KR20220101795A - 우레아제 검출 비색 센서 - Google Patents

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Abstract

본원은 기질 및 효소를 포함하는 용액을 형성하는 단계, 환원제 및 금속 전구체를 상기 용액 상에 투입하여 상기 금속 전구체를 금속 나노 입자로 환원시키는 단계, 및 상기 금속 나노 입자를 포함하는 용액의 색(color)이 변화하는 단계를 포함하는, 효소의 검출 방법에 관한 것이다.

Description

우레아제 검출 비색 센서 {COLORIMETRIC SENSOR FOR DETECTING UREASE}
본원은 우레아제 검출 비색 센서에 관한 것이다.
효소는 단백질 분자와 결합하여, 단백질 분자의 크기를 줄일 수 있도록 활성화에너지를 낮추는 생체 촉매의 일종을 의미한다. 이러한 효소는 일반적으로 박테리아, 식물, 곰팡이, 인체, 토양 등에서 미생물 또는 세포에 의해 합성될 수 있다.
예를 들어, 효소에는 인체 내에서 독성이 약해지도록 변환된 우레아(urea, 요소, CO(NH2)2)를 암모니아(NH3) 로 분해하는 우레아제(urease)등이 있다. 그러나, 상기 우레아제는 카테터 관련 요로 감염 확인의 지표가 되고, 토양 내의 우레아제는 질소 비료의 우레아를 NH3 및 CO2 로 분해하여 토양 및 대기를 오염시킬 수 있다.
따라서, 토양에 비료를 주기 전, 카테터를 삽입 후 해당부위의 우레아제 함량을 측정할 필요가 있다. 종래에는 크로마토그래피, 모세관 전기영동, ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), 전기화학적 방법 등을 통해 우레아제의 함량을 측정하였으나, 이들은 구조가 복잡하거나, 측정의 민감도가 낮거나, 또는 검출에 오랜 시간이 소요되는 단점이 존재한다.
본원의 배경이 되는 기술인 논문(H.-H. Deng, G.-L. Hong, F.-L. Lin, A.-L. Liu, X.-H. Xia, W. Chen, Colorimetric detection of urea, urease, and urease inhibitor based on the peroxidase-like activity of gold nanoparticles, Analytica Chimica Acta (2016), doi: 10.1016/j.aca.2016.02.008)은 우레아, 우레아제, 금 나노 입자 촉매, 및 우레아제 억제제를 통해 비색 검출하는 방법을 나타낸 논문이다. 그러나, 상기 논문은 은 나노 입자를 사용하는 방법을 인식하지 못하고 있다.
본원은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 민감하고, 단순한 방법으로 우레아제를 검출하기 위해 우레아제 검출 비색 센서에 적용될 수 있는 효소의 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다
또한, 본원은 상기 효소의 검출 방법을 이용한 효소 검출 센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.
다만, 본원의 실시예가 이루고자 하는 기술적 과제는 상기된 바와 같은 기술적 과제들로 한정되지 않으며, 또 다른 기술적 과제들이 존재할 수 있다.
상기한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본원의 제1 측면은 기질 및 효소를 포함하는 용액을 형성하는 단계, 환원제 및 금속 전구체를 상기 용액 상에 투입하여 상기 금속 전구체를 금속 나노 입자로 환원시키는 단계, 및, 상기 금속 나노 입자를 포함하는 용액의 색(color)을 분석하는 단계를 포함하는, 효소의 검출 방법을 제공한다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 효소는 우레아제(urease)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 효소는 상기 기질의 분해를 촉진시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 기질의 분해에 의해 상기 용액의 pH 가 증가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 용액은 상기 효소의 억제제(inhibitor)를 추가 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 용액의 색은, 상기 금속 나노 입자의 농도에 따라 변화할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 금속 전구체 및 상기 금속 나노 입자는 각각 독립적으로 Ag, Au, Cu, Pt, Pd, Ni, Co, Fe, Mn, Cr, V, Ti, 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 환원제는 탄닌산(tannic acid), NaOH, KOH, N2H4, Na2HPO4, 디메틸포름아미드(dimethylformamide), 테트라부틸암모늄(tetrabutyl ammonium), NaBH4, LiBH4, 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제2 측면은 효소 검출 센서에 대한 것으로서, 효소 및 기질을 반응시키는 반응부, 및 상기 반응부에 환원제 및 금속 전구체를 포함하는 용액을 주입하는 주입부를 포함하는, 효소 검출 센서를 제공한다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 기질의 농도는 0 mM 초과 50 mM이하 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 환원제의 농도는 0.001 mg/ml 내지 0.1 mg/ml 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 금속 전구체의 농도는 10 mM 내지 1,000 mM 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본원을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시 적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.
