KR20220107378A

KR20220107378A - Led 광원을 이용한 세포분석장치

Info

Publication number: KR20220107378A
Application number: KR1020210009933A
Authority: KR
Inventors: 최세운; 박종선; 임명식; 김소영
Original assignee: 금오공과대학교 산학협력단
Priority date: 2021-01-25
Filing date: 2021-01-25
Publication date: 2022-08-02

Abstract

본 발명은 LED 광원을 이용한 세포분석장치에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 광원으로 고가인 레이저를 사용하지 않고 경제적인 LED 와 광다이오드를 이용하여 세포의 정량분석이 가능한 세포분석장치에 관한 것이다.
본 발명에 따른 LED 광원을 이용한 세포분석장치는 세포에 빛을 조사하는 LED 광원;과 분석대상 세포가 수용되며 X 방향에서 LED 광원이 조사되는 큐벳;과 상기 큐벳의 Y방향에 배치되며, 세포가 X 방향에서 조사된 LED 광원에 의해 가 만나 발생된 측면산란을 측정하는 광다이오드 모듈;과 측정된 측면산란을 전압펄스로 변환하여 세포의 수를 분석하는 분석부;를 포함한다.

Description

LED 광원을 이용한 세포분석장치{Apparatus for Detecting Cell Compring LED}

본 발명은 LED 광원을 이용한 세포분석장치에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 광원으로 고가인 레이저를 사용하지 않고 경제적인 LED 와 광다이오드를 이용하여 세포의 정량분석이 가능한 세포분석장치에 관한 것이다.

유세포 분석기 (flow cytometer)는 세포의 표본이 현탁되어 있는 유체에 레이저 (Laser)를 조사하여 세포의 형태에 따른 빛의 산란 및 통과된 빛을 검출하여 분석하거나 형광 처리된 세포로부터 발현되는 빛의 파장에 따른 형광 산란을 측정하여 분석하는 기기로 이를 통해 세포 수, 세포의 크기, 복잡도, 세포 주기 등을 측정할 수 있다.

유세포 분석기는 세포가 작은 관내에 흐르는 상태에서 광원인 레이저와 부딪히며 발생하는 빛의 산란과 형광물질의 발광, 두 가지의 물리적 현상을 이용하여 세포에 관한 여러 가지 정보를 측정 및 정밀분석이 가능하다.

최근 들어, 형광물질의 개발과 다양한 파장의 레이저를 사용함으로써 오늘날의 유세포 분석기는 14가지 이상의 많은 매개변수를 동시에 측정하여 광학적 특성 분석이 가능하게 되었다.

유세포 분석기는 도 1과 같이 유체 시스템, 광학 시스템, 전자 시스템 등으로 구성되어 있으며, 유체시스템은 세포의 광학적 특성을 정확하게 측정하기 위해서 분석될 세포가 하나씩 레이저 광선을 통과하도록 유도하며, 광학 시스템은 레이저 광선의 산란 및 형광물질의 발광에 대한 광학 정보를 광학 필터와 다이크로익 미러를 통해 각각의 파장에서 선택적으로 빛을 수집한다.

분석하는 물질에서 발현하는 아날로그 신호인 광신호는 전자 시스템을 통해 컴퓨터로 처리할 수 있는 디지털 신호로 변환되며, 상용화된 유세포 분석기에서 주로 광원으로 사용되는 레이저는 강한 강도의 일정한 파장을 갖는 단색광으로 잘 퍼지지 않고 집중도가 높다는 장점이 있다. 레이저를 광원으로 사용할 경우, 세포가 일정 투과 점을 통과할 때 빛이 산란 되는데, 빛 진행 방향의 전면에서 감지한 빛을 전방산란(forward scatter, FSC), 90°에서 감지한 빛을 측면산란 (side scatter, SSC)이라 하며, 형광물질의 발광을 감지한 빛을 형광산란 (fluorescent scatter, FL)이라 한다.

유세포 분석기는 특히 면역계나 암이나 질병에 대한 면역 반응 등을 연구하는 데 효과적이며 백혈병 진단, 세포의 조직 형태와 부피 측정, DNA 및 RNA의 측정, 단백질의 발현 측정, 세포사멸 및 세포의 생존력 측정 등 많은 실험에 이용될 수 있어 분자 생물학, 면역학, 병리학 등 많은 분야에서 다양한 목적으로 이용되고 있다.

