KR20220099895A - 질량분석법 기반의 알츠하이머 선별 검사용 혈장 바이오마커 패널 - Google Patents
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Abstract
본원은 혈액 시료에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 여부를 질량분석법으로 검출할 수 있는 바이오마커 패널을 개시한다. 본원에 따른 패널은 혈액을 이용하여 알츠하이머의 조기 진단에 필요한 뇌의 아밀로이드 베차 축적 정보를 제공할 수 있어 질환의 진행을 늦출 수 있어 환자의 삶의 질의 걔선은 물론 병이 심화됨에 따라 추가될 수 있는 사회적 및 경제적 비용의 감소에 기여할 수 있다.
Description
본원은 알츠하이머성 치매 원인물질인 아밀로이드 베타의 뇌축적을 질량 분석법으로 분석할 수 있는 혈액 바이오 마커에 관한 것이다.
뇌에 아밀로이드 베타가 축적되어 발생하는 대표적 질환으로 알츠하이머병 또는 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease, AD 또는 ADD)를 들 수 있다. ADD는 치매 중 가장 일반적인 형태로서, 대표적인 신경 퇴행성 질환이다. 우리나라에서는 65세 이상 치매 환자가 2024년에 100만 명을 넘어설 것으로 예측되며, 2015년 기준 치매 관리 비용은 약 13.2조원인 것으로 추산된다. 알츠하이머는 치매의 원인 중 가장 큰 비중을 차지하고 있는 질병이다. 알츠하이머의 치료를 위하여 여러 실험들이 진행되고 있지만, 아직까지는 FDA 승인을 받은 치료법은 없는 상황이다.
따라서 알츠하이머는 조기 진단으로 병을 빠르게 발견하고, 지속적으로 관리하여 질병의 진행을 늦추는 것이 중요하다.
알츠하이머의 현재 진단 방식은 인지 장애가 어느 정도 진행되었는지를 먼저 확인하고 그 인지 장애가 알츠하이머로 인한 것인지를 판별하는 과정으로 진행된다.
인지 장애의 경우 설문지 방식의 테스트로 주로 판별을 하는데, 그 설문지의 종류가 다양하면서도 기준이 통일되지는 않아 설문지에 따라서 다른 결과가 나올 가능성이 있다. 또한 인지 장애의 원인을 파악하기 위해서는 PET 촬영, MRI 촬영, 뇌척수액 분석, 유전자 검사 등이 실행되어야 하는데, 이러한 과정은 환자에게 침습적이거나 시간적 및 금전적인 부담이 크다.
나아가 알츠하이머 진단을 위해 사용되는 바이오마커로 Amyloid beta와 Tau 단백질이 있지만, 검사를 위해 검사 대상자의 뇌척수액(Cerebrospinal fluid)에서 해당 바이오마커의 정량을 한다. 뇌척수액은 요추천자라는 시술을 통해 요추부위에 바늘을 삽입하여 빼내어 검사에 사용되는데, 이 과정이 매우 침습적이기 때문에 알츠하이머 환자의 모니터링을 위한 검체로는 적합하지 않다.
혈액에서 Amyloid beta와 Tau 단백질을 정량하기에는 혈액 내에서 해당 바이오마커가 pg/ml 단위의 농도로 존재하기 때문에 항체를 사용한 Enrichment 과정이 필요한데, 이 과정은 정량 결과의 변동을 유발할 수 있다. 그리고 알츠하이머의 발병 원인은 노화, 유전적인 요인, 생활 패턴 등 복합적인데 한 가지의 바이오마커로는 이 복합성을 반영할 수가 없다.
나아가 알츠하이머로 인한 신경의 손상 진행도를 예측하는 기술이 개발된 사례는 없다.
따라서 알츠하이머의 조기 진단을 위해서는 비교적 간단한 검사가 주기적으로 실행될 수 있어야 환자들이 그만큼 자주 검사를 받고 질병을 찾아낼 가능성이 높기 때문에 현재 검사 방식보다는 간편하면서도 정확한 진단 마커 패널의 개발이 필요하다.
선행기술문헌
미국 특허출원 공개공보 2016-0327572
일본 특허출원 공개공보 2017-500562
본 발명은 비교적 덜 침습적인 방식으로 얻을 수 있는 시료로서 혈액을 사용하고, 다수의 바이오마커를 조합하여 아밀로이드 베타 축적 여부와 신경 손상의 진행도를 판별할 수 있는 질량 분석 기반의 바이오마커 패널을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 혈액에서 ADIPOQ (Adiponectin), APOA4 (Apolipoprotein A-IV), APOB (Apolipoprotein B-100), B2M (Beta-2-microglobulin), C9 (Complement component C9), CA1 (Carbonic anhydrase 1), CFB (Complement factor B), F13A1 (Coagulation factor XIII A chain), FGA (Fibrinogen alpha chain), MTDH (Protein LYRIC) 및 TF (Serotransferrin) 조합의 바이오마커 발현 수준을 질량분석법으로 측정하기 위한 물질을 포함하는 뇌의 아밀로이드 베타 축적 여부 판단용 바이오마커 패널 또는 조성물을 제고한다.
일 구현예에서 본원의 상기 바이오마커 조합은 APOE e4 유전자형을 추가로 포함하며, 상기 유전자형 분석 또는 검출에 필요한 물질을 포함할 수 있다.
일구현예에서 본원에 따른 마커의 분석에 사용되는 질량 분석법이 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 또는 비행시간 질량 분석법을 포함한다.
일 구현예에서 질량 분석법에 사용되는 모드는 선택 반응 모니터링(Selected Reaction Monitoring, SRM) 또는 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring, MRM)이다.
일 구현예에서 질량 분석법 모드는 MRM이고, 상기 MRM에 분석에 사용되는 상기 패널을 구성하는 각 단백질 별 펩타이드는 표 4와 같다.
다른 양태에서 본원은 아밀로이드베타 축적 여부 판단에 대한 정보를 제공하기 위해, 대상체로부터 분리된 혈액으로부터 제 1 항에 따른 바이오마커 조합의 각 바이오마커의 발현 수준을 질량분석법으로 측정하는 단계; 및 상기 측정 결과를 대조군으로 PET 영상을 통해 뇌에 아밀로이드 베타가 축적되지 않은 것으로 확인된 인지기능 정상군(cognitive normal control, CN)의 혈액시료의 해당 마커의 상응하는 측정 결과와 비교하여, 아밀로이드 베타 축적과 연관시키는 단계를 포함하는, 인비트로에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 여부 판단용 바이오마커 검출 방법을 제공한다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법의 바이오마커 조합은 APOE e4를 추가로 포함하는 상기 APOE e4는 유전자형을 분석하며, 상기 유전자형을 PCR 분석을 통해 수행될 수 있다.
일 구현예에서 상기 질량 분석법이 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 또는 비행시간 질량 분석법을 포함한다.
일 구현예에서 질량 분석법에 사용되는 모드는 선택 반응 모니터링(Selected Reaction Monitoring, SRM) 또는 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring, MRM)이다.
일 구현예에서 상기 질량 분석법 모드는 MRM이고, 상기 MRM에 분석에 사용되는 상기 패널을 구성하는 각 단백질 별 펩타이드는 표 4와 같다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법의 연관시키는 단계에서, 상기 대상체의 측정 결과 그 발현 수준이 상기 대조군에 측정된 발현 수준과 비교하여 증가 또는 감소하는 경우, 상기 대상체는 뇌에 아밀로이드 베타가 축적된 것으로 판단하며, 상기 증가하는 마커는 ADIPOQ, MTDH, B2M, C9, 및 APOB이고, 상기 감소하는 마커는 APOA4, CA1, CFB, F13A1, FGA, 및 TF이다.
