KR20220104880A - Novel chlorin derivative CHLO-Cl and a method of inhibiting pathogen growth using it - Google Patents

Novel chlorin derivative CHLO-Cl and a method of inhibiting pathogen growth using it Download PDF

Info

Publication number
KR20220104880A
KR20220104880A KR1020210007212A KR20210007212A KR20220104880A KR 20220104880 A KR20220104880 A KR 20220104880A KR 1020210007212 A KR1020210007212 A KR 1020210007212A KR 20210007212 A KR20210007212 A KR 20210007212A KR 20220104880 A KR20220104880 A KR 20220104880A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
chlo
mycobacterium tuberculosis
photosensitizer
cells
tuberculosis
Prior art date
Application number
KR1020210007212A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR102498774B1 (en
Inventor
정유진
이창희
이효지
홍성진
백승환
Original Assignee
강원대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 강원대학교산학협력단 filed Critical 강원대학교산학협력단
Priority to KR1020210007212A priority Critical patent/KR102498774B1/en
Publication of KR20220104880A publication Critical patent/KR20220104880A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR102498774B1 publication Critical patent/KR102498774B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/22—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0076—PDT with expanded (metallo)porphyrins, i.e. having more than 20 ring atoms, e.g. texaphyrins, sapphyrins, hexaphyrins, pentaphyrins, porphocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/02—Local antiseptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

The present invention relates to a method for controlling pathogens including Mycobacterium tuberculosis, wherein the repeated administration and photoactivation of a novel photosensitizer CHLO-Cl controls the growth of existing Mycobacterium tuberculosis and antibiotic-resistant Mycobacterium tuberculosis, and increases the production of reactive oxygen species while protecting host cells from macrophage cells infected with Mycobacterium tuberculosis, thereby being expected to be used as a treatment method for effectively controlling pathogens such as Mycobacterium tuberculosis.

Description

신규 클로린 유도체 CHLO-Cl 및 이를 이용한 병원균 억제방법 {Novel chlorin derivative CHLO-Cl and a method of inhibiting pathogen growth using it}Novel chlorin derivative CHLO-Cl and a method of inhibiting pathogen growth using it

본 발명은 새로운 클로린 유도체 CHLO-Cl 및 이를 이용한 병원균 활성 억제방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel chlorine derivative CHLO-Cl and a method for inhibiting pathogen activity using the same.

결핵은 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis; Mtb)에 의해서 발생하는 질병으로서, 아직까지 퇴치되지 않고 있는 세계적인 보건문제이다. WHO의 발표에 의하면, 전 세계 인구의 1/3이 결핵균에 감염되어 있으며 매년 8백만 명의 새로운 환자가 발생하고, 사망자 수 역시 매년 3백만 명에 이르고 있다 [1]. 우리나라에서도 전 인구의 약 1/3 이상이 결핵균에 감염되어 있는 것으로 추정되며, 2019년 기준, 국내 전체 결핵환자는 30,304명 (10만 명당 59.0명)이라고 보고되었다. 전 세계 결핵 환자의 95%는 개발도상국에서 발생하고 있으나, 여행객의 증가, AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) 환자들의 교차감염 등 세계화의 영향으로 최근 결핵의 전세계 확산이 문제가 되고 있다.Tuberculosis is a disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), and is a global health problem that has not yet been eradicated. According to the World Health Organization (WHO), one-third of the world's population is infected with Mycobacterium tuberculosis, resulting in 8 million new cases and 3 million deaths each year [1]. It is estimated that more than 1/3 of the total population in Korea is also infected with Mycobacterium tuberculosis, and as of 2019, the total number of tuberculosis patients in Korea was reported to be 30,304 (59.0 per 100,000 people). Although 95% of the world's tuberculosis cases occur in developing countries, the global spread of tuberculosis has recently become a problem due to the influence of globalization, such as an increase in travelers and cross-infection of AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) patients.

최근에는 1차 항결핵제 혹은 그 하위의 항결핵제에 내성이 있는 MDR-TB (Multi drug resistance tuberculosis)과 XDR-TB (Extreme-drug resistance-tubersulosis)의 발병이 증가하고 있고, 우리나라는 2018년 전체 신환자 2만 6433명 중 618명이 MDR-TB에 속하고, 치료성공률이 2019년 66.6%로 선진국의 70~80%에 비해 여전히 낮아 질병부담을 낮추기 위한 노력이 시급하다. 따라서 항결핵제를 복용하는 화학치료 이외에 다른 치료 기술의 발견이 시급하다 [1].Recently, the incidence of MDR-TB (Multi drug resistance tuberculosis) and XDR-TB (Extreme-drug resistance-tubersulosis), which are resistant to first-line anti-tuberculosis drugs or lower-level anti-tuberculosis drugs, is increasing. 618 out of 6,433 people belong to MDR-TB, and the treatment success rate was 66.6% in 2019, which is still lower than 70-80% in developed countries, so efforts to lower the burden of disease are urgently needed. Therefore, there is an urgent need to discover other treatment techniques other than chemotherapy using anti-tuberculosis drugs [1].

결핵균은 그람양성 세균이며 항산성 세균이다. 결핵균으로 인한 감염은 감염된 숙주에게서 기침이나 재채기를 통해 분출된 비말핵의 흡입에 의해 일어난다 [3]. 흡입된 결핵균은 폐에 거주하고 있는 폐포 큰포식세포(Alveolar macrophage)에 의해 탐식되고 그 속에서 증식하기 시작한다. 따라서 결핵균의 병원성은 다른 병원균들처럼 내외독소를 생산함으로써 나타나는 것이 아니라 균이 숙주의 내재면역수용체로 인한 인지를 낮추거나 내재면역을 일으키는 신호의 활성화를 낮추는 등 숙주의 방어 기작을 회피함으로써 숙주 내에서 증식하여 나타나는 숙주의 면역반응 강도에 의해 결정된다 [4].Mycobacterium tuberculosis is a gram-positive bacterium and an acid-fast bacterium. Infection with Mycobacterium tuberculosis occurs by inhalation of droplet nuclei exhaled from an infected host through coughing or sneezing [3]. Inhaled Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by alveolar macrophages residing in the lungs and begins to multiply therein. Therefore, the pathogenicity of Mycobacterium tuberculosis does not appear by producing internal and external toxins like other pathogens, but by evading the host's defense mechanisms, such as lowering the recognition of the host's innate immune receptors or the activation of signals that cause intrinsic immunity. It is determined by the strength of the host's immune response through proliferation [4].

숙주의 면역세포는 패턴인식 수용체 (pattern-recognition receptor, PRRs)라고 불리는 세포막 결합 및 세포질에 존재하는 수용체를 이용하여 침입하는 병원체를 인식할 수 있다. PRRs은 병원균의 특이한 분자패턴 (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)을 인식하여 하위신호인 MAPKs, NF-κB를 활성화하고, 그 결과 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 분비를 유도한다 [5-7].Host immune cells can recognize invading pathogens using cell membrane-bound and cytoplasmic receptors called pattern-recognition receptors (PRRs). PRRs recognize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and activate sub-signals MAPKs and NF-κB, resulting in the secretion of pro-inflammatory cytokines and chemokines [5-7].

결핵균을 인지하는 주요 패턴인식 수용체는 톨-유사 수용체 (toll-like receptors, TLRs)이며, 이 중에서도 TLR2가 주된 역할을 하고 있다. TLR은 병원체의 세포벽 성분, 핵산 성분 등을 인지하는 패턴인식 수용체이다. TLR2는 결핵균의 lipoteichoic acid, lipopeptide를 인식할 수 있고 결핵균 감염에 대항하는 면역반응을 개시한다 [8].The major pattern recognition receptors that recognize Mycobacterium tuberculosis are toll-like receptors (TLRs), among which TLR2 plays a major role. TLR is a pattern recognition receptor that recognizes a cell wall component of a pathogen, a nucleic acid component, and the like. TLR2 can recognize Mycobacterium tuberculosis lipoteichoic acid and lipopeptide and initiate an immune response against Mycobacterium tuberculosis infection [8].

TLRs과 같은 패턴인식 수용체는 병원체의 특이적인 분자 패턴을 인식하는데, 이를 PAMPs이라 한다. 패턴인식 수용체가 각각의 PAMPs를 인지하면 세포 내로 신호를 전달하게 된다. 특히, TLR은 하위에 MyD88이라는 어댑터 단백질을 가지고 있으며, MyD88은 신호전달 복합체를 통해서 세포 내 신호를 전달하고, 최종적으로 핵 내의 전사인자인 NF-κB나 MAPKs 들을 활성화하며, TNF-α, IL-6, I형 인터페론과 같은 다양한 염증성 사이토카인을 발현하게 된다 [9]. 이로 인해 내재 면역 반응을 유도할 수 있으며 다양한 사이토카인과 케모카인을 분비하여 병원체에 대항하는 힘을 얻게 된다. Pattern recognition receptors such as TLRs recognize specific molecular patterns of pathogens, which are called PAMPs. When the pattern recognition receptor recognizes each PAMPs, it transmits a signal into the cell. In particular, TLR has an adapter protein called MyD88 underneath, MyD88 transmits intracellular signals through a signaling complex, and finally activates NF-κB and MAPKs, which are transcription factors in the nucleus, and TNF-α, IL- 6, various inflammatory cytokines such as type I interferon are expressed [9]. This can induce an intrinsic immune response and secrete various cytokines and chemokines to gain strength against pathogens.

전사 인자인 NF-κB (nuclear factor-κB )는 염증 조절 인자로서 종양괴사인자-α (tumor necrosis factor-α; TNF-α), IL-6 (interleukin-6), IL-1β 등 전염증성 사이토카인 및 iNOS (inducible nitric oxide synthase)의 전사를 유도한다 [10]. 또한, NF-kB의 활성화는 IL-12 생산 및 Th-1 면역반응을 유도하는데 필수적인 IFN-γ 생산에 필요하며, 이는 인간과 마우스의 결핵균을 제어하는데 매우 중요한 분자이라는 것이 밝혀졌다 [11]. Transcription factor NF-κB (nuclear factor-κB) is an inflammation regulator and pro-inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor-α (TNF-α), IL-6 (interleukin-6), and IL-1β It induces the transcription of kine and inducible nitric oxide synthase (iNOS) [10]. In addition, activation of NF-kB is required for IL-12 production and IFN-γ production, which is essential for inducing Th-1 immune responses, and it has been shown that it is a very important molecule in controlling Mycobacterium tuberculosis in humans and mice [11].

광역학 치료는 광민감제 (Photosensitizer)로 알려진 물질들이 빛에 의해 화학적 반응을 일으킴으로써 감염된 세포를 파괴하거나 또는 직접 세균을 선택적으로 파괴하는 차세대 치료법으로 알려져 있다 [12].Photodynamic therapy is known as a next-generation therapy in which substances known as photosensitizers cause a chemical reaction with light to destroy infected cells or selectively destroy bacteria [12].

광민감제가 특정 파장의 빛에 의해 활성화되면 들뜬 상태가 되는데 이때 발생하는 전자가 주변에 있는 산소 분자와 반응하여 활성산소종을 생성한다. 광민감제의 광활성화에 의한 활성산소종은 두 가지 경로에 의해 발생한다. 첫 번째는 자유라디칼 또는 라디칼 이온이 생성되는 I형 반응이다. 이 반응을 통해 하이드록시 라디칼 또는 수퍼옥사이드 음이온 등 활성산소종이 생성되는데 이 분자들은 숙주 내에 있는 균을 공격해 사멸하는데 기여한다. 두 번째는 singlet oxygen이 생성되는 II형 반응이다. 산소분자가 광민감제로부터 전해진 전자를 받아들여 singlet oxygen을 생성하면 가지고 있는 전자로 균을 사멸시킨다. 특히 이 반응은 I형 반응보다 느리게 진행된다고 알려져 있다. 또한, heme 등 광민감제들은 LDL 수용체의 리간드에 결합하여 세포 내로 유입되어 세포질에서도 일어날 수 있다 [13]. 광민감제의 특성으로는 어떤 파장의 빛 에너지를 흡수하는 기능을 가지고 있고, 흡수한 빛 에너지를 다른 분자에 전이시켜 주는 능력이 있어 광화학 반응을 잘 유도한다는 점이다. When a photosensitizer is activated by light of a specific wavelength, it enters an excited state, and the generated electrons react with surrounding oxygen molecules to generate reactive oxygen species. Reactive oxygen species by photoactivation of photosensitizers are generated by two pathways. The first is a type I reaction in which free radicals or radical ions are produced. Through this reaction, reactive oxygen species such as hydroxy radicals or superoxide anions are generated, and these molecules contribute to the death by attacking the bacteria in the host. The second is a type II reaction in which singlet oxygen is produced. When oxygen molecules accept electrons transferred from photosensitizers and generate singlet oxygen, the electrons they possess kill bacteria. In particular, it is known that this reaction proceeds more slowly than the type I reaction. In addition, photosensitizers such as heme bind to ligands of LDL receptors and flow into cells, and can occur in the cytoplasm [13]. The characteristics of a photosensitizer are that it has the ability to absorb light energy of a certain wavelength and has the ability to transfer the absorbed light energy to other molecules, so that it induces a photochemical reaction well.

광민감제는 개발된 시기에 따라 1, 2, 3, 세대로 분류되어있고 3세대 광민감제는 포르피린 (porphyrin), 클로린 (chlorine) 계열의 물질들이 포함되어 있다. 광민감제로는 체내 잔류기간이 짧아 광독성이 낮은 것, 정상세포에 비해 종양세포에 많이 축적될 것, 광민감제를 활성화할 수 있는 파장이 조직에 깊게 침투할 수 있는 것, 양자 수율이 높은 것이 광민감제로서 좋은 조건을 가지고 있다고 제안되고 있다.Photosensitizers are classified into 1st, 2nd, 3rd generation according to the time of development, and 3rd generation photosensitizers include porphyrin and chlorine-based substances. Photosensitizers include low phototoxicity due to short residence time in the body, accumulation in tumor cells compared to normal cells, wavelengths capable of activating photosensitizers that can penetrate deeply into tissues, and high quantum yield. It is suggested that it has good conditions as a deterrent.

