXN 단백질의 Vi와 비교하는 단계; 및 (iv) 시험 화합물의 존재 하에 FXN 단백질의 Vi가 시험 화합물의 부재 하에 FXN 단백질의 Vi와 상이할 때 FXN 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물로서 시험 화합물을 확인하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 분석 혼합물의 pH를 약 7.4 초과의 pH로 조정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 분석 혼합물의 pH를 약 7.9 이상의 pH로 조정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 분석 혼합물에 금속 이온을 첨가하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 금속 이온은 Mn2+, Fe3+, Zn2+, Cu2+ 및 Mg2+로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 금속 이온은 Mn2+이다. 다른 구체예에서, 금속 이온은 Fe3+이다.
일부 실시양태에서, 환원제는 유기 화합물이다. 일부 실시양태에서, 환원제는 환원된 퀴논 화합물이다. 일부 실시양태에서, 환원된 퀴논 화합물은 환원된 벤조퀴논 화합물, 환원된 나프토퀴논 화합물 및 환원된 안트라퀴논 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 환원된 퀴논 화합물은 환원된 벤조퀴논 화합물이다. 일부 실시양태에서, 환원된 벤조퀴논 화합물은 히드로퀴논이다.
일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 형광 프로브 또는 화학발광 프로브이다. 일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 슈퍼옥사이드 음이온 검출 시약 또는 과산화수소 검출 시약이다. 일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 코엘렌테라진; 디히드로에티듐; 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF), 루시게닌, 루미놀, 키프리디나 루시페린 아날로그(CLA), 키프리디나 루시페린 메톡시-아날로그(MCLA), 메틸티아졸릴디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT), p-니트로테트라졸륨 블루(NBT), 레독스 센서 레드 CC-1, 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-술포페닐)-2H-테트라졸륨-5-카복사닐라이드(XTT) 및 구조 변이체 및 이들의 유사체로 이루어진 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)이다.
일부 실시양태에서, 환원제 및 ROS 검출기 화합물은 동일한 화합물이다. 일부 실시양태에서, 환원제 및 ROS 검출기 화합물은 상이한 화합물이다. 한 실시양태에서, 환원제는 디히드로퀴논이고 ROS 검출기 화합물은 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)이다.
일부 실시양태에서, FXN 단백질은 프라탁신(FXN)이다. 일부 실시양태에서, FXN 단백질은 전장 hFXN 및 세포 투과 펩티드(CPP)를 포함하는 FXN 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, CPP는 Database of Cell-Penetrating Peptides CPPsite 2.0에 열거된 CPP의 군으로부터 선택된 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, CPP는 HIV-TAT, 갈라닌, 마스토파란, 트랜스포탄, 페네트라틴, 폴리아르기닌, VP22, 및 그의 변이체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, CPP는 HIV-TAT 또는 그의 변이체 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, FXN 융합 단백질은 서열 12를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 FXN 단백질을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 FXN 단백질의 활성은 본 개시내용의 방법에 따라 측정되었다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 FXN 단백질 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공하며, 여기서 FXN 단백질의 활성은 본 개시내용의 방법에 따라 측정되었다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법에 따라 FXN 단백질의 활성을 측정하고, FXN 단백질을 제제화함으로써 제약 조성물을 제조하는 것을 포함하는, FXN 단백질을 포함하는 제약 조성물의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 FXN 단백질을 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물과 조합함으로써 분석 혼합물을 생성하는 것을 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 측정하는 방법을 제공하고, 여기서 FXN 단백질은 환원제의 산화 및 ROS의 생성을 촉진한다.
일부 실시양태에서, 방법은 금속 이온을 분석 혼합물에 첨가하는 것을 추가로 포함한다. 추가 측면에서, 금속 이온은 Mn2+, Fe3+, Zn2+, Cu2+ 및 Mg2+로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 추가 양태에서, 금속 이온은 Fe2+ 이다. 또 다른 추가 측면에서, 금속 이온은 Mn2+이다.
일부 실시양태에서, 방법은 분석 혼합물을 인큐베이션하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 생성된 ROS의 양을 측정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 생성된 ROS의 양을 FXN 단백질의 활성과 상관시켜 FXN 단백질의 활성을 결정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 환원제는 유기 화합물이다. 일부 측면에서, 환원제는 환원된 퀴논 화합물이다. 일부 측면에서, 환원된 퀴논 화합물은 환원된 벤조퀴논 화합물, 환원된 나프토퀴논 화합물 및 환원된 안트라퀴논 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 환원된 퀴논 화합물은 환원된 벤조퀴논 화합물이다. 한 실시양태에서, 환원된 벤조퀴논 화합물은 히드로퀴논이다.
일부 측면에서, ROS 검출기 화합물은 형광 프로브 또는 화학발광 프로브이다. 일부 측면에서, ROS 검출기 화합물은 슈퍼옥사이드 음이온 검출 시약 또는 과산화수소 검출 시약이다. 일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 코엘렌테라진; 디히드로에티듐; 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF), 루시게닌, 루미놀, 키프리디나 루시페린 아날로그(CLA), 키프리디나 루시페린 메톡시-아날로그(MCLA), 메틸티아졸릴디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT), p-니트로테트라졸륨 블루(NBT), 레독스센서 레드 CC-1, 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-술포페닐)-2H-테트라졸륨-5-카복사닐라이드(XTT) 및 구조 변이체 및 이들의 유사체로 이루어진 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)이다.
일부 실시양태에서, 환원제 및 ROS 검출기 화합물은 동일한 화합물이다. 다른 실시양태에서, 환원제 및 ROS 검출기 화합물은 상이한 화합물이다.
일부 실시양태에서, 환원제는 디히드로퀴논이고 ROS 검출기 화합물은 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)이다.
일부 측면에서, FXN 단백질은 프라탁신(FXN)이다. 일부 측면에서, FXN 단백질은 전장 hFXN 및 세포 투과 펩티드(CPP)를 포함하는 FXN 융합 단백질이다.
일부 실시양태에서, CPP는 Database of Cell-Penetrating Peptides CPPsite 2.0에 열거된 CPP의 군으로부터 선택된 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, CPP는 HIV-TAT, 갈라닌, 마스토파란, 트랜스포탄, 페네트라틴, 폴리아르기닌, VP22, 및 그의 변이체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드를 포함한다. 한 측면에서, CPP는 HIV-TAT 또는 그의 변이체 또는 유도체를 포함한다.
일부 실시양태에서, FXN 융합 단백질은 서열 12를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법에 따라 FXN 단백질의 활성을 측정하는 것을 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질을 포함하는 샘플에 대해 품질 관리를 수행하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 FXN 단백질, 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물을 포함하는 FXN 단백질의 활성 측정용 조성물을 제공한다.
일부 측면에서, 조성물은 금속 이온을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 금속 이온은 Mn2+, Fe3+, Zn2+, Cu2+ 및 Mg2+로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 추가 양태에서, 금속 이온은 Fe2+이다. 또 다른 추가 측면에서, 금속 이온은 Mn2+ 이다.
일부 실시양태에서, 환원제는 유기 화합물이다. 일부 실시양태에서, 환원제는 환원된 퀴논 화합물이다. 일부 측면에서, 환원된 퀴논 화합물은 환원된 벤조퀴논 화합물, 환원된 나프토퀴논 화합물 및 환원된 안트라퀴논 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 환원된 퀴논 화합물은 환원된 벤조퀴논 화합물이다. 한 측면에서, 환원된 벤조퀴논 화합물은 히드로퀴논이다.
일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 형광 프로브 또는 화학발광 프로브이다. 일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 슈퍼옥사이드 음이온 검출 시약 또는 과산화수소 검출 시약이다. 일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 코엘렌테라진; 디히드로에티듐; 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF), 루시게닌, 루미놀, 키프리디나 루시페린 아날로그(CLA), 키프리디나 루시페린 메톡시-아날로그(MCLA), 메틸티아졸릴디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT), p-니트로테트라졸륨 블루(NBT), 레독스 센서 레드 CC-1, 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-술포페닐)-2H-테트라졸륨-5-카복사닐라이드(XTT) 및 구조 변이체 및 이들의 유사체로 이루어진 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)이다.
일부 측면에서, 환원제 및 ROS 검출기 화합물은 동일한 화합물이다. 다른 측면에서, 환원제 및 ROS 검출기 화합물은 상이한 화합물이다. 한 측면에서, 환원제는 디히드로퀴논이고 ROS 검출기 화합물은 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)이다.
일부 실시양태에서, FXN 단백질은 프라탁신(FXN)이다. 일부 실시양태에서, FXN 단백질은 전장 hFXN 및 세포 투과 펩티드(CPP)를 포함하는 FXN 융합 단백질이다. 일부 측면에서, CPP는 Database of Cell-Penetrating Peptides CPPsite 2.0에 열거된 CPP의 군으로부터 선택된 펩티드를 포함한다. 일부 측면에서, CPP는 HIV-TAT, 갈라닌, 마스토파란, 트랜스포탄, 페네트라틴, 폴리아르기닌, VP22, 및 그의 변이체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, CPP는 HIV-TAT 또는 그의 변이체 또는 유도체를 포함한다.
일 측면에서, FXN 융합 단백질은 SEQ ID NO: 12를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 FXN 단백질을 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 FXN 단백질은 약 1000 mU/mg의 FXN 단백질 내지 약 6500 mU/mg의 FXN 단백질의 범위 내에서 히드로퀴논 환원의 특이적 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 히드로퀴논 환원의 비활성은 약 1200 mU/mg 내지 약 6000 mU/mg 범위 내이다. 일부 실시양태에서, 비활성은 약 1400 mU/mg 내지 약 5900 mU/mg 범위 내이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은: (i) FXN 단백질을 시험 화합물, 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물과 조합하여 분석 혼합물을 생성하고, 여기서 FXN 단백질은 환원제의 산화 및 ROS의 생성을 촉진하는 단계; (ii) 시험 화합물의 존재 하에 생성된 ROS의 양을 측정하는 단계; (iii) 시험 화합물의 존재 하에 생성된 ROS의 양을 시험 화합물의 부재 하에 생성된 ROS의 양과 비교하는 단계; 및 (iv) 시험 화합물의 존재 하에 생성된 ROS의 양이 시험 화합물의 부재 하에 생성된 ROS의 양과 다를 때 FXN 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물로서 시험 화합물을 확인하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 방법은 분석 혼합물을 인큐베이션하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 생성된 ROS의 양을 FXN 단백질의 활성과 상관시켜 FXN 단백질의 활성을 측정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 환원제는 유기 화합물이다. 일부 실시양태에서, 환원제는 환원된 퀴논 화합물이다. 일부 실시양태에서, 환원된 퀴논 화합물은 환원된 벤조퀴논 화합물, 환원된 나프토퀴논 화합물 및 환원된 안트라퀴논 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 환원된 퀴논 화합물은 환원된 벤조퀴논 화합물이다. 한 측면에서, 환원된 벤조퀴논 화합물은 히드로퀴논이다.
일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 형광 프로브 또는 화학발광 프로브이다. 일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 슈퍼옥사이드 음이온 검출 시약 또는 과산화수소 검출 시약이다. 일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 코엘렌테라진; 디히드로에티듐; 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF), 루시게닌, 루미놀, 키프리디나 루시페린 아날로그(CLA), 키프리디나 루시페린 메톡시-아날로그(MCLA), 메틸티아졸릴디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT), p-니트로테트라졸륨 블루(NBT), 레독스 센서 레드 CC-1, 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-술포페닐)-2H-테트라졸륨-5-카복사닐라이드(XTT) 및 구조 변이체 및 이들의 유사체로 이루어진 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)이다.
일부 측면에서, 환원제 및 ROS 검출기 화합물은 동일한 화합물이다. 다른 측면에서, ROS 검출기 화합물은 상이한 화합물이다.
한 특정 실시양태에서, 환원제는 디히드로퀴논이고 ROS 검출기 화합물은 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)이다.
일부 실시양태에서, FXN 단백질은 프라탁신(FXN)이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 FXN 단백질을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 FXN 단백질의 활성은 본 개시내용에 의해 제공된 방법에 따라 측정되었다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 FXN 단백질 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공하며, 여기서 FXN 단백질의 활성은 본 개시내용의 제공된 방법에 따라 측정되었다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 본 개시내용에 의해 제공된 방법에 따라 FXN 단백질의 활성을 측정하고, FXN 단백질을 제형화함으로써 제약 조성물을 제조하는 것을 포함하는, FXN 단백질을 포함하는 제약 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 프라탁신 활성의 정량화 방법이 제공된다.
본 발명의 실시예의 비제한적인 예는 이 단락 다음에 나열되는 여기에 첨부된 도면을 참조하여 아래에 설명된다. 둘 이상의 그림에 나타나는 동일한 기능은 일반적으로 나타나는 모든 그림에서 동일한 레이블로 레이블이 지정된다. 도면에서 본 개시의 실시예의 주어진 특징을 나타내는 아이콘을 라벨링하는 라벨은 주어진 특징을 참조하기 위해 사용될 수 있다. 그림에 표시된 기능의 치수는 표현의 편의와 명확성을 위해 선택되었으며 반드시 축척으로 표시되지는 않는다.
도 1은 시간 경과에 따라 생성된 반응성 산소 종(ROS)의 양으로 측정된 예시적인 FXN 융합 단백질의 존재 하에 하이드로퀴논(HQ) 환원의 동역학을 도시한다. ROS의 양은 임의의 형광 단위(AFU)로 측정된 형광으로 표시된다. 도 1의 패널 A는 본 발명의 일 실시예에 따른 FXN 융합 단백질의 존재 또는 부재 하에 하이드로퀴논(HQ)의 산화를 통한 슈퍼옥사이드(O2· -) 생성의 동역학을 나타내는 그래프이다. 도 1의 패널 B는 본 개시내용의 실시양태에 따른, Mn2+ 및 Fe3+와 같은 금속 이온 및 FXN 융합 단백질의 존재 하에 슈퍼옥사이드 생성의 동역학을 나타내는 그래프이다. 도 1의 패널 C는 FXN 융합 단백질과 Fe3+ (회색 사각형); FXN 융합 단백질의 존재 및 Fe3+ 의 부재(회색 원); FXN 융합 단백질, Fe3+ 및 데페록사민(검은색 원)이 있는 경우; 및 FXN 융합 단백질이 없는 경우(작은 검은색 직사각형)의 존재하에서 슈퍼옥사이드 생성의 동역학을 보여주는 그래프이다.
도 2는 ROS 검출기 화합물 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인 디아세테이트(H2DCFDA)의 산화 생성물인 2',7'-디클로로플루오레세인(DCF)에 대한 표준 곡선이다. 본 개시내용의 실시양태에 따라, DCF 농도(μM 단위)의 함수로서 디클로로플루오레세인(DCF)에 의해 나타나는 형광(AFU)을 그래프화하여 표준 곡선을 생성하였다.
도 3은 예시적 FXN 융합 단백질의 다양한 배치의 특이적 활성을 나타내며, 여기서 상이한 배치는 FXN 융합 단백질의 상이한 농도에 있고 NADH 또는 NADPH로 처리될 때이다. 도 3의 패널 A는 본 개시내용의 실시양태에 따른 다양한 농도의 FXN 융합 단백질(0.03μM, 0.1μM, 0.3μM, 및 1μM)에서 FXN 융합 단백질(배치 05, 18, 28 및 32)의 4가지 다른 배치의 비활성(밀리그램당 밀리단위, mUnits/mg로 표시)을 보여주는 막대 그래프이다. 도 3의 패널 B는 본 개시내용의 실시양태에 따른 Fe3+, Fe3+ 및 NADH, 그리고 Fe3+ 및 NADPH의 존재 하에 FXN 융합 단백질의 비활성(mUnits/mg)을 나타내는 막대 그래프이다.
도 4는 예시적인 FXN 융합 단백질의 HQ-의존성 슈퍼옥사이드 생성 활성에 대한 저장 온도의 영향을 도시한다. 도 4의 패널 A는 -60 oC, 2-4 oC 및 25 oC에서 보관된 FXN 융합 단백질의 존재하에서, 본 개시내용의 실시양태에 따른 약물 물질(DS) 대조군과 비교하여 슈퍼옥사이드 생성의 동역학을 보여주는 그래프이다. 도 4의 패널 B는 -60 oC, 2-4 oC 및 25 oC에서 보관된 FXN 융합 단백질의 존재하에서, 본 개시내용의 실시예에 따른 물질(DS) 대조군과 비교하여 과산화물 생성의 최대 초기 속도(Vi)를 약물 대비 막대 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 예시적인 FXN 융합 단백질의 활성에 대한 화학적 처리의 효과를 보여준다. 구체적으로, 도 5는 본 개시의 실시예와 함께 FXN 융합 단백질의 존재에 따른 산화제 존재 및 승온 조건에서 저 pH 및 고 pH에서 보관된 슈퍼옥사이드 생성의 최대 초기 속도(Vi)를 나타내는 막대 그래프이다.
도 6은 상이한 금속 이온의 존재 하에 예시적인 FXN 융합 단백질의 HQ-의존성 슈퍼옥사이드 생성 활성의 동역학을 나타내는 그래프이다.
도 7은 pH의 함수로서 예시적인 FXN 융합 단백질의 활성의 측정으로서 Vi를 나타내는 그래프이다.
도 8은 고처리량 스크리닝(HTS)에 사용된 조건에서 본 개시내용의 FXN 활성 검정의 성능을 검증하도록 설계된 실험의 결과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 도 8의 그래프는 플레이트 1 및 2에 대해 10μM FXN 융합 단백질(높은 대조군), 5μM FXN 융합 단백질(낮은 대조군) 및 0μM FXN 융합 단백질(블랭크 대조군)을 함유하는 각 시험 샘플에 대해 결정된 Vi 값을 도시한다.
도 9는 HTS 실험에 포함된 3단계 및 관련 결과를 보여주는 순서도이다.
