KR20220097326A - Bacillus thuringiensis subsp. israelensis KNU-26 strain with high endospore germination rate and insecticidal properties against dipteran larvae - Google Patents
Bacillus thuringiensis subsp. israelensis KNU-26 strain with high endospore germination rate and insecticidal properties against dipteran larvae Download PDFInfo
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Abstract
Description
본 발명은 포자 형성속도가 빠르며 파리목 해충에 살충 효과를 가지는 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis sbusp. israelensis) KNU-26 균주(수탁번호 KCTC14383BP), 상기 균주를 이용한 살충용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a Bacillus thuringiensis subspecies Israelensis ( Bacillus thuringiensis sbusp. israelensis ) KNU-26 strain (Accession No. KCTC14383BP), an insecticidal composition using the strain, which has a fast spore formation rate and has an insecticidal effect on Diptera pests .
곤충은 현재 지구상의 알려진 생물 중에서 가장 많은 종을 차지하고 있으며 환경에 대한 적응력이 뛰어난 것으로 알려져 있다. 이러한 곤충들 일부는 상업적으로 중요하고 다양한 농경 작물에 많은 경제적 손실을 일으키고 있다. 때문에 이러한 해충을 방제하기 위해서 예전부터 화학살충제가 많이 사용되어 왔다. 그러나 화학살충제는 살충 능력이 비 특이적인 스펙트럼을 인해 이로운 익충 및 해충에 있는 기생충과 같은 비목적 미생물도 박멸하였고, 화학살충제를 자주 사용함에 따라 상기 화학살충제에 반복적으로 노출된 목적 해충이 화학살충제에 대한 내성 획들을 촉진하였으며, 아울러 화학살충제 성분은 인체에 해로운 단점을 가지고 있다.Insects currently occupy the largest number of species among known living things on the planet, and are known for their excellent adaptability to the environment. Some of these insects are commercially important and cause significant economic losses to various agricultural crops. For this reason, chemical insecticides have been widely used since ancient times to control these pests. However, chemical insecticides also eradicated beneficial beneficial insects and non-target microorganisms such as parasites in pests due to their non-specific spectrum of insecticidal ability. In addition, chemical pesticides have a disadvantage that is harmful to the human body.
반면, 미생물농약은 자연 상태에 존재하는 토착미생물로 생태계에 영향을 주지 않으면서 병, 해충을 억제하는 장점이 있으며, 농장물의 생장을 촉진하는 기능이 있다. 또한 식물을 포함한 인축에는 전혀 해가 없으면서 기주 곤충에게만 특이적인 살충력을 가지고 있어 효과적으로 방제가 가능하다.On the other hand, microbial pesticides are native microorganisms that exist in nature, and have the advantage of suppressing diseases and pests without affecting the ecosystem, and have the function of promoting the growth of farms. In addition, it is harmless to human livestock including plants, and has specific insecticidal power only to host insects, so it can be effectively controlled.
가장 널리 알려진 미생물농약은 기주 특이적으로 병, 해충을 죽이는 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)를 이용한 제품으로 비티(BT)제로 널리 알려져 있다. 이 균의 주요 작용 기작인 살충성 단백질은 비선택 유기체에 대하여 안전하기 때문에 친환경농업에 주요 작물보호 농자재로 사용된다. 또한, 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)는 호기성 그람 양성의 간균으로 내생포자를 형성하며 내독소 단백질로 이루어진 살충성 결정체(crystal) 단백질을 생성한다. 내독소 단백질은 주로 cy와 cyt 독소로 구성되어 있다. 또한, 체내의 Cry 단백질이 대상 곤충의 알카리성 위장에 녹아 위장벽에 이온 구멍을 형성하여 소화기의 파괴와 소화액의 누출을 야기시킴으로써 작용한다.The most widely known microbial pesticide is a product using Bacillus thuringiensis that specifically kills diseases and pests in a host, and is widely known as a BT agent. The insecticidal protein, which is the main mechanism of action of this fungus, is safe against non-selective organisms, so it is used as a major crop protection agricultural material in eco-friendly agriculture. In addition, Bacillus thuringiensis (Bacillus thuringiensis) is an aerobic Gram-positive bacillus, which forms endospores and produces an insecticidal crystal protein composed of an endotoxin protein. Endotoxin proteins are mainly composed of cy and cyt toxins. In addition, the Cry protein in the body dissolves in the alkaline stomach of the target insect and forms an ion hole in the stomach wall, causing destruction of the digestive system and leakage of digestive juices.