한국등록특허 10-1265525 '광역학적 치료를 통한 결핵균 활성 억제 방법'(2013.05.21. 공고)Korean Patent Registration 10-1265525 'Method of inhibiting Mycobacterium tuberculosis activity through photodynamic therapy' (2013.05.21. Announcement) 한국등록특허 10-0484206 '포르피린 화합물' (2005.04.20. 공고)Korean Patent Registration 10-0484206 'Porphyrin Compound' (2005.04.20. Announcement)

<World Health Organization. 2018. Global Tuberculosis Report 2018. WHO><World Health Organization. 2018. Global Tuberculosis Report 2018. WHO> <KCDC Korean Guidelines for Tuberculosis 2019><KCDC Korean Guidelines for Tuberculosis 2019> Gordon, S.V. & Parish, T. Microbiology 164, 437-439 (2018)Gordon, S. V. & Parish, T. Microbiology 164, 437-439 (2018) Arbues, A. et al., Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 4 (2014)Arbues, A. et al., Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 4 (2014) da Silva, F.D.C. et al. Int J Tuberc Lung D 23, 212-+ (2019)da Silva, F.D.C. et al. Int J Tuberc Lung D 23, 212-+ (2019) Eisenhut, M. Jmir Res Protoc 8 (2019)Eisenhut, M. Jmir Res Protoc 8 (2019) Gopalakrishnan, A. et al., Infect Immun 87 (2019)Gopalakrishnan, A. et al., Infect Immun 87 (2019) Sepehri, Z. et al., Lab Med 50, 117-129 (2019)Sepehri, Z. et al., Lab Med 50, 117-129 (2019) Yun, H.Y. et al., Crit Rev Neurobiol 10, 291-316 (1996)Yun, H.Y. et al., Crit Rev Neurobiol 10, 291-316 (1996) Fallahi-Sichani, M. et al., Front Physiol 3, 170 (2012)Fallahi-Sichani, M. et al., Front Physiol 3, 170 (2012) Bai, X. et al. PLoS One 8, e61925 (2013)Bai, X. et al. PLoS One 8, e61925 (2013) Liu, Y. et al., J Clin Transl Res 1, 140-167 (2015)Liu, Y. et al., J Clin Transl Res 1, 140-167 (2015) Peng, Q. et al., Ultrastruct Pathol 20, 109-129 (1996)Peng, Q. et al., Ultrastruct Pathol 20, 109-129 (1996) Lim, D.S. et al., Photochem Photobiol 82, 600-605 (2006)Lim, D.S. et al., Photochem Photobiol 82, 600-605 (2006) Park, J.H. et al. Int J Pharm 491, 393-401 (2015)Park, J. H. et al. Int J Pharm 491, 393-401 (2015) Sung, N. et al. Photodiagnosis Photodyn Ther 10, 694-702 (2013)Sung, N. et al. Photodiagnosis Photodyn Ther 10, 694-702 (2013) Domingo-Gonzalez, R. et al., Microbiol Spectr 4 (2016)Domingo-Gonzalez, R. et al., Microbiol Spectr 4 (2016) Yu, Y. et al. PLoS One 7, e44944 (2012)Yu, Y. et al. PLoS One 7, e44944 (2012) Fox, G.J. et al. Clin Microbiol Infect 23, 147-153 (2017)Fox, G. J. et al. Clin Microbiol Infect 23, 147-153 (2017) Kim, Y.R. & Yang, C.S. J Microbiol Biotechn 27, 1549-1558 (2017)Kim, Y. R. & Yang, C.S. J Microbiol Biotechn 27, 1549-1558 (2017) Schastak, S. et al., Plos One 5 (2010)Schastak, S. et al., Plos One 5 (2010) Xuan, W. et al. Sci Rep 8, 17130 (2018)Xuan, W. et al. Sci Rep 8, 17130 (2018) Fang, Y. et al., Sci Rep 6, 28357 (2016)Fang, Y. et al., Sci Rep 6, 28357 (2016) Dai, T. et al. Antimicrob Agents Chemother 53, 3929-3934 (2009)Dai, T. et al. Antimicrob Agents Chemother 53, 3929-3934 (2009) Kashef, N. et al., Photodiagnosis Photodyn Ther 9, 11-15 (2012)Kashef, N. et al., Photodiagnosis Photodyn Ther 9, 11-15 (2012) Redford, P.S. et al., Mucosal Immunol 4, 261-270 (2011)Redford, P.S. et al., Mucosal Immunol 4, 261-270 (2011) Abdalla, A.E. et al., Int J Biol Sci 12, 710-717 (2016)Abdalla, A.E. et al., Int J Biol Sci 12, 710-717 (2016) Mukhopadhyay, S. et al. J Exp Med 217 (2020)Mukhopadhyay, S. et al. J Exp Med 217 (2020) Wang, Z.Q. et al., Immunology 102, 331-337 (2001)Wang, Z. Q. et al., Immunology 102, 331-337 (2001)

본 발명의 목적은 친수성이 개선된 광민감제를 제공하려는 것이다.It is an object of the present invention to provide a photosensitizer with improved hydrophilicity.

또한, 본 발명의 목적은 친수성이 개선된 광민감제 및 이의 광 활성화를 통하여 세포 내 병원균의 효과적인 사멸 또는 제어방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a photosensitizer with improved hydrophilicity and an effective method for killing or controlling intracellular pathogens through photoactivation thereof.

또한, 본 발명의 목적은 세포 독성이 저감된 광민감제 및 이의 광 활성화를 통한 세포 내 병원균의 효과적인 사멸 또는 제어방법을 제공하는 것이다.In addition, it is an object of the present invention to provide a photosensitizer with reduced cytotoxicity and an effective method for killing or controlling intracellular pathogens through photoactivation thereof.

CHLO-Cl은 DH-I-180-3으로부터 합성된 포르피린 계열의 광민감제로서, DH-I-180-3에 염소 원자 1개를 치환하여 합성한 신규 화합물이다. CHLO-Cl is a porphyrin-based photosensitizer synthesized from DH-I-180-3, and is a novel compound synthesized by substituting one chlorine atom for DH-I-180-3.

Figure pat00001
Figure pat00001

CHLO-Cl의 전구물질인 DH-I-180-3은 1세대 광민감제인 포토프린(photofrin)에 비해서 더 긴 파장(666 nm)의 빛을 흡수하며, 체내 체류시간이 더 짧고, 같은 농도로 처리하였을 때 더 높은 효능을 나타낸다. 그러나 DH-I-180-3은 물에 대한 용해성이 낮으며, 선택성이 부족하다는 단점이 있다. 친수성이 큰 광민감제는 정맥을 통해서 목표한 조직이나 세포에 도달할 수 있지만, 그렇지 않은 경우 전달을 위한 별도의 매개체가 필요하기 때문에 광민감제의 친수성을 높일 필요가 있다 [17]. 또한, 이전 연구에 따르면 DH-I-180-3은 세포 내로의 흡수는 1시간 정도면 충분하며, 정상 세포보다 암세포에 더 많이 축적되어 활성산소종의 생성을 유도함으로써 암세포의 세포사멸을 향상시킨다고 보고된 바 있다 [15]. 또한, in vitro 조건에서 전구물질인 DH-I-180-3을 처리한 실험군에서 광 활성화 시 MDR-TB (multidrug-resistant tuberculosis)및, XDR-TB (extensively drug-resistant tuberculosis)를 효과적으로 사멸시킨다는 보고가 있었다 [16].DH-I-180-3, a precursor of CHLO-Cl, absorbs light with a longer wavelength (666 nm) than photofrin, the first-generation photosensitizer, has a shorter residence time in the body, and has the same concentration. higher efficacy when treated. However, DH-I-180-3 has disadvantages in that it has low solubility in water and lack of selectivity. Photosensitizers with high hydrophilicity can reach target tissues or cells through veins, but if not, a separate medium for delivery is required, so it is necessary to increase the hydrophilicity of the photosensitizers [17]. In addition, according to previous studies, absorption into cells of DH-I-180-3 is sufficient in about 1 hour, and it accumulates more in cancer cells than normal cells and induces the generation of reactive oxygen species, thereby enhancing apoptosis of cancer cells. It has been reported [15]. In addition, it is reported that light activation effectively kills MDR-TB (multidrug-resistant tuberculosis) and XDR-TB (extensively drug-resistant tuberculosis) in the experimental group treated with the precursor DH-I-180-3 in vitro. There was [16].

결핵의 원인균인 M. tuberculosis는 숙주에 감염된 후 큰포식세포에 침입, 증식하여 생존하는 것으로 알려져 있다. 큰포식세포가 결핵균을 인지하게 되면 MAPK, NF-κB등 신호를 활성화하여 TNF-α, IL-1, IL-6 등 전염증성 사이토카인의 발현을 증가시키거나 활성산소종, 산화질소 등 결핵균을 직접적으로 죽일 수 있는 분자들의 생성을 촉진하는 등 여러 가지 방어기전으로 결핵균의 증식을 억제한다 [17,18]. 하지만, 결핵균은 숙주의 방어 기작을 회피하거나 억제함으로써 병을 진행시킨다. 더욱이 최근 결핵약제에 대한 내성을 갖는 결핵균들이 많이 발견되었다. 결핵을 치료하는 최종약제에 대한 내성이 강한 균주들이 발견됨에 따라 화학요법(항생제) 치료가 한계점에 부딪히고 있는 실정이다 [19,20]. M. tuberculosis , the causative agent of tuberculosis, is known to survive by invading macrophages after infection with a host. When macrophages recognize Mycobacterium tuberculosis, they activate signals such as MAPK and NF-κB to increase the expression of pro-inflammatory cytokines such as TNF-α, IL-1, and IL-6, or kill Mycobacterium tuberculosis such as reactive oxygen species and nitric oxide. It suppresses the proliferation of Mycobacterium tuberculosis by various defense mechanisms, such as promoting the production of molecules that can be directly killed [17,18]. However, Mycobacterium tuberculosis advances the disease by evading or inhibiting the host's defense mechanisms. Moreover, recently, many Mycobacterium tuberculosis with resistance to tuberculosis drugs have been discovered. As strains with strong resistance to the final drug to treat tuberculosis have been discovered, chemotherapy (antibiotic) treatment is facing a limit [19,20].

광역학 치료는 항암치료 등 다른 화학적인 치료법을 대체할 수 있는 차세대 치료법으로 알려져 있다. 또한, 최근의 연구에서는 광역학 치료시 그람음성세균인 Pseudomonas aeruginosa , Escherichia coli , Staphylococcus aureus , Acinetobacter baumannii의 in vitro 배양에서 균의 생장을 효과적으로 억제한다는 보고가 있었다 [21-24]. 더욱이 광역학 치료는 MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus), MDR E. coli 등 항생제에 내성을 가진 균주도 효과적으로 억제한다고 보고되고 있다 [25].Photodynamic therapy is known as a next-generation therapy that can replace other chemical therapies such as chemotherapy. In addition, in a recent study, Pseudomonas aeruginosa , Escherichia , which are Gram-negative bacteria during photodynamic therapy coli , Staphylococcus aureus , Acinetobacter baumannii in in vitro culture There was a report that it effectively inhibits the growth of bacteria [21-24]. Moreover, it has been reported that photodynamic therapy effectively inhibits antibiotic-resistant strains such as MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus ) and MDR E. coli [25].

본 발명에서 대조군으로 사용한 DH-I-180-3의 경우 광역학 치료를 시행했을 때 결핵환자에게서 얻어낸 MDR-TB 및 XDR-TB가 억제되었다는 연구가 발표된 바 있다 [16]. 따라서 본 발명자들은 DH-I-180-3으로부터 새롭게 합성된 CHLO-Cl을 이용한 광역학 치료가 결핵균을 효과적으로 죽이면서 동시에 결핵균 감염에 대한 숙주의 면역 반응에서 중요한 역할을 하는 큰포식세포의 항결핵 활성 능력을 향상시키는데 기여하는지 규명하고자 하였다.In the case of DH-I-180-3 used as a control in the present invention, a study was published that showed that MDR-TB and XDR-TB obtained from tuberculosis patients were inhibited when photodynamic therapy was performed [16]. Therefore, the present inventors found that photodynamic treatment using CHLO-Cl, newly synthesized from DH-I-180-3, effectively kills Mycobacterium tuberculosis and at the same time, anti-tuberculosis activity of macrophages, which plays an important role in the host's immune response to Mycobacterium tuberculosis infection. The purpose of this study was to determine whether it contributes to improving the ability.