도 10은 FXN 활성을 30% 이상 증가시키는 화합물, FXN 활성을 30% 이상 감소시키는 화합물 및 FXN 활성의 변화를 30% 미만으로 유발하는 화합물을 포함하는 DMSO에서 화합물의 HTS 1차 스크린의 결과를 보여주는 상자 플롯이다.
도 11은 화합물 1 및 화합물 2(화합물 1은 FXN 융합 단백질의 부재 하에 활성이 없는 것으로서 카운터 스크린을 통과함); 및 FXN 융합 단백질의 부재 하에 활성을 갖는 것으로서 카운터 스크린에 실패한 화합물 2에 대한 확인 화면의 예시적인 결과를 나타내는 막대 그래프이다.
FXN 단백질의 활성을 측정하기 위한 방법 및 조성물
본 개시내용은 FXN 단백질의 활성을 측정하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 FXN 단백질, 예를 들어 FXN 융합 단백질, 예를 들어 서열 식별 번호: 12의 아미노산 서열을 갖는 예시적인 FXN 융합 단백질이 특히, 환원제의 존재 하에 과산화물(O2·-)에서 반응성 산소종(ROS)의 생성을 촉매할 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다. 본 개시는 또한 ROS의 역학, 예를 들어, 슈퍼옥사이드, 환원제의 존재 하에 FXN 단백질에 의한 생성은 효소 반응을 나타낸다. 따라서, 특정 이론에 얽매이지 않고, FXN 단백질의 생물학적 활성은 ROS의 효소 촉매 생성을 포함하는 것으로 여겨진다.
FXN 단백질이 ROS, 예를 들어 슈퍼옥사이드의 생성을 촉매할 수 있다는 발견은 FXN이 ROS의 생성을 억제할 수 있다는 당업계의 이전 보고서를 고려할 때 특히 놀라운 것이다. 특히, Vyas et al., Human Molecular Genetics 2012, 21(6):1230-1247(이하 "Vyas")에는 FXN 융합 단백질, TAT-FXN이 황산제일철 및 하이드로퀴논(HQ)과 혼합될 때, 자유 제1철 및 제2철 이온을 결합하고 이들이 초과산화물을 생성하는 활성 산화환원 순환에 참여하는 것을 방지하여 초과산화물을 생성한다. 그러나 Vyas에 설명된 분석은 효소 활성을 측정하지 않는 정적 종말점 분석이므로 FXN 단백질의 효소 퍼옥시다제 활성을 측정하지 않는다. 대조적으로, 본 개시내용의 FXN 단백질의 활성을 측정하는 방법은 일부 실시양태에서 ROS 생성의 동역학적 측정을 포함한다. 본 개시내용의 FXN 단백질의 활성을 측정하는 방법은 또한 일부 실시양태에서 FXN 단백질의 활성을 생성하는 ROS와 관련된 효소 파라미터의 확인을 포함한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 FXN 단백질을 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물과 조합하는 것을 포함하는, FXN 단백질의 활성을 위한 방법을 제공하고, 이에 의해 분석 혼합물을 생성하고, 여기서 FXN 단백질은 환원제의 산화 및 ROS의 생성을 촉진하여, 생성된 ROS의 양이 환원제 및 FXN 단백질이 없는 ROS 검출기 화합물을 포함하는 분석 혼합물에서 생성된 ROS의 양보다 높도록 한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 FXN 단백질을 환원제 및 ROS 검출기 화합물과 조합하여 분석 혼합물을 생성하는 단계; 및 시간 경과에 따라 분석 혼합물에서 생성된 ROS의 양을 측정하는 단계를 제공하고, 여기서 FXN 단백질은 환원제의 산화 및 ROS의 생성을 촉진하여, 생성된 ROS의 양이 환원제 및 FXN 단백질이 없는 ROS 검출기 화합물을 포함하는 분석 혼합물에서 생성된 ROS의 양보다 많도록 한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 FXN 단백질을 환원제 및 ROS 검출기 화합물과 조합하는 것을 포함하는, FXN 단백질의 활성을 측정하고, 이에 의해 분석 혼합물을 생성하는 단계; 및 FXN 단백질의 최대 초기 속도(Vi)를 결정하는 단계를 위한 방법을 제공한다. 본 명세서에 사용된 용어 "최대 초기 속도" 또는 "Vi"는 시간 경과에 따른 임의 형광 단위(AFU)의 가장 빠른 변화 속도를 의미한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 또한 최대 초기 속도(Ti)까지의 시간, 즉 분석 혼합물이 최대 초기 속도에 도달하는 데 걸리는 시간을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 또한 FXN 단백질의 단위 활성, 예를 들어 FXN 단백질의 밀리단위 활성을 결정하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "FXN 단백질의 밀리유닛 활성"은 약 7.4 초과의 pH, 예를 들어, 약 7.9의 pH에서 분당 1마이크로몰의 2',7'-디클로로플루오레세인(DCF) 생성을 촉매하는 데 필요한 FXN 단백질의 양으로 정의된다.
Vyas에 설명된 분석은 Fe2+의 존재를 필요로 한다. 대조적으로, 본 발명에서 제공하는 FXN 단백질의 활성을 측정하는 방법은 금속 이온의 부재 또는 존재 하에 수행될 수 있다. 놀랍게도 금속 이온의 존재는 FXN 단백질의 ROS 생성 활성에 필요하지 않지만 Fe3+ 및 Mn2+와 같은 금속 이온이 FXN 단백질의 ROS 생성 활성을 향상시킨다는 것이 발견되었다. 특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 금속 이온은 FXN 단백질에 결합하고 그 형태를 안정화시켜 ROS 생성 활성을 향상시킬 수 있다고 믿어진다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 FXN 단백질을 금속 이온의 부재 하에 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물과 조합하는 것을 포함하는, FXN 단백질의 활성을 측정하는 방법을 제공하고, 이에 의해 분석 혼합물을 생성하고, 여기서 FXN 단백질은 환원제의 산화 및 ROS의 생성을 촉진하여, 생성된 ROS의 양이 환원제 및 FXN 단백질이 없는 ROS 검출기 화합물을 포함하는 분석 혼합물에서 생성된 ROS의 양보다 더 많다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 철 이온의 부재 하에 FXN 단백질을 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물과 조합하는 것을 포함하는, FXN 단백질의 활성을 측정하는 방법을 제공하고, 이에 의해 분석 혼합물을 생성하고, 여기서 FXN 단백질은 환원제의 산화 및 ROS의 생성을 촉진하여, 생성된 ROS의 양이 환원제 및 FXN 단백질이 없는 ROS 검출기 화합물을 포함하는 분석 혼합물에서 생성된 ROS의 양보다 더 많다. 일부 실시양태에서, 철 이온은 Fe2+ 및/또는 Fe3+ 일 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 FXN 단백질을 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물과 조합함으로써 분석 혼합물을 생성하는 것을 포함하는 FXN 단백질의 활성을 측정하는 방법을 제공하고, 여기서 FXN 단백질은 환원제의 산화 및 ROS의 생성을 촉진하여, 생성된 ROS의 양이 환원제 및 FXN 단백질이 없는 ROS 검출기 화합물을 포함하는 분석 혼합물에서 생성된 ROS의 양보다 더 많으며, 환원제의 산화 및 ROS의 생성은 금속 이온의 부재 하에 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 FXN 단백질을 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물과 조합하는 것을 포함하는 FXN 단백질의 활성을 측정하는 방법을 제공하고, 이에 의해 분석 혼합물을 생성하고, 여기서 FXN 단백질은 환원제의 산화 및 ROS의 생성을 촉진하여, 생성된 ROS의 양이 환원제 및 FXN 단백질이 없는 ROS 검출기 화합물을 포함하는 분석 혼합물에서 생성된 ROS의 양보다 높도록 하고, 환원제의 산화 및 ROS의 생성은 철 이온의 부재하에 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 철 이온은 Fe2+ 및/또는 Fe3+일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "금속 이온의 부재 하에"는 금속 이온, 예를 들어 Fe3+ 또는 Mg2+를 분석 혼합물에 첨가하지 않고 FXN 단백질의 활성을 측정하는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 첨가된 금속 이온을 함유하지 않지만 그럼에도 불구하고 미량의 금속 이온을 함유할 수 있는 분석 혼합물에서 FXN 단백질의 활성을 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 금속 이온은 Mn2+, Fe3+, Fe2+, Zn2+, Cu2+ 및 Mg2+ 중 하나 이상일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "철 이온의 부재 하에"는 철 이온, 예를 들어, Fe2+, Fe3+, 또는 Mn2+를 분석 혼합물에 첨가하지 않고 FXN 단백질의 활성을 측정하는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 첨가된 철 이온을 함유하지 않지만 그럼에도 불구하고 미량의 철 이온을 함유할 수 있는 분석 혼합물에서 FXN 단백질의 활성을 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분석 혼합물은 미량의 철 이온, 예를 들어, Fe2+ 및/또는 Fe3+ 이온 및/또는 Mn2+ 를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "금속 이온의 미량" 또는 "금속 이온의 미량"은 매우 적은 양의 금속 이온, 예를 들어 약 0.2ppm 미만, 예를 들어, 약 0.1ppm 미만, 약 0.05ppm 미만 또는 약 0.01ppm 미만, 또는 약 0.05-0.2ppm 미만. 일부 실시양태에서, 용어 "미량의 금속 이온" 또는 "미량의 금속 이온"은 분석 혼합물 리터당 금속 이온 약 100㎍ 이하를 지칭한다. 일부 실시예에서, 금속 이온은 Mn2+, Fe3+, Fe2+, Zn2+, Cu2+ 및 Mg2+ 중 하나 이상일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 FXN 단백질, 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물을 포함하는 FXN 단백질의 활성을 측정하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물에는 금속 이온이 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 FXN 단백질, 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물을 포함하는 FXN 단백질의 활성을 측정하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물에는 철 이온이 실질적으로 없다.
본 명세서에서 "금속 이온이 실질적으로 없는"이라는 용어는 금속 이온이 첨가되지 않은 조성물을 의미한다. 일부 실시양태에서, 금속 이온이 실질적으로 없는 조성물은 미량의 금속 이온을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 "철 이온이 실질적으로 없는"이라는 용어는 철 이온이 첨가되지 않은 조성물을 의미한다. 일부 실시양태에서, 금속 이온이 실질적으로 없는 조성물은 미량의 철 이온을 포함할 수 있고, 예를 들면, Fe2+ 및/또는 Fe3+이다.
Vyas에 기술된 분석은 일반적으로 pH가 약 7.4인 PBS에서 수행되었다. Vyas에 기술된 검정과 대조적으로, 놀랍게도 본 개시내용의 방법을 사용하여 측정된 FXN 단백질의 활성이 약 7.4의 pH에서 낮거나 없다는 것이 발견되었다. 실시예 7에 기술되고 도 7에 예시된 바와 같이, FXN 단백질의 활성은 pH 의존적이며, 약 7.4의 pH에서 낮거나 없는 수준으로부터 약 8.5의 pH에서 피크로 증가한다. 특정 이론에 얽매이지 않고, 약 7.4의 pH에서의 활성과 비교하여 약 7.4 초과의 pH에서의 FXN 단백질의 증가된 활성은 FXN이 미토콘드리아 단백질이라는 사실을 반영하는 것으로 여겨진다. pH가 약 7.8인 미토콘드리아 기질 내에서 작용한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 약 7.4 초과의 pH에서 FXN 단백질을 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물과 조합하는 것을 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 측정하는 방법을 제공하고, 이에 의해 분석 혼합물을 생성하고, 여기서 FXN 단백질은 환원제의 산화 및 ROS의 생성을 촉진하고, 생성된 ROS의 양이 FXN 단백질이 없는 ROS 검출기 화합물 및 환원제를 포함하는 분석 혼합물에서 생성된 ROS의 양보다 더 많도록 한다. 일부 실시양태에서, FXN 단백질은 약 7.5 초과, 약 7.6 초과, 약 7.7 초과, 약 7.8 초과, 약 7.9 초과, 약 8.0 초과, 약 8.1 초과, 약 8.2 초과, 약 8.3 초과, 약 8.4 초과, 약 8.5 초과, 약 8.6 초과, 약 8.7 초과, 약 8.8 초과, 약 8.9 초과, 또는 약 9.0 초과의 pH에서 환원제 및 ROS 검출기 화합물과 조합될 수 있다. 한 실시양태에서, pH는 약 7.9 초과일 수 있다.
일부 실시양태에서, FXN 단백질은 약 7.5 이상, 약 7.6 이상, 약 7.7 이상, 약 7.8 이상, 약 7.9 이상, 약 8.0 이상, 약 8.1 이상, 약 8.2 이상, 약 8.3 이상, 약 8.4 이상, 약 8.5 이상, 약 8.6 이상, 약 8.7 이상, 약 8.8 이상, 약 8.9 이상, 또는 약 9.0 이상의 pH에서 환원제 및 ROS 검출기 화합물과 조합될 수 있다. 한 실시양태에서, pH는 약 7.9 이상일 수 있다.
일부 실시양태에서, FXN 단백질은 약 7.4 내지 약 8.0, 약 7.6 내지 약 8.3, 약 7.7 내지 약 8.4, 약 7.9 내지 약 8.7, 약 8.0 내지 약 8.5, 약 8.2 내지 약 8.7, 약 8 내지 약 9, 또는 약 8.5 내지 약 9의 pH에서 환원제 및 ROS 검출기 화합물과 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 FXN 단백질, 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물을 포함하는 FXN 단백질의 활성을 측정하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물의 pH는 약 7.4 초과, 예를 들어, 약 7.5 초과, 약 7.6 초과, 약 7.7 초과, 약 7.8 초과, 약 7.9 초과, 약 8.0 초과, 약 8.1 초과, 약 8.2 초과, 약 8.3 초과, 약 8.3 초과 8.4, 약 8.5 초과, 약 8.6 초과, 약 8.7 초과, 약 8.8 초과, 약 8.9 초과, 또는 약 9.0 초과일 수 있다. 한 실시양태에서, pH는 약 7.9 초과일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 FXN 단백질, 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물을 포함하는 FXN 단백질의 활성을 측정하기 위한 조성물을 제공하고, 여기서 조성물의 pH는 약 7.4 내지 약 8.0, 약 7.6 내지 약 8.3, 약 7.7 내지 약 8.4, 약 7.9 내지 약 8.7, 약 8.0 내지 약 8.5, 약 8.2 내지 약 8.7, 약 8 내지 약 9, 또는 약 8.5에서 약 9 이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 제공되는 FXN 단백질의 활성을 측정하는 방법은 FXN 단백질을 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물과 조합하여 분석 혼합물을 생성하는 것을 포함한다. 이 혼합물에서 FXN 단백질은 환원제의 산화와 ROS의 생성을 촉진한다. 상기 방법은 ROS의 생성을 허용하는 기간 동안 분석 혼합물을 인큐베이션하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 예를 들어 ROS 검출기 화합물에 의해 생성된 신호를 검출함으로써 인큐베이션 후에 생성된 ROS의 양을 측정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본 개시내용에 의해 제공되는 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 측정하는 방법은 금속 이온을 분석 혼합물에 첨가하는 것을 포함한다. 금속 이온은 Mn2+, Fe3+, Zn2+, Cu2+ and Mg2+ 로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 하나의 구체적인 예에서, 금속 이온은 Fe3+일 수 있다. 다른 구체적인 예에서, 상기 금속 이온은 Mn2+ 일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 하나 이상의 금속 이온을 분석 혼합물에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 한 예에서, Fe3+ 및 Mn2+ 모두는 본 개시내용의 실시양태에 따라 분석 혼합물에 모두 첨가될 수 있다.
일부 예에서, FXN 단백질은 약 1000mU/mg의 FXN 단백질 내지 약 6500mU/mg의 FXN 단백질 범위 내에서 하이드로퀴논 환원의 비활성을 나타낼 수 있다. 구현예에서, FXN 단백질은 약 1200 mU/mg 내지 약 6000 mU/mg, 약 1400 mU/mg 내지 약 5900 mU/mg 범위 내에서 하이드로퀴논 환원의 비활성을 나타낼 수 있다. FXN 단백질의 밀리단위(mU)는 초기 분석 속도 Vi = 1을 달성하는 데 필요한 FXN 단백질의 양으로 정의된다.
프라탁신(FXN) 단백질
본 개시내용은 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 측정하는 방법을 제공한다. 본원에 사용된 용어 "프라탁신 단백질" 또는 "FXN 단백질"은 프라탁신(FXN), 또는 FXN의 기능적 유사체, 유도체 또는 단편을 포함하는 임의의 폴리펩티드를 지칭한다. FXN은 심장, 척수, 간, 췌장 및 골격근에서 가장 높은 수준으로 신체 전체의 세포에서 발견되는 필수 계통 발생적으로 보존된 단백질이다. FXN은 핵에서 암호화되고 세포질에서 발현되며 미토콘드리아로 유입되어 성숙한 형태로 처리된다.
본 개시내용의 맥락에서, "FXN 단백질"에 포함된 FXN은 임의의 종, 예를 들어 포유동물 종, 예컨대 마우스, 사이노몰구스 마카크 또는 인간으로부터 유래될 수 있다. 한 측면에서, FXN 단백질은 인간 FXN(hFXN)을 포함한다. 인간에서 hFXN은 210개 아미노산의 전장 hFXN(hFXN1-210, 23.1kDa)으로 아미노 말단에 전형적인 미토콘드리아 표적화 서열(mitochondrial targeting sequence, MTS)을 포함하고 있으며, 이는 미토콘드리아 기질로 유입될 때 미토콘드리아 기질 처리 펩티다제(mitochondrial matrix processing peptidase, MPP)에 의해 2단계 절단으로 처리된다. 생성된 단백질은 130개 아미노산, 14.2kDa 성숙한 hFXN 단백질(hFXN81-210)이다. 전장 hFXN 및 성숙한 hFXN의 서열은 하기 표 1에 도시된다.