특히, 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis)는 모기, 나방파리, 버섯파리를 포함한 파리목에 효과적인 것으로 알려져 있다. 파리목 곤충의 경우 핥은 입 또는 찌르는 입을 가진 경우가 많아 엽면시비는 부적절하며, 그 생활사에서 물에서 유생 생활을 거치는 경우가 많아 수화제의 형태로 물에 희석시켜 유충에 작용하도록 해야 한다.In particular, Bacillus thuringiensis subspecies israelensis ( Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ) is known to be effective against Diptera including mosquitoes, moth flies, and mushroom flies. In the case of Diptera insects, foliar fertilization is inappropriate because they often have a licking or stinging mouth, and in their life cycle, they often go through a larval life in water.
대부분의 바실러스 속에 속하는 고활성 미생물의 경우 특징적으로 열과 건조 등 환경 스트레스에 견딜 수 있는 내생포자(endospore)를 형성한다. 상업적 생산을 위해서는 생산 비용의 최소화가 필요하며, 이를 위해서는 무엇보다 내생포자 형성 속다가 빨라야 한다. 또한 고효율의 미생물제를 대량으로 생산하여 장기간 보존에도 내생포자의 활력을 유지하여야 하기 때문에 상용화에 있어 매우 중요한 원인이 된다.Most highly active microorganisms belonging to the genus Bacillus characteristically form endospores that can withstand environmental stress such as heat and drying. For commercial production, it is necessary to minimize the production cost, and for this, the speed of endospore formation must be fast above all else. In addition, it is a very important cause for commercialization because it is necessary to maintain the vitality of the endospores even after long-term storage by mass production of high-efficiency microbial agents.
파리목 해충의 방제를 위해 다양한 물질에 대한 연구가 진행되고 있나 아직까지는 화학농약에 비하여 미생물농약에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 게다가, 미생물농약으로써 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis)와 같은 제제를 개발하였다 하더라도 제품을 위한 포자를 생산하는데는 많은 비용이 소요되며, 경제성의 문제로 제품화가 되지 않는 경향이 있다. 따라서 화학농약에 비하여 경제성이 있는 제품을 위해서는 포자 생성률이 큰 균주의 개발이 필수적이다.Is research on various substances being conducted to control Diptera pests? Research on microbial pesticides compared to chemical pesticides is still insufficient. In addition, even if a formulation such as Bacillus thuringiensis subsp. israelensis has been developed as a microbial pesticide, it costs a lot to produce spores for the product, and it tends not to be commercialized due to economic problems. There is this. Therefore, it is essential to develop a strain with a high spore production rate for products that are more economical than chemical pesticides.
본 발명자는 상업적으로 중요하고 다양한 농경 작물에 해를 입히는 해충 방제를 위한 곤충 병원성 미생물을 탐색하던 중 파리목 해충인 긴수염버섯파리 유충에 살충력이 있으며, 포자 형성능이 비교 대상 표준 균주에 비해 3배 이상 높은 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 균주를 분리하고, 상업 생산의 비용을 줄이는 것을 목적으로 한다.The present inventors have insecticidal power against larvae of the Diptera pests, while searching for entomopathogenic microorganisms for controlling pests that are commercially important and harmful to various agricultural crops, and the spore-forming ability is 3 times or more compared to the standard strain to be compared High Bacillus thuringiensis subspecies israelensis ( Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ) isolates the KNU-26 strain, and aims to reduce the cost of commercial production.
본 발명은 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 균주(수탁번호 KCTC14383BP)를 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention aims to provide a Bacillus thuringiensis subspecies Israel Rensis ( Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ) KNU-26 strain (accession number KCTC14383BP).