또 다른 양태에서 본원은 표 7의 조합의 바이오마커 발현 수준을 질량분석법으로 측정하기 위한 물질을 포함하는 알츠하이머로 인한 신경의 손상 진행도 판단용 바이오마커 패널 또는 조성물을 제공한다.
신경손상정도 판단에 사용되는 질량분석법은 앞서 언급된 것 및 본원에 기재된 것이 적용된다.
본원에 따른 바이오마커 패널은 알츠하이머성 치매 원인물질인 아밀로이드 베타의 뇌 축적을 조기에 혈액에서 간편하고 신속하게 검출할 수 있다. 또한 본원에 따른 바이오마커 패널은 혈액을 이용하여 기존 진단 방식보다 간단하며 비용도 절감할 수 있다. 아울러 알츠하이머의 조기 진단을 통해 병이 심화됨에 따라 추가될 수 있는 사회적 및 경제적 비용 (환자의 관리, 병원비) 감소에 기여할 수 있다. 항체 (Antibody)를 사용하는 정량법과는 다르게 항체를 사용하지 않아서 정량 결과의 변동량이 비교적 적고 보다 경제적으로 정량을 할 수 있다. 다중반응검지법이 가능한 질량 분석 기기가 구비되어있는 병원이라면 본 기술을 사용하여 적은 변동량과 높은 재현성과 정확도로 혈액을 분석하여 알츠하이머의 진단이 가능할 것으로 예상된다.
도 1은 본원에 따른 바이오마커 패널 모델 제작을 위한 시료의 구성 및 모델 제작의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본원의 일 구현예에 따라 혈장 시료를 전처리 한 후에 6490 Triple Quadrupole 질량분석기를 사용하여 MRM (Multiple reaction monitoring) 질량 분석을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본원에 따른 바이오마커 후보군의 선정 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 본원에 따른 아밀로이드 베타 축적 여부를 판단할 수 있는 11개 단백질 마커 패널 (b, 11-protein), 상기 마커 패널과 APOE ε4 대립유전자 보유 여부의 조합 (a, final) 및 APOE ε4 대립유전자 보유 여부 단독 (c, APOE ε4 )의 세 종류 모델의 민감도 및 특이도를 나타내는 ROC ( Receiver Operator Characteristic)이다.
도 5는 도 4의 ROC 커브에서 모델의 임계값 (Classification threshold)이 0.5일 때의 정확성, 민감도 및 특이도를 막대그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 본원에서 알츠하이머의 진행에 따른 신경 손상 진행도 모니터링을 위한 바이오마커 패널 구성을 위해 AsymAD, ProdAD, ADD군에서 차별적 발현량을 나타내는 32개의 단백질에 대해서 Multinomial log-linear regression을 수행한 결과 Variable importance가 1보다 큰 21개 단백질의 Variable Importance를 나타낸다. 상기 단백질에 대해 Multinomial log-linear regression을 사용하여 다중마커패널을 제작하였다.
도 7은 본원에 따른 알츠하이머 진행에 따른 신경손상 정도를 판단할 수 있는 13개 단백질 마커 패널, 상기 마커패널과 K-MMSE score를 조합한 모델, APOE ε4 대립유전자 보유 여부 단독 및 K-MMSE score 패널의 AsymAD 환자군, ProdAD 환자군, ADD 환자군을 구분하는 정확도를 나타낸다.
도 8은 도 7의 13개 단백질 마커 패널과 K-MMSE score를 조합한 모델, APOE ε4 대립유전자 보유 여부 단독 및 K-MMSE score 패널의 AsymAD 환자군, ProdAD 환자군, ADD 환자군을 구분하는 민감도 및 특이도를 나타낸다.
도 2는 본원의 일 구현예에 따라 혈장 시료를 전처리 한 후에 6490 Triple Quadrupole 질량분석기를 사용하여 MRM (Multiple reaction monitoring) 질량 분석을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본원에 따른 바이오마커 후보군의 선정 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 본원에 따른 아밀로이드 베타 축적 여부를 판단할 수 있는 11개 단백질 마커 패널 (b, 11-protein), 상기 마커 패널과 APOE ε4 대립유전자 보유 여부의 조합 (a, final) 및 APOE ε4 대립유전자 보유 여부 단독 (c, APOE ε4 )의 세 종류 모델의 민감도 및 특이도를 나타내는 ROC ( Receiver Operator Characteristic)이다.
도 5는 도 4의 ROC 커브에서 모델의 임계값 (Classification threshold)이 0.5일 때의 정확성, 민감도 및 특이도를 막대그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 본원에서 알츠하이머의 진행에 따른 신경 손상 진행도 모니터링을 위한 바이오마커 패널 구성을 위해 AsymAD, ProdAD, ADD군에서 차별적 발현량을 나타내는 32개의 단백질에 대해서 Multinomial log-linear regression을 수행한 결과 Variable importance가 1보다 큰 21개 단백질의 Variable Importance를 나타낸다. 상기 단백질에 대해 Multinomial log-linear regression을 사용하여 다중마커패널을 제작하였다.
도 7은 본원에 따른 알츠하이머 진행에 따른 신경손상 정도를 판단할 수 있는 13개 단백질 마커 패널, 상기 마커패널과 K-MMSE score를 조합한 모델, APOE ε4 대립유전자 보유 여부 단독 및 K-MMSE score 패널의 AsymAD 환자군, ProdAD 환자군, ADD 환자군을 구분하는 정확도를 나타낸다.
도 8은 도 7의 13개 단백질 마커 패널과 K-MMSE score를 조합한 모델, APOE ε4 대립유전자 보유 여부 단독 및 K-MMSE score 패널의 AsymAD 환자군, ProdAD 환자군, ADD 환자군을 구분하는 민감도 및 특이도를 나타낸다.
본원에서는 알츠하이머 (Alzheimer’disease) 발생의 중요한 인자인 아밀로이드 베타의 양성 여부와 알츠하이머의 진행도를 감별할 수 있는 혈액 바이오마커 패널을 개발하였다.
한 양태에서 본원은 혈액시료에서 ADIPOQ (Adiponectin), APOA4 (Apolipoprotein A-IV), APOB (Apolipoprotein B-100), B2M (Beta-2-microglobulin), C9 (Complement component C9), CA1 (Carbonic anhydrase 1), CFB (Complement factor B), F13A1 (Coagulation factor XIII A chain), FGA (Fibrinogen alpha chain), MTDH (Protein LYRIC) 및 TF (Serotransferrin) 조합의 뇌의 아밀로이드 베타 축적 여부 판단용 바이오마커 조합에 관한 것이다.
본원의 뇌의 아밀로이드 베타 플라크 축적 여부는 알츠하이머 질환과 관련된 것이다. 알츠하이머는 일반적으로 뇌의 아밀로이드 베타 플라크 (plaque)의 축적이라는 특징을 가졌으며, 인지 장애의 진행도에 따라서 무증상 알츠하이머 (Asymptomatic Alzheimer’disease), 전구 단계의 알츠하이머 (Prodromal Alzheimer’diseae), 치매를 동반한 알츠하이머 (Alzheimer’disease dementia)로 나눌 수 있다.
본원에서는 정상군. 무증상 알츠하이머 환자군, 전구 단계의 알츠하이머 환자군, 치매를 동반한 알츠하이머 환자군의 혈장 시료를 질량분석법으로 분석하여 뇌의 아밀로이드 베타 축적을 판단할 수 있는 바이오마커 패널 및 신경손상 정도를 판단할 수 있는 바이오마커 패널을 개발하였다.
본원에 따른 바이오마커 패널은 상기 마커를 인비트로 또는 인비보에서 검출할 수 있는 검출용 물질을 포함하는 조성물, 키트의 형태, 또는 상기 마커 자체를 포함하는 조성물의 형태, 또는 상기 마커를 이용한 베타 아밀로이드 축적 검출 방법 등의 형태로 구현될 수 있다.