전술한 본원의 과제 해결 수단에 의하면, 본원에 따른 효소의 검출 방법은 종래의 효소 검출 방법에 비해 0.0048 U/ml의 낮은 검출 한계(Limit of detection)를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본원에 따른 효소의 검출 방법은 토양에 존재하거나, 카테터를 사용하였을 때 해당 부위의 감염이 발생한 경우 존재할 수 있는 우레아제와 같은 효소를 검출하기 위한 것으로서, 효소와 기질의 반응을 통해 금속 나노 입자의 생성을 촉진시키고, 상기 금속 나노 입자에 의한 색의 변화를 통해 효소의 농도 또는 함량을 확인할 수 있어 간단한 구조를 가질 수 있다.
다만, 본원에서 얻을 수 있는 효과는 상기된 바와 같은 효과들로 한정되지 않으며, 또 다른 효과들이 존재할 수 있다.
도 1 은 본원의 일 구현예에 따른 효소의 검출 방법을 나타낸 메커니즘의 모식도이다.
도 2는 본원의 일 구현예에 따른 효소의 검출 방법에 관련한 그래프이다.
도 3의 (a) 내지 (e)는 본원의 일 실시예에 따른 효소의 검출 방법의 그래프이다.
도 4의 (a) 및 (b)는 본원의 일 실시예에 따른 효소의 검출 방법의 그래프이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 효소의 검출 방법에 억제제를 사용하였을 때의 그래프이다.
도 6의 (a)는 본원의 일 실시예에 따른 효소의 검출 방법의 사진이고, (b)는 본원의 일 실시예에 따른 효소의 검출 방법의 그래프이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다.
그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우 뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 "전기적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에", "상부에", "상단에", "하에", "하부에", "하단에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 본원 명세서 전체에서, "~ 하는 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는, A 및 B"를 의미한다.
이하에서는 본원의 우레아제 검출 비색 센서에 적용될 수 있는, 효소 검출 방법 및 이를 이용한 센서에 대하여, 구현 예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나 본원이 이러한 구현 예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.
상기한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본원의 제1 측면은 기질 및 효소를 포함하는 용액을 형성하는 단계, 환원제 및 금속 전구체를 상기 용액 상에 투입하여 상기 금속 전구체를 금속 나노 입자로 환원시키는 단계, 및 상기 금속 나노 입자를 포함하는 용액의 색(color)을 분석하는 단계를 포함하는, 효소의 검출 방법을 제공한다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 효소는 우레아제(urease)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 효소는 상기 기질의 분해를 촉진시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 기질은 우레아(urea)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 기질의 분해에 의해 상기 용액의 pH 가 증가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
효소는 일정한 온도 및 pH 조건에서 기질과 결합하여 상기 기질의 분해 속도를 향상시키는 생체 촉매의 일종을 의미한다. 이러한 효소는 기질 특이성을 가져, 하나의 효소는 하나의 기질과 선택적으로 결합될 수 있다.
예를 들어 상기 기질이 우레아고, 상기 효소가 우레아제일 경우, 우레아 및 우레아제를 포함하는 용액은 pH 가 서서히 증가할 수 있다. 구체적으로, 우레아제 효소에 의해 우레아가 상온에서 분해될 수 있어 CO2 및 NH3를 형성할 수 있고, 상기 NH3는 용액 상에 녹아 상기 용액의 pH를 증가시킬 수 있다.