본 연구 결과, CHLO-Cl의 광활성화가 결핵균 (이하, "마이코박테리움"과 혼용함)의 생장을 억제하였다. CHLO-Cl 처리 후 한 번 광 활성화 시 무처리 대조군에 비해 7일 차에 결핵균이 10배 감소하였다. 또한, CHLO-Cl 처리와 광 활성화를 매일 실시한 실험군은 대조군에 비해 결핵균이 100배 감소하였고 광 활성화 이후 3일째 되는 날 종래 사용되고 있는 항결핵제인 리팜피신(rifampicin) 처리군만큼 결핵균의 생장이 억제되었다. 또한, 마우스 큰포식세포주인 Raw 264.7 세포에 DH-I-180-3 또는 CHLO-Cl 처리군 광 활성화 시 CHLO-Cl은 DH-I-180-3에 비해 세포독성이 낮음을 관찰하였다. 광 활성화 없이 CHLO-Cl만 처리한 경우에도 세포 내 결핵균이 감소하였고, 광 활성화 실험군은 무처리 대조군에 비하여 세포 내 결핵균이 5배 감소하였다.As a result of this study, photoactivation of CHLO-Cl inhibited the growth of Mycobacterium tuberculosis (hereinafter, mixed with "Mycobacterium"). When light activation was performed once after CHLO-Cl treatment, Mycobacterium tuberculosis was reduced 10-fold on the 7th day compared to the untreated control group. In addition, the experimental group subjected to CHLO-Cl treatment and photoactivation daily reduced Mycobacterium tuberculosis 100 times compared to the control group, and the growth of Mycobacterium tuberculosis was inhibited as much as the group treated with rifampicin, a conventionally used antituberculosis agent, on the third day after photoactivation. In addition, it was observed that the cytotoxicity of CHLO-Cl was lower than that of DH-I-180-3 during photoactivation of DH-I-180-3 or CHLO-Cl treated group in Raw 264.7 cells, a mouse macrophage cell line. Even when only CHLO-Cl was treated without photoactivation, intracellular Mycobacterium tuberculosis was reduced, and the light-activated experimental group reduced intracellular Mycobacterium tuberculosis 5 times compared to the untreated control group.

결핵균의 감염을 제어하기 위해서는 염증성 및 항염증 사이토카인들의 생산이 매우 중요하다. CHLO-Cl의 광 활성화 시 TNF-α와 IL-10의 생산이 매우 증가하였고, 특히 IL-10의 분비는 CHLO-Cl만 처리해주어도 통계적으로 유의하게 증가하였다.Production of inflammatory and anti-inflammatory cytokines is very important in controlling Mycobacterium tuberculosis infection. Upon photoactivation of CHLO-Cl, the production of TNF-α and IL-10 was greatly increased, and in particular, the secretion of IL-10 was statistically significantly increased even when only CHLO-Cl was treated.

또한, 광민감제의 광 활성화 동안 전자를 내보내어 주변에 있던 산소분자와 반응하여 활성산소종이 생성이 되므로 CHLO-Cl 처리 동안 활성산소종 생성을 측정하고자 하였다. 결핵균을 감염시키지 않은 CHLO-CL 처리군은 무처리 대조군과 비교하여 활성산소종 생성이 3배 증가하였다.In addition, during photoactivation of the photosensitizer, electrons are emitted and react with oxygen molecules in the vicinity to generate reactive oxygen species. Therefore, it was intended to measure the generation of reactive oxygen species during CHLO-Cl treatment. The CHLO-CL-treated group not infected with Mycobacterium tuberculosis had a 3-fold increase in reactive oxygen species production compared to the untreated control group.

CHLO-Cl의 광 활성화에 따른 세포 내 결핵균 제어가 활성산소종에 의한 것임을 도 5에서 확인하였고 특히 활성산소종 scavanging에 의한 IL-10 분비의 감소가 통계적으로 유의하게 나타났다. 이전 연구에 따르면 IL-10이 큰포식세포의 세포사멸을 억제하거나 세포 내 박테리아 제어에 필수적인 사이토카인임이 보고된 바 있다 [26-29]. 따라서, CHLO-Cl의 광 활성화에 의한 IL-10의 분비의 증가가 세포 내 결핵균 제어에 중요한 역할을 할 것으로 추정된다.It was confirmed in FIG. 5 that the intracellular Mycobacterium tuberculosis control according to the light activation of CHLO-Cl was caused by reactive oxygen species. In particular, the decrease in IL-10 secretion by reactive oxygen species scavanging was statistically significant. Previous studies have reported that IL-10 is an essential cytokine for inhibiting apoptosis of macrophages or for controlling intracellular bacteria [26-29]. Therefore, it is presumed that the increase in IL-10 secretion by photoactivation of CHLO-Cl will play an important role in intracellular Mycobacterium tuberculosis control.

결론적으로 본 발명은 광민감제 CHLO-Cl이 결핵균 감염시 활성산소종 생성을 증가시키고 사이토카인의 생산을 유도하여 결핵균 감염에 대한 효과적인 항균 활성을 제공한다는 것을 시사한다. 또한, 본 발명은 결핵균 등의 병원균을 효과적으로 제어할 수 있는 치료방법을 제공한다.In conclusion, the present invention suggests that the photosensitizer CHLO-Cl provides effective antibacterial activity against Mycobacterium tuberculosis infection by increasing the production of reactive oxygen species and inducing the production of cytokines during Mycobacterium tuberculosis infection. In addition, the present invention provides a treatment method that can effectively control pathogens such as Mycobacterium tuberculosis.

감염 후, 마이코박테리아는 대식세포에 의해 식균되고, 그래서 많은 항생 물질 약제 및 면역계로부터 보호된다. After infection, mycobacteria are phagocytosed by macrophages, thus protecting them from many antibiotic drugs and the immune system.

본 발명의 방법은 결핵균과 같은 마이코박테리아를 비롯한 병원체 감염 또는 세포 내 병원체에 의해 발생하는 질병을 치료하는데 이용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 일 실시 형태는 세포 내 병원체와 관련된 질환 환자에게 광민감제 및 표적화 모이어티 (targeting moiety)를 포함하는 분자 복합체를 투여함으로써 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 표적화 모이어티가 분자 복합체를 세포 내 병원체로 이끌 수 있는 방법을 특징으로 한다. 일 실시 형태에서 항생 물질에 기초한 종래의 치료법과 같이, 광증감제 및 표적화 모이어티를 포함한 분자 복합체에 의해 환자를 치료할 수 있다. 표적화 모이어티는 분자 복합체를 세포 내 병원체 또는 감염된 숙주 세포 (예를 들면 대식세포)에 표적 부착될 수 있다.The method of the present invention can be used to treat diseases caused by pathogenic infections or intracellular pathogens, including mycobacteria such as Mycobacterium tuberculosis. For example, one embodiment of the present invention relates to a method of treating a patient by administering to a patient with a disease associated with an intracellular pathogen a molecular complex comprising a photosensitizer and a targeting moiety, wherein the targeting moiety is the molecular complex is characterized by a method that can lead to intracellular pathogens. In one embodiment, the patient may be treated with a molecular complex comprising a photosensitizer and a targeting moiety, such as conventional therapy based on antibiotics. The targeting moiety can target the molecular complex to intracellular pathogens or infected host cells (eg macrophages).

따라서, 본 발명은 세포 내 병원체 관련 질병을 가지는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 항생 물질 및 분자 복합체(광민감제 또는 광민감제와 상기 분자 복합체를 병원체에 표적 붙이는 표적화 모이어티를 포함할 수 있다)를 투여하는 공정을 포함하는 방법을 특징으로 한다. 이 분자 복합체는 항생 물질이 투여되기 전, 투여되어 있는 도중, 또는 투여 후에 투여할 수 있다. 다른 실시 형태에서 세포 내 병원체는 세균 (예컨대 결핵균과 같은 마이코박테리아)이다. 상기 병원체는 식세포 (예컨대 대식세포) 내에 존재한다. 이 방법은 바람직하게는, 상기 광민감제에 세포 장애 효과를 일으키는 파장을 이용하여 환자에 광을 조사하는 공정을 포함할 수 있다. 광원은 특별한 제한은 없으며, 예컨대 레이저 광이다.Accordingly, the present invention provides a method of treating a patient having an intracellular pathogen-associated disease, comprising an antibiotic and a molecular complex (a photosensitizer or a photosensitizer and a targeting moiety that targets the molecular complex to the pathogen to the patient). ) is characterized by a method comprising the step of administering. This molecular complex may be administered before, during, or after the antibiotic is administered. In another embodiment, the intracellular pathogen is a bacterium (eg, a mycobacterium such as Mycobacterium tuberculosis). The pathogen is present in phagocytes (eg macrophages). The method may include a step of irradiating light to the patient using a wavelength that causes a cytotoxic effect on the photosensitizer. The light source is not particularly limited and is, for example, laser light.

광민감제는 적절한 파장의 전자에너지가 조사되었을 때 세포 장애 효과를 일으키는 물질이다. 일반적으로 광민감제는 적절한 파장의 광에 의해 조사된다.A photosensitizer is a substance that causes a cytotoxic effect when irradiated with electron energy of an appropriate wavelength. In general, the photosensitizer is irradiated with light of an appropriate wavelength.

적절한 에너지 레벨 및 파장에서의 광 조사 (광 활성화)에 의해 광민감제는 활성산소종을 생성한다. 활성산소종은 매우 활성이 높고 반응성 질소 중간체와 같이 표적 유기체에게 독성이 있다. 상기 "표적 유기체"라 함은 본 발명의 방법에 의해 파괴 또는 제어하기 위해 표적으로 되는 유기체를 말하며, 숙주 유기체 또는 그 세포를 감염시키고 그 숙주에게 질환을 일으키거나 악화시키는 유기체, 통칭 병원균을 말한다. 병원균이라 함은 바이러스, 박테리아, 원생동물, 프라이온, 바이로이드 또는 진균과 같은 감염성 미생물이나 감염원을 말하며, 특히 바람직한 표적 유기체는 특히 결핵균과 같은 마이코박테리아 속 또는 톡소플라즈마 속의 세균 또는 바이러스이다. 상기 병원균으로는 마이코박테리아 결핵(Mycobacterium tuberculosis), 연쇄상 구균, 슈도모나스, 이질균, 캄필로박터, 살모넬라, 미코플라스마 등의 박테리아, 아데노바이러스과(Adenoviridae), 피코르나바이러스과(Picornaviridae), 헤르페스바이러스과(Herpesviridae), 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae), 플라비바이러스과(Flaviviridae), 레트로바이러스과(Retroviridae), 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae), 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae), 파포바바이러스과(Papovaviridae), 폴리오마바이러스(Polyomavirus), 랍도바이러스과(Rhabdoviridae), 토가바이러스과(Togaviridae) 등의 병원성 바이러스, 병원성 균류, 프라이온, 기타 다수의 원생동물과 유충을 포함한 몇 몇의 진핵생물, 조류 등을 들 수 있다.By irradiation with light (photoactivation) at appropriate energy levels and wavelengths, photosensitizers generate reactive oxygen species. Reactive oxygen species are highly active and toxic to target organisms as reactive nitrogen intermediates. The term "target organism" refers to an organism that is targeted for destruction or control by the method of the present invention, and refers to an organism, commonly called a pathogen, that infects a host organism or its cells and causes or worsens a disease in the host. The term pathogen refers to an infectious microorganism or an infectious agent such as a virus, bacteria, protozoa, prion, viroid or fungus, and a particularly preferred target organism is a bacterium or virus of the genus Mycobacteria or Toxoplasma such as Mycobacterium tuberculosis in particular. The pathogens include Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus, Pseudomonas, Shigella, Campylobacter, Salmonella, Mycoplasma, and other bacteria, Adenoviridae, Picornaviridae, Herpesviridae , Hepadnaviridae, Flaviviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papovaviridae, Polyomavirus, Rap Pathogenic viruses such as Rhabdoviridae and Togaviridae, pathogenic fungi, prions, and several other eukaryotes, including larvae, and several eukaryotes.

본 발명의 방법에 의해 표적으로 되는 유기체는 임의의 광 영향을 받는 (light-accessible) 표면상 또는 광의 영향을 받는 구역 내, 예를 들면 사람 및 동물의 피험자 내에서 볼 수 있다. 사람 및 동물의 경우, 표피, 구강, 비강, 폐, 요관 및 위장관의 감염이 광의 영향을 받는다. 상피 감염은 세균, 균류, 바이러스 및 동물 기원의 바람직하지 않은 유기체의 감염을 포함하고 그 감염이 광의 영향을 받는다, 예를 들면 원생동물, 기생충, 또는 기생 진드기에 의해 발생하는 피하 감염, 특히 국부 손상을 들 수 있다. 맹장염에서 발생하는 감염과 같은 복강의 감염은 적어도 복강경 장치 등을 통해 광의 영향을 받을 수 있다. 항생 물질 또는 장기간의 항진균 치료에 대해서 면역이 있는 다양한 피부 감염, 예를 들면 발가락, 손발톱의 피부 사상균증이 본 발명의 방법을 이용한 광역학 요법에 적합하다.Organisms targeted by the methods of the present invention can be seen on any light-accessible surface or in a zone affected by light, for example in human and animal subjects. In humans and animals, infections of the epidermis, oral cavity, nasal cavity, lung, ureter and gastrointestinal tract are affected by light. Epithelial infections include infections of bacteria, fungi, viruses and undesirable organisms of animal origin, the infections of which are affected by light, subcutaneous infections, in particular local injuries, caused for example by protozoa, parasites, or parasitic mites. can be heard Infections of the abdominal cavity, such as those resulting from appendicitis, can be affected by light, at least through a laparoscopic device or the like. Various skin infections that are immune to antibiotic or long-term antifungal treatment, for example, dermatophytosis of the toes and toenails, are suitable for photodynamic therapy using the method of the present invention.

본 발명의 분자 복합체의 숙주 유기체로의 투여는 광민감제가 표적화 모이어티에 결합되었을 때, 얻어진 복합체는 복합체를 환자에게 투여하는데 이용할 수 있다. Administration of the molecular complex of the present invention to a host organism, when the photosensitizer is bound to a targeting moiety, the resulting complex can be used to administer the complex to a patient.

본 발명의 분자 복합체는 유리 형태로 즉 용액 중의 복합체로서 환자에게 공급할 수 있다. 혹은 복합체는 이하로 한정되는 것이 아니지만 리포좀, 펩타이드 결합, 고분자 결합, 또는 세제 함유 배합물을 포함한 다양한 배합물 형태로 공급할 수 있다. 당업자는 그러한 배합물을 용이하게 조제하고 투여할 수 있다.The molecular complexes of the present invention can be supplied to the patient in free form, ie as complexes in solution. Alternatively, the complex may be supplied in the form of various formulations including, but not limited to, liposomes, peptide bonds, polymer bonds, or detergent-containing formulations. Those skilled in the art can readily formulate and administer such formulations.