본원에서 바이오마커 패널은 패널에 포함되는 각 마커의 검출용 물질을 포함하는 바이오마커 패널 또는 바이오마커 패널 조성물일 수 있다.
현재까지 뇌의 아밀로이드 베타 플라크의 축적의 검출은 알츠하이머성 치매환자의 사후 뇌 조직검사에 의해 확인되었다. 최근 뇌영상으로 뇌 아밀로이드베타의 축적을 확인할 수 있는 PIB-PET 등의 기술이 개발되었으나 이는 매우 고가의 검사이고 일부 대학병원에서만 시행할 수 있는 고가의 장비이며 환자에게도 여러 불편을 준다. 따라서 뇌의 아밀로이드 베타의 축적을 확인할 수 있는 본원에 따른 혈액 바이오마커는 그 중요성이 매우 크다.
뇌 아밀로이드 베타의 축적은 치매나 건망증 등의 임상적 증상이 나타나기 15~20년 전부터 시작되므로 임상적 증상이 없거나 또는 경미한 임상적 증상을 나타내는 환자의 혈액검사를 통해 뇌 아밀로이드 베타 축적여부를 확인할 수 있다면 알츠하이머 치매를 조기 진단할 수 있고 조기에 그 진행을 늦추거나 막을 수 있다. 또한 뇌 아밀로이드 베타가 축적되지 않은 알츠하이머병 환자로 확인할 수 있어, 이러한 환자에 대한 치료전략을 달리 할 수 있다.
또한 본원에 따른 마커를 이용한 뇌의 베타 아밀로이드 축적 검출은 또한 베타 아밀로이드가 축적되어 발생되는 질환의 진단에 또한 사용될 수 있다.
구체적으로, 뇌에 베타 아밀로이드가 축적되어 발생되는 다양한 질환이 알려져 있고(Head, E., and Lott, I. T. (2004) Down syndrome and beta-amyloid deposition. Curr Opin Neurol 17; Primavera et al., (1999) Brain Accumulation of Amyloid-beta in Non-Alzheimer Neurodegeneration. J Alzheimers Dis; Masliah et al., (2001) beta-amyloid peptides enhance alpha-synuclein accumulation and neuronal deficits in a transgenic mouse model linking Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci), 따라서 본원에 따른 마커는 또한 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 다양한 질환의 진단, 검출 등에 사용될 수 있다.
일 구현예에서 이러한 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환은 예를 들면 알츠하이머병, 파킨슨병 치매, 루이소체치매, 헌팅톤병 치매, 또는 전임상 알츠하이머병, 다운 신드롬, 또는 인지장애를 포함한다.
본원에서 “인지장애”는 신경 퇴행성 질환을 일컫는 것으로 예를 들면 알츠하이머(AD : Alzheimer Disease)성 치매, 파킨슨병 치매, 루이소체치매 또는 헌팅톤병 치매, 알츠하이머성 치매증상(ADD) 보유군, 치매로 진행되기 전단계인 약한 인지기능 장애, 즉 경도 인지장애(MCI : Mild Cognitive Impairment)를 포함하는 것으로, 이런 의미에서 치매 또는 비치매 환자군을 모두 포함할 수 있다. 이러한 인지장애의 중증도는 MMSE(Mini mental state examination, 2006_Benson et al., Journal of clinical Psychiatry, 2008_O’et al., Arch Neurol) 스코어 등과 같은 방법으로 분류될 수 있다.
인지 장애의 진행도에 따라서 인지기능 정상군에 속하는 전임상 또는 무증상 알츠하이머 (Asymptomatic Alzheimer’disease), 경도 인지 장애의 전구 단계의 알츠하이머 (Prodromal Alzheimer’diseae), 및 치매를 동반한 알츠하이머로 나눌 수 있다.
본원에서 “인지기능 정상군”은 상술한 MMSE 등의 검사를 통해 인지기능이 정상으로 판별된 군을 의미한다. 인지기능이 정상인 경우라도, 인지기능 저하 없고 뇌 아밀로이드 베타 축적이 있는 정상인을 포함한다. 베타 아밀로이드가 뇌에 축적이 되어 있는 경우에는 경도 인지장애를 거쳐 치매로 진행될 수 있기 때문에, 인지기능 정상군에서의 베타 아밀로이드 축적 여부를 판별하는 것은 치매의 조기 발견에 매우 중요하다.
본원에서 “경도인지 장애군”은 인지기능 저하가 있지만 일상생활이 가능한 치매의 전단계로서 뇌 아밀로이드 베타 축적이 없는 환자 및 베타 축적이 있는 환자로서 인지기능 저하가 있지만 일상생활이 가능한 치매의 전단계를 포함한다.
이런 측면에서 인지기능의 저하 정도에 따라, 인지기능 정상군, 경도 인지장애군 및 알츠하이머성 치매증상(ADD) 보유군을 포함하는 치매군의 순서로 인지기능의 저하 정도가 심화된다.
본원에서 “알츠하이머성 치매”또는 “알츠하이머 병”은 신경 퇴행성 뇌질환으로 기억력을 포함한 인지기능의 약화가 점진적으로 진행되는 병이다. 이는 인지기능 정상군에 속하는 전임상 또는 무증상 알츠하이머, 경도 인지 장애를 갖는 전구 단계의 알츠하이머 및 치매로 진행된 알츠하이머를 포함한다. 대다수의 알츠하이머병 환자의 뇌에는 신경반(혹은 노인반) 또는 신경섬유다발이 생성되는데, 신경반(혹은 노인반)은 베타 아밀로이드 단백질의 침착과 신경섬유다발은 타우 단백질(tau protein)의 과인산화, 염증반응, 산화적 손상 때문인 것으로 알려져 있다. 상기 전임상 알츠하이머병은 임상적 소견은 보이지 않지만 뇌의 아밀로이드 플라크 침착이 나타나는 단계를 말한다.
아밀로이드 베타는 뇌에 침작되어 플라크를 형성한다. 아밀로이드 베타 플라크는 아밀로이드 베타를 포함하는 불용성 섬유성 단백질 응집체이며, 주성분은 A-베타40 또는 A-베타42 이다. 일 구현예에서는 상기 아밀로이드 플라크는 세포 내, 세포 표면에, 및/또는 세포 사이의 공간에 존재하는 것일 수 있다. 특히 신경조직의 세포 사이의 공간에 존재하는 것이며, 알츠하이머 치매 진단의 표지 물질로 사용되며, 플라크의 축적 정도에 따른 치매 진단은 개시된 바를 참고할 수 있다(Mawuenyega et al., Science, 2010_Querfurth and LaFerla, The New England journal of medicine). 문맥에 따른 아밀로이드 베타 플라크를 아밀로이드 베타로 칭할 수 있으며, 이는 당업자가 용이하게 판단할 수 있을 것이다.
본원에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본원에서 “조기 진단”은 경도인지장애, 또는 임상증상이 나타나기 전인 전임상(preclinical) 단계에서 진단하는 것을 포함한다.
본 발명에서 바이오마커 패널에 포함된 마커는 아밀로이드 베타 플라크의 축적과 함께, 혈중 농도가 변화하며 본원에 따른 마커 중 ADIPOQ, MTDH, B2M, C9, APOB은 아밀로이드 베타 플라크의 축적에 따라 혈중 농도가 증가하고, APOA4, CA1, CFB, F13A1, FGA, 및 TF는 발현량이 감소한다. 상기 각 단백질의 아미노산 및 유전자 서열은 Uniprot 에서 검색이 가능하다.
본 명세서 내 용어, "바이오마커 패널"은 췌장암 진단을 위한 바이오마커의 임의의 조합을 사용하여 구성된 것이다. 이러한 조합은 전체 세트, 또는 그의 임의의 서브세트 또는 서브조합을 의미할 수 있다.