후술하겠지만, 우레아제 및 우레아의 농도에 따라 우레아제 및 우레아의 반응에 의해 생성되는 NH3의 양이 상이할 수 있고, 이에 따라 용액의 pH 가 증가되는 정도가 상이할 수 있으며, 상기 용액의 pH 가 증가하면 상기 환원제의 환원력이 증가할 수 있다. 즉, 상기 우레아제 및 우레아의 농도에 따라 환원제의 환원력의 증가폭이 달라져 상기 금속 전구체가 환원되는 정도가 상이할 수 있고, 상기 금속 전구체가 환원되어 형성된 상기 금속 나노 입자의 농도에 따라 상기 용액의 색이 변화하기 때문에, 상기 용액의 색이나, 또는 상기 용액을 UV-vis 기법으로 측정하면 상기 용액 내의 Ag 나노 입자의 농도를 측정할 수 있고, 이를 통해 우레아제의 농도를 정량화 할 수 있다.
구체적으로, 우레아가 일정 농도로서 존재할 경우, 우레아제의 농도가 증가할수록 용액의 색이 갈색에 가까워질 수 있으나, 우레아가 저 농도로서 존재할 경우 색변화에 한계가 존재할 수 있다. 또한, 우레아제의 농도에 따라 분해될 수 있는 우레아의 농도가 한정되어 있기 때문에, 일정 시간이 경과하면 우레아제의 활성이 감소할 수 있다.
또한, 상기 우레아제의 농도가 일정 농도 이상이어야 상기 우레아와 우레아제 사이에서 분해 반응이 발생할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 환원제는 탄닌산(tannic acid), NaOH, KOH, N2H4, Na2HPO4, 디메틸포름아미드(dimethylformamide), 테트라부틸암모늄(tetrabutyl ammonium), NaBH4, LiBH4, 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 환원제는 탄닌산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 금속 전구체 및 상기 금속 나노 입자는 각각 독립적으로 Ag, Au, Cu, Pt, Pd, Ni, Co, Fe, Mn, Cr, V, Ti, 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 금속 전구체는 AgNO3 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이 때, 상기 기질이 우레아(urea)일 경우, 상기 효소는 우레아제(urease) 일 수 있으나, 상기 우레아와 상기 우레아제의 반응은 NH3를 생성시키고, 상기 탄닌산을 포함하는 용액의 pH를 증가시킬 수 있다. 시료 내의 우레아제의 농도 또는 함량이 많을수록 더 많은 양의 NH3가 형성되고, 이로 인해 탄닌산의 환원력이 증가하여 더 많은 Ag 나노 입자가 생성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이 때, Ag 나노 입자의 농도에 따라 상기 용액의 색이 변화될 수 있고, 상기 용액의 색 또는 상기 Ag 나노 입자의 농도를 UV-vis을 이용해 측정하면, 상기 Ag 나노 입자의 농도를 측정할 수 있고, 이를 통해 상기 우레아제의 농도를 정량화 할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 용액의 색은, 상기 금속 나노 입자의 농도에 따라 변화할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 금속 나노 입자가 Ag 나노 입자일 경우, 상기 용액은 무색(Ag 나노 입자가 없음)에서 노란색으로 변화한 후, 상기 Ag 나노 입자의 농도에 따라 갈색으로 변화할 수 있다.
상기 효소의 검출 방법은, 효소를 포함하는 용액을 기질, 환원제, 및 금속 전구체를 일정한 농도로서 포함하는 용액과 반응시키는 것으로서, 기질 및 효소의 반응에 의해 상기 용액의 pH 가 증가하고, 상기 용액의 pH 증가에 의해 상기 환원제의 환원력이 증가하며, 상기 환원제에 의해 금속 전구체가 금속 나노 입자로 환원되면, 상기 용액 상에서 상기 금속 나노 입자의 농도에 따라 상기 용액의 색이 변화하는 것을 통해 상기 효소의 농도를 추정할 수 있다.
도 2는 본원의 일 구현예에 따른 효소의 검출 방법에 관련한 그래프이다. 구체적으로, 도 2는 환원제를 대표하는 TA(Tannic acid, 탄닌산), 금속 전구체를 대표하는 AgNO3, 기질을 대표하는 우레아(urea), 효소를 대표하는 우레아제(Urease) 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 용액이 특정 파장의 빛을 얼마나 흡수할 수 있는지 나타낸 그래프이다.