본 발명은 아래 화학식 1로 표시되는 신규 클로린 유도체 화합물 CHLO-Cl에 관한 것이다.The present invention relates to a novel chlorine derivative compound CHLO-Cl represented by the following formula (1).

<화학식 1><Formula 1>

Figure pat00002
Figure pat00002

또한, 본 발명은 세포에 상기 광민감제 CHLO-Cl을 처리하는 단계; 및 상기 광민감제 CHLO-Cl을 활성화하기 위하여 광선을 조사하는 단계;를 포함하는 세포 내 병원균 활성 억제방법에 관한 것이다.In addition, the present invention comprises the steps of treating the cells with the photosensitizer CHLO-Cl; And it relates to a method of inhibiting intracellular pathogen activity comprising; irradiating light to activate the photosensitizer CHLO-Cl.

또한, 본 발명은 상기 병원균이 바이러스, 박테리아, 원생동물, 프라이온, 바이로이드 또는 진균인 것을 특징으로 하는, 세포 내 병원균 활성 억제방법에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a method for inhibiting intracellular pathogen activity, characterized in that the pathogen is a virus, bacteria, protozoa, prion, viroid or fungus.

또한, 본 발명은 상기 병원균이 마이코박테리움, 마이코플라스마, 톡소플라스마, 리스테리아 또는 살모넬라인 것을 특징으로 하는, 세포 내 병원균 활성 억제방법에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a method for inhibiting intracellular pathogen activity, characterized in that the pathogen is Mycobacterium, Mycoplasma, Toxoplasma, Listeria or Salmonella.

또한, 본 발명은 상기 병원균이 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 튜베쿨로시스, 마이코박테리움 보비스, 마이코박테리움 미크로티, 마이코박테리움 아프리카눔 등의 마이코박테리움 균인 것을 특징으로 하는, 세포 내 병원균 활성 억제방법에 관한 것이다.In addition, the present invention provides that the pathogen is Mycobacterium bacteria such as Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tubeculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium microti, and Mycobacterium africanum. It relates to a method for inhibiting intracellular pathogen activity, characterized in that.

또한, 본 발명은 상기 마이코박테리움 균이 다제 내성 결핵균 (Multi drug resistance tuberculosis) 또는 광범위 약제 내성 결핵균 (Extreme drug resistance tubersulosis)인 것을 특징으로 하는, 세포 내 병원균 활성 억제방법에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a method for inhibiting intracellular pathogen activity, characterized in that the Mycobacterium is a multi-drug resistance tuberculosis or Extreme drug resistance tubersulosis.

또한, 본 발명은 상기 광선이 650 ~ 670 nm, 바람직하게는 660 nm 파장인 것을 특징으로 하는, 세포 내 병원균 활성 억제방법에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a method for inhibiting the activity of pathogens in cells, characterized in that the light has a wavelength of 650 to 670 nm, preferably 660 nm.

또한, 본 발명은 상기 CHLO-Cl을 1~50 μg/ml 농도로 사용하는 것을 특징으로 하는, 세포 내 병원균 활성 억제방법에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a method for inhibiting intracellular pathogen activity, characterized in that the CHLO-Cl is used at a concentration of 1-50 μg/ml.

또한, 본 발명은 상기 광민감제 CHLO-Cl를 포함하는 항균성 약학 조성물에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to an antibacterial pharmaceutical composition comprising the photosensitizer CHLO-Cl.

또한, 본 발명은 표적화 제제 (targeting agent)를 더 포함하는 항균성 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to an antimicrobial pharmaceutical composition further comprising a targeting agent.

또한, 본 발명은 상기 표적화 제제가 항-큰포식세포 염증 단백질 항체인 것을 특징으로 하는, 항균성 약학 조성물에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to an antibacterial pharmaceutical composition, characterized in that the targeting agent is an anti-macrophage inflammatory protein antibody.

또한, 본 발명은 바이러스, 박테리아, 원생동물, 프라이온, 바이로이드 또는 진균과 같은 병원균의 성장이나 생존을 억제하는 것을 특징으로 하는, 항균성 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to an antibacterial pharmaceutical composition, characterized in that it inhibits the growth or survival of pathogens such as viruses, bacteria, protozoa, prions, viroids or fungi.

또한, 본 발명은 상기 병원균이 마이코박테리움, 마이코플라스마, 톡소플라스마, 리스테리아 또는 살모넬라인 것을 특징으로 하는, 항균성 약학 조성물에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to an antibacterial pharmaceutical composition, characterized in that the pathogen is Mycobacterium, Mycoplasma, Toxoplasma, Listeria or Salmonella.

또한, 본 발명은 상기 병원균이 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 튜베쿨로시스, 마이코박테리움 보비스, 마이코박테리움 미크로티 또는 마이코박테리움 아프리카눔 등의 마이코박테리움 균인 것을 특징으로 하는, 항균성 약학 조성물에 관한 것이다.In addition, the present invention provides that the pathogen is Mycobacterium bacteria such as Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tubeculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium microti or Mycobacterium africanum. It relates to an antimicrobial pharmaceutical composition, characterized in that.

또한, 본 발명은 상기 마이코박테리움 균이 다제 내성 결핵균 (Multi drug resistance tuberculosis) 또는 광범위 약제 내성 결핵균 (Extreme drug resistance tubersulosis)인 것을 특징으로 하는, 항균성 약학 조성물에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to an antibacterial pharmaceutical composition, characterized in that the Mycobacterium is a multi-drug-resistant tuberculosis or Extreme drug resistance tubersulosis.

상기 약학적 조성물은 상기 병원균에 항균 활성을 갖는 공지의 물질을 하나 이상 추가로 함유할 수 있다. 상기 공지의 물질은 그람양성균 저해제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The pharmaceutical composition may further contain one or more known substances having antibacterial activity against the pathogen. The known substance may be a Gram-positive bacteria inhibitor, but is not limited thereto.

본 발명에 따른 항균성 약학 조성물은 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 함유할 수 있다. The antimicrobial pharmaceutical composition according to the present invention may further contain one or more pharmaceutically acceptable additives selected from the group consisting of excipients, lubricants, wetting agents, sweeteners, fragrances and preservatives.

본 발명에 따른 조성물은 통상의 방법에 따라 제형화하여 사용할 수 있다. 특히 인간 또는 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다.The composition according to the present invention can be formulated and used according to a conventional method. In particular, it may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a human or mammal.

본 발명에 따른 조성물의 투여방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 예컨대, 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내, 코안, 경막외 또는 구강 경로를 통하여 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The administration method of the composition according to the present invention can be easily selected according to the dosage form, and can be administered orally or parenterally. For example, it may be used via an intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, nasal, epidural, or oral route, but is not limited thereto.

경구 투여를 위한 고형제제는 정제, 알약, 연질 또는 경질 캅셀제, 환제, 산제 또는 과립제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 한편, 비경구 투여를 위한 형태는 크림, 로션제, 연고제, 경고제, 액제, 패취제 또는 주사제 등의 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The solid preparation for oral administration may be a tablet, pill, soft or hard capsule, pill, powder or granule, but is not limited thereto. Meanwhile, the form for parenteral administration may be in the form of a cream, lotion, ointment, warning agent, liquid, patch or injection, but is not limited thereto.

본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 수 있으나, 유효 투여량은 통상적으로 성인(60 kg)의 경우, 약 1 ng/일 내지 1000 ㎎/일, 특히 약 1 ㎍/일 내지 1 ㎎/일이다. 투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동 가능하기 때문에, 상기 투여량에 가감이 있을 수 있다는 사실은 당업자에게 자명하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.The dosage of the composition according to the present invention may vary depending on the patient's weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate and severity of disease, etc., but the effective dosage is usually an adult (60 kg), about 1 ng/day to 1000 mg/day, especially about 1 μg/day to 1 mg/day. Since the dosage may vary depending on various conditions, it is apparent to those skilled in the art that the dosage may be adjusted or decreased, and thus, the dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way. The number of administration may be administered once a day or divided into several times within a desired range, and the administration period is not particularly limited.

또한, 본 발명은 상기 광민감제 CHLO-Cl를 포함하는 항균 소독제 조성물에 관한 것이다. 광민감제 CHLO-Cl를 포함하는 항균 소독제 조성물은 가정용, 학교나 공장, 식당, 축사 등에서 사용하는 일반용, 병원 등에서 사용하는 의료용 등으로 다양하게 이용할 수 있으며, 용도가 이에 한정되는 것은 아니다. 항균 소독제 조성물을 분사, 도포 등의 방법으로 적용한 후 광을 조사하여 광 활성화하면 항균 활성이 현저히 높아진다.In addition, the present invention relates to an antibacterial disinfectant composition comprising the photosensitizer CHLO-Cl. The antibacterial disinfectant composition containing the photosensitizer CHLO-Cl can be used variously for home use, general use used in schools, factories, restaurants, livestock, etc., medical use used in hospitals, etc., and the use is not limited thereto. When the antibacterial disinfectant composition is applied by spraying, applying, etc. and then photo-activated by irradiating light, the antibacterial activity is remarkably increased.

또한, 본 발명은 상기 항균 소독제 조성물이 의료용인 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that the antibacterial disinfectant composition is for medical use.

본 발명의 CHLO-Cl 광민감제 처리와 이의 광 활성화 방법은 결핵균을 현저히 억제하는 효과가 있다.The CHLO-Cl photosensitizer treatment of the present invention and its photoactivation method have an effect of remarkably inhibiting Mycobacterium tuberculosis.

또한, 본 발명의 CHLO-Cl 광민감제와 이의 광 활성화는 세포 내 활성산소종을 현저히 증가시켜 결핵균을 사멸하는 효과를 거둘 수 있다.In addition, the CHLO-Cl photosensitizer of the present invention and its photoactivation can achieve the effect of killing Mycobacterium tuberculosis by remarkably increasing intracellular reactive oxygen species.

이뿐만 아니라, 본 발명의 CHLO-Cl 광민감제와 이의 광 활성화는 종래 광민감제인 DH-I-180-3과 달리 세포 독성이 낮다.In addition, the CHLO-Cl photosensitizer of the present invention and its photoactivation have low cytotoxicity, unlike DH-I-180-3, which is a conventional photosensitizer.

본 발명의 광민감제 CHLO-Cl의 반복 투여 및 광 활성화는 기존 결핵균 및 항생제 내성 결핵균의 성장을 제어할 뿐 아니라, 결핵균에 감염된 큰포식세포에서 숙주세포를 보호하면서 염증성 사이토카인인 TNF-α의 생산을 증가시킴으로써 결핵균을 효과적으로 제어할 수 있다.Repeat administration and photoactivation of the photosensitizer CHLO-Cl of the present invention not only control the growth of Mycobacterium tuberculosis and antibiotic-resistant Mycobacterium tuberculosis, but also protect the host cells from Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages while producing the inflammatory cytokine TNF-α It is possible to effectively control Mycobacterium tuberculosis by increasing the