전장 hFXN 및 성숙한 hFXN의 서열
서열번호 단백질 아미노산 서열
1 전체 길이 hFXN

hFXN1-210 		MWTLGRRAVAGLLASPSPAQAQTLTRVPRPAELAPLCGRRGLRTDIDATCTPRRASSNQRGLNQIWNVKKQSVYLMNLRKSGTLGHPGSLDETTYERLAEETLDSLAEFFEDLADKPYTFEDYDVSFGSGVLTVKLGGDLGTYVINKQTPNKQIWLSSPSSGPKRYDWTGKNWVYSHDGVSLHELLAAELTKALKTKLDLSSLAYSGKDA
2 성숙한 hFXN
hFXN81-210 		SGTLGHPGSLDETTYERLAEETLDSLAEFFEDLADKPYTFEDYDVSFGSGVLTVKLGGDLGTYVINKQTPNKQIWLSSPSSGPKRYDWTGKNWVYSHDGVSLHELLAAELTKALKTKLDLSSLAYSGKDA
전장 hFXN(서열 식별 번호: 1)은 성숙한 hFXN(서열 식별 번호: 2) 및 아미노산 서열MWTLGRRAVAGLLASPSPAQAQTLTRVPRPAELAPLCGRRGLRTDIDATCTPRRASSNQRGLNQIWNVKKQSVYLMNLRK (서열번호: 3)을 갖는 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)을 포함한다.
일부 예에서, FXN 단백질은 hFXN, 예를 들어 전장 hFXN(서열 식별 번호 1) 또는 성숙한 hFXN(서열 식별 번호 2)을 포함한다. 일부 예에서, FXN 단백질은 hFXN의 기능적 단편을 포함한다. 일부 예에서, FXN 단백질은 hFXN의 유도체를 포함한다. 일부 예에서, FXN 단백질은 hFXN의 기능적 유사체를 포함한다.
일부 예에서, FXN 단백질은 FXN 융합 단백질일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "FXN 융합 단백질"은 FXN, 예를 들어 전장 hFXN(서열 식별 번호 1) 또는 성숙한 hFXN(서열 식별 번호 2), 또는 기능적 유사체, 유도체를 포함하는 인공 폴리펩티드를 의미한다. 또는 FXN의 단편, 및 추가 모이어티. FXN 융합 단백질에 포함될 수 있는 추가 모이어티는 FXN과 상이한 단백질, 예를 들어 전장 단백질 또는 단백질 단편일 수 있다. 일부 예에서, FXN 융합 단백질은 FXN, 예를 들어 전장 hFXN(서열 식별 번호 1) 또는 성숙한 hFXN(서열 식별 번호 2), 및 추가 모이어티로서 세포 투과 펩티드(cell penetrating peptide, CPP)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포 투과 펩티드(cell penetrating peptide)" 또는 "CPP"는 단백질과 같은 다양한 분자 화물의 세포 섭취를 촉진할 수 있는 일반적으로 5 내지 30개 아미노산 길이의 짧은 펩티드 서열을 지칭한다. 본 개시내용의 맥락 내에서, FXN 융합 단백질에 존재하는 CPP는 FXN 융합 단백질의 세포, 예를 들어 수용 세포 내로의 전달을 촉진한다. 일단 세포 내부에 들어가면, FXN 융합 단백질은 CPP를 제거하기 위해 세포 기계에 의해 처리되어 FXN 융합 단백질을 제거할 수 있다.
CPP는 다중양이온성일 수 있다. 즉, 라이신 또는 아르기닌과 같은 양으로 하전된 아미노산을 상대적으로 많이 함유하는 아미노산 조성을 가질 수 있다. CCP는 또한 양친매성일 수 있다. 즉, 극성/하전된 아미노산 및 비극성, 소수성 아미노산의 교대 패턴을 포함하는 서열을 가질 수 있다. CPP는 또한 소수성일 수 있다. 즉, 순전하가 낮은 무극성 잔기만 포함하거나 세포 흡수에 중요한 소수성 아미노산 그룹을 가질 수 있다.
본 발명의 맥락에서 유용한 FXN 융합 단백질에 포함될 수 있는 CPP는 당업자에게 공지된 임의의 CPP일 수 있다. 예를 들어, CPP는 Database of Cell-Penetrating Peptides CPPsite 2.0에 나열된 임의의 CPP일 수 있으며, 이의 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서 유용한 CPP는 HIV 전사 활성제(HIV-TAT), 갈라닌, 마스토파란, 트랜스포탄, 페네트라틴, 폴리아르기닌 또는 VP22으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 유래된 세포 투과 펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, CPP는 86개 아미노산 전장 HIV-TAT 단백질(이 11개 아미노산 펩티드는 또한 본원에서 "HIV-TAT"로 지칭될 수 있음, 서열 식별 번호: 4)의 47-57 을 포함하는 TAT 단백질 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, CPP는 HIV-TAT(서열 식별 번호 4)로 이루어진다. 일부 실시양태에서, CPP는 개시(12 AA; "HIV-TAT+M") : MYGRKKRRQRRR(서열 식별 번호 아니오: 5)를 위해 아미노 말단에 추가된 메티오닌을 갖는 86개 아미노산 전장 HIV-TAT 단백질의 아미노산 47-57을 포함한다.
하기 표 2는 예시적인 CPP의 아미노산 서열을 나열한다.
예시적인 CPP 및 해당 시퀀스
서열번호 CPP 아미노산 서열
4 HIV-TAT YGRKKRRQRRR
5 HIV-TAT+M MYGRKKRRQRRR
6 Galanin GWTLNSAGYLLGPHAVGNHRSFSDKNGLTS
7 Mastoparan INLKALAALAKKIL-NH2
8 Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL
9 Penetratin RQIKIWFQNRRMKWKK
10 Polyarginine RRRRRRRRR
11 VP22 DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE
일부 측면에서, FXN 융합 단백질은 전장 hFXN을 포함할 수 있고, 예를 들어, 서열 식별 번호 : 1, 또는 적어도 85%, 예를 들어, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성의 전장 hFXN를 갖는 아미노산 서열, 예를 들어, 표 1에 나열된 서열 식별 번호 : 1일 수 있다.
일부 측면에서, FXN 융합 단백질은 성숙한 hFXN을 포함할 수 있고, 예를 들어, 서열 식별 번호 : 2, 또는 적어도 85%, 예를 들어, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%를 갖는 아미노산 서열 , 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성의 성숙한 hFXN를 갖는 아미노산 서열, 예를 들어, 표 1에 나열된 서열 식별 번호 : 2일 수 있다.
일부 측면에서, FXN 융합 단백질은 MTS를 포함할 수 있고, 예를 들어, 서열 식별 번호 : 3, 또는 적어도 85%, 예를 들어, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%를 갖는 아미노산 서열 , 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성의 MTS를 갖는 아미노산 서열, 예를 들어, 서열 식별 번호 : 3 일 수 있다.
일부 측면에서, FXN 융합 단백질은 CPP로서 HIV-TAT를 포함할 수 있고, 예를 들어, 서열 식별 번호 : 4, 또는 서열 동일성이 HIV- TAT, 예를 들어 서열 식별 번호 : 4와 적어도 85%, 예를 들어, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%를 갖는 아미노산 서열 , 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 일 수 있다. 일부 측면에서, FXN 융합 단백질은 개시를 위해 아미노 말단에 추가된 메티오닌과 함께 CPP로서 HIV-TAT를 포함할 수 있고, 예를 들어, 서열 식별 번호 : 5, 또는 서열 식별 번호 : 5와 서열 동일성이 적어도 85%, 예를 들어, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%를 갖는 아미노산 서열 , 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 일 수 있다.
일부 예에서, FXN 융합 단백질에 포함된 CPP는 HIV-TAT(서열 번호 4)이다. 일부 실시양태에서, FXN 융합 단백질은 CPP로서 전장 FXN, 예를 들어 서열 1 및 HIV-TAT, 예를 들어 서열 4를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, FXN 융합 단백질은 성숙한 FXN, 예를 들어 서열식별번호: 2, MTS, 예를 들어 서열식별번호: 3 및 HIV-TAT, 예를 들어 서열식별번호: 4를 CPP로서 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 FXN 융합 단백질에서, CPP는 FXN, 예를 들어 전장 FXN과 함께 융합되거나, 링커를 통해 MTS와 함께 융합되어 단일 폴리펩티드 사슬을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 GG를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서,FXN 융합 단백질은 하기 아미노산서열(224개아미노산)을 포함한다:MYGRKKRRQRRRGGMWTLGRRAVAGLLASPSPAQAQTLTRVPRPAELAPLCGRRGLRTDIDATCTPRRASSNQRGLNQIWNVKKQSVYLMNLRKSGTLGHPGSLDETTYERLAEETLDSLAEFFEDLADKPYTFEDYDVSFGSGVLTVKLGGDLGTYVINKQTPNKQIWLSSPSSGPKRYDWTGKNWVYSHDGVSLHELLAAELTKALKTKLDLSSLAYSGKDA(SEQ ID NO: 12). 일부 실시양태에서, FXN 융합 단백질은 서열식별번호: 12의 아미노산 서열로 이루어진다. 서열식별번호: 12를 포함하거나 이로 이루어진 FXN 융합 단백질은 미국 가특허출원 제62/891,029호 및 미국 특허 출원 번호 16/942,276, 각각의 전체 내용이 여기에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 FXN 또는 FXN의 기능적 유사체, 유도체 또는 단편을 포함할 수 있는 FXN 단백질, 예를 들어 FXN 융합 단백질의 활성을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "유도체"는 본 개시내용에서 구체적으로 정의된 폴리펩티드와 상이한 아미노산 서열(폴리펩티드)을 포함하고, 예를 들어, 원래의 폴리펩티드의 활성을 실질적으로 변경하지 않는 아미노산의 삽입, 결실, 치환 및 변형에 의한 서열 식별 번호 1-3 이다. 본원에 사용된 용어 "삽입(들)", "삭제(들)" 또는 "치환(들)"은 각각 1 내지 50개 폴리펩타이드의 아미노산 잔기의 임의의 추가, 결실 또는 대체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 1개 내지 5개 아미노산 잔기, 1개 내지 10개 아미노산 잔기, 5개 내지 15개 아미노산 잔기, 10개 내지 20개 아미노산 잔기, 25개 내지 40개 아미노산 잔기 또는 30개 내지 50개 아미노산 잔기 이다. 보다 구체적으로, 삽입(들), 결실(들) 또는 치환(들)은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기 중 어느 하나일 수 있다. 삽입(들), 결실(들) 또는 치환(들)은 변형된 펩티드의 임의의 위치뿐만 아니라 그의 N' 또는 C' 말단 중 어느 곳에서도 일어날 수 있음을 주목해야 한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 맥락 내에서 FXN 단백질의 아미노산 서열은 자연 발생 FXN, 예를 들어, hFXN의 아미노산 서열과 상이할 수 있다. 예를 들어, FXN 단백질은 보존적 아미노산 치환, 즉 구조적으로 유사한 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 구조적으로 유사한 아미노산은 다음을 포함한다: (이소류신(I), 류신(L) 및 발린(V)); (페닐알라닌(F) 및 티로신(Y)); (리신(K) 및 아르기닌(R)); (글루타민(Q) 및 아스파라긴(N)); (아스파라긴산(D) 및 글루탐산(E)); 및 (글리신(G) 및 알라닌(A)).
본원에 사용된 용어 "유도체"는 원래 폴리펩티드의 상동체, 변이체 및 유사체, 예를 들어 FXN 뿐만 아니라 원래 폴리펩티드의 공유 변형을 포함한다. FXN의 유도체, 변이체 및 유사체는 본래의 형태와 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 가질 것이다.
환원제
본 개시내용에 의해 제공되는 방법은 FXN 단백질을 환원제 및 ROS 검출기 화합물과 조합함으로써 분석 혼합물을 생성하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "환원제"는 FXN 단백질과 조합될 때 ROS, 예를 들어 슈퍼옥사이드의 생성을 초래하는 임의의 환원제를 지칭한다. 일부 예에서, 환원제는 유기 화합물일 수 있다. 추가 예에서, 유기 화합물은 환원된 퀴논 화합물일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "퀴논 화합물"은 짝수의 -CH= 그룹이 -C(=O)- 그룹으로 전환되어 방향족 화합물로부터 유도된 완전 공액 고리형 디온 구조를 갖는 화합물을 의미한다. 이중 결합의 필요한 재배열과 함께(다환 및 헤테로환 유사체가 포함됨). 예를 들어, 퀴논 화합물은 짝수의 -C(=O)- 기를 포함하는 방향족 기를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 퀴논 화합물의 방향족 기는 1개 이상, 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 공액 고리를 갖는 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 퀴논 화합물은 벤조퀴논 화합물, 즉 단일 방향족 고리를 갖는 벤조퀴논을 포함하는 화합물일 수 있다. 다른 예에서, 퀴논 화합물은 나프토퀴논 화합물, 즉 2개의 공액 방향족 고리를 갖는 나프토퀴논을 포함하는 화합물일 수 있다. 또 다른 예에서, 퀴논 화합물은 안트라퀴논 화합물, 즉 3개의 방향족 고리를 포함하는 안트라퀴논을 포함하는 화합물일 수 있다.
-C(=O)- 그룹을 포함하는 퀴논 화합물은 산화된 형태이다. 일부 실시양태에서, 퀴논 화합물은 -C(=O)- 기가 -C-OH 기로 환원된 환원된 퀴논 화합물일 수 있다. 산화 및 환원된 형태의 예시적인 퀴논 화합물을 하기 표 3에 나타내었다.
예시적인 퀴논 화합물
명칭 산화된 형태 환원된 상태
Benzoquinone
Figure pct00001
Figure pct00002
Naphthoquinone
Figure pct00003
Figure pct00004
Anthraquinone
Figure pct00005
Figure pct00006
일 예에서, 본 개시내용의 방법에 유용한 환원제는 환원된 퀴논 화합물, 예를 들어 환원된 벤조퀴논 화합물, 환원된 나프토퀴논 화합물 또는 환원된 안트라퀴논 화합물이다. 추가 예에서, 환원제는 하기 구조를 갖는 하이드로퀴논과 같은 환원된 벤조퀴논 화합물이다:
Figure pct00007
하이드로퀴논.
ROS 검출기 화합물
본 개시내용에 의해 제공되는 방법은 FXN 단백질을 환원제 및 ROS 검출기 화합물과 조합함으로써 분석 혼합물을 생성하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "ROS 검출기 화합물"은 FXN 단백질 및 환원제의 존재 하에 생성되는 ROS, 예를 들어 슈퍼옥사이드에 반응하여 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 임의의 화합물을 지칭한다. 일부 예에서, ROS 검출기 화합물은 형광 프로브 또는 화학발광 프로브일 수 있다. 일부 예에서, ROS 검출기 화합물은 슈퍼옥사이드 검출 시약, 즉 슈퍼옥사이드에 반응하여 신호를 생성할 수 있는 시약, 또는 과산화수소 검출 시약일 수 있고, 즉, 과산화수소에 반응하여 신호를 생성할 수 있는 시약이다. 예시적인 ROS 검출기 화합물, 예를 들어 과산화물 검출 시약 또는 과산화수소 검출 시약은 예를 들어 ThermoFisher Scientific 카탈로그에서 찾을 수 있다. 일부 실시양태에서, 슈퍼옥사이드 음이온 검출 시약은 하기 표 4에 나타낸 시약 및 그의 구조적 유사체 또는 변이체로부터 선택될 수 있다.
예시적인 ROS 검출기 화합물
명칭 구조
coelenterazine
Figure pct00008
dihydroethidium
Figure pct00009
2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA)
Figure pct00010
2',7'-dichlorodihydrofluorescein (H2DCF)
Figure pct00011
lucigenin
Figure pct00012
luminol
Figure pct00013
Cypridina Luciferin Analog (CLA)
Figure pct00014
Cypridina Luciferin methoxy-analogue (MCLA)
Figure pct00015
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Figure pct00016
p-Nitrotetrazolium blue (NBT)
Figure pct00017
RedoxSensor Red CC-1
Figure pct00018
2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide (XTT)
Figure pct00019
특정 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)이다. H2DCF는 시판되는 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인 디아세테이트(H2DCFDA)로부터 이를 예를 들어 염기로 처리하여 아세틸 기를 제거함으로써 얻을 수 있다(예를 들어, 본 개시내용의 실시예 1 참조). ROS의 존재하에 H2DCF는 2'-7'-디클로로플루오레세인(DCF)으로 산화되며, 이는 형광성이 높고 ROS의 정량에 사용될 수 있다. DCF 형광 측정에 대해 보고된 파장은 여기의 경우 498 nm이고 방출의 경우 522 nm이다.
일부 예에서, ROS 검출기 화합물은 항산화제 화합물 또는 ROS 스캐빈저 화합물일 수 있다. ROS 검출기 화합물은 또한 과산화수소 프로브일 수 있다. 예를 들어, 특정 형광성 기질은 측정될 수 있는 과산화수소(H2O2) 및 양고추냉이 과산화효소(HRP) 효소의 존재 하에서 강렬한 형광성 생성물을 생성한다. 이러한 형광성 기질은 또한 FXN 단백질 활성의 결과로서 생성된 ROS의 양을 측정하기 위해 본 개시내용의 방법에서 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 아래와 같이 9-(4-메톡시-2-메틸페닐)-6-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-3H-크산텐-3-온 구조의 Peroxy Green 1(PG1)과 같은 과산화수소 프로브일 수 있다:
Figure pct00020
Peroxy Green 1 (PG1).
또 다른 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 7-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-3H-페녹사진-3-온과 같은 과산화수소 프로브일 수 있다.
Figure pct00021
Peroxy Crimson 1 (PC1).