또한, 본 발명은 상기 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 균주(수탁번호 KCTC14383BP)의 배양액을 이용하는, 살충용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, the present invention aims to provide an insecticidal composition using the culture medium of the Bacillus thuringiensis subsp. israelensis KNU-26 strain (accession number KCTC14383BP).
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본 발명은 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 균주(수탁번호 KCTC14383BP)를 제공한다. The present invention provides a Bacillus thuringiensis subsp. israelensis KNU-26 strain (accession number KCTC14383BP).
본 발명에서는 긴수염버섯파리 유충의 사체, 긴수염버섯파리 유충이 서식하는 작물 및 토양을 채집하여 긴수염버섯파리 유충에 대한 살충 효과를 가지는 균주를 선발하였으며(도 1 참조), 상기 균주를 '바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26'으로 동정하고(도 2 참조), 이를 2020년 11월 XX일 부로 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다(수탁 번호: KCTC14383BP)In the present invention, strains having an insecticidal effect on long beard fly larvae were selected by collecting the cadavers, crops and soil inhabiting the long beard fly larvae (see FIG. 1), and the strain was ' Bacillus thuringiensis subspecies Israel Rensis ( Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ) was identified as KNU-26' (see FIG. 2), and it was deposited at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC) as of November XX, 2020 ( Accession number: KCTC14383BP)
본 발명의 일 구체예에서 상기 균주는 서열 번호 1로 표시되는 16S rRNA gene 영역의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the strain may include the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene region represented by SEQ ID NO: 1.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 균주는 서열번호로 이루어지는 군으로부터 선택되는 내독소 단백질을 암호화 하고 있는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the strain is characterized in that it contains a gene encoding an endotoxin protein selected from the group consisting of SEQ ID NOs.
상기 균주는 살충효과를 가질 수 있고, 상기 '살충 효과'는 작물의 성장을 저해시키거나 작물에 피해를 입히는 해충의 발생, 생장을 저해시키거나 해충을 죽이는 것을 모두 포함한다. 상기 해충은 작물의 성장을 저해시키는 모든 곤충을 의미할 수 있으며 구체적으로는 파리목 해충을 의미할 수 있으며, 더욱 구체적으로는 긴수염버섯파리 유충을 의미할 수 있다.The strain may have an insecticidal effect, and the 'insecticidal effect' includes all of inhibiting the growth of crops or generating pests that damage crops, inhibiting growth, or killing pests. The pest may mean any insect that inhibits the growth of crops, specifically, may refer to a Diptera pest, and more specifically, may refer to a larvae of the long bearded mushroom fly.
본 발명의 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 균주는 기술분야에 널리 알려진 조건에서 배양, 보관될 수 있으며, 구체적으로는 30℃ 및 pH 7.0에서 최적 생육 조건을 가질 수 있으며 호기성 균으로, 동결 건조하여 보존할 수 있고 50% 글리세롤 수용액과 상기 균 배양액을 1 대 1로 혼합한 뒤 -80℃에서 냉동 하는 등의 통상의 방법으로 보관할 수 있다.Bacillus thuringiensis subspecies Israel Rensis ( Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ) KNU-26 strain of the present invention can be cultured and stored under conditions well known in the art, specifically, optimal growth conditions at 30 ℃ and pH 7.0 As aerobic bacteria, it can be stored by freeze-drying, and can be stored in a conventional manner such as mixing a 50% glycerol aqueous solution and the bacterial culture solution one-to-one and then freezing at -80°C.