도 1. 항결핵 약물 리팜피신 (0.5 μg/ml), 광민감제 DH-I-180-3 또는 CHLO-Cl (13.17 μM)를 1시간 동안 처리한 다음, 7H9 Broth (0.2% 글리세롤 함유 10% ADC 보충됨)에 결핵균 균주 H37Rv를 72시간 동안 접종하였다 (A). 광민감제를 한 번 (B) 처리하거나, (C) 광민감제를 매일 처리하고 660nm의 파장으로 1분 동안 빛을 조사하였다. 3주 동안 7H10 한천 배지(0.5% 글리세롤 함유 10% OADC 보충됨)에 박테리아 희석액을 접종하여 CFU (colony-forming unit)를 측정하였다. (D) A-C 패널의 막대그래프는 3일째 박테리아 성장을 표시하였다.
도 2. Raw 264.7 큰포식세포를 H37Rv (MOI=10에서)로 4시간 동안 감염시킨 후, 광민감제인 DH-I-180-3 또는 CHLO-Cl (13.17μM)로 1시간 동안 처리하였다. 광 조사는 표시된 시간과 같이 처리하였다. (A) 광 조사 48시간 후 및 (B) 72시간 후 각각 트리판블루 배제 분석 (trypan blue exclusion assay)을 수행하였다.
도 3. Raw 264.7 큰포식세포를 H37Rv (at MOI of 10) 로 4시간 동안 감염시킨 후, 광민감제인 DH-I-180-3 또는 CHLO-Cl (13.17 μM)로 1시간 동안 처리하였다. (A) 광 조사 48시간 후 세균의 수를 평가하였다. (B) 세포수 당 대조군 군집수의 비율을 측정하였다. 광 조사 18시간 또는 24시간 후 TNF-α (C) 및 IL-10 (D)의 생성은 배양 상층액에서 ELISA로 측정하였다.
도 4. H37Rv에 감염되지 않은 Raw 264.7 세포를 광민감제 DH-I-180-3 또는 CHLO-Cl (13.17 μΜ)로 1시간 동안 처리하였다.
도 5. Raw 264.7 큰포식세포를 H37Rv (MOI=10일 때)로 4시간 동안 감염시킨 후, 아포시닌 10μM 및 DH-I-180-3 또는 CHLO-Cl (13.17μM)로 1시간 동안 처리하였다. (A) 광 조사 48시간 후 트리판블루 배제 분석으로 시험하였다. 박테리아의 수는 48시간 후에 평가하였다. (C) 세포수 당 대조군 군집수의 비율을 측정하였다.
도 6. Raw 264.7 큰포식세포를 H37Rv (MOI=10일 때)로 4시간 동안 감염시킨 후, 아포시닌 10μM 및 DH-I-180-3 또는 CHLO-Cl (13.17μM)로 1시간 동안 처리하였다. 광 조사 18시간, 24시간 및 48시간 후 TNF-α (A) 및 IL-10 (B), 산화질소 (C)의 생산을 ELISA로 측정하고, 배양 상층액에서 griess 분석을 수행하였다.
도 7. 광민감제 CHLO-Cl 처리 후 광 활성화한 경우 각 결핵균주 (H37Rv, MDR 균주의 일종인 ST065, XDR 균주의 일종인 M0012859)의 성장이 감소하였음을 보여준다.Figure 1. Treatment with anti-tuberculosis drug rifampicin (0.5 μg/ml), photosensitizer DH-I-180-3 or CHLO-Cl (13.17 μM) for 1 hour, followed by 7H9 Broth (10% ADC with 0.2% glycerol supplementation) ) was inoculated with Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv for 72 hours (A). The photosensitizer was treated once (B), or (C) the photosensitizer was treated daily and irradiated with light at a wavelength of 660 nm for 1 minute. CFU (colony-forming unit) was measured by inoculating the bacterial dilution on 7H10 agar medium (supplemented with 10% OADC containing 0.5% glycerol) for 3 weeks. (D) Histogram of the AC panel indicated bacterial growth at day 3.
Figure 2. Raw 264.7 macrophages were infected with H37Rv (at MOI=10) for 4 hours, and then treated with photosensitizers DH-I-180-3 or CHLO-Cl (13.17 μM) for 1 hour. Light irradiation was treated as indicated time. (A) after 48 hours of light irradiation and (B) after 72 hours, trypan blue exclusion assay was performed, respectively.
Figure 3. Raw 264.7 macrophages were infected with H37Rv (at MOI of 10) for 4 hours, and then treated with photosensitizers DH-I-180-3 or CHLO-Cl (13.17 μM) for 1 hour. (A) The number of bacteria was evaluated after 48 hours of light irradiation. (B) The ratio of the number of control groups to the number of cells was measured. The production of TNF-α (C) and IL-10 (D) after 18 or 24 hours of light irradiation was measured by ELISA in the culture supernatant.
Figure 4. Raw 264.7 cells not infected with H37Rv were treated with the photosensitizer DH-I-180-3 or CHLO-Cl (13.17 μM) for 1 hour.
Figure 5. Raw 264.7 macrophages were infected with H37Rv (when MOI = 10) for 4 hours and then treated with aposinin 10 μM and DH-I-180-3 or CHLO-Cl (13.17 μM) for 1 hour. did. (A) Tested by trypan blue exclusion assay 48 hours after light irradiation. The number of bacteria was assessed after 48 hours. (C) The ratio of the number of control groups to the number of cells was measured.
Figure 6. Raw 264.7 macrophages were infected with H37Rv (when MOI = 10) for 4 hours and then treated with aposinin 10 μM and DH-I-180-3 or CHLO-Cl (13.17 μM) for 1 hour. did. The production of TNF-α (A), IL-10 (B), and nitric oxide (C) was measured by ELISA after 18, 24 and 48 hours of light irradiation, and griess analysis was performed on the culture supernatant.
FIG. 7. It shows that the growth of each tuberculosis strain (H37Rv, ST065, a type of MDR strain, M0012859, a type of XDR strain) was reduced in the case of photoactivation after treatment with the photosensitizer CHLO-Cl.

아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 특히, 본 발명의 실시예에서는 병원균의 일례로 결핵균을 이용하였으나, 본 발명의 방법 및 조성물은 결핵균에만 한정하여 사용할 수 있는 것이 아니며, 결핵균은 본 발명의 일 예시로서 사용한 것임은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in more detail with reference to specific embodiments. However, it is apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited only to the description of the examples. In particular, in the embodiment of the present invention, Mycobacterium tuberculosis was used as an example of the pathogen, but the method and composition of the present invention can not be used limited to Mycobacterium tuberculosis, and Mycobacterium tuberculosis is used as an example of the present invention. It is obvious to those of ordinary skill in the field.

CHLOCHLO -Cl의 합성 및 정제-Cl synthesis and purification

메틸페오포바이드를 triethylene glycol과 반응시킨 후 정제하여 얻어지는 유도체 300mg (0.414mmol)을 THF 200mL에 녹인 용액에, 아염소산나트륨 (sodium chlorite) 38mg을 증류수 50mL에 녹인 용액을 천천히 넣어주고, 진한 염산을 18방울을 첨가한 뒤 질소 기체 하에서 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 증류수 100mL를 가해 반응을 종결하고 methylene chloride로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨을 넣어 건조, 여과 후 용매를 제거하였다. 얻은 고체를 관 크로마토그래피로 분리하였다.To a solution of 300 mg (0.414 mmol) of a derivative obtained by reacting methylpheophobide with triethylene glycol and purification in 200 mL of THF, a solution of 38 mg of sodium chlorite in 50 mL of distilled water was slowly added, and concentrated hydrochloric acid was added. After adding 18 drops, the mixture was stirred at room temperature under nitrogen gas for 1 hour. 100 mL of distilled water was added to terminate the reaction, and extraction was performed with methylene chloride. The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was removed. The obtained solid was separated by column chromatography.

수율: 198mg (62%); 1H NMR(400MHz, CDCl3)δ 9.60 (s, 2H), 7.93 (m, 1H), 6.31(d, 1H, J = 1.68Hz), 6.27 (s, 1H), 6.19 (d, 1H, J = 1.68 Hz), 4.79 (m, 1H), 4.50 (m, 2H), 4.20 (m, 1H), 3.75-3.21 (m, 23H), 2.50 (m, 3H), 2.18 (m, 4H), 1.70 (m, 3H), 1.61 (m, 2H), 0.99 (s, 1H), -1.89 (s, 1H); MALDI-TOF MS Calcd.for C41H47ClN4O8 exact mass 758.3082,Found 759.0952(M+1).Yield: 198 mg (62%); 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 9.60 (s, 2H), 7.93 (m, 1H), 6.31 (d, 1H, J = 1.68 Hz), 6.27 (s, 1H), 6.19 (d, 1H, J ) = 1.68 Hz), 4.79 (m, 1H), 4.50 (m, 2H), 4.20 (m, 1H), 3.75-3.21 (m, 23H), 2.50 (m, 3H), 2.18 (m, 4H), 1.70 (m, 3H), 1.61 (m, 2H), 0.99 (s, 1H), -1.89 (s, 1H); MALDI-TOF MS Calcd.for C 41 H 47 ClN 4 O 8 exact mass 758.3082, Found 759.0952 (M+1).

이와 같이 얻은 신규 클로린 유도체 화합물을 "CHLO-Cl"이라 명명한다.The novel chlorine derivative compound thus obtained is named "CHLO-Cl".

1. 시약1. Reagents

광민감제인 DH-I-180-3과 CHLO-Cl은 이창희 교수(강원대학교 화학과)로부터 제공 받았다. 항결핵제 리팜피신은 TCI (Tokyo, Japan)에서 구매하였고 anti-phospho-MEK1/2, anti-MEK1/2, anti-phospho-ERK, anti-ERK, anti-phospho-IκB-α, anti-IκB-α, anti-phospho-RIP, anti-phospho-RIP3, anti-GSDMD 항체는 Cell Signaling Tech (Danvers, USA)에서 구매하였다. Anti-Actin, anti-GAPDH 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Heidelberg, Germany)에서 구매하였다.The photosensitizers DH-I-180-3 and CHLO-Cl were provided by Professor Changhee Lee (Department of Chemistry, Kangwon National University). The anti-tuberculosis drug rifampicin was purchased from TCI (Tokyo, Japan), anti-phospho-MEK1/2, anti-MEK1/2, anti-phospho-ERK, anti-ERK, anti-phospho-IκB-α, anti-IκB-α, Anti-phospho-RIP, anti-phospho-RIP3, and anti-GSDMD antibodies were purchased from Cell Signaling Tech (Danvers, USA). Anti-Actin, anti-GAPDH antibodies are manufactured by Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Heidelberg, Germany).

2. 균주 배양2. Strain culture

본 실험에 사용된 균주는 Mycobacterium tuberculosis H37Rv이며 10% ADC (5% bovine albumin, 2% dextrose, 0.03% catalase, 0.85% sodium chloride)가 첨가된 DifcoTM Middlebrook 7H9 broth (BD, Franklin Lakes, USA) 50 ml에 접종하여 37℃에서 3주간 진탕배양하여 결핵균을 1 vial 당 100 μl로 나누어 -70℃에 보관하였다. 계대마다 10% OADC (0.06% oleic acid, 5% bovine albumin, 2% dextrose, 0.03% catalase, 0.85% sodium chloride)가 포함된 DifcoTM Middlebrook 7H10 broth (BD, Franklin Lakes, USA) 고체배지에 접종하여 3주 후에 CFU (colony-forming unit)를 결정하여 실험에 사용하였다.The strain used in this experiment is Mycobacterium tuberculosis H37Rv and Difco TM Middlebrook 7H9 broth (BD, Franklin Lakes, USA) 50 with 10% ADC (5% bovine albumin, 2% dextrose, 0.03% catalase, 0.85% sodium chloride) added. ml was inoculated and cultured with shaking at 37°C for 3 weeks, and Mycobacterium tuberculosis was divided into 100 μl per vial and stored at -70°C. Each passage was inoculated into a solid medium of Difco TM Middlebrook 7H10 broth (BD, Franklin Lakes, USA) containing 10% OADC (0.06% oleic acid, 5% bovine albumin, 2% dextrose, 0.03% catalase, 0.85% sodium chloride). After 3 weeks, CFU (colony-forming unit) was determined and used for the experiment.

3. 세포 배양3. Cell Culture

마우스 큰포식세포주 Raw 264.7 세포를 DMEM (10-030, CORNING, Tewksbury, USA)에 10% FBS (fetal Bovine serum; FP-0500-A, Atlas Biologicals, Fort Collins, USA), 1％ PS (Penicillin-Streptomycin; 30-002-CI, CORNING, Tewksbury, USA)을 혼합한 후, 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양하였다.Mouse macrophage cell line Raw 264.7 cells in DMEM (10-030, CORNING, Tewksbury, USA) in 10% FBS (fetal bovine serum; FP-0500-A, Atlas Biologicals, Fort Collins, USA), 1% PS (Penicillin- Streptomycin; 30-002-CI, CORNING, Tewksbury, USA) was mixed, and then cultured at 37° C., 5% CO 2 in a cell incubator.

4. 결핵균 4. Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis 감염infection

마우스 큰포식세포주인 Raw 264.7를 2×104 cells/ml의 농도로 12 웰 플레이트 (SPL #30012; SPL lifesciences, Pocheon, Korea)에 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 안정화한 다음 사용하였다. PBS (phosphate buffered saline; Gibco BRL Life Technologies, Caitherburg, USA)를 이용하여 2번 세척 후 결핵균을 10 MOI (multiplicity of infection)로 감염시켰다. 4시간 동안 감염시킨 후 감염되지 못한 상층액 내의 균을 PBS로 2번 세척하여 제거하였고 각 실험조건에 따라 아포시닌 (apocynin) 10 μM을 1시간 동안 전처리하였다. 그 후 각각의 시간대에 세포 내 결핵균의 생존율을 비교하기 위하여, PBS로 세척한 후 0.1% 사포닌 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo, USA)을 15분 동안 처리하였다. 0.1% 사포닌으로 세포를 파괴한 후 세포 내 생존 균을 Middlebrook 7H10 agar 배지에 접종시킨 후 21일째 되는 날 콜로니 형성단위 분석 (colony forming unit assay; CFU assay)를 수행하였다.The mouse macrophage cell line, Raw 264.7, was dispensed in a 12-well plate (SPL #30012; SPL lifesciences, Pocheon, Korea) at a concentration of 2×10 4 cells/ml and stabilized at 37°C, 5% CO 2 conditions for 24 hours. The following was used. After washing twice using PBS (phosphate buffered saline; Gibco BRL Life Technologies, Caitherburg, USA), Mycobacterium tuberculosis was infected with 10 MOI (multiplicity of infection). After being infected for 4 hours, the bacteria in the uninfected supernatant were washed twice with PBS and removed, and 10 μM of apocynin was pretreated for 1 hour according to each experimental condition. Thereafter, in order to compare the survival rate of Mycobacterium tuberculosis in cells at each time period, after washing with PBS, 0.1% saponin (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo, USA) was treated for 15 minutes. After destroying the cells with 0.1% saponin, a colony forming unit assay (CFU assay) was performed on the 21st day after inoculating the intracellular viable bacteria on Middlebrook 7H10 agar medium.

5. 5. 광역학photodynamics 치료 cure

DH-I-180-3 과 CHLO-Cl은 DMSO (Dimethyl Sulfoxide)에 10 μg/ml (13.17 μM)이 되도록 용해하여 사용하였다. 각 실험군에 13.17 μM로 처리하였고 1시간 동안 배양하였다. 666nm의 파장에서 가장 높은 활성을 보여 제일 비슷한 660nm의 파장을 내보내는 할로겐 램프(Pray, XY-020)를 사용하여 빛을 조사하였다.DH-I-180-3 and CHLO-Cl were dissolved in DMSO (Dimethyl Sulfoxide) to 10 μg/ml (13.17 μM) and used. Each experimental group was treated with 13.17 μM and cultured for 1 hour. Light was irradiated using a halogen lamp (Pray, XY-020) that showed the highest activity at a wavelength of 666 nm and emits the most similar wavelength of 660 nm.