PG1 및 PC1은 가시 파장 여기 및 방출 파장을 갖는 붕산염 기반 과산화수소 프로브이다. 과산화수소와의 반응은 PG1 및 PC1의 형광을 각각 10배 및 40배 증가시킨다. PG1은 460 nm의 여기 파장과 510 nm에서 최대 방출을 특징으로 하는 반면 PC1은 적색 편이 여기 및 자가형광을 감소시키는 더 큰 스톡 이동의 개선된 특성을 보여준다(여기: 480 nm, 방출: 584 nm).
일부 예에서, ROS 검출기 화합물은 하기 나타낸 구조를 갖는 호모바닐산과 같은 과산화수소 프로브일 수 있다:
Figure pct00022
homovannilic acid.
호모바닐산 양고추냉이 과산화효소 촉매작용을 통해 과산화수소에 의해 산화될 때 이량체화된다. 단량체로서 호모바닐산은 비형광이지만, 이량체로서 호모바닐산은 315 nm의 피크 여기 파장과 425 nm의 방출 파장을 갖는다.
일부 예에서, ROS 검출기 화합물은 ROS와 반응할 때 단백질에서 형태적 변화를 유도할 수 있는 산화환원-반응성 도메인을 포함하는 단백질, 예를 들어 조작된 단백질일 수 있다. 예를 들어, 형광 단백질은 산화환원-반응성 도메인을 포함하고 산화환원-반응성 도메인의 산화환원 활성에 따라 형태를 변경하도록 조작될 수 있다. HyPer라고 하는 이러한 예시적인 단백질 중 하나는 원핵생물 H2O2-감지 단백질인 OxyR의 조절 도메인에 삽입된 원형 순열 황색 형광 단백질(cpYFP)로 구성된다.
일부 예에서, ROS 검출기 화합물은 표지를 포함할 수 있으며, 여기서 표지는 예를 들어 DCF에서와 같이 ROS 검출기 화합물의 통합 부분일 수 있다. 대안적으로, 표지는 ROS 검출기 화합물에 공유적으로 연결될 수 있다.
예를 들어, ROS 검출기 화합물에 포함된 표지는 형광 표지, 비색 표지 또는 발광 기반 표지일 수 있다. 형광은 표준 형광계로 측정할 수 있다. 휘도는 표준 조도계로 측정할 수 있고, 비색 라벨은 표준 비색계로 측정할 수 있다.
일부 예에서, 환원제 및 ROS 검출기 화합물은 동일한 화합물일 수 있다. 이러한 화합물은 FXN 단백질에 의해 산화되고 ROS, 예를 들어 슈퍼옥사이드를 생성하는 동시에 산화된 형태로 검출 가능한 신호를 방출할 수 있다. 그러한 예시적인 화합물 중 하나는 H2DCF이다.
다른 예에서, 환원제 및 ROS 검출기 화합물은 상이한 화합물일 수 있다. 예를 들어, 환원제는 환원된 퀴논 화합물, 예를 들어 하이드로퀴논일 수 있고, ROS 검출기 화합물은 H2DCF일 수 있다.
설명에서, 달리 명시되지 않는 한, "실질적으로" 및 "약"과 같은 형용사는 본 개시내용의 실시양태의 특징 또는 특징의 조건 또는 관계 특성을 수정하고, 조건 또는 특성이 의도된 애플리케이션에 대한 실시예의 작동에 허용되는 허용 오차 내로 정의됨을 의미하는 것으로 이해된다. 달리 표시되지 않는 한, 설명 및 청구범위에서 단어 "또는"은 배타적 또는가 아니라 포괄적인 "또는"(및/또는의 의미를 가짐)으로 간주되며 결합하는 항목 중 적어도 하나 또는 임의의 조합을 나타낸다.
본 출원의 설명 및 청구범위에서, 각각의 동사, "포함하다", "포함하다" 및 "갖다", 및 이들의 활용은 동사의 목적어 또는 목적어가 동사의 주어 또는 주어의 구성요소, 요소 또는 부분의 완전한 목록일 필요는 없음을 나타내는 데 사용된다.
FXN 단백질의 활성 측정용 키트
본 개시내용은 또한 FXN 단백질의 활성을 결정하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 환원제, ROS 검출기 화합물 및 사용 설명서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 사용 설명서는 환원제, ROS 검출기 화합물 및 FXN 단백질을 조합하여 분석 혼합물을 생성하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 사용 설명서는 분석 혼합물에서 FXN 단백질의 Vi를 측정하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
본 개시내용에 의해 제공되는 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 FXN 단백질의 활성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, FXN 단백질은 예를 들어 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2를 포함하는 인간 FXN 단백질일 수 있다. 한 실시양태에서, FXN 단백질은 예를 들어 서열 식별 번호: 12를 포함하거나 이로 이루어진 FXN 융합 단백질일 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 금속 이온 화합물, 예를 들어 염을 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "금속 이온 화합물"은 수용액에 용해될 때 금속 이온의 공급원이 될 수 있는 화합물을 의미한다. 일부 실시양태에서, 금속 이온은 Mn2+, Fe3+, Zn2+, Cu2+ 및 Mg2+로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 금속 이온은 Fe3+이다. 다른 구체예에서, 금속 이온은 Mn2+ 이다. 다른 실시예에서, 금속 이온은 Zn2+ 이다. 다른 실시예에서, 금속 이온은 Cu2+ 이다. 다른 구체예에서, 금속 이온은 Mg2+ 이다. 일 구현예에서, 상기 금속 이온 화합물은 MgCl2일 수 있다.
일부 실시양태에서, 환원제는 본원에 기재된 바와 같을 수 있다. 한 실시양태에서, 환원제는 히드로퀴논이다.
일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 본원에 기재된 바와 같을 수 있다. 한 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)이다.
FXN 활성을 조절할 수 있는 화합물을 확인하는 방법
본 개시내용은 또한 FXN 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 방법은 시험 화합물의 존재 하에 본 개시내용의 방법에 따라 FXN 단백질의 활성을 측정함으로써 FXN 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 확인하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 확인하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, FXN 단백질을 시험 화합물, 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물과 조합하는 단계, 이에 의해 분석 혼합물을 생성하는 단계, 여기서 FXN 단백질은 환원제의 산화 및 ROS의 생성을 촉진하고; 및 시험 화합물의 존재 하에 생성된 ROS의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 FXN 단백질의 Vi를 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 시험 화합물의 존재 하에 FXN 단백질의 Vi를 시험 화합물의 부재 하에 FXN 단백질의 Vi와 비교하는 단계 및 시험 화합물의 존재 하에 FXN 단백질의 Vi가 시험 화합물의 부재 하에 FXN 단백질의 Vi와 상이할 때 FXN 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물로서 시험 화합물을 확인하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 시험 화합물의 존재 하에 FXN 단백질의 Vi를 시험 화합물의 부재 하에 FXN 단백질의 Vi와 비교하는 단계 및 시험 화합물의 존재 하에서의 FXN 단백질의 Vi가 시험 화합물의 부재하에서의 FXN 단백질의 Vi보다 더 큰 경우 FXN 단백질의 활성을 증가시킬 수 있는 화합물로서 시험 화합물을 확인하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 시험 화합물의 존재 하에 FXN 단백질의 Vi를 시험 화합물의 부재 하에 FXN 단백질의 Vi와 비교하는 단계 및 시험 화합물의 존재 하에 FXN 단백질의 Vi가 시험 화합물의 부재 하에 FXN 단백질의 Vi보다 낮을 때 시험 화합물을 FXN 단백질의 활성을 감소시킬 수 있는 화합물로 확인하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 분석 혼합물의 pH를 약 7.4 초과, 또는 약 7.4 이상의 pH로 조정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 분석 혼합물의 pH를 약 7.9 초과의 pH, 또는 약 7.9 이상의 pH로 조정하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 방법은 분석 혼합물의 pH를 약 8.0으로 조정하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 분석 혼합물의 pH를 약 7.4 내지 약 8.0, 약 7.6 내지 약 8.3, 약 7.7 내지 약 8.4, 약 7.9 내지 약 8.7, 약 8.0 내지 약 8.5, 약 8.2 내지 약 8.2, 약 8.7, 약 8 내지 약 9, 또는 약 8.5 내지 약 9의 pH로 조정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 금속 이온, 예를 들어 Mn2+, Fe3+, Zn2+, Cu2+ 및 Mg2+ 로 이루어진 군으로부터 선택된 금속 이온을 분석 혼합물에 첨가하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 금속 이온은 Mn2+ 이다. 다른 구체예에서, 금속 이온은 Fe3+ 이다. 다른 실시예에서, 금속 이온은 Zn2+ 이다. 다른 실시예에서, 금속 이온은 Cu2+ 이다. 다른 구체예에서, 금속 이온은 Mg2+ 이다.
일부 실시양태에서, 환원제는 본원에 기재된 바와 같을 수 있다. 한 실시양태에서, 환원제는 히드로퀴논이다.
일부 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 본원에 기재된 바와 같을 수 있다. 한 실시양태에서, ROS 검출기 화합물은 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)이다.
FXN 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 FXN 단백질일 수 있다. 한 실시양태에서, FXN 단백질은 예를 들어 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2를 포함하는 인간 FXN 단백질일 수 있다. 한 실시양태에서, FXN 단백질은 예를 들어, SEQ ID NO: 12를 포함하거나 이로 구성된 FXN 융합 단백질일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물"은 본 개시내용의 방법에 의해 측정된 바와 같이 FXN 단백질의 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있는 화합물을 지칭한다. 한 실시양태에서, FXN 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물은 FXN 단백질의 증가된 활성을 유발할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, FXN 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물은 FXN 단백질의 활성 감소를 유발할 수 있다.
FXN 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 확인하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 절차는 예를 들어 실시예 8에 기재된 바와 같은 화합물 라이브러리의 고속 처리 스크리닝(HTS)을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "약"은 값 또는 범위가 예를 들어 명시된 값 또는 명시된 범위 한계의 10% 이내, 5% 이내, 1% 또는 0.1% 이내일 수 있도록 pH 값과 같은 값 또는 범위의 가변성 정도를 허용할 수 있다.
본 출원에서 본 개시내용의 실시양태에 대한 설명은 예로서 제공되며 본 개시내용의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 설명된 실시예는 다른 특징을 포함하며, 모든 실시예에서 이들 모두가 요구되는 것은 아니다. 일부 실시예는 특징 중 일부 또는 특징의 가능한 조합만을 이용한다. 설명된 본 개시의 실시예의 변형, 및 설명된 실시예에서 언급된 특징의 상이한 조합을 포함하는 실시예는 당업자에게 발생할 것이다.
실시예
실시예 1. 하이드로퀴논(HQ) 환원 분석을 위한 프로토콜
1. H 2 DCFDA에서 H 2 DCF로의 활성화
a. 1mM H2DCFDA(DMSO 중) 1ml를 0.01M NaOH 작업 용액 20mL에 첨가하여 활성화 용액을 생성한다. 용액을 암실에서 실온에서 30분 동안 교반하였다.
b. 79mL의 33mM NaH2PO4 용액을 활성화 용액에 첨가하여 10μM H2DCF의 최종 농도를 생성한다.
c. 활성화된 H2DCFDA는 최대 2주 동안 4°C의 어둠 속에서 10mL 분취량으로 보관할 수 있다.
2. 형광 판독
a. 아래 섹션 3에서 5에 설명된 반응 혼합물을 포함하는 다중 웰 플레이트를 모든 판독 전에 3초 동안 731cpm(2mm)의 주파수로 선형 진탕기에서 흔든다.
b. 플레이트의 여기 및 방출 판독은 485/20에서 여기, 528/20에서 방출, 상단에서 광학, 1mm의 판독 높이 및 50의 이득.
3. HQ 분석 플레이트 준비
a. 폴리스티렌 96웰 플레이트(검은색, 표면이 비결합)를 분석에 사용하는 것이 추천된다. 동등한 대안을 사용할 수도 있다.
각 웰에 다음을 추가한다.
나. 10 μL의 20X 하이드로퀴논(20 μM 최종 농도까지)
ii. 10 μL의 20X Mn2+(5 μM 최종 농도)
b. 트리스 버퍼 추가
나. FXN 단백질 샘플 웰: 168μL
ii. DCF 표준 곡선 웰: 170μL
HQ 분석 플레이트의 예는 아래 표 5에 자세히 설명되어 있다.
HQ 분석을 위한 분석 플레이트
분석 플레이트 Control FXN Protein Test FXN Protein Batch DCF Standard Curve
A 3 μM 3 μM 1 μM
B 1 μM 1 μM 0.5 μM
C 0.3 μM 0.3 μM 0.25 μM
D 0.1 μM 0.1 μM 0.125 μM
E 0.03 μM 0.03 μM 0.0625 μM
F 0.01 μM 0.01 μM 0.0313 μM
G 0 (Blank) Control 0 (Blank) Control 0.0156 μM
H 0 (Blank) Control 0 (Blank) Control 0 μM (Blank)
4. DCF 표준 희석 플레이트
a. 96웰 플레이트(천연, 0.5mL, V-바닥, 멸균, 단일 포장)를 희석 플레이트로 사용한다.
b. 20X DCF 표준 곡선의 준비
나. 20μM DCF 용액 500μL를 하기 표 6에 예시된 플레이트 맵에 따라 희석한다.
화합물(DCF) 희석 플레이트
희석 플레이트 3 (DCF Standard Curve)
A 500μL DCF Working solution = [20 μM]
B 200μL H2O + 200μL Transfer from A3 = [10 μM]
C 200μL H2O + 200μL Transfer from B3 = [5 μM]
D 200μL H2O + 200μL Transfer from C3 = [2.5 μM]
E 200μL H2O + 200μL Transfer from D3 = [1.25 μM]
F 200μL H2O + 200uL Transfer from E3 = [0.0625 μM]
G 200μL H2O + 200μL Transfer from F3 = [0.3125 μM]
H 200μL H2O = [0 μM]
c. 대조군 및 시험 FXN 단백질 샘플의 준비
i. 100x FXN 단백질 연속 희석은 아래 표 7에 예시된 플레이트 맵에 따라 수행된다.
FXN 단백질 희석 플레이트
희석 플레이트 1 (Control) 2 (Test)
A XμL of FXN protein + XμL Tris = [300μM] XμL of test FXN protein + XμL Tris = [300μM]
B 6μL A1 + 12μL Tris = [100μM] 6μL A2 + 12μL Tris = [100μM]
C 1.5μL A1 + 13.5μL Tris = [30μM] 1.5μL A2 + 13.5μL Tris = [30μM]
D 1.5μL B1 + 13.5μL Tris = [10μM] 1.5μL B2 + 13.5μL Tris = [10μM]
E 1.5μL C1 + 13.5μL Tris = [3μM] 1.5μL C2 + 13.5μL Tris = [3μM]
F 1.5μL D1 + 13.5μL Tris = [1μM] 1.5μL D2 + 13.5μL Tris = [1μM]
G 20μL Tris = [0μM] 20μL Tris = [0μM]
H 20μL Tris = [0μM] 20μL Tris = [0μM]
5. 최종 HQ 분석 플레이트 준비
a. 희석 플레이트(표 6에 표시)의 20xDCF 표준 곡선에서 10 μL을 표 5에 표시된 플레이트 맵에 따라 HQ 분석 플레이트로 옮긴다.
b. 10μL의 H2DCF(10μM 작업 용액)가 0.5μM H2DCF의 최종 농도에 도달하도록 모든 웰(DCF 표준 곡선 제외)에 추가된다.
c. FXN 단백질 희석 플레이트에서 2 μL의 FXN 단백질을 표 5에 표시된 대로 플레이트 맵에 따라 HQ 분석 플레이트에 즉시 추가한다(표 6).
d. 플레이트는 플레이트 판독기에 신속하게 배치되고 운동 판독은 즉시 시작되어야 한다.
e. (c) 및 (d) 단계는 시간에 민감하며 빠르게 수행된다.
6. 데이터 분석
a. 운동 분석
i. 여러 배치 비교 - 산점도
1. FXN 단백질의 각 농도는 별도의 그래프에 표시된다.
2. 임의의 형광 단위(AFU)는 Y축에 표시되고 시간[HH:MM 또는 분]은 X축에 표시된다.
3. 오류 막대로서의 중복 +/- 표준 편차의 평균.
b. 최대 초기 속도(Vi) 분석
나. 최대 속도 운동 분석을 수행해야 한다.
1. 2분에서 20분 사이;
2. 5점으로 계산한 속도
3. 분당 상대 형광 단위(RFU).
ii. 형광 스캐너에서 생성된 Vi는 산점도에 표시된다.
1. 컨트롤 웰에서 배경을 뺀다.
2. Y축은 Vi 단위를 나타낸다.
3. X축은 농도를 [μM] 단위로 나타낸다.
4. 오류 막대로서의 중복 +/- 표준 편차의 평균.
c. 밀리 단위 분석
i. [0] DCF에 대해 배경을 빼고 DCF 표준 곡선을 플로팅한다. 선은 0,0을 지나야 하며 기울기가 기록된다. 기울기는 Y=mX → X=Y/m에서 변환되어야 한다.
ii. 배경은 표 7에서 행 G 및 H로 지정된 [0uM] 제어 웰을 사용하여 Vi에서 뺀다.
iii. 값을 기울기로 나누고 단위(U)를 제공한다.
iv. 단위는 밀리단위(mU)로 1,000을 곱한다.
v. 표 8에 제시된 차트는 단백질의 mg을 결정하는 데 사용된다. mU를 단백질 mg으로 나누면 mU/mg가 된다.
FXN의 μM에서 웰당 mg으로의 전환
FXN 단백질의 μM 농도 mg 당 FXN 단백질 (25kDa)의 웰(well)
3 0.015
1 0.005
0.3 0.0015
0.1 0.0005
0.03 0.00015
0.01 0.00005
vi. 중복은 평균을 내고 표준편차는 오차로 기록한다.
vii. Vi 산점도에서 가장 선형으로 나타나는 FXN 단백질 μM 농도를 선택해야 한다.