상기 균주를 배양하기 위한 배지는 공지의 배지를 활용할 수 있으며, 구체적으로는 경제적인 방법으로 대량 생산하기 위해 배지에 글리세린, 트립톤, 효모 추출물, 염화 나트륨 등으로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상을 추가로 첨가할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 고체 배지에서 배양할 경우 균의 생육에 가장 큰 영향을 주는 것은 통기성과 온도, 수분 ?t유량으로 온도가 30℃일 ??, 산소와의 접촉이 원활할수록, 생산된 생균 수의 양이 개선되고 균체의 생샨량도 향상된다. 상기 배지에 첨가된 글리세린은 배지의 물성 및 수분 ?t유도를 개선하기 위한 보조제로서 사용되며, 트립톤은 박테리아 생장에 필요로 하는 아미노산을 제공하고, 효모 추출물은 미량 원소 및 질소원을 제공하며, 염화 나트륨은 삼투 현상을 조절하는데 사용된다.The medium for culturing the strain may utilize a known medium, specifically, one or two or more selected from the group consisting of glycerin, tryptone, yeast extract, sodium chloride, etc. in the medium for mass production in an economical way may be additionally added, but is not limited thereto. When cultured in a solid medium, the biggest influence on the growth of bacteria is air permeability, temperature, and water ?t flow. When the temperature is 30℃ and contact with oxygen is smooth, the amount of produced live cells is improved. The production volume of the cells is also improved. Glycerin added to the medium is used as an adjuvant to improve the physical properties and moisture induction of the medium, tryptone provides amino acids required for bacterial growth, yeast extract provides trace elements and nitrogen source, and chloride Sodium is used to control osmosis.
본 발명의 동 방법에 의하여 본 균주는 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) ATCC 39152에 비하여 최대 3배 이상의 포자 생성능력을 보인다. By the same method of the present invention, this strain exhibits a spore-producing ability up to three times higher than that of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ATCC 39152.
구체적으로 본 발명의 균주는 포자 형성을 위한 상업 배양에서 배양 24시간 이후부터는 1*109(10억 spores/ ml) 이상, 36시간 이후부터 밀리리터당 2*109(20억 spores/ ml) 이상으로 포자형성이 가능하여 이는 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) ATCC 39152이 배양 48시간까지 밀리리터당 1*109(10억 spores/ ml) 미만으로 포자를 형성하는 것과 비교할 때 높은 포자 생성능을 가진다. Specifically, the strain of the present invention is 1*10 9 (1 billion spores/ml) or more after 24 hours of culture in commercial culture for spore formation, and 2*10 9 (2 billion spores/ml) or more per milliliter after 36 hours This is comparable to that Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ATCC 39152 spores less than 1 * 10 9 (1 billion spores / ml) per milliliter up to 48 hours of culture. when it has high spore production capacity.
또한, 본 발명의 균주는 배양 20시간 시점에서도 20% 이상의 높은 포자형성능을 가진다. 이는 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) ATCC 39152가 배양 50시간까지 20% 보다 낮은 포자형성능을 가지는 것과 비교할 때 본 발명의 균주는 높은 포자 생성능을 가지는 것이다. In addition, the strain of the present invention has a high sporulation capacity of 20% or more even at the time of incubation for 20 hours. This is Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ( Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ) The strain of the present invention has a high spore-forming ability compared to that of ATCC 39152 having a sporulation performance lower than 20% up to 50 hours of culture.
상기 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 균주는 해충인 긴수염버섯파리 유충에 대해 높은 치사율을 보여 긴수염버섯파리 유충에 대한 곤충 병원성이 우수한 것이다(실시예 2 참조).The Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ( Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ) KNU-26 strain shows a high fatality rate against larvae of the larvae of the larvae of the larvae of the larvae of the larvae of the larvae of the larvae of the larvae of the larvae of the larvae of the larvae of the long worms (Example 2) Reference).
또한, 본 발명은 상기 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 균주(수탁번호 KCTC14383BP)의 배양액을 이용하는, 살충용 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides an insecticidal composition using the culture solution of the Bacillus thuringiensis subsp. israelensis KNU-26 strain (accession number KCTC14383BP).
상기 '배양액'은 미생물 생장에 적절한 배지에 일정 농도의 포자를 접종하여 배양기에서 일정 기간 동안 미생물이 생장하도록 유도한 후 수득된, 균체, 균체가 생장하면서 분비한 물질, 및 생장에 필요한 영양성분이 혼합된 액으로서, 종이필터를 이용하여 불순물을 걸러내는 과정을 거쳐 제조할 수 있다.The 'culture solution' is obtained after inoculating a certain concentration of spores in a medium suitable for microbial growth and inducing microorganisms to grow for a certain period in an incubator. As a mixed solution, it can be manufactured through a process of filtering impurities using a paper filter.