6. 세포 계수6. Cell counting

Raw 264.7 세포에 결핵균을 감염하거나 하지 않은 조건에서 광민감제 처리 및 광활성화 후 48 및 72시간에 세포 계수를 진행하였다. 세포 계수는 트리판 블루 배제 분석법으로 수행하였으며, 트리판 블루 (Sigma-Aldrich, steinheim, Germmany)로 염색한 후 hemacytometer 상에서 염색되지 않은 세포를 계수하였다.Raw 264.7 cells were counted at 48 and 72 hours after photosensitizer treatment and photoactivation under conditions with or without Mycobacterium tuberculosis infection. Cell counting was performed by trypan blue exclusion assay, and unstained cells were counted on a hemacytometer after staining with trypan blue (Sigma-Aldrich, steinheim, Germmany).

7. 7. 활성산소종reactive oxygen species 염색 분석 staining analysis

Raw 264.7 세포를 지름 18mm의 유리 커버슬립 (SPL lifesciences, Pocheon, Korea)을 넣은 12-웰 배양 플레이트에서 하루 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 시간별로 DCF-DA 염색을 진행하였다. 세포 내 활성산소종을 염색하기 위하여 H2DCF-DA (2',7'-dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Sigma)를 사용하였다. DCF-DA (dichlorofluorescein diacetate)가 세포 내로 들어가면 가수분해 반응에 의해 DCF-H (2',7'-dihydrodichlorofluorescein)로 전환되고, 이 물질은 활성산소종이 발생하는 곳에서 형광을 발하는 DCF (dichlorofluorescein)로 전환된다. 시간별로 DCF-DA 10 μM를 20분 동안 처리하였고, 핵을 염색하기 위해 DAPI (4'-6-Diamidino-2-phenylindole, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)를 5분 동안 처리하였다. DCF 형광 신호는 공초점현미경 (Olympus, FV1000 SPD, Tokyo, Japan)을 사용하여 측정하였다. Raw 264.7 cells were cultured in a 12-well culture plate containing 18 mm diameter glass coverslips (SPL lifesciences, Pocheon, Korea) for one day at 37° C., 5% CO 2 conditions. DCF-DA staining was performed by time. H 2 DCF-DA (2',7'-dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Sigma) was used to stain intracellular reactive oxygen species. When DCF-DA (dichlorofluorescein diacetate) enters the cell, it is converted to DCF-H (2',7'-dihydrodichlorofluorescein) by hydrolysis, and this substance is converted into DCF (dichlorofluorescein) that fluoresces where reactive oxygen species are generated. is converted Each time, 10 μM of DCF-DA was treated for 20 minutes, and DAPI (4'-6-Diamidino-2-phenylindole, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) was treated for 5 minutes to stain the nucleus. DCF fluorescence signal was measured using a confocal microscope (Olympus, FV1000 SPD, Tokyo, Japan).

8. 산화질소 생성8. Nitric Oxide Production

산화질소는 공기 중에서 수 분 내에 아질산염 이온 (nitrite ion)으로 산화되기 때문에 실제로는 아질산염의 농도를 측정하였다. 아질산염의 측정은 nitric oxide plus detection kit (Intron Bio- technology Inc., Seoul, Korea)를 사용하였다. Raw 264.7 세포에 결핵균 10 MOI를 감염시킨 후 아포시닌 (apocynin) 전처리와 광민감제의 광활성화를 유도한 실험조건에서 상청액을 1ml씩 수거하였다. 수거한 상청액을 96 웰 마이크로플레이트 (SPL #30096; SPL lifesciences, Pocheon, Korea)에 100 ml씩 옮긴 다음 N1 완충액을 50ml씩 처리하였다. 실온에서 10분 동안 반응시킨 후, N2 완충액 50ml을 첨가하였고, microplate reader (Biotek Instruments Inc., Powerwave XS, Wincoski, USA)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 정제된 아질산염을 희석하여 작성하였다.Since nitric oxide is oxidized to nitrite ions within a few minutes in air, the concentration of nitrite was actually measured. Nitric oxide plus detection kit (Intron Bio-technology Inc., Seoul, Korea) was used for the measurement of nitrite. After infecting Raw 264.7 cells with Mycobacterium tuberculosis 10 MOI, 1 ml of the supernatant was collected under experimental conditions in which apocynin pretreatment and photoactivation of a photosensitizer were induced. 100 ml of the collected supernatant was transferred to a 96-well microplate (SPL #30096; SPL lifesciences, Pocheon, Korea), and then treated with 50 ml of N1 buffer. After reacting at room temperature for 10 minutes, 50 ml of N2 buffer was added, and absorbance was measured at 540 nm using a microplate reader (Biotek Instruments Inc., Powerwave XS, Wincoski, USA). The standard curve was prepared by diluting purified nitrite.

9. 통계 분석9. Statistical Analysis

Raw 264.7 세포에 결핵균을 감염시킨 후 측정한 세포 수와 사이토카인, 활성산소종 생성 및 세포 내 박테리아의 수에서 유의성을 확인하기 위하여 Two-way ANOVA를 이용하여 통계처리 하였다. 95%의 신뢰수준에서 결과를 표시하였으며, 큰 유의성을 나타낸 실험군에 '*'로 표기하였다 (p<0.05, *, p<0.01, **, p<0.0005, ***, p<0.0001, ****).After infecting Raw 264.7 cells with Mycobacterium tuberculosis, statistical processing was performed using two-way ANOVA to confirm the significance in the number of cells, cytokines, reactive oxygen species production, and the number of intracellular bacteria. Results are displayed at the 95% confidence level, and the experimental group showing great significance is marked with '*' (p<0.05, *, p<0.01, **, p<0.0005, ***, p<0.0001, * ***).

결과 1. Result 1. CHLOCHLO -Cl 항균 활성 평가-Cl antibacterial activity evaluation

결핵균에 대한 CHLO-Cl의 세포독성을 알아보기 위하여 실험을 진행하였고 대조군으로 항결핵제로 사용되고 있는 리팜피신 (rifampicin; RIF)과 광민감제 DH-I-180-3을 사용하였다. 결핵균을 진탕배양하고 3일 후부터 광민감제를 24시간마다 7일 동안 처리하였고, 시약 처리 후 1시간 뒤에 1분 동안 광 활성화하였다. 실험은 광민감제만 처리한 실험군, 광 활성화를 한 번만 진행한 실험군, 매일 광 활성화를 1분 동안 진행한 실험군으로 나누어 진행하였다.Experiments were conducted to investigate the cytotoxicity of CHLO-Cl against Mycobacterium tuberculosis, and rifampicin (RIF), which is used as an anti-tuberculosis agent, and DH-I-180-3, a photosensitizer, were used as controls. Mycobacterium tuberculosis was cultured with shaking, and after 3 days, the photosensitizer was treated every 24 hours for 7 days, and 1 hour after the reagent treatment, light was activated for 1 minute. The experiment was carried out by dividing the experimental group in which only the photosensitizer was treated, the experimental group in which photoactivation was performed only once, and the experimental group in which photoactivation was performed for 1 minute every day.

실험 결과, 광 활성화를 하지 않고 광민감제만 처리한 군에서는 결핵균이 죽지 않고 생존하는 것을 관찰할 수 있었다 (도 1의 A). 반면, 광민감제 처리 후 광 활성화를 한 번만 진행한 실험군은 무처리 대조군과 비교하여 7일 차에 박테리아의 성장이 10배 감소한 것으로 나타났다 (도 1의 B). 매일 광민감제 처리와 광 활성화를 수행한 실험군은 무처리 대조군에 비해 박테리아 성장이 100배 감소하였다 (도 1의 C). 특히 매일 광 활성화한 군은 최초 광 활성화 후 3일째 되는 날 항결핵제인 리팜피신을 처리한 군과 거의 비슷하게 결핵균의 생장이 억제되었다 (도 1의 D). 또한, 광민감제로서 DH-I-180-3을 처리하고 광 활성화하는 경우 본 발명의 광민감제 CHLO-Cl을 처리하고 광 활성화한 실험군과 유사한 경향을 보였다 (도 1의 A-D).As a result of the experiment, it was observed that Mycobacterium tuberculosis did not die and survived in the group treated with only a photosensitizer without photoactivation (FIG. 1A). On the other hand, the experimental group, in which light activation was performed only once after the photosensitizer treatment, showed a 10-fold decrease in bacterial growth on the 7th day compared to the untreated control group (FIG. 1B). The experimental group subjected to daily photosensitizer treatment and photoactivation showed a 100-fold decrease in bacterial growth compared to the untreated control group (FIG. 1C). In particular, the daily photoactivation group inhibited the growth of Mycobacterium tuberculosis almost similarly to the group treated with rifampicin, an anti-tuberculosis agent, on the third day after the initial light activation (FIG. 1D). In addition, when DH-I-180-3 as a photosensitizer was treated and photoactivated, the experimental group treated with the photosensitizer CHLO-Cl of the present invention and photoactivated showed a similar trend (FIG. 1A-D).

결과 2. 결핵균에 감염된 Result 2. Infected with Mycobacterium tuberculosis 큰포식세포에서의in macrophages CHLOCHLO -Cl 세포 독성 측정-Cl cytotoxicity measurement

앞의 결과에서 결핵균에 CHLO-Cl 처리 후 광 활성화 시 박테리아 성장이 제어된다는 것을 발견하였다. 이번에는 결핵균에 감염된 큰포식세포에 CHLO-Cl을 처리했을 때 세포독성을 알아보기 위하여, 마우스의 큰포식세포주인 Raw 264.7에 결핵균을 10 MOI 감염시키고 광민감제를 1시간 동안 처리한 뒤 각 처리조건으로 광 활성화하고 48시간 뒤 트리판 블루 배재 분석을 진행하였다. In the previous results, it was found that bacterial growth was controlled upon photoactivation after CHLO-Cl treatment in Mycobacterium tuberculosis. This time, in order to examine the cytotoxicity of macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis (CHLO-Cl) treatment, 10 MOI of Mycobacterium tuberculosis was infected with Raw 264.7, a mouse macrophage cell line, and a photosensitizer was treated for 1 hour. After photo-activation, 48 hours later, trypan blue exclusion analysis was performed.

결핵균 감염 여부에 상관없이 무처리 대조군에서는 광 활성화에 따른 세포독성이 나타나지 않았다. DH-I-180-3을 처리한 실험군은 감염과 관계없이 5초만 광활성화를 시행하여도 무처리 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하게 세포 성장 억제가 나타났으며, 광 활성화 시간에 따라 세포독성이 나타났다. 반면, CHLO-Cl을 처리한 실험군은 광 활성화 처리시간에 관계없이 무처리 대조군과 비교하여 세포독성에서 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 이 경향은 감염시키지 않은 실험군 및 감염시킨 실험군 모두에서 동일하였다 (도 2의 A). 결론적으로, 기존에 알려져 있던 광민감제인 DH-I-180-3과 비교하여 결핵균에 감염되지 않거나 감염된 큰포식세포에서 본 발명의 광민감제 CHLO-Cl이 더 적은 세포독성을 나타내었다.Cytotoxicity according to photoactivation was not observed in the untreated control group regardless of whether or not the tuberculosis infection was present. The experimental group treated with DH-I-180-3 showed statistically significant inhibition of cell growth compared to the untreated control group even after photoactivation for only 5 seconds regardless of infection, and the cytotoxicity decreased according to the light activation time. appear. On the other hand, the experimental group treated with CHLO-Cl had no statistically significant difference in cytotoxicity compared to the untreated control group regardless of the light activation treatment time. This trend was the same in both the non-infected experimental group and the infected experimental group (FIG. 2A). In conclusion, compared to the previously known photosensitizer, DH-I-180-3, the photosensitizer CHLO-Cl of the present invention showed less cytotoxicity in macrophages not infected with Mycobacterium tuberculosis or infected macrophages.

결과 3. Result 3. CHLOCHLO -Cl 처리 후 광 활성화 시 세포 내 결핵균 제어-Control of Mycobacterium tuberculosis in cells during photoactivation after treatment with Cl

CHLO-Cl 처리 후 광 활성화는 항균 효과를 나타내며, 결핵균에 감염된 큰포식세포에서 세포독성이 낮은 것을 관찰할 수 있었다. 본 발명자들은 CHLO-Cl이 세포 내 박테리아의 생존에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. 결핵균 10 MOI를 감염시키고 광민감제 처리 및 광 활성화 48시간 뒤 세포 내 박테리아의 성장을 콜로니 형성 단위 분석법 (colony forming unit assay)으로 평가하였다.Photoactivation after CHLO-Cl treatment exhibited an antibacterial effect, and low cytotoxicity was observed in macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis. The present inventors tried to find out how CHLO-Cl affects the survival of bacteria in cells. Mycobacterium tuberculosis 10 MOI was infected, and the growth of bacteria in cells after 48 hours of photosensitizer treatment and photoactivation was evaluated by colony forming unit assay.