ⅷ. 활동을 비교하기 위해 다른 배치를 막대 그래프로 표시할 수 있다.
실시예 2. 하이드로퀴논 산화 촉매로서의 FXN 융합 단백질
SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 갖는 FXN 융합 단백질은 세포 투과 펩타이드, HIV-TAT(SEQ ID NO: 4) 및 전장 hFXN(SEQ ID NO: 1)를 포함하며, 이는 링커를 통해 hFXN의 N-말단에 연결된다. FXN 융합 단백질의 치료 특성은 시험관 내 및 생체 내에서 입증되었다. 시험관 내에서, FXN 융합 단백질 처리 전후의 FXN 결핍 세포주의 게놈 발자국이 특성화되었으며, 확인된 유전자 세트의 발현에서 상당한 차이가 확인되었다(데이터는 표시되지 않음). 생체 내에서 FDRA 마우스 모델을 FXN 융합 단백질로 치료하면 심근병증 표현형, 예를 들어 심장 수축 및 기타 증상에서 측정 가능한 개선이 나타났다(데이터는 표시되지 않음).
프라탁신 대체 요법, 즉 FXN 융합 단백질의 투여는 시험관내 및 생체내 생물학적 활성을 입증하고 FXN 결핍과 관련된 상태의 치료를 위한 치료제로 사용될 수 있기 때문에 활성 분석을 가능하게 하기 위해 개발되었다. 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 FXN 융합 단백질과 같은 FXN 단백질의 상이한 배치에서의 FXN 단백질 활성의 비교. 분석은 산화환원제로서 FXN 단백질의 이전에 확인되지 않은 특성을 이용한다.
히드로퀴논(HQ) 환원 분석은 서열번호 12의 FXN 융합 단백질 및 실시예 1에 기재된 기본 프로토콜을 사용하여 수행하였다. FXN 단백질의 존재하에 HQ의 환원은 하기 스킴 1로 나타낼 수 있다:
Figure pct00023
스킴(Scheme) 1.
H2Q →Q2- + 2H+
Q2- - 2ё + 2O2 → 2O2ㆍ-
ROS, 즉 슈퍼옥사이드의 생성은 예를 들어 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)과 같은 ROS 검출기 화합물을 사용하여 검출되었으며, 도 1의 패널 A에 도시된 바와 같이 동역학적으로 따랐다.
도 1은 시간 경과에 따라 생성된 반응성 산소 종(ROS)의 양에 의해 측정된, 예시적인 FXN 융합 단백질의 존재 하에 하이드로퀴논(HQ) 환원의 동역학을 나타낸다. ROS의 양은 임의의 형광 단위(AFU)로 측정된 형광으로 표시된다. 도 1의 패널 A는 예시적인 FXN 융합 단백질의 존재 또는 부재 하에 하이드로퀴논(HQ)의 산화를 통한 슈퍼옥사이드(O2ㆍ-) 생성의 동역학을 보여주는 그래프이다.
반응의 효율은 금속 이온, 특히 Fe3+ 및/또는 Mn2+ 이온의 존재에 반응했다. 두 개의 다른 배치에서 얻은 4.5μM FXN 융합 단백질을 사용한 분석에서 두 개의 금속 이온의 효과를 비교했다. 표 9는 실험에서 테스트한 다양한 시약 조합을 포함한 다양한 샘플에 대한 설명을 제공한다. 표 9에서 체크 표시(√)는 분석 혼합물에 주어진 성분의 존재를 나타낸다.
실험에서 테스트된 분석 혼합물
반응번호 도 1의 패널 B에 있는 해당 레이블 반응 버퍼 FXN 융합 단백질 HQ Fe3+ Mn2+
1 No addition √
2 No FXN fusion protein √ √
3 Fe3+ √ √ √
4 Mn2+ √ √ √
5 Fe3+, Mn2+ √ √ √ √
6 Hq √ √ √
7 Fe3+, HQ √ √ √ √
8 Hq, Mn2+ √ √ √ √
9 Fe3+, Hq, Mn2+ √ √ √ √ √
실험의 대표적인 결과는 그림 1의 패널 B에 나와 있다. 결과는 Mn2+와 Fe3+가 모두 HQ 산화 반응에서 FXN 융합 단백질의 인핸서 또는 보조 인자로 작용함을 보여준다. 더욱이, Mn2+ 단독의 존재 하에서, 반응 속도 및 형광 출력은 Fe3+ 단독의 존재에서보다 상당히 더 높다. 또한, Mn2+를 포함하는 분석에 Fe3+를 추가하면 Fe3+가 없는 Mn2+를 포함하는 분석과 비교하여 증분 효과가 없다.
다른 실험에서, 예시적인 FXN 융합 단백질의 활성에 대한 Fe3+ 이온의 존재 효과가 연구되었다. 이 실험에서, 시간 경과에 따라 생성된 ROS의 동역학은 10μM 예시적인 FXN 융합 단백질, 10μM HQ 및 5μM H2DCF를 함유하는 분석 혼합물에서 측정되었다. 한 분석 혼합물은 또한 철 킬레이트제인 1mM 데페록사민을 함유했다. 도 1, 패널 C는 예시적인 FXN 융합 단백질 및 Fe3+(회색 사각형); 예시적인 FXN 융합 단백질의 존재 및 Fe3+의 부재(회색 원); 예시적인 FXN 융합 단백질, Fe3+ 및 데페록사민(검정색 원)의 존재 하에; 및 예시적인 FXN 융합 단백질이 없는 경우(작은 검은색 직사각형)의 존재 하에 슈퍼옥사이드 생성의 동역학을 보여주는 그래프이다.
도 1의 패널 C에 표시된 데이터는 테스트된 조건 하에서 Fe3+가 있거나 없을 때 ROS가 생성되지만 Fe3+가 없을 때, ROS 생성까지 약 2시간의 지연 시간이 관찰된다.
도 1에 나타낸 데이터는 시간 경과에 따른 ROS 생성에 의해 측정된 바와 같이 예시적인 FXN 융합 단백질이 효소 활성을 보유함을 입증한다. 이 효소 활성은 금속 이온의 존재 여부에 관계없이 분명하지만 Fe3+ 및/또는 Mn2+와 같은 금속 이온의 존재하에 강화된다. 특정 이론에 얽매이지 않고, 금속 이온의 존재는 FXN 단백질, 예를 들어 FXN 융합 단백질에서 구조적 변화를 유도하여 그의 활성을 향상시킬 수 있다고 믿어진다.
이 실시예에 기술된 FXN 융합 단백질 활성 분석은 실시예 1에 제공된 기본 프로토콜을 따랐고, 절차는 하기에 더 상세히 기술된다.
금속 이온의 존재에서 하이드로퀴논에 대한 예시적인 FXN 융합 단백질의 산화환원 활성 측정을 위한 프로토콜
1. 열 1-6의 웰에는 다음이 로드되었다
i. 100μM HQ(5μM 최종 농도) 10μl;
ii. 100 μM Fe(III) 황산염 10 μl 또는 100 μM Mn(II) 염화물 10 μl(둘 모두에 대해 5 μM 최종 농도).
컬럼 1-4의 웰에는 다음이 추가로 로드되었다.
iii. 160㎕의 트리스-염산염(THCl); 그리고
컬럼 5-6의 웰에는 다음이 추가로 로드되었다.
iv. 170μl THCl.
2. 표 7에 기재된 바와 같이 표준 및 시험 샘플에 대한 예시적인 FXN 융합 단백질(서열 번호 12)의 연속 희석액을 제조하였으며, 여기서 초기 1:3 희석액(6μL에서 12μL의 50mM Tris-HCL, pH 8.0)을 1:10으로 추가 희석하였다(1.5 μL에서 13.5 μL로).
3. 10μM DCF가 1:1로 희석된 표 6에 설명된 대로 DCF 연속 희석액을 준비했다(200μL에서 200μL의 물 중 0.04% DMSO).
4. DCF 표준 곡선 플레이트(표 6)의 10μL를 96웰 HQ 분석 플레이트(표 5)의 컬럼 5-6으로 옮겼다.
5. 96웰 HQ 분석 플레이트의 컬럼 1-2 및 컬럼 3-4에 각각 표 7에 표시된 대로 10μL 표준 FXN 단백질 또는 테스트 FXN 단백질을 표 7에 나타낸 바와 같다.
위의 실시예 1에 기술된 기본 프로토콜에서 언급한 바와 같이, 활성화된 H2DCF 용액 10μl를 컬럼 1-4의 각 웰에 추가하고(0.5μM의 최종 H2DCF 농도에 대해) 플레이트를 플레이트 판독기로 옮기는 다음 단계 키네틱 읽기는 매우 빠르게 수행되었다.
예시적인 FXN 융합 단백질은 ROS 검출기 화합물로서 H2DCF와 함께 Fe3+ 및/또는 Mn2+의 존재 하에 HQ와 함께 인큐베이션되었다. 485 nm(485/20) 범위의 여기 필터 및 530 nm(528/20) 범위의 방출 필터, 상단에서 광학 및 50의 이득을 사용하여 형광 플레이트 판독기에서 형광을 측정했다.
DCF의 상업적으로 이용 가능한 산화 생성물인 2',7'-디클로로플루오레세인의 적정은 반응에서 생성물의 양과 형광 판독 사이의 선형성을 나타내는 분석 조건의 확립을 가능하게 하였다. 적정은 예시적인 FXN 융합 단백질의 다른 배치에 사용되는 "예시적인 FXN 융합 단백질의 단위"의 정의에 대한 기초를 제공했다.
도 2는 DCF 농도(μM 단위)의 함수로서 DCF에 의해 나타나는 형광(AFU)을 그래프화하여 생성된 2',7'-디클로로플루오레세인(DCF)에 대한 표준 곡선이다. DCF 표준 곡선에서 AFU = 66681은 1μM의 DCF에 해당한다. DCF 표준 곡선에서 외삽하여 다음 공식을 기반으로 분당 1마이크로몰(μM)의 DCF 생성을 촉매하는 데 필요한 FXN 융합 단백질의 양으로 FXN 융합 단백질 1밀리단위의 정의를 제공했다.
Vi = AFU/min = ΔμM/min.
따라서 최대 초기 속도 Vi = 1을 달성하는 데 필요한 FXN 단백질의 양은 FXN 단백질의 밀리단위로 정의된다.
본 결과는 처음으로 FXN 융합 단백질과 같은 FXN 단백질이 산화환원에 민감한 효소로 기능하고 하이드로퀴논의 산화와 슈퍼옥사이드의 생성을 동시에 촉매할 수 있음을 보여준다. FXN 융합 단백질의 산화환원 활성은 Mn2+ 및 Fe3+와 같은 금속 이온의 존재하에 향상된다. 이들 실험은 또한 본 발명자들이 FXN 융합 단백질의 효소 단위의 활성을 정의할 수 있게 하였다.
실시예 3. FXN 융합 단백질의 다른 배치 및 NADH 또는 NADP 존재하에서의 활성 비교
예시적인 FXN 융합 단백질의 효소 단위의 활성이 정의되면, HQ 검정을 사용하여 서열 식별 번호 : 12의 FXN 융합 단백질의 4개의 상이한 배치의 비활성(FXN 융합 단백질 mg당 mUnits로 정의)을 비교하였다. 실험 결과는 도 3의 패널 A에 제시되어 있다. 구체적으로, 도 3의 패널 A는 다양한 농도의 FXN 융합 단백질(0.03μM, 0.1μM, 0.3μM, 1μM)에서 4개의 상이한 배치의 FXN 융합 단백질(배치 05, 18, 28 및 32)의 비활성(specific activity, 밀리그램당 밀리단위로 표시, mUnits/mg)을 나타내는 막대 그래프이다. 도 3의 패널 A에 제시된 결과는 각각의 시험된 FXN 융합 단백질 배치의 비활성이 4가지 상이한 농도의 FXN 융합 단백질에 걸쳐 비교적 일정했음을 나타낸다. 또한 배치 32는 평균 활성이 1582 mUnits/mg로 최소 활성인 반면, 배치 05는 평균 활성이 5790 mUnits/mg으로 최대 활성이다.
RFXN 융합 단백질의 산화환원 활성도 NADPH 및 NADH 존재하에서 측정하였다. 도 3의 패널 B는 Fe3+, Fe3+ 및 NADH, 그리고 Fe3+ 및 NADPH 존재하에서 FXN fusion protein의 비활성(mUnits/mg)을 나타내는 막대 그래프이다. 도 3의 패널 B에 제시된 결과는 검정에 NADPH를 첨가하면 ROS 생성을 유의하게 감소시켜 FXN 융합 단백질의 산화환원 활성을 억제하는 반면 NADH를 첨가하면 FXN 융합 단백질의 산화환원 활성에 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
실시예 4: FXN 융합 단백질의 활성은 고온 저장 조건에 민감하다
이 실험의 목적은 다양한 온도에서 단기 보관(1개월) 후 FXN 융합 단백질의 활성을 평가하여 예시적인 FXN 융합 단백질의 열 안정성을 평가하는 것이었다. 본 실험에서는 SEQ ID NO: 12의 FXN 융합 단백질을 사용하였다. 본 연구에서 시험된 보관 조건 및 해당 결과는 하기 표 10에 요약되어 있다.
예시적인 FXN 융합 단백질의 온도 안정성 연구를 위한 조건(그림 4, 패널 A)
샘플 이름 설명 결과(% 활동)
SPL1 1 mL of FXN fusion protein at -60 °C 1개월 100% (1123 Vi units)
SPL2 1 mL of FXN fusion protein at 2-4 °C 1 개월 66.4% (746 Vi units)
SPL3 1 mL of FXN fusion protein at 25 °C 1개월 23.4% (263 Vi units)
Drug substance (DS) control Drug substance (DS) control (stored at -80 °C) 100.2% (1126 Vi units)
실험 결과는 또한 도 4에 제시되어 있다. 구체적으로, 도 4의 패널 A는 -60 oC (SPL1), 2-4 oC (SPL2) 및 25 oC (SPL3)에서 보관된 예시적인 융합 단백질의 존재 하에 DS 대조군과 비교하여 슈퍼 옥사이드 생성의 동역학을 보여주는 그래프이다. 도 4의 패널 B는 -60 oC (SPL1), 2-4 oC (SPL2) 및 25 oC (SPL3)에서 보관된 예시적인 융합 단백질의 존재 하에 DS 대조군과 비교하여 슈퍼옥사이드 생성의 최대 초기 속도(Vi)를 보여주는 막대 그래프이다.
도 4 및 표 10에 제시된 결과는 1개월 동안 -60 oC 이외의 조건에서 예시적인 FXN 융합 단백질의 저장이 HQ 검정에서 예시적인 FXN 융합 단백질의 감소된 활성을 초래하였음을 입증한다. 이것은 또한 -60 oC보다 높은 온도에서 예시적인 FXN 융합 단백질의 인큐베이션이 HQ 분석에서 그의 활성을 감소시킨다는 것을 입증한다.
실시예 5. 예시적인 FXN 융합 단백질의 활성은 화학적 스트레스에 민감하다
이 실험의 목표는 FXN 융합 단백질의 단백질 변성 및/또는 분해를 유발할 수 있는 화학적 스트레스 요인에 대한 노출 후 예시적인 FXN 융합 단백질의 활성을 평가함으로써 예시적인 FXN 융합 단백질의 화학적 스트레스에 대한 안정성을 평가하는 것이었다. 본 실험에서는 SEQ ID NO: 12의 FXN 융합 단백질을 사용하였다. 연구에서 테스트한 보관 조건과 해당 결과는 그림 5에 나와 있으며 아래 표 11에도 요약되어 있다.
예시적인 FXN 융합 단백질의 화학적 안정성 연구를 위한 조건
샘플 이름 설명 결과(% 활성)
연구 통제 1 mL of FXN fusion protein at 2-8 oC 2 시간 100% (2,908 Vi units)
산성 스트레스 1 mL of FXN fusion protein, pH ≤4, at 37 oC 2일 23.7% (689 Vi units)
알칼리성 스트레스 1 mL of FXN fusion protein, pH ≥ 10, at 37 oC 2 일 0.02% (0.7 Vi units)
산 및 알칼리 조절 1 mL of FXN fusion protein at 37 oC 2일 79.7% (1,730 Vi units)
산화 1 mL of FXN fusion protein 0.05% peroxide at 37 oC 2 시간 2.2% (63 Vi units)
산화 통제 1 mL of FXN fusion protein at 37 oC 2 시간 59.5% (1,730 Vi units)
열 스트레스 1 mL of FXN fusion protein at 50 °C for 2 시간 96.9% (2,820 Vi units)
간단히 말해서, 연구 대조군은 연구 과정에 걸쳐 2-8°C에서 보관되었다. 각 처리는 다음과 같이 수행되었다.
i. 산 처리: pH ≤ 4에 도달할 때까지 FXN 융합 단백질을 함유하는 용액에 1N HCl을 첨가하였다. 샘플을 37 ℃에서 2일 동안 유지한 후, 완충액을 DS 제제의 완충액으로 교환하였다. 샘플은 연구의 나머지 기간 동안 2-8 ℃에서 보관되었다.
ii. 알칼리 처리: 1M Tris 염기를 pH ≥ 10에 도달할 때까지 FXN 융합 단백질을 포함하는 용액에 첨가했다. 샘플을 37 oC에서 2일 동안 유지한 후, 완충액을 DS 제제의 완충액으로 교환하였다. 샘플을 2-8 oC에서 보관했다.
iii. 산 및 염기 대조군: FXN 융합 단백질을 포함하는 용액을 37 oC에서 2일 동안 보관한 다음 2-8 ℃에서 보관했다.
iv. 산화 스트레스 처리: 예시적인 FXN 융합 단백질을 0.05% 과산화수소의 존재 하에 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 2-8 ℃에서 저장하였다.
v. 산화 제어: 예시적인 FXN 융합 단백질을 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 2-8 ℃에서 보관하였다.
vi. 열 스트레스 처리: 예시적인 FXN 융합 단백질을 50 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음 2-8 ℃에서 보관했다. 모든 샘플은 외관, pH, 단백질 정량(A280 기준), 크기 배제 초고성능 액체 크로마토그래피(SE-UPLC), 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC), 이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(IE-HPLC), 환원 모세관 전기영동 소듐 도데실 설페이트(rCE-SDS), 비환원 모세관 전기영동 소듐 도데실 설페이트(nrCE-SDS) 및 유리 티올(데이터 표시 안 됨)에 대해 분석되었다. FXN 융합 단백질의 농도는 웨스턴 블롯에 의해 결정되었고, 산화환원 활성은 전술한 바와 같이 HQ 분석을 사용하여 결정되었다.