상기 살충용 조성물은 긴수염버섯파리 유충에 대해 살충 활성을 갖는 것일 수 있다. The insecticidal composition may be one having insecticidal activity against the larvae of Mushroom fly larvae.
상기 균주 배양액은 zeolite와 같은 seed 물질에 코팅할 수 있다. The culture medium of the strain may be coated on a seed material such as zeolite.
상기 살충용 조성물은 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 충전제(fillers), 용매, 부형제, 계면활성제(surfactants), 현탁제(suspending agents), 스프래더(spreaders), 부착제(adhesives), 소 포제, 분산제, 습윤제, 드리프트 감소제(drift reducitng agents), 보조제(suxiliaries), 보강제(adjuvants) 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다.The insecticidal composition may include an acceptable carrier, and may contain fillers, solvents, excipients, surfactants, suspending agents, spreaders, adhesives, and antifoaming agents. , dispersing agents, wetting agents, drift reducing agents, suxiliaries, adjuvants, or mixtures thereof.
또한, 상기 살충용 조성물은 농축물, 용액, 스프레이, 에어로졸, 침수용(immersion baths), 침지(dips), 에멀젼 (emulsions), 현탁 농축액, 겔, 과립(granules) 등의 타입으로 제제화 할 수 있다.In addition, the insecticidal composition can be formulated in the form of concentrates, solutions, sprays, aerosols, immersion baths, dips, emulsions, suspension concentrates, gels, granules, etc. .
상기 살충용 조성물은 하는 방식으로 진행하고 미생물 자체가 받는 피해와 활성 저해를 최소화하기 위하여 저온유동층공정기를 사용하여 제조될 수 있다. The insecticidal composition may be prepared using a low temperature fluidized bed processing machine in order to proceed in the same manner and to minimize the damage and activity inhibition of the microorganism itself.
상기 살충용 조성물을 적용할 수 있는 식물은 특별히 제한되지는 않으며, 배추, 양배추, 오이, 무, 들깨, 고추, 결구상추(양상추), 딸기, 토마토, 파, 담배, 등의 경제작물 이외에도 화훼 또는 특용작물 등의 식물 표면이나 이들 식물이 생장하고 있는 토양에 처리될 수 있으며 또는 재배하여 수송 또는 저장 중인 채소 표면에도 처리될 수 있다.Plants to which the insecticidal composition can be applied are not particularly limited, and in addition to economic crops such as Chinese cabbage, cabbage, cucumber, radish, perilla, red pepper, lettuce (lettuce), strawberry, tomato, green onion, tobacco, flowers or It may be treated on the surface of plants such as special crops or the soil in which these plants are growing, or it may be treated on the surface of vegetables that are grown and transported or stored.
본 발명의 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 균주는 포자 형성을 위한 상업 배양에서 밀리리터당 5*10^9(50억 spores/ ml)에 달하며 표준 균주의 포자 형성 속도의 1/3로 단축시킬 수 있고, 곤충 병원성을 가지고 농작물에 해를 끼치는 해충인 긴수염버섯파리 유충 방제에 탁월한 살충 효과를 나타냄으로 경제적이고 친환경적 해충 방제 수단으로 유용하게 이용 될 수 있다. Bacillus thuringiensis subsp. israelensis KNU-26 strain of the present invention is 5 * 10 ^ 9 (5 billion spores / ml) per milliliter in commercial culture for spore formation, and the spores of the standard strain It can be shortened to 1/3 of the formation rate, and it can be usefully used as an economical and eco-friendly means of controlling pests because it has an excellent insecticidal effect in controlling the larvae of long beard flies, which are insect pathogenic and harmful pests to crops.
도 1은 본 발명의 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp.israelensis) KNU-26를 PacBio Sequel로 whole genome sequencing을 한 후, 기존의 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KCTC 39152와 전체 유전자 서열을 비교할 수 있는 ANI (average nucleotide identity) 분석을 통해 얻은 결과이다.