예를 들어, cisplatin을 난소암 세포 (SKOV3)에 처리하여 특정 단백질의 발현 및 세포사멸에 관한 연구, 테논낭 섬유아세포 (HTCFs)에 대해 황화수소 (HS)가 세포 분화 억제에 미치는 영향 및 세포사멸 유발에 관한 연구, 구강편평세포암종 (SCC)의 주기 분석을 통한 Heat shock proteins 90 (HSP90) 억제제로서의 Geldanamycin과 17-AAG가 세포증식 억제에 관한 연구와 두릅 추출물을 이용한 유방암세포 (MDA-MB-231)의 사멸 효과에 관한 연구 등의 최근 많은 연구에서 유세포 분석기가 활용된 바 있다.

그러나 분석할 세포 각각에 대한 정밀분석이 아닌 표본 전체에 대한 빛의 산란 정도나 형광을 측정하여 세포의 광학적 특성을 단순 비교하거나 세포 수 측정과 같이 단순 분석만이 필요한 경우, 유세포 분석기는 고가이며 유지관리 측면에서 비합리적이다.

국내공개특허 제10-2015-0041891호 국내공개특허 제10-2019-0006164호

상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 광원으로 고가인 레이저를 사용하지 않고 경제적인 LED 와 광다이오드를 이용하여 세포의 정량분석이 가능한 세포분석장치를 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 제 1실시예에 따른 LED 광원을 이용한 세포분석장치는 세포에 빛을 조사하는 LED 광원;과 분석대상 세포가 수용되며 X 방향에서 LED 광원이 조사되는 큐벳;과 상기 큐벳의 Y방향에 배치되며, 세포가 X 방향에서 조사된 LED 광원에 의해 가 만나 발생된 측면산란을 측정하는 광다이오드 모듈;과 측정된 측면산란을 전압펄스로 변환하여 세포의 수를 분석하는 분석부;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 제 2실시예에 따른 LED 광원을 이용한 세포분석장치는 세포에 염색된 형광염료를 야기시키기 위한 파장영역대의 빛을 조사하는 LED 광원;과 형광염료로 염색된 분석대상 세포가 수용되며 X 방향에서 LED 광원이 조사되는 큐벳;과 상기 큐벳의 Y방향에 배치되며, 세포에 염색된 형광염료가 X 방향에서 조사된 LED 광원에 의해 여기되어 발생된 측면산란을 측정하는 광다이오드 모듈;과 측정된 측면산란을 전압펄스로 변환하여 세포의 수를 분석하는 분석부;를 포함한다.

제 1실시예와 제 2실시예에 따른 LED 광원을 이용한 세포분석장치는 상기 LED 광원과 큐벳 사이 또는 상기 큐벳과 광다이오 모듈 사이 또는 이들 모두에 특정 파장대의 빛을 구분하여 보내주기 위한 광학필터를 더 포함할 수 있다.

제 1실시예와 제 2실시예에 따른 LED 광원을 이용한 세포분석장치는 LED 광원 및 모듈의 과열을 방지하기 위한 쿨링팬을 더 구비할 수 있으며, 상기 쿨링팬은 LED 광원 및 모듈의 소자의 발열로 인한 출력 감소 현상을 예방할 수 있다.

제 1실시예와 제 2실시예에 따른 LED 광원을 이용한 세포분석장치의 큐벳 내부에 교반기를 더 포함하여 세포가 현탁액 내에서 균일하게 혼합되도록 하는 것도 가능하다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 LED 광원을 이용한 세포분석장치에 의하면, 광원으로 고가인 레이저를 사용하지 않고 경제적인 LED 와 광다이오드를 이용하여 세포의 정량분석이 가능한 효과가 있다.

도 1은 종래 레이저를 이용한 유세포 분석기의 구성.
도 2(A)는 정전압 및 정전류 회로, (B)는 광다이오드 동작 회로.
도 3은 광학 특성 모니터링 시스템.
도 4는 광학 모니터링 시스템의 모식도.
도 5는 메인 모듈의 3D 디자인.
도 6은 Rhodamine 6G로 형광 처리된 자궁경부암 세포.
도 7은 필터 최적화를 위한 필터의 광학적 특성.
도 8은 Rhodamine으로 형광 처리된 자궁경부암 세포의 세포 수 에 대한 측면산란.

본 발명의 구체적 특징 및 이점들은 이하에서 첨부도면을 참조하여 상세히 설명한다. 이에 앞서 본 발명에 관련된 기능 및 그 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 구체적인 설명을 생략하기로 한다.

1. 실험방법

1.1 회로설계

광원은 유세포 분석기와 달리 레이저가 아닌 LED와 광다이오드를 사용하므로, 이에 대한 새로운 회로 시스템을 설계하였다. 실험에 사용되는 형광물질을 야기 시키기 위하여 470nm (Blue)의 출력 파장을 갖는 LED(Photron, 3W, USA)가 사용되었고, 광원의 출력과 소비전력을 안정적으로 얻기 위해 도 2(A)와 같이 MATLAB(MathWorks, USA)의 Simulink 기능을 통해 사용가능한 Simscape를 활용하여, 정전압 회로와 정전류 회로를 구성하였다. 정전압 회로에서는 교환 방식 전원 공급 장치(SMPS, 12, 1A)로부터 전원을 공급받아 정전압 집적회로 소자(LM7809CT, On Semiconductor, USA)를 통해 9V의 안정된 전압을 정전류 회로에 공급한다. 출력의 안정성 및 기대 수명의 연장을 고려하여 670mA의 전류가 LED에 인가되도록 설계하였으며, 470nm LED의 경우 2.1W의 전력을 소비하고, 620mm의 LED의 경우 1.5W의 전력을 소비하도록 설계하였다. 또한, 각 소자의 발열로 인한 출력 감소 현상을 쿨링팬(12V, 0.2A)을 활용하여 제어하였으며, 그 결과, 670mA

1mA의 안정적인 전류가 LED에 흐르는 것을 확인하였다.

도 2(B)는 광다이오드 동작 회로를 보여주는 것으로, 광다이오드(FDS1010, 350-1100nm, Thorlabs, USA)로부터 광신호를 획득하기 위해 LED 회로와 마찬가지로 Simscape를 활용하여 설계 도면을 작성하였다. 9V의 전원을 SMPS로부터 공급받아 정전압 집적회로 소자를 통해 9V의 전압을 5V의 안정된 전압으로 변환하고, RC 회로를 통해 잡음을 제거하여 광다이오드에 역방향 바비어스를 인가하도록 하였다. 광다이오드는 역방향 바이어스가 인가되고 입사된 광이 없을 때는 일반적인 다이오드와 동일한 특성을 가지지만, 광이 입사할 때는 역방향 전류가 입사 광량과 비례하는 특성을 가진다. 따라서 관다이오드와 10k

의 부하 저항(

)을 직렬로 연결하고 부하 저항의 양단에 인가되는 전압을 도 3과 같이 디지털 멀티미터를 활용하여 광신호를 측정할 수 있도록 설계하였다.

1.2 광학 모니터링 모듈제작

광학 모니터링 시스템은 도 3과 도 4와 같이 광원이 LED를 제어하는 정전류 모듈과 LED, 광학 필터, 유리 큐벳, 광다이도를 고정하기 위한 메인 모듈이 있고 측면산란을 측정하는 광다이오드와 디지털 멀티미터로부터 광신호를 획득하기 위한 광다이오드 모듈로 구성되어있다. LED에서 출력되는 빛은 1차 필터(Excitation filter)를 통해 유리 큐벳에 담긴 자궁경부암 세포를 조사하며, 이로 인한 90도로 산란 된 빛은 2차 필터(Emission filter)를 통해 광다이오드에 입사하는데, 이를 모니터링하기 위한 시스템이다.

메인 모듈의 구조물은 3D 설계 소프트웨어인 SolidWorks(Dassault Systems, USA)를 사용하여 설계하였으며, 3D 프린터(3DP-310F, Cubicon Inc, Korea)를 사용하여 출력하였다. 도 5와 같이 광학 필터를 부착하기 위한 Filter holder, 유리 큐벳과 Filter holder를 Cuvette&Filter Slot, LED& Photodiode holder를 고정하기 위한 LED&Photodiode slot으로 구성된 간단한 구조이다. LED를 부착하여 고정하기 위한 LED holder는 내열성이 좋은 ABS 필라멘트를 사용하여 출력하였고, 나머지 부품들은 친환경 수지인 PLA+ 필라멘트를 사용하여 출력하였다.

1.3 in vitro 실험

실험에 사용한 자궁경부암 세포(한국 세포주 은행, 대한민국)는 37℃의 온도에서 5%의 이산화탄소를 포함한 환경의 배양기에서 고농도의 글루코스가 포함된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM), 10%의 Fetal Bovine Serum(FBS, pH 7.4)와 1%의 Penicillin Streptomycin으로 구성된 배지 용액으로 3-4일 증식시켰다. Phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)을 사용하여 세척 작업을 하고, trypsin EDTA를 사용하여 세포 배양 플라스크로부터 자궁경부암 세포를 분리시켰다. 도 6과 같이 분리된 세포들은 형광 염료 Rhodamine 6G로 처리하여 측면산란을 세포수별로 총6회씩 60개의 데이터를 측정하였다.

1.4 광학 모니터링 실험

자궁경부암 세포의 광신호를 측정할 때, 유리 큐벳 내에자석 교반기를 넣어 세포가 현탁액 내에서 잘 혼합되도록 하여 시스템적 오류(Systematic error)가 발생하지 않도록 하였다.

형광 염료 Rhodamine 6G의 경우 Excitation/Emission 파장이 560nm/580nm 이므로 Rhodamine 6G로 형광 처리한 세포는 470nm(Blue)의 출력 파장을 갖는 LED를 사용하여 측정하였다. 도 7에서, Blue LED를 사용하여 측정하는 경우 1차 필터 #96 Lime를 사용하였고 2차 필터 #07 Pale Yellow를 사용하였다. 또한, 유세포 분석기와 달리 다이크로익 미러를 사용하지 않으므로 형광 산란만을 측정할 수 없다. 따라서 형광 처리를 한 세포로부터의 측면산란과 형광 처리를 하지 않은 세포로부터의 측면산란 측정값의 차이를 통해 형광 산란을 구하였다.

Rhodamine 6G로 형광 처리유무에 따른 자궁경부암 세포의 경우 도 8과 같이 나타내었다. 선형 회귀분석을 통해 회귀방정식을 추정하고 y 절편을 0으로 하여 직선과 점선으로 나타내었으며, 각 세포 수의 측정 데이터의 평균값을 추정한 y 절편만큼 감소시켜 그래프화 시켰다. Blue LED를 광원으로 선택한후, Rhodamine 6G로 형광 처리하고 측정하였을 때 1차 필터 #96 Lime, 2차 필터 #07 Pale Yellow를 사용한 경우가 기울기 (slope)가 0.0341로 하기의 표 1을 통해 확인할 수 있었다.

형광처리 유무	Slope	R²
형광 처리 O	0.0341	0.9937
형광 처리 X	0.02	0.9816

결정계수(R²)는 0.9937로 측면산란 측정값은 세포 수를 99.37% 설명한다고 할 수 있다. 또한, 같은 조건에서의 형광처리를 하지않은 대조군의 경우 기울기가 0.02 결정계수가 0.9816인 것으로 보아 형광처리를 하지 않았을 때보다 필터에 대한 투과율이 낮음을 알 수 있다.

따라서, 일정 수의 자궁경부암 세포를 본 광학 모니터링 시스템에 주입하였을 때, 출력 전압에 따라 세포의 농도가 측정/예측이 가능하다고 할 수 있다. 또한, 1차 2차 광학 필터를 사용하여 형광물질로 염색된 자궁경부암 세포의 농도에 따른 출력 전압값을 통해 세포의 농도 판별이 가능함을 확인할 수 있었다.

이상과 같이 본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 바람직한 실시예를 중심으로 설명하였지만 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 특허청구범위에 기재된 기술적 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 또는 변형하여 실시할 수 있다. 따라서 본 발명의 범주는 이러한 많은 변형의 예들을 포함하도록 기술된 청구범위에 의해서 해석되어야 한다.

Claims

세포에 빛을 조사하는 LED 광원;과
분석대상 세포가 수용되며 X 방향에서 LED 광원이 조사되는 큐벳;과
상기 큐벳의 Y방향에 배치되며, 세포가 X 방향에서 조사된 LED 광원에 의해 가 만나 발생된 측면산란을 측정하는 광다이오드 모듈;과
측정된 측면산란을 전압펄스로 변환하여 세포의 수를 분석하는 분석부;를 포함하는 것을 특징으로 하는
LED 광원을 이용한 세포분석장치.
세포에 염색된 형광염료를 야기시키기 위한 파장영역대의 빛을 조사하는 LED 광원;과
형광염료로 염색된 분석대상 세포가 수용되며 X 방향에서 LED 광원이 조사되는 큐벳;과
상기 큐벳의 Y방향에 배치되며, 세포에 염색된 형광염료가 X 방향에서 조사된 LED 광원에 의해 여기되어 발생된 측면산란을 측정하는 광다이오드 모듈;과
측정된 측면산란을 전압펄스로 변환하여 세포의 수를 분석하는 분석부;를 포함하는 것을 특징으로 하는
LED 광원을 이용한 세포분석장치.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 LED 광원과 큐벳 사이 또는 상기 큐벳과 광다이오 모듈 사이 또는 이들 모두에 특정 파장대의 빛을 구분하여 보내주기 위한 광학필터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는
LED 광원을 이용한 세포분석장치.