HQ 활성의 결과는 도 5에 제시되어 있다. 구체적으로 도 5는 모든 시험된 샘플의 과산화물 생성의 최대 초기 속도(Vi)를 나타내는 막대 그래프이다. 결과는 FXN 융합 단백질이 2시간 동안 적용되었을 때 열 스트레스에 대한 내성이 상당함을 나타낸다. 결과는 또한 FXN 융합 단백질이 알칼리성 및 산화 스트레스에 민감하고 부분적으로 산 스트레스에 취약함을 나타낸다.
실시예 6. 상이한 금속 이온의 존재 하에 예시적인 FXN 융합 단백질의 활성
이 실험의 목표는 다른 금속 이온의 존재 하에 예시적인 FXN 융합 단백질의 HQ-의존성 슈퍼옥사이드 생성 활성을 평가하는 것이었다. 본 실험에서는 SEQ ID NO: 12의 FXN 융합 단백질을 사용하였다. 과산화물 생성의 동역학은 pH 8.0에서 50 mM Tris-HCL 완충액에 20 μM HQ, 5 μM 금속, 5 μM FXN 융합 단백질, 0.25 μM H2DCF 를 포함하는 반응 혼합물에서 평가되었다. 실험에서 테스트된 금속 이온은 Mn2+, Fe3+, Zn2+, Cu2+ 및 Mg2+를 포함한다.
도 6은 상이한 금속 이온의 존재 하에 예시적인 FXN 융합 단백질의 HQ-의존성 슈퍼옥사이드 생성 활성의 동역학을 나타내는 그래프이다. 도 6에 제시된 데이터는 FXN 융합 단백질이 Mn2+ 의 존재하에서 가장 높은 활성을 나타내었음을 입증한다.
실시예 7. 예시적인 FXN 융합 단백질의 활성의 pH 의존성
이 실험의 목적은 예시적인 FXN 융합 단백질의 HQ 의존성 슈퍼옥사이드 생성 활성의 pH 의존성을 평가하는 것이었다. 본 실험에서는 SEQ ID NO: 12의 FXN 융합 단백질을 사용하였다. 구체적으로, 예시적인 FXN 융합 단백질에 의한 슈퍼옥사이드 생성의 동역학을 7.0 내지 9.0 범위의 pH에서 평가하였다. 각 반응 혼합물은 pH 7.0, 7.4, 7.8, 8.0, 8.2, 8.5 및 9.0에서 50mM Tris-HCL에 5μM HQ, 5μM Fe(III) 황산염, 0.05μM H2DCF 및 10μM 예시적인 FXN 융합 단백질을 함유했다.
분석 플레이트를 플레이트 판독기에 놓고 모든 분석 성분을 함께 혼합한 직후에 동역학 판독을 시작했다. 플레이트 판독기 설정은 다음과 같다. 5분마다 형광 판독(여기 485/20, 방출 528/25, 이득 50)이 있는 2시간 운동 스캔과 판독 사이에 10초의 흔들림이 있다. 최대 초기 속도(Vi)는 5개의 데이터 포인트에 걸쳐 임의 형광 단위(AFU)의 가장 빠른 변화를 측정하여 각 웰에 대해 결정되었다.
도 7은 pH의 함수로서 예시적인 FXN 융합 단백질의 활성의 측정으로서 Vi를 나타내는 그래프이다. 도 7에 제시된 데이터는 예시적인 FXN 융합 단백질의 초과산화물 생성 활성이 pH 의존적임을 입증한다. 구체적으로, FXN 융합 단백질은 pH 7.4 이하에서 거의 활성을 나타내지 않는다. pH가 7.4 초과로 증가함에 따라, 예시적인 FXN 융합 단백질의 활성이 증가하고, 약 8.5의 pH에서 피크가 된다. 예시적인 FXN 융합 단백질에 대한 이러한 최적 pH 범위는 약 7.4의 세포질의 pH보다 높은 약 7.8의 미토콘드리아 기질의 pH와 중첩된다.
실시예 8. FXN 활성에 영향을 미칠 수 있는 화합물을 식별하기 위한 고처리량 스크린(HTS)
본 실험의 목적은 본 발명의 HQ 분석과 HTS(High Throughput Screen)를 이용하여 FXN 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 확인하는 것이다. 본 실험에서는 SEQ ID NO: 12의 FXN 융합 단백질을 사용하였다. 실험은 두 부분으로 구성되었다. 실험의 첫 번째 부분에서는 HTS에 사용된 조건에서 HQ 분석의 성능을 검증했다. 검정의 두 번째 부분에서, 예시적인 FXN 융합 단백질의 활성을 향상시킬 수 있는 화합물을 확인하기 위해 770 화합물 라이브러리의 일련의 스크린을 수행했다.
분석 성능 평가
실험의 첫 번째 부분의 목표는 HTS에 사용된 조건에서 HQ 분석의 성능을 검증하는 것이었다. 이를 위해 HQ 분석은 신호 대 배경(S/B) 비율, Z` 인자(이는 분석 판독값의 통계적 견고성의 척도임), 플레이트 내 및 플레이트 간 변동성과 같은 통계적 매개변수를 측정하여 특성화되었다. 이를 위해 2개의 96웰 플레이트를 각각 9개의 섹션으로 분할했다: 각 플레이트의 4개의 섹션에는 10μM 농도의 예시적인 FXN 융합 단백질(고대조군)이 함유되었고; 4개의 섹션은 0.5 μM의 농도에서 예시적인 FXN 융합 단백질(낮은 대조군)이 함유되었고; 1개의 섹션에는 FXN 융합 단백질이 없는 분석 믹스(블랭크 대조군)만 함유되었다.
H2DCF는 교반하면서 30분 동안 20mL의 0.01M NaOH 중 1mL의 1mM H2DCF-DA를 암실에서 인큐베이션함으로써 활성화되었다. 이어서, 75mL의 33mM NaH2PO4를 활성화 혼합물에 첨가하여 10μM의 최종 H2DCF 농도를 산출했다. 이 용액을 4 ℃에 보관하고 사용할 때까지 빛으로부터 보호했다. 각 웰의 분석 믹스에는 50mM Tris-HCL(pH 8.0), 50μM HQ, 1μM MnCl2, 0.5μM 활성화된 H2DCF 및 10μM(높은 대조군), 0.5μM(낮은 제어) 및 0 μM(공백 제어). 분석 믹스를 플레이트에 첨가한 후, 플레이트를 즉시 플레이트 판독기에 넣고 동역학 판독을 시작했다. 플레이트 판독기 설정은 다음과 같다. 1분마다 형광 판독(여기 482/20, 방출 530/25, 이득 50)이 있는 45분 운동 스캔(판독 사이에 3초 흔들기)이다. 최대 초기 속도(Vi)는 5개의 데이터 포인트에 걸쳐 임의 형광 단위(AFU)의 가장 빠른 변화를 측정하여 각 웰에 대해 결정되었다. 신호 대 배경(S/B) 비율, Z` 인자, 플레이트 내 및 플레이트 간 변동성과 같은 통계적 매개변수를 계산하여 분석 성능을 특성화했다.
결과는 도 8 및 하기 표 12에 제시되어 있다. 도 8은 플레이트 1 및 2에 대해 10μM FXN 융합 단백질(높은 FXN 대조군), 5μM FXN 융합 단백질(낮은 FXN 대조군) 및 0μM FXN 융합 단백질(블랭크 대조군)을 포함하는 각 테스트 샘플에 대해 결정된 Vi 값을 보여주는 그래프이다. 이 데이터를 기반으로 높은 FXN 대조군 샘플에 대한 Z` 계수는 0.67보다 큰 것으로 계산되었고 관련 S/B 비율은 7.8보다 큰 것으로 계산되었으며, 낮은 FXN 대조군 샘플에 대한 Z` 인자는 0.85보다 큰 것으로 계산되었고 S/B 비율은 6.18보다 큰 것으로 계산되었다.
표 12는 HQ 분석의 플레이트 간 변동성을 평가하는 데 사용되는 데이터를 나타낸다.
테스트된 각 조건 및 관련 통계 매개변수에 대한 Vi 값
Sample Mean Vi % CV N
(number of wells)
Plate 1 High control
(10 μM FXN fusion protein)		 5390.0 3.8 48
Low control
(0.5 μM FXN fusion protein)		 471.0 2.8 40
Blank control(0 μM FXN fusion protein) 76.4 1.7 8
Plate 2 High control
(10 μM FXN fusion protein)		 4995.1 9.1 48
Low control
(0.5 μM FXN fusion protein)		 635.5 3.8 40
Blank control(0 μM FXN fusion protein) 98.6 1.9 8
Plates 1 and 2 combined High control
(10 μM FXN fusion protein)		 5192.5 7.7 96
Low control
(0.5 μM FXN fusion protein)		 553.2 15.4 80
Blank control(0 μM FXN fusion protein) 87.5 13.2 16
도 8 및 표 12에 표시된 결과는 HQ 분석의 성능이 테스트된 조건에서 HTS 실험에 적합함을 보여준다.
높은 처리량 스크린(High Throughput Screen, HTS)
실험의 일부의 목표는 이 분석에서 FXN 단백질의 활성을 조절하는 화합물을 확인하기 위해 본 발명의 HQ 분석을 사용하여 약물 라이브러리의 높은 처리량 스크리닝을 수행하는 것이다. HTS는 Enzo Life Sciences(제품 번호 BML-2843-0100)에서 구입한 SCREEN-WELL® FDA 승인 약물 라이브러리 V2를 사용하여 수행되었다. 이 라이브러리에는 FDA 승인을 받은 770개 이상의 화합물이 포함되어 있으며 생물학적 활성, 안전성 및 생체이용률이 잘 알려져 있다. 라이브러리는 또한 제초제, 살충제, 자외선 차단제 및 세포독성제와 같은 관련 없는 화합물을 피한다. SCREEN-WELL® FDA 승인 약물 라이브러리 V2의 화합물은 예시적인 FXN 융합 단백질의 활성을 향상시키는 능력에 대해 스크리닝되었다.
수행된 HTS 실험의 요약은 도 9에 도시된다. 구체적으로 도 9는 HTS 실험에 포함된 3단계 및 관련 결과를 보여주는 순서도이다. 첫 번째 단계에는 SCREEN-WELL® FDA 승인 약물 라이브러리 V2의 화합물이 FXN 강화 활성에 대해 스크리닝되는 1차 스크리닝이 포함되었다. 이 화면에서 30% 이상의 FXN 활동 향상을 보여주는 17개의 히트가 식별되었다. 두 번째 단계에는 1차 선별에서 확인된 17개의 화합물을 다시 선별하는 확인 선별이 포함되었으며, 16개의 화합물이 각 분석 플레이트에 포함된 낮은 FXN 대조군 웰의 표준 편차의 2배 이상으로 FXN 활성을 향상시키는 것으로 확인되었다. 세 번째 단계에는 확인 화면에서 확인된 16개의 화합물이 예시적인 FXN 융합 단백질의 부재 하에 스크리닝되는 카운터 스크리닝이 포함되었다. 이 화면에서 FXN 강화 활성이 FXN의 존재에 엄격하게 의존하는 16개 화합물 중 2개가 확인되었다.
1차 스크린은 다음과 같은 절차로 진행되었다. 완전한 분석 혼합물은 분석 플레이트에 첨가하기 직전에 새로 제조되었으며 50mM Tris-HCL(pH 8.0), 50μM HQ, 1μM MnCl2, 0.5μM 활성화된 H2DCF, 0.5 μM 농도의 예시적인 FXN 융합 단백질 및 10μM의 최종 농도에서 시험 화합물을 포함했다. 또한, 각 플레이트는 1% DMSO 및 물에서 10μM(상한 대조군), 0.5μM(하한 대조군) 또는 0μM(블랭크 대조군용 비히클) 농도의 예시적인 FXN 융합 단백질을 함유하는 내부 대조군도 포함했다. 라이브러리 화합물이 DMSO 또는 물에 용해되었기 때문에 DMSO 및 물 모두의 대조군이 포함되었다. 분석의 모든 구성 요소를 함께 혼합한 후, 플레이트를 즉시 플레이트 판독기에 넣고 동역학 판독을 시작했다. 플레이트 판독기 설정은 다음과 같다. 1분마다 형광 판독(여기 482/20, 방출 530/25, 이득 50)이 있는 45분 운동 스캔(판독 사이에 3초 흔들기).
최대 초기 속도(Vi)는 곡선의 모든 위치에서 5개 데이터 포인트에 대해 임의 형광 단위(AFU)의 가장 빠른 변화를 측정하여 각 웰에 대해 결정되었다. 0.5μM FXN 융합 단백질을 포함하는 대조군 웰에 대한 Vi 값의 평균을 계산하고 플레이트 평균보다 30% 높은 창을 히트 화합물의 컷오프로 결정했다.
도 10은 DMSO에서 화합물의 HTS 1차 스크린의 결과를 보여주는 상자 플롯이고, FXN 활성을 30% 이상 증가시키는 화합물, FXN 활성을 30% 이상 감소시키는 화합물 및 FXN 활성의 변화를 30% 미만으로 유발하는 화합물을 포함한다. 컷오프보다 높은 Vi 값을 가진 모든 화합물은 2차 스크린에 적합했다. 위에 표시된 대로 기본 화면에서 30% 이상의 FXN 활동 향상을 입증한 17개의 히트가 확인되었다.
확인 화면은 기본 화면에서 사용한 것과 유사한 절차를 사용하여 수행되었다. 확인 화면에서 16개 화합물이 0.5μM FXN 융합 단백질이 포함된 각 플레이트에 포함된 낮은 FXN 대조군 웰의 표준 편차보다 2배 이상 FXN 활성을 향상시키는 것으로 확인되었다.