본원에 따른 바이오마커 패널은 ApoE 유전자 형 마커를 추가로 포함할 수 있다.
ApoE 유전자는 ApoE 2, ApoE 3, ApoE 4의 세가지 유전자 형이 있는데 ApoE 4를 가지고 있는 사람이 AD에 걸릴 확률이 안 가지고 있는 사람에 비해서 매우 높음이 이미 널리 알려져 있는 리스크 인자이다. ApoE (Apolipoprotein E)는 E2(cys112, cys158), E3(cys112, arg158), 및 E4(arg112, arg158)라고 불리는 세 종류의 대립형질이 존재하여 한 개체의 유전체형은 E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4, 또는 E4/E4 형으로 존재한다. 이중 E4 대립형질은 인구의 약 20% 정도에서 발견되며, 알츠하이머 치매 발병 위험도를 증가시키는 것으로 알려졌다. 본원에 따르면 ApoE 유전자형 마커를 본원에 따른 마커에 추가하여 사용하는 경우 특이성과 민감도가 향상될 수 있다. ApoE 유전자형의 검출은 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 본원에 따른 일 구현예에서는 대립유전자 특이적 프라이머를 이용한 PCR 방법이 사용될 수 있다.
본원에 따른 마커는 특히 혈액 시료에서 검출된다. 혈액시료는 치매의 진단에 사용되는 뇌 척수액과 같은 시료와 비교하여, 매우 용이하게 얻을 수 있는 것으로, 비용의 절감은 물론 편리성이 매우 증대된다. 본원에 따른 마커가 사용되는 검체는 일 구현예에서는 혈장이 사용된다. 본원에 사용되는 검체는, 비교 분석을 위해, 진단 또는 검출이 필요한 검사 대상자의 검체는 물론, 정상 대조군, 특정 질환을 갖는 대조군 유래의 검체가 또한 사용될 수 있다.
본원에서 대조군은 인지기능 정상군으로 뇌의 아밀로이드베타 축적이 없는 대상체이다.
본원에 따른 일 구현예에서는 질량분석법(Mass spectrometry)를 이용하여 마커를 검출할 수 있으며, 이는 검체로부터 단백질 또는 펩타이드를 분리 한 후 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방식대로 분석될 수 있으며, 또한 예를 들면 (Kim, et al. 2010 J Proteome Res. 9: 689-99; Anderson, L et al. 2006. Mol Cell Proteomics 5: 573-88.)를 참조할 수 있다. 한 구현예에서는 예를 들면 Triple Quadrupole LC-MS/MS, QTRAP 등을 이용한 다중반응모니터링(Multiple reaction monitoring, MRM) 기술이 사용된다.
본원에 사용되는 질량분석법은 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 및/또는 비행시간 질량 분석법을 포함할 수 있다. 이때 사용되는 질량 분석법 모드는, 예를 들어 선택 반응 모니터링(Selected Reaction Monitoring, SRM), 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring, MRM) 일 수 있다.
본원에 따른 일 구현 예에서는 특히 이온을 4개의 전극주로 구성되는 사중 양극에 유도하여 질량/전하(m/z) 비율에 따라 분석하는 방식의 예를 들면 Triple Quadrupole (Q1, Q2, Q3) 질량분석기를 이용한 다중반응모니터링(Multiple reaction monitoring, MRM) 모드가 사용된다. MRM 질량분석법의 원리는 선정된 타겟 단백질들을 모두 펩타이드로 가수분해 시킨 후에, 각 타겟 단백질들에 특이적인 mass to charge (m/z)를 가지는 펩타이드(precursor ion, MS1)를 선택한다. 이 특이적인 펩타이드를 충돌시켰을 때(Quadruple 2, Q2), 발생하는 파편들 중에서 특징적인 m/z를 가지는 특이적 질량을 가진 단편(fragmentation ion, MS2)을 선택한다. MS1/MS2에서 각각 얻어지는 precursor ion/fragment ion의 쌍을 타겟 단백질의 특이적 transition(타겟 단백질의 특이적 질량 지문)이라 명명하며, 이 transition들을 모든 타겟 단백질(300 단백질 이상)에 대해서 측정하면 시료에 있는 모든 타겟 단백질의 양을 동시에 상대 혹은 절대 정량할 수 있다. 상대 혹은 절대 정량을 위해서는 SIS (동위원소 치환된 동일 아미노산 순서의) 펩타이드를 표준 물질로 사용하는데, 측정 시료의 input 표준 물질 (SIS 펩타이드) 양을 알고 있기 때문에 타겟 펩타이드 양을 비례적으로 계산할 수 있는 원리이다. MS2를 통과한 transition은 검출기에서 digital signal로 전환되어 peak chromatogram으로 전환되며 peak 면적을 계산하여 상대 및 절대 정량 분석을 수행할 수 있게 된다. 이러한 원리로 MRM은 목적하는 분석 대상만을 높은 민감도로 선택적으로 검출 및 정량이 가능하다.
MRM 분석에 있어서 분석 대상 펩타이드는 분석 대상의 전체 단백질 서열 중, MRM 분석에 사용되는 일부 서열로, 단백질의 전체 서열 중 일정 조건 예를 들면 분석 대상 단백질에 대한 대표성, 변형가능 여부, MRM 분석에 적합한 길이 등과 같은 조건을 만족하는 최적인 대상 펩타이드가 선정될 수 있다. 예를 들면 아미노산의 길이가 6 - 30개의 길이를 가지는 펩타이드를 선별한다. 상기 범위보다 너무 길이가 짧으면 선택성이 떨어지고, 너무 길면 민감도가 떨어지게 된다. 아울러 메티오닌, 시스테인, 트립토판은 산화와 같이 화학적 변형이 쉬워, 선정 시에 제외시킨다. 본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 바이오마커를 MRM으로 분석할 때 사용되는 대상 펩타이드는 표 4에 기재되어 있다.
다른 구현예에서는 펩타이드를 근간으로 하는 MRM 키트가 제공되며, MRM 방식에 대하여는 앞서 설명한 바와 같다. MRM 방법은 특정 단백질을 선택적으로 인식하는 펩타이드를 이용하는 것으로, 온도, 습도 등 환경에 민감한 항체를 이용하는 기존의 방법과 비교하여, 보다 안정적으로 생체시료에서 마커를 검출할 수 있다. 예를 들면 펩타이드는 상술한 바와 같이 기재된 것이 사용될 수 있다.
다른 구현예에서 본원은 아밀로이드베타 축적 여부 판단에 대한 정보를 제공하기 위해, 대상체로부터 분리된 혈액으로부터 제 1 항에 따른 바이오마커 패널의 각 바이오마커의 발현 수준을 질량분석법으로 측정하는 단계; 및 상기 측정 결과를 대조군 즉, PET 영상을 통해 뇌에 아밀로이드 베타가 축적되지 않은 것으로 확인된 인지기능 정상군 (cognitive normal control, CN)의 혈장 시료의 해당 마커의 상응하는 측정 결과와 비교하여, 아밀로이드 베타 축적과 연관시키는 단계를 포함하는, 인비트로에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 여부 판단용 바이오마커 검출 방법을 제공한다.
본원에서 대상체는 인지기능 정상군, 경도 인지 장애군, 치매 환자군을 포함하는 뇌의 베타 아밀로이드 축적이 필요한 사람을 포함한다.