도 2를 참조하면, 탄닌산과 AgNO3를 혼합한 용액(SS)에 NH3 또는 우레아 및 우레아제를 첨가하면, 약 400 nm의 동일한 영역에서 흡광도를 확인할 수 있으므로, 상기 SS에 첨가된 우레아 및 우레아제는 NH3 와 같은 역할을 수행함을 확인할 수 있다. 구체적으로, 상기 SS에 첨가된 NH3는 SS 내의 탄닌산이 Ag+ 이온을 Ag 나노 입자로 환원시킬 수 있는 환경을 조성하거나 또는 탄닌산의 환원력을 향상시킬 수 있으므로, 상기 SS 용액에 우레아 및 우레아제를 첨가하면 유레아 및 우레아제의 반응에 의해 NH3 가 형성되어 상기 SS 용액의 탄닌산이 Ag+ 이온을 Ag 나노 입자로 환원시킬 수 있는 환경을 조성하거나 또는 탄닌산의 환원력을 향상시킬 수 있고, 이로 인해 의해 상기 SS 용액 내의 Ag+ 이온이 환원되어 Ag 나노 입자가 형성될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 용액의 색은 육안에 의해 비교되거나, 또는 RGB 분석될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상술하였듯 상기 용액의 색은 상기 기질, 효소, 및 환원제에 의해 상기 금속 전구체가 환원되어 형성된 금속 나노 입자의 농도에 따라 변화될 수 있다.
상기 금속 나노 입자의 농도가 클수록 상기 용액의 색은 갈색에 가까워지기 때문에, 상기 용액의 색을 통해 상기 효소의 농도를 추정하는 것이 가능하다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 용액은 상기 효소의 억제제를 추가 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 따른 억제제는 기질을 분해시키는 효소의 활성을 억제하는 물질을 의미한다.
예를 들어, 상기 억제제는 acetohydroxamic acid 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 기질이 우레아고, 효소가 우레아제일 경우, 우레아와 우레아제의 반응에 의해 발생할 수 있는 문제를 해결하기 위해 토양에 억제제(예를 들어 acetohydroxamic acid)를 사용한 후 우레아제의 검출을 시도하여 상기 우레아제의 검출이 잘 진행되는지 확인할 수 있다. 이 때, 억제제의 농도가 증가할수록 상기 우레아제의 검출 반응은 억제될 수 있다.
본원의 제2 측면은 효소 검출 센서에 대한 것으로서, 기질 및 효소를 반응시키는 반응부, 및 상기 반응부에 환원제 및 금속 전구체를 포함하는 용액을 주입하는 주입부를 포함하는, 효소 검출 센서를 제공한다.
이와 관련하여, 상기 효소 검출 센서가 상기 효소의 농도를 측정하는 원리는 상기 제1 측면에서 효소를 검출하는 방법과 동일한 원리일 수 있다.
구체적으로, 제2 측면의 반응부는 상기 제 1 측면의 용액을 포함할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 환원제의 농도는 0.001 mg/ml 내지 0.1 mg/ml 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 환원제의 농도는 약 0.001 mg/ml 내지 약 0.1 mg/ml, 약 0.005 mg/ml 내지 약 0.1 mg/ml, 약 0.01 mg/ml 내지 약 0.1 mg/ml, 약 0.02 mg/ml 내지 약 0.1 mg/ml, 약 0.03 mg/ml 내지 약 0.1 mg/ml, 약 0.04 mg/ml 내지 약 0.1 mg/ml, 약 0.05 mg/ml 내지 약 0.1 mg/ml, 약 0.06 mg/ml 내지 약 0.1 mg/ml, 약 0.07 mg/ml 내지 약 0.1 mg/ml, 약 0.08 mg/ml 내지 약 0.1 mg/ml, 약 0.09 mg/ml 내지 약 0.1 mg/ml, 약 0.001 mg/ml 내지 약 0.005 mg/ml, 약 0.001 mg/ml 내지 약 0.01 mg/ml, 약 0.001 mg/ml 내지 약 0.02 mg/ml, 약 0.001 mg/ml 내지 약 0.03 mg/ml, 약 0.001 mg/ml 내지 약 0.04 mg/ml, 약 0.001 mg/ml 내지 약 0.05 mg/ml, 약 0.001 mg/ml 내지 약 0.06 mg/ml, 약 0.001 mg/ml 내지 약 0.07 mg/ml, 약 0.001 mg/ml 내지 약 0.08 mg/ml, 약 0.001 mg/ml 내지 약 0.09 mg/ml, 약 0.005 mg/ml 내지 약 0.09 mg/ml, 약 0.01 mg/ml 내지 약 0.08 mg/ml, 약 0.02 mg/ml 내지 약 0.07 mg/ml, 약 0.03 mg/ml 내지 약 0.06 mg/ml, 또는 약 0.04 mg/ml 내지 약 0.05 mg/ml 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 금속 전구체의 농도는 10 mM 내지 1,000 mM 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 금속 전구체의 농도는 약 10 mM 내지 약 1,000 mM, 약 50 mM 내지 약 1,000 mM, 약 100 mM 내지 약 1,000 mM, 약 200 mM 내지 약 1,000 mM, 약 300 mM 내지 약 1,000 mM, 약 400 mM 내지 약 1,000 mM, 약 500 mM 내지 약 1,000 mM, 약 600 mM 내지 약 1,000 mM, 약 700 mM 내지 약 1,000 mM, 약 800 mM 내지 약 1,000 mM, 약 900 mM 내지 약 1,000 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 300 mM, 약 10 mM 내지 약 400 mM, 약 10 mM 내지 약 500 mM, 약 10 mM 내지 약 600 mM, 약 10 mM 내지 약 700 mM, 약 10 mM 내지 약 800 mM, 약 10 mM 내지 약 900 mM, 약 50 mM 내지 약 900 mM, 약 100 mM 내지 약 800 mM, 약 200 mM 내지 약 700 mM, 약 300 mM 내지 약 600 mM, 또는 약 400 mM 내지 약 500 mM 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 금속 전구체의 농도가 10 mM 미만일 경우, 상기 금속 전구체는 상기 기질, 효소, 및 환원제에 의해 환원되는 정도가 낮아 반응속도가 느리고, 반응 최대 농도가 제한될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 효소 검출 센서에 존재하는 기질의 농도는 0.1 mM 내지 50 mM 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 기질의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 50 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 5 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 15 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 25 mM 내지 약 50 mM, 약 30 mM 내지 약 50 mM, 약 35 mM 내지 약 50 mM, 약 40 mM 내지 약 50 mM, 약 45 mM 내지 약 50 mM, 약 0.1 mM 내지 약 1 mM, 약 0.1 mM 내지 약 5 mM, 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 약 0.1 mM 내지 약 15 mM, 약 0.1 mM 내지 약 20 mM, 약 0.1 mM 내지 약 25 mM, 약 0.1 mM 내지 약 30 mM, 약 0.1 mM 내지 약 35 mM, 약 0.1 mM 내지 약 40 mM, 약 0.1 mM 내지 약 45 mM, 약 1 mM 내지 약 45 mM, 약 5 mM 내지 약 40 mM, 약 10 mM 내지 약 35 mM, 약 15 mM 내지 약 30 mM, 또는 약 20 mM 내지 약 25 mM 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 효소 검출 센서에 의해 검출될 수 있는 효소의 농도는 0 U/ml 초과 100 U/ml 이하 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 효소 검출 센서에 의해 검출될 수 있는 효소의 농도는 0 U/ml 초과 약 100 U/ml 이하, 약 0.0001 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 0.001 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 0.01 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 0.1 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 1 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 5 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 10 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 15 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 20 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 25 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 30 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 35 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 40 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 45 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 50 