카운터 스크린은 FXN 융합 단백질의 존재에 의존하는 FXN 강화 활성을 갖는 화합물을 확인했다. 이 화면에서는 내부 차량 컨트롤에 의해 표시되는 FXN 활성에서 표준 편차의 2배 이상 벗어나지 않는 FXN 활성을 갖는 화합물이 선택되었다. 도 11은 화합물 1 및 화합물 2에 대한 확인 스크린의 예시적인 결과를 보여주는 막대 그래프이다. 도 11에 나타낸 결과는 화합물 1이 FXN 융합 단백질의 부재 하에 활성을 나타내지 않았기 때문에 카운터 스크린을 통과했음을 나타내고; 한편, 화합물 2는 FXN 융합 단백질의 부재 하에 활성을 나타내었기 때문에 실격되었다. 카운터 스크린에서 확인 스크린의 16개 화합물 중 2개가 FXN의 존재에 의존하는 FXN 강화 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
SEQUENCE LISTING <110> CHONDRIAL THERAPEUTICS, INC. <120> METHODS FOR QUANTIFYING FRATAXIN ACTIVITY <130> 130197-01020 <140> <141> <150> 62/940,214 <151> 2019-11-25 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Trp Thr Leu Gly Arg Arg Ala Val Ala Gly Leu Leu Ala Ser Pro 1 5 10 15 Ser Pro Ala Gln Ala Gln Thr Leu Thr Arg Val Pro Arg Pro Ala Glu 20 25 30 Leu Ala Pro Leu Cys Gly Arg Arg Gly Leu Arg Thr Asp Ile Asp Ala 35 40 45 Thr Cys Thr Pro Arg Arg Ala Ser Ser Asn Gln Arg Gly Leu Asn Gln 50 55 60 Ile Trp Asn Val Lys Lys Gln Ser Val Tyr Leu Met Asn Leu Arg Lys 65 70 75 80 Ser Gly Thr Leu Gly His Pro Gly Ser Leu Asp Glu Thr Thr Tyr Glu 85 90 95 Arg Leu Ala Glu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Ala Glu Phe Phe Glu Asp 100 105 110 Leu Ala Asp Lys Pro Tyr Thr Phe Glu Asp Tyr Asp Val Ser Phe Gly 115 120 125 Ser Gly Val Leu Thr Val Lys Leu Gly Gly Asp Leu Gly Thr Tyr Val 130 135 140 Ile Asn Lys Gln Thr Pro Asn Lys Gln Ile Trp Leu Ser Ser Pro Ser 145 150 155 160 Ser Gly Pro Lys Arg Tyr Asp Trp Thr Gly Lys Asn Trp Val Tyr Ser 165 170 175 His Asp Gly Val Ser Leu His Glu Leu Leu Ala Ala Glu Leu Thr Lys 180 185 190 Ala Leu Lys Thr Lys Leu Asp Leu Ser Ser Leu Ala Tyr Ser Gly Lys 195 200 205 Asp Ala 210 <210> 2 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Gly Thr Leu Gly His Pro Gly Ser Leu Asp Glu Thr Thr Tyr Glu 1 5 10 15 Arg Leu Ala Glu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Ala Glu Phe Phe Glu Asp 20 25 30 Leu Ala Asp Lys Pro Tyr Thr Phe Glu Asp Tyr Asp Val Ser Phe Gly 35 40 45 Ser Gly Val Leu Thr Val Lys Leu Gly Gly Asp Leu Gly Thr Tyr Val 50 55 60 Ile Asn Lys Gln Thr Pro Asn Lys Gln Ile Trp Leu Ser Ser Pro Ser 65 70 75 80 Ser Gly Pro Lys Arg Tyr Asp Trp Thr Gly Lys Asn Trp Val Tyr Ser 85 90 95 His Asp Gly Val Ser Leu His Glu Leu Leu Ala Ala Glu Leu Thr Lys 100 105 110 Ala Leu Lys Thr Lys Leu Asp Leu Ser Ser Leu Ala Tyr Ser Gly Lys 115 120 125 Asp Ala 130 <210> 3 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Trp Thr Leu Gly Arg Arg Ala Val Ala Gly Leu Leu Ala Ser Pro 1 5 10 15 Ser Pro Ala Gln Ala Gln Thr Leu Thr Arg Val Pro Arg Pro Ala Glu 20 25 30 Leu Ala Pro Leu Cys Gly Arg Arg Gly Leu Arg Thr Asp Ile Asp Ala 35 40 45 Thr Cys Thr Pro Arg Arg Ala Ser Ser Asn Gln Arg Gly Leu Asn Gln 50 55 60 Ile Trp Asn Val Lys Lys Gln Ser Val Tyr Leu Met Asn Leu Arg Lys 65 70 75 80 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 4 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 5 Met Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Galanin sequence" <400> 6 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro His Ala Val 1 5 10 15 Gly Asn His Arg Ser Phe Ser Asp Lys Asn Gly Leu Thr Ser 20 25 30 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 7 Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 1 5 10 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 8 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila sp. <400> 9 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 10 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 11 <211> 34 <212> PRT <213> Human alphaherpesvirus 1 <400> 11 Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr 1 5 10 15 Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro 20 25 30 Val Glu <210> 12 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 12 Met Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Met Trp 1 5 10 15 Thr Leu Gly Arg Arg Ala Val Ala Gly Leu Leu Ala Ser Pro Ser Pro 20 25 30 Ala Gln Ala Gln Thr Leu Thr Arg Val Pro Arg Pro Ala Glu Leu Ala 35 40 45 Pro Leu Cys Gly Arg Arg Gly Leu Arg Thr Asp Ile Asp Ala Thr Cys 50 55 60 Thr Pro Arg Arg Ala Ser Ser Asn Gln Arg Gly Leu Asn Gln Ile Trp 65 70 75 80 Asn Val Lys Lys Gln Ser Val Tyr Leu Met Asn Leu Arg Lys Ser Gly 85 90 95 Thr Leu Gly His Pro Gly Ser Leu Asp Glu Thr Thr Tyr Glu Arg Leu 100 105 110 Ala Glu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Ala Glu Phe Phe Glu Asp Leu Ala 115 120 125 Asp Lys Pro Tyr Thr Phe Glu Asp Tyr Asp Val Ser Phe Gly Ser Gly 130 135 140 Val Leu Thr Val Lys Leu Gly Gly Asp Leu Gly Thr Tyr Val Ile Asn 145 150 155 160 Lys Gln Thr Pro Asn Lys Gln Ile Trp Leu Ser Ser Pro Ser Ser Gly 165 170 175 Pro Lys Arg Tyr Asp Trp Thr Gly Lys Asn Trp Val Tyr Ser His Asp 180 185 190 Gly Val Ser Leu His Glu Leu Leu Ala Ala Glu Leu Thr Lys Ala Leu 195 200 205 Lys Thr Lys Leu Asp Leu Ser Ser Leu Ala Tyr Ser Gly Lys Asp Ala 210 215 220

Claims (132)

  1. 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법에 있어서,
    상기 FXN 단백질을 환원제와 반응성 산소종(ROS)검출기 화합물과 결합하여 분석 혼합물을 생성하는 단계를 포함하고,
    상기 FXN 단백질은 환원제의 산화를 촉진시키고 ROS 의 생성을 촉진하여, 생성된 ROS 의 양은 상기 FXN 단백질 없이 상기 환원제 및 상기 ROS 검출기 화합물을 포함하는 분석 혼합물에서 생성된 ROS 의 양보다 더 높은, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  2. 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 측정하기 위한 방법에 있어서,
    상기 FXN 단백질을 환원제 및 반응성 산소종(reactive oxygen species,ROS)검출기 화합물과 약 7.4 이상의 pH 에서 결합하는 단계, 그렇게 함으로써 분석 혼합물을 제조하는 단계를 포함하고,
    상기 FXN 단백질은 환원제의 산화를 촉진시키고 ROS 의 생성을 촉진하여, 생성된 ROS의 양은 상기 FXN 단백질 없이 상기 환원제 및 상기 ROS 검출기 화합물을 포함하는 분석 혼합물에서 생성된 ROS 의 양보다 더 높은, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 측정하기 위한 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 약 7.9 이상의 pH 에서 상기 FXN 단백질을 환원제와 반응성 산소종(ROS)검출기 화합물과 결합하는 단계를 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 측정하기 위한 방법.
  4. 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법에 있어서,상기 방법은:
    상기 FXN 단백질을 환원제와 결합하는 단계 및 금속 이온의 부재하에 반응성 산소종(reactive oxygen species,ROS)검출기 화합물을 조합하여 분석 혼합물을 생성하는 단계를 포함하고,
    여기서 상기 FXN 단백질은 환원제의 산화 및 ROS의 생성을 촉진하여, 생성된 ROS의 양이 상기 FXN 단백질이 없이 상기 환원제 및 상기 ROS 검출기 화합물을 포함하는 분석 혼합물에서 생성된 ROS의 양보다 높은, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  5. 프라탁신(FXN)단백질의 활성 측정 방법에 있어서,
    상기 FXN 단백질을 환원제와 결합하는 단계 및 철 이온의 부재하에 반응성 산소종(reactive oxygen species,ROS)검출기 화합물을 조합하여 분석 혼합물을 생성하는 단계를 포함하며,
    상기 FXN 단백질은 환원제의 산화 및 ROS 의 생성을 촉진하여, 생성된 ROS 의 양은 상기 FXN 단백질 없이 상기 환원제 및 상기 ROS 검출기 화합물을 포함하는 분석 혼합물에서 생성된 ROS 의 양보다 더 높은, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  6. 제 1 항, 제 4 항 및 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석 혼합물의 pH 를 약 7.4 보다 큰 pH 로 조정하는 단계를 더 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 분석 혼합물의 pH 를 약 7.9 이상의 pH 로 조정하는 단계를 더 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 6 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석 혼합물에 금속 이온을 첨가하는 단계를 더 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,상기 금속 이온은 Fe2+ 가 아닌, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,상기 금속 이온은,
    Mn2+,Fe3+,Zn2+,Cu2+ 및 Mg2+ 으로 구성된 상기 그룹 중에서 선택되는 상기 금속 이온인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 금속 이온은 Mn2+ 인,프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  12. 제 10 항에 있어서,상기 금속은 Fe3+ 인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 분석 혼합물을 인큐베이션하는 단계를 더 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석 혼합물에서 생성된 ROS 의 양을 측정하는 단계를 더 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 시간에 걸쳐 상기 분석 혼합물에서 생성된 ROS 의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 규칙적인 시간 간격들에서 생성된 ROS 의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  17. 제 15 항 및 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석 혼합물의 인큐베이션 시작 후 약 0.1 초 내지 약 10 분 마다 생성되는 ROS 의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  18. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석 혼합물에서 ROS 생성의 최대 초기 속도(Vi)를 결정하는 단계를 더 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 최대 초기 속도(Ti)에 대한 시간을 결정하는 단계를 더 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 약 7.4 초과의 pH 에서 FXN 단백질의 단위 활성을 결정하는 단계를 더 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  21. 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법에 있어서,
    상기 FXN 단백질을 환원제와 반응성 산소종(reactive oxygen species;ROS) 검출기 화합물과 결합하여 분석 혼합물을 생성하는 단계; 및
    상기 분석 혼합물에서 생성된 ROS 의 양을 시간에 따라 측정하는 단계를 포함하며,
    상기 FXN 단백질은 상기 환원제 및 ROS 의 생성을 촉진하여, 생성된 ROS 의 양이 상기 FXN 단백질 없이 환원제 및 ROS 검출기 화합물을 포함하는 분석 혼합물에서 생성된 ROS 의 양보다 더 높은, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 규칙적인 시간 간격들에서 생성된 ROS 의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  23. 제 21 항 및 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 0.1 초 내지 약 10 분 마다 생성된 ROS 의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  24. 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 분석 혼합물에서 ROS 생성의 최대 초기 속도(Vi)를 결정하는 단계를 더 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 최대 초기 속도(Ti)에 대한 시간을 결정하는 단계를 더 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 FXN 단백질의 단위 활성을 결정하는 단계를 더 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환원제가 유기 화합물인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 환원제가 환원된 퀴논 화합물인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 환원된 퀴논 화합물이 환원된 벤조퀴논 화합물, 환원된 나프토퀴논 화합물 및 환원된 안트라퀴논 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 환원된 퀴논 화합물이 환원된 벤조퀴논 화합물인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 환원된 벤조퀴논 화합물이 하이드로퀴논인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROS 검출기 화합물이 형광 프로브 또는 화학발광 프로브인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  33. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROS 검출기 화합물이 수퍼옥사이드 음이온 검출 시약 또는 과산화수소 검출 시약인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  34. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROS 검출기 화합물이 코엘렌테라진; 디하이드로에티디움; 2', 7'- 디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF), 루게닌, 루미놀, 키프리디나 루시페린 유사체(CLA), 키프리디나 루시페린 메톡시-유사체(MCLA), 메틸티아졸릴디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT), p-니트로테트라졸륨 블루(NBT), 레독스센서 레드 CC-1, 2,3-비스-(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)- 2H-테트라졸륨-5-카복스아닐리드(XTT)및 그의 구조 변이체 및 유사체로 이루어진 그룹에서 선택되는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 ROS 검출기 화합물이 2', 7'- 디클로로디히드로플루오레세인 디아세테이트(H2DCF)인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  36. 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환원제 및 상기 ROS 검출기 화합물이 동일한 화합물인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  37. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환원제 및 상기 ROS 검출기 화합물이 상이한 화합물인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 환원제는 디히드로퀴논(dihydroquinone)이고, 상기 ROS 검출기 화합물은 2', 7'- 디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  39. 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FXN 단백질은 프라탁신(FXN)인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  40. 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FXN 단백질이 전장 hFXN 및 세포 투과 펩티드(CPP)를 포함하는 FXN 융합 단백질인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, CPP 는 세포 투과 펩티드 CPP사이트 2.0 의 데이터베이스에 열거된 CPP 의 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하는 것인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 CPP 는 HIV-TAT, 갈라닌, 마스토파란, 트랜스포탄, 페네트라틴, 폴리아르기닌, VP22 및 이의 변이체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드를 포함하는 것인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 CPP 가 HIV-TAT 또는 이의 변이체 또는 유도체를 포함하는, 융합 단백질.
  44. 제 40 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FXN 융합 단백질이 서열 식별 번호:12 를 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성 측정 방법.
  45. 프라탁신(FXN) 단백질을 포함하는 샘플에 대한 품질 제어를 수행하는 방법에 있어서,
    제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 FXN 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  46. FXN 단백질의 활성을 측정하기 위한 조성물에 있어서, 상기 조성물은:
    FXN 단백질, 환원제 및 반응성 산소종(ROS)검출기 화합물을 포함하고, 조성물의 pH 가 약 7.4 이상인 FXN 단백질의 활성을 측정하기 위한 조성물.
  47. 제 46 항에 있어서, 조성물의 pH 가 약 7.9 이상인 조성물.
  48. 제 46 항 및 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 금속 이온을 추가로 포함하는 조성물.
  49. 제 48 항에 있어서, 상기 금속 이온은 Fe2+ 가 아닌 조성물.
  50. 제 48 항에 있어서,상기 금속 이온이 Mn2+,Fe3+,Zn2+,Cu2+ 및 Mg2+ 로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  51. 제 50 항에 있어서, 상기 금속 이온이 Fe3+ 인 조성물.
  52. 제 50 항에 있어서, 상기 금속 이온이 Mn2+ 인 조성물.
  53. FXN 단백질의 활성을 측정하기 위한 조성물에 있어서,
    FXN 단백질, 환원제 및 반응성 산소종(ROS)검출기 화합물을 포함하고,
    상기 조성물은 실질적으로 금속 이온을 함유하지 않는, FXN 단백질의 활성을 측정하기 위한 조성물.
  54. FXN 단백질의 활성을 측정하기 위한 조성물에 있어서,
    FXN 단백질, 환원제 및 반응성 산소종(ROS) 검출기 화합물을 포함하며, 상기 조성물은 철 이온을 실질적으로 함유하지 않는, FXN 단백질의 활성을 측정하기 위한 조성물.
  55. 제 53 항 및 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 pH 가 약 7.4 이상인 조성물.
  56. 제 55 항에 있어서, 상기 조성물의 pH 가 약 7.9 이상인 조성물.
  57. 제 46 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환원제가 유기 화합물인 조성물.
  58. 제 57 항에 있어서, 상기 환원제가 환원된 퀴논 화합물인 조성물.
  59. 제 58 항에 있어서, 상기 환원된 퀴논 화합물이 환원된 벤조퀴논 화합물, 환원된 나프토퀴논 화합물 및 환원된 안트라퀴논 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  60. 제 59 항에 있어서, 상기 환원된 퀴논 화합물이 환원된 벤조퀴논 화합물인 조성물.
  61. 제 60 항에 있어서, 상기 환원된 벤조퀴논 화합물이 하이드로퀴논인 조성물.
  62. 제 46 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROS 검출기 화합물이 형광 프로브 또는 화학발광 프로브인 조성물.
  63. 제 46 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROS 검출기 화합물이 수퍼옥사이드 음이온 검출 시약 또는 과산화수소 검출 시약인 조성물.
  64. 제 62 항 및 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROS 검출기 화합물이 코엘렌테라진; 디하이드로에티디움; 2', 7'- 디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF), 루게닌, 루미놀, 키프리디나 루시페린 유사체(CLA), 키프리디나 루시페린 메톡시-유사체(MCLA), 메틸티아졸릴디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT), p-니트로테트라졸륨 블루(NBT), 레독스센서 레드 CC-1, 2,3-비스-(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)- 2H-테트라졸륨-5-카복스아닐리드(XTT)및 그의 구조 변이체 및 유사체를 포함하는 그룹에서 선택되는 조성물.
  65. 제 64 항에 있어서, 상기 ROS 검출기 화합물이 2', 7'- 디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)인 조성물.
  66. 제 46 항 내지 제 65 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환원제 및 상기 ROS 검출기 화합물이 동일한 화합물인 조성물.
  67. 제 46 항 내지 제 65 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환원제 및 상기 ROS 검출기 화합물이 상이한 화합물인 조성물.
  68. 제 67 항에 있어서, 상기 환원제는 디히드로퀴논(dihydroquinone)이고, 상기 ROS 검출기 화합물은 2', 7'- 디클로로디히드로플루오레세인(FhDCF)인 조성물.
  69. 제 45 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FXN 단백질이 프라탁신(fractaxin)인 조성물.
  70. 제 45 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FXN 단백질이 전장 hFXN 및 세포 투과 펩티드(CPP)를 포함하는 FXN 융합 단백질인, 조성물.
  71. 제 70 항에 있어서, 상기 CPP 가 세포 투과 펩티드 CPP사이트 2.02 의 데이터베이스에 열거된 CPP 의 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하는 조성물.
  72. 제 71 항에 있어서, 상기 CPP 가 HIV-TAT, 갈라닌, 마스토파란, 트랜스포탄, 페네트라틴, 폴리아르기닌, VP22 및 이의 변이체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드를 포함하는 조성물.
  73. 제 72 항에 있어서, 상기 CPP 가 HIV-TAT 또는 이의 변이체 또는 유도체를 포함하는 조성물.
  74. 제 73 항에 있어서, 상기 FXN 융합 단백질이 서열 식별 번호 :12 를 포함하는 조성물
  75. FXN 단백질을 포함하는 조성물에 있어서,
    상기 FXN 단백질은 FXN 단백질의 약 1000 mU/mg 내지 약 6500 mU/mg 범위의 하이드로퀴논 감소의 비활성(specific activity)을 나타내는 것인 조성물.
  76. 제 75 항에 있어서, 하이드로퀴논 환원의 비활성은 약 1200 mU/mg 내지 약 6000 mU/mg 의 범위 내에 있는, 조성물.
  77. 제 76 항에 있어서, 상기 비활성은 약 1400 mU/mg 내지 약 5900 mU/mg 의 범위 내에 있는, 조성물.
  78. FXN 단백질의 활성을 결정하기 위한 키트(kit)에 있어서,
    환원제, ROS 검출기 화합물 및 환원제 결합 지침, ROS 검출기 화합물 및 FXN 단백질을 포함하고, 그렇게 함으로써 분석 혼합물을 생성하는, FXN 단백질의 활성을 결정하기 위한 키트.
  79. FXN 단백질의 활성을 결정하기 위한 키트에 있어서,
    환원제, ROS 검출기 화합물 및 환원제 결합 지침, ROS 검출기 화합물 및 FXN 단백질을 포함하고,
    이에 의해 분석 혼합물을 생성하고; 및
    상기 분석 혼합물에서 상기 FXN 단백질의 Vi 를 결정하는, 키트
  80. 제 78 항 및 제 79 항 중 어느 한 항에 있어서, 금속 이온 화합물을 추가로 포함하는, 키트.
  81. 제 80 항에 있어서, 상기 금속 이온 화합물은 Mn2+,Fe3+,Zn2+,Cu2+ 및 Mg2+ 로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 이온을 포함하는, 키트.
  82. 제 81 항에 있어서, 상기 금속 이온 화합물은 Fe3+ 를 포함하는 키트.