도 2는 본 발명의 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 균주를 현미경으로 관찰한 사진으로 내생포자를 확인할 수 있다 (좌상단 화살표).
도 3은 본 발명의 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 균주 배양액과 무처리군의 긴수염버섯파리 유충에 대한 사멸율을 비교한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 균주의 생장 곡선과 내생포자 형성 속도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) ATCC 39152 표준 균주의 생장 곡선과 내생포자 형성 속도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 균주와, 표준 균주인 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) ATCC 39152 균주의 배양일자에 따른 내생포자 형성 비율을 비교한 그래프이다.1 is a Bacillus thuringiensis subsp. israelensis of the present invention, after whole genome sequencing of KNU-26 with PacBio Sequel, the existing Bacillus thuringiensis subspecies Israel Rensis ( Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ) This is the result obtained through ANI (average nucleotide identity) analysis that can compare the entire gene sequence with
2 is a microscopic photograph of the Bacillus thuringiensis subsp. israelensis KNU-26 strain of the present invention, and endospores can be identified (upper left arrow).
Figure 3 is a Bacillus thuringiensis subsp. israelensis of the present invention ( Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ) KNU-26 strain culture medium and a graph comparing the mortality rate for the larvae of the long beard mushroom fly in the untreated group.
4 is a graph showing the growth curve and endospore formation rate of the Bacillus thuringiensis subsp. israelensis KNU-26 strain of the present invention.
5 is a graph showing the growth curve and endospore formation rate of the Bacillus thuringiensis subsp. israelensis
Figure 6 is Bacillus thuringiensis subsp. israelensis of the present invention ( Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ) KNU-26 strain and the standard strain Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ( Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ) Culture of
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시 예를 제시한다. 그러나 하기의 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시 예에 의해 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다Hereinafter, preferred embodiments are presented to help the understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for easier understanding of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples.
[실시예][Example]
실시예 1. 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Example 1. Bacillus thuringiensis subspecies Israelensis ( Bacillus thuringiensis subsp. israelensisBacillus thuringiensis subsp. israelensis ) KNU-26 균주의 분리 및 동정) Isolation and identification of KNU-26 strain
본 발명에서 토양 해충에 대해 살충력을 가지는 균을 분리하기 위하여, 야외에서 병원성 균주에 의해 감염되어 죽은 곤충들을 채집하는 방법, 토양 해충이 서식하는 작물 및 토양 시료로부터 분리하는 방법을 병행하였다.In the present invention, in order to isolate bacteria having insecticidal power against soil pests, a method of collecting insects infected and dead outdoors by a pathogenic strain, a method of separating from crops inhabiting soil pests and a soil sample were combined.
구체적으로, 감염되어 죽은 긴수염버섯파리 유충의 무게를 칭량한 뒤 0.85% 염류 용액(saline solution)에 10배 순차 희석하여 현택액 중 0.1 mL을 취하고 하기 표 1과 같은 루리아-베르타니 아가 배지(LB 배지; Luria-Bertani Agar media)에 도말 하였다. 하기 예에 표기된 배지의 성분은 본 발명의 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis)를 분리하기 위함이며 하기에 제시된 성분의 가감에는 제한이 없다.Specifically, after weighing out the infected and dead larvae of Mushroom fly larvae, 10 times sequentially diluted in 0.85% saline solution, 0.1 mL of the suspension is taken, and Luria-Bertani agar medium as shown in Table 1 below ( LB medium; Luria-Bertani Agar media). The components of the medium indicated in the following examples are for isolating the Bacillus thuringiensis subsp. israelensis of the present invention, and there is no limitation on the addition or subtraction of the components presented below.