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 55 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 60 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 65 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 70 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 75 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 80 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 85 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 90 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 약 95 U/ml 내지 약 100 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 95 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 90 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 85 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 80 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 75 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 70 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 65 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 60 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 55 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 50 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 45 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 40 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 35 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 30 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 25 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 20 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 15 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 10 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 5 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 1 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 0.1 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 0.01 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 0.001 U/ml 이하, 0 U/ml 초과 약 0.0001 U/ml 이하, 약 0.0001 U/ml 내지 약 95 U/ml 이하, 약 0.001 U/ml 내지 약 90 U/ml 이하, 약 0.01 U/ml 내지 약 85 U/ml 이하, 약 0.1 U/ml 내지 약 80 U/ml 이하, 약 1 U/ml 내지 약 75 U/ml 이하, 약 5 U/ml 내지 약 70 U/ml 이하, 약 10 U/ml 내지 약 65 U/ml 이하, 약 15 U/ml 내지 약 60 U/ml 이하, 약 20 U/ml 내지 약 55 U/ml 이하, 약 25 U/ml 내지 약 50 U/ml 이하, 약 30 U/ml 내지 약 45 U/ml 이하, 또는 약 35 U/ml 내지 약 40 U/ml 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 기질이 우레아고, 상기 효소가 우레아제일 경우, 상기 효소 검출 센서의 효소의 검출 한계(Limit of detection, LOD)는 검출 방법에 따라 상이할 수 있다. 예를 들어, 상기 효소 검출 센서가 상기 제1 측면에 따른 방법으로 우레아제의 농도를 검출할 경우, 상기 센서의 검출 한계는 0.0048 mM 일 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시 예 1]
37℃의 온도에서, 50 μL: 우레아제를 포함하는 0.5 mM PB(phosphate buffer) 용액과 20 mM의 우레아 수용액 50 μL을 혼합하고, 10 분간 정치하였다. 이어서, 800 μL의 탄닌산(농도: 0.01 mg/ml) 및 100 μL의 AgNO3 수용액(농도: 15 mM)을 상기 용액에 첨가한 후, 20 분간 추가로 정치하였다. 이 때, 상기 우레아제, 우레아, 타닌산, 및 AgNO3는 증류수에 용해된 것이고, 상기 우레아제 수용액의 농도는 0 U/ml 초과 100 U/ml 이하이며, 상기 탄닌산 및 AgNO3 수용액의 혼합액을 SS 라고 한다.
[실험예 1]
실시예 1의 조건을 찾기 위해, 우레아 및 우레아제의 반응 시간 및 농도, 및 탄닌산과 AgNO3의 농도를 조절하여 Ag 나노 입자의 형성을 조절하였다.
도 3의 (a) 내지 (e)는 본원의 일 실시예에 따른 효소의 검출 방법의 그래프이다. 구체적으로, 도 3의 (a)는 탄닌산의 농도를, (b)는 AgNO3의 농도를, (c)는 NH3의 농도와 정치 시간을, (d)는 우레아 및 우레아제의 농도를, (e)는 우레아 및 우레아제의 정치 시간을 변경한 것이다.
도 2 및 도 3를 참조하면, 상기 우레아와 우레아제의 반응에 의해 형성된 NH3 역시 표준 NH3 와 마찬가지로 탄닌산의 AgNO3의 환원 작용을 도울 수 있음을 확인할 수 있다. 또한, 도 3의 y 축 A413 은 Ag 나노 입자의 고유 파장에 대한 흡광도로서, Ag 나노 입자의 농도가 증가할수록 A413 역시 커지고, 이를 통해 우레아제의 농도를 확인할 수 있다.
[실험예 2]
도 4의 (a) 및 (b)는 본원의 일 실시예에 따른 효소의 검출 방법의 그래프이다. 구체적으로, 도 4는 상기 우레아제의 농도에 따라 색이 변화되는 것을 표현한 그래프이다.
도 4를 참조하면, 상기 우레아제의 농도가 50 U/ml에 가까울수록 상기 용액은 갈색빛을 띄는 것을 확인할 수 있다.
[실험예 3]
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 효소의 검출 방법에 억제제를 사용하였을 때의 사진이다.
도 5을 참조하면, 상기 용액에 억제제인 AHA(acetohydroxamic acid)의 농도가 커질수록, 우레아제가 우레아를 분해하는 정도가 작아질 수 있다. 즉, 상기 효소 검출 방법에서 상기 억제제의 농도가 커질수록, 상기 용액의 색은 무색에 가까워질 수 있다.