  83. 제 81 항에 있어서, 상기 금속 이온 화합물은 Mn2+ 를 포함하는 키트.
  84. 제 78 항 내지 제 83 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환원제가 유기 화합물인 키트.
  85. 제 84 항에 있어서, 상기 환원제가 환원된 퀴논 화합물인 키트.
  86. 제 85 항에 있어서, 상기 환원된 퀴논 화합물이 감소된 벤조퀴논 화합물, 감소된 나프토퀴논 화합물 및 감소된 안트라퀴논 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키트.
  87. 제 86 항에 있어서, 상기 환원된 퀴논 화합물이 환원된 벤조퀴논 화합물인 키트.
  88. 제 87 항에 있어서, 상기 환원된 벤조퀴논 화합물이 하이드로퀴논인 키트.
  89. 제 78 항 내지 제 88 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROS 검출기 화합물이 형광 프로브 또는 화학발광 프로브인 키트.
  90. 제 78 항 내지 제 88 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROS 검출기 화합물이 수퍼옥사이드 음이온 검출 시약 또는 과산화수소 검출 시약인 키트.
  91. 제 89 항 및 제 90 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROS 검출기 화합물은 코엘렌테라진; 디하이드로에티디움; 2', 7'- 디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF), 루게닌, 루미놀, 키프리디나 루시페린 유사체(CLA), 키프리디나 루시페린 메톡시-유사체(MCLA), 메틸티아졸릴디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT), p-니트로테트라졸륨 블루(NBT), 레독스센서 레드 CC-1, 2,3-비스-(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)- 2H-테트라졸륨-5-카복스아닐리드(XTT)및 그의 구조 변이체 및 유사체를 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 키트.
  92. 제 91 항에 있어서, 상기 ROS 검출기 화합물이 2', 7'- 디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)인, 키트.
  93. 제 78 항 내지 제 92 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환원제 및 상기 ROS 검출기 화합물이 동일한 화합물인, 키트.
  94. 제 78 항 내지 제 92 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환원제 및 상기 ROS 검출기 화합물이 상이한 화합물인, 키트.
  95. 제 94 항에 있어서, 상기 환원제는 디히드로퀴논(dihydroquinone)이고, 상기 ROS 검출기 화합물은 2', 7'- 디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)인, 키트.
  96. 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법에 있어서,
    (i) 상기 FXN 단백질을 시험 화합물,환원제 및 반응성 산소종(reactive oxygen species;ROS)검출기 화합물과 조합하여 분석 혼합물을 생성하는 단계, 여기서 상기 FXN 단백질은 상기 환원제의 산화 및 상기 ROS 의 생성을 용이하게 하고;
    (ii) 상기 시험 화합물의 존재 하에 생성된 ROS 의 양을 측정하는 단계;
    (iii) 상기 시험 화합물의 존재하에 생성된 ROS 의 양을 시험 화합물의 부재하에 생성된 ROS 의 양과 비교하는 단계; 및
    (iv) 시험 화합물의 존재 하에 생성된 ROS 의 양이 시험 화합물의 부재하에 생성된 ROS 의 양과 상이한 경우, 상기 FXN 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물로서 시험 화합물을 식별하는 단계; 를 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  97. 제 96 항에 있어서, 상기 분석 혼합물을 인큐베이션하는 단계를 더 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  98. 제 96 항 및 제 97 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계(ii)는 시간 경과에 따라 상기 분석 혼합물에서 생성된 ROS의 양을 측정하는 것을 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  99. 제 98 항에 있어서, 상기 단계(ii)는 규칙적인 시간 간격으로 생성된 ROS 의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  100. 제 98 항 및 제 99 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(ii)는 매 10 분 마다 매 0.1 초 마다 생성된 ROS 의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  101. 제 96 항 내지 제 100 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석 혼합물에서 ROS 생성의 최대 초기 속도(Vi)를 결정하는 단계를 더 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  102. 제 101 항에 있어서,최대 초기 속도(Ti)에 대한 시간을 결정하는 단계를 더 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  103. 제 102 항에 있어서,상기 FXN 단백질의 단위 활성을 결정하는 단계를 더 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  104. 제 101 항에 있어서,
    상기 시험 화합물의 부재하에 상기 FXN 단백질의 Vi 를 상기 FXN 단백질의 Vi 와 비교하는 단계; 및
    상기 시험 화합물의 존재하에 상기 FXN 단백질의 Vi 가 상기 시험 화합물의 부재하에 상기 FXN 단백질의 Vi 와 상이한 경우, 상기 FXN 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물로서 상기 시험 화합물을 확인하는 단계를 더 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  105. 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법에 있어서, 상기 방법은:
    (i)상기 FXN 단백질을 시험 화합물, 환원제 및 반응성 산소종(reactive oxygen species;ROS)검출기 화합물과 조합하여 분석 혼합물을 생성하는 단계; 여기서 상기 FXN 단백질은 환원제의 산화 및 ROS 의 생성을 용이하게 한다;
    (ii)상기 시험 화합물의 존재 하에 생성된 ROS 의 양을 측정하고, 상기 FXN 단백질의 Vi 를 결정하는 단계;
    (iii)상기 시험 화합물의 부재하에 상기 FXN 단백질의 Vi 와 상기 FXN 단백질의 Vi 를 비교하는 단계; 및
    (iv)상기 시험 화합물의 존재하에 상기 FXN 단백질의 Vi 가 상기 시험 화합물의 부재하에 상기 FXN 단백질의 Vi 와 상이한 경우, 상기 FXN 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물로서 상기 시험 화합물을 확인하는 단계를 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  106. 제 96 항 내지 제 105 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석 혼합물의 pH 를 약 7.4 보다 큰 pH 로 조절하는 단계를 더 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  107. 제 106 항에 있어서, 상기 분석 혼합물의 pH 를 약 7.9 이상의 pH 로 조정하는 단계를 더 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  108. 제 96 항 내지 제 107 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석 혼합물에 금속 이온을 첨가하는 단계를 더 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  109. 제 108 항에 있어서, 상기 금속 이온은 Mn2+, Fe3+, Zn2+, Cu2+ 및 Mg2+ 로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  110. 제 109 항에 있어서, 상기 금속 이온은 Mn2+ 인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  111. 제 109 항에 있어서, 상기 금속 이온은 Fe3+ 인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  112. 제 96 항 내지 제 111 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환원제가 유기 화합물인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  113. 제 112 항에 있어서, 상기 환원제가 환원된 퀴논 화합물인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  114. 제 113 항에 있어서, 상기 환원된 퀴논 화합물이 환원된 벤조퀴논 화합물, 환원된 나프토퀴논 화합물 및 환원된 안트라퀴논 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 , 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  115. 제 114 항에 있어서, 상기 환원된 퀴논 화합물이 환원된 벤조퀴논 화합물인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  116. 제 115 항에 있어서, 상기 환원된 벤조퀴논 화합물이 하이드로퀴논인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  117. 제 96 항 내지 제 116 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROS 검출기 화합물이 형광 프로브 또는 화학발광 프로브인 것인 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  118. 제 96 항 내지 제 116 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROS 검출기 화합물이 수퍼옥사이드 음이온 검출 시약 또는 과산화수소 검출 시약인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  119. 제 96 항 내지 제 118 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROS 검출기 화합물은 코엘렌테라진; 디하이드로에티디움; 2', 7'- 디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF), 루게닌, 루미놀, 키프리디나 루시페린 유사체(CLA), 키프리디나 루시페린 메톡시-유사체(MCLA), 메틸티아졸릴디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT), p-니트로테트라졸륨 블루(NBT), 레독스센서 레드 CC-1, 2,3-비스-(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)- 2H-테트라졸륨-5-카복스아닐리드(XTT)및 그의 구조 변이체 및 유사체으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  120. 제 119 항에 있어서, 상기 ROS 검출기 화합물이 2', 7'- 디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  121. 제 96 항 내지 제 120 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환원제 및 상기 ROS 검출기 화합물이 동일한 화합물인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  122. 제 96 항 내지 제 120 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환원제 및 상기 ROS 검출기 화합물이 상이한 화합물인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  123. 제 122 항에 있어서, 상기 환원제는 디히드로퀴논(dihydroquinone)이고,상기 ROS 검출기 화합물은 2', 7'- 디클로로디히드로플루오레세인(H2DCF)인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법
  124. 제 96 항 내지 제 123 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FXN 단백질은 frataxin(FXN)인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  125. 제 96 항 내지 제 123 항 중 어느 한 항에 있어서, FXN 단백질이 전장 hFXN 및 세포 투과 펩티드(CPP)를 포함하는 FXN 융합 단백질인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  126. 제 125 항에 있어서, 상기 CPP 는 세포 투과 펩티드 CPP사이트 2.0 의 데이터베이스에 열거된 CPP의 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하는 것인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  127. 제 125 항에 있어서, 상기 CPP 는 HIV-TAT, 갈라닌, 마스토파란, 트랜스포탄, 페네트라틴, 폴리아르기닌, VP22, 및 그의 변이체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하는 것인, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  128. 제 127 항에 있어서, 상기 CPP 는 HIV-TAT 또는 이의 변이체 또는 유도체를 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  129. 제 128 항에 있어서, 상기 FXN 융합 단백질은 서열 식별 번호:12 를 포함하는, 프라탁신(FXN) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법.
  130. 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 FXN 단백질의 활성이 측정된 FXN 단백질을 포함하는, 조성물.
  131. 약제학적 조성물에 있어서,
    FXN 단백질 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하고, 상기 FXN 단백질의 활성이 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 방법에 따라 측정된 것인, 약제학적 조성물.
  132. FXN 단백질을 포함하는 약학 조성물의 제조방법에 있어서,
    제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 FXN 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
    상기 FXN 단백질을 제형화하는 단계를 포함하는, FXN 단백질을 포함하는 약학 조성물의 제조방법.
KR1020227021394A 2019-11-25 2020-11-25 프라탁신 활성의 정량화 방법 KR20220108094A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962940214P 2019-11-25 2019-11-25
US62/940,214 2019-11-25
PCT/US2020/062355 WO2021108659A1 (en) 2019-11-25 2020-11-25 Methods for quantifying frataxin activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220108094A true KR20220108094A (ko) 2022-08-02

Family

ID=73839131

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227021394A KR20220108094A (ko) 2019-11-25 2020-11-25 프라탁신 활성의 정량화 방법

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11988675B2 (ko)
EP (1) EP4065984A1 (ko)
KR (1) KR20220108094A (ko)
CN (1) CN114902050A (ko)
AU (1) AU2020391489A1 (ko)
CA (1) CA3162628A1 (ko)
IL (1) IL293359A (ko)
WO (1) WO2021108659A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4142768A1 (en) 2020-04-30 2023-03-08 Larimar Therapeutics, Inc. Methods for treating myelin associated diseases and mitochondria associated diseases
CN116867506A (zh) 2020-12-12 2023-10-10 拉利玛生物医药公司 包括弗里德赖希共济失调蛋白融合蛋白的药物组合物及其使用方法
US20230357851A1 (en) * 2022-04-06 2023-11-09 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for monitoring frataxin-replacement therapy

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2005116204A1 (ja) 2004-05-11 2008-06-19 株式会社アルファジェン Ｒｎａ干渉を生じさせるポリヌクレオチド、および、これを用いた遺伝子発現抑制方法
CA2604333A1 (en) 2005-04-15 2006-10-19 Cenix Bioscience Gmbh Human marker genes and agents for cardiovascular disorders and artherosclerosis
CA2649538C (en) 2006-04-21 2014-06-03 Yatin Gokarn Buffering agents for biopharmaceutical formulations
EP2536690B1 (en) 2010-02-19 2018-08-08 Arizona Board Of Regents Multifunctional radical quenchers and their use
PT2598525E (pt) 2010-07-28 2015-11-02 Testi Roberto Mutantes de frataxina
WO2012149478A2 (en) 2011-04-28 2012-11-01 Serket Pharma, Llc Agents useful for treating friedreich's ataxia and other neurodegenerative diseases
US9260495B2 (en) 2011-06-17 2016-02-16 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mitochondrial targeting and therapeutic use thereof
EP2753359B1 (en) 2011-09-06 2018-02-28 Translational Sciences Inc. Serpinf2-binding molecules and methods of use
WO2013071440A1 (en) 2011-11-18 2013-05-23 UNIVERSITé LAVAL Methods and products for increasing frataxin levels and uses thereof
US8912147B2 (en) 2013-04-15 2014-12-16 BioBlast Pharma Ltd. Mitochondrial proteins constructs and uses thereof
GB201414130D0 (en) 2014-08-08 2014-09-24 Agency Science Tech & Res Mutants of the bacteriophage lambda integrase
WO2016119856A1 (en) 2015-01-29 2016-08-04 Universite De Strasbourg Autophagy-inducing molecules for increasing insulin release
EP3286321A4 (en) 2015-04-24 2018-10-17 University of Florida Research Foundation, Inc. Aav vector for treatment of friedreich's ataxia
EP3429636A4 (en) 2016-03-17 2019-11-20 Vanderbilt University IMPROVEMENT OF PLASMINACTIVITY FOR PREVENTING SOFT TISSUE CALIBRATION
CN109476716A (zh) 2016-03-23 2019-03-15 加利福尼亚大学董事会 治疗线粒体障碍的方法
US10426775B2 (en) 2017-09-11 2019-10-01 Fratagene Therapeutics Srl Methods for treating Friedreich's ataxia with etravirine
WO2020223576A1 (en) 2019-04-30 2020-11-05 Chondrial Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for determining effectiveness of frataxin replacement therapy
CA3147742A1 (en) 2019-07-18 2021-01-21 Larimar Therapeutics, Inc. Use of frataxin for treating leigh syndrome, french canadian type
US11459363B2 (en) 2019-07-29 2022-10-04 The Trustees Of Indiana University Materials and methods for treating Friedreich's Ataxia
KR20220106953A (ko) 2019-07-29 2022-08-01 라리마 테라퓨틱스, 인코포레이티드 프라탁신 및 프라탁신 융합 단백질의 정량화 방법
US11891420B2 (en) 2020-03-26 2024-02-06 Larimar Therapeutics, Inc. Molecules for organelle-specific protein delivery
EP4142768A1 (en) 2020-04-30 2023-03-08 Larimar Therapeutics, Inc. Methods for treating myelin associated diseases and mitochondria associated diseases
CN116867506A (zh) 2020-12-12 2023-10-10 拉利玛生物医药公司 包括弗里德赖希共济失调蛋白融合蛋白的药物组合物及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021108659A1 (en) 2021-06-03
AU2020391489A1 (en) 2022-06-09
CN114902050A (zh) 2022-08-12
US11988675B2 (en) 2024-05-21
EP4065984A1 (en) 2022-10-05
US20210156874A1 (en) 2021-05-27
IL293359A (en) 2022-07-01
CA3162628A1 (en) 2021-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20220108094A (ko) 프라탁신 활성의 정량화 방법
Churbanova et al. Redox-dependent changes in molecular properties of mitochondrial apoptosis-inducing factor
Goodwin et al. The Azotobacter vinelandii NifEN complex contains two identical [4Fe-4S] clusters
Allan et al. A conserved START domain coenzyme Q-binding polypeptide is required for efficient Q biosynthesis, respiratory electron transport, and antioxidant function in Saccharomyces cerevisiae
Babot et al. ND3, ND1 and 39 kDa subunits are more exposed in the de-active form of bovine mitochondrial complex I
Brown et al. Determining Protein− Protein interactions by oxidative cross-linking of a glycine-glycine-histidine fusion protein
Wei et al. Synthesis and evaluation of ferrocenoyl pentapeptide (Fc-KLVFF) as an inhibitor of Alzheimer’s Aβ1–42 fibril formation in vitro
T'Sai et al. Purification and characterization of highly purified cytochrome b from complex III of baker's yeast
Jung et al. Dynamics of lactose permease of Escherichia coli determined by site-directed fluorescence labeling
Wang et al. Ratiometric fluorescent probe for vicinal dithiol-containing proteins in living cells designed via modulating the intramolecular charge transfer–twisted intramolecular charge transfer conversion process
Tognaccini et al. Structure–function relationships in human cytochrome c: The role of tyrosine 67
Ortmayer et al. Rewiring the “Push-Pull” catalytic machinery of a heme enzyme using an expanded genetic code
He et al. Effects of gold complexes on the assembly behavior of human islet amyloid polypeptide
Tomášková et al. Peroxidase activity of cytochrome c in its compact state depends on dynamics of the heme region
Pfister et al. The role of redox-active amino acids on compound I stability, substrate oxidation, and protein cross-linking in yeast cytochrome c peroxidase
Maklashina et al. Retention of heme in axial ligand mutants of succinate-ubiquinone oxidoreductase (complex II) from Escherichia coli
Gentry et al. Probing protein–protein and protein–substrate interactions in the dynamic membrane-associated ternary complex of cytochromes P450, b 5, and reductase
Ilagan et al. Regulation of FMN subdomain interactions and function in neuronal nitric oxide synthase
Chen et al. A high-performance genetically encoded fluorescent biosensor for imaging physiological peroxynitrite
Barreiro et al. Bacterial peroxidases–Multivalent enzymes that enable the use of hydrogen peroxide for microaerobic and anaerobic proliferation
Lanciano et al. High-stability semiquinone intermediate in nitrate reductase A (NarGHI) from Escherichia coli is located in a quinol oxidation site close to heme b D
Lu et al. Key roles of Arg5, Tyr10 and His residues in Aβ–heme peroxidase: relevance to Alzheimer’s disease
Wu et al. Catechol-modified green fluorescent protein as a specific biosensor for Al ions
Clark et al. Investigation of the role of the N-terminal proline, the distal heme ligand in the CO sensor CooA
US8748172B2 (en) Cell modeling of heme deficiency using ferrochelatase mutations