결핵균에 감염된 Raw264.7 세포에 광민감제인 DH-I-180-3 또는 CHLO-Cl을 처리하고 광 활성화하지 않았을 때 세포 내 박테리아 성장은 무처리 대조군과 비교하여 차이가 없었다. 그러나 광민감제 DH-I-180-3 또는 CHLO-Cl 처리 후 광 활성화 시 광 활성화 시간에 따라 세포 내 결핵균의 성장이 감소하였다 (도 3의 A). 그러나 DH-I-180-3의 광 활성화 시 나타나는 세포독성을 고려하여, CFU 분석을 통해 얻은 결과를 각 동일한 실험군의 살아있는 세포 수로 정규화한 결과, 광 활성화 없이 CHLO-Cl을 단독으로 처리한 경우 무처리 대조군과 비교하여 세포 내 박테리아 성장이 30% 감소하였고 5초 또는 20초 광 활성화 시 대조군과 비교하여 세포 내 박테리아 성장이 각각 4배, 5배 감소하였다. 반면, 결핵균에 감염된 Raw264.7 세포에 DH-I-180-3을 광 활성화 없이 단독 처리하거나, 5초 동안 광 활성화 시 무처리 대조군과 비교하여 세포 내 박테리아 성장에는 통계적으로 유의한 차이가 없었고 20초 동안 광 활성화 시 무처리 대조군과 비교하여 약 30배 증가하였다 (도 3의 B). When Raw264.7 cells infected with Mycobacterium tuberculosis were treated with photosensitizers DH-I-180-3 or CHLO-Cl and not photoactivated, there was no difference in intracellular bacterial growth compared to the untreated control group. However, the growth of Mycobacterium tuberculosis in cells decreased according to the light activation time upon photoactivation after treatment with the photosensitizer DH-I-180-3 or CHLO-Cl ( FIG. 3A ). However, considering the cytotoxicity of DH-I-180-3 during photoactivation, the results obtained through CFU analysis were normalized to the number of living cells in each same experimental group. Compared with the treatment control group, intracellular bacterial growth was reduced by 30%, and intracellular bacterial growth was reduced by 4 and 5 times, respectively, compared to the control, upon 5 sec or 20 sec light activation. On the other hand, there was no statistically significant difference in intracellular bacterial growth in Raw264.7 cells infected with Mycobacterium tuberculosis when treated with DH-I-180-3 alone without photoactivation or light activation for 5 seconds compared to the untreated control group 20 The light activation for seconds increased about 30-fold compared to the untreated control group (FIG. 3B).

결론적으로, Raw264.7 세포에서 DH-I-180-3 단독 처리 또는 DH-I-180-3 처리 후 광 활성화 시 세포 내 결핵균 제어효과가 없었지만, CHLO-Cl 단독처리 또는 CHLO-Cl 처리 후 광 활성화 시 세포 내 박테리아를 효과적으로 제어하는 것을 규명하였다.In conclusion, there was no effect of controlling intracellular Mycobacterium tuberculosis in Raw264.7 cells when photoactivation after DH-I-180-3 treatment or DH-I-180-3 treatment, but after treatment with CHLO-Cl alone or CHLO-Cl It was found to effectively control intracellular bacteria upon activation.

광민감제의 광 활성화에 따른 세포 내 결핵균 제어 효과가 필수적 사이토카인의 생산과 관련이 있는지 증명하기 위하여 Raw264.7 세포에 결핵균 (10 MOI)을 감염시키고 DH-I-180-3 또는 CHLO-Cl을 처리한 후 5초간 광 활성화하였다. 18시간 또는 24시간 후 세포를 배양한 상청액을 이용하여 각각 TNF-α와 IL-10의 농도를 ELISA 분석으로 평가하였다. 광민감제만 단독 처리한 실험군은 무처리 대조군과 비교하여 TNF-α의 분비에서 통계적으로 큰 차이가 없었다. 또한, DH-I-180-3 단독 처리 실험군과 DH-I-180-3 처리 후 광 활성화 실험군은 TNF-α의 분비에서 통계적으로 차이가 없었다. 반면, CHLO-Cl 단독 처리 실험군과 CHLO-Cl 처리 후 광 활성화 실험군은 통계적으로 유의한 차이가 있었으며, 특히 무처리 대조군과 비교하였을 때 TNF-α의 분비가 2배 증가하였다 (도 3의 C). 반면, 광 활성화 시행의 유무와 상관없이 DH-I-180-3 또는 CHLO-Cl 처리군에서는 IL-10의 분비가 모두 증가하였으며, DH-I-180-3 처리군보다 CHLO-Cl 처리군에서 결핵균 감염 시 IL-10의 분비가 증가하는 경향을 보였다 (도 3의 D).To prove whether the intracellular Mycobacterium tuberculosis control effect according to the photoactivation of the photosensitizer is related to the production of essential cytokines, Raw264.7 cells were infected with Mycobacterium tuberculosis (10 MOI) and DH-I-180-3 or CHLO-Cl After treatment, photoactivation was carried out for 5 seconds. After 18 hours or 24 hours, the concentrations of TNF-α and IL-10 were evaluated by ELISA analysis using the cell-cultured supernatant, respectively. The experimental group treated with only the photosensitizer had no statistically significant difference in the secretion of TNF-α compared to the untreated control group. In addition, there was no statistical difference in the secretion of TNF-α between the DH-I-180-3 treatment group and the photoactivation experimental group after DH-I-180-3 treatment. On the other hand, there was a statistically significant difference between the CHLO-Cl alone treatment group and the light activation experimental group after the CHLO-Cl treatment, and in particular, the secretion of TNF-α was doubled when compared to the untreated control group (Fig. 3C). . On the other hand, both IL-10 secretion increased in the DH-I-180-3 or CHLO-Cl treatment group regardless of the presence or absence of photoactivation, and in the CHLO-Cl treatment group than in the DH-I-180-3 treatment group. During infection with Mycobacterium tuberculosis, the secretion of IL-10 showed a tendency to increase (FIG. 3D).

결과 4. Result 4. CHLOCHLO -Cl의 처리에 기인한 Due to the treatment of -Cl ROSROS 생성 평가 generative evaluation

Raw264.7 cell에서 광민감제 처리 및 광활성화에 따른 세포 내 ROS 생성을 비교 분석하였다. 세포 내 ROS 양을 평가하기 위해 DCFDA staining을 수행하였다. Mtb 감염되지 않은 그룹은 DH-I-180-3 및 CHLO-Cl를 단독으로 처리만 해주면 세포 내 ROS가 무처리 대조군에 비해 증가하였다 (도 4).In Raw264.7 cells, intracellular ROS generation according to photosensitizer treatment and photoactivation was comparatively analyzed. DCFDA staining was performed to evaluate the amount of intracellular ROS. In the non-Mtb-infected group, when DH-I-180-3 and CHLO-Cl were treated alone, intracellular ROS increased compared to the untreated control group ( FIG. 4 ).

결과 5. Result 5. CHLOCHLO -Cl의 처리와 -Cl treatment and 광활성화에for photoactivation 따른 followed ROSROS 생산의 항결핵 효과 규명 Identification of the anti-tuberculosis effect of production

CHLO-Cl의 광활성화에 따른 세포 내 항결핵 효과가 ROS에 기인한 것인지 규명하기 위해 결핵균에 감염시킨 큰포식세포주 Raw264.7에 ROS scavanger 중 하나인 apocynin을 1시간 처리한 후 DH-I-180-3 및 CHLO-Cl를 광활성화한 후 48시간 뒤에 세포의 성장을 측정하였다. 그 결과 DH-I-180-3이 광활성화된 실험군은 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때 통계적으로 유의하게 큰포식세포의 성장이 감소하였으나 apocynin을 처리한 그릅은 세포의 성장 감소가 약화되었다 (도 5의 A). 또한, 아무것도 처리하지 않은 대조군과 CHLO-Cl이 광활성화된 실험군은 apocynin 처리와 상관없이 모두 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 따라서 DH-I-180-3을 광활성화 하였을 때 발생하는 세포 독성이 apocynin을 처리한 그룹에서 감소하였고 아무것도 처리하지 않은 대조군 그리고 CHLO-Cl을 광활성화한 그룹은 차이가 없었다.To investigate whether the intracellular anti-tuberculosis effect following photoactivation of CHLO-Cl is due to ROS, the macrophage cell line Raw264.7 infected with Mycobacterium tuberculosis was treated with apocynin, one of the ROS scavengers, for 1 hour, and then DH-I-180 Cell growth was measured 48 hours after photoactivation of -3 and CHLO-Cl. As a result, the experimental group in which DH-I-180-3 was photoactivated had a statistically significant decrease in macrophage growth compared to the control group that was not treated with anything. 5A). In addition, the control group untreated and the experimental group in which CHLO-Cl was photoactivated did not show any statistically significant difference regardless of apocynin treatment. Therefore, the cytotoxicity caused by photoactivation of DH-I-180-3 was reduced in the apocynin-treated group, and there was no difference between the untreated control group and the CHLO-Cl photoactivation group.

앞선 큰포식세포의 성장을 측정한 실험과 동일한 조건에서 DH-I-180-3 및 CHLO-Cl의 광활성화에 따른 세포 내 결핵균의 성장을 평가하였다. DH-I-180-3이 광활성화된 실험군에서는 대조군과 비교하였을 때 결핵균의 생존이 약 30%, CHLO-Cl이 광활성화된 실험군에서는 약 50% 감소하였으며 apocynin을 처리한 실험군과 광민감제가 광활성화만 유도된 실험군과 비교하였을 때 DH-I-180-3 및 CHLO-Cl의 광활성화된 실험군 모두 통계적으로 유의하게 결핵균의 성장이 증가하였다 (도 5의 B). 또한, 동일한 실험조건에서 생존한 큰포식세포의 수를 이용하여 정규화하였을 때 무처리 대조군과 비교하여 DH-I-180-3을 광활성화한 실험군들은 apocynin의 처리와 상관없이 모두 통계적으로 유의한 차이가 없었으며 CHLO-Cl를 광활성화한 그룹은 apocynin을 처리하였을 때 처리하지 않은 그룹과 비교하여 통계적으로 결핵균의 성장이 증가하였다. 따라서 CHLO-Cl의 광활성화에 따른 ROS의 생성이 세포 내 결핵균의 제어에 영향이 있음을 검증하였다.The growth of Mycobacterium tuberculosis in cells according to the photoactivation of DH-I-180-3 and CHLO-Cl was evaluated under the same conditions as in the previous experiment measuring the growth of macrophages. In the experimental group in which DH-I-180-3 was photoactivated, the survival of Mycobacterium tuberculosis was reduced by about 30% compared to the control group, and by about 50% in the experimental group in which CHLO-Cl was photoactivated. Compared with the activation-induced experimental group, both the photo-activated experimental groups of DH-I-180-3 and CHLO-Cl showed a statistically significant increase in the growth of Mycobacterium tuberculosis (FIG. 5B). In addition, when normalized using the number of macrophages surviving under the same experimental conditions, the experimental groups photoactivated with DH-I-180-3 compared to the untreated control group showed a statistically significant difference regardless of the treatment with apocynin. The growth of Mycobacterium tuberculosis was statistically increased in the group in which CHLO-Cl was photoactivated compared to the group in which apocynin was not treated. Therefore, it was verified that the generation of ROS according to the photoactivation of CHLO-Cl had an effect on the control of Mycobacterium tuberculosis in the cell.

결과 6. Result 6. CHLOCHLO -Cl의 처리 및 -Cl treatment and 광활성화photoactivation 시 city ROSROS 생성의 증가에 따른 사이토카인 분비 규명 Identification of cytokine secretion according to the increase in production

CHLO-Cl의 처리 혹은 광활성화에 따른 사이토카인의 분비의 증가가 ROS에 기인한 것인지 규명하기 위해 ELISA로 사이토카인 분비를 평가하였다. CHLO-Cl의 광활성화에 기인하여 Mtb에 감염된 큰포식세포에서 TNF-α의 분비가 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 50% 증가하였으며 apocynin을 처리한 그룹은 CHLO-Cl이 광활성화가 된 그룹과 비교하여 통계적으로 유의하게 TNF-α의 분비가 감소된 반면 아무것도 처리하지 않은 실험군과, DH-I-180-3이 광활성화가 된 그룹은 ROS scavanging에 의한 TNF-α 분비가 감소되는 경향이 있었지만 통계적으로 유의한 차이가 없었다 (도 6의 A). To determine whether the increase in cytokine secretion following treatment with CHLO-Cl or photoactivation is due to ROS, cytokine secretion was evaluated by ELISA. Due to the photoactivation of CHLO-Cl, the secretion of TNF-α from macrophages infected with Mtb increased by 50% compared to the control group untreated. In comparison, while the secretion of TNF-α was decreased statistically significantly, the experimental group untreated and the group in which DH-I-180-3 was photoactivated tended to decrease TNF-α secretion by ROS scavanging. There was no statistically significant difference (FIG. 6A).

IL-10의 분비는 DH-I-180-3 및 CHLO-Cl의 광활성화 실험군에서 무처리 대조군과 비교하여 각각 4배, 10배 증가하였고 CHLO-Cl 및 광활성화 실험군이 DH-I-180-3 및 광활성화 실험군과 비교하여 약 2.5배 정도 증가하였다. 반면, ROS scavanging에 의해 CHLO-Cl 및 광활성화 실험군에서 IL-10의 분비가 통계적으로 유의하게 감소하였으며 DH-I-180-3 및 광활성화 실험군에서는 차이가 없었다 (도 6의 B). The secretion of IL-10 was increased 4 times and 10 times, respectively, in the light activation experimental group of DH-I-180-3 and CHLO-Cl compared to the untreated control group, and in the CHLO-Cl and light activation experimental group, the DH-I-180- 3 and the photoactivation test group increased by about 2.5 times. On the other hand, the secretion of IL-10 was statistically significantly decreased in the CHLO-Cl and light activation experimental groups by ROS scavanging, and there was no difference in the DH-I-180-3 and light activation experimental groups ( FIG. 6B ).

마지막으로 광민감제 CHLO-Cl 처리 및 광 활성화가 세포 내 결핵균 제어에 필수적인 분자인 산화질소의 생성에 영향이 있는지 확인하고자 griess assay로 평가하였다. DH-I-180-3의 광활성화에 따라 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때 산화질소의 생성이 통계적으로 유의하게 감소하였으며, CHLO-Cl은 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 반면, ROS scavanging에 의해 대조군과 CHLO-Cl 및 광활성화 실험군에서 산화질소 생성이 통계적으로 유의하게 감소하였으며 DH-I-180-3 및 광활성화 실험군은 apocynin의 처리 유무와 관계없이 차이가 없었다 (도 6의 C).Finally, the photosensitizer CHLO-Cl treatment and photoactivation were evaluated by griess assay to determine if they had an effect on the production of nitric oxide, a molecule essential for intracellular Mycobacterium tuberculosis control. According to the photoactivation of DH-I-180-3, the production of nitric oxide was significantly reduced compared to the control group not treated with anything, and there was no statistically significant difference in CHLO-Cl. On the other hand, nitric oxide production was statistically significantly decreased in the control group, CHLO-Cl and photoactivation experimental groups by ROS scavanging, and there was no difference between the DH-I-180-3 and photoactivation experimental groups with or without apocynin treatment (Fig. 6, C).