본원에 따른 방법에 사용되는 질량 분석법, 바이오마커 패널은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실험방법 및 재료
1. 본원에 사용된 혈액 시료가 유래된 환자의 질환 정보
본원에서는 1) 아밀로이드 베타 축적의 여부, 및 2) 알츠하이머의 진행에 따른 신경 손상 진행도에 따라 발현 차이를 보이는 단백질 후보군 선정을 위해 정상군 46례, Asymptomatic Alzheimer’disease (AsymAD) 환자 39례, Prodromal Alzheimer’disease (ProdAD) 50례, Alzheimer’disease dementia (ADD) 50례를 사용하였다. 특히 AsymAD 환자의 혈액 시료를 분석에 사용함으로써 무증상 알츠하이머 환자의 진단에 본 발명의 결과물이 사용될 수 있도록 하였다. 여기에서 사용된 알츠하이머 환자 군에 해당되는 AsymAD, ProdAD, ADD 환자 군은 PET 영상을 통해 뇌에 아밀로이드 베타가 축적된 것으로 확인된 사람들이다.
2. 혈액시료 전처리
2-1. 혈장 시료의 준비
상기 시료에서 1)아밀로이드 베타 축적의 경우 정상군은 음성, 나머지 3개의 집단은 양성으로 구분하여 실험을 진행하였다. 전남대학교병원과 조선대학교병원에서 혈장 시료를 모았으며, 혈장 시료는 EDTA 튜브에 수집되었다. EDTA 튜브에 수집된 혈장 시료는 분주된 후 즉시 동결하여 보관하였다.
2-2. 혈장 시료의 Depletion
혈액 내에 낮은 농도로 존재하는 알츠하이머 바이오마커의 발굴을 위해 각 개별 시료당 44μL의 시료를 취하여 depletion을 진행하였다. Depletion의 대상은 혈액 단백질 중에서 많은 비율을 차지하고 있는 6종 (albumin, IgG, IgA, haptoglobin, transferrin, alpha-1-antitrypsin)의 단백질이며, 6종 단백질의 제거 후 남은 Low-abundant 단백질들의 분석을 진행하였다.
2-3. 혈장 단백질의 펩타이드화
Depletion 후 혈장 시료를 3K filter를 사용하여 농축하였고, 농축한 시료는 Bicinchoninic acid (BCA) assay를 통해 농도를 측정하였다. BCA assay로 측정한 농도 값을 바탕으로 100μg의 단백질이 포함된 시료를 취한 다음, 최종 농도 0.1% RapiGest, 10mM DTT 처리를 하고 60℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 이후 최종 농도 20mM IAA 처리를 하고 상온에서 30분 동안 빛이 들지 않게 하여 인큐베이션하였다. Trypsin과 단백질의 비율이 1:50이 되도록 계산하여 Trypsin 처리한 후 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. Formic acid를 최종 농도 1%로 처리하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션을 한 시료는 4℃에서 60분 동안 15000rpm으로 원심분리 후 상층액 90μL을 취하여 Desalting 과정을 수행하였다.
2-4. 혈장 단백질의 Desalting
OASIS column에 100% Methanol 1mL을 흘려줘서 Activation을 수행하고, 100% Acetonitrile 1mL을 세 번, 0.1% Formic acid in distilled water 1mL를 다섯 번 흘려줘서 Equilibration을 수행하였다. 펩타이드 시료의 Loading은 두 번 시행하였고, 0.1% Formic acid in distilled water 1mL를 세 번 흘려줘서 펩타이드의 Washing을 수행하였다. 0.1% Formic acid in 40% acetonitrile 0.5mL과 0.1% Formic acid in 60% acetonitrile 0.5mL을 각각 한 번씩 흘려줘서 펩타이드의 Elution을 수행하였다. Elution을 수행한 펩타이드 시료는 냉동 후 Speed-vac으로 건조하였다. 건조된 펩타이드 시료는 최종 농도가 0.25μg/μL이 되도록 0.1% Formic acid with distilled water로 녹인 후, 15000rpm에서 60분 동안 원심분리하고, 상층액만을 취하여 분석을 수행하였다.
3. 다중반응검지법 분석 (Multiple reaction monitoring-mass spectrometry)
3-1 원리
6490 Triple Quadrupole LC-MS/MS (Agilent, USA) 분석은 한 번의 미량의 시료를 주입하는 것으로 60분의 분석 시간동안 최대 300개의 단백질을 정량할 수 있는 기술이다. 시료의 전처리 과정을 통해 단백질을 펩타이드 단위로 단편화하여 이온화시킨 후 질량분석기에 주입한다. 이온화된 펩타이드는 Triple quadrupole mass spectrometry에 주입되면 Q1, Q2, 및 Q3을 거치면서 특정 질량값을 가진 이온이 정량된다. Q1에서는 특정 질량값을 가진 펩타이드 단백질이 Mass filter 기능에 의해 선별되어 Q2로 전달되고, Q2에서는 전달받은 펩타이드 이온에 Collision energy를 가하여 fragmentation을 하여 Product ion으로 만든다. 이를 Q3에 전달하면 Q3에서는 특정 질량값을 가진 Product ion을 Mass filter 기능으로 선별한다. 다중마커패널을 구성하고 있는 단백질의 종류가 다수이고, 분석해야 하는 시료의 수도 총 185례로 비교적 많기 때문에 한 번의 분석으로 대량의 단백질을 정량할 수 있는 MRM-MS 기법을 사용하였다.
3-2 SIS 펩타이드 스파이킹 (peptide spiking)
단백질 바이오마커의 상대 정량을 위해 Stable isotope standard (SIS) 펩타이드를 시료에 넣고 정량을 진행하였다. 연구에 사용된 SIS 펩타이드는 C-termini의 Arginine 또는 Lysine에 방서성 동위원소로 표지된 펩타이드이다. SIS 펩타이드는 혈액 내의 단백질 바이오마커와는 화학적 특징은 같아서 같은 Retention time에 두 종류의 펩타이드가 분석이 되고, 질량값에는 차이가 있어서 Peak integration을 할 때 두 펩타이드의 Peak를 각각 얻을 수 있다. 측정 시료의 SIS 펩타이드의 양은 이미 알고 있기 때문에 타겟 펩타이드의 양을 비례적으로 계산할 수 있다. 두 펩타이드의 Peak intensitiy의 비율을 (혈액 단백질의 펩타이드 Intensity)/(SIS 펩타이드 Intensity)로 계산하여 상대 정량을 하면 단백질 정량 시에 생길 수 있는 감도의 차이 등을 보정할 수 있다.
3-3. MRM 분석
상기와 같이 혈장 시료를 전처리 한 후에 6490 Triple Quadrupole 질량분석기를 사용하여 Multiple reaction monitoring-mass spectrometry를 시행하였다 (도 1 및 도 2 참조). 기기로 투입된 시료는 ACN gradient는 3%에서 40%로 증가시키면서 52분동안 분획되었고, Q1에서 특정 질량값을 가진 peptide ion을 선별하여 Q2에서 Product ion으로 Fragmentation 했다. 이후 Q3에서 특정 질량값을 가진 Product ion을 선별하였다. Q3을 통과한 ion은 Detector에서 디지털 신호로 전환되고, 이 신호는 Peak chromatogram으로 확인할 수 있다. 분석 후 나온 Raw data는 Skyline을 사용하여 Peak integration을 통해 면적을 분석해 상대 정량을 진행하였다.
실시예 1. 본원에 따른 바이오마커 후보군 선정
1-1. 최초 마커 후보군 선정
바이오마커 후보군 선정 과정은 도 3에 나타냈다. 알츠하이머와 관련된 마커 후보군을 선정하기 위해 1) US Food and Drug Administration (FDA) 승인 바이오마커 리스트, Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) database (https://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfCLIA%20/search.cfm)의 Laboratory developed tests (LDT), Electronic Code of Federal Regulations (eCFR) (https://www.ecfr.gov/cgibin/ECFR?page=browse)의 제21편 (Title 21), Lab Tests Online (https://labtestsonline.org/tests-index) 등의 source로부터 얻은 바이오마커 리스트 2) 알츠하이머 코호트 연구 논문(Johnson, E. C. B. et al., Nat Med, 2020 April; 26(5):769-780)에서 2개의 뇌척수액 알츠하이머 코호트에서 발현량의 차이를 보인 타겟 3) 41편의 알츠하이머 관련 연구 논문들에서 언급된 타겟들을 확인하였다. 1)의 리스트에서 446개, 2)의 리스트에서 184개, 3)의 리스트에서 114개의 단백질을 선정해서 종합하여 644개의 단백질이 마커 후보군으로 선정되었다.