[실험예 4]
토양에서의 우레아제를 검출하기 위해, 상기 실시예 1의 방법을 사용하였다. 구체적으로, 토양에 우레아제를 추가하지 않거나, 0.11 U/L, 0.22 U/L, 또는 0.44 U/L의 우레아제를 추가한 후, 실시예 1의 방법을 수행하였다.
도 6의 (a)는 본원의 일 실시예에 따른 효소의 검출 방법의 사진이고, (b)는 본원의 일 실시예에 따른 효소의 검출 방법의 그래프이다. 또한, 하기 표 1 은 토양 내의 우레아제 효소의 검출결과를 표로 나타낸 것이다.
Sample Added,
(Unit/L)		 Found,
(Unit/L)		 Recoveries,
(%)		 RSD
(%, n=3)
샘플 1 0 0.032 - 2.16
0.11 0.139 97.13 3.17
0.22 0.258 102.8 2.66
0.44 0.509 108.38 3.4
상기 표 1에서, 상기 Added 된 값은 토양 샘플에 추가된 우레아제의 농도를 의미하는 것이며, Found된 값은 토양 샘플 또는 우레아제가 추가된 토양 샘플에서 검출된 우레아제의 농도를 의미한다.도 6 및 표 1을 참조하면, 본원에 따른 방법은 토양 샘플에 우레아제가 추가되어도 추가된 우레아제를 높은 정확도로 검출할 수 있다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (12)

  1. 기질 및 효소를 포함하는 용액을 형성하는 단계;
    환원제 및 금속 전구체를 상기 용액 상에 투입하여 상기 금속 전구체를 금속 나노 입자로 환원시키는 단계; 및
    상기 금속 나노 입자를 포함하는 용액의 색(color)을 분석하는 단계;
    를 포함하는,
    효소의 검출 방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 효소는 우레아제(urease)를 포함하는 것인, 효소의 검출 방법.
  3. 제2 항에 있어서,
    상기 효소는 상기 기질의 분해를 촉진시키는 것인, 효소의 검출 방법.
  4. 제3 항에 있어서,
    상기 기질의 분해에 의해 상기 용액의 pH 가 증가하는 것인, 효소의 검출 방법.
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 용액은 상기 효소의 억제제를 추가 포함하는 것인, 효소의 검출 방법.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 용액의 색은, 상기 금속 나노 입자의 농도에 따라 변화하는 것인, 효소의 검출 방법.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 금속 전구체 및 상기 금속 나노 입자는 각각 독립적으로 Ag, Au, Cu, Pt, Pd, Ni, Co, Fe, Mn, Cr, V, Ti, 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 금속의 이온을 포함하는 것인, 효소의 검출 방법.
  8. 제1 항에 있어서,
    상기 환원제는 탄닌산(tannic acid), NaOH, KOH, N2H4, Na2HPO4, 디메틸포름아미드(dimethylformamide), 테트라부틸암모늄(tetrabutyl ammonium), NaBH4, LiBH4, 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것인, 효소의 검출 방법.
  9. 기질 및 효소를 반응시키는 반응부; 및
    상기 반응부에 환원제 및 금속 전구체를 포함하는 용액을 주입하는 주입부;
    를 포함하는,
    효소 검출 센서.
  10. 제9 항에 있어서,
    상기 기질의 농도는 0 mM 초과 50 mM 이하인, 효소 검출 센서.
  11. 제9 항에 있어서,
    상기 환원제의 농도는 0.001 mg/ml 내지 0.1 mg/ml 인, 효소 검출 센서.
  12. 제9 항에 있어서,
    상기 금속 전구체의 농도는 10 mM 내지 1,000 mM 인, 효소 검출 센서.

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3873269A (en) * 1972-10-11 1975-03-25 Merck Patent Gmbh Indicator for the determination of urea
KR20130126322A (ko) * 2012-05-11 2013-11-20 가천대학교 산학협력단 액정 배열변화 및 이미징을 이용한 비표지 바이오센서

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