이로부터 CHLO-Cl 처리 후 광활성화에 기인한 활성산소종 생성이 사이토카인의 분비를 증가시키고, 산화질소 생성이 감소하는 것을 확인하였다.From this, it was confirmed that the generation of reactive oxygen species due to photoactivation after treatment with CHLO-Cl increased the secretion of cytokines and decreased the production of nitric oxide.

도 7은 광민감제 CHLO-Cl 처리 후 광 활성화한 경우 각 결핵균주 (H37Rv, MDR 균주인 ST065, XDR 균주인 M0012859)의 성장이 감소하였음을 보여준다.7 shows that the growth of each Mycobacterium tuberculosis strain (H37Rv, MDR strain ST065, XDR strain M0012859) was reduced in the case of photoactivation after treatment with the photosensitizer CHLO-Cl.

Claims (17)

아래 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 CHLO-Cl.
<화학식 1>
Figure pat00003

A novel compound CHLO-Cl represented by Formula 1 below.
<Formula 1>
Figure pat00003

 세포에 아래 화학식 1로 표시되는 광민감제 CHLO-Cl을 처리하는 단계; 및
상기 광민감제 CHLO-Cl을 활성화하기 위하여 광선을 조사하는 단계;를 포함하는 세포 내 병원균 활성 억제방법.
<화학식 1>
Figure pat00004

treating the cells with the photosensitizer CHLO-Cl represented by Formula 1 below; and
Intracellular pathogen activity inhibition method comprising; irradiating light to activate the photosensitizer CHLO-Cl.
<Formula 1>
Figure pat00004

 청구항 2에 있어서,
상기 병원균은 바이러스, 박테리아, 원생동물, 프라이온, 바이로이드 또는 진균인, 세포 내 병원균 활성 억제방법.
3. The method according to claim 2,
The pathogen is a virus, bacteria, protozoa, prion, viroid or fungus, a method for inhibiting the activity of pathogens in cells.
 청구항 2에 있어서,
상기 병원균은 마이코박테리움, 마이코플라스마, 톡소플라스마, 리스테리아 또는 살모넬라인, 세포 내 병원균 활성 억제방법.
3. The method according to claim 2,
The pathogen is Mycobacterium, Mycoplasma, Toxoplasma, Listeria or Salmonella, a method for inhibiting the activity of pathogens in cells.
 청구항 4에 있어서,
상기 병원균은 마이코박테리움인, 세포 내 병원균 활성 억제방법.
5. The method according to claim 4,
The pathogen is Mycobacterium, a method for inhibiting the activity of pathogens in cells.
 청구항 5에 있어서,
상기 마이코박테리움은 다제 내성 결핵균 (Multi drug resistance tuberculosis) 또는 광범위 약제 내성 결핵균 (Extreme drug resistance tubersulosis)인, 세포 내 병원균 활성 억제방법.
6. The method of claim 5,
The mycobacterium is a multi-drug resistance tuberculosis (Multi drug resistance tuberculosis) or broad-spectrum drug resistance tuberculosis (Extreme drug resistance tubersulosis), the method for inhibiting the activity of pathogens in cells.
 청구항 2에 있어서,
상기 광선은 650 ~ 670 nm 파장인, 세포 내 병원균 활성 억제방법.
3. The method according to claim 2,
The light is 650 ~ 670 nm wavelength, the method for inhibiting the activity of pathogens in cells.
 청구항 2에 있어서,
상기 CHLO-Cl은 1~50 μg/ml 농도로 사용하는, 세포 내 병원균 활성 억제방법.
3. The method according to claim 2,
The CHLO-Cl is used at a concentration of 1-50 μg/ml, a method for inhibiting intracellular pathogen activity.
 아래 화학식 1로 표시되는 광민감제 CHLO-Cl를 포함하는 항균성 약학 조성물.
<화학식 1>
Figure pat00005

An antibacterial pharmaceutical composition comprising the photosensitizer CHLO-Cl represented by Formula 1 below.
<Formula 1>
Figure pat00005

 청구항 9에 있어서,
표적화 제제 (targeting agent)를 더 포함하는 항균성 약학 조성물.
10. The method of claim 9,
An antimicrobial pharmaceutical composition further comprising a targeting agent.
 청구항 10에 있어서,
상기 표적화 제제는 항-큰포식세포 염증 단백질 항체인, 항균성 약학 조성물.
11. The method of claim 10,
The targeting agent is an anti-macrophage inflammatory protein antibody, antibacterial pharmaceutical composition.
 청구항 9에 있어서,
상기 조성물은 바이러스, 박테리아, 원생동물, 프라이온, 바이로이드 또는 진균에 대해 사용하는, 항균성 약학 조성물.
10. The method of claim 9,
The composition is used against viruses, bacteria, protozoa, prions, viroids or fungi, antibacterial pharmaceutical composition.
 청구항 9에 있어서,
상기 조성물은 마이코박테리움, 마이코플라스마, 톡소플라스마, 리스테리아 또는 살모넬라에 대해 사용하는, 항균성 약학 조성물.
10. The method of claim 9,
The composition is used against Mycobacterium, Mycoplasma, Toxoplasma, Listeria or Salmonella, an antibacterial pharmaceutical composition.
 청구항 9에 있어서,
상기 조성물은 마이코박테리움에 대해 사용하는, 항균성 약학 조성물.
10. The method of claim 9,
The composition is used against Mycobacterium, an antibacterial pharmaceutical composition.
 청구항 14에 있어서,
상기 마이코박테리움은 다제 내성 결핵균 (Multi drug resistance tuberculosis) 또는 광범위 약제 내성 결핵균 (Extreme drug resistance tubersulosis)인, 항균성 약학 조성물.
15. The method of claim 14,
The Mycobacterium is a multi-drug-resistant tuberculosis (Multi drug resistance tuberculosis) or broad-spectrum drug-resistant tuberculosis (Extreme drug resistance tubersulosis), the antibacterial pharmaceutical composition.
 아래 화학식 1로 표시되는 광민감제 CHLO-Cl를 포함하는 항균 소독제 조성물.
<화학식 1>
Figure pat00006

An antibacterial disinfectant composition comprising the photosensitizer CHLO-Cl represented by Formula 1 below.
<Formula 1>
Figure pat00006

 청구항 16에 있어서,
상기 항균 소독제 조성물은 의료용인 것을 특징으로 하는, 항균 소독제 조성물.
17. The method of claim 16,
The antibacterial disinfectant composition is for medical use, characterized in that the antibacterial disinfectant composition.
KR1020210007212A 2021-01-19 2021-01-19 Novel chlorin derivative CHLO-Cl and a method of inhibiting pathogen growth using it KR102498774B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210007212A KR102498774B1 (en) 2021-01-19 2021-01-19 Novel chlorin derivative CHLO-Cl and a method of inhibiting pathogen growth using it

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210007212A KR102498774B1 (en) 2021-01-19 2021-01-19 Novel chlorin derivative CHLO-Cl and a method of inhibiting pathogen growth using it

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220104880A true KR20220104880A (en) 2022-07-26
KR102498774B1 KR102498774B1 (en) 2023-02-09

Family

ID=82609786

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210007212A KR102498774B1 (en) 2021-01-19 2021-01-19 Novel chlorin derivative CHLO-Cl and a method of inhibiting pathogen growth using it

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102498774B1 (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100484206B1 (en) 2003-01-16 2005-04-20 주식회사 테크노마트 Porphyrin derivatives
KR101265525B1 (en) 2010-11-12 2013-05-21 서울대학교병원 (분사무소) Method for inhibiting activity of Mycobacterium tuberculosis by photodynamic therapy

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100484206B1 (en) 2003-01-16 2005-04-20 주식회사 테크노마트 Porphyrin derivatives
KR101265525B1 (en) 2010-11-12 2013-05-21 서울대학교병원 (분사무소) Method for inhibiting activity of Mycobacterium tuberculosis by photodynamic therapy

Non-Patent Citations (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
<KCDC Korean Guidelines for Tuberculosis 2019>
<World Health Organization. 2018. Global Tuberculosis Report 2018. WHO>
Abdalla, A.E. et al., Int J Biol Sci 12, 710-717 (2016)
Arbues, A. et al., Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 4 (2014)
Bai, X. et al. PLoS One 8, e61925 (2013)
da Silva, F.D.C. et al. Int J Tuberc Lung D 23, 212-+ (2019)
Dai, T. et al. Antimicrob Agents Chemother 53, 3929-3934 (2009)
Domingo-Gonzalez, R. et al., Microbiol Spectr 4 (2016)
Eisenhut, M. Jmir Res Protoc 8 (2019)
Fallahi-Sichani, M. et al., Front Physiol 3, 170 (2012)
Fang, Y. et al., Sci Rep 6, 28357 (2016)
Fox, G.J. et al. Clin Microbiol Infect 23, 147-153 (2017)
Gopalakrishnan, A. et al., Infect Immun 87 (2019)
Gordon, S.V. & Parish, T. Microbiology 164, 437-439 (2018)
H. SCHEE 등, Photochemistry and Photobiology, 1986, 제43권, 페이지 559~571 *
Kashef, N. et al., Photodiagnosis Photodyn Ther 9, 11-15 (2012)
Kim, Y.R. & Yang, C.S. J Microbiol Biotechn 27, 1549-1558 (2017)
Lim, D.S. et al., Photochem Photobiol 82, 600-605 (2006)
Liu, Y. et al., J Clin Transl Res 1, 140-167 (2015)
Mukhopadhyay, S. et al. J Exp Med 217 (2020)
Park, J.H. et al. Int J Pharm 491, 393-401 (2015)
Peng, Q. et al., Ultrastruct Pathol 20, 109-129 (1996)
Redford, P.S. et al., Mucosal Immunol 4, 261-270 (2011)
Schastak, S. et al., Plos One 5 (2010)
Sepehri, Z. et al., Lab Med 50, 117-129 (2019)
Sung, N. et al. Photodiagnosis Photodyn Ther 10, 694-702 (2013)
Wang, Z.Q. et al., Immunology 102, 331-337 (2001)
Xuan, W. et al. Sci Rep 8, 17130 (2018)
Yu, Y. et al. PLoS One 7, e44944 (2012)
Yun, H.Y. et al., Crit Rev Neurobiol 10, 291-316 (1996)

Also Published As

Publication number Publication date
KR102498774B1 (en) 2023-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Roatt et al. Recent advances and new strategies on leishmaniasis treatment
Dong et al. Synergistic photoactivated antimicrobial effects of carbon dots combined with dye photosensitizers
Mihu et al. Novel therapies for treatment of multi-drug resistant Acinetobacter baumannii skin infections
Miller et al. Design, synthesis, and study of a mycobactin− artemisinin conjugate that has selective and potent activity against tuberculosis and malaria
Ali et al. Identification and characterization of antibacterial compound (s) of cockroaches (Periplaneta americana)
Maisch et al. Antibacterial photodynamic therapy in dermatology
Kawczyk-Krupka et al. Photodynamic therapy as an alternative to antibiotic therapy for the treatment of infected leg ulcers
Miyabe et al. Effect of photodynamic therapy on clinical isolates of Staphylococcus spp
Ma et al. The effects of aloe emodin-mediated antimicrobial photodynamic therapy on drug-sensitive and resistant Candida albicans
Mu et al. Cationic Polysaccharide Conjugates as Antibiotic Adjuvants Resensitize Multidrug‐Resistant Bacteria and Prevent Resistance
Grinholc et al. Bactericidal effect of photodynamic therapy against methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain with the use of various porphyrin photosensitizers.
Guterres et al. Preliminary evaluation of the positively and negatively charge effects of tetra-substituted porphyrins on photoinactivation of rapidly growing mycobacteria
Pérez et al. Photodynamic therapy for treatment of Staphylococcus aureus infections
US20150141415A1 (en) Methionine Aminopeptidase Inhibitors for Treating Infectious Diseases
EP2616065A1 (en) Glyco-substituted dihydroxy-chlorins and b-functionalized chlorins for anti-microbial photodynamic therapy
Faridnia et al. Investigating in vitro anti-leishmanial effects of silibinin and silymarin on Leishmania major
Abgottspon et al. In vivo Evaluation of FimH Antagonists–A Novel Class of Antimicrobials for the Treatment of Urinary Tract Infection
Wang et al. Aloe-emodin-mediated antimicrobial photodynamic therapy against multidrug-resistant Acinetobacter baumannii: An in vivo study
Chavas et al. A macrophage-targeted platform for extending drug dosing with polymer prodrugs for pulmonary infection prophylaxis
KR102498774B1 (en) Novel chlorin derivative CHLO-Cl and a method of inhibiting pathogen growth using it
WO2011032000A2 (en) Method for protection of antimicrobial and anticancer drugs from inactivation by nitric oxide
US6423741B1 (en) Anti-microbial composition and method for producing the same
Zhang et al. Green synthesis of Chlorin e6 and tests of its photosensitive bactericidal activities
Pourhajibagher et al. Evaluation of photodynamic therapy effect along with colistin on pandrug-resistant Acinetobacter baumannii
US20180312473A1 (en) Phenazine derivatives as antimicrobial agents

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant