KR20220100567A

KR20220100567A - 감마 델타 t 세포의 억제 또는 활성화 방법

Info

Publication number: KR20220100567A
Application number: KR1020227002506A
Authority: KR
Inventors: 안드레아스 베렌; 조나단 세본; 마크 리가우 코탈; 토마스 사무엘 풀포드; 데일 이안 갓프리; 앤드류 햄멧; 시몬 오스트로스카; 콘 파누시스; 아담 피터 울리히
Original assignee: 더 유니버시티 오브 멜버른; 올리비아 뉴튼-존 캔서 리서치 인스티튜트; 씨에스엘 이노베이션 피티와이 엘티디
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2020-06-26
Publication date: 2022-07-15
Also published as: US20220273713A1; CN114746445A; EP3990496A4; AU2020301813A1; JP2022539753A; WO2020257871A1; EP3990496A1; CA3144755A1

Abstract

본 개시내용은 대상체에게 BTN2A1 길항제(antagonist)를 투여함으로써 대상체에서 Vγ9+ TCR을 발현하는 γδ T세포의 활성화를 억제하는 방법 뿐만 아니라 대상체에게 BTN2A1 길항제를 투여함으로써 대상체에서 Vγ9+ TCR을 발현하는 γδ T세포를 유도 또는 향상하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 추가로 BTN2A1 길항제 및 BTN2A1 작용제(agonists)에 관한 것이다.

Description

감마 델타 T 세포의 억제 또는 활성화 방법

관련 출원 데이타

본 출원은 2019년 6월 28일에 출원된 "감마 델타 T 세포의 억제 또는 활성화 방법"이라는 제목의 호주 특허 출원 번호 2019902308, 2019년 12월 17일에 출원된 "감마 델타 T 세포의 억제 또는 활성화 방법"이라는 제목의 호주 특허 출원 번호 2019904771 및 2019년 12월 17일에 출원된 "감마 델타 T 세포의 억제 또는 활성화 방법"이라는 제목의 호주 특허 출원 번호 2019904773로 부터 우선권을 주장한다.

서열목록

본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록의 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.

본 개시내용은 γδ T세포를 억제 또는 활성화하기 위한 시약 및 방법에 관한 것이다.

서론

알파-베타(αβ) T세포는 TCR-α 및 TCR-β 유전자 자리에 의해 암호화된 T세포 수용체(T cell receptors:TCRs)를 통해 항원(antigens:Ag)을 인식하며, 이는 Ag-제시 분자(Ag-presenting molecules)에 의해 표시되는 Ag에 결합한다. 이 기본 원리는 MHC 분자가 제시하는 펩타이드 Ag를 인식하는 αβ T세포, CD1d가 제시하는 지질 Ag를 인식하는 NKT세포, MR1이 제시하는 비타민 B 대사산물을 인식하는 MAIT(mucosal-associated invariant T)세포에 적용된다(J. Rossjohn et al. (2015)). 감마-델타(γδ) T세포는 별도의 변형(variable:V), 다양성(diversity:D), 연결(joining:J) 및 불변(constant:C) TCR-γ 및 TCR-δ 유전자 좌(gene loci)에서 유래된 TCR을 발현하는 고유한 계통(lineage)이다. 순환하는 대부분의 인간 γδ T세포는 Vγ9+ TCR을 발현하고, 이들 대부분은 인산화항원(phosphoantigens:pAg)이라고 하는 별개의 Ag 부류에 반응한다(P.Constant et al. (1994); Y. Tanaka et al., (1995)).

pAg는 거의 모든 세포 유기체에 존재하는 이소프레노이드(isoprenoids) 생합성의 중간체(intermediates)이다. 척추동물이 메발로네이트(mevalonate) 경로를 통해 이소프레노이드를 생산하는 동안 미생물은 비-메발로네이트 경로를 이용하여 화학적으로 구별되는 pAg 중간체를 생성한다(L. Zhao et al. (2013)). Vγ9+ T세포는 메발로네이트 경로의 이소펜테닐 피로포스페이트(isopentenyl pyrophosphate:IPP) 및 비-메발로네이트 경로의 4-하이드록시-3-메틸-부트-2-에닐 피로포스페이트(4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate:HMBPP)를 포함하여 두 경로를 통해 생성된 pAg를 감지하나, 척추동물 IPP pAgs보다 미생물 HMBPP에 대한 민감도는 ~1000배 더 높다(A. Sandstrom et al. (2014)). 따라서 그들은 미생물 감염에서 유래한 HMBPP에 반응할 수 있지만 암세포와 같은 비정상 세포에 축적된 IPP에도 반응할 수 있다. 박테리아 및 기생충 감염 동안 pAg는 Vγ9+ T세포를 구동하여 사이토카인(cytokines)을 생성하고 확장하여 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells:PBMCs)의 ~10%-50%를 차지한다(Y.L. Wu et al. (2014); J. Zheng et al. (2013)). Vγ9+ T세포가 항박테리아 면역에서 수행하는 중요한 역할은 인간 PBMC가 면역 결핍 마우스로 전달되어 박테리아 감염에 대한 Vγ9 T 세포 의존적 보호를 유도함으로써 입증되었다(L. Wang et al. (2001)). 그들은 또한 pAg 의존적 방식으로 시험관 내에서 다양한 종양 세포주를 죽일 수 있으며 수많은 임상 시험에서 이들의 항암 가능성을 조사했으며 일부 고무적인 결과를 얻었다(D.I. Godfrey et al. (2018)). 따라서 Vγ9+ γδ T세포는 인간 면역계의 중요하고 중복되지 않는 부분을 나타낸다.

보호 면역에서 γδ T세포에 의한 pAg 감지의 중요성에도 불구하고, pAg 인식을 지배하는 분자 메커니즘은 불분명하다.

예를 들어 암 환자 또는 만성 감염 환자에서 γδ T 세포 반응을 유도하거나 억제할 수 있는 신규한 면역요법 및 제제를 제공하기 위해 pAg 인식을 제어하는 메커니즘을 더 잘 이해할 필요가 있다는 것은 전술한 내용으로부터 숙련자에게 명백할 것이다.

요약

본 발명에 도달함에 있어서, 본 발명자들은 pAg-반응성 γδTCR에 대한 신규 리간드로서 표면 단백질 부티로필린, 서브패밀리 2, 구성원 A1(surface protein butyrophilin, subfamily 2, member A1:BTN2A1)을 확인하였다. 본 발명자들은 BTN2A1 발현이 γδ T 세포에 의한 효과적인 pAg 반응에 필수적임을 입증하였다. 본 발명자들은 또한 BTN2A1이 항원 제시 세포(antigen presenting cells:APCs)의 표면에서 BTN3A1과 밀접하게 결합하고 이 복합체가 마우스 및 햄스터 APC에 pAg-제시 능력을 부여하는 데 필요하고 충분하다는 것을 보여주었다.

본 발명자들에 의한 이러한 발견은 BTN2A1에 결합하고 γδ T 활성화를 향상시키는 시약, 및 예를 들어 암 또는 감염의 치료에서의 이들의 용도에 대한 기초를 제공한다.

본 발명자들의 이러한 발견은 또한 BTN2A1에 결합하고 γδ T 활성화를 방해하는 시약에 대한 기초를 제공하고, 예를 들어 자가면역 질환, 이식 거부(transplantation rejection) 또는 이식편대숙주병(graft versus host disease)의 치료에서의 이들의 용도를 제공한다.

따라서, 본 개시내용은 대상체에게 BTN2A1 길항제(antagonist)를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 Vγ9+ TCR을 발현하는 γδ T세포의 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 상기 BTN2A1 길항제는

i) BTN2A1/BTN3 복합체, 예를 들어 세포 표면의 BTN2A1/BTN3A1 복합체 형성을 억제;

ii) Vγ9에 대한 BTN2A1의 결합을 억제;

iii) Vγ9+ TCR에 대한 BTN2A1/BTN3, 예를 들어 BTN2A1/BTN3A1 복합체의 결합을 억제; 및/또는

iv) BTN2A1을 발현하는 세포의 활성 및/또는 생존을 감소시킨다.

한 실시예에서, 방법은 하나 이상의 Vγ9+ T세포 서브세트(subsets)의 활성화를 억제한다. 예를 들어, 방법은 Vγ9Vδ2+, Vγ9Vδ1+, Vγ9Vδ3+, Vγ9Vδ4+ 또는 Vγ9Vδ5+ γδ T세포 중 하나 이상의 활성화를 억제한다. 다른 예에서, 방법은 Vγ9Vδ2-T세포의 활성화를 억제한다. 예를 들어, 이 방법은 Vγ9Vδ2+, Vγ9Vδ1+, Vγ9Vδ3+, Vγ9Vδ4+, 또는 Vγ9Vδ5+ γδ 또는 Vγ9Vδ2-T세포 중 하나 이상의 활성화를 억제한다. 예를 들어, 방법은 하나 이상의 Vγ9+ T세포 서브세트의 표면상의 CD25 상향조절 및/또는 이로부터 IFN-γ의 생성을 억제한다. 한 실시예에서, 방법은 Vγ9Vδ2+ γδ T세포의 활성화를 억제한다. 또 다른 실시예에서, 방법은 Vγ9Vδ2-γδ T세포의 활성화를 억제한다. 추가 실시예에서, 방법은 Vγ9Vδ2+ γδ T세포 및/또는 Vγ9Vδ2-γδ T세포의 활성화를 억제한다.

한 실시예에서, BTN2A1/BTN3은 BTN2A1/BTN3A1 복합체이다. 복합체는 이종체(heteromeric) 복합체 또는 다량체(multimeric) 복합체일 수 있다.

한 실시예에서, BTN2A1 및 BTN3은 같은 세포에서 발현된다.

추가 실시예에서, BTN2A1/BTN3A1 복합체는 BTN3A2 및/또는 BTN3A3과 같은 하나 이상의 추가 분자를 포함한다. 하나 이상의 추가 분자는 γδ T세포의 활성화를 향상시킬 수 있다.

한 실시예에서, 방법은 세포용해 기능(cytolytic function), 하나 이상의 사이토카인 생산, 또는 γδ T세포의 증식 중 하나 이상을 억제한다.

한 실시예에서, BTN2A1 길항제는 γδ T 세포의 인산항원 매개 활성화를 억제시킨다.

한 실시예 또는 추가 실시예에서, BTN2A1 길항제는 BTN2A1 및 BTN3A1의 결합을 억제시키고, 예를 들어, BTN2A1 길항제는 BTN2A1 및 BTN3A1의 직접적인 결합을 억제시킨다.

한 실시예 또는 추가 실시예에서, BTN2A1 길항제는 Vγ9의 생식세포계열-엔코드된(germline-encoded) 영역 및/또는 TCR δ-사슬의 말단(distal)에 대한 BTN2A1의 결합을 억제시킨다. 한 실시예에서, BTN2A1 길항제는 프레임워크(framework) 영역 및/또는 Vγ9의 Arg20, Glu70 및 His85 중 적어도 하나를 포함하는 영역에 대한 BTN2A1의 결합을 방지시킨다. BTN2A1 길항제는 Vγ9의 ABED 역평행 β-시트의 B, D 및 E 가닥의 외부면에 있는 영역에 대한 결합을 방지시킬 수 있다. 한 실시예에서, BTN2A1 길항제는 CDR 루프(loops)보다 Cγ 도메인에 더 가까운 영역에 결합한다.

한 실시예에서, BTN2A1 길항제는 TCR δ 사슬의 CDR2 루프 및/또는 TCR γ 사슬의 CDR3 루프와 같은 Vδ2의 생식세포계열-엔코드된 영역에 대한 BTN2A1/BTN3 복합체의 결합을 억제시킨다. 예를 들어, BTN2A1 길항제는 Vδ2의 Arg51 및 Vγ9-JγP-엔코드된 CDR3 루프의 Lys108에 근접한 영역에 BTN2A1의 결합을 방지시킨다.

한 실시예에서, BTN2A1 길항제는 BTN2A1 분자를 자극성(stimulatory) BTN2A1에서 비-자극성(non-stimulatory)으로 전환하기 위해 BTN2A1 분자의 세포외 도메인(IgV 및/또는 IgC) 중 하나 이상을 변형시킨다.

한 실시예 또는 추가 실시예에서, BTN2A1 길항제는 BTN2A1 분자의 세포외 도메인(IgV 및/또는 IgC) 중 하나 이상을 변형시키고 인산항원 활성화를 억제시킨다. 예를 들어, BTN2A1 길항제는 BTN2A1 및/또는 BTN3 분자의 세포질 도메인에 대한 인산항원의 결합을 억제시킨다.

한 실시예에서, BTN2A1 길항제는 BTN2A1 및 BTN3 분자, 예를 들어 BTN3A1에 대해 이중-특이적(bi-specific)이다. 또 다른 실시예에서, BTN2A1 길항제는 BTN3 분자, 예를 들어 BTN3A1과 교차 반응(cross-reacts)한다. 또 다른 실시예에서, BTN2A1 길항제는 가용성(soluble) Vγ9+ TCR이다.

본 개시내용은 또한 대상체에게 BTN2A1 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 Vγ9+ γδ T 세포 반응을 방지(suppressing) 또는 억제하는(inhibiting) 방법을 제공하며, 여기서 BTN2A1 길항제는

ii) Vγ9+ TCR에 대한 BTN2A1의 결합을 억제;

iii) Vγ9+ TCR에 대한 BTN2A1/BTN3 복합체, 예를 들어 BTN2A1/BTN3A1 복합체의 결합을 억제; 및/또는

한 실시예에서, 방법은 Vγ9Vδ2+, Vγ9Vδ1+, Vγ9Vδ3+, Vγ9Vδ4+, 또는 Vγ9Vδ5+ γδ T세포 반응 중 하나 이상을 방지 또는 억제한다. 한 실시예에서, 방법은 Vγ9Vδ2+, Vγ9Vδ2-, Vγ9Vδ1+, Vγ9Vδ3+, Vγ9Vδ4+ 또는 Vγ9Vδ5+ γδ T세포 반응 중 하나 이상을 방지 또는 억제한다. 한 실시예에서, 방법은 Vγ9Vδ2+ γδ T세포 반응을 방지 또는 억제한다. 또 다른 실시예에서, 방법은 Vγ9Vδ2-γδ T세포 반응을 방지 또는 억제한다. 추가 실시예에서, 방법은 Vγ9Vδ2+ γδ T세포 반응 및/또는 Vγ9Vδ2-γδ T세포 반응을 방지 또는 억제한다.

한 실시예에서, BTN2A1/BTN3은 BTN2A1/BTN3A1 복합체이다. 복합체는 이종체 복합체 또는 다량체 복합체일 수 있다.

한 실시예에서, 방법은 세포용해 기능, 하나 이상의 사이토카인 생산, 또는 γδ T세포의 증식 중 하나 이상을 방지 또는 억제한다.

한 실시예에서, BTN2A1 길항제는 γδ T세포의 인산항원 매개 활성화를 억제시킨다.

한 실시에 또는 추가 실시예에서, BTN2A1 길항제는 BTN2A1 및 BTN3A1의 결합을 억제시키고, 예를 들어, BTN2A1 길항제는 BTN2A1 및 BTN3A1의 직접적인 결합을 억제시킨다.

한 실시예 또는 추가 실시예에서, BTN2A1 길항제는 Vγ9의 생식세포계열-엔코드된 영역 및/또는 TCR δ-사슬의 말단에 대한 BTN2A1의 결합을 억제시킨다. 한 실시예에서, BTN2A1 길항제는 프레임워크 영역 및/또는 Vγ9의 Arg20, Glu70 및 His85 중 적어도 하나를 포함하는 영역에 대한 BTN2A1의 결합을 방지한다. BTN2A1 길항제는 Vγ9의 ABED 역평행 β-시트의 B, D 및 E 가닥의 외부면에 있는 영역에 대한 결합을 방지시킬 수 있다. 한 실시예에서, BTN2A1 길항제는 CDR 루프보다 Cγ 도메인에 더 가까운 영역에 결합한다.

한 실시예에서, BTN2A1 길항제는 TCR γ 사슬의 CDR2 루프 및/또는 CDR3 루프와 같은 Vδ2의 생식세포계열-엔코드된 영역에 대한 BTN2A1/BTN3 복합체의 결합을 억제시킨다. 예를 들어, BTN2A1 길항제는 Vγ9-JγP-엔코드된 CDR3 루프의 Arg51 및 Lys108 중 적어도 하나에 근접한 영역에 대한 BTN2A1의 결합을 방지한다.

한 실시예에서, BTN2A1 길항제는 BTN2A1 분자를 자극성 BTN2A1에서 비자극성으로 전환하기 위해 BTN2A1 분자의 세포외 도메인(IgV 및/또는 IgC) 중 하나 이상을 변형시킨다.

한 실시예 또는 추가 실시예에서, BTN2A1 길항제는 BTN2A1 분자의 세포외 도메인(IgV 및/또는 IgC) 중 하나 이상을 변형시키고 인산항원 활성화를 억제한다. 예를 들어, BTN2A1 길항제는 BTN2A1 및/또는 BTN3 분자의 세포질 도메인에 대한 인산항원의 결합을 억제시킨다.

한 실시예에서, BTN2A1 길항제는 BTN2A1 및 BTN3 분자, 예를 들어 BTN3A1에 대해 이중특이적이다. 또 다른 실시예에서, BTN2A1 길항제는 BTN3 분자, 예를 들어 BTN3A1과 교차 반응한다. 또 다른 실시예에서, BTN2A1 길항제는 가용성 Vγ9+ TCR이다.

본 개시내용은 또한 γδ T세포 및 BTN2A1을 발현하는 세포를 BTN2A1 길항제의 존재하에 배양하는 단계를 포함하는, 시험관내 또는 생체외에서 Vγ9+ TCR을 발현하는 γδ T 세포의 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 상기 BTN2A1 길항제는

i) 세포 표면에서 BTN2A1/BTN3A1 이종체 복합체 형성을 억제;

ii) Vγ9에 대한 BTN2A1의 결합을 억제;

iii) Vγ9+ TCR에 대한 BTN2A1/BTN3A1 이종cp 복합체의 결합을 억제; 및/또는

한 실시예에서, 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 γδ T세포를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, γδ T세포는 조작된 수용체, 예를 들어 유전적으로 조작된 또는 변형된 T세포 수용체를 포함한다. 예를 들어, γδ T세포는 조작된 수용체, 예를 들어 유전적으로 조작된 또는 변형된 T세포 수용체를 포함하지 않는다. 추가 실시예에서, γδ T세포는 조작된 γδ T세포이다. 이 방법은 조직 이식편 또는 동종 혈구 이식편으로 환자를 치료하는 맥락에서 유용할 수 있다.

본 개시내용은 또한 대상체에서 자가면역 질환, 이식 거부 또는 이식편대숙주병(graft versus host disease), 또는 이식편대종양효과(graft versus tumour effect)를 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방, 또는 증상완화에 충분한 양으로 BTN2A1 길항제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환, 이식 거부, 이식편대숙주병, 또는 이식편대종양효과의 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방, 또는 증상완화 방법을 제공한다.

본 개시내용은 또한 대상체에서 암 또는 감염을 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방 또는 증상완화에 충분한 양으로 BTN2A1 길항제를 대상체에서 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 감염의 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방 또는 증상완화 방법을 제공한다.

본 개시내용은 또한 대상체에게 BTN2A1 작용제(agonist)를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 Vγ9+ TCR을 발현하는 γδ T세포를 활성화시키는 방법을 제공하며, 여기서 BTN2A1 작용제는

i) BTN2A1/BTN3, 예를 들어 세포 표면의 BTN2A1/BTN3A1 복합체 형성을 촉진;

ii) γδ T세포에서 Vγ9+ TCR의 리게이션(ligation)을 유도; 및/또는

iii) BTN2A1을 발현하는 세포의 활성 및/또는 생존을 증가시킨다.

한 실시예에서, 방법은 하나 이상의 Vγ9+ T세포 서브세트(subsets)를 활성화한다. 예를 들어, Vγ9Vδ2+, Vγ9Vδ1+, Vγ9Vδ3+, Vγ9Vδ4+, 또는 Vγ9Vδ5+ γδ T세포 중 하나 이상. 예를 들어, Vγ9Vδ2+, Vγ9Vδ2?, Vγ9Vδ1+, Vγ9Vδ3+, Vγ9Vδ4+ 또는 Vγ9Vδ5+ γδ T세포 중 하나 이상. 한 실시예에서, 방법은 Vγ9Vδ2+ γδ T세포를 활성화한다. 또 다른 실시예에서, 방법은 Vγ9Vδ2-γδ T 세포를 활성화한다. 추가 실시예에서, 방법은 Vγ9Vδ2+ γδ T세포 및 Vγ9Vδ2- γδ T 세포를 활성화한다.

한 실시예에서, 방법은 세포용해 기능, 하나 이상의 사이토카인 생산, 또는 γδ T세포의 증식 중 하나 이상을 활성화한다.

한 실시예 또는 추가 실시예에서, 활성화된 γδ T세포는 CD25, CD40-리간드(CD40-L), CD69 및 CD107a 중 하나 이상을 발현한다.

한 실시예에서, BTN2A1 작용제는 인산항원 결합과 무관하게(independent) γδ T세포를 활성화 시킨다.

한 실시예 또는 추가 실시예에서, BTN2A1 작용제는 BTN2A1 및 BTN3A1의 결합을 촉진하고, 예를 들어, BTN2A1 작용제는 BTN2A1 및 BTN3A1의 직접적인 결합을 촉진한다. 예를 들어, BTN2A1 작용제는 BTN2A1 및 BTN3A1을 교차 연결시킨다.

한 실시예에서, BTN2A1 작용제는 BTN2A1 및 BTN3 분자, 예를 들어 BTN3A1에 대해 이중 특이적이다. 또 다른 실시예에서, BTN2A1 작용제는 BTN3 분자, 예를 들어 BTN3A1과 교차 반응한다.

한 실시예에서, BTN2A1 작용제는 BTN2A1 분자의 세포외 도메인(IgV 및/또는 IgC) 중 하나 이상을 변형하여 BTN2A1을 비자극성 BTN2A1에서 자극성으로 전환시킨다.

본 개시내용은 또한 대상체에게 BTN2A1 작용제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 Vγ9+ γδ T 세포 반응을 유도 또는 향상시키는 방법을 제공하며, 상기서 BTN2A1 작용제는

ii) γδ T세포에서 Vγ9+ TCR의 리게이션을 유도; 및/또는

한 실시예에서, 방법은 하나 이상의 Vγ9+ T세포 서브세트를 유도한다. 예를 들어, Vγ9Vδ2+, Vγ9Vδ1+, Vγ9Vδ3+, Vγ9Vδ4+, 또는 Vγ9Vδ5+ γδ T세포 중 하나 이상. 예를 들어, Vγ9Vδ2+, Vγ9Vδ2? γδ, Vγ9Vδ1+, Vγ9Vδ3+, Vγ9Vδ4+ 또는 Vγ9Vδ5+ γδ T세포 중 하나 이상. 한 실시예에서, 방법은 Vγ9Vδ2+ γδ T세포 반응을 유도한다. 또 다른 실시예에서, 방법은 Vγ9Vδ2-γδ T세포 반응을 유도한다. 추가 실시예에서, 방법은 Vγ9Vδ2+ γδ T세포 및 Vγ9Vδ2-γδ T세포 반응을 유도한다.

한 실시예 또는 추가 실시예에서, 활성화된 γδ T세포는 CD25, CD69, CD40-리간드(CD40-L) 및 CD107a와 같은 하나 이상의 활성화 관련 마커를 발현한다.

한 실시예에서, BTN2A1 작용제는 인산항원 결합과 무관하게 γδ T세포를 활성화 시킨다.

한 실시예에서, BTN2A1 작용제는 BTN2A1 및 BTN3 분자, 예를 들어 BTN3A1에 대해 이중-특이적이다. 또 다른 실시예에서, BTN2A1 작용제는 BTN3 분자, 예를 들어 BTN3A1과 교차 반응한다.

본 개시내용은 또한 BTN2A1 작용제의 존재하에 γδ T세포 및 BTN2A1을 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo)에서 Vγ9+ TCR을 발현하는 γδ T 세포를 활성화시키는 방법을 제공하며, 여기서 BTN2A1 작용제는

i) 항원 제시 세포의 표면에서 BTN2A1/BTN3A1 이종체 복합체의 형성을 촉진;

ii) γδ T세포에서 Vγ9+ TCR의 리게이션을 유도; 및/또는

한 실시예에서, 방법은 활성화된 γδ T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 실시예에서, 방법은 조작된 γδ T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

본 개시내용은 또한 대상체에서 자가면역 질환, 이식 거부 또는 이식편대숙주병, 또는 이식편대종양효과를 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방, 또는 증상완화에 충분한 양으로 BTN2A1 작용제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환, 이식 거부, 이식편대숙주병, 또는 이식편대종양효과의 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방, 또는 증상완화 방법을 제공한다.

본 개시내용은 또한 대상체에서 암 또는 감염을 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방 또는 증상완화에 충분한 양으로 BTN2A1 작용제를 대상체에서 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 감염의 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방 또는 증상완화 방법을 제공한다.

본 개시내용은 또한 BTN2A1에 특이적으로 결합하고

i) BTN2A1/BTN3 복합체, 예를 들어 세포 표면 상의 BTN2A1/BTN3A1 복합체 형성;

ii) Vγ9에 대한 BTN2A1의 결합;

iii) Vγ9+ TCR에 대한 BTN2A1/BTN3A1 복합체의 결합; 및/또는

iv) BTN2A1을 발현하는 세포의 활성 및/또는 생존을 감소시키는 BTN2A1 길항제를 제공한다.

본 개시내용은 또한 BTN2A1에 특이적으로 결합하고

i) BTN2A1/BTN3 복합체, 예를 들어 세포 표면 상의 BTN2A1/BTN3A1 복합체의 형성을 촉진;

ii) γδ T세포에서 Vγ9+ TCR의 리게이션을 유도; 및/또는

iii) BTN2A1을 발현하는 세포의 활성 및/또는 생존을 증가시키는 BTN2A1 작용제를 제공한다.

한 실시예에서, BTN2A1 길항제 또는 작용제는 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질이다.

한 실시예에서 단백질은

(i) 단일 사슬 Fv 단편(single chain Fv fragment:scFv)

(ii) 이량체(dimeric) scFv;

(iii) Fv 단편

(iv) 단일 도메인 항체(single domain antibody:sdAb);

(v) 나노바디(nanobody);

(vi) 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 또는 고차 멀티머(higher order multimer);

(vii) Fab 단편;

(viii) Fab' 단편;

(ix) F(ab') 단편;

(x) F(ab')₂ 단편;

(xi) 항체의 Fc 영역에 연결된 (i)-(x) 중 어느 하나;

(xii) 면역 이펙터(effector) 세포에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 융합된 (i)-(x) 중 어느 하나; 또는

(xiii) 항체이다.

한 실시에에서, 단백질은

(i) 단일 사슬 Fv 단편(single chain Fv fragment:scFv)

(ii) 이량체(dimeric) scFv;

(iii) Fv 단편

(iv) 단일 도메인 항체(single domain antibody:sdAb);

(v) 나노바디(nanobody);

(vii) Fab 단편;

(viii) Fab' 단편;

(ix) F(ab') 단편;

(x) F(ab')₂ 단편;

(xi) 항체의 Fc 영역에 연결된 (i)-(x) 중 어느 하나;

(xiii) 항체이다.

한 예에서, 본 개시내용의 단백질은 친화성 성숙(affinity matured), 키메릭(chimeric), CDR 이식(CDR grafted) 또는 인간화 항체(humanized antibody), 또는 그의 항원 결합 단편이다.

한 예에서, BTN2A1 길항제는 서열번호 100으로 표시되는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region:V_H) 및 서열번호 101로 표시되는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(light chain variable region:V_L)을 포함하는 항체이다. 또 다른 예에서, BTN2A1 길항제는 서열번호 108로 표시되는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H) 및 서열번호 109로 표시되는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하는 항체이다.

또 다른 예에서, BTN2A1 길항제는 서열번호 116으로 표시되는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H) 및 서열번호 117로 표시되는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하는 항체이다.

또 다른 예에서, BTN2A1 길항제는 서열번호 124로 표시되는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H) 및 서열번호 125로 표시되는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하는 항체이다.

또 다른 예에서, BTN2A1 길항제는 서열번호 132로 표시되는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H) 및 서열번호 133으로 표시되는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하는 항체이다.

한 예에서, BTN2A1 길항제는 서열번호 100으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 상보성 결정 영역(CDRs)을 포함하는 VH 및 서열번호 101로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 CDRs을 포함하는 V_L이다.

예를 들어, 길항제는 다음을 포함하는 항체이다:

(i) 다음을 포함하는 V_H:

(a) 서열번호 100의 아미노산 26-33에 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 100의 아미노산 51-58에 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 100의 아미노산 97-105에 표시되는 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는

(ii) 다음을 포함하는 V_L:

(a) 서열번호 101의 아미노산 27-32에 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 101의 아미노산 50-52에 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 101의 아미노산 89-97에 표시되는 서열을 포함하는 CDR3.

한 예에서, 길항제는 다음을 포함하는 항체이다:

(i) 다음을 포함하는 V_H:

(a) 서열번호 102로 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 103으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 104로 표시되는 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는

(ii) 다음을 포함하는 V_L:

(a) 서열번호 105로 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 106으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 107로 표시되는 서열을 포함하는 CDR3.

또 다른 예에서, 길항제는 다음을 포함하는 항체이다:

(i) 다음을 포함하는 V_H:

(a) 서열번호 108의 아미노산 26-33에 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 108의 아미노산 51-58에 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 108의 아미노산 97-105에 표시되는 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는

(ii) 다음을 포함하는 V_L:.

(a) 서열번호 109의 아미노산 27-33에 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 109의 아미노산 51-53에 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 109의 아미노산 90-98에 표시되는 서열을 포함하는 CDR3.

한 예에서, 길항제는 다음을 포함하는 항체이다:

(i) 다음을 포함하는 V_H:

(a) 서열번호 110으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 111로 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 112로 표시되는 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는

(ii) 다음을 포함하는 V_L:

(a) 서열번호 113으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 114로 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 115로 표시되는 서열을 포함하는 CDR3.

또 다른 예에서, 길항제는 다음을 포함하는 항체이다:

(i) 다음을 포함하는 V_H:

(a) 서열번호 116의 아미노산 26-33에 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 116의 아미노산 51-58에 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 116의 아미노산 97-104에 표시되는 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는

(ii) 다음을 포함하는 V_L:

(a) 서열번호 117의 아미노산 27-32에 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 117의 아미노산 24-26에 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 117의 아미노산 89-97에 표시되는 서열을 포함하는 CDR3.

한 예에서, 길항제는 다음을 포함하는 항체이다:

(i) 다음을 포함하는 V_H:

(a) 서열번호 118로 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 119로 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 120으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는

(ii) 다음을 포함하는 V_L:

(a) 서열번호 121로 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 122로 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 123으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR3.

또 다른 예에서, 길항제는 다음을 포함하는 항체이다:

(i) 다음을 포함하는 V_H:

(a) 서열번호 124의 아미노산 26-33에 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 124의 아미노산 51-58에 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 124의 아미노산 97-105에 표시되는 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는

(ii) 다음을 포함하는 V_L:

(a) 서열번호 125의 아미노산 26-33에 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 125의 아미노산 51-53에 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 125의 아미노산 90-101에 표시되는 서열을 포함하는 CDR3.

한 예에서, 길항제는 다음을 포함하는 항체이다:

(i) 다음을 포함하는 V_H:

(a) 서열번호 126으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 127로 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 128로 표시되는 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는

(ii) 다음을 포함하는 V_L:

(a) 서열번호 129로 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 130으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열 131으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR3.

또 다른 예에서, 길항제는 다음을 포함하는 항체이다:

(i) 다음을 포함하는 V_H:

(a) 서열번호 132의 아미노산 26-33에 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 132의 아미노산 51-58에 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 132의 아미노산 97-106에 표시되는 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는

(ii) 다음을 포함하는 V_L:

(a) 서열번호 133의 아미노산 26-33에 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 133의 아미노산 51-53에 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 133의 아미노산 92-100에 표시되는 서열을 포함하는 CDR3.

한 예에서, 길항제는 다음을 포함하는 항체이다:

(i) 다음을 포함하는 V_H:

(a) 서열번호 134로 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 135로 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 136으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는

(ii) 다음을 포함하는 V_L:

(a) 서열번호 137로 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 138로 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 139로 표시되는 서열을 포함하는 CDR3.

한 예에서, 본 개시내용의 단백질은 친화성 성숙, 키메릭, CDR 이식 또는 인간화 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이다.

한 예에서, 단백질, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 임의의 전술한 단백질, 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 핵산에 의해 암호화된 임의의 형태의 단백질, 항체 또는 이의 기능적 단편이다.

한 예에서, 길항제는 단백질, 예를 들어 본원에 개시된 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 가변 영역을 포함하는 항체이다.

또 다른 실시예에서, BTN2A1 길항제는 가용성 Vγ9+ TCR이다. 가용성 Vγ9+ TCR은 임의의 TCR 대립유전자를 포함할 수 있다.

한 실시예에서, 가용성 Vγ9+ TCR은 모노머(monomer)이다.

한 실시에에서, 가용성 Vγ9+ TCR은 멀티머(multimer)이다.

한 실시예에서, 가용성 Vγ9+ TCR은 서열번호 85 내지 89 중 어느 하나로 표시되는 서열을 포함하는 γ사슬 및/또는 서열번호 70 내지 74 중 어느 하나로 표시되는 서열을 포함하는 δ사슬을 포함한다. 한 실시예에서, γ 및 δ사슬은 예를 들어, 트롬빈 프로테아제(thrombin protease) 절단 부위(예: LVPRGS)에서 절단된다.

한 실시에에서, 가용성 Vγ9+ TCR은 서열번호 90 내지 94 중 어느 하나로 푯되는 서열을 포함하는 가변영역을 포함하는 γ사슬 및/또는 서열번호 75 내지 79 중 어느 하나로 표시되는 서열을 포함하는 가변영역을 포함하는 δ사슬을 포함한다.

한 실시에에서, 가용성 Vγ9+ TCR은 서열번호 95 내지 99 중 어느 하나로 표시되는 서열을 포함하는 γ사슬 가변영역의 상보성 결정 영역 3(CDR3) 및/또는 서열번호 80 내지 84 중 어느 하나로 표시되는 서열을 포함하는 가변영역의 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함한다.

한 실시에에서, 가용성 Vγ9+ TCR은 서열번호 95 내지 99 중 어느 하나로 표시되는 CDR3을 포함하는 γ사슬 가변영역 및/또는 서열번호 80 내지 84 중 어느 하나로 표시되는 CDR을 포함하는 δ사슬 가변영역을 포함한다.

한 실시예에서, 가용성 Vγ9+ TCR은 서열번호 95로 표시되는 CDR3을 포함하는 γ사슬 가변영역 및 서열번호 80으로 표시되는 CDR3을 포함하는 δ사슬 가변영역을 포함한다.

한 실시예에서, 가용성 Vγ9+ TCR은 서열번호 96으로 표시되는 CDR3을 포함하는 γ사슬 가변영역 및 서열번호 81로 표시되는 CDR3을 포함하는 δ사슬 가변영역을 포함한다.

한 실시예에서, 가용성 Vγ9+ TCR은 서열번호 97로 표시되는 CDR3을 포함하는 γ사슬 가변영역 및 서열번호 82로 표시되는 CDR3을 포함하는 δ사슬 가변영역을 포함한다.

한 실시예에서, 가용성 Vγ9+ TCR은 서열번호 98로 표시되는 CDR3을 포함하는 γ사슬 가변영역 및 서열번호 83으로 표시되는 CDR3을 포함하는 δ사슬 가변영역을 포함한다.

한 실시에에서, 가용성 Vγ9+ TCR은 서열번호 99로 표시되는 CDR3을 포함하는 γ사슬 가변영역 및 서열번호 84로 표시되는 CDR3을 포함하는 δ사슬 가변영역을 포함한다.

본 개시내용은 BTN2A1에 특이적으로 결합하고 γδ T세포의 활성화를 유도하는 BTN2A1 작용제를 추가로 제공한다.

본 개시내용은 BTN2A1에 특이적으로 결합하고 γδ T세포 활성화와 관련된 세포 표면 마커의 발현을 유도하는 BTN2A1 작용제를 추가로 제공한다.

본 개시내용은 BTN2A1에 특이적으로 결합하고 γδ T세포에 의한 사이토카인 또는 사이토카인의 분비를 유도하는 BTN2A1 작용제를 추가로 제공한다.

본 개시내용은 BTN2A1에 특이적으로 결합하고 암세포를 사멸시키는 γδ T세포를 유도 및/또는 암세포의 성장을 억제 및/또는 예를 들어, 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 감염된 세포 사멸 및/또는 예를 들어, 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 감염된 세포의 성장을 억제하는 BTN2A1 작용제를 추가로 제공한다.

본 개시내용은 BTN2A1에 특이적으로 결합하고

(i) γδ T세포를 활성화 및/또는 세포 집단에서 활성화된 γδ T세포의 수를 증가; 및/또는

(i) T세포 활성화의 마커를 발현하는 γδ T세포의 백분율을 증가; 및/또는

(ii) γδ T세포에 의한 사이토카인(예: 인터페론-γ)의 분비 증가; 및/또는

(iii) 암세포를 사멸시키는 γδ T세포의 유도 및/또는 암세포의 성장을 억제 및/또는 감염된 세포의 사멸 및/또는 감염된 세포의 성장을 억제; 및/또는

(iv) γδ T세포의 세포 표면에 발현되는 T세포 활성화 마커의 양을 증가시키는 BTN2A1 작용제를 추가로 제공한다.

본 개시내용은 BTN2A1에 특이적으로 결합하고

(i) 세포 표면에서 CD25를 발현하는 γδ T세포의 백분율을 증가; 및/또는

(ii) γδ T세포에 의한 인터페론 γ분비 증가; 및/또는

(iii) 암세포를 사멸시키는 γδ T세포를 유도 및/또는 암세포의 성장을 억제; 및/또는

(iv) γδ T 세포의 세포 표면에서 발현되는 CD25의 양을 증가시키는 BTN2A1 작용제를 추가로 제공한다.

한 예에서, BTN2A1 작용제는 적어도 6시간 또는 8시간 또는 10시간 또는 12시간의 기간 동안 시험관 내에서 γδ T세포 집단을 BTN2A1 작용제와 접촉시키고 CD25를 발현하는 집단에서 γδ T세포의 백분율을 유세포 분석으로 측정하는 것을 포함하는 분석에서 측정된 바와 같이 세포 표면에서 CD25를 발현하는 γδ T세포의 수를 증가시킨다. 이러한 분석은 또한 γδ T세포에서 발현되는 CD25 및/또는 기타 분자의 수준을 평가하는 데 유용하다.

한 예에서, 세포 표면에서 CD25를 발현하는 γδ T세포의 백분율 증가는 다음과 관련이 있다:

(i) BTN2A1 작용제와 접촉되지 않은 γδ T 세포 집단에서 세포 표면에서 CD25를 발현하는 γδ T 세포의 백분율; 및/또는

(ii) BTN2A1 작용제 또는 BTN2A1 길항제가 아닌 BTN2A1에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉된 γδ T 세포 집단에서 세포 표면에서 CD25를 발현하는 γδ T 세포의 백분율.

한 예에서, 작용제는 γδ T세포의 활성화의 하나 이상의 추가 마커(CD25에 추가)를 발현하는 γδ T세포의 백분율을 증가 및/또는 γδ T세포의 세포 표면상에 발현되는 활성화 CD25(CD25에 추가)의 하나 이상의 추가 마커의 양을 증가시킨다.

한 예에서, BTN2A1 작용제는 세포 표면에서 CD25를 발현하는 γδ T세포의 백분율을 γδ T세포 집단에서 세포의 적어도 10%까지 증가시킨다. 한 예에서, BTN2A1 작용제는 세포 표면에서 CD25를 발현하는 γδ T세포의 백분율을 γδ T세포 집단에서 세포의 적어도 15%까지 증가시킨다. 한 에에서, BTN2A1 작용제는 세포 표면에서 CD25를 발현하는 γδ T세포의 백분율을 γδ T세포 집단에서 세포의 적어도 20%까지 증가시킨다. 한 예에서, BTN2A1 작용제는 세포 표면에서 CD25를 발현하는 γδ T세포의 백분율을 γδ T세포 집단에서 세포의 적어도 30%까지 증가시킨다. 한 예에서, BTN2A1 작용제는 세포 표면에서 CD25를 발현하는 γδ T세포의 백분율을 γδ T세포 집단에서 세포의 적어도 40%까지 증가시킨다.

또 다른 예에서, BTN2A1 작용제는 적어도 6시간 또는 8시간 또는 10시간 또는 12시간의 기간 동안 BTN2A1 작용제와 함께 시험관내 세포 배양에서 γδ T 세포 집단을 배양하고 세포 배양액 mL당 인터페론-γ의 양을 측정하는 단계를 포함하는 분석에서 측정된 바와 같이 γδ T세포에 의한 인터페론-γ의 분비를 증가시킨다.

한 에에서, BTN2A1 작용제는 인터페론-γ의 분비를 γδ T세포 배양액에서 10pg/mL까지 증가시킨다. 한 예에서, BTN2A1 작용제는 인터페론-γ의 분비를 γδ T세포 배양액에서 20pg/mL까지 증가시킨다. 한 예에서, BTN2A1 작용제는 인터페론-γ의 분비를 γδ T 세포 배양액에서 30pg/mL까지 증가시킨다. 한 예에서, BTN2A1 작용제는 γδ T 세포 배양액에서 인터페론-γ의 분비를 40pg/mL까지 증가시킨다.

한 예에서, 작용제는 하나 이상의 추가 또는 대체 사이토카인(인터페론-γ에 추가 또는 대체)의 분비를 증가시킨다.

추가 예에서, 세포, 예를 들어 흑색종(melanoma) 세포 또는 흑색종 세포라인을 γδ T세포 및 BTN2A1 작용제 및 살아있는 세포에 의해 검출가능한 시약(예: 포르마잔(formazan))으로 환원되는 시약(예: 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드[MTT](3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide))의 존재하에 배양하고 검출가능한 시약을 검출하는 단계를 포함하는 분석에서 측정된 바와 같이 γδ T세포가 세포(예: 암세포 또는 감염된 세포)의 사멸 및/또는 성장을 억제하도록 유도하고, 여기서 BTN2A1 작용제의 부재와 비교하여 BTN2A1 작용제의 존재 하에 검출가능한 시약의 감소된 수준은 세포가 사멸되었거나 세포의 성장이 억제되었음을 나타낸다.

한 예에서, BTN2A1 작용제는 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질이다.

한 실시예에서, 단백질은 (i) 단일 사슬 Fv 단편(single chain Fv fragment:scFv)

(ii) 이량체(dimeric) scFv;

(iii) Fv 단편

(iv) 단일 도메인 항체(single domain antibody:sdAb);

(v) 나노바디(nanobody);

(vii) Fab 단편;

(viii) Fab' 단편;

(ix) F(ab') 단편;

(x) F(ab')₂ 단편;

(xi) 항체의 Fc 영역에 연결된 (i)-(x) 중 어느 하나;

(xiii) 항체이다.

한 실시예에서, BTN2A1 작용제는 서열번호 140으로 표시되는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(VL) 및 서열 144로 표시되는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 항체이다.

한 실시예에서, BTN2A1 작용제는 서열번호 148로 표시되는 서열을 포함하는 VL 및 서열번호 152로 표시되는 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체이다.

한 실시예에서, BTN2A1 작용제는 서열번호 156으로 표시되는 서열을 포함하는 VL 및 서열 160으로 표시되는 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체이다.

한 실시예에서, BTN2A1 작용제는 VL 및 임의의 상기 항체의 CDR을 포함하는 VH를 포함하는 항체이다. 예를 들어, CDR은 Kabat의 넘버링 시스템(numbering system)에 의해 정의된 것과 같다(Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991).

예를 들어, BTN2A1 작용제는 다음을 포함하는 항체이다:

(i) 다음을 포함하는 V_L:

(a) 서열번호 140의 아미노산 26-33에 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 140의 아미노산 51-53에 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 140의 아미노산 90-98에 표시되는 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는

(ii) 다음을 포함하는 V_H:

(a) 서열번호 144의 아미노산 26-33에 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 144의 아미노산 51-58에 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 144의 아미노산 97-109에 표시되는 서열을 포함하는 CDR3.

예를 들어, BTN2A1 작용제는 다음을 포함하는 항체이다:

(i) 다음을 포함하는 V_L:

(a) 서열번호 148의 아미노산 26-33에 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 148의 아미노산 51-53에 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 148의 아미노산 90-100에 표시되는 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는

(ii) 다음을 포함하는 V_H:

(a) 서열번호 152의 아미노산 26-33에 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 152의 아미노산 51-58에 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 152의 아미노산 97-116에 표시되는 서열을 포함하는 CDR3.

예를 들어, BTN2A1 작용제는 다음을 포함하는 항체이다:

(i) 다음을 포함하는 V_L:

(a) 서열번호 156의 아미노산 26-33에 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 156의 아미노산 51-53에 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 156의 아미노산 90-100에 표시되는 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는

(ii) 다음을 포함하는 V_H:

(a) 서열번호 160의 아미노산 26-33에 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 160의 아미노산 51-58에 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 160의 아미노산 97-109에 표시되는 서열을 포함하는 CDR3.

한 예에서, BTN2A1 작용제는 다음을 포함하는 항체이다:

(i) 다음을 포함하는 V_L:

(a) 서열번호 141로 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 142로 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 143으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는

(ii) 다음을 포함하는 V_H:

(a) 서열번호 145로 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 146으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 147로 표시되는 서열을 포함하는 CDR3.

한 예에서, BTN2A1 작용제는 다음을 포함하는 항체이다:

(i) 다음을 포함하는 V_L:

(a) 서열번호 149로 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 150으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 151로 표시되는 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는

(ii) 다음을 포함하는 V_H:

(a) 서열번호 153으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 154로 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 155로 표시되는 서열을 포함하는 CDR3.

한 예에서, BTN2A1 작용제는 다음을 포함하는 항체이다:

(i) 다음을 포함하는 V_L:

(a) 서열번호 157로 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 158로 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 159로 표시되는 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는

(ii) 다음을 포함하는 V_H:

(a) 서열번호 161로 표시되는 서열을 포함하는 CDR1;

(b) 서열번호 162로 표시되는 서열을 포함하는 CDR2; 및

(c) 서열번호 163으로 표시되는 서열을 포함하는 CDR3.

한 예에서, 본 개시내용의 BTN2A1 작용제는 친화성 성숙, 키메릭, CDR 이식 또는 인간화 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이다.

한 예에서, BTN2A1 작용제는 단백질, 예를 들어 본원에 개시된 항체의 결합을 경쟁적으로 억제 및/또는 본원에 개시된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 가변 영역을 포함하는 항체이다.

본 개시내용은 또한 상기 기재된 바와 같이 대상체에게 BTN2A1 작용제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 Vγ9+ TCR을 발현하는 γδ T세포를 활성화시키는 방법을 제공한다.

본 개시내용은 또한 상기 기재된 바와 같이 대상체에게 BTN2A1 작용제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 Vγ9+ γδ T세포 반응을 유도 또는 향상시키는 방법을 제공한다.

본 개시내용은 또한 상기 기재된 바와 같이 BTN2A1 작용제의 존재 하에 γδ T 세포 및 BTN2A1을 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 시험관내 또는 생체외에서 Vγ9+ TCR을 발현하는 γδ T 세포를 활성화시키는 방법을 제공한다. 한 실시예에서, 방법은 활성화된 γδ T세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

본 개시내용은 또한 대상체에서 암 또는 감염을 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방 또는 증상완화에 충분한 양으로 BTN2A1 작용제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 감염의 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방 또는 증상완화 방법을 제공한다,

서열 목록의 핵심

서열번호 1은 인간 BTN2A1 이소폼(isoform) 1의 아미노산 서열이다.

서열번호 2는 인간 BTN2A1 이소폼 2의 아미노산 서열이다.

서열번호 3은 인간 BTN2A1 이소폼 3의 아미노산 서열이다.

서열번호 4는 인간 BTN2A1 이소폼 4의 아미노산 서열이다.

서열번호 5는 인간 아넥신(Annexin) A5의 아미노산 서열이다.

서열번호 6은 인간 아넥신 A1의 아미노산 서열이다.

서열번호 7은 락타데린(Lactadherin) C1C2 도메인의 아미노산 서열이다.

서열번호 8은 PSP1 단백질의 아미노산 서열이다.

서열번호 9 내지 69는 프라이머를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열이다(표 2 참조).

서열번호 70은 δ2(클론(clone) 6)의 아미노산 서열이다.

서열번호 71은 δ2(클론 3)의 아미노산 서열이다.

서열번호 72는 δ2(클론 4)의 아미노산 서열이다.

서열번호 73은 δ2(클론 5)의 아미노산 서열이다.

서열번호 74는 δ2(클론 7)의 아미노산 서열이다.

서열번호 75는 δ2(클론 6)의 가변영역의 아미노산 서열이다.

서열번호 76은 δ2(클론 3)의 가변영역의 아미노산 서열이다.

서열번호 77은 δ2(클론 4)의 가변 영역의 아미노산 서열이다.

서열번호 78은 δ2(클론 5)의 가변 영역의 아미노산 서열이다.

서열번호 79는 δ2(클론 7)의 가변 영역의 아미노산 서열이다.

서열번호 80은 CDR3δ(클론 3)의 아미노산 서열이다.

서열번호 81은 CDR3δ(클론 4)의 아미노산 서열이다.

서열번호 82는 CDR3δ(클론 5)의 아미노산 서열이다.

서열번호 83은 CDR3δ(클론 6)의 아미노산 서열이다.

서열번호 84는 CDR3δ(클론 7)의 아미노산 서열이다.

서열번호 85는 γ9(클론 6)의 아미노산 서열이다.

서열번호 86은 γ9(클론 3)의 아미노산 서열이다.

서열번호 87은 γ9(클론 4)의 아미노산 서열이다.

서열번호 88은 γ9(클론 5)의 아미노산 서열이다.

서열번호 89는 γ9(클론 7)의 아미노산 서열이다.

서열번호 90은 γ9(클론 6)의 가변영역의 아미노산 서열이다.

서열번호 91은 γ9(클론 3)의 가변영역의 아미노산 서열이다.

서열번호 92는 γ9(클론 4)의 가변영역의 아미노산 서열이다.

서열번호 93은 γ9(클론 5)의 가변영역의 아미노산 서열이다.

서열번호 94는 γ9(클론 7)의 가변영역의 아미노산 서열이다.

서열번호 95는 CDR3γ(클론 3)의 아미노산 서열이다.

서열번호 96은 CDR3γ(클론 4)의 아미노산 서열이다.

서열번호 97은 CDR3γ(클론 5)의 아미노산 서열이다.

서열번호 98은 CDR3γ(클론 6)의 아미노산 서열이다.

서열번호 99는 CDR3γ(클론 7)의 아미노산 서열이다.

서열번호 100은 Hu34C V_H의 아미노산 서열이다.

서열번호 101은 Hu34C V_L의 아미노산 서열이다.

서열번호 102는 Hu34C V_H CDR1의 아미노산 서열이다.

서열번호 103은 Hu34C V_H CDR2의 아미노산 서열이다.

서열번호 104는 Hu34C V_H CDR3의 아미노산 서열이다.

서열번호 105는 Hu34C V_L CDR1의 아미노산 서열이다.

서열번호 106은 Hu34C V_L CDR2의 아미노산 서열이다.

서열번호 107은 Hu34C V_L CDR3의 아미노산 서열이다.

서열번호 108은 클론 227 V_H의 아미노산 서열이다.

서열번호 109는 클론 227 V_L의 아미노산 서열이다.

서열번호 110은 클론 227 V_H CDR1의 아미노산 서열이다.

서열번호 111은 클론 227 V_H CDR2의 아미노산 서열이다.

서열번호 112는 클론 227 V_H CDR3의 아미노산 서열이다.

서열번호 113은 클론 227 V_L CDR1의 아미노산 서열이다.

서열번호 114는 클론 227 V_L CDR2의 아미노산 서열이다.

서열번호 115는 클론 227 V_L CDR3의 아미노산 서열이다.

서열번호 116은 클론 236 V_H의 아미노산 서열이다.

서열번호 117은 클론 236 V_L의 아미노산 서열이다.

서열번호 118은 클론 236 V_H CDR1의 아미노산 서열이다.

서열번호 119는 클론 236 V_H CDR2의 아미노산 서열이다.

서열번호 120은 클론 236 V_H CDR3의 아미노산 서열이다.

서열번호 121은 클론 236 V_L CDR1의 아미노산 서열이다.

서열번호 122는 클론 236 V_L CDR2의 아미노산 서열이다.

서열번호 123은 클론 236 V_L CDR3의 아미노산 서열이다.

서열번호 124는 클론 266 V_H의 아미노산 서열이다.

서열번호 125는 클론 266 V_L의 아미노산 서열이다.

서열번호 126은 클론 266 V_H CDR1의 아미노산 서열이다.

서열번호 127은 클론 266 V_H CDR2의 아미노산 서열이다.

서열번호 128은 클론 266 V_H CDR3의 아미노산 서열이다.

서열번호 129는 클론 266 V_L CDR1의 아미노산 서열이다.

서열번호 130은 클론 266 V_L CDR2의 아미노산 서열이다.

서열번호 131은 클론 266 V_L CDR3의 아미노산 서열이다.

서열번호 132는 클론 267 V_H의 아미노산 서열이다.

서열번호 133은 클론 267 V_L의 아미노산 서열이다.

서열번호 134는 클론 267 V_H CDR1의 아미노산 서열이다.

서열번호 135는 클론 267 V_H CDR2의 아미노산 서열이다.

서열번호 136은 클론 267 V_H CDR3의 아미노산 서열이다.

서열번호 137은 클론 267 V_L CDR1의 아미노산 서열이다.

서열번호 138은 클론 267 V_L CDR2의 아미노산 서열이다.

서열번호 139는 클론 267 V_L CDR3의 아미노산 서열이다.

서열번호 140은 항체 244의 V_L의 아미노산 서열이다.

서열번호 141은 항체 244의 V_L의 CDR1의 아미노산 서열이다.

서열번호 142는 항체 244의 V_L의 CDR2의 아미노산 서열이다.

서열번호 143은 항체 244의 V_L의 CDR3의 아미노산 서열이다.

서열번호 144는 항체 244의 V_H의 아미노산 서열이다.

서열번호 145는 항체 244의 V_H의 CDR1의 아미노산 서열이다.

서열번호 146은 항체 244의 V_H의 CDR2의 아미노산 서열이다.

서열번호 147은 항체 244의 V_H의 CDR3의 아미노산 서열이다.

서열번호 148은 항체 253의 V_L의 아미노산 서열이다.

서열번호 149는 항체 253의 V_L의 CDR1의 아미노산 서열이다.

서열번호 150은 항체 253의 V_L의 CDR2의 아미노산 서열이다.

서열번호 151은 항체 253의 V_L의 CDR3의 아미노산 서열이다.

서열번호 152는 항체 253의 V_H의 아미노산 서열이다.

서열번호 153은 항체 253의 V_H의 CDR1의 아미노산 서열이다.

서열번호 154는 항체 253의 V_H의 CDR2의 아미노산 서열이다.

서열번호 155는 항체 253의 V_H의 CDR3의 아미노산 서열이다.

서열번호 156은 항체 259의 V_L의 아미노산 서열이다.

서열번호 157은 항체 259의 V_L의 CDR1의 아미노산 서열이다.

서열번호 158은 항체 259의 V_L의 CDR2의 아미노산 서열이다.

서열번호 159는 항체 259의 V_L의 CDR3의 아미노산 서열이다.

서열번호 160은 항체 259의 V_H의 아미노산 서열이다.

서열번호 161은 항체 259의 V_H의 CDR1의 아미노산 서열이다.

서열번호 162는 항체 259의 V_H의 CDR2의 아미노산 서열이다.

서열번호 163은 항체 259의 V_H의 CDR3의 아미노산 서열이다.

도 1. BTN2A1에 의존하는 Vγ9Vδ2 + γδ T세포 수용체 테트라머 염색. (A) 다양한 세포라인의 Vγ9Vδ2+ γδTCR 테트라머 염색. γδTCR 테트라머 #3-#7; 관련없는 대조군(마우스 CD1d-α-GalCer) 테트라머; 스트렙타비딘(streptavidin)(SAv)-PE 대조군을 나타내는 히스토그램(Histograms). (B) 분류되지 않은 세포 및 Vγ9Vδ2 γδTCR tetramer^lo LM-MEL-62 세포 사이의 각 gRNA에 대한 log₂(배수 변화) 대 -log₁₀(p-값)을 나타내는 볼캐노 플롯(Volcano plo), 여기서 짙은 회색은 상당한 차이를 나타낸다(오발견률(false discovery rate) < 0.05). (c) 모세포와 비교한 LM-MEL-62 BTN2A1^null 및 LM-MEL-75 BTN2A1^null 세포의 Vγ9Vδ2+ γδTCR 테트라머 염색. (D) 항-BTN2A1 mAb(클론 231), 항-BTN3A1/3A2/3A3 mAb(클론 103.2), 및 BTN2A1 또는 BTN3A1로 형질감염된 모세포 및 BTN2A1^null1 ^/ ^null2 LM-MEL-62 세포에 대한 Vγ9Vδ2+ γδTCR 테트라머(#6) 염색. ^*WT 세포의 γδTCR 테트라머 염색은 두 번 묘사된다. (E) 항-BTN2A1 mAb 패널로 세포를 사전 인큐베이션한 후 LM-MEL-62, LM-MEL-75 및 HEK-293T 세포의 Vγ9Vδ2+ γδTCR 테트라모 #6 염색, 이소타입(isotype) 대조군(백색)과 비교. 하단 히스토그램은 관련없는 마우스 CD1d-α-GalCer 테트라머를 사용한 대조군 염색을 나타낸다. (A), (C), (D), (E)의 데이터는 두 개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 2. Vγ9 + γδ T세포 수용체에 결합하는 BTN2A1 . (A) BTN2A1 테트라머-PE(첫 번째 콜룸(column)) 또는 스트렙타비딘-PE 대조군(두 번째 콜룸) 대 3개의 대표적인 인간 PBMC 샘플에 대한 CD3ε 염색. 게이트(gated) γδ T세포(CD3+ γδTCR+), αβ T세포(CD3+ γδTCR-), B세포(CD3-CD19+), 단핵구(CD3-CD19-CD14+) 또는 기타(CD3-CD19-CD14-) 서브세트에 대한 BTN2A1 테트라머-PE 염색(백색) 또는 스트렙타비딘-PE 대조군(회색)을 나타내는 히스토그램. 다른 공여자의 혈액 샘플에서 BTN2A1 테트라머에 결합하는 각 세포 계통의 백분율을 나타내는 박스(box) 및 위스커 플롯(whisker plots)(오른쪽). (B) Vγ9+Vδ2+, Vγ9+Vδ1+, Vγ9-Vδ1+ γδ T세포에서 스트렙타비딘-PE 단독 대조군(회색 히스토그램) 염색으로 오버레이드(overlaid)되었으며 부모 게이팅(parent gating)은 왼쪽에 표시되는 BTN2A1 테트라머(백색 히스토그램). 다른 공여자에서 BTN2A1 테트라머-PE에 결합하는 각 γδ T세포 서브세트의 백분율을 나타내는 박스 및 위스커 플롯(오른쪽). (C) 정제된 시험관 내 확장 Vδ2+ T세포를 사용한 이중 염색 또는 단일 염색 대조군에서 BTN2A1 테트라머-PE와 CD3ε-APC 간의 FRET 형광(히스토그램 오버레이). 박스 및 위스커 플롯은 다양한 인간 공여자의 γδ T세포 서브세트에서 FRET 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity:MFI)를 나타낸다. (D) 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)에 의해 측정된 고정화된 Vγ9+Vδ2+('TCR #6', 왼쪽), Vγ9+Vδ1+('하이브리드', 중간) 및 Vγ5+Vδ1+('9C2', 오른쪽) γδTCR에 대한 가용성 BTN2A1(200-3.1 μM)의 결합. 포화(Saturation) 플롯(아래)은 평형 및 스캐차드(Scatchard) 플롯에서의 결합을 나타낸다. K _D , 평형에서 해리 상수 ± SEM; SAv, 스트렙타비딘. (A)의 데이터는 2개의 독립적인 실험에서 모은 n=8 공여자를 나타낸다; (B) 두 실험에서 n=8 공여자; (C) 3개의 독립적인 실험에서 모인 n=7 공여자; (D) n=2개의 개별 실험, 그 중 하나(Expt 2)가 이중으로 수행되고 평균화되었다.
도 3. BTN2A1에 의존하는 pAg에 대한 γδ T세포 기능적 반응. (A) CD25 발현 및 CD3ε은 표시된 바와 같이 24시간±4μM 졸레드로네이트(zoledronate) 및 ±10μg/ml 중화 항-BTN2A1 mAb 동안 배양된 PBMC 중에서 게이트된 Vδ2+ 및 대조군 Vδ1+ T세포에 대한 형광 강도(MFI)를 의미한다. *, p<0.05; **, p<0.01, ***, p<0.001, ANOVA에 의해. (B) (A)의 배양 상청액(culture supernatants)에서 IFN-γ 및 TNF 농도. **, p<0.01; ***, p<0.001, Friedman test에 의해. (C) 4μM 졸레드로네이트(zoledronate)가 없거나(회색) 또는 함께(진한 회색) 부모 또는 BTN2A1^null LM-MEL-62 APC와 공동 배양된 정제된 시험관 내 확장 Vδ2+ T세포에서 CD3 MFI 및 CD25 발현. 각 기호는 다른 공여자를 나타낸다. 막대 그래프는 평균 ±SEM을 나타낸다. (D) 1μM 졸레드로네이트로 2일 챌린지(challenge)한 후 IL-2를 함유하는 배지에서 추가로 7일 동안 비부착 PBMC를 유지한 후 PBMC와 부모 또는 BTN2A1^null1 LM-MEL-62 APC의 공동 배양에서 Vδ2+ γδ T세포의 수. *, p< 0.05 Mann-Whitney test를 사용. (E) 입력 세포수(input cell number)에 대해 정규화된 대사 염료(metabolic dye) MTS를 사용하여 결정된 세포 생존율은 표시된 시점 ±1μM 졸레드로네이트에서 시험관 내 확장 Vδ2+ T세포와 부모 또는 BTN2A1^null LM-MEL-62 표적의 공동 배양물의 공동 배양물이다. *, p< 0.05 Mann-Whitney test를 사용. (F) HMBPP(0.5ng/ml) 또는 플레이트-결합된(plate-bound) 항-CD3 플러스(plus) 항-CD28(10μg/ml each) ±10㎍/ml 중화 항-BTN2A1 mAb와 함께 정제된 시험관내-확장된 Vδ2+ T세포의 배양 후 CD25 발현(왼쪽) 및 IFN-γ농도(오른쪽). (A) 및 (B) n=8명의 공여자의 데이터는 두 개의 독립적인 실험에서 풀링됨(pooled); (C) 3개의 독립적인 실험에서 풀링된 n=3 공여자, 각각 다른 기호로 표시된 n=4 기술 복제로 수행됨; (D) n=4 공여자, 각각은 5개의 독립적인 실험에 걸쳐 1-5개의 기술적 복제에서 평균을 냈고; (E) 2개의 독립적인 실험에서 풀링된 n=8 공여자; (F) n=4 공여자, 각각은 6개의 독립적인 실험에 걸쳐 2-6개의 기술 복제에서 평균을 냈다. 졸, 졸레드로네이트..
도 4. pAg 표시에 필요한 BTN2A1 및 BTN3A1 모두. (A) 40μM 졸레드로네이트의 존재(진한 회색) 또는 부재(회색)하에, G115 Vγ9Vδ2+ γδ TCR(상단행), 9C2 Vγ5Vδ1+ γδ TCR(가운데), 및 모(TCR-) J.RT3-T3.5(하단행) 표시된 APC와의 밤새 공동 배양 후 Jurkat 세포에서의 CD69 발현. 숫자는 중앙 형광 강도를 나타낸다. (B) (B) BTNL3 , BTNL8 , BTN2A1 , BTN3A1 및 BTN3A2, 또는 (C) BTN2A1ΔB30, BTN3A1 및 BTN3A2의 표시된 조합으로 형질감염된 CHO-K1(햄스터 기원) 또는 NIH-3T3(마우스 기원) APC와 함께 4μM 졸레드로네이트의 존재(진한 회색) 또는 부재(회색)에서 24시간 동안 공동 배양된 정제된 시험관 내 확장 γδ T세포에서 CD25 발현의 변화. (D) γδ T세포는 각각 BTN2A1, BTN3A1 및 BTN3A2의 조합으로 개별적으로 형질감염된 2개의 APC 집단의 1:1 혼합물의 존재를 제외하고 (A)에서와 같이 공동-배양된다. 각 기호와 연결선은 다른 공여자를 나타낸다. *, p < 0.05; **, p < 0.01 a Wilcoxon paired test를 사용. 막대 그래프는 평균 ±SEM을 나타낸다. (A) 세 가지 유사한 실험 중 하나를 나타내는 데이터; (B-D)는 3-5개의 독립적인 실험에서 풀링된 그룹당 n=7-9명의 공여자를 나타낸다.
도 5. 세포 표면에서 BTN3A1과 결합하는 BTN2A1 . (A) 표면 BTN2A1(클론 259) 및 BTN3A(클론 103.2), 및 모 LM-MEL-75("WT", 상단행), BTN2A1^null(가운데 행) 및 BTN3A1^null(하단행) 세포에 대한 판-HLA 클래스 I(pan-HLA class I)(클론 W6/32)의 Z-스택(Z-stack) 공초점 현미경. (B) 개별 시야에 대한 피어슨 상관 계수(Pearson correlation coefficients)를 나타내는 그래프. 항-BTN2A1 대 항-BTN3A1/3A2/3A3("BTN3A")(왼쪽), 항-BTN2A1 대 항-HLA-A,B,C(가운데), 및 항-BTN3A 대 항 -HLA-A,B,C(오른쪽)간의 상관관계를 나타내는 대표적인 복셀 밀도 플롯(voxel density plots). ***, p<0.001 Kruskal-Wallis with Dunn's post test를 사용. (C) 표시된 mAb 클론을 사용하여 LM-MEL-75 세포에서 항-BTN2A1 대 BTN3A 공동 염색 또는 단일 염색, 또는 마우스 IgG1 대 마우스 IgG2a 이소타입 대조군 염색(각각 x축 및 y축). FRET 형광을 나타내는 히스토그램(두 번째 행). (D) 부티로필린(butyrophilin)CFP/YFP-형질감염된 NIH-3T3 세포 사이의 FRET+ 세포의 백분율. (A) 및 (B) 2개의 풀링된 독립적인 실험; (C) 하나의 실험; (D) 4개의 독립적인 실험을 나타내는 데이터.
도 6. 두 개의 별개의 리간드 결합 도메인을 포함하는 Vγ9Vδ2 + γδ T세포 수용체. (A) G115 WT γδTCR의 BTN2A1 테트라머 염색으로 표준화된 단일 잔기 G115 γδTCR 알라닌 돌연변이체(alanine mutants)(또는 대조군 Jurkat.9C2 γδTCR)로 형질감염된 게이트 GFP+CD3+ HEK-293T 세포의 BTN2A1 사량체-PE(진한 회색) 및 대조군 스트렙타비딘-PE 단독(검정색) 염색. (B) G115 γδTCR의 카툰 뷰(Cartoon view)(pdb 코드 1HXM(T.J. Allison et al.(2001)) R20, E70 및 H85의 측쇄를 나타내는 Vγ9 ABED β-시트. (C) 40μM 졸레드로네이트의 존재(진한 회색) 또는 부재(검정)에서 LM-MEL-75 APC로 밤새 배양한 후. G115 WT γδTCR+ Jurkat 세포의 활성화 수준으로 정규화된 G115 γδTCR 알라닌 돌연변이체(또는 9C2 γδTCR+ 또는 모 γδTCR- Jurkat 세포)를 발현하는 Jurkat 세포에서의 CD69 발현. (D) BTN2A1 테트라머 결합(상단행) 및 졸레드로네이트 반응성(하단행)에 중요한 잔기를 나타내는 G115 γδTCR(pdb 코드 1HXM(25))의 표면. BTN2A1 결합 또는 CD69 유도가 75% 이상 손실된 잔기의 측쇄는 표지되고 또한 짙은 회색으로 표시; 50%-75% 감소는 표지되고 중간 어두운 회색으로도 표시; <50% 감소는 회색; Vδ2, 밝은 회색; Vγ9, 중간 회색; 불변 영역, 흰색으로 표시됨. MFI, 중앙 형광 강도; SAv, 스트렙타비딘 단독 대조군; 무자극(unstim), 무자극 대조군(unstimulated control). (A) 및 (B)의 데이터는 N=3 개별 실험의 평균 ±SEM을 나타낸다.
도 7. BTN2A1에 의존한 항- BTN3A1 mAb 클론 20.1의 작용 활성(Agonistic activity). 항-BTN3A(클론 20.1, 10μg/ml, 짙은 회색 히스토그램) 또는 이소타입 대조군(마우스 IgG1, 10μg/ml, 밝은 회색)과 함께 사전 배양된 부모 LM-MEL-75("WT") 또는 BTN2A1^null APC와 공동 배양 후, Vγ9Vδ2+ γδTCR(클론 G115), 또는 표시된 G115 γδTCR 돌연변이, 또는 대조군 Vγ5Vδ1+ γδTCR(클론 9C2)을 발현하는 Jurkat 세포에서의 CD69 발현.
도 8. 가용성 Vγ9Vδ2 + γδ TCR 테트라머의 생성. (A) PBMC의 단일 세포 분류 Vδ2+ γδ T세포에서 Vδ2 및 Vγ9에 대한 PCR. 음성 대조군은 동일한 플레이트의 빈 웰에 대한 PCR을 나타낸다. (B) 선택된 세포에서 짝을 이루는 γ-사슬 및 δ-사슬 유전자 사용 및 CDR3 모티프(motifs). (C) 류신 지퍼(leucine zippers) 및 Avi-tag/His6 태그에 결합된 전장 엑토도메인(full-length ectodomains)을 포함하는 가용성 γδ TCR 구성 설계. (D) 비오틴화된(biotinylated) TCR δ-사슬이 천연 스트렙타비딘과의 복합체에 통합되었음을 보여주는, 단독으로 또는 변성되지 않은 천연 스트렙타비딘(SAv)과 혼합된 변성 가용성 비오틴화 및 비오틴화되지 않은 Vγ9Vδ2+ γδ TCR의 SDS-PAGE 분석. MW, 분자량 마커.
도 9. 전체 게놈 CRISPR / Cas9 녹아웃(knockout) 스크린을 사용한 Vγ9Vδ2 + γδ TCR 리간드의 확인. (A) n=4 개별 복제물로부터 연속 4회 분류 정제한 γδTCR 테트라머 #6^lo LM-MEL-62 세포. 각 라운드의 분류 후, 배양 1-2주 후 대조군 염색으로 오버레이드된 γδTCR 테트라머 #6을 나타내는 히스토그램. (B) 대조군 미분류("사전 분류") LM-MEL-62 세포와 비교되는, γδTCR 테트라머 #6^lo 집단 내의 상위 40개 가이드 RNA 유전자 표적.
도 10. BTN2A1 및 BTN3A1 녹아웃 세포주의 생성.
BTN2A1^null 및 BTN3A1^null LM-MEL-62 또는 LM-MEL-75 세포는 Cas9 및 특이적 가이드 RNA를 엔코딩하는 벡터로 표적 세포를 일시적으로 형질감염시킨 후, 벌크 세포 분류(bulk cell sorting)를 통해 생성했다. (A) 이소타입 대조군과 오버레이드된 각 세포라인의 항-BTN2A1(클론 231) 및 항-BTN3A1/3A2/3A3(클론 103.2) 염색. (B) 관련없는 테트라머 대조군(마우스 CD1d-α-GalCer, 회색)과 오버레이드된 각 세포주의 Vγ9Vδ2+ γδ TCR 테트라머 #6 염색(진한 회색). 데이터는 두 개의 유사한 실험을 나타낸다.
도 11. 항- BTN2A1 mAb의 생성. (A) BTN2A1, BTN2A2, BTN3A1, BTN3A2 엑토도메인의 정렬. (B) ELISA에 의한 플레이트 결합 BTN2A1, BTN2A2 또는 BTN3A3 엑토도메인에 대한 항-BTN2A1 mAb 클론의 결합, 여기서 히트 맵은 흡광도를 나타낸다. (C) 표시된 대로 전장 인간 BTN2A1, BTN2A2 또는 BTN3A1로 형질감염된 마우스 NIH-3T3 세포, 또는 형질감염되지 않은 세포에 대한 항-BTN2A1 mAb 반응성. (D) BV421-접합된 2차 폴리클로날(polyclonal) Ab를 사용하여 LM-MEL-62 모("WT"), BTN2A1^null1 및 BTN2A1^null2 세포에 대한 선택된 항-BTN2A1 클론 또는 이소타입 대조군(마우스 IgG2a κ, 클론 BM4)의 반응성. 동일한 이소타입 대조군이 각 개별 행에 걸쳐 오버레이드된다. (E) PE-접합된 2차 폴리클로날 Ab를 사용한 LM-MEL-62 모("WT"), BTN2A1^null 및 BTN3A1^null 세포에 대한 선택된 항-BTN2A1 클론의 반응성. A450, 450 nm에서의 흡광도.
도 12. BTN2A1 테트라머의 생성. (A) C-말단 링커(아미노산 서열: GTGSGSGG)에 융합된 BTN2A1 엑토도메인(IgV 및 IgC 도메인, Gln29에서 Ser245), 그 다음 Avi(비오틴 리가제(biotin ligase)) 및 His6- 태그(아미노산 서열: LNDIFEAQKIEWHEHHHHH)를 포함하는 구성 설계. (B) 293T 세포에서 생산된 비오틴화된 BTN2A1(및 대조군 BTN3A1) 엑토도메인의 SDS-PAGE 분석. 오른쪽 차선은 변성되지 않은 스트렙타비딘(SAv.) 및 복합된 BTN2A1-비오틴을 변성했다. (C) 이소타입 대조군(클론 BM4)과 비교하여 항-BTN2A1 클론 Hu34C 및 231에 대한 플레이트-결합된 BTN2A1 엑토도메인 반응성의 ELISA. 한 실험을 나타내는 패널(C)의 데이터. MW, 분자량 마커.
도 13. Vγ9Vδ2 + γδ TCR 테트라머에 의해 특이적으로 인식되는 BTN2A1 .
인간 BTN2A1, BTN2A2, BTNL3 플러스 BTNL8 또는 BTN3A1 플러스 BTN3A2(부모 게이팅은 밀도 플롯의 맨 위 행에 표시됨)로 형질감염된 후. gated GFP+ 마우스 3T3 세포에 Vγ9Vδ2+ γδ TCR 테트라머 #6, 관련없는 대조군 테트라머(마우스 CD1d-α-GalC) 또는 대조군 스트렙타비딘(SAv.) 단독 염색. 데이터는 두 개의 유사한 실험을 나타낸다.
도 14. Vδ2 + γδ T세포의 pAg 매개 활성화는 특이적으로 차단하지만 CD8+ αβ T세포의 펩티드 매개 활성화는 차단하지 않는 길항제 항- BTN2A1 mAb .
(A) pAg HMBPP(0.5ng/ml) 또는 졸레드로네이트(4μM) 단독으로 또는 거대 세포 바이러스(cytomegalovirus), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus) 및 인플루엔자(influenza)(1μg/ml)±10μg/ml 중화 항-BTN2A1 mAb(클론 Hu34C, 236, 259, 267), 항-BTN3A 분자(클론 103.2) 또는 이소타입 대조군(마우스 IgG2a, κ, 클론 BM4).에서 유래한 면역원성 펩티드를 함유하는 CEF 펩티드 혼합물 조합과 시험관 내 챌린지 후, PBMC 중 게이트 Vδ2+ CD3+ T세포(왼쪽) 또는 CD8+ CD3+ T세포(오른쪽)에 대한 세포내 IFN-γ 발현. (B) 대표적인 게이팅(상단행) 및 게이트 Vδ2+ CD3+ T세포(가운데행) 또는 CD8+ CD3+ T세포(하단행)에 대한 IFN-γ염색 플롯. 데이터는 두 개의 독립적인 실험에서 얻은 7명의 공여자를 나타낸다.
도 15. BTN2A1에 의존하는 졸레드로네이트 , HMBPP 및 IPP에 대한 Jurkat G115 Vγ9Vδ2 + γδ T세포 반응.
(A) 차등된 용량(graded doses)의 pAgs HMBPP, IPP 또는 졸레드로네이트±모체 LM-MEL-75 APC와의 공동배양 후. Jurkat G115 Vγ9Vδ2 γδTCR+ 또는 대조군 Jurkat 9C2 Vγ5Vδ1 γδTCR+ T세포에 대한 CD69 유도. Jurkat G115 및 Jurkat 9C2 T세포라인을 모체 LM-MEL-75, BTN2A1^null 또는 BTN3A1^null APC±HMBPP(100nM), IPP(100μM) 또는 졸레드로네이트(40μM)와 공동배양한 후, (B) 대표적인 CD69 히스토그램 및 (C) 발현 수준. 한 실험의 (A) 데이터; (B) 및 (C) N=4 독립적인 실험에서 풀링.
도 16. BTN2A1 및 BTN3A1은 pAg를 γδ T세포에 제시할 수 있는 능력을 가 진 마우스 APC를 생성. (A) BTNL3, BTNL8, BTN2A1, BTN3A1 및 BTN3A2, 또는 BTN2A1ΔB30의 표시된 조합으로 형질감염된 NIH-3T3 세포에서, BTN2A1(클론 231) 대 BTN3A1/3A2/3A3 염색(클론 103.2), 또는 이소타입 대조군 염색(마우스 IgG2a 클론 BM4). (B) BTNL3, BTNL8, BTN2A1, BTN3A1 및 BTN3A2 또는 BTN2A1ΔB30의 표시된 조합으로 형질감염된 CHO-K1 또는 NIH-3T3 APC가 있는 4μM 졸레드로네이트의 존재(진한 회색) 또는 부재(회색)에서, 24시간 동안 동시 배양된 정제된 시험관 내 확장 γδ T세포에서 CD25 발현. 오른쪽의 3개 그룹은 각각 BTN2A1, BTN3A1 및 BTN3A2의 표시된 조합으로 개별적으로 형질감염된 2개의 APC 집단의 1:1 혼합물의 존재하에 공동배양된 γδ T세포를 나타낸다. (C) 관련 대조군과 오버레이드된 BTN2A1 및 BTN2A1ΔB30 구조(왼쪽)의 개략도와 BTN2A1 또는 BTN2A1ΔB30으로 형질감염된 NIH-3T3 세포의 항-BTN2A1(클론 259) 및 γδTCR 테트라머(#6)를 나타내는 히스토그램. 데이터는 3-5개의 독립적인 실험에서 모은 그룹당 n=7-9명의 공여자를 나타낸다. TM, 막횡단 도메인(transmembrane domain).
도 17. BTN2A1의 세포내 B30.2 도메인에 대한 HMBPP의 검출가능한 결합의 부존재. (A) 원시 등온 적정 열량계(Raw isothermal titration calorimetry) 추적 및 (B) pAgs HMBPP, IPP 또는 PBS 버퍼 단독의 연속 주입 시 재조합 BTN2A1(왼쪽 콜름) 또는 BTN3A1(오른쪽 콜름) B30.2 도메인(100μM)의 결합 등온선. 두 가지 독립적인 실험 중 하나에서 얻은 데이터이다.
도 18. 세포내 B30.2 도메인과 무관한 세포 표면에서 BTN2A1 및 BTN3A1 사이의 연관.
BTN2A1, BTN3A1, BTN3A1 및/또는 BTN2A의 표시된 조합으로 형질감염된 마우스 NIH-3T3 세포에서 이소타입 대조군 염색(x축의 마우스 IgG1 클론 MOPC-173 대 y축의 마우스 IgG2a 클론 BM4 대, 회색)과 중첩된 BTN3A(클론 103.2) 염색(진회색) 대 BTN2A1(클론 259)을 나타낸 등고선(Contour) 플롯(상단 행). 2개의 독립적인 실험을 나타내는 데이터이다.
도 19. CFP- 및 YFP -태그가 붙은 부티로필린 ( butyrophilin ) 구조의 생성.
(A) CFP 또는 YFP에 결합된 "긴(long)" 또는 "짧은(short)" C-말단 유연한 링커가 있는 전장 BTN2A1, BTN3A1, BTNL3 및 BTNL8의 디자인. (B) C-말단 링커 및 CFP/YFP 도메인의 아미노산 서열. (C) 각각의 구성물로 일시적으로 형질감염된 마우스 NIH-3T3 세포에서 항-BTN2A1(클론 231) 및 항-BTN3A 분자(클론 103.2) mAb 염색(진한 회색) 또는 이소타입 대조군 염색(IgG1 대 IgG2a, 검정색)을 나타내는 대표적인 플롯. (D) WT BTN 분자 또는 CFP/YFP 태그-BTN 분자로 형질감염된 마우스 NIH-3T3 세포에서 BTN2A1(왼쪽) 및 BTN3A1(오른쪽) 표면 발현을 나타내는 대표적인 플롯.
도 20. pAg의 영향을 받지 않고 연관되어 있는 BTN2A1 및 BTN3A1의 세포내 도메인.
(A) 부티로필린 분자(상단행) 또는 단일 형질감염된 대조군(두 번째행)의 다양한 조합으로 형질감염된 마우스 3T3 세포에서 FRET 대 공여자 형광단(donor fluorophore:CFP)을 나타내는 플롯. (B) CFP/YFP 태그 부티로필린 형질감염 마우스 3T3 세포의 표시된 조합 사이의 FRET, ±HMBPP(100ng/ml) 또는 졸레드로네이트(40μM)로 밤새 챌린지. (C) 항-BTN2A1(클론 259) 및 항-BTN3A1(클론 103.2) 공동 염색에 의해 측정된 BTN2A1 및 BTN3A1 엑토도메인 사이의 FRET, ±HMBPP(100ng/ml) 또는 졸레드로네이트(40μM)로 밤새 챌린지. 모든 플롯은 감염되지 않은 대조군을 제외하고 감염된 세포(CFP 또는 YFP 또는 둘 다)에 미리 게이트(pre-gated)되어 있다. (A)의 데이터는 4개의 독립적인 실험을 대표하고; (B) 및 (C) 두 개의 독립적인 실험을 대표한다.
도 21. 항- BTN2A1 mAb에 의해 중단된 BTN2A1 및 BTN3A1 사이의 세포내 도메인 연관.
형질감염된 마우스 NIH-3T3 세포를 비접합된 항-BTN2A1 mAb(10μg/ml) 패널 또는 이소타입 대조군(마우스 IgG2a, κ, 클론 BM4)과 배양한 후. CFP 또는 YFP-태그 BTN2A1 및 BTN3A1 사이의 FRET+ 세포의 백분율(회색). 대조군 BTN3A1+BTNL8 형질전환체의 FRET 수준도 표시된다(진한 회색). BTN2A1+BTN3A1 그룹에 대한 데이터는 각각 BTN2A1CFP+BTN3A1YFP 및 BTN3A1CFP+BTN2A1YFP 형질전환체로 수행된 두 개의 독립적인 실험을 나타내고(그래프에서 함께 풀링됨); BTN3A1CFP+BTNL8YFP는 두 개의 독립적인 실험에서 나온 것이다.
도 22. 정상 γδTCR 발현 및 Jurkat .G115 γδTCR 돌연변이에 의한 항-CD3 자극에 대한 반응성. (A) 각각의 Jurkat G115 γδTCR 돌연변이와 함께 형질감염된 HEK-293T 세포에 대한 CD3ε/GFP 공동 발현. 게이트는 BTN2A1 테트라머 염색 강도를 결정하는 데 사용되는 세포를 나타낸다. (B) 대표적인 BTN2A1 테트라머 염색(진회색) 및 스트렙타비딘 단독 대조군(회색)은 (A)에 게이트된 각 집단이다. (C) 40 μM 졸레드로네이트가 있거나 없는(회색) LM-MEL-75 WT APC를 포함하는 공동 배양에서 Jurkat G115 돌연변이에 대한 대표적인 CD69 유도. (D) 플레이트결합 항-CD3/항-CD28(각각 10㎍/ml, 진한 회색) 또는 단독(회색)에서 밤새 배양한 후 Jurkat G115 γδTCR 돌연변이체에 대한 CD69 유도. (D)의 데이터는 n=2 독립 실험의 평균 ±SEM을 나타낸다. ND, 완료되지 않음.
도 23. BTN2A1이 Vγ9Vδ2 + γδ TCR에 결합하는 데 필요하지 않은 복잡한 N-글리칸(Complex N- glycans ).
복잡한 글리칸이 있는 BTN2A1 엑토도메인은 포유동물 Expi293F에서 생성되었고, 단순 글리칸(simple glycans)이 있는 BTN2A1 엑토도메인은 GNTI-결함 HEK-293S 세포에서 생성되었다. 후자를 제조사 지침(manufacturer instructions:NEB)에 따라 실온에서 밤새 GlycoBuffer 3에서 엔도글리코시다제(endoglycosidase) H로 처리하여 탈당화된(deglycosylated) BTN2A1을 생성했다. (A) 상이한 비오틴화된 BTN2A1 엑토도메인의 SDS-PAGE. (B) 비오틴화된 BTN2A1 엑토도메인의 각 배치 또는 대조군 스트렙타비딘(SAv.) 단독을 사용하여 부모(TCR-) J.RT3-T3.5(상단행), J.RT3-T3.5.9C2 Vγ5Vδ1+ γδ TCR(가운데행) 및 Jurkat J.RT3-T3.5.G115 Vγ9Vδ2+ γδ TCR(하단행) 및 항-CD3ε-알로피코시아닌(allophycocyanin)과 함께 세포라인으로부터 생성된 피코에리트린-접합된 테트라머(Phycoerythrin-conjugated tetramers). BTN2A1 사량체 및 항-CD3ε 사이의 FRET(하부 히스토그램)도 각 샘플에서 측정되었다. (C) PBMC 기증자에 대한 글리코실화된(glycosylated)(복합 또는 단순) BTN2A1 사량체의 염색(왼쪽) 또는 정제되고 시험관 내 확장된 Vδ2+ γδ T세포의 n=3 샘플(오른쪽 그림).
도 24. 순환 단핵구에서 발현되는 BTN2A1 . BTN2A2에 교차 반응하지 않는 항-BTN2A1 클론 259 및 클론 229, 이소타입 대조군(IgG2a, κ) 또는 이차 단독(백색) 염색과 비교하여 2명의 건강한 PBMC 기증자의 개폐형 백혈구 서브세트 염색. 다음의 염색을 나타내는 히스토그램: B세포(CD19+ CD3-), CD4+ T세포(CD3+ CD4+ CD8-), CD8+ T세포(CD3+ CD4- CD8+), γδ T세포(CD3+ γδTCR+), MAIT 세포(CD3+ MR1-5-OP-RU 사량체+), NK 세포(CD3-CD56+) 및 단핵구(CD14+). (B) (A)에 따라, 그래프가 n=4-5 기증자의 평균 형광 강도(MFI) 염색을 나타내는 것을 제외. (C) 부모 LM-MEL-62 및 BTN2A1^null1 세포와 비교하여 5명의 독립적인 기증자의 시험관 내 확장된 Vδ2+ γδ T세포에 대한 BTN2A1 및 대조군 GAPDH의 웨스턴 면역블롯 분석.
도 25. 감마 델타 T 세포에 의한 인산항원 -유도 사이토카인 생산에 중요한 BTN2A1. 표시된 LM-MEL-62 세포(WT 또는 BTN2A1-KO)를 분리된 감마-델타 T세포(이펙터 대 표적 비율 2:1)와 공동 배양하고 졸레드로네이트로 처리했다. 1일 및 3일 후에 배양 상등액을 수집하고 사이토카인 분석(Luminex 키트 사용)을 실시하였다. 데이터 포인트는 독립적으로 배양되고 처리된 단일 웰이다.
도 26. 항- BTN2A1 항체 244, 253 및 259가 인간 Vγ9Vδ2 + γδ T세포에 대한 자극 활성을 나타냄. (A) 표시된 대로 밤새 배양 ± 10μg/ml 항-BTN2A1 항체 또는 이소타입 대조군(IgG2a 클론 BM4) 후 시험관 내 사전 확장된 Vγ9Vδ2+ γδ T세포에서 CD25 발현. (B) 세포 측정 비드 어레이(cytometric bead array)에 의해 검출된 동일한 배양물로부터의 인터페론-γ 생산. 데이터는 두 개의 개별 실험에서 풀링된 n=8 공여자를 나타낸다.
도 27. 항- BTN2A1 항체 253 및 259가 종양 세포의 용해를 유도할 수 있음을 나타냄.
(A) LM-MEL-75(밝은 회색 막대 및 원 기호) 또는 LM-MEL-62(진한 회색 막대 및 사각형 기호) 및 항체 253, 259, BM4(이소타입 대조군), 졸레드로네이트(양성 대조군) 또는 HMBPP(양성 대조군)의 존재 하에, 배양된 Vγ9Vδ2+ γδ T세포에 의한 종양 세포 용해. (B) 도 19A에서와 동일한 Vγ9Vδ2+ γδ T세포에서의 CD25 발현.
도 28. (A) CD25 상향조절에 의한 항- BTN2A1 항체 -253 및 259를 사용하여 포스포항원과 무관한 Vγ9Vδ2의 활성화를 나타냄. 항체 259는 활성화 가능성이 더 높다. 항체가 활성화 잠재력을 발휘하기 위해 APC 또는 인산항원을 추가할 필요가 없다. (B) 1:1 비율의 Vγ9Vδ2 세포와 각각 다른 양의 항체 253 또는 259와 공동 배양한 후 LM-MEL-62 세포의 생존력. 최대 사멸은 항체 259가 항체 253보다 세포 사멸의 더 강력한 유도제인 1과 10μg/ml 사이의 두 항체 모두에 대해 도달한 것으로 보인다. (C) Vγ9Vδ2가 이펙터이고 LM-MEL-62 세포가 표적이 되는 상이한 이펙터 대 표적 세포(E:T) 비율에서 Vγ9Vδ2 세포와 공동 배양한 후 LM-MEL-62 세포의 생존력. Vγ9Vδ2는 흑색종 환자(환자 1) 또는 건강한 공여자로부터 유래되었고 Vγ9Vδ2 세포를 활성화하기 위해 항체 259 또는 졸레드로네이트로 처리되었다. 치료군과 기증자 모두에서 증가된 이펙터 세포수와 함께 표적 세포의 생존력 감소는 Vγ9Vδ2 세포에 대한 세포 사멸의 의존성을 보여준다.
도 29. 흑색종 환자(A 및 B) 또는 건강한 공유자(C 및 D)로부터 확장된 Vγ 9Vδ2 세포의 사이토카인/ 케모카인 프로파일 산포도는 2개의 독립적인 복제물의 평균 값을 보여준다. 0의 값은 로그 스케일에 표시되도록 0.1로 설정되었다. 표시되지 않은 사이토카인/케모카인은 검출되지 않았다.
도 30(A 및 B). BM4( 이소타입 처리)와 비교할 때 다른 처리 하에서 표시된 사이토카인/케모카인의 발현 변화 퍼센트를 나타냄. 막대는 하나의 웰만 사용된 259를 제외하고 2 값의 평균값의 백분율 변화를 보여준다. 표시되지 않은 사이토카인/케모카인은 검출되지 않았다.
도 31. BTN2A1은 동족(cognate) TCR 리간드에 대한 Vγ9Vδ1 + T세포라인의 활성화를 증가시킴. (A) 대표적인 CD69 히스토그램 및 (B) CD1c, CD1d, BTN2A1 또는 대조군 BTNL3의 표시된 조합으로 형질감염된 마우스 3T3 세포 APC와의 24시간 공동배양 후. 인간 CD1c와 반응하는 Vγ9Vδ1+ TCR, 또는 인간 CD1d와 반응하는 Vγ9Vδ1+ TCR, 또는 인간 CD1d와 반응하는 Vγ5Vδ1+ TCR(9C2)을 발현하는 T세포 라인의 CD69 형광 강도 중앙값. 데이터는 n=4개의 독립적인 실험에서 풀링된다.

일반

본 명세서 전반에 걸쳐, 달리 구체적으로 언급되지 않거나 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단일 단계, 물질의 조성, 단계의 그룹 또는 물질의 조성 그룹에 대한 언급은 이들 단P, 물질의 조성, 단계의 그룹 또는 물질의 조성 그룹 중 하나 및 목수(즉, 하나 이상)을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.

당업자는 본 개시내용이 구체적으로 기재된 것 이외의 변형 및 수정이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 본 개시내용은 이러한 모든 변형 및 수정을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시내용은 또한 개별적으로 또는 집합적으로 본 명세서에서 언급되거나 표시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 상기 단계 또는 특징 중 임의의 및 모든 조합 또는 임의의 둘 이상을 포함한다.

본 개시내용은 단지 예시의 목적으로 의도된 본 명세서에 기재된 특정 예에 의해 범위가 제한되어서는 안 된다. 기능적으로 동등한 제품, 조성물 및 방법은 분명히 본 개시내용의 범위 내에 있다.

여기에서 본 개시의 임의의 예는 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 개시의 임의의 다른 예에 준용하여 적용되는 것으로 취해져야 한다. 달리 말하면, 본 개시의 임의의 특정 예는 개시의 임의의 다른 특정 예와 결합될 수 있다(상호 배타적인 경우 제외).

특정 특징 또는 특징 그룹 또는 방법 또는 방법 단계를 개시하는 본 개시내용의 임의의 예는 특정 특징 또는 특징 그룹 또는 방법 또는 방법 단계를 부인하기 위한 명시적 지원을 제공하기 위해 취해질 것이다.

달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 여기에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 간주되어야 한다(예: 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역 조직 화학, 단백질 화학 및 생화학).

달리 명시되지 않는 한, 본 개시내용에서 사용되는 재조합 단백질, 세포 배양 및 면역학적 기술은 당업자에게 잘 알려진 표준 절차이다. 이러한 기술은 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988), and J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (including all updates until present)과 같은 출처에서 문헌 전반에 걸쳐 묘사되고 설명된다.

가변 영역 및 이의 부분, 항체 및 이의 단편에 대한 설명 및 정의는 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991, Bork et al., J Mol . Biol . 242, 309-320, 1994, Chothia and Lesk J. Mol Biol . 196:901 -917, 1987, Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989 and/or or Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273, 927-948, 1997의 논의에 의해 추가로 명확해질 수 있다.

용어 "및/또는(and/or)", 예를 들어 "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해되어야 하며 두 가지 의미 또는 어느 한 의미에 대한 명시적 지원을 제공하는 것으로 간주되어야 한다.

본 명세서 전반에 걸쳐 "포함하다(comprise)"라는 단어, 또는 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소 그룹, 정수 또는 단계의 포함을 의미하는 것으로 이해되지만, 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소 그룹, 정수 또는 단계의 배제는 아니다.

본원에서 사용된 용어 "~에서 유래된(derived from)"은 특정 소스에서 반드시 직접적으로는 아닐지라도 지정된 정수가 특정 소스에서 얻어질 수 있음을 나타내기 위해 취해져야 한다.

선택된 정의

용어 "부티로필린(Butyrophilins:BTNs)" 및 "부티로필린 유사(butyrophilin like:BTNL)" 분자는 막관통 단백질의 면역글로불린(immunoglobulin:Ig) 슈퍼패밀리에 속하는 면역 반응의 조절자를 의미한다. 그들은 구조적으로 공동 자극 분자의 B7 계열과 관련이 있으며 유사한 면역 조절 기능을 가지고 있다. BTN은 T세포 발달, 활성화 및 억제뿐만 아니라 T세포와 항원 제시 세포 및 상피 세포의 상호작용 조절과 관련이 있다. 특정 BTN은 유전적으로 자가면역 및 염증성 질환과 관련이 있다. 인간 부티로필린 계열에는 3개의 서브패밀리로 세분화되는 7개의 구성원이 있다: BTN1, BTN2 및 BTN3. BTN1 서브패밀리는 원형 단일 카피 BTN1A1 유전자만을 포함하는 반면, BTN2 및 BTN3 서브패밀리는 각각 3개의 유전자 BTN2A1, BTN2A2 및 BTN2A3, 및 BTN3A1, BTN3A2 및 BTN3A3을 포함한다. BTNL 단백질은 BTN 계열 구성원과 상당한 상동성을 공유한다. 인간 게놈에는 4개의 BTNL 유전자가 있다: BTNL2, 3, 8 및 9.

부티로필린 및 BTNL 분자는 2개의 면역글로불린 유사 도메인, 즉 N-말단 Ig-V-유사(본원에서 "IgV"로 지칭됨) 및 C-말단 Ig-C-유사 도메인(본원에서 "IgC"로 지칭됨)을 함유한다.

명명 목적으로만 제한되지 않고 BTN2A1의 아미노산 서열은 NCBI RefSeq NP_001184162.1, NP_001184163.1, NP_008980.1 또는 NP_001184163.1 및/또는 서열번호 1 내지 4이다. 한 예에서, BTN2A1은 인간 BTN2A1이다.

용어 "γδ T세포"는 T-세포 수용체(TCR) 복합체의 일부로서 γ 및 δ 사슬을 발현하는 세포를 지칭한다. γδ TCR은 가변 및 불변 Ig 도메인을 각각 포함하는 γ-사슬 및 δ-사슬로 구성된다. 도메인은 TCRδ 및 γ 유전자좌 내에서 가변(V), 다양성(D)(TCRδ 전용), 연결(J) 및 불변(C) 유전자의 유전적 재조합에 의해 형성된다. 각 사슬의 가변 도메인은 일반적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역으로 알려진 리간드와 접촉하는 3개의 용매 노출 루프를 포함하고, 후자는 V-D 및 D-J 재조합 부위에서 V-D-J 조합 다양성 및 비주형 뉴클레오티드 변화(추가 및 결실)로 인해 구성이 매우 다양하다.

인간에서, γδ T세포는 "Vδ2" 및 "비-Vδ2 세포"로 추가로 나눌 수 있으며, 후자는 Vδ4, Vδ6, Vδ7, Vδ8을 갖는 대부분의 Vδ1- 및 드물게 Vδ3- 또는 Vδ5-사슬 발현 세포로 구성된다. γδ T세포는 항체 의존성 세포 매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity:ADCC) 및 식균 작용을 매개할 수 있으며 사전 분화 또는 확장 없이 병원체 특이적 항원에 빠르게 반응할 수 있다. γδ T세포는 단백질 및 비-펩티드 항원에 직접 반응하므로 MHC 제한이 없다. 적어도 일부 γδ T세포 특이적 항원은 미생물 병원체 및 유도된 자가 항원에서 발견되는 진화적으로 보존된 분자 패턴을 나타내며, 이는 세포 스트레스, 감염 및 형질전환에 의해 상향 조절된다. 이러한 항원은 본원에서 일반적으로 "인산항원(phosphoantigens)" 또는 pAg로 지칭된다. Vγ9+ γδ T-세포는 또한 TCR 및 (공)수용체를 통해 다른 항원 및 리간드에 반응할 수 있다.

또한, γδ T세포는 다음과 같이 여러 기능적 집단으로 추가 분류될 수 있다: IFN-γ 생산 γδ T세포, IL-17A 생산 γδ T세포, 항원 제시 γδ T세포, 여포 b 헬퍼(helper) γδ T세포 및 조절 γδ T세포. γδ T세포는 직접적인 세포독성, 사이토카인 생성 및 간접적인 면역 반응을 발휘하는 면역 반응을 촉진할 수 있다. 예를 들어, IFN-γ 생성 표현형은 CD56 발현 증가 및 세포용해 반응 증가를 특징으로 한다. 일부 γδ T세포 서브세트는 염증 및/또는 면역 억제를 촉진하여 질병 진행에 기여할 수 있다. 예를 들어, IL-17A를 생성하는 γδ T세포는 감염 및 자가면역 질환 동안 병원성 역할을 하는 염증 반응에 광범위하게 참여한다.

γ 및 δ 유전자의 상보성 결정 영역 3(CDR3) 영역은 수용체 상단에 상당히 큰 돌출부를 형성한다. Vγ9 및 Vδ2 사슬로 구성된 인간 TCR은 C-V 접합부에서 팔꿈치 각도(elbow angle)가 특징이다. Vδ의 CDR2 루프에서 C'가닥은 도메인의 내부 β-시트(sheet)의 C'가닥과 쌍을 이룬다.

용어 "BTN2A1 작용제(BTN2A1 agonist)"는 BTN2A1에 특이적으로 결합하고 Vγ9+ γδ TCR 활성화를 유도하거나 향상시키는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 작용제는 BTN2A1 분자의 세포외 도메인(IgV 및/또는 IgC) 중 하나 이상에 결합한다. 작용제 BTN2A1은 Vγ9+Vδ2+ 및/또는 Vγ9+Vδ2-γδ TCR 활성화를 유도하거나 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 작용제 BTN2A1은 Vγ9+Vδ2+ 및/또는 Vγ9+Vδ1+ γδ TCR 활성화를 포함하나 이에 제한되지 않는 Vγ9+ γδ TCR 활성화를 유도하거나 향상시킬 수 있다. 활성화는 항원 독립적일 수 있다. 예를 들어, 이론이나 동기에 얽매이지 않고 BTN2A1에 대한 BTN2A1 작용제의 결합은 비자극성 BTN2A1에서 자극성으로의 전환으로서 항원(예: pAg) 활성화를 모방하는 방식으로 BTN2A1 분자의 세포외 도메인(IgV 및/또는 IgC) 중 하나 이상을 변형할 수 있다. BTN2A1 작용제는 항원 결합과 유사한 동역학(kinetics) 및 효능으로 Vγ9+ γδ TCR 활성화를 유도할 수 있다. 한 실시예에서, BTN2A1 작용제의 결합은 예를 들어 종양 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 및/또는 자연 살해(NK) 세포의 세포 표면에서 BTN2A1 분자의 조직화를 변화시킨다. 예를 들어, BTN2A1 작용제는 세포 표면에서 BTN2A1/BTN3 복합체, 예를 들어 BTN2A1/BTN3A1 복합체의 형성을 촉진할 수 있다. 작용제는 BTN3A1과 교차 반응할 수 있거나 BTN2A1 및 BTN3 분자, 예를 들어 BTN3A1에 대해 이중 특이적일 수 있다. 또 다른 또는 추가 실시예에서, BTN2A1 작용제의 결합은 γδ T세포에 대한 Vγ9+ TCR의 리게이션(ligation)을 유도하고/거나 BTN2A1을 발현하는 세포의 활성 및/또는 생존을 증가시킨다. BTN2A1 작용제는 γδ T세포에 대한 자극성이며 세포용해 기능, 하나 이상의 사이토카인의 사이토카인 생산 또는 γδ T세포의 증식 중 하나 이상을 활성화할 수 있다.

용어 "BTN2A1 길항제(BTN2A1 antagonist)"는 BTN2A1에 특이적으로 결합하고 Vγ9+ γδ TCR 활성화를 억제하는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 길항제는 BTN2A1 분자의 세포외 도메인(IgV 및/또는 IgC) 중 하나 이상에 결합한다. BTN2A1 길항제는 Vγ9+Vδ2+ 및/또는 Vγ9+Vδ2-γδ TCR 활성화를 억제할 수 있다. 예를 들어, BTN2A1 길항제는 Vγ9+Vδ2+ 및/또는 Vγ9+Vδ1+ γδ TCR 활성화를 억제할 수 있다. 예시적인 BTN2A1 길항제는 BTN2A1 분자의 세포외 도메인(IgV 및/또는 IgC) 중 하나 이상에 결합하고 항원(예를 들어, pAg) 활성화를 억제하고, Vγ9+ γδ TCR에 결합하고/하거나 BTN3 분자, 예를 들어 BTN3A1과의 상호작용을 방지한다. BTN2A1 길항제는 예를 들어 항원 활성화 및/또는 BTN3A1과의 상호작용을 방지하기 위해 BTN2A1 분자를 자극성 BTN2A1에서 비자극성으로 전환하는 형태적 변화를 유도할 수 있다. BTN2A1 길항제는 Vγ9+ TCR과 상호작용하는 BTN2A1 분자 상의 부위 또는 BTN3 분자, 예를 들어 BTN3A1과 상호작용하는 BTN2A1 분자 상의 부위에 결합할 수 있다. 예를 들어, BTN2A1 길항제는 가용성 TCR일 수 있다. 다른 예에서, BTN2A1 길항제는 BTN3A1과 교차 반응할 수 있거나 BTN2A1 및 BTN3 분자(예: BTN3A1)에 대해 이중 특이적일 수 있다. BTN2A1 길항제는 γδ T세포를 억제하며 세포용해 기능, 하나 이상의 사이토카인 생산 또는 γδ T세포의 증식 중 하나 이상을 억제할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, γδ T세포 활성화의 맥락에서 용어 "억제(들)(inhibit(s))" 또는 "억제하는(inhibiting)"은 본 개시내용의 BTN2A1 길항제가 Vγ9+ γδ TCR 활성화의 수준을 감소 또는 감소시키는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 전술한 내용으로부터 본 개시내용의 BTN2A1 길항제가 활성화를 완전히 억제할 필요는 없으며, 오히려 통계적으로 유의한 양만큼, 예를 들어, 예를 들어, 적어도 약 10%, 또는 약 20%, 또는 약 30%, 또는 약 40%, 또는 약 50%, 또는 약 60%, 또는 약 70%, 또는 약 80%, 또는 약 90%, 또는 약 95%로 활성을 감소시킬 필요가 있음이 명백할 것이다. Vγ9+ γδ TCR 활성화의 억제를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고/있거나 본원에 기술되어 있다.

본원에서 사용된 용어 "BTN2A1/BTN3 복합체"는 BTN2A1과 BTN3 분자의 복합체는 종양 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 실질 세포 및/또는 자연 살해(NK)t세포와 같은 세포 표면의 BTN2A1 및 BTN3 분자의 복합체, 예를 들어 BTN2A1 및 BTN3A1 복합체를 의미한다. 복합체는 BTN3A1 및 BTN3A2와 같은 하나 이상의 BTN3 분자 및/또는 ATP-결합 카세트 수송체 A1(ATP-binding cassette transporter A1:ABCA1)과 같은 다른 단백질을 포함할 수 있다. 복합체는 BTN2A1 다이머(dimer)를 포함할 수 있다. 유사하게, BTN3 분자는 모노머(monomer) 또는 다이머릭(dimeric) 형태로 존재할 수 있다. BTN2A1 및 BTN3 분자는 세포 표면에 함께 위치할 수 있거나 직접(예: 크로스-링크(cross-linked)) 또는 간접적으로(다른 분자 또는 단백질을 통해) 결합할 수 있다. BTN2A1/BTN3 복합체는 항원에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, BTN2A1 및/또는 BTN3 분자의 세포질 도메인은 항원에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "암(cancer)"은 자율적 성장 능력을 갖는 세포, 즉 급속하게 증식하는 세포 성장을 특징으로 하는 비정상적인 상태 또는 상태를 지칭한다.

과증식성(Hyperproliferative) 및 네오플라스틱(neoplastic) 질병 상태는 병리적, 즉 질병 상태를 특징짓거나 구성하는 것으로 분류될 수 있거나, 또는 비-병리적, 즉 정상으로부터의 편차이지만 질병 상태와 관련되지 않은 것으로 분류될 수 있다. 이 용어는 조직병리학적 유형 또는 침습성 단계에 관계없이 모든 유형의 암성 성장 또는 발암성 과정, 전이성 조직 또는 악성으로 형질전환된 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 것을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, BTN2A1 작용제 또는 길항제의 결합 영역과 BTN2A1 분자의 상호작용과 관련하여 용어 "결합한다(binds)"는 상호작용이 BTN2A1 분자 상의 특정 구조(예를 들어, 에피토프(epitope)을 의미한다. 예를 들어, 항체는 일반적으로 단백질이 아닌 특정 단백질 구조를 인식하여 결합한다. 항체가 에피토프 "A"(또는 프리(free), 표지되지 않은 "A")하는 경우, 표지된 "A" 및 단백질을 함유하는 반응에서 에피토프 "A"를 함유하는 분자의 존재는 항체에 결합된 표지된 "A"의 양을 감소시킬 것이다.

본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합한다(specifically binds)"는 BTN2A1 작용제 또는 길항제 상의 결합 영역과 BTN2A1 분자 사이의 결합 상호작용이 항원 결정기 또는 에피토프의 존재에 의존함을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 결합 영역은 다른 분자 또는 유기체의 혼합물에 존재하는 경우에도 특정 항원 결정기 또는 에피토프에 우선적으로 결합하거나 인식한다. 한 예에서, 결합 영역은 대체 항원 또는 세포에서 하는 것보다 더 자주, 더 빠르게, 더 긴 지속 시간 및/또는 더 큰 친화도로 이를 발현하는 특정 성분 또는 세포와 반응하거나 결합한다. 예를 들어, 특정 성분에 특이적으로 결합하는 결합 영역이 제2 항원에 특이적으로 결합하거나 결합하지 않을 수 있다는 것은 이 정의를 읽음으로써 또한 이해된다. 이와 같이, "특이적 결합(specific binding)"은 반드시 다른 항원의 배타적 결합 또는 검출 불가능한 결합을 필요로 하지 않는다. 용어 "특이적으로 결합한다"는 본원에서 "선택적으로 결합한다(selectively binds)"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에서 결합에 대한 언급은 특이적 결합을 의미하며, 각 용어는 다른 용어에 대한 명시적 지원을 제공하는 것으로 이해되어야 한다. 특이적 결합을 결정하는 방법은 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들어, 본 개시내용의 결합 영역을 포함하는 결합 단백질은 이를 발현하는 성분 또는 세포 또는 그의 돌연변이 형태 또는 대안적 항원과 접촉된다. 그런 다음 구성 요소 또는 돌연변이 형태 또는 대안적인 항원에 대한 결합이 결정되고 위에서 설명한 바와 같이 결합하는 결합 영역은 구성 요소에 특이적으로 결합하는 것으로 간주된다. 한 예에서, 이를 발현하는 성분 또는 세포에 대한 "특이적 결합"은, 결합영역은 10μM 이하, 예를 들어, 9 μM이하, 8μM 이하, 7μM 이하, 6μM 이하, 5μM 이하, 4μM 이하, 3μM 이하, 2 μM이하, 또는 1μM 이하, 예를 들어 100nM 이하, 예를 들어 50nM 이하, 예를 들어 20nM 이하, 예를 들어 1nM 이하, 예를 들어 0.8nM 이하, 1x10^-8M 이하, 예를 들어 5x10^-9M 이하, 예를 들어 3x10^-9M 이하, 예를 들어 2.5x10^-9M 이하의 평형상수(equilibrium constant:K_D)로 결합함을 의미한다.

"재조합(recombinant)"이라는 용어는 인공 유전자 재조합의 산물을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 맥락에서, 이 용어는 B 세포 성숙 동안 발생하는 자연 재조합의 산물인 대상체의 신체 내에서 자연적으로 발생하는 항체를 포함하지 않는다. 그러나, 그러한 항체가 분리된 경우, 항체 가변영역을 포함하는 분리된 단백질로 간주되어야 한다. 유사하게, 단백질을 엔코딩하는 핵산이 분리되고 재조합 수단을 사용하여 발현된다면, 생성된 단백질은 재조합 단백질이다. 재조합 단백질은 또한 예를 들어 발현되는 세포, 조직 또는 대상체 내에 있을 때 인공 재조합 수단에 의해 발현되는 단백질을 포함한다.

용어 "단백질(protein)"은 단일 폴리펩티드 사슬, 즉 펩티드 결합에 의해 연결된 일련의 연속 아미노산 또는 서로 공유 또는 비-공유 연결된 일련의 폴리펩티드 사슬(즉, 폴리펩티드 복합체)을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 일련의 폴리펩타이드 사슬은 적절한 화학 또는 이황화 결합을 사용하여 공유적으로 연결될 수 있다. 비-공유 결합의 예로는 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘(Van der Waals forces) 및 소수성 상호 작용이 있다.

용어 "폴리펩티드(polypeptide)" 또는 "폴리펩티드 사슬(polypeptide chain)"은 펩티드 결합에 의해 연결된 일련의 인접 아미노산을 의미하는 것으로 상기 단락으로부터 이해될 것이다.

당업자는 "항체(antibody)"는 일반적으로 다수의 폴리펩티드 사슬로 구성된 가변영역을 포함하는 단백질, 예를 들어 경쇄 가변영역(light chain variable region:V_L)을 포함하는 폴리펩티드 및 중쇄 가변영역(heavy chain variable region:V_H)을 포함하는 폴리펩티드로 간주된다는 것을 있을 것이다. 항체는 또한 일반적으로 불변 도메인을 포함하며, 그 중 일부는 불변영역으로 배열될 수 있으며, 이는 불변 단편 또는 중쇄의 경우 결정화 가능한 단편(fragment crystallizable:Fc)을 포함한다. V_H 및 V_L은 상호작용하여 하나 또는 몇 개의 밀접하게 관련된 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 영역을 포함하는 Fv를 형성한다. 일반적으로 포유류의 경쇄는 κ 경쇄 또는 λ 경쇄이고 포유류의 중쇄는 α, δ, ε, γ 또는 μ이다. 항체는 모든 유형(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다. 용어 "항체"는 또한 인간화 항체(humanized antibodies), 영장류화 항체(primatized antibodies), 인간 항체(human antibodies), 동인간화 항체(synhumanized antibodies) 및 키메릭 항체(chimeric antibodies)를 포함한다. "항체"라는 용어는 또한 엔코드된 C-말단 라이신(lysine) 잔기가 결여된 변이체, 탈아미드화된(deamidated) 변이체 및/또는 글리코실화된(glycosylated) 변이체 및/또는 예를 들어, 단백질(예를 들어, 항체)의 N-말단에 피로글루타메이트(pyroglutamate)를 포함하는 변이체 및/또는 N-말단 잔기, 예를 들어, 항체 또는 V 영역 내의 N-말단 글루타민(glutamine) 및/또는 분비 신호의 전부 또는 일부를 포함하는 변이체를 포함한다. 엔코드된 아스파라긴(asparagine) 잔기의 탈아미드화된 변이체는 이소아스파라긴산(isoaspartic acid) 및 아스파라긴산 이소폼을 생성하거나 심지어 인접한 아미노산 잔기를 포함하는 숙신아미드(succinamide)를 생성할 수 있다. 엔코드된 글루타민 잔기의 탈아미드화된 변이체는 글루타민산을 생성할 수 있다. 이러한 서열 및 변이체의 이종 혼합물을 포함하는 조성물은 특정 아미노산 서열이 언급될 때 포함되도록 의도된다.

본 개시내용의 맥락에서, 용어 "반 항체(half antibody)"는 단일 항체 중쇄 및 단일 항체 경쇄를 포함하는 단백질을 지칭한다. 용어 "반 항체"는 또한 항체 경쇄 및 항체 중쇄를 포함하는 단백질을 포함하며, 여기서 항체 중쇄는 다른 항체 중쇄와의 회합을 방지하도록 돌연변이 되었다.

"전장 항체(full-length antibody)", "온전한 항체(intact antibody)" 또는 "전체 항체(whole antibody)"라는 용어는 항체의 항원 결합 단편과 대조적으로 실질적으로 온전한 형태의 항체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 구체적으로, 전체 항체는 Fc 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 것을 포함한다. 불변 도메인은 야생형 서열 불변 도메인(예를 들어, 인간 야생형 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.

본원에 사용된 "가변영역(variable region)"은 항원에 특이적으로 결합하고, 예를 들어 CDR의 아미노산 서열을 포함하는 본원에 정의된 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 부분; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 프레임워크 영역(framework regions:FR)을 지칭한다. 예를 들어, 가변영역은 3개의 CDR과 함께 3개 또는 4개의 FR(예를 들어, FR1, FR2, FR3 및 임의로 FR4)을 포함한다. VH는 중쇄의 가변영역을 나타낸다. VL은 경쇄의 가변영역을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역(complementarity determining regions)"(동의 CDR, 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항체 가변영역의 아미노산 잔기가 존재하는 항체 가변영역의 아미노산 잔기가 특이적 항원 결합에 대한 주요 기여자(contributors)임을 지칭한다. 각각의 가변 영역은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다. 한 예에서, CDR 및 FR에 할당된 아미노산 위치는 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 및 1991(본원에서 "Kabat 넘버링 시스템"으로도 지칭됨)에 따라 정의된다. Kabat의 넘버링 시스템에 따르면 VH FRs 및 CDRs은 다음과 같이 배치된다: 잔기 1-30(FR1), 31-35(CDR1), 36-49(FR2), 50-65(CDR2), 66-94(FR3), 95-102(CDR3) 및 103-113(FR4). Kabat의 넘버링 시스템에 따르면 VL FRs 및 CDRs은 다음과 같이 배치된다: 잔기 1-23(FR1), 24-34(CDR1), 35-49(FR2), 50-56(CDR2), 57-88(FR3), 89-97(CDR3) 및 98-107(FR4).

"프레임워크 영역"(이하 FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

본원에 사용된 용어 "Fv"는 V_L 및 V_H가 결합하여 항원 결합 부위, 즉 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 복합체를 형성하는 다중 폴리펩티드 또는 단일 폴리펩티드로 구성되는 모든 단백질을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 항원 결합 부위를 형성하는 V_H 및 V_L은 단일 폴리펩티드 사슬 또는 상이한 폴리펩티드 사슬에 있을 수 있다. 또한, 본 개시내용의 Fv(및 본 개시내용의 임의의 단백질)는 동일한 항원에 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는 다중 항원 결합 부위를 가질 수 있다. 이 용어는 항체로부터 직접적으로 유래된 단편뿐만 아니라 재조합 수단을 사용하여 생산된 그러한 단편에 상응하는 단백질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 예에서, V_H는 중쇄 불변 도메인(heavy chain constant domain:C_H) 1에 연결되지 않고/하거나 V_L은 경쇄 불변 도메인(light chain constant domain:C_L)에 연결되지 않는다. 폴리펩타이드 또는 단백질을 함유하는 예시적인 Fv는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab') 단편, scFv, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 또는 고차 복합체(higher order complex), 또는 불변영역 또는 그의 도메인, 예를 들어 C_H2에 연결된 전술한 것 중 임의의 것 또는 C_H3 도메인, 예를 들어 미니바디(minibody)를 포함한다. "Fab 단편(Fab fragment)"은 항체의 1가(monovalent) 항원 결합 단편으로 구성되며, 전체 항체를 효소 파파인(papain)으로 분해하여 온전한 경쇄와 중쇄의 일부로 구성된 단편을 생성하거나 재조합 수단을 사용하여 생성할 수 있다. 항체의 "Fab' 단편"은 전체 항체를 펩신(pepsin)으로 처리한 후 환원하여 VH 및 단일 불변 도메인을 포함하는 중쇄의 일부 및 온전한 경쇄로 구성된 분자를 생성함으로써 얻을 수 있다. 이러한 방식으로 처리된 항체당 2개의 Fab' 단편이 수득된다. Fab' 단편은 또한 재조합 수단에 의해 생성될 수 있다. 항체의 "F(ab')2 단편"은 2개의 이황화 결합에 의해 함께 고정된 2개의 Fab' 단편의 다이머로 구성되며, 후속 환원 없이 전체 항체 분자를 효소 펩신으로 처리하여 수득된다. "Fab₂" 단편은 예를 들어 류신 지퍼(leucine zipper) 또는 C_H3 도메인을 사용하여 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 재조합 단편이다. "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"는 경쇄의 가변 영역과 중쇄의 가변 영역이 적합한 유연한 폴리펩티드 링커에 의해 공유 연결된 항체의 가변 영역 단편(Fv)을 함유하는 재조합 분자이다.

본 명세서에서 용어 "불변영역(constant region)"은 가변영역 이외의 항체의 중쇄 또는 경쇄의 일부를 의미한다. 중쇄에서, 불변영역은 일반적으로 다수의 불변 도메인 및 힌지영역(hinge region)을 포함하고, 예를 들어, IgG 불변영역은 하기 연결된 성분, 불변 중(C_H)1, 링커, C_H2 및 C_H3을 포함한다. 중쇄에서 불변영역은 Fc를 포함한다. 경쇄에서 불변영역은 일반적으로 하나의 불변 도메인(C_L1)을 포함한다.

"결정화 가능한 단편(fragment crystalizable)" 또는 "Fc" 또는 "Fc 영역" 또는 "Fc 부분"(본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있음)이라는 용어는 적어도 하나의 불변 도메인을 포함하고 일반적으로(반드시 그렇지는 않지만) 글리코실화되고 하나 이상의 Fc 수용체 및/또는 보체 캐스케이드(complement cascade)의 성분에 결합할 수 있는 항체의 영역을 지칭한다. 중쇄 불변 영역은 5가지 이소타입 중에서 선택할 수 있다: α, δ, ε, γ, or μ. 또한, 다양한 서브클래스(예: 중쇄의 IgG 서브클래스)의 중쇄는 상이한 이펙터 기능을 담당하므로 원하는 중쇄 불변영역을 선택함으로써 원하는 이펙터 기능을 갖는 단백질을 생산할 수 있다. 예시적인 중쇄 불변 영역은 감마 1(IgG1), 감마 2(IgG2) 및 감마 3(IgG3), 또는 이들의 하이브리드(hybrids)이다.

항체의 "항원 결합 단편(antigen binding fragment)"은 온전한 항체의 하나 이상의 가변영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자, 반 항체 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

용어 "안정화된 IgG4 불변 영역"은 Fab 암 교환을 감소시키도록 변형된 IgG4 불변 영역, 또는 Fab 암 교환 또는 반 항체 형성을 겪는 경향 또는 반 항체를 형성하는 경향을 의미하는 것으로 이해될 것이다. "Fab 암 변형(Fab arm exchange)"은 인간 IgG4에 대한 일종의 단백질 변형을 말하며, 여기서 IgG4 중쇄 및 부착된 경쇄(반-분자)가 다른 IgG4 분자의 중쇄 쌍으로 교체된다. 따라서, IgG4 분자는 2개의 별개의 항원을 인식하는 2개의 별개의 Fab 암을 획득할 수 있다(이중특이적 분자를 생성함). Fab 암 변형은 생체 내에서 자연적으로 발생하며 정제된 혈액 세포 또는 환원된 글루타티온(glutathione)과 같은 환원제에 의해 시험관 내에서 유도될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "단일특이적(monospecific)"은 각각 동일한 에피토프 특이성을 갖는 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 결합영역을 지칭한다. 따라서, 단일특이적 결합영역은 단일 항원 결합부위(예: Fv, scFv, Fab 등) 또는 동일한 에피토프(예: 서로 동일함)를 인식하는 여러 항원 결합부위(예: 디아바디 또는 항체)를 포함할 수 있다. 결합영역이 "단일특이적"이라는 요건은 다중 항원이 단일 항원 결합 부위에 의해 결합될 수 있는 공유되거나 매우 유사한 에피토프를 가질 수 있기 때문에 그것이 하나의 항원에만 결합한다는 것을 의미하지 않는다. 하나의 항원에만 결합하는 단일특이적 결합영역은 해당 항원에 "배타적으로 결합(exclusively bind)"한다고 한다.

용어 "다중특이적(multispecific)"은 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 영역을 말하며, 각각은 별개의 에피토프에 결합하고, 예를 들어 각각은 별개의 항원에 결합한다. 예를 들어, 다중특이적 결합영역은 동일한 단백질의 2개 이상의 상이한 에피토프를 인식하거나 상이한 단백질의 2개 이상의 상이한 에피토프를 인식할 수 있는 항원 결합 부위를 포함할 수 있다(예를 들어, BTN2A1 및 BTN3A1과 같은 BTN3 분자 상에서). 한 예에서, 결합영역은 "이중특이적"일 수 있으며, 즉 이는 2개의 별개의 에피토프에 특이적으로 결합하는 2개의 항원 결합부위를 포함한다. 예를 들어, 이중특이적 결합영역은 동일한 단백질에 있는 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하거나 특이성을 갖는다. 또 다른 예에서, 이중특이적 결합영역은 2개의 상이한 단백질(예: BTN2A1 및 BTN3A1과 같은 BTN3 분자) 상의 2개의 별개의 에피토프에 특이적으로 결합한다.

본원에 사용된 "가용성 T 세포 수용체(soluble T cell receptor)" 또는 "가용성 TCR"은 단, 최소한 수용체 사슬의 막횡단 영역이 결실되거나 돌연변이되어 수용체가 세포에 의해 발현될 때 막과 결합하지 않을 것이라는 점을 제외하고. 전체 길이(예: 막 결합) 수용체의 사슬로 구성된 TCR을 지칭한다. 가장 일반적으로, 가용성 수용체는 야생형 수용체 사슬의 세포외 도메인으로만 구성됩니다(즉, 막횡단 및 세포질 도메인이 없음). 본 개시내용의 가용성 γδ TCR은 Vγ9 및 δ사슬을 포함하는 γ사슬의 헤테로다이머(본원에서 "가용성 V□9+ TCR"로 지칭됨)로 구성된다. γ 및 δ사슬의 다양한 특정 조합이 본 발명의 가용성 γδ TCR에 사용하기에 바람직하며, 특히 생체내 존재하는 것으로 알려져 있지만 Vγ9 및 δ사슬을 포함하는 γ사슬의 실질적으로 임의의 조합을 갖는 가용성 TCR도 본 개시내용에서 사용하기 위해 고려되는 것으로 이해되어야 하는 γδ TCR 서브세트에 상응하는 것들이다. 바람직하게는, 가용성 γδ TCR은 동일한 동물종(예: 쥐, 인간)에서 유래된 γ 및 δ사슬을 포함한다.

본 명세서에 사용된 용어 "질병(disease)", "장애(disorder)" 또는 "상태(condition)"는 정상 기능의 파괴 또는 간섭을 지칭하며, 임의의 특정 상태에 제한되지 않으며, 질병 또는 장애를 포함할 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 질병 또는 상태 또는 이의 재발 또는 재발이 "위험에 처한(at risk)" 대상체는 검출 가능한 질병 또는 질병의 증상을 갖거나 갖지 않을 수 있고, 본 개시내용에 따른 치료 전에 검출 가능한 질병 또는 질병의 증상을 나타내거나 나타내지 않을 수 있다. "위험에 처한"은 대상체가 하나 이상의 위험 인자를 갖고 있음을 나타내며, 이는 당업계에 공지되고/되거나 본원에 기재된 바와 같이 질환 또는 상태의 발병과 상관관계가 있는 측정 가능한 매개변수이다.

본원에 사용된 용어 "치료하는(treating)", "치료하다(treat)" 또는 "치료(treatment)"는 본원에 기재된 단백질을 투여하여 특정 질병 또는 상태의 적어도 하나의 증상을 감소 또는 제거하거나 질병 또는 상태의 진행을 늦추는 것을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "예방하는(preventing)", "예방하다(prevent)" 또는 "예방(prevention)"은 특정 질병 또는 상태의 발생 또는 재발과 관련하여 예방을 제공하는 것을 포함한다. 개인은 질병 또는 질병 재발의 소인이 있거나 발병할 위험이 있지만 아직 질병 또는 재발로 진단되지 않았다.

"효과적인 양(effective amount)"은 원하는 결과를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 투여량에서 적어도 효과적인 양을 의미한다. 예를 들어, 원하는 결과는 치료 또는 예방 결과일 수 있다. 효과적인 양은 하나 이상의 투여로 제공될 수 있다. 본 개시내용의 일부 예에서, 용어 "효과적인 양"은 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 상태의 치료에 영향을 미치는 데 필요한 양을 의미한다. 본 개시내용의 일부 예에서, 용어 "효과적인 양"은 Vγ9+ TCR γδ T세포 활성화에 영향을 미치거나 Vγ9+ TCR γδ T세포의 활성화를 억제하는데 필요한 양을 의미한다. 본 개시내용의 일부 예에서, 용어 "효과적인 양"은 하나 이상의 세포용해 기능(cytolytic function), 하나 이상의 사이토카인 생산, 또는 γδ T세포의 증식 또는 하나 이상의 세포용해 기능 억제, 하나 이상의 사이토카인 생산 또는 γδ T세포 증식에 영향을 미치는 데 필요한 양을 의미한다. 효과적인 양은 치료될 질병 또는 상태 또는 변경될 인자에 따라, 또한 체중, 연령, 인종 배경, 성별, 건강 및/또는 신체 상태 및 치료되는 포유동물과 관련된 기타 요인에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 유효량은 의사가 일상적인 시험 및 실험을 통해 결정할 수 있는 비교적 넓은 범위(예: "투여량(dosage)" 범위)에 속한다. 따라서, 이 용어는 본 개시내용을 특정 양, 예를 들어 결합 단백질의 중량 또는 수로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 효과적인 양은 단일 용량으로 투여되거나 치료 기간 동안 1회 또는 수회 반복되는 용량으로 투여될 수 있다.

"치료학적으로 효과적인 양(therapeutically effective amount)"은 특정 질병 또는 상태의 측정 가능한 개선에 영향을 미치는 데 필요한 최소한의 최소 농도이다. 본원의 치료학적으로 효과적인 양은 환자의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 이끌어내는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료학적으로 효과적인 양은 또한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 임의의 독성 또는 유해한 효과가 치료학적으로 유익한 효과보다 더 큰 양이다.

본원에 사용된 용어 "예방적으로 효과적인 양(prophylactically effective amount)"은 질병 또는 상태 또는 이의 합병증의 하나 이상의 검출 가능한 증상의 발병을 예방하거나 억제하거나 개시를 지연시키기에 충분한 양의 BTN2A1 작용제 또는 길항제를 의미하는 것으로 간주되어야 한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체(subject)"는 인간을 포함하는 모든 동물, 예를 들어 포유동물을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 예시적인 대상체는 인간 및 인간이 아닌 영장류를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 대상체는 인간이다.

항체

한 예에서, 본 개시내용의 BTN2A1 작용제 또는 길항제는 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질이 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다.

예방접종-기반 방법(Immunization-based Methods)

항체를 생성하는 방법은 당업계에 알려져 있고/있거나 Harlow and Lane (editors) Antibodies에 설명되어 있다: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988). 일반적으로, 이러한 방법에서 단백질 또는 면역원성 단편(immunogenic fragment) 또는 이의 에피토프 또는 이를 발현하고 표시하는 세포(즉, 면역원(immunogen))는 임의의 적합하거나 원하는 담체(carrier), 보조제(adjuvant) 또는 약학적으로 허용되는 부형제(pharmaceutically acceptable excipient)와 함께 임의로 제형화되어 비-인간, 예를 들어, 마우스, 닭, 쥐, 토끼, 기니피그, 개, 말, 소, 염소 또는 돼지에게 투여된다. 면역원은 비강내(intranasally), 근육내(intramuscularly), 피하(sub-cutaneously), 정맥내(intravenously), 피내(intradermally), 복강내(intraperitoneally), 또는 기타 공지된 경로에 의해 투여될 수 있다. 다클론 항체의 생산은 면역화 후 다양한 지점에서 면역화된 동물의 혈액을 샘플링하여 모니터링할 수 있다. 원하는 항체 역가(titer)를 달성하기 위해 필요한 경우 하나 이상의 추가 면역이 제공될 수 있다. 적절한 역가가 달성될 때까지 부스팅(boosting) 및 역가 과정을 반복한다. 원하는 수준의 면역원성이 얻어지면 면역화된 동물을 채혈하고 혈청을 분리 및 저장하고/하거나 동물을 사용하여 단클론 항체(mAb)를 생성한다.

모노클로날(Monoclonal) 항체는 본 개시내용에 의해 고려되는 항체의 한 예시적인 형태이다. 용어 "모노클로날 항체" 또는 "mAb"는 동일한 항원(들), 예를 들어 항원 내의 동일한 에피토프에 결합할 수 있는 균질한 항체 집단을 지칭한다. 이 용어는 항체의 출처 또는 그것이 만들어지는 방식과 관련하여 제한되는 것으로 의도되지 않는다.

mAb의 생산을 위해, 예를 들어, US4196265 또는 상기 Harlow and Lane(1988)에 예시된 절차와 같은 다수의 공지된 기술 중 임의의 하나가 사용될 수 있다.

예를 들어, 항체 생성 세포를 자극하기에 충분한 조건 하에 적합한 동물을 면역원으로 면역화시킨다. 토끼, 생쥐 및 쥐와 같은 설치류가 대표적인 동물입니다. 인간 면역글로불린 단백질을 발현하도록 유전적으로 조작되고, 예를 들어 뮤린 면역글로불린 단백질을 발현하지 않는 마우스는 또한 본 개시내용의 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, WO2002066630에 기재된 바와 같음).

면역화 후, 항체 생성 가능성이 있는 체세포, 예를 들어 B 림프구(B 세포)가 mAb 생성 프로토콜에 사용하기 위해 선택된다. 이 세포는 비장, 편도선 또는 림프절의 생검 또는 말초 혈액 샘플에서 얻을 수 있다. 면역화된 동물의 B 세포는 일반적으로 면역원으로 면역화된 동물과 동일한 종에서 유래한 불멸성 골수종 세포의 세포와 융합된다. 잡종은 조직 배양 배지에서 뉴클레오타이드의 새로운 합성을 차단하는 제제를 포함하는 선택 배지에서 배양에 의해 증폭된다. 예시적인 제제는 아미노프테린(aminopterin), 메토트렉세이트(methotrexate) 및 아자세린(azaserine)이다.

증폭된 하이브리도마(hybridomas)는 예를 들어 유세포분석(flow cytometry) 및/또는 면역조직화학(immunohistochemistry) 및/또는 면역분석(예를 들어 방사선면역분석(radioimmunoassay), 효소면역분석(enzyme immunoassay), 세포독성분석(cytotoxicity assay), 플라크분석(plaque assay), 점면역분석(dot immunoassay) 등)과 같은 항체 특이성 및/또는 역가에 대한 기능적 선택을 받는다.

또는 ABL-MYC 기술(NeoClone, Madison WI 53713, USA)을 사용하여 MAb를 분비하는 세포라인을 생산한다(예를 들어, Largaespada et al, J. Immunol . Methods. 197: 85-95, 1996).

라이브러리-기반 방법(Library-Based Methods)

본 개시내용은 또한 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예를 들어, 그의 가변 영역을 포함함)의 라이브러리의 스크리닝(screening)을 포함한다. 본 개시내용에 의해 고려되는 라이브러리의 예는 나이브 라이브러리(na

ve libraries)(비시험 대상체로부터), 면역화된 라이브러리(immunized libraries)(항원으로 면역화된 대상체로부터) 또는 합성 라이브러리(synthetic libraries)를 포함한다. 항체 또는 그의 영역(예를 들어, 가변 영역)을 코딩하는 핵산은 통상적인 기술(예를 들어, Sambrook and Russell, eds, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed, vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001에 기술)에 의해 클로닝되고 당업계에 공지된 방법을 사용하여 단백질을 엔코드 및 디스플레이(display)하는데 사용된다. 단백질 라이브러리를 생성하기 위한 다른 기술은 예를 들어, US6300064(예를 들어, a HuCAL library of Morphosys AG); US5885793; US6204023; US6291158; 또는 US6248516에 기술되어 있다.

본 개시내용에 따른 항원 결합 단편은 가용성 분비 단백질일 수 있거나 세포 또는 입자(particle)(예를 들어, 파지(phage) 또는 기타 바이러스, 리보솜(ribosome) 또는 포자(spore))의 표면 상에 융합 단백질로서 제시될 수 있다. 다양한 디스플레이 라이브러리 형식이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 라이브러리는 생체외(in vitro) 디스플레이 라이브러리이다(예를 들어, US7270969에 기재된 바와 같은 리보솜 디스플레이 라이브러리, 공유 디스플레이 라이브러리 또는 mRNA 디스플레이 라이브러리). 또 다른 예에서, 디스플레이 라이브러리는 예를 들어 US6300064; US5885793; US6204023; US6291158; 또는 US6248516에 기재된 바와 같이 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 단백질이 파지 상에서 발현되는 파지 디스플레이 라이브러리이다. 다른 파지 디스플레이 방법은 당업계에 공지되어 있고 본 개시내용에 의해 고려된다. 유사하게, 세포 디스플레이 방법은 예를 들어, US5516637에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 박테리아 디스플레이 라이브러리; 효모 디스플레이 라이브러리, 예를 들어 US6423538에 기재된 바와 같은 포유동물 디스플레이 라이브러리가 고려된다.

디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 한 예에서, 본 개시내용의 디스플레이 라이브러리는 예를 들어 Scopes(In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994) 에 기재된 바와 같이 친화성 정제를 사용하여 스크리닝된다. 친화성 정제 방법은 일반적으로 라이브러리에 의해 표시된 항원 결합 단편을 포함하는 단백질을 표적 항원(예: BTN2A1)과 접촉시키고 세척 후 항원에 결합된 채로 남아 있는 도메인을 용리(eluting)하는 것을 포함한다.

스크리닝에 의해 확인된 모든 가변영역 또는 scFv는 원하는 경우 완전한 항체로 쉽게 변형된다. 가변 영역 또는 scFv를 완전한 항체로 변형 또는 재포맷(reformatting)하기 위한 예시적인 방법이 예를 들어, Jones et al., J Immunol Methods. 354:85-90, 2010; 또는 Jostock et al., J Immunol Methods, 289: 65-80, 2004; 또는 WO2012040793에 기재되어 있다. 대안적으로 또는 추가로, 표준 클로닝 방법이 예를 들어, Ausubel et al (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987), 및/또는 (Sambrook et al (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001)에 설명된 바와 같이 사용된다.

탈면역화 , 키메릭 , 인간화, 합성인간화, 영장류화 및 인간 항체 또는 항원 결합 단편

본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편은 인간화될 수 있다.

용어 "인간화 항체(humanized antibody)"는 인간-유사 가변 영역을 포함하는 단백질을 지칭하는 것으로 이해되어야 하며, 여기에는 인간 항체의 FRs에 이식되거나 삽입된 비-인간 종(예: 마우스 또는 쥐 또는 비인간 영장류)의 항체로부터의 CDR이 포함된다(이 유형의 항체는 "CDR-이식된 항체"라고도 함). 인간화 항체는 또한 인간 단백질의 하나 이상의 잔기가 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형되고/거나 인간 항체의 하나 이상의 FR 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된 항체를 포함한다. 인간화 항체는 또한 인간 항체 또는 비인간 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 항체의 임의의 추가 영역(예: Fc 영역)은 일반적으로 인간이다. 인간화는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 US5225539, US6054297, US7566771 또는 US5585089를 사용하여 수행될 수 있다. 용어 "인간화 항체"는 또한 예를 들어 US7732578에 기재된 바와 같은 초-인간화 항체(super-humanized antibody)를 포함한다. "인간화 항원 결합 단편(humanized antigen binding fragment)"이라는 용어에 유사한 의미가 적용될 것이다.

본 개시내용의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "인간 항체(human antibody)"는 인간에서 예를 들어, 인간 생식세포 또는 체세포에서 또는 그러한 영역을 사용하여 생산된 라이브러리에서 발견되는 가변 및 선택적으로 불변 항체 영역을 갖는 항체를 의미한다. "인간(human)" 항체는 인간 서열, 예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 지정 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이(특히 단백질의 소수의 잔기, 예를 들어 단백질 잔기의 1, 2, 3, 4 또는 5에서 보존적 치환 또는 돌연변이를 포함하는 돌연변이)에 의해 엔코드되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 "인간 항체"는 반드시 인간의 면역 반응의 결과로 생성될 필요는 없으며, 오히려 재조합 수단(예: 파지 디스플레이 라이브러리 스크리닝) 및/또는 인간 항체 불변 및/또는 가변 영역을 엔코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환 동물(예를 들어, 마우스) 및/또는 가이드 셀렉션(guided selection)을 사용하여(예를 들어, 또는 US5565332에 기재된 바와 같음) 생성될 수 있다. 이 용어는 또한 그러한 항체의 친화성 성숙 형태(affinity matured forms)를 포함한다. 본 개시의 목적을 위해, 인간 항체는 또한 인간 항체로부터의 FR을 포함하는 단백질 또는 인간 FR의 공통 서열(consensus sequence)로부터의 서열을 포함하는 FR을 포함하고 CDR 중 하나 이상이 무작위 또는 반-무작위, 예를 들어, US6300064 및/또는 US6248516에 기재된 단백질을 포함하는 것으로 간주될 것이다. "인간 항원 결합 단편"이라는 용어에 유사한 의미가 적용될 것이다. 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 합성인간화 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 용어 "합성인간화 항체(synhumanized antibody)"는 WO2007019620에 기재된 방법으로 제조된 항체를 의미한다. 합성인간화 항체는 항체의 가변영역을 포함하고, 여기서 가변영역은 New World 영장류 항체 가변영역으로부터의 FR 및 비-New World 영장류 항체 가변영역으로부터의 CDR을 포함한다.

본 개시내용의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 영장류화될 수 있다. "영장류화 항체(primatized antibody)"는 비-인간 영장류(예를 들어, 사이노몰구스 마카크(cynomolgus macaque))의 면역화 후에 생성된 항체로부터의 가변영역(들)을 포함한다. 선택적으로, 비인간 영장류 항체의 가변영역은 인간 불변영역에 연결되어 영장류화된 항체를 생성한다. 영장류화된 항체를 생산하기 위한 예시적인 방법은 US6113898에 기재되어 있다.

한 예에서 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 키메릭 항체 또는 단편이다. 용어 "키메릭 항체(chimeric antibody)" 또는 "키메릭 항원 결합 단편(chimeric antigen binding fragment)"은 가변 도메인 중 하나 이상이 특정 종(예: 마우스 또는 래트(rat)와 같은 뮤린(murine))에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 또는 단편을 지칭하고, 항체 또는 단편의 나머지는 다른 종(예: 인간 또는 비-인간 영장류)에서 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 하위 클래스에 속한다.

한 예에서, 비-인간 항체(예를 들어, 뮤린 항체)로부터의 V_H 및/또는 V_L을 포함하는 키메릭 항체 및 항체의 나머지 영역은 인간 항체로부터의 것이다. 이러한 키메릭 항체 및 이의 항원 결합 단편의 생성은 당업계에 공지되어 있고 표준 수단(예를 들어, US6331415; US5807715; US4816567 및 US4816397에 기재된 바와 같음)에 의해 달성될 수 있다.

본 개시내용은 또한 예를 들어 WO2000034317 및 WO2004108158에 기재된 바와 같은 탈면역화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 고려한다. 탈면역화된 항체 및 단편은 하나 이상의 에피토프, 예를 들어, B세포 에피토프 또는 T세포 에피토프가 제거(즉, 돌연변이)되어 대상체가 항체 또는 단백질에 대한 면역 반응을 일으킬 가능성을 감소시킨다. 예를 들어, 본 개시내용의 항체를 분석하여 하나 이상의 B 또는 T세포 에피토프를 확인하고 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 항체의 면역원성을 감소시킨다.

이중특이적 항체

본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편은 이중특이적 항체 또는 그의 단편일 수 있다. 이중특이적 항체는 상이한 항원 또는 에피토프에 대한 특이성을 갖는 2가지 유형의 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 2개의 절반 항체)을 포함하는 분자이다. 예시적인 이중특이적 항체는 동일한 단백질의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 대안적으로, 이중특이적 항체는 2개의 상이한 단백질 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다.

US5731168에 기술된 예시적인 "키 및 홀(key and hole)" 또는 "노브 및 홀(knob and hole)" 이중특이적 단백질. 한 예에서, 불변영역(예를 들어, IgG4 불변영역)은 T366W 돌연변이(또는 노브)를 포함하고 불변영역(예를 들어, IgG4 불변영역)은 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이(또는 홀)를 포함한다. 또 다른 예에서, 첫 번째 불변영역은 T350V, T366L, K392L 및 T394W 돌연변이(노브)를 포함하고 두 번째 불변영역은 T350V, L351Y, F405A 및 Y407V 돌연변이(홀)를 포함한다.

이중특이적 항체를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 예시적인 방법이 본원에 기재되어 있다.

한 예에서, IgG 유형 이중특이적 항체는 IgG 항체를 생산하는 2가지 유형의 하이브리도마를 융합하여 형성된 하이브리드 하이브리도마(quadroma)에 의해 분비된다(Milstein C et al., Nature 1983, 305: 537-540). 다른 예에서, 항체는 동시발현을 위한 두 개의 관심(interest) IgG를 구성하는 L 사슬과 H 사슬의 유전자를 세포에 도입함으로써 분비될 수 있다(Ridgway, JB et al. Protein Engineering 1996, 9: 617-621; Merchant, AM et al. Nature Biotechnology 1998, 16: 677-681).

한 예에서, 이중특이적 항체 단편은 상이한 항체로부터 유래된 Fab를 화학적으로 크로스-링킹(cross-linking)함으로써 제조된다(Keler T et al. Cancer Research 1997, 57: 4008-4014).

한 예에서, Fos 및 Jun 등으로부터 유래된 류신 지퍼(leucine zipper)는 이중특이적 항체 단편을 형성하기 위해 사용된다(Kostelny SA et al. J. of Immunology, 1992, 148: 1547-53).

한 예에서, 이중특이적 항체 단편은 2개의 교차 scFv 단편을 포함하는 디아바디 형태로 제조된다(Holliger P et al. Proc. of the National Academy of Sciences of the USA 1993, 90: 6444-6448).

항체 단편

단일-도메인 항체

일부 예에서, 본 개시내용의 항체의 항원 결합 단편은 단일-도메인 항체("도메인 항체(domain antibody)" 또는 "dAb"라는 용어와 상호교환적으로 사용됨)이거나 이를 포함한다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬이다. 예를 들어, 단일-도메인 항체는 나노바디 이다.

디아바디 , 트리아바디 , 테트라바디

일부 예에서, 본 개시내용의 항원 결합 단편은 WO98/044001 및/또는 WO94/007921에 기재된 것과 같은 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 고차 단백질 복합체이거나 이를 포함한다.

예를 들어, 디아바디는 2개의 연관된 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단백질이고, 각각의 폴리펩티드 사슬은 V_L-X-V_H 또는 V_H-X-V_L 구조를 포함하며, 상기 X는 단일 폴리펩티드 사슬의 V_H 및 V_L이 결합(또는 Fv를 형성)하거나 부재하도록 하기에 불충분한 잔기를 포함하는 링커이고, 상기 하나의 폴리펩티드 사슬의 V_H는 다른 폴리펩티드 사슬의 V_L에 결합하여 항원 결합 부위를 형성하며, 즉, 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fv분자를 형성한다. V_L 및 V_H는 각각의 폴리펩티드 사슬에서 동일할 수 있거나 V_L 및 V_H는 각각의 폴리펩티드 사슬에서 상이하여 이중특이적 디아바디(즉, 상이한 특이성을 갖는 2개의 Fv를 포함함)를 형성할 수 있다.

단일 사슬 Fv ( scFv ) 단편

당업자는 scFv는 단일 폴리펩티드 사슬의 V_H 및 V_L 영역 및 scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 V_H 및 V_L 사이의 폴리펩티드 링커(즉, 단일 폴리펩티드 사슬의 V_H 및 V_L이 서로 결합하여 Fv를 형성함)를 포함한다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 링커는 scFv에 대해 더 선호되는 링커 중 하나인 (Gly4Ser)3과 함께 12개 초과의 아미노산 잔기를 포함한다.

한 예에서, 링커는 서열 SGGGGSGGGGSGGGGS를 포함한다.

본 개시내용은 또한 단일 시스테인 잔기가 V_H의 FR 및 V_L의 FR 및 이황화 결합에 의해 연결된 시스테인 잔기에 도입되어 안정한 Fv를 생성하는 이황화 안정화 Fv(또는 diFv 또는 dsFv)를 고려한다.

대안적으로, 또는 추가로, 본 개시내용은 다이머릭 scFv, 즉, 비-공유 또는 공유 결합, 예를 들어 류신 지퍼 도메인(예를 들어, Fos 또는 Jun으로부터 유래됨)에 의해 연결된 2개의 scFv 분자를 포함하는 단백질을 포괄한다. 대안적으로, 2개의 scFv는 예를 들어 US20060263367에 기술된 바와 같이, scFv 둘 모두가 항원을 형성하고 항원에 결합하도록 허용하기에 충분한 길이의 펩티드 링커에 의해 연결된다.

반-항체

일부 실시예에서, 본 개시내용의 항원 결합 단편은 반-항체 또는 반-분자이다. 당업자는 반 항체가 단일 중쇄 및 단일 경쇄를 포함하는 단백질을 지칭한다는 것을 인지할 것이다. 용어 "반 항체"는 또한 항체 경쇄 및 항체 중쇄를 포함하는 단백질을 포함하며, 상기 항체 중쇄는 다른 항체 중쇄와의 결합을 방지하기 위해 돌연변이되었다. 한 예에서, 반 항체는 항체가 해리되어 각각 단일 중쇄 및 단일 경쇄를 포함하는 2개의 분자를 형성할 때 형성된다. 반 항체를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며 예시적인 방법이 본원에 기술되어 있다.

한 예에서, 반 항체는 발현하고자 하는 IgG를 구성하는 단일 중쇄 및 단일 경쇄의 유전자를 세포에 도입함으로써 분비될 수 있다. 한 예에서, 불변영역(예를 들어, IgG4 불변영역)은 헤테로다이머 형성을 방지하기 위한 "키 또는 홀"(또는 "노브 또는 홀") 돌연변이를 포함한다. 한 예에서, 불변영역(예를 들어, IgG4 불변 영역)은 T366W 돌연변이(또는 노브)를 포함한다. 다른 예에서, 불변영역(예: IgG4 불변영역)은 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이(또는 홀)를 포함한다. 다른 예에서, 불변영역은 T350V, T366L, K392L 및 T394W 돌연변이(노브)를 포함한다. 다른 예에서, 불변영역은 T350V, L351Y, F405A 및 Y407V 돌연변이(홀)를 포함한다. 예시적인 불변영역 아미노산 치환은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.

다른 항체 및 항체 단편

본 개시내용은 또한 다음과 같은 다른 항체 및 항체 단편을 고려한다:

(i) 예를 들어 US5837821에 기재된 바와 같은 미니바디(minibody);

(ii) 예를 들어, US4676980에 기재된 바와 같은 이종접합체(heteroconjugate) 단백질;

(iii) 예를 들어, US4676980에 기재된 바와 같은 화학적 크로스-링커(cross-linker)를 사용하여 생산된 이종접합체 단백질;

(iv) Fab₃(예를 들어, EP19930302894에 기술된 바와 같음).

안정화된 단백질

본 개시내용의 항원 결합 단백질은 IgG4 불변 영역 또는 안정화된 IgG4 불변 영역을 포함할 수 있다. 용어 "안정화된 IgG4 불변영역(stabilized IgG4 constant region)"은 Fab 암 교환을 감소시키도록 변형된 IgG4 불변영역 또는 Fab 암 교환 또는 반-항체 형성 또는 반항체 형성 경향을 의미하는 것으로 이해될 것이다. "Fab 암 교환(Fab arm exchange)"는 IgG4 중쇄 및 부착된 경쇄(반-분자)가 다른 IgG4 분자의 중쇄 쌍으로 교환되는 인간 IgG4에 대한 단백질 변형 유형을 나타낸다. 따라서, IgG4 분자는 2개의 별개의 항원을 인식하는 2개의 별개의 Fab 암을 획득할 수 있다(이중특이적 분자를 생성함). Fab 암 교환은 생체 내에서 자연적으로 발생하며 정제된 혈액 세포 또는 환원된 글루타티온(glutathione)과 같은 환원제에 의해 시험관 내에서 유도될 수 있다.

한 예에서, 안정화된 IgG4 불변영역은 Kabat 시스템에 따른 힌지영역의 위치 241에 프롤린(proline)을 포함한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987 및/또는 1991). 이 위치는 EU 넘버링 시스템에 따른 힌지영역의 위치 228에 해당한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 2001 and Edelman et al., Proc . Natl . Acad . USA, 63, 78-85, 1969). 인간 IgG4에서 이 잔기는 일반적으로 세린(serine)이다. 프롤린에 대한 세린의 치환 후, IgG4 힌지영역은 서열 CPPC를 포함한다. 이와 관련하여, 당업자는 "힌지영역"이 항체의 2개의 Fab 암에 이동성을 부여하는 Fab영역 및 Fc를 연결하는 항체 중쇄 불변영역의 프롤린이 풍부한 부분이라는 것을 인지할 것이다. 힌지영역은 중쇄간 이황화 결합에 관여하는 시스테인 잔기를 포함한다. 일반적으로 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 인간 IgG1의 Glu226에서 Pro243으로 늘어나는 것으로 정의됩니다. 다른 IgG 이소타입의 힌지영역은 중쇄간 이황화(S-S) 결합을 형성하는 첫 번째 및 마지막 시스테인 잔기를 동일한 위치에 배치함으로써 IgG1 서열과 정렬될 수 있다(예: WO2010080538 참조).

면역글로불린 및 면역글로불린 단편

본 개시내용의 항원 결합 단백질의 예는 TCR 또는 중쇄 면역글로불린(예를 들어, IgNAR, 낙타류 항체)과 같은 면역글로불린의 가변영역을 포함하는 단백질이다.

중쇄 면역글로불린

중쇄 면역글로불린은 중쇄를 포함하지만 경쇄를 포함하지 않는다는 점에서 많은 다른 형태의 면역글로불린(예: 항체)과 구조적으로 상이하다. 따라서 이러한 면역글로불린은 "중쇄 전용 항체(heavy chain only antibodies)"라고도 한다. 중쇄 면역글로불린은 예를 들어 낙타와 연골어류(IgNAR라고도 함)에서 발견된다.

자연 발생 중쇄 면역글로불린에 존재하는 가변 영역은 기존의 4-사슬 항체에 존재하는 중쇄 가변영역("V_H 도메인"이라고 함) 및 기존의 4-사슬 항체에 존재하는 경쇄 가변영역("V_L 도메인"이라고 하는)과 구별하기 위해일반적으로 낙타류 Ig에서 "V_HH 도메인"으로, IgNAR에서 V-NAR로 지칭된다.

중쇄 면역글로불린은 관련 항원에 대해 높은 친화도 및 높은 특이도로 결합하기 위해 경쇄의 존재를 필요로 하지 않는다. 이는 단일 도메인 결합 단편이 발현하기 쉽고 일반적으로 안정하고 가용성인 중쇄 면역글로불린으로부터 유래될 수 있음을 의미한다.

낙타과의 중쇄 면역글로불린 및 이의 가변영역 및 이의 생산 및/또는 분리 및/또는 사용 방법에 대한 일반적인 설명은 특히 다음 참조 WO94/04678, WO97/49805 및 WO 97/49805에서 찾을 수 있다.

연골 어류로부터의 중쇄 면역글로불린 및 이의 가변영역 및 이의 생산 및/또는 분리 및/또는 사용 방법에 대한 일반적인 설명은 특히 WO2005118629에서 발견된다.

V-유사 단백질

한 예에서, 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 TCR을 포함한다. T세포 수용체에는 항체의 Fv모듈과 유사한 구조로 결합되는 2개의 V-도메인이 있다.

Novotny et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 8646-8650, 1991은 T세포 수용체의 두 V-도메인(알파 및 베타라고 함)이 어떻게 융합되어 단일 사슬 폴리펩티드로 발현될 수 있는지, 나아가 항체 scFv와 직접적으로 유사한 소수성을 감소시키기 위해 표면 잔기를 변경하는 방법을 설명한다. 2개의 V-알파 및 V-베타 도메인을 포함하는 단일-사슬 T-세포 수용체 또는 멀티머릭(multimeric) TCR의 생산을 기술하는 다른 간행물에는 WO1999045110 또는 WO2011107595가 포함된다.

항원 결합 도메인을 포함하는 다른 비-항체 단백질은 일반적으로 모노머릭(monomeric) V-유사 도메인을 갖는 단백질을 포함한다. 이러한 V-유사 도메인을 포함하는 단백질의 예는 CTLA-4, CD28 및 ICOS를 포함한다. 이러한 V-유사 도메인을 포함하는 단백질의 추가 개시는 WO1999045110에 포함된다.

애드넥틴 ( Adnectins )

한 예에서, 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 애드넥틴을 포함한다. 애드넥틴은 루프 영역이 항원 결합을 부여하도록 변경되는 인간 피브로넥틴(fibronectin)의 10번째 피브로넥틴 유형 III(10Fn3) 도메인을 기반으로 한다. 예를 들어, 10Fn3 도메인의 β-샌드위치(β-sandwich) 한쪽 끝에 있는 3개의 루프는 애드넥틴이 항원을 특이적으로 인식할 수 있도록 조작될 수 있다. 자세한 내용은 US20080139791 또는 WO2005056764를 참조한다.

안티칼린(Anticalins)

추가 예에서, 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 안날린을 포함한다. 안티칼린은 스테로이드(steroids), 빌린(bilins), 레티노이드(retinoids) 및 지질(lipids)과 같은 작은 소수성 분자를 운반하는 세포외 단백질 계열인 리포칼린(lipocalins)에서 파생된다. 리포칼린은 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 원추형 구조의 열린 말단에 다수의 루프가 있는 단단한 β-시트(β-sheet) 2차 구조를 가지고 있다. 이러한 조작된 리포칼린은 안티칼린(anticalins)으로 알려져 있다. 안티칼린에 대한 추가 설명은 US7250297 또는 US20070224633을 참조한다.

아피바디(Affibodies)

추가 예에서, 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 아피바디를 포함한다. 아피바디는 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 황색 포도구균(Staphylococcus aureus) 단백질 A의 Z 도메인(항원 결합 도메인)에서 파생된 스캐폴드(scaffold)이다. Z 도메인은 약 58개 아미노산의 3-나선 번들(three-helical bundle)로 구성된다. 라이브러리는 표면 잔류물의 무작위화에 의해 생성된다. 자세한 내용은 EP1641818을 참조한다.

아비머(Avimers)

추가 예에서, 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 아비머를 포함한다. 아비머는 A-도메인 스캐폴드 패밀리에서 파생된 다중도메인 단백질이다. 약 35개 아미노산의 고유 도메인은 정의된 이황화 결합 구조를 채택한다. 다양성은 A-도메인 계열이 나타내는 자연적 변이를 섞음으로써 생성된다. 자세한 내용은 WO2002088171을 참조한다.

DARPins

추가 예에서, 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 디자인된 안키린 반복 단백질(Designed Ankyrin Repeat Protein:DARPin)을 포함한다. DARPin은 세포 골격에 통합 막 단백질의 부착을 매개하는 단백질 패밀리인 안키린에서 파생된다. 단일 안키린 반복은 2개의 α-나선(α-helices)과 β-턴(β-turn)으로 구성된 33개 잔기 모티프(motif)이다. 그들은 첫 번째 α-나선과 각 반복의 β-턴에서 잔기를 무작위화하여 다른 표적 항원에 결합하도록 조작할 수 있다. 모듈의 수를 늘려 결합 인터페이스(binding interface)를 늘릴 수 있다(친화성 성숙 방법). 자세한 내용은 US20040132028을 참조한다.

아넥신(Annexins)

한 예에서, 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 아넥신을 포함한다. 리포코르틴(lipocortin)으로도 알려진 아넥신은 Ca2+ 의존적 방식으로 음전하를 띤 인지질, 특히 포스파티딜세린(phosphatidylserine:PS)을 노출시키는 막에 결합하는 가용성 단백질 패밀리를 형성한다. 아넥신은 고도로 보존된 70개 아미노산 도메인의 4중(예외적으로 8배) 반복과 기능적 특이성을 담당하는 것으로 추정되는 가변 아미노(N) 말단 도메인에 의해 형성된다. 아넥신은 세포 모양의 변화와 관련된 막 스캐폴드를 제공하는 것과 같은 다양한 세포 및 생리학적 과정에서 중요한다. 아넥신은 또한 소포의 트래픽킹(trafficking) 및 조직화, 엑소사이토시스(exocytosis), 엔도사이토시스(endocytosis) 및 칼슘 이온 채널 형성에 관여하는 것으로 나타났다.

아넥신 종 II, V 및 XI는 세포막 내에 위치하는 것으로 알려져 있다. 아넥신 A5는 가장 풍부한 막 결합 아넥신 스캐폴드이다. 아넥신 A5는 막의 포스파티딜세린 단위에 결합될 때 2차원 네트워크를 형성할 수 있다. 아넥신 A5는 e엔도사이토시스 및 엑소사이토시스 뿐만 아니라 다른 세포막 과정 동안 세포 모양의 변화를 안정화시키는 데 효과적이다.

아넥신 종 I(또는 아넥신 A1)은 원형질막의 세포질 면에 우선적으로 위치하며 막의 포스파티딜세린 단위에 결합한다. 아넥신 A1은 활성화된 막에 2차원 네트워크를 형성하지 않는다.

한 예에서, 아넥신 종은 아넥신 유도체 또는 이의 변이체이다. 아넥신 유도체 또는 이의 변이체는 당업계에 공지되어 있으며 예시적인 유도체 또는 변이체가 여기에 개시되어 있다. 예를 들어, 아넥신 변이체/유도체는 WO199219279, WO2002067857, WO2007069895, WO2010140886, WO2012126157, Schutters et al., Cell Death and Differentiation 20: 49-56, 2013, 또는 Ungeth

m et al., J Biol Chem., 286(3):1903-10, 2011에 기술되어 있다.

예를 들어, 아넥신 유도체는 절단될 수 있으며, 예를 들어 천연 단백질보다 하나 이상의 도메인 또는 더 적은 수의 아미노산 잔기를 포함하거나 치환된 아미노산을 포함할 수 있다. 한 예에서, 아넥신 유도체는 절단된 아넥신 1이다. 예를 들어, 절단된 아넥신 1은 N-말단 자가 절단 부위를 포함하지 않는다(예: 41개의 N-말단 아미노산이 삭제됨). 한 예에서, 변형된 아넥신은 X₁-Gly-X₂와 같은 아미노산 확장을 포함하는 N-말단 킬레이트화 부위를 가질 수 있으며, 여기서 X₁ 및 X₂는 Gly 및 Cys에서 선택된다. 한 예에서, 아넥신 유도체 또는 변형된 아넥신은 포스파티딜세린에 결합한다. 한 예에서, 아넥신 유도체 또는 변형 아넥신은 야생형 아넥신과 유사한 수준으로 포스파티딜세린에 결합한다. 예를 들어, 아넥신 유도체 또는 변형 아넥신은 야생형 아넥신과 동일한 수준에서 포스파티딜세린에 결합한다.

한 예에서, 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 아넥신 A5를 포함한다. 명명 목적으로만 제한되지 않고 아넥신 A5의 아미노산 서열은 유전자 수탁 ID 308, NCBI 레퍼런스 서열 NP_001145 및/또는 서열 번호 5에 표시되어 있다. 명명 목적으로만 제한되지 않고 아넥신 A1의 아미노산 서열은 NCBI 레퍼런스 서열 NP_000691.1 및/또는 서열 번호 7에 표시되어 있다.

감마- 카르복시글루탐산 -풍부(Gamma- carboxyglutamic acid- rich:GLA ) 도메인

한 예에서, 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 감마-카르복시글루탐산-풍부(GLA) 도메인 또는 이의 변이체를 포함한다.

GLA 도메인은 비타민 K 의존성 카르복실화에 의해 번역 후 변형되어 감마-카르복시글루타메이트(gamma-carboxyglutamate:Gla)를 형성하는 글루타메이트 잔기를 포함한다.

GLA 도메인을 포함하는 것으로 알려진 단백질은 당업계에 공지되어 있으며 비타민 K 의존성 단백질 S 및 Z, 프로트롬빈(prothrombin), 트랜스티레틴(transthyretin), 오스테오칼신(osteocalcin), 기질 GLA 단백질, 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 H2(inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2) 및 성장 정지 특이적 단백질 6(growth arrest-specific protein 6)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

락타데린 도메인( Lactadherin Domains)

한 예에서, 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 락타데린 도메인을 포함한다. 락타데린은 다양한 세포 유형에서 분비되는 당단백질이며 혈액 응고 인자 V 및 VIII의 C1 및 C2 도메인과 서열 상동성을 갖는 2개의 EGF 도메인과 2개의 C 도메인(C1C2 및 C2)을 포함한다. 이러한 응고 인자와 유사하게 락타데린은 포스파티딜세린(PS) 함유 막에 높은 친화력으로 결합한다.

한 예에서, 락타데린 도메인은 C1C2 도메인(예를 들어, 서열 번호: 27에 제시된 바와 같음)이다. 다른 예에서, 락타데린 도메인은 C2 도메인이다.

단백질 키나제 ( kinase ) 도메인

한 예에서, 본 개시내용은 단백질 키나제 C 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다.

단백질 키나제 C(Protein kinase C:PKC)는 이러한 단백질 또는 이 패밀리의 구성원에 있는 세린(serine) 및 트레오닌(threonine) 아미노산 잔기의 하이드록실 그룹(hydroxyl groups)의 인산화를 통해 다른 단백질의 기능을 제어하는 데 관여하는 단백질 키나제 효소 패밀리이다. PKC의 구조는 당업계에 공지되어 있고 힌지 영역에 의해 함께 연결된 조절 도메인 및 촉매 도메인으로 구성된다. 조절 도메인은 PKC를 원형질막으로 모집하기 위해 각각 DAG 및 Ca2+에 결합하는 C1 및 C2 도메인을 포함한다.

한 예에서, 단백질 키나제 C 도메인은 C1 도메인입니다. 다른 예에서, 단백질 키나제 C 도메인은 C2 도메인이다.

플렉스트린 ( Pleckstrin ) 상동 도메인

한 예에서, 본 개시내용은 플렉스트린 상동(pleckstrin homology:PH) 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. PH 도메인은 당업계에 공지되어 있으며 세포내 신호전달에 관여하거나 세포골격의 구성요소로서 광범위한 단백질에서 발생하는 작은 모듈 도메인이다. PH 도메인은 대략 120개의 아미노산을 포함한다. 도메인은 헤테로트리머릭(heterotrimeric) G 단백질의 베타/감마 서브유닛과 같은 단백질 및 생물학적 막 내에서 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol)에 결합할 수 있다. 이러한 상호 작용을 통해 PH 도메인은 단백질을 다른 막으로 모집하여 적절한 세포 구획으로 표적화하거나 신호 전달 경로의 다른 구성 요소와 상호 작용할 수 있도록 하는 역할을 한다.

포스파티딜세린 상호작용 펩티드

한 에에서, 본 개시내용은 포스파티딜세린-상호작용 펩티드를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 적합한 펩티드는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, Thapa et al., J. Cell. Mol . Med . 12. 1649-1660, 2008 및 Kim et al., PLOS One, 10(3): e0121171에 기재되어 있는 PSP1을 포함한다. PSP1은 서열 CLSYYPSYC(서열 번호 28)를 포함한다. 본 개시내용은 또한 포스파티딜세린에 결합하는 능력을 보유하는 PSP1의 변이체를 고려한다.

가용성 T세포 수용체

한 예에서, 본 개시내용의 BTN2A1 길항제는 가용성 Vγ9+ TCR이다. 본 개시내용에서 유용한 가용성 Vγ9+ TCR은 전형적으로 Vγ9+ γ사슬 및 δ사슬을 포함하는 γ사슬을 포함하는 헤테로다이머이지만, 2개의 상이한 γδ 헤테로다이머 또는 2개의 동일한 γδ 헤테로다이머를 포함하는 멀티머(예를 들어, 테트라머)가 또한 본 개시내용에서 사용을 위해 고려된다.

본 개시내용의 가용성 Vγ9+ TCR은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생성될 수 있고, 가장 일반적으로 재조합으로 생성된다. 본 개시내용에 따르면, 가용성 γδ TCR을 생성하는데 유용한 재조합 핵산분자는 전형적으로 재조합 벡터 및 γδ TCR의 하나 이상의 분절(예를 들어, 사슬)을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본 개시내용에 따르면, 재조합 벡터는 선택된 핵산 서열을 조작하기 위한 도구 및/또는 이러한 핵산 서열을 숙주 세포 내로 도입하기 위한 도구로서 사용되는 조작된 (즉, 인공적으로 생성된) 핵산 분자이다. 따라서 재조합 벡터는 선택 핵산 서열을 발현 및/또는 숙주 세포 내로 전달하여 재조합 세포를 형성하는 것과 같이 선택 핵산 서열을 클로닝, 시퀀싱 및/또는 달리 조작하는데 사용하기에 적합하다. 이러한 벡터는 일반적으로 이종 핵산 서열, 즉 클로닝되거나 전달될 핵산 서열에 인접하여 자연적으로 발견되지 않는 핵산 서열을 포함하지만, 벡터는 또한 관심 단백질(예를 들어, TCR 사슬)을 암호화하는 핵산 서열에 인접하여 자연적으로 발견되거나 핵산 분자의 발현에 유용한 조절 핵산 서열(예: 프로모터, 번역되지 않은 영역)을 함유할 수 있다. 벡터는 RNA 또는 DNA, 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있으며 일반적으로 플라스미드(plasmid)이다.

전형적으로, 재조합 핵산 분자는 하나 이상의 전사 제어 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다. 본원에 사용된 "재조합 분자(recombinant molecule)" 또는 "재조합 핵산 분자(recombinant nucleic acid molecule)"라는 문구는 "핵산 분자"는 주로 전사 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 핵산 분자 또는 핵산 서열을 말하지만, 이러한 핵산 분자가 본 명세서에서 논의된 바와 같은 재조합 분자인 경우 "핵산 분자"라는 문구와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 개시내용에 따르면, "작동적으로 연결된(operatively linked)"이라는 어구는 숙주 세포 내로 형질감염(즉, 형질전환, 형질도입, 형질감염, 접합 또는 전도)될 때 분자가 발현될 수 있도록 하는 방식으로 핵산 분자를 전사 제어 서열에 연결하는 것을 지칭한다. 전사 조절 서열은 전사의 개시, 연장 또는 종결을 조절하는 서열이다. 특히 중요한 전사 조절 서열은 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer), 오퍼레이터(operator) 및 리프레서(repressor) 서열과 같은 전사 개시를 조절하는 것이다. 적합한 전사 제어 서열은 재조합 핵산 분자가 도입될 숙주 세포 또는 유기체에서 기능할 수 있는 임의의 전사 제어 서열을 포함한다.

본 발명의 하나 이상의 재조합 분자는 본 개시내용의 엔코드된 생성물(예를 들어, 가용성 γδ TCR)을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시예에서, 엔코드된 생성물은 단백질을 생산하기에 효과적인 조건하에 본원에 기술된 바와 같은 핵산 분자를 발현함으로써 생산된다. 엔코드된 단백질을 생산하는 바람직한 방법은 숙주 세포를 하나 이상의 재조합 분자로 형질감염시켜 재조합 세포를 형성하는 것이다. 형질감염에 적합한 숙주 세포는 형질감염될 수 있는 임의의 박테리아, 진균(예를 들어, 효모), 곤충, 식물 또는 동물 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 숙주 세포는 형질감염되지 않은 세포 또는 적어도 하나의 다른 재조합 핵산 분자로 이미 형질감염된 세포일 수 있다. 본 발명의 생성된 단백질은 재조합 세포 내에 남거나; 배양 배지로 분비되고; 두 세포막 사이의 공간으로 분비되며; 또는 세포막의 외부 표면에 유지된다. "단백질을 회수한다(recovering the protein)"라는 문구는 단백질을 함유하는 전체 배양 배지를 수집하는 것을 의미하며, 분리 또는 정제의 추가 단계를 의미할 필요는 없다. 본 발명에 따라 생산된 단백질은 예를 들어, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 여과(filtration), 전기영동(electrophoresis), 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography), 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography), 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography), 콘카나발린 A 크로마토그래피(concanavalin A chromatography), 크로마토포커싱(chromatofocusing) 및 차등 가용화(differential solubilization)를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 정제할 수 있다. 본 개시내용에 따라 생산된 단백질은 바람직하게는 "실질적으로 순수한(substantially pure)" 형태로 회수된다. 본원에 사용된 "실질적으로 순수한"은 본 개시내용의 조성물 및 방법에서 가용성 γδ TCR의 효과적인 사용을 허용하는 순도를 지칭한다.

예를 들어, 관련 γ 및 δ 유전자(예를 들어, γδ TCR의 γ 및 δ사슬의 원하는 부분을 엔코딩하는 핵산 서열)를 함유하는 재조합 구조물은 새로 합성될 수 있거나 원하는 수용체를 발현하는 γδ T세포(예: 하이브리도마, 클론, 형질전환 세포)의 공급원으로부터 유래된 TCR cDNA의 PCR에 의해 생성될 수 있다. 원하는 γ 및 δ 유전자의 PCR 증폭은 사슬의 막횡단 및 세포질 도메인이 생략되도록 설계될 수 있다(즉, 가용성 수용체 생성). 바람직하게, 사슬간 이황화 결합을 형성하는 유전자의 일부가 유지되어 γδ 헤테로다이머 형성이 보존된다. 또한, 원하는 경우, 생성물 또는 구조물의 정제 또는 표지를 위한 선택가능한 마커를 엔코딩하는 서열이 구조물에 추가될 수 있다. 그런 다음 증폭된 γ 및 δ cDNA 쌍을 복제하고, 서열을 확인하고, 이중 배큘로바이러스(baculoviral vector) 프로모터(예: pAcUW51, Pharmingen Corp., San Diego, CA)를 포함하는 배큘로바이러스 벡터와 같은 적합한 벡터로 전달한다.

그런 다음 가용성 γδ TCR DNA 구조물은 예를 들어 상청액으로 재조합 수용체를 발현하고 분비할 적합한 숙주 세포(예를 들어, 배큘로바이러스 벡터의 경우 적절한 곤충 숙주 세포 내로 또는 포유동물 발현 벡터의 경우 적절한 포유동물 숙주 세포 내로)로 공동-형질감염된다. 가용성 γδ TCR을 포함하는 배양 상층액은 니켈 니트릴로트리아세트산 친화성 컬럼(nickel nitrilotriacetic acid affinity columns)과 같은 다양한 친화성 컬럼을 사용하여 정제할 수 있다. 생성물은 농축하여 보관될 수 있다. 본 개시내용에서 사용하기 위한 가용성 TCR을 생성하기 위해 다른 방법 및 프로토콜이 사용될 수 있고, 이러한 방법은 본원에서 사용하기 위해 명백히 고려된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.

약학적 조성물

적합하게는, BTN2A1 작용제 또는 길항제를 대상체에 투여하기 위한 조성물 또는 방법에서, BTN2A1 작용제 또는 길항제는 당업계에서 이해되는 바와 같이 제약상 허용되는 담체(carrier)와 조합된다. 따라서, 본 개시내용의 한 예는 약학적으로 허용되는 담체와 조합된 본 개시내용의 BTN2A1 작용제 또는 길항제를 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)을 제공한다.

일반적으로, "담체(carrier)"는 고체 또는 액체 충전제(liquid filler), 결합제(binder), 희석제(diluent), 캡슐화 물질(encapsulating substance), 유화제(emulsifier), 습윤제(wetting agent), 용매(solvent), 현탁제(suspending agent), 코팅(coating) 또는 윤활제(lubricant)를 의미하며, 이는 인간과 같은 모든 대상체에게 안전하게 투여될 수 있다. 특정 투여 경로에 따라, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991)에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 다양한 허용가능한 담체가 사용될 수 있다.

BTN2A1 작용제 또는 길항제 발명은 예방 또는 치료 치료를 위해 비경구, 국소, 경구 또는 국부 투여, 에어로졸 투여, 또는 경피 투여에 유용하다. 한 예에서, BTN2A1 작용제 또는 길항제는 피하 또는 정맥내와 같이 비경구적으로 투여된다. 에를 들어, BTN2A1 작용제 또는 길항제는 정맥내 투여된다.

투여될 BTN2A1 작용제 또는 길항제의 제형은 투여 경로 및 선택된 제형(예를 들어, 용액, 에멀젼, 캡슐)에 따라 달라질 것이다. 투여될 BTN2A1 작용제 또는 길항제를 포함하는 적절한 약학적 조성물은 생리학적으로 허용되는 담체에서 제조될 수 있다. 용액 또는 에멀젼의 경우, 적합한 담체는 예를 들어 염수 및 완충 매질을 포함하는 수성 또는 알코올성/수성 용액, 에멀젼(emulsions) 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클(vehicles)은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose), 덱스트로스(dextrose) 및 염화나트륨, 락테이트 링거(lactated Ringer's) 또는 고정 오일을 포함할 수 있다. 물, 완충수(buffered water), 완충 식염수(buffered saline), 폴리올(polyols)(예를 들어, 글리세롤(glycerol), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 액체 폴리에틸렌 글리콜(liquid polyethylene glycol)), 덱스트로스 용액 및 글리신(glycine)을 포함하는 다양한 적절한 수성 담체가 당업자에게 공지되어 있다. 정맥내 비히클은 다양한 첨가제, 방부제, 또는 유체, 영양소 또는 전해질 보충제를 포함할 수 있다(일반적으로 Remington's Pharmaceutical Science, 16th Edition, Mack, Ed. 1980 참조). 조성물은 pH 조절제 및 완충제 및 독성 조절제, 예를 들어, 아세트산나트륨(sodium acetate), 염화나트륨(sodium chloride), 염화칼륨(potassium chloride), 염화칼슘(calcium chloride) 및 젖산나트륨(sodium lactate)과 같은 생리학적 조건을 근사화하는 데 필요한 약학상 허용되는 보조 물질을 임의로 함유할 수 있다. BTN2A1 작용제 또는 길항제는 액체 단계에서 저장될 수 있거나 저장을 위해 동결건조될 수 있고 당업계에 공지된 동결건조 및 재구성 기술에 따라 사용하기 전에 적합한 담체에서 재구성될 수 있다.

γδ T세포 면역 반응의 기능적 측정

본 개시내용은 또한 세포용해 기능, 하나 이상의 사이토카인의 사이토카인 생산 및/또는 γδ T세포의 증식을 활성화 또는 억제할 수 있는 BTN2A1 작용제 또는 길항제에 관한 것이다. T-세포 수 및 기능은 사이토카인 생성, 증식 또는 세포독성과 같은 활성에 의해 T 세포를 검출하는 검정에 의해 모니터링될 수 있다. 이러한 활동은 임상 결과와 상관관계가 있을 수 있다. 예를 들어, 세포용해 활성의 활성화는 BTN2A1 작용제 또는 길항제로 치료한 후 종양 표적 또는 감염된 세포의 용해를 초래할 수 있다. 활성화 및 증가된 사이토카인 생성은 종양 또는 기타 표적의 사이토카인 유도 세포 사멸을 유발할 수 있다.

γδ T세포의 세포용해 기능을 활성화함으로써, 이는 γδ T세포의 세포독성의 증가, 즉 γδ T세포에 의한 표적 세포의 특이적 용해의 증가를 의미한다. γδ T세포의 세포용해 기능을 억제함으로써, 이는 γδ T세포의 세포독성의 감소, 즉 γδ T세포에 의한 표적 세포의 특이적 용해의 감소를 의미한다. γδ T세포의 세포용해 기능은 예를 들어 직접적인 세포독성 분석에 의해 측정될 수 있다. 세포독성 분석은 일반적으로 T세포 또는 PBMC를 포함하는 샘플을 ⁵¹Cr 또는 유로퓸(europium)이 로딩된 표적과 혼합하고 표적 세포 용해 후 크롬(chromium) 또는 유로퓸의 방출을 측정하는 것을 포함한다. 종양 세포라인과 같은 대리 표적이 자주 사용된다. 표적에는 항원, 예를 들어 pAg가 로딩될 수 있다. 샘플 및 표적은 BTN2A1 작용제 또는 길항제의 존재 또는 부재하에 인큐베이션된다. 약 4시간 동안 인큐베이션한 후 표적의 용해 백분율은 달성 가능한 표적의 최대 용해와 비교하여 계산된다. 세포독성 분석은 수동적으로 전달된 T세포 및 능동 면역요법 접근법의 활성을 모니터링하는 데 사용할 수 있다.

γδ T세포에 의한 하나 이상의 사이토카인 생성을 활성화 또는 억제함으로써, 이는 γδ T세포에 의한 하나 이상의 특정 사이토카인(예를 들어, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, IL-2, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1α 또는 IL-17A)의 총 사이토카인 생산의 각각 증가 또는 감소를 의미한다. T세포에 의한 사이토카인 분비는 벌크(bulk) 사이토카인 생산(ELISA에 의해), 비드 기반 분석(bead based assays)(예: Luminex)에 의해, 또는 개별 사이토카인 생산 T세포를 열거(ELISPOT 분석에 의해)하여 검출할 수 있다.

ELISA 분석에서, PBMC 샘플은 BTN2A1 작용제 또는 길항제의 존재 또는 부재 하에 BTN2A1을 발현하는 세포가 첨가되거나 첨가되지 않은 상태에서 인큐베이션되고, 정의된 기간 후, 배양물로부터의 상청액을 수확하고 관심 있는 사이토카인에 대한 항체로 코팅된 미세역가(microtiter) 플레이트에 첨가한다. 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자에 연결된 항체를 추가하고 플레이트를 세척하고 판독한다. 일반적으로 단일 사이토카인은 각 웰에서 측정되지만 단일 샘플에서 최대 15개의 사이토카인을 측정할 수 있다. 관심 있는 사이토카인에 대한 항체는 형광 염료의 균일하고 독특한 비율로 미소구체에 공유 결합될 수 있다. 그런 다음 형광 리포터 염료에 접합된 검출 항체를 추가하고 유세포 분석을 수행한다. 관심 있는 특정 사이토카인을 나타내는 특정 형광에 게이팅(gating)함으로써 리포터 형광의 양에 비례하는 사이토카인의 양을 정량화하는 것이 가능하다.

Luminex와 같은 비드 기반 분석에서, 샘플은 일반적으로 분석물 특이적 포획 항체로 미리 코팅된 색상으로 구분된 비드의 혼합물에 추가된다. 항체는 관심 있는 분석물에 결합한다. 관심 분석물에 특이적인 비오틴화된(Biotinylated) 검출 항체가 추가되어 항체-항원 샌드위치(antibody-antigen sandwich)를 형성한다. 형광단 결합 스트렙타비딘(Fluorophore-conjugated streptavidin)이 추가되어 비오틴화된 검출 항체에 결합한다. 비드는 흐름 기반 감지 기기에서 읽는다. 하나의 레이저는 비드를 분류하고 검출되는 분석 물질을 결정한다. 두 번째 레이저는 결합된 분석물의 양에 정비례하는 형광단 유래 신호의 크기를 결정한다.

ELISPOT 분석은 일반적으로 96-웰 마이크로타이터 플레이트(96-well microtiter plate)를 정제된 사이토카인 특이적 항체로 코팅; 무작위 단백질의 비특이적 흡수를 방지하기 위해 플레이트를 차단; BTN2A1 작용제 또는 길항제의 존재 또는 부재하에 다양한 희석액으로 사이토카인 분비 T세포를 자극 세포와 함께 배양; 세제로 세포 용해; 표지된 2차 항체 추가; 및 항체-사이토카인 복합체 검출하는 단계를 포함한다. 최종 단계의 생성물은 일반적으로 현미경, 시각적 또는 전자적으로 정량할 수 있는 착색된 생성물을 생성하는 효소/기질 반응이다. 각 반점은 관심 있는 사이토카인을 분비하는 하나의 단일 세포를 나타낸다.

γδ T세포에 의한 하나 이상 사이토카인의 사이토카인 생산은 또한 다중 매개변수 유세포 분석에 의해 검출될 수 있다. 여기에서 사이토카인 분비는 γδ T 세포에서 브레펠딘 A(Brefeldin A) 또는 모넨신(Monensin)(서로 다른 방식으로 골지에 작용하는 두 단백질 수송 억제제, 어떤 것이 가장 좋은지는 검사할 사이토카인에 따라 다르다)으로 4-24시간 동안 차단된 후 세포가 관심 마커에 대해 표면 염색된 다음 고정 및 투과화되고 관심 있는 사이토카인을 표적으로 하는 형광단 결합 항체로 세포내 염색된다. 그 후 세포는 유세포분석에 의해 분석될 수 있다. 유세포 분석을 통해 말초 혈액, 림프절 또는 조직에서 T 세포의 사이토카인 분비 패턴을 특성화하여 인간의 면역 반응을 모니터링하는 것이 가능하다. 이것은 BFA 또는 모넨신 치료 없이 생체 외에서 수행할 수 있다.

γδ T세포의 증식을 활성화 또는 억제한다는 것은 각각 γδ T세포의 수의 증가 또는 감소를 의미한다. 증식은 림프 증식 분석을 사용하여 측정할 수 있다. 정제된 T세포 또는 PBMC의 샘플은 BTN2A1 작용제 또는 길항제의 존재 또는 부재하에 자극제 세포의 다양한 희석액과 혼합된다. 72-120시간 후, [3H]티미딘([3H]thymidine)이 첨가되고, DNA 합성(증식의 척도로서)은 DNA에 통합된 방사성 표지된 티미딘의 양을 측정하기 위해 감마 계수기를 사용하여 정량화될 수 있다. 증식 분석은 BTN2A1 작용제 또는 길항제의 투여 전후에 γδ T-세포 반응을 비교하기 위해 사용될 수 있다.

본 개시내용은 또한 BTN2A1을 발현하는 세포, 예를 들어 단핵구, 대식세포 및/또는 수지상 세포의 활성 및/또는 생존을 활성화 또는 억제할 수 있는 BTN2A1 작용제 또는 길항제에 관한 것이다. BTN2A1을 발현하는 세포의 활성을 활성화 또는 억제함으로써, BTN2A1 작용제 또는 길항제는 세포 표면에서 공동자극 분자 발현(예: CD86, CD80 및 HLA-DR)을 각각 증가 또는 감소시키고, 및/또는 이들 세포에서 TLR(Toll-like receptor) 리간드에 의해 유도된 염증전 반응을 증가시키고/시키거나 면역 체크포인트 분자(PD-L1, PD-L2와 같은)의 발현을 조절하는 것을 의미한다. BTN2A1을 발현하는 세포의 활성 및/또는 생존은 항원 제시 분석(antigen presentation assays)에 의해 측정될 수 있다. 간단히 말해서, CD14+ 세포는 PBMC로부터 분리될 수 있고 GM-CSF 및 IL-4를 함유하는 배지에서 5일에 걸쳐 배양되어 MODC를 생성할 수 있다. 항체-단백질 복합체가 이들에 추가될 수 있고 이전에 설명된 바와 같이 MODC에 추가된 단백질을 인식할 수 있는 HLA-일치 T세포를 추가한 후 이러한 T세포에 대한 ICS를 추가함으로써 제시 능력을 측정할 수 있다.

적응증(Indications)

본 개시내용은 질병 또는 상태의 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방 또는 증상 완화에 사용될 수 있는 BTN2A1 작용제 또는 길항제에 관한 것이다. BTN2A1 작용제 또는 길항제는 이를 필요로 하는 대상체에게 직접 투여될 수 있거나 생체외 자극 및 대상체로의 세포(γδ T-세포 포함)의 입양 전달(adoptive transfer)을 위해 사용될 수 있다.

당업자는 BTN2A1 작용제 또는 길항제의 사용이 하나 이상의 γδ T-세포 면역 반응을 향상시키거나 억제하기를 원하는지 여부 및 표적화된 γδ T-세포 집단이 면역 억제 또는 면역 자극인지 여부에 의존한다는 것을 이해할 것이다. 한 실시예에서, γδ T-세포 기능은 예를 들어 종양 또는 감염된 세포에 대한 세포독성을 촉진함으로써 γδ T-세포의 항종양 또는 항병원체 활성을 촉진하도록 조작된다. 다른 실시예에서, γδ T세포 기능은 면역 반응 동안 γδ T세포의 면역억제 및/또는 조절 활성을 촉진하도록 조작된다.

BTN2A1 작용제 또는 길항제는 암의 증상을 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방 또는 완화에 사용할 수 있다.

BTN2A1 작용제 또는 길항제는 또한 감염 증상을 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방 또는 완화에 사용할 수 있다.

BTN2A1 작용제 또는 길항제는 암 또는 감염 치료를 위한 백신 보조제로 사용될 수 있다.

BTN2A1 작용제 또는 길항제는 또한 자가면역 질환을 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방 또는 증상 완화에 사용할 수 있다.

BTN2A1 길항제는 프레드니손(prednisone), 아자티오프린(azathioprine), 사이클로스포린(cyclosporin), 메토트렉세이트(methotrexate) 및 사이클로포스파미드(cyclophosphamide)와 같은 다른 면역억제제 및 화학요법제와 조합하여 사용할 수 있다.

실시예 1: 재료 및 방법

인간 샘플

건강한 기증자 혈액 유래 인간 말초 혈액 세포(peripheral blood cells:PBMCs)는 윤리 승인 17-08VIC-16 또는 16-12VIC-03에 따라 호주 적십자사 혈액 서비스(Australian Red Cross Blood Service)에서 수득했고, University of Melbourne 인간 윤리 소위원회(1035100) 또는 Olivia Newton John Cancer Research Institute(ONJCRI) Austin Health Human Research Ethics Committee(H2012-04446)의 윤리 승인을 받았으며, 밀도 구배 원심분리(Ficoll-Paque PLUS GE Health Care) 및 적혈구 용해(ACK 완충액, 사내 생산)를 통해 분리되었다. 확립된 세포라인은 MycoAlert 테스트(Lonza)를 사용하여 마이코플라스마-음성(Mycoplasma-negative)으로 일상적으로 확인되었으며 STR 프로파일링(profiling)에 의해 교차-오염(cross-contamination)이 배제되었다.

유세포 분석

인간 세포를 펠릿하고(pelleted)(400 x g) 세척하고 인간 Fc 수용체 블록(Miltenyi Biotec)을 포함하는 PBS/2% 소 태아 혈청(fetal bovine serum:FBS)과 함께 4ºC에서 인큐베이션했다. 마우스 NIH-3T3 세포를 항-CD16/CD32(클론 2.4G2, 사내 생산)와 함께 인큐베이션했다. 그런 다음 세포를 7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D:7-AAD, Sigma) 또는 LIVE/DEAD® 생존 마커(ThermoFisher) 및 항체와 함께 인큐베이션했다(표 1). BTN2A1 및 BTN3A는 사내에서 생성된 모노클로날 항체를 사용하여 검출되었다(아래 참조). 항-BTN2A1 mAb 또는 일치하는 이소형 대조군(클론 BM4, 사내 생산)은 아민 커플링(amine coupling)(Thermo Fisher)을 통해 Alexa Fluor®-647에 접합되었고, 항-BTN3A(클론 103.2)는 설포-SMCC 헤테로이종기능성 크로스링커(sulfo-SMCC heterobifunctional crosslinker)를 사용하여 R-피코에리트린(R-phycoerythrin)(Prozyme)에 접합되었다. 일부 실시예에서, 결합되지 않은 항-BTN2A1 mAb는 염소 항-마우스 다클론성 이차 항체 PE(anti-mouse polyclonal secondary antibody PE)(BD-Pharmingen)를 사용하여 검출되었으며, 후속 차단 단계(5% 정상 마우스 혈청)가 있었다. 세포는 또한 사량체 Vγ9Vδ2+ γδTCR, BTN2A1 또는 마우스 CD1d-α-GalCer 엑토도메인(ectodomains)(사내 생산, 아래 참조) 또는 등가량의 스트렙타비딘 접합체 단독(streptavidin conjugate alone)(BD)으로 염색되었다. 각 시약을 적정하여 최적의 희석 인자를 결정했다. 모든 데이터는 LSRFortessa™ II(BD)에서 수집되었으며 FACSDiva 및 FlowJo(BD) 소프트웨어로 분석되었다. 모든 샘플은 시간, 전방 산란 면적 대 높이 및 생존 염료 매개변수를 사용하여 불안정한 이벤트(events), 이중선 및 죽은 세포를 각각 제외하도록 게이트(gated)되었다.

유세포 분석에 사용되는 항체

타켓 (Target)	타겟 종 (Target species)	소스 종 (Source species)	클론 이름 (Clone name)	형광색소 ( Fluorochrome )	제조사 (Manufacturer)	농도 (Concentration)
Fc receptor block	Human	Unknown	N.A.	None	Miltenyi Biotec	1:40
Fc receptor block	Mouse	Rat	2.4G2	None	In-house	1:50
7-AAD	Mouse/human	N.A.	N.A.	Not applicable	Sigma	3 μg/ml
LIVE/DEAD marker	Mouse/human	N.A.	N.A.	Near-IR, Violet	ThermoFisher	1:1,000
CD3ε	Human	Mouse	UCHT1	APC	BD-Pharmingen	1:50
CD3ε	Human	Mouse	UCHT1	BUV395	BD-Pharmingen	1:100
CD3	Human	Mouse	SK7	APC-Cy7	BioLegend	1:100
CD3ε	Human	Mouse	OKT3	-	In-house	1:100
γδTCR	Human	Mouse	11F2	PE-Cy7	BD-Pharmingen	1:50
CD19	Human	Mouse	SJ25C1	APC-Cy7	BD-Pharmingen	1:100
CD4	Human	Mouse	RPA-T4	FITC	BD-Pharmingen	1:20
CD8α	Human	Mouse	SK1	APC, PE	BD-Pharmingen	1:100-200
CD56	Human	Mouse	HCD56	BV605	BioLegend	1:100
TCR Vδ1	Human	Mouse	TS8.2	FITC	Invitrogen	1:200
TCR Vδ2	Human	Mouse	B6	BV711	BioLegend	1:150-400
TCR Vγ9	Human	Mouse	B3	APC	BioLegend	1:400
CD14	Human	Mouse	M5E2	BUV805	BD-Pharmingen	1:400
CD45	Human	Mouse	HI30	AF700	BioLegend	1:150
CD25	Human	Mouse	M-A251	PE	BD-Pharmingen	1:50
CD69	Human	Mouse	FN50	PE-Cy7	BD-Pharmingen	1:100
CD69	Human	Mouse	FN50	PE	BD-Pharmingen	1:50
IFN -γ	Human	Mouse	4S.B3	PerCP-Cy5.5	Biolegend	1:100
Isotype control IgG1, κ	N.A.	Mouse	MOPC-21	Unconjugated, PE	BioLegend	10μg/ml
Isotype control IgG2a, κ	N.A.	Human-m. IgG2a	BM4	Unconjugated, AF647	In house	2μg/ml
BTN2A1	Human	Human-m. IgG2a	See Fig. 11	Unconjugated, AF647	In house	2μg/ml
BTN3A1 /3A2/3A3	Human	Mouse	20.1	Unconjugated, PE	In house	2μg/ml
BTN3A1 /3A2/3A3	Human	Mouse	103.2	Unconjugated, PE	In house	0.3μg/ml
pan- Immunoglobulin	Mouse	Goat	polyclonal	BV421, PE	BioLegend	1:40
MR1-5-OP- RU tetramer	Human			BV421	In-house	2μg/ml
TCR tetramers	Human			PE	In-house	5μg/ml
BTN2A1 tetramer	Human			PE	In-house	5μg/ml
mouse CD1d tetramer	Mouse			PE	In-house	5μg/ml

γδ T세포 분리 및 확장

일부 실험에서 γδ T세포는 항-γδTCR-PECy7에 이어 항-피코에리트린-매개 자기 비드 정제(anti-phycoerythrin-mediated magnetic bead purification)를 사용하거나 γδ T세포 분리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 MACS에 의해 강화되었다. 농축 후 CD3+ Vδ2+ γδ T세포를 Aria III(BD)를 사용하여 분류하여 추가로 정제했다. 농축된(Enriched) γδ T세포는 플레이트 결합 항-CD3ε(OKT3, 10μg/ml, Bio-X-Cell), 가용성 항-CD28(CD28.2, 1μg/ml, BD Pharmingen)파이토헤마글루티닌(phytohemagglutinin)(0.5㎍/ml, Sigma) 및 재조합 인간 IL-2(100U/ml, PeproTech)로 48시간 동안 시험관 내에서 자극되고, 14-21일 동안 IL-2로 유지 관리하였다. 세포는 10%(v/v) FCS(JRH Biosciences)가 보충된 RPMI-1640 및 AIM-V(Invitrogen)의 50:50(v/v) 혼합물, 페니실린(100U/ml), 스트렙토마이신(100㎍/ml), 글루타맥스(2mM), 피루브산나트륨(1mM), 비필수 아미노산(0.1mM) 및 HEPES 완충액(15mM), pH 7.2?7.5(모두 Invitrogen Life Technologies에서 제공), 플러스 50μM 2-메르캅토에탄올(Sigma-Aldrich)로 구성된 완전배지에서 배양되었다.

형질전환( Transfections )

BTN2A1, BTN2A2, BTN3A1, BTN3A2, BTNL3 및 BTNL8(모두 isoform 1)은 pMIG II 포유류 발현 벡터(D. Vignali의 gift(Addgene 플라스미드 # 52107)(J. Holst et al.(2006))에 클로닝되고 Sanger 시퀀싱으로 확인되었다. 마우스 NIH-3T3, 햄스터 CHO-K1, 인간 LM-MEL-62 세포를 전날 도말하고 제조업체의 지침에 따라 OptiMEM에서 FuGene HD® 또는 Viafect™를 사용하여 형질감염시켰다. 유전자 발현을 가능하게 하기 위해 48시간(LM-MEL-62 세포의 경우 72시간) 후, 세포를 GFP 및 유전자 발현에 대해 테스트한 후 표현형 또는 기능적 분석에 사용했다.

γδ T세포 기능 분석

신선한 PBMC(2 x 106)는 24웰 플레이트 ± 졸레드로네이트(4μM, Sigma)에서 배양되고 BTN2A1, BTN3A1 또는 이소타입 대조군 IgG1κ(MOPC-21, BioLegend)(10㎍/ml)에 대해 정제된 mAb를 24시간 후 CD3ε+ γδTCR+ Vδ2+/- γδ T세포 활성화를 유세포 분석에 의해 평가했으며, 사이토카인 생산은 제조사 지침(manufacturer instructions:BD)에 따라 세포측정 비드 어레이(cytometric bead array)에 의해 결정되었다. 도 14의 분석의 경우, PBMC를 24웰 플레이트에서 배양하고 BTN2A1, BTN3A1 또는 이소타입 대조군(10㎍/ml)에 대한 mAb로 30분 동안 차단했다. 세포는 IL-2(25U/ml, Miltenyi) 및 Golgiplug 단백질 수송 억제제(BD Biosciences)에 더하여 (0.5 ng/ml, Sigma) HMBPP (0.5 ng/ml, Sigma), 졸레드로네이트(4μM, Sigma), 및 CEF(1μg/ml, Miltenyi)의 조합으로 18시간 동안 자극되었다. 세포를 표면 염색한 다음 제조업체의 프로토콜에 따라 Foxp3/전사 인자 염색 완충제 세트(Invitrogen)를 사용하여 고정하고 투과시킨 다음 항-IFN-γ(Biolegend)로 염색했다. 공동 배양 분석의 경우, 정제되고 시험관 내 확장된 γδ T세포(5x10⁵)를 APC(3 x 10⁵)와 함께 96웰 플레이트에서 24시간 ± 졸레드로네이트(4μM) 동안 배양하고, γδ T세포 활성화를 위와 같이 유세포 분석에 의해 결정했다. 대안적으로(도 3C에서), 4x10⁴ PBMC 공여자로부터 γδ T세포 자기 비드 분리 키트(Miltenyi)를 사용하여 정제된 1차 γδ T세포를 1μM 졸레드로네이트의 존재하에 LM-MEL-62 WT 또는 BTN2A1^null1 APC와 2:1 비율로 2일간 배양했다. 비부착 세포를 후속적으로 세척하고 APC가 없는 새로운 플레이트에서 배지 플러스 100U/ml IL-2에서 추가로 7일 동안 배양하였다. 그 다음, Vδ2+ γδ T세포를 유세포 분석에 의해 계수하였다.

FRET 분석

BTN2A1과 BTN3A1 엑토도메인 사이의 FRET 검출을 위해, 세포를 PE-접합된 항-BTN3A1(공여자) 및 Alexa 647-접합된 BTN2A1(수용체)으로 염색했다. 보상된 노란색 670/30 채널에서 FRET이 감지되었다. 긴(BTN3A1 및 BTNL3에 사용됨) 또는 짧은(BTN2A1 및 BTNL8에 사용됨) 유연한 N-말단 링커(도 19B)를 포함하는 CFP(mTurquoise2, 공여자) 및 YFP(mVenus, 수용체) 구조물을 합성하고 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 도입된 프레임 내 MfeI 부위와 pMIG IRES-GFP 모티프도 제거한 3' SalI 부위 사이의 부티로필린(butyrophilin) 구조의 C-말단에 클로닝되었다. CFP는 보라색 450/50 채널에서, YFP는 노란색 585/15를 사용하여, FRET는 보라색 530/30 채널을 사용하여 감지되었으며 CFP 및 YFP 유출이 보상에 의해 제거되었다. 이중 형질감염체(dual tranfectants)의 경우 게이트 CFP+YFP+ NIH-3T3 세포 및 단일 형질감염체(single transfectants)의 경우 CFP+ 또는 YFP+에서 FRET+로 확인된 세포의 빈도를 조사했다.

종양 생존력 분석

종양(104) 세포를 RF-10의 96웰 플레이트에 플레이팅했다. 다음날 2x10⁴γδ T세포에 100U/ml IL-2(Miltenyi) ± 1μM 졸레드로네이트(Sigma)를 첨가하였다. 1~3일 인큐베이션 후, SpectroStar Nano 플레이트 판독기(BMG Labtech)에서 490nm에서 측정된 흡광도를 사용하여 MTS 분석에 의해 생존력을 평가하고 배경에 대해 보정하고 각 시점에서 APC만 포함하는 웰에 대해 정규화했다.

단일 세포 γδTCR 시퀀싱

건강한 PBMC 공여자로부터 유래된 CD3ε+ γδTCR+ Vδ2+ γδ T세포를 개별적으로 분류했다. 그런 다음 γδTCR을 보충 표 2에 나열된 프라이머로 증폭했다. 그런 다음 PCR 앰플리콘(amplicons)은 발현을 위해 γ- 또는 δ-사슬 엑토도메인(도 8C)을 포함하는 pHL-sec에 클로닝했다.

전체 게놈 CRISPR / Cas9 녹아웃 스크린

CRISPR/Cas9 녹아웃 화면은 기본적으로 J. Young et al. (2017)에 설명된 대로 수행되었다. 간단히 말해서, 유전자당 n=6 gRNA를 포함하는 풀링된 렌티바이러스 인간 gRNA 녹아웃 라이브러리(GeCKOv2, a gift from Feng Zhang, Addgene #1000000048)를 >500x 적용 범위에서 Endura™ ElectroCompetent 세포(Lucigen)로 형질전환하고 1L 액체 Luria Broth 배양액에서 37ºC에서 16시간 동안 성장시켰다. 플라스미드 DNA를 정제하고(PureLink™ gigaprep, ThermoFisher) 사전 및 사후 증폭 라이브러리의 gRNA 풍부도를 <0.2% gRNA 드롭아웃(dropout)으로 PCR 증폭 라이브러리(Illumina HiSeq, 샘플당 60 x 10⁶ reads)의 시퀀싱으로 검증했다. 렌티바이러스(Lentiviral particles) 입자는 FuGENE®(Promega)를 사용하여 gRNA 라이브러리 DNA와 패키징 플라스미드로 HEK-293T 세포의 일시적 형질감염에 의해 생성되었고, 배양 상청액을 LM-MEL-62 세포에서 적정하여 퓨로마이신(puromycin)(1μg/ml, ThermoFisher)을 사용하여 바이러스 역가를 결정했다. LM-MEL-62 세포의 4가지 생물학적 복제물(각각 2 x 10⁸)은 ~0.3의 감염 다중도에서 렌티바이러스 라이브러리로 형질도입되었다. 그런 다음 형질도입된 세포를 추가 5일 동안 퓨로마이신으로 선택하고, 그 후 Vγ9Vδ2+ γδTCR 테트라머 #6low 세포를 각 복제의 절반(~6 x 10⁷)에서 분류했으며. 나머지 절반은 정렬되지 않은 대조군으로 사용되었다. 분류된 세포를 ~2주 동안 다시 확장한 후 다시 분류했다. 이것은 LM-MEL-62 세포의 명확한 Vγ9Vδ2+ γδTCR 테트라머 #6low 집단을 적절하게 풍부하게 하기 위해 추가로 2회 반복되었다(도 9A). 추가 페놀-클로로포름 정제 단계를 포함하는, 이전에 설명된 S. Chen et al. (2015)대로 게놈 DNA를 추출했다. 분류되지 않은 ~6x10⁷ 및 분류된 ~3x10⁷세포의 gRNA는 Pfu 기반 DNA 중합효소(Herculase II Fusion, Agilent Technologies)와 이전에 설명된(J. Young et al (2017) 대로 인덱스(index) 및 어댑터(adaptor) 서열(IDT 울트라머 올리고스(IDT Ultramer oligos))을 포함하는 1단계 프라이머를 사용하여 PCR(33 주기)을 사용하여 게놈 DNA에서 증폭되었습니다. 전기영동(Wizard® SV Gel Clean-Up System, Promega) 후 앰플리콘은 겔 추출되고 PicoGreen®(ThermoFisher)으로 정량화되고 NovaSeq(Illumina)를 사용하여 시퀀싱되었다. 샘플 데이터는 Cutadapt(M. Martin et al(2011))를 사용하여 정방향 프라이머 스태거 모티프(stagger motifs)와 역 8-mer 바코드(reverse 8-mer barcodes)의 조합을 사용하여 역다중화(demultiplex)되었고 R 스튜디오에서 EdgeR 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석되었다(MD Robinson et al.(2010)). 단일 염기 쌍 불일치 또는 이동된 가이드 위치(shifted guide position)를 허용하는 processAmplicons 기능을 사용하여 가이드를 열거했다. 최소 5개 샘플에서 0.5개/10⁶개 미만의 가이드는 분석에서 제외되었다. 분산 추정 후, 분류되지 않은 샘플 및 분류된 샘플 간의 차등 gRNA 발현은 exactTest 기능을 사용하여 결정되었으며, 여기서 <0.05의 거짓 발견률(false discovery rate:FDR)은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

가용성 단백질의 생산

가용성 인간 γδTCR, 부티로필린 2A1 및 마우스 CD1d 엑토도메인은 pHL-sec 벡터 DNA 인코딩 구성물과 함께, 각각 ExpiFectamine 또는 PEI를 사용하여 포유류 Expi293F 또는 GNTI-결함 HEK-293S 세포의 일시적 형질감염에 의해 발현된다. MR1-5-OP-RU 테트라머는 이전에 설명한 대로 생성되었다(H.F. Koay et al.(2019)). 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography:IMAC) 및 겔 여과를 사용하여 배양 상등액으로부터 단백질을 정제하고 BirA(사내 생산)를 사용하여 효소적으로 비오틴화하였다. 단백질을 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)로 재정제하고 -80ºC에서 보관했다. 비오틴화된 단백질을 4:1 몰비로 스트렙타비딘-PE(BD)로 테트라머화하였다. C-말단 His6 태그가 있는 부티로필린 B30.2 세포내 도메인을 엔코딩하는 DNA 구조물을 새로 합성하고(ThermoFisher) pET-30 박테리아 발현 벡터에 클로닝했다. BL21 DE3(pLysS) E. coli는 IPTG(1mM)로 유도한 후 30ºC에서 하룻밤 발현에 사용되었다. 세포 펠렛을 세척하고 PBS/1mM DTT에서 초음파 분쇄기를 사용하여 용해시키고 B30.2 단백질을 IMAC 및 겔 여과를 사용하여 정화된 용해물로부터 정제하였다.

항- BTN2A1 모노클로날 항체의 생성

인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 BTN2A1에 대한 특이성을 갖는 항체 클론을 스크리닝했다. 스크리닝은 스트렙타비딘 코팅 상자성 비드(Dynal)에 고정된 50nM 재조합 가용성 C-말단 His 태그가 붙은 BTN2A1 엑토도메인에 대한 결합을 위한 3회의 선택으로 이루어졌으며, 스트렙타비딘 코팅된 비드에 고정된 관련 없는 대조군 His 태그가 붙은 단백질에 비특이적 결합제가 사전 흡착되었다. 대대적인 세탁 후, 결합된 파지를 용출시키고 기하급수적으로 성장하는 박테리아 배양물(TG1; Stratagene)의 감염에 의해 밤새 증폭시켰다. 정제된 파지는 이후 패닝 라운드에 사용되었다. 3라운드 후, 결합된 파지를 용출시키고 190개의 클론을 무작위로 선택하고 마이크로플레이트에 고정된 BTN2A1에 대한 결합에 대해 ELISA에 의해 시험하였다. 양성 클론을 시퀀싱한 결과 총 52개의 개별 항체 클론이 나타났으며, 그 중 45개는 Expi293F™ 세포(ThermoFisher)에서의 발현 및 MabSelect SuRe 수지(GE Lifesciences)에서 인간 IgG4 Fab 영역 및 뮤린 IgG2a Fc 영역을 포함하는 전장 IgG 분자에서의 정제를 위해 포유동물 발현 벡터에 서브클로닝되었다. 이소타입 대조군 클론 BM4는 관련이 없는 특이성을 갖는 마우스 Fab 영역을 제외하고는 동일한 Fc 영역을 함유하였다.

단일-세포 PCR 라운드 1	서열번호 9	TRDV2_External	TGGGCAGGAGTCATGTCAG
	서열번호 10	TRDC_Rev1	GCAGGATCAAACTCTGTTATCTTC
	서열번호 11	TRGV9_External	GGCTCTGTGTGTATATGGTGC
	서열번호 12	TRGC_Rev1	CTGACGATACATCTGTGTTCTTTG
단일-세포 PCR 라운드 2	서열번호 13	TRDV2_Fwd_soluble	ATACCGGTGCCATTGAGTTGGTGCCT
	서열번호 14	TRDC_Rev_soluble	TGTTCCGGATATCCTTGGGGTAGAATTCCTTCA
	서열번호 15	TRDV9_Fwd_soluble	ATACCGGTGCAGGTCACCTAGAGCAAC
	서열번호 16	TRDC_Rev_soluble	CAGCAATTGAAGGAAGAAAAATAGTGGGCTTG
부위-지향적 돌연변이 유발 (Site-directed mutagenesis)	서열번호 17	E28Aδ_Fwd	ATGAAGGGCGcAGCCATCGGC
	서열번호 18	E28Aδ_Rev	GCTACACCGCAGTGTGGC
	서열번호 19	R51Aδ_Fwd	CTTCATCTACgcAGAGAAGGACATCTACGG
	서열번호 20	R51Aδ_Rev	GTCATGGTGTTGCCCTGG
	서열번호 21	L97Aδ_Fwd	CTGTGACACAgcTGGAATGGGCGGCGAG
	서열번호 22	L97Aδ_Rev	GCGCAGTAGTAGCTGCCC
	서열번호 23	E5Aγ_Fwd	GGACATCTGGcACAGCCCCAG
	서열번호 24	E5Aγ_Rev	AGCGCCATACACACACAG
	서열번호 25	R20Aγ_Fwd	CAAGACCGCCgcACTGGAATGC
	서열번호 26	R20Aγ_Rev	CTCAGTGTCTTGGTGCTG
	서열번호 27	E22Aγ_Fwd	GCCAGACTGGcATGCGTGGTG
	서열번호 28	E22Aγ_Rev	GGTCTTGCTCAGTGTCTTGG
	서열번호 29	T29Aγ_Fwd	GTCCGGCATCgCAATCAGCGC
	서열번호 30	T29Aγ_Rev	ACCACGCATTCCAGTCTGG
	서열번호 31	Y54Aγ_Fwd	GTCCATCAGCgcCGATGGCACC
	서열번호 32	Y54Aγ_Rev	ACCAGGAACTGGATCACTTC
	서열번호 33	T57Aγ_Fwd	CTACGATGGCgCCGTGCGGAA
	서열번호 34	T57Aγ_Rev	CTGATGGACACCAGGAACTGG
	서열번호 35	K60Aγ_Fwd	CACCGTGCGGgcAGAGAGCGGC
	서열번호 36	K60Aγ_Rev	CCATCGTAGCTGATGGACAC
	서열번호 37	S62Aγ_Fwd	GCGGAAAGAGgcCGGCATCCCTTC
	서열번호 38	S62Aγ_Rev	ACGGTGCCATCGTAGCTG
	서열번호 39	S66Aγ_Fwd	CGGCATCCCTgCTGGCAAGTT
	서열번호 40	S66Aγ_Rev	CTCTCTTTCCGCACGGTG
	서열번호 41	E70Aγ_Fwd	GGCAAGTTCGcGGTGGACAGAATC
	서열번호 42	E70Aγ_Rev	AGAAGGGATGCCGCTCTC
	서열번호 43	E76Aγ_Fwd	AGAATCCCCGcGACAAGCACC
	서열번호 44	E76Aγ_Rev	GTCCACCTCGAACTTGCC
	서열번호 45	H85Aγ_Fwd	ACTGACCATCgcCAACGTGGAAAAGCAG
	서열번호 46	H85Aγ_Rev	GTGCTGGTGCTTGTCTCG
	서열번호 47	N86Aγ_Fwd	GACCATCCACgcCGTGGAAAAGCAG
	서열번호 48	N86Aγ_Rev	AGTGTGCTGGTGCTTGTC
	서열번호 49	E88Aγ_Fwd	CACAACGTGGcAAAGCAGGATATC
	서열번호 50	E88Aγ_Rev	GATGGTCAGTGTGCTGGT
	서열번호 51	Q90Aγ_Fwd	CGTGGAAAAGgcGGATATCGCC
	서열번호 52	Q90Aγ_Rev	TTGTGGATGGTCAGTGTG
	서열번호 53	K108Aγ_Fwd	AGAGCTGGGCgcGAAAATCAAGGTGTTCG
	서열번호 54	K108Aγ_Rev	TGTTGGGCTTCCCACAGG
CRISPR / Cas9	서열번호 55	CRISPR 2 top	TCACAAAGGTGGTTCTTCCT
	서열번호 56	CRISPR 2 bottom	AGGAAGAACCACCTTTGTGACGGTG
	서열번호 57	CRISPR 4 top	CAATAGATGCATACGGCAAT
	서열번호 58	CRISPR 4 bottom	ATTGCCGTATGCATCTATTGCGGTG
	서열번호 59	sc-404202 A	GGCACTTACGAGATGCATAC
	서열번호 60	sc-404202 B	GAGAGACATTCAGCCTATAA
	서열번호 61	sc-404202 C	ACCATCAGAAGTTCCCTCCT
	서열번호 62	2A1 CRISPR1 MiSeqF	GTGACCTATGAACTCAGGAGTCCTTGAGTGACGGGAGAGGTT
	서열번호 63	2A1 CRISPR1 MiSeqR	CTGAGACTTGCACATCGCAGCTCCTTTTGGACAGTGCTGGT
	서열번호 64	2A1 CRISPR2 MiSeqF	GTGACCTATGAACTCAGGAGTCCCTTTGTTGAACAGCCCAGT
	서열번호 65	2A1 CRISPR2 MiSeqR	CTGAGACTTGCACATCGCAGCTAGGACCTGCCTTCTTGGAA
	서열번호 66	2A1 CRISPR3 MiSeqF	GTGACCTATGAACTCAGGAGTCCCGAGAAAAATGCTGAGGAC
	서열번호 67	2A1 CRISPR3 MiSeqR	CTGAGACTTGCACATCGCAGCAATGGGCCTGAGGTTAGGAG
	서열번호 68	2A1 CRISPR4 MiSeqF	GTGACCTATGAACTCAGGAGTCAGAAAGCAGGAGAGCAGGTG
	서열번호 69	2A1 CRISPR4 MiSeqR	CTGAGACTTGCACATCGCAGCTTGCACACGTTCTTTCTCCA

항- BTN3A 항체의 생산

항-BTN3A 항체 가변 도메인(클론 20.1 및 103.2, Palakodeti et al.(2012)에 설명됨)을 엔코딩하는 DNA 구조물을 합성하고(ThermoFisher) 마우스 IGHV 신호 펩티드 및 IgG1 불변 영역을 포함하는 포유동물 발현 벡터에 클로닝했다. 항체를 상기와 같이 Expi293F™ 세포에서 발현시키고 Protein G 컬럼 크로마토그래피 60(GE)을 사용하여 정제한 후 PBS로 완충액 교환하였다.

효소 면역 분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay)

정제된 재조합 단백질(0.2-20μg/ml)을 4ºC에서 밤새 PBS 버퍼의 마이크로플레이트 웰에 고정했다. 그런 다음 비특이적 결합은 0.05% 트윈(tween) 20 플러스(plus) 5% 탈지분유(skim milk powder) 또는 0.5%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 PBS에서의 배양에 의해 차단되었다. 그런 다음 웰을 PBS/0.05% 트윈-20/2% 탈지분유 또는 0.5% BSA에서 2-5μg/mL의 항체 존재 하에 실온에서 60분 동안 인큐베이션한 다음 PBS/0.05% 트윈-20으로 세척했다.

그런 다음 플레이트를 HRP 표지된 양 항-마우스 IgG 이차 항체(Chemicon) 또는 염소 항-마우스 IgG 이차 항체(Millipore)와 함께 배양한 다음 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 기질(tetramethylbenzidine substrate)(Sigma) 및 흡광도는 플레이트 판독기를 사용하여 450nm에서 측정되었다.

CRISPR / Cas9 매개 녹아웃 세포주의 생성

BTN2A1 녹아웃 라인의 경우, 2개의 gRNA BTN2A1^null1: 5'-TCACAAAGGTGGTTCTTCCT-3'(서열번호 55) 및 BTN2A1^null2: 5'-CAATAGATGCATACGGCAAT-3')(서열번호 57)을 제조업체의 프로토콜에 따라 GeneArt® CRISPR Nuclease Vector Kit(Life Technologies)에 클로닝하고 Sanger 시퀀싱으로 서열을 확인했다. 세포를 Lipofectamine 2000을 사용하여 형질감염시키고 48시간 후 주황색 형광 단백질 발현을 기준으로 분류했다. 세포를 배양하고 항-BTN2A1(클론 Hu34C)로 염색하고 음성 분획을 분류하였다. BTN3A1 녹아웃 라인의 경우, 3개의 특정 gRNA 서열(5-GGCACTTACGAGATGCATAC-3'(서열번호 59), 5'-GAGAGACATTCAGCCTATAA-3'(서열번호 60), 5'-ACCATCAGAAGTTCCCTCCT-3'(서열번호 61))을 함유하는 BTN3A1 CRISPR/Cas9 KO 플라스미드 키트(Santa Cruz Biotechnology)가 사용되었다. 세포를 Lipofectamine 3000(ThermoFisher)을 사용하여 형질감염시키고 48시간 후에 녹색 형광 단백질을 기준으로 분류했다. 분류된 세포를 배양하고 항-BTN3A1(클론 103.2)으로 염색하고 음성 분획을 분류하고 배양하였다.

Jurkat 분석

96웰 플레이트에 2.5x10⁴ 세포/웰의 LM-MEL-62 또는 LM-MEL-75 APC를 넣고 밤새 배양했다. 그런 다음 2x104 G115 돌연변이 γδTCR-발현 J.RT3-T3.5(ATCC® TIB-153™)(Jurkat)세포 ± 졸레드로네이트, HMBPP 또는 IPP를 20시간 동안 첨가했다. 그런 다음 CD69 발현을 GFP+ Jurkat 세포에서 유세포 분석에 의해 측정했다. 각각 Vγ9Vδ2+ G115 TCR의 Vγ9 또는 Vδ2 도메인 내에 있는 19개의 단일-잔기 알라닌(Ala) 돌연변이의 패널은 표 2에 나열된 프라이머를 사용하여 부위 지정 돌연변이유발에 의해 생성되었다. 프라이머(IDT)를 인산화(PNK, NEB)한 후 pMIG의 WT G115를 주형으로 사용하여 KAPA HiFi 마스터 믹스(KAPA Biosystems)를 사용하여 25주기의 PCR을 수행했고, PCR 생성물을 DpnI(NEB)로 분해하고 T4 DNA 리가제(NEB)로 연결했다. 그 다음, 형질감염 전에 Sanger 시퀀싱에 의해 구조물 서열을 확인하였다. BTN2A1 테트라머에 결합하는 G115 TCR 돌연변이체의 능력을 조사하기 위해, HEK-293T 세포를 1:3 비율로 개별 γ-사슬 또는 δ-사슬 돌연변이체, 및 각각 상응하는 WT δ- 또는 γ-사슬, 뿐만 아니라 OptiMEM™(Gibco, Thermo-Fisher)에서 FuGENE® HD(Promega)와 1:3 비율로 2A-연결된 인간 CD3γδεζ를 엔코딩하는 pMIG 구조물을 형질감염 시켰다. 형질감염 48시간 후, HEK293T 세포를 피펫팅으로 재현탁시키고 CD3ε 발현 및 PE 표지된 BTN2A1 사량체 또는 대조군 PE-접합된 스트렙타비딘에 대해 염색하였다. 돌연변이 G115 TCR과 상호작용하는 BTN2A1 사량체의 중앙 형광 강도(MFI)는 유세포 분석에 의해 게이트된 CD3+GFP+ HEK293T 세포에서 조사되었다.

pAg 자극에 반응하는 G115 돌연변이체의 능력은 J.RT3-T3.5 Jurkat 세포를 G115 돌연변이체 TCR로 형질도입함으로써 평가하였다. HEK-293T 세포는 인간 CD3, pVSV(-G) 및 pEQ-Pam3(-E), OptiMEM™에서 FuGENE® HD와 1:3 비율로 혼합한 것과 함께 각각의 특정 γ-사슬 또는 δ-사슬 돌연변이와 상응하는 야생형 δ- 또는 γ-사슬로 형질감염되었다. 24시간 후, 바이러스 상층액을 수집하고 0.45μm CA 주사기 필터를 통해 여과한 다음 JRT3-T3.5 Jurakt 세포와 12시간 동안 인큐베이션했다. 이 과정을 4일 동안 하루에 두 번 반복했다. CD3+GFP+ Jurkat 세포를 FACS(BD FACSAria™ III)로 정제하고 위에서 설명한 대로 야생형 LM-MEL-75 APC에 의해 제시된 pAg에 반응하는 능력을 조사했다.

항-BTN3A1(클론 20.1) mAb에 대한 G115 γδTCR-발현 Jurkat 세포 반응성을 측정하기 위해, 2.5x10⁴LM-MEL-75 APC 세포를 기능 등급 20.1(10μg/ml, Biolegend) 또는 상온에서 30분 동안 일치하는 이소타입 대조군과 함께 사전 배양한 후 평평한 바닥 96 웰 플레이트에 플레이팅했다. APC가 부착되면 최종 항체 농도가 5μg/ml가 되도록 2.5×10⁴Jurkat 세포를 추가했다. 24시간 공동배양 후 CD3+GFP+ Jurkat 세포에서 CD69의 수준을 유세포 분석에 의해 결정했다.

표면 플라즈몬 공명(Surface plasmon resonance)

SPR 실험은 10mM HEPES-HCl(pH 7.4), 300mM NaCl 및 0.005% Tween-20 완충액을 사용하여 Proteon XPR36 기기(Bio-Rad)에서 25°C에서 수행되었다. γδTCR 엑토도메인은 스트렙타비딘으로 사전 고정된 Biacore 센서 칩 SA의 260 공명 단위(RU)에 직접 고정되었다. 가용성 부티로필린을 연속 희석(200-3.1μM)하고 30μl/min의 속도로 테스트 및 대조군 표면에 동시에 주입했다. 컨트롤 플로우 셀(스트렙타비딘 단독) 및 블랭크 주입에서 데이터를 뺀 후 Biacore T200 평가 소프트웨어(GE Healthcare) 및 Prism 버전 8(GraphPad)을 사용하여 상호 작용을 분석하고 평형에서 평형 해리 상수(KD)를 유도했다.

등온 적정 열량계(Isothermal titration calorimetry)

ITC 실험은 25°C에서 MicroCal ITC200 기기(GE Healthcare)에서 수행되었다. BTN2A1 또는 BTN3A1 B30.2 도메인을 PBS로 완충액 교환하고 최종 농도를 100μM로 조정하였다. HMBPP(Cayman Chemical) 또는 IPP를 2mM의 최종 농도로 조정하고 분석에서 폐기된 초기 0.4μl 주입 후 2μl 증분(increments)으로 세포에 연속 주입했다. 데이터는 Microcal Origin 소프트웨어로 분석되었다.

공초점 현미경(Confocal microscopy)

LM-MEL-75 WT, BTN2A1^null, BTN3A1^null 세포는 10%(v/v) FCS(JRH Biosciences), 페니실린(penicillin)(100U/ml), 스트렙토마이신(streptomycin)(100㎍/ml), 글루타맥스(Glutamax)(2mM), 피루브산나트륨(sodium pyruvate)(1mM), 비필수 아미노산(nonessential amino acids)(0.1mM) 및 HEPES 완충액(15mM), pH7.2-7.5(모두 Invitrogen Life Technologies) 플러스 50μM 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol)(Sigma-Aldrich), 및 챔버 웰 슬라이드(Lab-Tek, Thermo-Fisher)에 부착할 수 있는 보충된 RPMI-1640(Thermo-Fisher)에서 밤새 배양되었다. 다음날 세포를 세척하고 OptiMEM™(Thermo-Fisher)으로 희석된 인간 Fc 수용체 블록(Miltenyi Biotec)과 함께 얼음에서 20분 동안 인큐베이션했습니다. 세포를 세척하고 얼음 위의 OptiMEM™에 20분 동안 희석한 항-BTN2A1-AF647(클론 259), 항-BTN3A-PE(클론 103.2) 및 항-pan-HLA 클래스 I-AF488(클론 W6/32, BioLegend)으로 염색했다. 세포를 PBS에서 20분 동안 1% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)(Electron Microscopy Sciences)로 고정한 다음 ProLong Gold AntiFade(Thermo-Fisher)로 장착하고 #1 커버슬립(Menzel-Glaser)으로 밤새 덮었다. 각 시약을 적정하여 최적의 희석 인자를 결정했다. 76.9nm 측면 및 400nm 축 복셀 크기 및 1024x1024 복셀 밀도를 갖는 Z 스택 단일 타일 이미지는 반전된 20x(0.8NA) 대물렌즈 및 Zen 소프트웨어(Zeiss)가 있는 LSM780 레이저 스캐닝 공초점 현미경에서 획득했다. 형광색소는 488, 561 및 633nm 레이저 라인으로 여기되었다(excited). 이미지는 Huygens Professional(Scientific Volume Imaging)로 디컨볼루션되었고 Imaris(Oxford Instruments) 소프트웨어로 분석되었다. 이미지화된 세포를 정의하는 관심 영역은 명시야 채널을 기반으로 만들어졌으며 Imaris Coloc 모듈은 각 얼룩에 대한 음성 대조군을 기반으로 분석된 각 채널에 대해 설정된 강도 임계값으로 복셀의 Pearson 상관 계수를 계산하는 데 사용되었다.

BTN2A1은 Vγ9 + γδTCR에 대한 리간드이다.

Vγ9Vδ2+ γδ TCR에 대한 후보 리간드를 확인하기 위해, 본 발명자들은 pAg-반응성 γδ T세포로부터 유래된 가용성 Vγ9Vδ2+ TCR 테트라머를 생성하였고(도 8), 인간 세포주의 다양한 패널을 염색하는 데 사용했다. 이것은 HEK-293T를 포함하는 일부 계통의 명확한 염색을 나타내었지만 B 세포라인 C1R을 포함하는 다른 계통은 그렇지 않았다(도 1A). 특히, 흑색종(melanoma) 세포 라인 LM-MEL-62는 강하게 염색되었다(A. Behran et al.(2013))(도 1A). 전체 게놈 녹다운 스크린(도 9)을 사용하여 Vγ9Vδ2+ TCR-테트라머 반응성을 담당하는 가장 중요한 가이드 RNA(gRNA)는 BTN2A1이었고 대조군과 비교하여 >13배 농축되었다(도 1A 및 도 9). BTN2A1은 부티로필린 계열의 특성이 잘 나타나지 않는 구성원으로 인간에서는 발견되지만 생쥐에서는 발견되지 않는다. BTN3A1과 마찬가지로 2개의 세포외 도메인(IgV 및 IgC)과 세포내 B30.2 도메인으로 구성된다. 글리코실화 의존적 방식으로 C-타입 렉틴 수용체(C-type lectin receptor) CD209(DC-SIGN)와 상호작용할 수 있다는 한 연구와는 별도로(G. Malcherek et al(2007), BTN2A1은 일반적으로 고아 수용체(orphan receptor)로 간주된다. 이 발견의 의미를 더 조사하기 위해, 본 발명자들은 2개의 독립적인 LM-MEL-62 BTN2A1 돌연변이주(BTN2A1^null1 및 BTN2A1^null2)에서 Vγ9Vδ2+ TCR 테트라머에 대한 반응성의 손실을 확인했으며, 별개의 LM-MEL-75 BTN2A1 돌연변이 세포 라인에서도 유사한 결과를 얻었다(도 1C 및 도 10). 이것은 부모 LM-MEL-62와 BTN2A1^null 계통 사이에서 본질적으로 변하지 않는 BTN3A1 발현과 무관했다(도 1C 및 도 10A). 대안적으로, BTN3A1^null 계통의 Vγ9Vδ2 TCR 테트라머 반응성은 모계 라인과 유사하였다(도 10B). LM-MEL-62 BTN2A1^null1 또는 BTN2A1^null2 세포에 BTN2A1을 재도입하면 Vγ9Vδ2 TCR 테트라머 반응성이 회복되었지만 BTN3A1을 사용한 형질감염은 효과가 없었다(도 1D). 따라서, BTN2A1 발현은 Vγ9Vδ2+ TCR 사량체 반응성에 필수적이다.

다음으로, 본 발명자들은 BTN2A2(87% 엑토도메인 상동성)에 대해 다양한 정도의 교차 반응성을 나타내지만 BTN3A2(45% 엑토도메인 상동성)에 대해서는 그렇지 않은 BTN2A1-반응성 mAb의 패널을 생성하였다(도 11A-C). 이러한 mAb는 모체 LM-MEL-62를 염색했지만 대부분은 LM-MEL-62 BTN2A1^null 라인에 결합하는 데 실패하여 BTN2A1에 대한 반응성을 확인했다(도 11D-E). 대부분의 항-BTN2A1 클론은 LM-MEL-62, LM-MEL-75 및 293T 세포에서 Vγ9Vδ2 TCR 테트라머 염색을 차단하거나 부분적으로 차단했으며(도 1E), 이는 BTN2A1이 Vγ9Vδ2+ γδTCR에 대한 리간드임을 시사한다. BTN2A1이 Vγ9Vδ2+ γδ T세포에 선택적으로 결합하는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 형광성 BTN2A1 엑토도메인 테트라머(도 12)를 생산했는데, 이는 PMBC 내에서 CD3+ T세포의 서브세트를 염색하지만 다른 세포 유형은 염색하지 않았다(도 2A). BTN2A1 테트라머+ 세포는 γδTCR+였지만 αβTCR+는 아니었다(도 2A). BTN2A1 테트라머는 본질적으로 모든 Vγ9+Vδ2+ 및 Vγ9+Vδ1+ γδ T세포를 표지했지만 Vγ9-Vδ1+ γδ T세포는 표지하지 않았으며, 이는 TCR γ-사슬의 Vγ9 도메인이 반응성과 연관되어 있음을 시사한다(도 2B). 또한, 형광 BTN2A1 테트라머와 항-CD3ε mAb(P. Batard et al(2002)) 사이의 Forster 공명 에너지 전달(Forster resonance energy transfer:FRET)은 BTN2A1 사량체가 γδTCR에서 ~10nm 내에서 결합하고 있음을 나타낸다(도 2C). BTN2A1이 Vγ9+ γδTCR에 결합하는지 여부를 직접 평가하기 위해, 본 발명자들은 가용성 BTN2A1과 γδTCR 엑토도메인 사이의 상호작용을 측정하기 위해 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 수행하였다. 1차 γδ T세포 사이의 BTN2A1 테트라머 반응성 패턴과 일치하여, KD=40μM의 친화도를 갖는 가용성 BTN2A1 TCR #6(Vγ9Vδ2+)은 기존 αβ T세포에서 관찰되는 것과 유사하다(ME Birnbaum et al(2014)). 또한 유사한 친화도(50μM)로 관련 없는 Vδ1+ γ-사슬과 쌍을 이루는 TCR #6 γ-사슬을 공동 발현하는 "하이브리드(hybrid)" γδTCR에 결합했다. 그러나, BTN2A1은 Vδ1+ δ-사슬과 쌍을 이루는 Vγ5+ γ-사슬로 구성된 γδTCR에 결합하지 않았다(도 2D). 마지막으로, 본 발명자들은 다른 부티로필린 계열 구성원이 Vγ9Vδ2 TCR에 결합할 수 있는지 여부를 테스트했다. BTN2A2는 매우 약한 결합만을 나타내었고, BTN3A1+BTN3A2 및 BTNL3+BTNL8 형질감염된 세포는 Vγ9Vδ2 TCR 테트라머에 결합하지 않았다(도 13). 따라서, BTN2A1은 Vγ9+ γδTCR에 대한 리간드이다.

BTN2A1은 pAg에 대한 γδ T세포 반응에 중요하다.

다음으로 본 발명자들은 BTN2A1이 pAg-매개 γδ T 세포 반응에서 중요한지 여부를 결정하였다. 예상대로, pAg IPP(A.J. Roelofs et al. (2009))의 축적을 유도하는 아미노비스포스포네이트(aminobisphosphonate) 화합물 졸레드로네이트와 함께 배양된 PBMC는 Vδ2+를 초래했지만 Vδ1+ γδ T세포는 CD25의 유도, 표면 CD3의 하향조절(도 3A), 및 IFN-γ 및 TNF 생산(도 3B)을 유도하지 않았다. TCR-의존적 활성화의 이러한 지표는 항-BTN2A1 mAb 클론 Hu34에 의해, 그리고 이소타입 대조군 mAb-처리된 샘플과 비교하여 클론 259 및 267에 의해 상당히 억제되었다. 다음으로, 정제된 시험관 내 사전 확장된 Vγ9Vδ2+ T세포를 APC로서 모 또는 BTN2A1^null LM-MEL-62 세포와 함께 배양하였다. CD25 상향 조절 및 CD3 하향 조절 측면에서 졸레드로네이트에 대한 강력한 Vδ2+ T세포 반응이 부모 LM-MEL-62 APC의 존재 하에 관찰되었다. 그러나, BTN2A1^null1 및 BTN2A1^null2 APC는 모두 APC가 없는 대조군 배양물보다 γδ T세포 활성화를 촉진하지 못했다(도 3C). 유사하게, Vδ2+ γδ 세포의 증식 확장은 BTN2A1^null1 APC가 사용되었을 때 감소되었다(도 3D). 본 발명자들은 또한 BTN2A1^null1 세포에서 관찰되지 않은 모체 LM-MEL-62 종양 세포의 γδ T세포 매개, 졸레드로네이트 의존적 사멸을 관찰하였으며, 이는 BTN2A1이 종양 표적의 Vγ9Vδ2+ T세포 세포독성에 중요함을 시사한다(도 3D). 이러한 데이터는 BTN2A1이 내인성 형태의 pAg에 대한 γδ T세포 반응에 중요함을 나타낸다.

Vγ9Vδ2+ γδ T세포는 APC의 부재 하에 미생물 HMBPP와 같은 높은 친화력의 외래 형태의 pAg를 자가 제시할 수 있다(C.T. Morita et al.(1995)). BTN2A1은 또한 정제된 시험관 내 사전 확장된 Vδ2+ T세포가 CD25를 상향 조절하지 못하고 중화 항-BTN2A1 mAb(클론 Hu34C, 227, 236 및 266)의 존재 하에 IFN-γ를 생성하지 못하기 때문에 이 설정에서 필수 불가결했다(도 3E). 클론 267은 HMBPP-유도 활성화의 부분적 억제제일 뿐이다(도 3E). 중요한 것은, 이들 mAb는 항-CD3와 항-CD28-매개 활성화를 억제하지 않았고(도 3E) 거대 세포 바이러스, 엡스타인-바 바이러스 및 인플루엔자 에피토프에서 유래한 바이러스 펩티드의 혼합물에 의해 매개된 1차 CD8+ αβ T세포 활성화를 차단하지 않았다("CEF" 펩티드, 도 14). 따라서, 이들 BTN2A1 mAb는 pAg-유도 T 세포 면역의 자가 및 외래 형태 모두의 특이적 길항제이다. 종합하면, BTN2A1은 인간 Vγ9Vδ2+ γδ T세포에 의한 pAg 매개 사이토카인 생산, 활성화, 증식 및 종양 세포독성에서 중요한 역할을 한다.

BTN2A1은 BTN3A1과 협력하여 γδ T세포에 의한 pAg 반응을 유도한다.

다음으로 본 발명자들은 BTN2A1-의존성 pAg 반응이 γδTCR 신호전달을 통해 특이적으로 매개되는지 여부를 결정하였다. 모체 LM-MEL-75 또는 LM-MEL-62 APC와의 공동 배양 후, 원형 "G115" Vγ9Vδ2+ TCR 클론타입(T.J. Allison et al. (2001))을 발현하는 J.RT3-T3.5(Jurkat) T세포는 졸레드로네이트에 대한 반응으로 CD69를 상향 조절했고; 그러나, BTN2A1^null 및 BTN3A1^null APC는 pAg 반응성을 유도하는 데 크게 실패했다(도 4A). 형질도입되지 않은(부모) Jurkat 세포 또는 관련 없는 γδTCR을 발현하는 세포(클론 9C2; A.P. Uldrich et al.(2013))도 pAg에 반응하지 못했다. 유사한 결과가 HMBPP 및 IPP를 사용하여 얻어졌으며(도 15A-C), 이는 BTN2A1 및 BTN3A1이 모두 Vγ9Vδ2+ γδTCR-의존적 방식으로 pAg 반응을 특이적으로 매개하는 데 필요함을 나타낸다. BTN3A1은 pAg 매개 반응에 필수적이지만, orced BTN3A1 과발현은 pAg 구동 γδ T 세포 자극 능력을 햄스터 및 마우스 APC에 부여하지 못하여 다른 요인에 대한 요구 사항을 나타낸다(A. Sandstrom et al.(2014); F. Riano et al.(2014)). 본 발명자들은 BTN2A1 및 BTN3A1이 조합되어 형질감염된 햄스터 및 마우스 APC 둘 모두가 γδ T세포의 pAg 의존적 활성화가 가능함을 발견하였다(도 4B 및 도 16A-B). 다른 부티로필린 분자인 BTN3A2는 이 반응에 필요하지 않았지만, BTN2A1 및 BTN3A1과 결합할 때 γδ T세포의 활성화를 적당히 향상시켰으며, 이는 BTN3A1 활성을 증가시키는 잠재적인 역할과 일치한다(P. Vantourout et al.(2018)). BTN2A1ΔB30으로 명명된 마우스 쌍을 이루는 면역글로불린 유사 유형 2 수용체 베타로부터 유래된 관련 없는 막횡단 및 세포내 도메인을 갖는 변형된 BTN2A1 구조물도 시험하였다. 이것은 여전히 세포 표면에서 발현되었고 Vγ9Vδ2+ TCR 테트라머에 결합되었지만(도 16C), pAg-제시 능력을 부여하지 않았다(도 4C). 따라서, Vγ9+ γδTCR에 결합하는 세포외 도메인의 역할 외에도, BTN2A1의 세포내 또는 막횡단 도메인은 또한 Vγ9Vδ2+ γδ T세포의 pAg 매개 활성화에 중요할 수 있다. 이것은 BTN3A1 B30.2 도메인과 pAg 사이의 명확한 상호작용과 대조적으로 등온 적정 열량계를 사용하여 이들 분자 사이의 명확한 상호작용이 검출되지 않았기 때문에(도 17) 예상대로 정제된 pAg(HMBPP 또는 IPP)에 직접 결합하는 BTN2A1의 세포내 B30.2 도메인으로 인한 것으로 보이지 않았다(A. Sandstrom et al. (2014), S. Gu et al., (2017), M. Salim et al (2017)).

마지막으로, 본 발명자들은 BTN2A1 및 BTN3A1이 동일한 세포(시스) 또는 별도의 세포(트랜스) 상에서 발현될 때 pAg-매개 활성화를 유도하는지 여부를 시험하였다. BTN3A1+ APC 또는 BTN3A1+BTN3A2+ APC와 혼합된 BTN2A1+ APC는 pAg에 대한 γδ T세포 반응을 유도하지 못했으며(도 4D), 이는 이들 분자가 γδ T세포의 pAg 유도 활성화를 매개하기 위해 동일한 APC에서 발현되어야 함을 시사한다.

BTN2A1은 세포 표면의 BTN3A 분자와 결합한다.

cis에서 BTN2A1 및 BTN3A1 공동 발현에 대한 요구 사항은 이들이 서로 연관될 가능성을 높였다. 항-BTN2A1 및 항-BTN3A1/3A2/3A3("BTN3A 분자") mAb로 염색된 모체 LM-MEL-75 세포는 세포 표면의 BTN2A1 및 BTN3A 분자에 대해 유사한 염색 패턴을 나타냈다(도 5A-C). Pearson 상관 계수는 BTN2A1과 BTN3A 분자의 염색 사이에 유의미한 중복이 나타났으며, 이는 관련 없는 대조군(HLA-A, B, C)과의 중복과 비교되었다. 따라서 BTN2A1 및 BTN3A 분자는 원형질막에서 결합된 것으로 보인다(도 5B). 또한, LM-MEL-75 세포를 항-BTN2A1(클론 259) 및 항-BTN3A(클론 103.2)와 함께 염색하면 명확한 FRET 신호(도 5C)가 나타났으며, 이는 세포 표면의 공동 국소화를 나타낸다(도 5C). 항-BTN3A(클론 20.1)를 사용한 공동 염색은 FRET를 유발하지 못했으며, 마찬가지로 일부 다른 항-BTN2A1 클론(Hu34C 및 267)은 약한 FRET만 발생시켰습니다. 이는 일부 mAb 조합이 FRET 검출을 위한 10nm 한계를 넘어 공간적으로 분리된 공여자 및 수용체 형광색을 생성하기 때문일 수 있다. 상이한 조합의 BTN 분자로 형질감염된 마우스 NIH-3T3 섬유아세포를 사용하여 유사한 결과가 유도되었다(도 18). 재미있게, 항-BTN2A1 및 항-BTN3A를 사용한 BTN2A1ΔB30+BTN3A1+ 또는 BTN2A1ΔB30+BTN3A2+ NIH-3T3 세포의 염색은 또한 명확한 FRET를 초래했다. 후자의 발견은 BTN3A2에도 B30.2 도메인이 없기 때문에 이들 분자 사이의 연관성이 B30.2 도메인과 무관함을 시사한다(도 18).

다음으로, 본 발명자들은 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein:CFP) 또는 황색 형광 단백질(yellow fluorescent protein:YFP)-접합된 부티로필린 구조물을 생성함으로써 BTN2A1 및 BTN3A1의 세포내 도메인이 또한 연관되는지 여부를 결정하였다(도 19). BTN2A1CFP+BTN3A1^YFP 또는 BTN2A1YFP+BTN3A1^CFP를 사용한 마우스 NIH-3T3 섬유아세포의 공동 형질감염은 연관되는 것으로 알려진 양성 대조군(부티로필린 유사 분자 3(butyrophilin-like molecule 3:BTNL3)^CFP+BTNL8^YFP)과 유사한 명확한 FRET 신호를 생성했다(P. Vantourout et al. (2018)). BTN3A1^CFP+BTNL8^YFP 또는 BTNL3^CFP+BTN2A1^YFP 또는 단일 형질감염 대조군에서는 FRET가 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다(도 5D 및 도 20A). 본 발명자들은 또한 pAg가 BTN2A1과 BTN3A1 사이의 FRET 신호를 변조했지만 어떠한 주요 변화도 검출하지 않았는지 여부를 시험하였고(도 20B 및 20C); 그러나, 길항제 활성을 갖는 항-BTN2A1 mAb 클론(도 3D로부터)은 모두 이들의 결합을 강력하게 파괴하였다(도 21). 따라서, BTN2A1 및 BTN3A1의 세포외 및 세포내 도메인은 모두 밀접하게 연관되어 있다.

Vγ9Vδ2 + γδTCR은 2개 이상의 리간드를 공동 인식한다.

BTN2A1이 모든 Vγ9+ γδTCR에 결합하지만 Vγ9+Vδ2+ T세포만이 pAg 반응성임을 감안할 때, 본 발명자들은 Vδ2도 상호작용에 관여한다는 가설을 세웠다. 이 가설의 결과는 Vγ9의 생식세포-엔코드된 영역 내에 위치한 BTN2A1 결합을 담당하는 Vγ9Vδ2+ γδTCR 상의 분리된 결합 도메인과 Vδ2 특이성을 통합하는 pAg 반응성을 담당하는 다른 도메인일 수 있다. Ala에 대한 Vγ9 잔기 Arg20, Glu70 및 His85(및 더 적은 정도로 Glu22)의 돌연변이는 모두 BTN2A1 사량체 반응성의 완전한 손실을 초래한 반면, Vδ2 돌연변이 중 어느 것도 이에 영향을 미치지 않았다(도 6A). 이러한 Vγ9-민감성 잔기의 측면 사슬은 서로 매우 근접해 있으며(Glu70-His85 거리 2.8

; His85-Arg20 거리 5.1

), Vγ9의 ABED 역평행 β 시트의 B, D 및 E 가닥의 외부면에 각각 위치한다. 함께 그들은 Vγ9의 프레임워크 영역 내에서 극성 트라이어드(triad)를 형성하며(도 6B), 대다수의 Vγ9+ T 세포에 결합하는 BTN2A1과 일치한다(도 2B). 따라서 BTN2A1은 δ-사슬의 원위부인 Vγ9 측면에 결합하는 것으로 보이며 일반적으로 Ag 인식과 관련된 상보성 결정 영역(CDR) 루프 부근에는 없다.

다음으로, 본 발명자들은 어떤 잔기가 pAg에 대한 기능적 반응을 매개하는데 중요한지 조사하였다. γδTCR 돌연변이로 형질도입된 Jurkat 세포는 표면에서 유사한 수준의 CD3/γδTCR 복합체를 발현하고 고정된 항-CD3 mAb에 동등하게 반응했지만(도 22), γ-chain 돌연변이의 BTN2A1-결합 트라이어드 각각에 대한 돌연변이는 또한 pAg-매개 Jurkat 세포 활성화를 폐지하였다(도 6B). 그러나, 두 개의 추가 잔기인 Vδ2로 엔코딩된 CDR2 루프의 Arg51 및 TCR γ-사슬의 CDR3 루프의 Lys108에 대한 돌연변이도 pAg 매개 활성화를 폐지했습니다(도 6C 및 (H. Wang et al (2010))). 이러한 잔기는 BTN2A1 결합에 영향을 미치지 않았으며(도 6B) 추정 BTN2A1 발자국(~30-40

분리)에 대한 TCR의 반대쪽에 위치했다. 그러나 그들은 서로 매우 근접하여(~11

)(도 6D), 잠재적으로 Vγ9Vδ2+ γδTCR에 의한 pAg 매개 활성화에 필요한 별도의 결합 계면을 나타내지만 BTN2A1 결합에는 그렇지 않았다. 이 두 번째 바인딩 인터페이스는 다음의 중요성을 설명한다: (i) 생식세포-엔코드된 잔기의 관여를 통한 Vδ2+ TCR δ-사슬, 및 (ii) 이 루프 내의 특정 잔기의 결합을 통해 pAg 반응성 γδ T세포 사이의 CDR3γ 모티프의 불변 특성.

마지막으로, 본 발명자들은 작용제 BTN3A1 mAb(클론 20.1) 매개 활성화를 테스트했는데, 이는 BTN3A1의 구조적 조절 또는 가교에 의한 pAg 매개 신호전달을 모방하는 것으로 생각된다(C. Harly et al.(2012)). 작용제 BTN3A1 mAb -펄스된(pulsed) 부모 APC가 Vγ9Vδ2 γδTCR+ Jurkat 세포 활성화를 유도했지만(도 7), 이는 BTN2A1null APC에서는 발생하지 않았으며, 이는 BTN2A1이 γδ T세포의 BTN3A1 매개 활성화에 중요함을 시사한다. 또한, BTN2A1-결합 잔기 His85, Arg20 및 Glu70의 TCR γ-사슬 Ala 돌연변이를 발현하는 Jurkat 세포, 뿐만 아니라 Arg51(δ-사슬) 및 Lys108(γ-사슬)의 BTN2A1-독립 돌연변이는 모두 작용제 항-BTN3A1 mAb로 펄스된 부모 APC에 반응하지 못했습니다(도 7). 따라서 BTN2A1과 Vγ9+ TCR γ-chain 간의 상호작용은 BTN3A1에 의해 유도되는 γδ T세포 반응에 필수적이지만 충분하지는 않다. 이 사실은 이전 연구에서 작용제 항-BTN3A1 mAb가 인간 BTN3A1 단독으로 형질감염된 마우스 유래 APC와의 공동 배양에서 γδ T 세포의 활성화를 유도하지 못한 이유를 설명할 수 있다(A. Sandstorm et al. (2014)). 마우스는 BTN2A1을 발현하지 않기 때문이다.

따라서, 이러한 돌연변이 연구는 pAg 및 BTN3A1 매개 활성화에 필요한 Vγ9Vδ2+ γδTCR에 대한 2개의 개별 상호작용 부위의 존재를 밝혀냈다. Vγ9 측면의 한 부위는 BTN2A1 결합과 활성화 모두에 필수적이며, Vδ2 CDR2 및 γ-사슬 CDR3 루프를 모두 포함하는 다른 부위는 pAg 및 BTN3A1 매개 활성화에 필요하다. 따라서, Vγ9Vδ2+ T세포는 별개의 이중 리간드 상호작용을 통해 pAg에 의해 선택적으로 활성화되는 것으로 보이며, 이로써 BTN2A1은 Vγ9 도메인에 결합하고 다른 리간드, 잠재적으로 BTN3A1은 Vγ9 및 Vδ2 도메인을 모두 포함하는 별도의 계면에 결합한다.

결론(Concluding remarks)

이 발견은 BTN2A1과 BTN3이 세포 표면에서 결합하고 pAg 매개 γδ T세포 활성화에 둘 다 필요하다는 모델을 뒷받침한다. 이 모델은 또한 pAg가 BTN3, 예를 들어 BTN3A1의 세포내 B30.2 도메인을 통해 결합한 후 BTN2A1-BTN3 복합체가 2개의 별개의 결합 부위: BTN2A1은 Vγ9 프레임워크 영역에 결합하는 반면, 다른 리간드, 가능하게는 BTN3, 예를 들어 BTN3A1은 TCR의 반대쪽에 있는 Vδ2로 엔코딩된 CDR2 및 γ-사슬로 인코딩된 CDR3 루프에 결합를 통해 γδTCR과 결합함을 시사한다. 이것은 αβ T세포에 의한 표준 MHC-Ag 복합 인식과 매우 다른 Ag 감지의 고유한 모델을 나타낸다.

이전 연구에서, 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA:shRNA) 녹다운을 사용하여 pAg 표시에서 BTN2A1에 대한 명백한 역할을 찾지 못했다(S. Vavassori et al.(2013)). 그러나, 녹다운 효율이 81%에 불과하고 BTN2A1 단백질이 측정되지 않았기 때문에 잔여 BTN2A1이 기능을 유지했을 수 있다. 지금까지, BTN2A1은 글리코실화 의존성 수용체인 CD209를 확인하는 단 하나의 이전 연구와 함께 제대로 특성화되지 않았다(G. Malcherek et al.(2007)). 본 발명자들은 N-연결된 글리칸이 γδTCR에 결합하는 BTN2A1에 필요하지 않으며(도 24), CD209가 이러한 상호작용에서 역할을 할 가능성이 없음을 발견하였다. BTN2A1의 발현 패턴에 대해서는 알려진 바가 거의 없지만 RNA 분석은 면역 세포에서 광범위한 발현을 예측한다. 본 발명자들은 BTN2A1이 순환하는 T, B, NK 세포, 단핵구 및 Vγ9Vδ2+ T세포에서 발현된다는 것을 확인했으며(도 24), 이는 잠재적으로 γδ T세포가 pAg를 스스로에게 제시할 수 있는 방법을 설명할 수 있다(CT Morita et al. 1995).

최근 연구에 따르면 인간 BTNL3과 BTNL8이 공동 연관되어 있으며 인간 Vγ4+ γδ T세포에 자극적이며, BTNL3은 HV4 루프라고 하는 γ-사슬 가변 도메인의 생식세포 엔코드된 영역과 상호작용한다(R. Di Marco Barros et al. (2016); D. Melandri et al. (2018)). 비슷하게, 마우스 BTNL1 및 BTNL6은 연결되고 장내 Vγ7+ γδ T세포 기능에 중요하며 γδTCR의 유사한 영역에 결합하는 것으로 보인다(R. Di Marco Barros et al.(2016); D. Melandri et al.(2018)). 대조적으로, BTN2A1-Vγ9 결합 인터페이스는 HV4 루프보다 Vγ9 TCR의 ABED β 시트의 외부 표면에 더 큰 의존성을 나타내는 것으로 보이며, 이는 Vγ9의 BTN2A1 결합 발자국이 CDR 루프에서 더 멀리 떨어져 있고 Cγ 도메인에 더 가깝게 위치할 수 있음을 나타낸다. 부티로필린 분자가 이량체화하는 경향을 감안할 때(예: BTN3A1은 안정한 V자형 헤테로다이머를 형성할 수 있으며, BTN3A2(S. Gu et al.(2017)) 및 BTNL3-BTNL8 헤테로다이머와도 헤테로다이머를 형성할 수 있다(D. Melandri et al.(2018))), BTN2A1과 BTN3 사이의 연관성(예: BTN3A1)은 직접적인 상호작용을 나타낼 수 있지만 이에 대한 분자 기반은 아직 결정되지 않았다.

다른 Ag 제시 분자(MHC 및 MHC 유사 분자)와 비교하여 헤테로머 부티로필린 복합체의 인식은 근본적으로 구별되는 면역 인식 부류를 나타낸다. pAg가 항원성을 유도하기 위해 이 복합체를 변경하는 방법은 아직 알려져 있지 않지만, 부티로필린 이량체 또는 다량체 리모델링 및/또는 BTN2A1 및 BTN3에 대한 구조적 변화가 포함될 수 있다. ABCA1(B. Castella et al.(2017))과 같은 다른 관련 분자가 직접 필요할 수 있다.

이 발견은 BTN2A1이 감염성 질환, 암 및 자가면역에 대한 γδ T세포 매개 면역요법에서 작용제 및/또는 길항제 개입의 직접적인 표적임을 나타낸다.

종양 사멸/억제 분석

다음 실험에서, γδ T세포는 PE-Cy7-접합된 항-γδTCR에 이어 항-피코에리트린 매개 자기 비드 정제(anti-phycoerythrin-mediated magnetic bead purification)(Miltenyi Biotec)를 사용한 MACS에 의해 강화되었다. 농축 후 CD3+ Vδ2+ γδ T세포를 Aria III(BD)를 사용하여 분류하여 추가로 정제했다. 농축된 γδ T세포는 플레이트 결합 항-CD3ε(OKT3, 10μg/ml, Bio-X-Cell), 가용성 항-CD28(CD28.2, 1μg/ml, BD Pharmingen), 파이토헤마글루티닌(0.5μg/ml, Sigma), IL-15(50ng/ml) 및 재조합 인간 IL-2(100U/ml, PeproTech)로 48시간 동안 시험관 내에서 자극되었고, 14-21일 동안 IL-2 및 IL-15로 유지 관리한다. 세포는 10%(v/v) FCS(JRH Biosciences), 페니실린(100U/ml), 스트렙토마이신(100μg/ml), 글루타맥스(2mM), 피루브산나트륨(1mM), 비필수 아미노산(0.1mM), 및 HEPES 완충액(15mM), pH 7.2-7.5(모두 Invitrogen Life Technologies에서 제공), 플러스 50μM 2-메르캅토에탄올(Sigma-Aldrich)로 보충된 RPMI-1640 및 AIM-V(Invitrogen)의 50:50(v/v) 혼합물로 구성된 완전 배지에서 배양되었다.

LM-MEL-62 및 LM-MEL-75 흑색종 세포를 10% FBS가 보충된 RPMI1640 배지에서 96웰 평평한 바닥 플레이트에 웰당 1x10⁴로 플레이팅하고 밤새 부착되도록 두었다. T25 감마 델타 T 세포를 100U/ml IL-2와 함께 TCRPMI에서 2:1 이펙터:표적 비율로 추가하고 5uM 졸레드로네이트, 0.5ng/ml HMBPP로 자극하거나 자극하지 않은 채로 두었다. 작용제 항체 253, 259 또는 이소타입 대조군 BM4를 10ug/ml로 각 웰에 첨가하였다. 모든 조건을 3회 반복했다. 세포를 37도에서 인큐베이션하고 3일째에 Vd2+ 세포를 유세포 분석에 의해 획득하였다. 살아있는 세포를 게이트하고 활성화를 CD25 발현 분석에 의해 결정하였다. 흑색종 세포 생존력은 MTS 분석에 의해 결정되었다. MTS 시약을 RPMI 배지에 1:5 비율로 첨가하고 웰당 100ul를 첨가하였다. 세포를 37도에서 30분 동안 인큐베이션하고 플레이트를 490nm에서 Spectrostar 나노 플레이트 판독기에서 판독했다.

작용성 항체(agonistic antibodies)가 있는 상태에서 γδ T세포 활성화 측정

일부 실험에서 γδ T 세포는 PE-Cy7-접합된 항-γδTCR에 이어 항-피코에리트린 매개 자기 비드 정제(Miltenyi Biotec)를 사용한 MACS에 의해 강화되었다. 농축 후 CD3+ Vδ2+ γδ T세포를 Aria III(BD)를 사용하여 분류하여 추가로 정제했다. 농축된 γδ T세포는 플레이트 결합 항-CD3ε(OKT3, 10μg/ml, Bio-X-Cell), 가용성 항-CD28(CD28.2, 1μg/ml, BD Pharmingen), 파이토헤마글루티닌(phytohemagglutinin)(0.5μg/ml, Sigma), IL-15(50ng/ml) 및 재조합 인간 IL-2(100U/ml, PeproTech)로 48시간 동안 시험관 내에서 자극되고, 14-21일 동안 IL-2 및 IL-15로 유지 관리된다. 세포는 10%(v/v) FCS(JRH Biosciences), 페니실린(100U/ml), 스트렙토마이신(100μg/ml), 글루타맥스(2mM), 피루브산나트륨(1mM), 비필수 아미노산(0.1mM), 및 HEPES 완충액(15mM), pH 7.2?7.5(모두 Invitrogen Life Technologies에서 제공)와 50μM 2-머캅토에탄올(Sigma-Aldrich)로 보충된 RPMI-1640 및 AIM-V(Invitrogen)의 50:50(v/v) 혼합물로 구성된 완전배지에서 배양되었다.

시험관 내 사전 확장된 CD3+ Vδ2+ γδ T세포(5 x 10⁵)를 HMBPP(0.5ng/ml) ± 10㎍/ml 중화 항-BTN2A1 mAb 또는 이소타입 대조군과 함께 24시간 동안 배양했다. CD25 발현은 유세포 분석에 의해 결정되었고, IFN-γ 농도는 제조사 지침에 따라 세포 측정 비드 어레이(BD Bioscience)에 의해 결정되었다.

BTN2A1 작용성 항체의 확인

본 발명자들은 BTN2A1에 작용할 수 있는 항체를 확인하기 위해 전술한 바와 같이 BTN2A1에 특이적인 항체 패널을 스크리닝하였다. 본 발명자들은 γδ T세포를 활성화시키는 항-BTN2A1 항체의 능력을 평가하였다. 본 발명자들은 세포를 10㎍/ml 항-BTN2A1 항체 또는 이소타입 대조군 항체(BM4)로 밤새 배양한 후 이전에 확장된 γδ T세포의 표면에서 CD25의 상향조절을 평가하였다. 도 26A에 나타낸 바와 같이, 항체 244, 253 및 259는 모두 CD25를 발현하는 γδ T세포의 백분율을 증가시킬 수 있었다.

본 발명자들은 밤새 10㎍/ml 항-BTN2A1 항체 또는 이소타입 대조군 항체(BM4)의 존재 하에 배양 후 γδ T세포에 의해 분비되는 인터페론 γ의 수준을 추가로 측정하였다. 인터페론 γ 분비는 TCR 의존적 활성화의 또 다른 지표이다. 도 26B에 나타낸 바와 같이, 항체 244, 253 및 259는 모두 분비된 인터페론 γ의 수준을 증가시킬 수 있었다.

본 발명자들은 공동 배양 실험에서 γδ T세포를 활성화하고 암세포를 사멸시키고/시키거나 암세포의 성장을 예방하는 항-BTN2A1 항체의 능력을 추가로 시험하였다. 배양은 γδ T세포 및 흑색종 세포(LM-MEL-75 또는 LM-MEL-62)를 2:1 비율로 사용하여 수행되었다. 세포를 항체 253 또는 259 또는 BM4(이소타입 대조군) 또는 졸레드로네이트(양성 대조군) 또는 HMBPP(양성 대조군)와 함께 3일 동안 배양하였다. 도 27A에 나타낸 바와 같이, 항체 253 또는 259의 존재 하에 배양된 세포는 양성 대조군과 유사한 수준의 흑색종 세포주의 세포 용해를 유도하였다. 도 27B는 CD25 상향조절에 의해 평가된 γδ T세포의 활성화 수준을 보여준다. 특히, 도 27B는 항체 253 또는 259의 존재 하에 배양된 γδ T세포에서 발현 수준이 상향조절됨을 보여준다.

인산항원 부재시 γδT세포 활성화 및 세포사멸 유도

재료 및 방법

루미넥스(uminex)(PBMC)

건강한 공여자(Red Cross Australia)의 혈액을 채취하고, PBMC 층을 수집, 세척하고 5x10⁵개의 세포를 100u/ml IL-2가 보충된 500ul TCRPMI에서 10㎍/ml로 표시된 항체로 이중@ 처리하고 37℃ 및 5% CO₂에서 16시간 동안 인큐베이션했다. 상청액을 수집하고 Luminex Human 20-plex Inflammation 패널 분석(EPX200-12185-901)을 위해 Crux Biolabs(Scoresby, VIC, Australia)에 제출했다. 이것은 다음 분석 물질을 측정한다: GM-CSF; ICAM-1, IFN-α; IFN-g, IL-1α, IL-1b, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-4, IL-8, IP-10, MCP-1, IL-6, MIP- 1a, MIP-1b, sE-s셀렉틴(selectin), sP-셀렉틴, TNF-α. 모든 샘플은 적절한 대조군과 표준으로 실행되었습니다. 항체 259를 사용한 처리는 하나의 웰에서만 수행되었다.

루미넥스(Vγ9Vδ2)

간략하게, Vγ9Vδ2 세포는 TCRγ/δ+ T세포 분리 키트(Miltenyi)를 사용하여 1명의 건강한 공여자(Red Cross Australia) 및 1명의 암 환자 유래 PBMC로부터 분리되었다. 세포를 100u/ml IL-2, CD3(10μg/ml) 및 CD28(1μg/ml)이 보충된 TCRPMI에서 48시간 동안 자극했다. 세포를 세척하고 37℃ 및 5% CO₂에서 100u/ml IL-2가 보충된 TCRPMI에서 14일 동안 성장시킨 다음 동결시켰다. 환자는 사전 동의를 제공했으며 연구는 HREC 14/425에 따라 승인되었다. Vγ9Vδ2를 해동하고(defrosted) 37℃ 및 5% CO₂에서 50u/ml IL-2가 보충된 TCRPMI에서 밤새 휴지(rested)시켰다. 다음날 2x10⁵세포를 100u/ml IL-2가 보충된 200ul TCRPMI에서 10㎍/ml 또는 졸레드론산(4μM) 또는 HMBPP(0.5ng/ml)로 이중@ 으로 표시된 항체로 처리하고 37°C 및 5% CO₂에서 16시간 동안 인큐베이션했다. 상청액을 수집하고 Luminex Human 20-plex Inflammation 패널 분석(EPX200-12185-901)을 위해 Crux Biolabs(Scoresby, VIC, Australia)에 제출했다. 모든 샘플은 적절한 대조군과 표준으로 실행되었다.

시험관내 킬링(killing) 분석

Vγ9Vδ2 세포는 TCRγ/δ+ T 세포 분리 키트(Miltenyi)를 사용하여 건강한 공여자(Red Cross Australia) 또는 암 환자 유래 PBMC로부터 분리되었다. 환자는 정보에 입각한 동의를 제공했으며 연구는 HREC 14/425에 따라 승인되었다. 세포를 100u/ml IL-2, CD3(10μg/ml) 및 CD28(1μg/ml)이 보충된 TCRPMI에서 48시간 동안 자극했다. 세포를 세척하고 37℃ 및 5% CO₂에서 100u/ml IL-2가 보충된 TCRPMI에서 14일 동안 성장시킨 다음 동결시켰다. Vγ9Vδ2를 해동하고 37℃ 및 5% CO₂에서 50u/ml IL-2가 보충된 TCRPMI에서 밤새 휴지시켰다.

모든 분석에 대해 LM-MEL-62 흑색종 세포를 96웰 평평한 바닥 플레이트의 100μl RF10 배지에서 10,000개 세포/웰로 플레이팅하고 37°C 및 5% CO₂에서 밤새 부착되도록 둔다.

E:T 적정(E:T titration)

다음날 Vγ9Vδ2 세포를 세척하고, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 또는 1:16의 E:T 비율에서 100u/ml IL-2 및 4uM 졸레드로네이트 또는 10ug/ml 항체 259가 보충된 TCRPMI의 흑색종 세포를 계수하고 추가한다.

항체 적정

Vγ9Vδ2 세포를 세척하고 계수하고 100u/ml IL-2가 보충된 TCRPMI에서 10,000개 세포/웰로 플레이팅했다. 항-BTN2A1 항체 253, 259 또는 BM4 이소타입 대조군을 10, 1, 0.1 및 0.01ug/ml의 희석도로 이중으로 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO₂에서 배양하였다. 3일째에 Vγ9Vδ2 세포를 세척하고 100μl MTS 시약을 제조사 프로토콜(Promega, USA)에 따라 1시간 동안 웰에 첨가했다. 이후에 Spectrostar Nano 마이크로플레이트 판독기(BMG Labtech)를 사용하여 490nm에서 플레이트를 판독하여 배경 흡광도에 대해 보정된 세포 생존력을 결정했다.

유세포 분석

Vγ9Vδ2 세포는 이전에 설명된 대로 CD3, Vδ2, CD25 및 살아있는 사멸 생존 염료에 대해 염색되었고 Canto 유세포 분석기(BD)에서 분석되었다. 세포는 림프구, 단일 세포, 살아있는 세포, CD3+ Vδ2+에 대해 게이팅되었고 활성화는 CD25 발현을 기반으로 결정되었다.

논의(Discussion)

Vγ9Vδ2 세포는 사이토카인 발현뿐만 아니라 CD25 및 CD69를 비롯한 활성화 마커의 상향조절과 함께 인산항원 제시에 반응한다. 이것은 항원 제시 세포의 표면에서 BTN2A1 및 BTN3A1 발현을 필요로 한다. 항-BTN2A1 항체 259 및 253은 멜라보네이트/비-메발로네이트(melavonate/non-mevalonate) 경로의 이러한 중간체의 존재 없이 다양한 정도로 포스포항원 매개 활성화를 모방할 수 있다(도 28A).

기능적으로, 이 활성화는 흑색종 종양 세포(본원에서 LM-MEL-62로 지칭됨)를 인식하고 죽이는 사전 확장된 Vγ9Vδ2T 세포의 능력의 용량 의존적 증가를 유도한다. 2명의 다른 공여자(흑색종 환자)로부터 유래된 Vγ9Vδ2 세포를 사전 확장하고 흑색종 세포(1:1 비율)와 공동 인큐베이션하고 항체 253 또는 항체 259의 양을 다르게 처리했다. 도 28A의 활성화 데이터와 유사하게, 항체 259로 처리하면 항체 253과 비교할 때 LM-MEL-62 세포의 생존율이 더 낮아졌다. 항체 259의 더 높은 농도는 Vγ9Vδ2 세포 매개 종양 세포 사멸을 향상시켰고 1 내지 10㎍/ml 사이에서 달성된 두 공여자에 걸쳐 최대 사멸을 나타냈다(도 28B).

종양 세포 사멸은 항체의 용량뿐만 아니라 표적(LM-MEL-62) 세포에 대한 효과기(Vγ9Vδ2)의 비율에 의존적이었다(도 28C). 졸레드론산 처리와 비교할 때, 항체 259 매개 세포 사멸은 E:T와 상관관계를 나타내었지만(더 많은 이펙터가 더 높은 사멸로 이어짐), 사멸은 두 공여자 모두에서 더 적은 정도로 발생했다. 흥미롭게도, 암 환자(환자 1)에서 파생된 Vγ9Vδ2 세포는 건강한 공여자에서 파생된 것보다 사용된 자극과 무관하게 종양 세포를 죽이는 능력이 떨어지는 것으로 보였다. 이것은 암 환경에서 Vγ9Vδ2 세포의 (가역적) 기능적 변경이 잠재적으로 종양 미세 환경을 넘어 확장됨을 시사한다(세포는 순환계에서 분리되었다).

이러한 차이는 시험관 내 확장된 Vγ9Vδ2 세포에서 유래하고 졸레드로네이트, HMBPP로 활성화되거나 표시된 바와 같이 다른 항체로 처리된 사이토카인/케모카인 프로필에 부분적으로 반영되었다(도 29A 및 B, 표 3 및 4). 건강한 공여자 및 환자 유래 Vγ9Vδ2에서, 졸드로네이트 및 HMBPP를 사용한 치료는 GMCSF, ICAM-1, IFNγ, IL-13, MIP-1a, MIP-1b, sE-셀렉틴, sP-셀렉틴 및 TNFα의 발현/분비를 증가시켰다. ICAM1을 제외하고 이들 모두는 더 강한 자극 -HMBPP-가 사용될 때 더 높게 표현되었으며, ICAM-1 발현은 졸레드로네이트 및 HMBPP와 유사한 정도로 상향조절되었다. IL-17A 및 IL-4의 분비는 HMBPP 활성화 설정에서만 감지할 수 있었다. IL-17의 면역 억제 기능을 고려할 때, 이것은 가장 원하는 결과를 달성하기 위해 활성화 및 차단 신호를 미세 조정할 수 있어야 할 필요성을 보여준다. 2개의 작용제 항-BTN2A1 항체 253 및 259를 사용한 처리는 졸레드로네이트 및 HMBPP를 사용한 처리와 유사한 패턴을 나타내었지만 253은 더 약한 자극이었다.

건강한 공여자 유래 Vγ9Vδ2 세포에서, 항체 253으로 처리하면 분비된 GMCSF의 양이 약간 증가하지만 다른 측정된 사이토카인/케모카인에서는 증가하지 않았다. 암 환자 유래 Vγ9Vδ2 세포에서는 분석물의 증가가 검출되지 않았지만, 다중 분석물의 기저 수준은 이소타입 항체 단독(BM4)으로 처리했을 때 종종 검출 가능한 발현이 없었던 건강한 공여자 유래 세포에서보다 더 높았다.

항체 259는 GMCSF, IFNγ, IL-13, IL-17(매우 낮음), MIP1α 및 MIP1β, sE- 및 sP-셀렉틴, TNFα를 포함하여 두 공여자 모두에 걸쳐 여러 분석물을 상당히 증가시켰다. 건강한 공여자 유래 세포의 독특한 점은 항체 259 처리 시 ICAM1이 증가하고 암 유래 세포에서 IL-4가 400pg/ml 이상으로 새롭게 발현된다는 점이다. 건강한 공여자에서는 항체 259 처리 시 IL-4가 검출되지 않았다.

본 발명자들은 BTN2A1 감마-델타 TCR 결합/활성화를 억제함으로써 사전-확장된 Vγ9Vδ2 세포 내에서 어떤 기준선 발현 사이토카인이 차단될 수 있는지 조사하기 위해 BTN2A1 길항성 항체를 추가로 사용하였다. 건강한 기증자 세포에서 34C1 처리는 이소타입(BM4) 처리된 대조군과 비교할 때 MIP1α 및 b 뿐만 아니라 GMCSF의 하향 조절을 유도했다. GMCSF 수준에서 사이토카인 감소의 기준선 발현이 훨씬 더 높은 암 환자 유래 세포에서 ICAM1(검출할 수 없는 수준까지), IFNγ, IL-13, MIP1α 및 MIP1β 및 sE-셀렉틴이 검출될 수 있었고, BTN2A1 차단은 이러한 요인을 줄이기 위한 유효한 치료 전략일 수 있다.

우리의 작용성 항-BTN2A1 항체 259가 PBMC의 맥락에서 사이토카인/케모카인 발현에 어떻게 영향을 미치는지 알아보기 위해, 본 발명자들은 건강한 공여자로부터 새로 분리된 PBMC를 항체 259 및 항체 229(길항성 항-BTN2A1 항체) 및 이소타입 대조군으로 처리하였다. BTN2A1 및/또는 3A1을 발현하는 다른 면역 세포 하위 집합의 신호 또는 Vγ9Vδ2 세포 활성화의 2차 효과를 포함하여 BTN2A1 차단 및 활성화 신호(259)에 대한 기준선 설정에서 억제 신호의 사이토카인 발현에 대한 결과를 조사했다.

분리된 Vγ9Vδ2 세포 배양에서 파생된 이전 데이터와 일치하여, 항체 259는 완전한 PBMC의 맥락에서 IFNγ 및 sE-셀렉틴의 발현을 증가시켰고, BTN2A1 및 BTN3A1 억제 항체 모두 기준선 발현을 차단하였다(도 30). 고농축 Vγ9Vδ2 세포 배양물에 존재하는 다른 신호는 전체 PBMC의 맥락에서 검출되지 않았다. 가장 두드러지게, 항체 259와 접촉 시 TNFα 수준의 증가는 검출되지 않았다(표 5). 이것은 PBMC 내의 적은 수의 Vγ9Vδ2 세포로 인해 신호가 검출 임계값을 초과하여 희석되기 때문일 수 있다.

흥미롭게도, 본 발명자들은 단일 배양에서 검출되지 않은 추가 사이토카인/케모카인이 259만큼 상향 조절되는 것을 확인했다. 여기에는 면역 세포, 주로 호중구 및 T세포에 대한 또 다른 화학 유인 물질인 IL-8(CXCL8)이 포함되며(Henkels et al 2011), T세포를 유인하여 건선(psoriasis)과 같은 자가면역 상태에서 중요한 역할을 할 수 있다(Zheng et al 1998). 또한, 본 발명자들은 CCL2(MCP-1), 수지상 세포의 강력한 화학 유인 물질 및 IL-6이 259 치료 시(Erlandsson et al, 2017; Hashizume et al., 2015) 염증 과정과 관련된 원형 및 주요 인터루킨으로 증가하는 것을 확인했다. 이러한 모든 사이토카인/케모카인은 229로 BTN2A1/3A1 신호전달 축을 차단함으로써 하향조절되었으며, 이는 이 복합체를 통한 신호전달의 의존성을 확인시켜준다.

일부 사이토카인 및 케모카인은 항체 259 처리에 의해 발현이 향상되지 않았음에도 불구하고 길항 항체를 사용하여 이소타입 대조군 수준 이하로 감소했다. 여기에는 ICAM-1, MIP1α 및 MIP1β 및 sE-셀렉틴이 포함된다.

Vδ2-γδ T세포의 활성화

방법

마우스 3T3 섬유아세포를 pMSCV-IRES-GFP 플라스미드 및 Fugene 형질감염 시약을 사용하여 전장 인간 CD1c 또는 CD1d 중쇄 또는 대조군 구조물(BTNL3)로 형질감염시켰다. 3T3 세포가 표면 CD1c 또는 CD1d를 발현했을 때 ~2일 후, 이들은 CD1c(Vγ9Vδ1+) 또는 CD1d(Vγ9Vδ1+ 또는 Vγ5Vδ1+)에 특이적인 인간 γδTCR을 발현하는 인간 T세포 라인과 24시간 동안 공동 배양되었으며, 그 후 T 세포주에 대한 활성화 수준을 CD69를 사용하는 유세포 분석에 의해 결정했다. T 세포 라인은 양성 대조군으로서 고정된 항-CD3/항-CD28 상에서 배양되거나, 음성 대조군으로서 형질감염되지 않은 3T3 세포와 함께 배양되었다.

논의

그들의 동족 리간드에 대한 Vδ2-γδ T세포 반응성을 증가시키는 BTN2A1의 능력을 시험하기 위해, 본 발명자들은 각각 CD1c 및 CD1d에 반응성인 2개의 γδ T 세포주 Vγ9Vδ1 γδTCR+를 사용하여 시험관내 분석을 수행하였다(도 31). 본 발명자들은 또한 CD1d 반응성이지만 Vγ9가 없기 때문에 BTN2A1에 결합해서는 안 되는 대조군 Vγ5Vδ1+ γδ T세포 라인(클론 9C2; A.P. Uldrich et al.(2013))를 포함했다. 본 발명자들은 마우스 3T3 APC를 인간 CD1c 또는 CD1d, 플러스 BTN2A1 또는 관련 없는 대조군 구조물(인간 BTNL3)로 형질감염시키고 이들을 γδ T세포 라인과 공동 배양하고 24시간 후에 활성화(CD69)를 측정하였다. 데이터는 BTN2A1이 (a) 추가적인 TCR 리간드가 없는 경우에도 이러한 Vγ9+ γδ T세포 라인의 일부 활성화를 유도할 수 있고, (b) CD1c- 및 CD1d-특이적 γδTCR 둘 다의 활성화를 증가시킬 수 있음을 보여준다. 이것은 9C2(Vγ5+)가 CD1d에 특이적으로 반응하는 반면, 이것은 BTN2A1 발현에 의해 강화되지 않았기 때문에 이것은 Vγ9+ TCR에 특이적인 것으로 보였다.

이러한 발견은 Vγ9Vδ2+ γδ T세포의 활성화에 필수적일 뿐만 아니라, BTN2A1은 또한 Vδ2-γδ T세포의 활성화를 직접 유도할 수 있으며, 또한 동족 Ag에 대한 이들 세포의 반응을 증가시킬 수 있다.

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Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tgttccggat atccttgggg tagaattcct tca 33 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ataccggtgc aggtcaccta gagcaac 27 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cagcaattga aggaagaaaa atagtgggct tg 32 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 atgaagggcg cagccatcgg c 21 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gctacaccgc agtgtggc 18 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 cttcatctac gcagagaagg acatctacgg 30 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gtcatggtgt tgccctgg 18 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ctgtgacaca gctggaatgg gcggcgag 28 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gcgcagtagt agctgccc 18 <210> 23 <211> 21 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Sequence <220> <223> primer <400> 32 accaggaact ggatcacttc 20 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 ctacgatggc gccgtgcgga a 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 ctgatggaca ccaggaactg g 21 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 caccgtgcgg gcagagagcg gc 22 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 ccatcgtagc tgatggacac 20 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gcggaaagag gccggcatcc cttc 24 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 acggtgccat cgtagctg 18 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 cggcatccct gctggcaagt t 21 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 ctctctttcc gcacggtg 18 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 ggcaagttcg cggtggacag aatc 24 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 agaagggatg ccgctctc 18 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 agaatccccg cgacaagcac c 21 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 gtccacctcg aacttgcc 18 <210> 45 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 actgaccatc gccaacgtgg aaaagcag 28 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 gtgctggtgc ttgtctcg 18 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 gaccatccac gccgtggaaa agcag 25 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 agtgtgctgg tgcttgtc 18 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 cacaacgtgg caaagcagga tatc 24 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 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95 Ala Arg Asp His Tyr Asp Ser Ser Gly Arg Ala Thr Asn Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 153 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR1 of the VH of antibody 253 <400> 153 Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Asp 1 5 <210> 154 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR2 of the VH of antibody 253 <400> 154 Ile Ser Pro Ser Gly Gly Leu Thr 1 5 <210> 155 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR3 of the VH of antibody 253 <400> 155 Ala Arg Asp His Tyr Asp Ser Ser Gly Arg Ala Thr Asn Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Tyr Met Asp Val 20 <210> 156 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the VL of antibody 259 <400> 156 Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Glu Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Ser Trp Phe Gln Gln Leu Pro Gly Ser Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Asp His Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Val Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Gln Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 157 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR1 of the VL of antibody 259 <400> 157 Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr 1 5 <210> 158 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR2 of the VL of antibody 259 <400> 158 Asn Asp His 1 <210> 159 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR3 of the VL of antibody 259 <400> 159 Ser Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Val Val 1 5 10 <210> 160 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the VH of antibody 259 <400> 160 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Gly Pro Ser Gly Gly Gly Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Gly Gly Leu Ser Val Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 161 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR1 of the VH of antibody 259 <400> 161 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 162 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR2 of the VH of antibody 259 <400> 162 Ile Gly Pro Ser Gly Gly Gly Thr 1 5 <210> 163 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR3 of the VH of antibody 259 <400> 163 Ala Arg Asp Leu Gly Gly Leu Ser Val Leu Phe Asp Tyr 1 5 10

Claims

대상체에게 BTN2A1 길항제(antagonist)를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 Vγ9+ TCR을 발현하는 γδ T세포의 활성화를 억제하는 방법으로, 상기 BTN2A1 길항제는
i) 세포 표면의 BTN2A1/BTN3A1 복합체 형성을 억제;
ii) Vγ9에 대한 BTN2A1의 결합을 억제;
iii) Vγ9+ TCR에 대한 BTN2A1/BTN3A1 복합체의 결합을 억제; 및/또는
iv) BTN2A1을 발현하는 세포의 활성 및/또는 생존을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 Vγ9Vδ2+ γδ T세포의 활성화를 억제시키는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 Vγ9Vδ2-γδ T세포의 활성화를 억제시키는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1/BTN3A1 복합체는 하나 이상의 추가 분자를 포함하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 BTN2A1/BTN3A1 복합체는 BTN3A2 및/또는 BTN3A3을 포함하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 세포용해 기능(cytolytic function), 하나 이상의 사이토카인(cytokines) 생성, 또는 γδ T세포의 증식 중 하나 이상을 억제시키는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1 길항제는 γδ T세포의 인산항원 매개 활성화(phosphoantigen mediated activation)를 억제시키는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1 길항제는 BTN2A1 및 BTN3A1의 결합을 억제시키는 방법.
제8항에 있어서, 상기 BTN2A1 길항제는 BTN2A1 및 BTN3A1의 직접적인 결합을 억제시키는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1 길항제는 Vγ9의 생식세포계열-엔코드된(germline-encoded) 영역 및/또는 δ-사슬의 말단(distal)에 대한 BTN2A1의 결합을 억제시키는 방법.
제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1 길항제는 TCR γ 사슬의 CDR2 루프(loop) 및/또는 CDR3 루프와 같은 Vδ2의 생식세포계열-엔코드된 영역에 대한 BTN2A1/BTN3A1 복합체의 결합을 억제시키는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1 길항제는 BTN2A1 분자를 자극성(stimulatory) BTN2A1에서 비-자극성(non-stimulatory)으로 전환(switch)하도록 BTN2A1 분자의 세포외 도메인(IgV 및/또는 IgC) 중 하나 이상을 변형시키는 방법.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1 길항제는 BTN2A1 분자의 세포외 도메인(IgV 및/또는 IgC) 중 하나 이상을 변형시키고 인산항원 활성화를 억제시키는 방법.
대상체에게 BTN2A1 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 Vγ9+ γδ T세포 반응을 방지하는(suppressing) 또는 억제하는(inhibiting) 방법으로, 상기 BTN2A1 길항제는
i) 세포 표면의 BTN2A1/BTN3A1 복합체 형성을 억제;
ii) Vγ9+ TCR에 대한 BTN2A1의 결합을 억제;
iii) Vγ9+ TCR에 대한 BTN2A1/BTN3A1 복합체의 결합을 억제; 및/또는
iv) BTN2A1을 발현하는 세포의 활성 및/또는 생존을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 방법은 Vγ9Vδ2+ γδ T세포 반응을 방지 또는 억제시키는 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 방법은 Vγ9Vδ2-γδ T세포 반응을 방지 또는 억제시키는 방법.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1/BTN3A1 복합체는 하나 이상의 추가 분자를 포함하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 BTN2A1/BTN3A1 복합체는 BTN3A2 및/또는 BTN3A3을 포함하는 방법.
제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 세포용해 기능, 하나 이상의 사이토카인 생성, 또는 γδ T세포의 증식 중 하나 이상을 방지 또는 억제시키는 방법.
제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1 길항제는 γδ T세포의 활성화를 억제시키는 방법.
제20항에 있어서, 상기 BTN2A1 길항제는 γδ T세포의 인산항원 매개 활성화를 억제시키는 방법.
제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1 길항제는 BTN2A1및 BTN3A1의 결합을 억제시키는 방법.
제22항에 있어서, 상기 BTN2A1 길항제는 BTN2A1 및 BTN3A1의 직접적인 결합을 억제시키는 방법.
제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1 길항제는 Vγ9의 생식세포계열 엔코드된 영역 및/또는 δ-사슬의 말단에 대한 BTN2A1의 결합을 억제시키는 방법.
제15항 내지 제24항에 있어서, 상기 BTNA1 길항제는 TCR γ 사슬의 CDR2 및/또는 CDR3 루프와 같은 Vδ2의 생식세포계열 엔코드된 영역에 대한 BTN2A1/BTN3A1 복합체의 결합을 억제시키는 방법.
제14항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1 길항제는 BTN2A1 분자를 자극성 BTN2A1에서 비자극성으로 전환하도록 BTN2A1 분자의 세포외 도메인(IgV 및/또는 IgC) 중 하나 이상을 변형시키는 방법.
제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1 길항제는 BTN2A1 분자의 세포외 도메인(IgV 및/또는 IgC) 중 하나 이상을 변형시키고 인산항원 활성화를 억제시키는 방법.
γδ T세포 및 BTN2A1을 발현하는 세포를 BTN2A1 길항제의 존재하에 배양하는 단계를 포함하는, 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo)에서 Vγ9+ TCR을 발현하는 γδ T세포의 활성화를 억제하는 방법으로, 상기 BTN2A1 길항제는
i) 세포 표면에 BTN2A1/BTN3A1 복합체 형성;
ii) Vγ9에 대한 BTN2A1의 결합; 및/또는
iii) Vγ9+ TCR에 대한 BTN2A1/BTN3A1 복합체를 결합시키는 방법.
제28항에 있어서, 제2항 내지 제13항에서 정의된 특징 중 어느 하나에 의해 추가로 정의되는 것을 특징으로 하는 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 방법은 대상체에게 γδ T세포를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
대상체에서 자가면역 질환, 이식 거부 또는 이식편대숙주병(graft versus host disease), 또는 이식편대종양효과(graft versus tumour effect)를 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방, 또는 증상완화에 충분한 양으로 BTN2A1 길항제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환, 이식 거부, 이식편대숙주병, 또는 이식편대종양효과의 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방, 또는 증상완화 방법.
대상체에서 암 또는 감염을 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방 또는 증상완화에 충분한 양으로 BTN2A1 길항제를 대상체에서 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 감염의 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방 또는 증상완화 방법,
대상에게 BTN2A1 작용제(agonist)를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 Vγ9+ TCR을 발현하는 γδ T세포를 활성화하는 방법으로, 상기 BTN2A1 작용제는
i) 세포 표면에서 BTN2A1/BTN3A1 복합체의 형성을 촉진;
ii) γδ T세포에서 Vγ9+ TCR의 리게이션(ligation)을 유도; 및/또는
iii) BTN2A1을 발현하는 세포의 활성 및/또는 생존을 증가시키는 방법.
제33항에 있어서, 상기 방법은 Vγ9Vδ2+ γδ T세포를 활성화 시키는 방법.
제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 방법은 Vγ9Vδ2-γδ T세포를 활성화 시키는 방법.
제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 BTN2A1/BTN3A1 복합체는 하나 이상의 추가 분자를 포함하는 방법.
제36항에 있어서, 여기서 BTN2A1/BTN3A1 복합체는 BTN3A2 및/또는 BTN3A3을 포함하는 방법.
제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 γδ T세포의 세포용해 기능, 사이토카인 생산 또는 증식 중 하나 이상을 활성화 시키는 방법.
제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1 작용제는 인산항원 결합과 무관하게(independent) γδ T세포를 활성화 시키는 방법.
제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1 작용제는 BTN2A1및 BTN3A1의 결합을 촉진시키는 방법.
제38항에 있어서, 상기 BTN2A1 작용제는 BTN2A1 및 BTN3A1의 직접적인 결합을 촉진시키는 방법.
제33항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1 작용제는 BTN2A1 및 BTN3A1에 대해 이중-특이적(bi-specific)인 것을 특징으로 하는 방법.
제42항에 있어서, 상기 BTN2A1 작용제는 BTN3A1과 교차-반응(cross-reacts)하는 것을 특징으로 하는 방법.
제33항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1 작용제는 BTN2A1 분자를 비자극성 BTN2A1에서 자극성 분자로 전환하기 위해 BTN2A1 분자의 세포외 도메인(IgV 및/또는 IgC) 중 하나 이상을 변형시키느 방법.
대상체에게 BTN2A1 작용제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 Vγ9+ γδ T세포 반응을 유도(inducing) 또는 향상(enhancing)하는 방법으로, 상기 BTN2A1 작용제는
i) 세포 표면에 BTN2A1/BTN3A1 복합체 형성 촉진;
ii) γδ T세포에서 Vγ9+ TCR의 리게이션을 유도; 및/또는
iii) BTN2A1을 발현하는 세포의 활성 및/또는 생존을 증가시키는 방법.
제45항에 있어서, 상기 방법은 Vγ9Vδ2+ γδ T세포 반응을 유도하는 것을 득징으로 하는 방법.
제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 방법은 Vγ9Vδ2-γδ T세포 반응을 유도하는 방법.
제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 BTN2A1/BTN3A1 복합체는 하나 이상의 추가 분자를 포함하는 방법.
제48항에 있어서, 상기 BTN2A1/BTN3A1 복합체는 BTN3A2 및/또는 BTN3A3을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 세포용해 기능, 하나 이상의 사이토카인 생산, 또는 γδ T세포의 증식 중 하나 이상을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1 작용제는 인산항원 결합과 무관하게 γδ T세포를 활성화 시키는 방법.
제45항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1 작용제는 BTN2A1및 BTN3A1의 결합을 촉진시키는 방법.
제52항에 있어서, 여기서 BTN2A1 작용제는 BTN2A1 및 BTN3A1의 직접적인 결합을 촉진시키는 방법.
제45항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1 작용제는 BTN2A1 및 BTN3A1에 대해 이중-특이적인 것을 특징으로 하는 방법.
제54항에 있어서, 상기 BTN2A1 작용제는 BTN3A1과 교차-반응하는 것을 특징으로 하는 방법.
제45항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1 작용제는 BTN2A1 분자를 비자극성 BTN2A1에서 자극성 분자로 전환하기 위해 BTN2A1 분자의 세포외 도메인(IgV 및/또는 IgC) 중 하나 이상을 변형시키는 방법.
γδ T세포 및 BTN2A1을 발현하는 세포를 BTN2A1 작용제의 존재하에 배양하는 단계를 포함하는, 시험관내 또는 생체외에서 Vγ9+ TCR을 발현하는 γδ T세포를 활성화시키는 방법으로, 상기 BTN2A1 작용제는
i) 항원 제시 세포(antigen presenting cells)의 표면에서 BTN2A1/BTN3A1 복합체의 형성을 촉진;
ii) γδ T세포에서 Vγ9+ TCR의 리게이션을 유도; 및/또는
iii) BTN2A1을 발현하는 세포의 활성 및/또는 생존을 증가시키는 방법.
제57항에 있어서, 제33항 내지 제44항에 정의된 특징 중 어느 하나에 의해 추가로 정의되는 것을 특징으로 하는 방법.
제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 방법은 활성화된 γδ T세포를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
대상체에서 자가면역 질환, 이식 거부 또는 이식편대숙주병, 또는 이식편대종양효과를 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방, 또는 증상완화에 충분한 양으로 BTN2A1 작용제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환, 이식 거부, 이식편대숙주병, 또는 이식편대종양효과의 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방, 또는 증상완화 방법.
대상체에서 암 또는 감염을 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방 또는 증상완화에 충분한 양으로 BTN2A1 작용제를 대상체에서 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 감염의 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방 또는 증상완화 방법.
BTN2A1에 특이적으로 결합하고
i) 세포 표면에 BTN2A1/BTN3A1 복합체 형성;
ii) Vγ9에 대한 BTN2A1의 결합; 및/또는
iii) Vγ9+ TCR에 대한 BTN2A1/BTN3A1 복합체의 결합을 억제시키는 것을 특징으로 하는 BTN2A1 길항제.
제62항에 있어서, 제2항 내지 제12항에 정의된 특징 중 어느 하나에 의해 추가로 정의되는 것을 특징으로 하는 BTN2A1 길항제.
BTN2A1에 특이적으로 결합하고
i) 세포 표면에서 BTN2A1/BTN3A1 복합체의 형성을 촉진;
ii) γδ T 세포에서 Vγ9+ TCR의 리게이션을 유도; 및/또는
iii) BTN2A1을 발현하는 세포의 활성 및/또는 생존을 증가시키는 것을 특징으로 하는 BTN2A1 작용제.
제64항에 있어서, 제33항 내지 제44항에서 정의된 특징 중 어느 하나에 의해 추가로 정의되는 것을 특징으로 하는 BTN2A1 작용제.
제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BTN2A1 길항제 또는 작용제는 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제66항에 있어서, 상기 단백질은
(i) 단일 사슬 Fv 단편(single chain Fv fragment:scFv)
(ii) 이량체(dimeric) scFv;
(iii) Fv 단편
(iv) 단일 도메인 항체(single domain antibody:sdAb);
(v) 나노바디(nanobody);
(vi) 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 또는 고차 멀티머(higher order multimer);
(vii) Fab 단편;
(viii) Fab' 단편;
(ix) F(ab') 단편;
(x) F(ab')₂ 단편;
(xi) 항체의 Fc 영역에 연결된 (i)-(x) 중 어느 하나;
(xii) 면역 이펙터(effector) 세포에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 융합된 (i)-(x) 중 어느 하나; 또는
(xiii) 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제67항에 있어서, 상기 단백질은 친화성 성숙(affinity matured), 키메릭(chimeric), CDR 이식(CDR grafted) 또는 인간화 항체(humanized antibody), 또는 이의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
BTN2A1 길항제는 가용성(soluble) Vγ9+ TCR인 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제32항 중 어느 하나의 방법, 또는 제62항 또는 제63항의 BTN2A1 길항제.
제69항에 있어서, 상기 가용성 Vγ9+ TCR은 모노머(monomer)인 것을 특징으로 하는 방법.
제69항에 있어서, 상기 가용성 Vγ9+ TCR은 멀티머(multimer)인 것을 특징으로 하는 방법.
BTN2A1 길항제는 서열번호 100으로 표시되는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region:V_H) 및 서열 101로 표시되는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(light chain variable region:V_L)을 포함하는 항체인 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법, 또는 제62항 또는 제63항의 BTN2A1 길항제.
BTN2A1 길항제는 서열번호 108로 표시되는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H) 및 서열번호 109로 표시되는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하는 항체인 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법, 또는 제62항 또는 제63항의 BTN2A1 길항제.
BTN2A1 길항제는 서열번호 116으로 표시되는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H) 및 서열번호 117로 표시되는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하는 항체인 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법, 또는 제62항 또는 제63항의 BTN2A1 길항제.
BTN2A1 길항제는 서열번호 124로 표시되는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H) 및 서열번호 125로 표시되는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하는 항체인 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법, 또는 제62항 또는 제63항의 BTN2A1 길항제.
BTN2A1 길항제는 서열번호 132으로 표시되는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H) 및 서열번호 133으로 표시되는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하는 항체인 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법, 또는 제62항 또는 제63항의 BTN2A1 길항제.
BTN2A1에 특이적으로 결합하고 및
(i) γδ T세포를 활성화 시키고 및/또는 세포 집단에서 활성화된 γδ T세포의 수를 증가; 및/또는
(i) γδ T세포 활성화의 마커를 발현하는 γδ T세포의 백분율(percentage)을 증가; 및/또는
(ii) γδ T세포에 의한 사이토카인의 분비를 증가; 및/또는
(iii) 암세포를 사멸시키는 γδ T세포를 유도 및/또는 암세포의 성장을 억제 및/또는 감염된 세포를 사멸 및/또는 감염된 세포의 성장을 억제; 및/또는
(iv) γδ T세포의 세포 표면에서 발현되는 γδ T세포 활성화의 마커의 양을 증가시키는 것을 특징으로 하는 BTN2A1 작용제.
BTN2A1에 특이적으로 결합하고 및
(i) 세포 표면에서 CD25를 발현하는 γδ T세포의 백분율을 증가; 및/또는
(ii) γδ T세포에 의한 인터페론(interferon) γ의 분비를 증가; 및/또는
(iii) 암 세포를 사멸시키는 γδ T 세포를 유도 및/또는 암 세포의 성장을 억제; 및/또는
(iv) γδ T세포의 세포 표면에서 발현되는 CD25의 양을 증가시키는 것을 특징으로 하는 BTN2A1 작용제.
제77항에 있어서, 다음을 포함하는 항체인 것을 특징으로 하는 BTN2A1 작용제:
(i) 서열번호 140으로 표시되는 서열 또는 이의 상보성 결정 영역(complementarity determining regions:CDRs)을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L) 및 서열번호 144로 표시되는 서열 또는 이의 CDRs을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H);
(ii) 서열번호 148로 표시되는 서열 또는 이의 CDRs을 포함하는 VL 및 서열번호 152로 표시되는 서열 또는 그의 CDRs을 포함하는 VH;
(iii) 서열번호 156으로 표시되는 서열 또는 이의 CDRs을 포함하는 VL 및 서열번호 160으로 표시되는 서열 또는 그의 CDRs을 포함하는 VH.
대상체에게 제77항 내지 제79항 중 어느 한 항의 BTN2A1 작용제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 Vγ9+ TCR을 발현하는 γδ T세포를 활성화하는 방법.
대상체에게 제77항 내지 제79항 중 어느 한 항의 BTN2A1 작용제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 Vγ9+ γδ T세포 반응을 유도 또는 향상하는 방법.
제77항 내지 제79항 중 어느 한 항의 BTN2A1 작용제의 존재하에 γδ T세포 및 BTN2A1을 발현하는 세포를 배양하는 단계, 임의로, 대상체에게 활성화된 γδ T세포를 투여하는 단계를 포함하는, 시험관내 또는 생체외에서 Vγ9+ TCR을 발현하는 γδ T세포를 활성화하는 방법.
대상체에서 자가면역 질환, 이식 거부 또는 이식편대숙주병, 또는 이식편대종양효과를 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방, 또는 증상완화에 충분한 양으로 제77항 내지 제79항 중 어느 한 항의 BTN2A1 작용제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환, 이식 거부, 이식편대숙주병, 또는 이식편대종양효과의 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방, 또는 증상완화 방법.
대상체에서 암 또는 감염을 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방 또는 증상완화에 충분한 양으로 제77항 내지 제79항 중 어느 한 항의 BTN2A1 작용제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 감염의 예방, 치료, 진행 지연, 재발 예방 또는 증상완화 방법,