1-2. 검출 가능한 타겟 후보군 선정
상기 644개의 단백질 후보 중 질량분석기에서 검출되는 후보를 선정하기 위해서 National Institute of Standards and Technology (NIST), PeptideAtlas, SWATHatlas의 Spectral library를 사용하여 필터링을 하였다. 필터링을 할 때 펩타이드의 아미노산 개수는 6-30개가 되도록 지정하였으며, Skyline 프로그램을 사용하여 필터링을 진행하였다. 실제 질량분석기에서 검출이 가능한 타겟을 선정해야 하기 때문에, 이를 위하여 상기 기술된 정상군 혈장 46례, Asymptomatic Alzheimer’disease (AsymAD) 환자군 혈장 39례, Prodromal Alzheimer’disease (ProdAD) 환자군 혈장 50례, Alzheimer’disease dementia (ADD) 환자군 혈장 50례에서 만들어진 Pooling 시료를 이용해 상기 기술된 바와 같이 MRM 분석을 진행하였다. MRM 분석을 통해 피크의 강도가 800 이상인지, 관찰된 피크가 예측된 단백질이 맞을 확률을 뜻하는 Dot product(dotp)라는 점수가 0.8 이상인지, 피크가 예측된 Retention time의 앞뒤로 5분 범위 안으로 검출이 되었는지 확인하였다. 그 결과 단백질 431개와 펩타이드 732개가 검출 가능한 타겟 후보군으로 선정되었다.
1-3. 개별 시료 MRM 분석을 위한 타겟 후보군 선정
상기 431개의 단백질과 732개의 펩타이드에 해당되는 SIS 펩타이드를 사용하여 정상군 혈장 46례, Asymptomatic Alzheimer’disease (AsymAD) 환자군 혈장 39례, Prodromal Alzheimer’disease (ProdAD) 환자군 혈장 50례, Alzheimer’disease dementia (ADD) 환자군 혈장 50례에서 만들어진 Pooling 시료에 대해 3회 반복으로 MRM 상대정량 분석을 시행하였다. MRM 상대정량 분석을 통해 SIS 펩타이드와 Endogenous(내생) 펩타이드의 Retention time과 Product ion의 강도 패턴 (Intensity pattern)을 확인하고, Endogenous 펩타이드 이외의 다른 펩타이드에 의한 Signal 간섭 (Interference) 현상을 보이는지를 확인했다. Signal interference 현상의 확인은 AuDIT (Automated detection of inaccurate and imprecise transitions) 프로그램을 사용하였고, 이 프로그램을 통해 Endogenous 펩타이드와 SIS 펩타이드의 피크 면적 값이 반복 측정 시 일정하게 검출되는지(CV threshold : 0.3)와 함께, Endogenous 펩타이드와 SIS 펩타이드의 상대적인 생성이온 강도(P-value threshold : 0.05)를 확인하였다.
그 결과 Signal interference 현상 없이 정량이 가능한 159개의 단백질과 159개의 펩타이드가 선정되었고, 이 타겟들을 알츠하이머 개별 시료 MRM 분석에 사용하였다.
실시예 2. 바이오마커 후보군 분석
2-1. 알츠하이머 개별 시료 MRM 분석
알츠하이머 개별 시료는 정상군 혈장 46례, Asymptomatic Alzheimer’disease (AsymAD) 환자군 혈장 39례, Prodromal Alzheimer’disease (ProdAD) 환자군 혈장 50례, Alzheimer’disease dementia (ADD) 환자군 혈장 50례로 구성되었다. 185례의 시료는 상기 기술된 바와 같이 시료의 전처리 과정과 질량분석기 주입까지 무작위 배치(Randomization batch)를 통해 정한 순서대로 실험을 수행하였다. 혈장 시료를 전처리 한 후에 6490 Triple Quadrupole 질량분석기를 사용하여 159개의 단백질과 159개의 펩타이드에 대해 Multiple reaction monitoring-mass spectrometry를 시행하였다. MRM 분석은 상기 기술된 바와 같이 같이 수행하였다. 실시예 1의 159개의 단백질과 159개의 펩타이드에 대한 Peak area 값은 Endogenous 펩타이드의 Peak area 값을 이에 대응하는 SIS 펩타이드의 Peak area 값으로 나누어서 Normalization 하여 Data를 준비하였다.
2-2. 데이터 분석을 위한 타겟 선정
상기 159개의 단백질과 159개의 펩타이드 중에서 정량값이 정규 분포를 이루고 있는 타겟만을 이후 데이터 분석에 사용하기 위해서 정량 분석 데이터를 log10(x) 값으로 변환한 후 왜도(Skewness) 값을 계산하였다. Skewness의 값은 R의 e1071 package (version 1.7-3)을 사용하여 계산하였다. Skewness의 값이 -1.5에서 1.5 사이인 타겟만을 선정한 결과, 119개의 단백질과 119개의 펩타이드가 기준을 통과하였고, 해당 타겟들을 대상으로 데이터 분석을 수행하였다. 119개의 타겟은 표 1에 상세히 나타냈다.
[표 1]
실시예 3. 본원에 따른 바이오마커 패널 구성
상기 실시예 2에서 선택된 정량한 단백질은 1) 아밀로이드 베타 축적에 따라 차별적 발현량을 보이는 단백질 및 2) 알츠하이머가 진행됨에 따라 차별적 발현량을 보이는 단백질 군을 각각 선정하여 머신러닝 기법 중 하나인 Logistic regression 통계 분석 프로그램으로 R을 사용했으며, caret package (Version 6.0-86)의 ‘glm’function을 사용해서 Logistic regression을 사용하여 두 종류의 다중마커패널을 제작하였다. 두 종류의 다중마커패널은 각각 아밀로이드 베타 축적 여부 구분 및 알츠하이머 진행에 따른 신경 손상의 진행도를 판별하는 역할을 수행한다. 알츠하이머의 경우 발병 요인이 노화, 유전적인 문제, 생활 습관 등 복합적이기 때문에 이를 단일의 바이오마커로 나타내기에는 적합하지 않다고 판단하여 다수의 단백질을 조합해서 진단 패널을 제작하였다.
3-1. 아밀로이드 베타 축적의 여부를 구분하기 위한 바이오마커 패널 구성
본원 바이오마커 패널 개발에 사용된 시료 구성은 표 2에 나타냈다. 상기 표 1의 총 119개의 단백질 정량 데이터에 대해 통계분석(Student’t-test)을 수행하여 아밀로이드 베타 축적 여부에 따른 발현량 차이를 보이는 단백질을 선정하였다. 그 결과 18개의 단백질이 아밀로이드 베타 축적 여부에 따라 다른 발현량 차이를 보였다. 이에 해당하는 18개의 단백질은 표 3에 나타낸 것과 같이 MTDH, ADIPOQ, B2M, C9, APOB, FGA, TF, IL5, C8A, RBP4, CFB, SERPINA4, F13B, PON1, IGFBP3, APOA4,
CA1, F13A1이다.
[표 2]
[표 3]
표 3의 아밀로이드 베타 축적 여부에 따라 발현량 차이를 보이는 단백질로부터 본원에 따른 마커 패널을 구성하는 타겟은 Recursive feature elimination (RFE) 방식을 사용했다. 패널 제작 시 학습의 과적합(Overfitting)을 막기 위하여 Nested cross validation 방식으로 교차 검증을 수행하였다. Nested cross validation의 Inner fold는 3 folds로, Outer fold는 5 folds로 설정하였으며, Inner fold는 Round 수를 10회로, Outer fold는 Repeat 수를 10회로 지정하여 수행하였다.
아밀로이드 베타 축적의 여부를 구분하는 모델 생성 결과 11개의 펩타이드로 이루어진 다중 마커 패널이 구축되었으며, 여기에 APOE ε4 대립유전자 보유 여부도 패널의 Feature로 포함시켜서 구분력을 향상시켰다. 패널을 구성하는 11개의 단백질 마커는 ADIPOQ, APOA4, APOB, B2M, C9, CA1, CFB, F13A1, FGA, MTDH, TF이며, 표 4에 마커 (아밀로이드 축적 판단)를 구성하는 단백질 및 상응하는 펩타이드를 기재하였다.
[표 4]
상기 표 4의 패널에서 1) APOE ε4 대립유전자 보유 여부의 단독 모델 성능 결과는 Area under the curve (AUC) 0.679, 민감도 63.3%, 특이도 80.4%, 정확도 67.6% 이고, 2) 11개의 단백질 마커로 구성된 다중마커패널 모델의 성능 결과는 AUC 0.835, 민감도 73.7%, 특이도 81.3%, 정확도 75.9% 이고; 3) 11개의 단백질 마커와 APOE ε4 대립유전자 보유 여부를 조합한 다중마커패널 모델의 성능 결과는 AUC 0.860, 민감도 80.7%, 특이도 79.2%, 정확도 80.1% 인 것으로 나타났다. (도 4 및 도 5 참조).
상기 세 종류 모델에서 APOE ε4 대립유전자 보유 여부의 단독 성능과 11개의 단백질 마커로 구성된 다중마커패널, 11개의 단백질 마커와 APOE ε4 대립유전자 보유 여부를 조합한 다중마커패널의 성능을 비교한 결과, 11개의 단백질 마커로 구성된 다중마커패널의 AUC 값과 민감도, 정확도가 APOE ε4 대립유전자 보유 여부로 아밀로이드 베타 축적의 여부를 구분했을 때의 AUC 값과 민감도, 정확도보다 높은 것으로 확인되었으며, 11개의 단백질 마커로 구성된 다중마커패널에 APOE ε4대립유전자 보유 여부를 추가로 조합한 결과 AUC 값과 민감도, 정확도가 향상된 사실을 확인하였다. (도 4 및 도 5 참조).
3-2. 알츠하이머의 진행에 따른 신경 손상 진행도 모니터링을 위한 바이오마커 패널 구성
바이오마커 패널 개발에 사용된 시료 구성은 상기 설명한 바와 같다. 총 119개의 단백질 정량 데이터에 대해 통계 분석을 진행한 결과 32개의 단백질이 AsymAD (Asymptomatic Alzheimer’diseas, 무증상 알츠하이머), ProdAD (Prodromal Alzheimer’disease, 전구기 알츠하이머), ADD(Alzheimer’disease dementia, 알츠하이머 치매) 군에서 차별적 발현량을 보였다. 이에 해당하는 32개의 단백질은 표 5 및 표 6에 나타낸 것과 같이 HBA1, MTDH, PFN1, DSG3, CFHR3, F13A1, FGA, CST3, F13B, C7, AZGP1, APOB, FGB, FGG, FN1, TF, CFB, COMP, VTN, CRP, HP, LAMP2, B2M, ORM1, CALR, CFI, DES, UMOD, APOA4, RBP4, HRG, SELL이다.
[표 5]
[표 6]
표 5 및 표 6의 상기 32개의 단백질 중에서 19개의 단백질(HBA1, MTDH, PFN1, DSG3, CFHR3, F13A1, FGA, CST3, F13B, C7, AZGP1, APOB, FGB, FGG, FN1, TF, CFB, COMP, VTN)은 AsymAD 환자군과 ProdAD 환자군 사이에서 다른 발현량을 보였으며, 15개의 단백질(CRP, HP, FN1, LAMP2, B2M, ORM1, CALR, CFI, DES, UMOD, APOA4, RBP4, CST3, HRG, SELL)은 ProdAD 환자군과 ADD 환자군 사이에서 다른 발현량을 보였다.
상기 32개의 단백질에 대해서 Multinomial log-linear regression을 수행한 결과 Variable importance가 1보다 큰 단백질이 21개인 것으로 확인되었고, 이 21개의 단백질에 대해 Multinomial log-linear regression을 사용하여 다중마커패널을 제작하였다. 도 6에 해당 21개 단백질과 단백질들의 Variable importance를 나타냈다.
패널을 구성하는 타겟 선정의 방식으로는 Backward selection 방식을 사용했다. 패널 제작 시 학습의 과적합(Overfitting)을 막기 위하여 Nested cross validation 방식으로 교차 검증을 수행하였다. Nested cross validation의 Inner fold는 3 folds로, Outer fold는 5 folds로 설정하였으며, Inner fold는 Round 수를 10회로, Outer fold는 Repeat 수를 10회로 지정하여 수행하였다. 알츠하이머의 진행에 따른 신경 손상 진행도 모니터링을 위한 모델 생성 결과 13개의 펩타이드로 이루어진 다중 마커 패널이 구축되었으며, 여기에 K-MMSE score도 패널의 Feature로 포함시켜서 구분력을 향상시켰다. 패널을 구성하는 13개의 단백질 마커는 APOA4, APOB, B2M, CARL, CFB, COMP, CRP, CST3, F13A1, FGA, FN1, MTDH, ORM1이며, 표 7에 알츠하이머 진행에 따른 신경손상에 대한 마커를 구성하는 단백질 및 해당 펩타이드를 나타냈다.
[표 7]
AsymAD 환자군과 (ProdAD + ADD) 환자군 비교 시 네 종류 패널들의 성능 결과는 다음과 같다: 1) APOE ε4 대립유전자 보유 여부의 단독 성능 결과: 민감도 97.2%, 특이도 5.4%; 2) K-MMSE score 패널의 단독 성능 결과: 민감도 81.9%, 특이도 61.8%; 3) 13개의 단백질 마커로 구성된 다중마커패널의 성능 결과: 민감도 92.9%, 특이도 80.5%; 및 4) 13개의 단백질 마커와 K-MMSE score를 조합한 다중마커패널의 성능 결과: 민감도 94.2%, 특이도 83.8%.
AsymAD 환자군과 ProdAD 환자군 비교 시 네 종류 패널들의 성능 결과는 다음과 같다: 1) APOE ε4 대립유전자 보유 여부의 단독 성능 결과; 민감도 94.5%, 특이도 10.2%; 2) K-MMSE score 패널의 단독 성능 결과: 민감도 60.7%, 특이도 14.9%; 3) 13개의 단백질 마커로 구성된 다중마커패널의 성능 결과: 민감도 93.2%, 특이도 87.5%; 및 4) 13개의 단백질 마커와 K-MMSE score를 조합한 다중마커패널의 성능 결과: 민감도 92.8%, 특이도 87.5%.
ProdAD 환자군과 ADD 환자군 비교 시 네 종류 패널들의 성능 결과는 다음과 같다: 1) APOE ε4 대립유전자 보유 여부의 단독 성능 결과: 민감도 38.1%, 특이도 49.3%; 2) K-MMSE score 패널의 단독 성능 결과: 민감도 81.5%, 특이도 73.4%; 3) 13개의 단백질 마커로 구성된 다중마커패널의 성능 결과: 민감도 83.0%, 특이도 80.9%; 4) 13개의 단백질 마커와 K-MMSE score를 조합한 다중마커패널의 성능 결과: 민감도 86.9%, 특이도 88.2%.
AsymAD 환자군, ProdAD 환자군, ADD 환자군의 비교 시 APOE ε4 대립유전자 보유 여부, K-MMSE score 패널, 13개의 단백질 마커로 구성된 다중마커패널, 13개의 단백질 마커와 K-MMSE score를 조합한 다중마커패널의 정확도는 각각 32.0%, 63.4%, 77.3%, 82.9%였다. 네 종류의 모델의 성능 결과는 도 7 및 도 8에 나타냈다. APOE ε4 대립유전자 보유 여부의 단독 성능과 K-MMSE score 패널의 단독 성능 결과, 13개의 단백질 마커로 구성된 다중마커패널, 13개의 단백질 마커와 K-MMSE를 조합한 다중마커패널의 성능을 비교한 결과, 13개의 단백질 마커로 구성된 다중마커패널의 정확도가 APOE ε4 대립유전자 보유 여부 또는 K-MMSE score로 AsymAD 환자군, ProdAD 환자군, ADD 환자군을 구분했을 때의 정확도보다 높은 것으로 확인되었으며, 13개의 단백질 마커로 구성된 다중마커패널에 K-MMSE score를 추가로 조합한 결과 정확도가 향상된 사실을 확인하였다.
특히 AsymAD 환자군과 다른 알츠하이머 환자군의 비교 시에는 다중마커패널의 특이도가 APOE ε4 대립유전자 보유 여부 또는 K-MMSE score 패널과 같은 단독 패널의 특이도와 비교했을 때 크게 상승한 것을 확인하였다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
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<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(9)
<223> Apolipoprotein A-IV
<400> 1
Ile Ser Ala Ser Ala Glu Glu Leu Arg
1 5
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(15)
<223> Apolipoprotein B-100
<400> 2
Thr Ser Ser Phe Ala Leu Asn Leu Pro Thr Leu Pro Glu Val Lys
1 5 10 15
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(10)
<223> Beta-2-microglobulin
<400> 3
Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys
1 5 10
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(9)
<223> Complement component C9
<400> 4
Val Val Glu Glu Ser Glu Leu Ala Arg
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(10)
<223> Carbonic anhydrase 1
<400> 5
Tyr Ser Ser Leu Ala Glu Ala Ala Ser Lys
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(12)
<223> Coagulation factor XIII A chain
<400> 6
Ser Thr Val Leu Thr Ile Pro Glu Ile Ile Ile Lys
1 5 10
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(11)
<223> Fibrinogen alpha chain
<400> 7
Gly Ser Glu Ser Gly Ile Phe Thr Asn Thr Lys
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(11)
<223> Protein LYRIC
<400> 8
Trp Asn Ser Val Ser Pro Ala Ser Ala Gly Lys
1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(11)
<223> Serotransferrin
<400> 9
Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys
1 5 10
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(15)
<223> Adiponectin
<400> 10
Gly Asp Ile Gly Glu Thr Gly Val Pro Gly Ala Glu Gly Pro Arg
1 5 10 15
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(9)
<223> Complement factor B
<400> 11
Asp Ile Ser Glu Val Val Thr Pro Arg
1 5
Claims (11)
- 혈액에서 APOA4 (Apolipoprotein A-IV), APOB (Apolipoprotein B-100), B2M (Beta-2-microglobulin), C9 (Complement component C9), CA1 (Carbonic anhydrase 1), F13A1 (Coagulation factor XIII A chain), FGA (Fibrinogen alpha chain), MTDH (Protein LYRIC), TF (Serotransferrin), ADIPOQ (Adiponectin) 및 CFB (Complement factor B) 조합의 바이오마커 발현 수준을 질량분석법으로 측정하기 위한 물질을 포함하는 뇌의 아밀로이드 베타 축적 여부 판단용 바이오마커 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 바이오마커 조합은 APOE ε4 유전자형을 추가로 포함하는 것인, 뇌의 아밀로이드 베타 축적 여부 판단용 바이오마커 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 질량 분석법이 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 또는 비행시간 질량 분석법을 포함하는 것인, 뇌의 아밀로이드 베타 축적 여부 판단용 바이오마커 조성물.
- 제 3 항에 있어서,
상기 질량 분석법에 사용되는 모드는 선택 반응 모니터링(Selected Reaction Monitoring, SRM) 또는 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring, MRM)인 것인, 뇌의 아밀로이드 베타 축적 여부 판단용 바이오마커 조성물.
- 제 4 항에 있어서,
상기 질량 분석법 모드는 MRM이고, 상기 MRM에 분석에 사용되는 상기 패널을 구성하는 각 단백질 별 펩타이드는 다음 표와 같은 것인, 뇌의 아밀로이드 베타 축적 여부 판단용 바이오마커 조성물.
- 아밀로이드베타 축적 여부 판단에 대한 정보를 제공하기 위해,
대상체로부터 분리된 혈액으로부터 제 1 항에 따른 바이오마커 조합의 각 바이오마커의 발현 수준을 질량분석법으로 측정하는 단계; 및
상기 측정 결과를 대조군으로 PET 영상을 통해 뇌에 아밀로이드 베타가 축적되지 않은 것으로 확인된 인지기능 정상군(cognitive normal control, CN)의 혈액시료의 해당 마커의 상응하는 측정 결과와 비교하여, 아밀로이드 베타 축적과 연관시키는 단계를 포함하는, 인비트로에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 여부 판단용 바이오마커 검출 방법.
- 제 6 항에 있어서,
상기 바이오마커 조합은 APOE ε4를 추가로 포함하는 상기 APOE ε4는 유전자형을 분석하는 것인, 인비트로에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 여부 판단용 바이오마커 검출 방법.
- 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
상기 질량 분석법이 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 또는 비행시간 질량 분석법을 포함하는 것인, 인비트로에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 여부 판단용 바이오마커 검출 방법.
- 제 8 항에 있어서,
상기 질량 분석법에 사용되는 모드는 선택 반응 모니터링(Selected Reaction Monitoring, SRM) 또는 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring, MRM)인 것인, 인비트로에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 여부 판단용 바이오마커 검출 방법.
- 제 9 항에 있어서,
상기 질량 분석법 모드는 MRM이고, 상기 MRM에 분석에 사용되는 상기 패널을 구성하는 각 단백질 별 펩타이드는 다음 표와 같은 것인, 인비트로에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 여부 판단용 바이오마커 검출 방법:
- 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
상기 연관시키는 단계에서, 상기 대상체의 측정 결과 그 발현 수준이 상기 대조군에 측정된 발현 수준과 비교하여 증가 또는 감소하는 경우, 상기 대상체는 뇌에 아밀로이드 베타가 축적된 것으로 판단하며,
상기 증가하는 마커는 ADIPOQ, MTDH, B2M, C9, 및 APOB이고, 상기 감소하는 마커는 APOA4, CA1, CFB, F13A1, FGA, 및 TF인, 인비트로에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 여부 판단용 바이오마커 검출 방법.
Applications Claiming Priority (2)
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Publications (2)
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ID=82407174
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210170670A KR102603913B1 (ko) | 2021-01-07 | 2021-12-02 | 질량분석법 기반의 알츠하이머 선별 검사용 혈장 바이오마커 패널 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102603913B1 (ko) |
-
2021
- 2021-12-02 KR KR1020210170670A patent/KR102603913B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Naoki KANEKO et al., Proc. Jpn. Acad., Ser. B, 2014, Vol. 90, pp 353-364. 1부.* * |
| Wei-Wei Li et al., J Alzheimers Dis., 2019, Vol. 69, pp 169-178. 1부.* * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102603913B1 (ko) | 2023-11-20 |
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