상기 배지를 30℃에서 2 일간 배양시킨 후, 일반적으로 알려진 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis)와 형태학적으로 유사한 균주만을 선별 분리하여 새 LB 배지에 접종하여 동일 조건에서 배양하였다.After culturing the medium at 30° C. for 2 days, select and isolate only strains morphologically similar to the commonly known Bacillus thuringiensis subsp. israelensis , inoculated into a new LB medium and cultured under the same conditions. did
그 결과, 긴수염버섯파리 유충에 대해 살충력을 가지는 곤충 병원성이 있는 8개의 균주를 선발하였고, 상기 균주를 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis)로 동정하였다. 본 발명자들은 상기에서 분리한 곤충 병원성 분리균 중 살충력이 우수하고 포자 생성률이 가장 우수한 균주를 '투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26'라 명명하였고, 이를 2020년 11월 XX일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다(수탁 번호: KCTC14383BP).As a result, 8 strains having insecticidal properties with insecticidal properties against the larvae of Mushroom fly larvae were selected, and the strains were identified as Bacillus thuringiensis subsp. israelensis . The present inventors named the strain with excellent insecticidal power and the best spore production rate among the entomopathogenic isolates isolated above as ' Bacillus thuringiensis subsp. israelensis KNU-26', and this was It was deposited at the Korea Institute of Biotechnology and Biotechnology Microbial Resource Center (KCTC) on the XX day of the month (accession number: KCTC14383BP).
상기 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 균주와 기존의 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KCTC 39152와 전체 유전자 서열을 비교할 수 있도록 PacBio Sequel을 이용하여 whole genome sequencing을 한 후, ANI (average nucleotide identity) 분석을 진행한 결과를 도 1에 나타내었다.The thuringiensis subspecies israelensis ( Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ) KNU-26 strain and the existing Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ( Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ) PacBio Sequel so that the entire gene sequence can be compared with
또한, 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26의 형택적 특성과 내생포자의 형성을 파악하기 위하여, 루리아-베르타니 액체 배지(LB broth)에 배양한 후, 현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.In addition, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ( Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ) In order to understand the morphological characteristics and the formation of endospores of KNU-26, Luria-Bertani liquid medium (LB broth) after culturing in, microscopic was observed with The results are shown in FIG. 2 .
실시예 2. 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Example 2. Thuringiensis subspecies Israelensis ( Bacillus thuringiensis subsp. isralensisBacillus thuringiensis subsp. isralensis ) KNU-26 균주의 토양 해충에 대한 병원성 검증) Verification of pathogenicity against soil pests of KNU-26 strain
버섯 농가에서 문제가 되고 있는 긴수염버섯파리 유충(Lycoriella mali)을 공시충(test insect)으로 사용하였고 기주작물로는 느타리 버섯을 이용하여 실험을 실시하였다. Lycoriella mali , which is a problem in mushroom farms, was used as a test insect, and an oyster mushroom was used as a host crop.
긴수염버섯파리 유충은 사육상자(10 ㎝ X 10 ㎝ X 12 ㎝)에서 사육하였고 사육온도는 25±2℃, 상대습도 60-70%로 유지하면서 사육하였다.Long beard mushroom fly larvae were reared in a breeding box (10
본 발명에서 분리한 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 균주의 긴수염버섯파리 유충에 대한 살충력을 검증하고자 상기 균주를 루리아-베르타니 액체 배지(LB broth)에서 30℃, 2일간 배양하였다. 대조군으로서 0.85%의 염화 나트륨(Sodium choloride)를 이용하였고, 상기 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 균주의 배양액을 긴수염버섯파리 유충에 분사하였다. 상기 살충력 실험은 3회 반복하여 실시하였으며, 긴수염버섯파리 유충은 총 10마리씩 사용하였고, 분사 후 0 내지 24시간 경과 동안의 살충력을 확인하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.In order to verify the insecticidal power of the thuringiensis subspecies Israel Rensis isolated in the present invention ( Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ) KNU-26 strain against the larvae of the long beard mushroom fly, the strain was subjected to 30 in Luria-Bertani liquid medium (LB broth). C, and incubated for 2 days. As a control, 0.85% sodium chloride (Sodium choloride) was used, and the culture medium of the Bacillus thuringiensis subsp . The insecticidal power test was repeated 3 times, and a total of 10 long beard mushroom fly larvae were used, and the insecticidal power was confirmed for 0 to 24 hours after spraying. The results are shown in FIG. 3 .
바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis)의 상업 생산에 있어 가장 생산비를 가중시키는 요인은 저조한 내생 포자 형성율이다. 특정 균주의 살충력이 우수하다고 하더라도 내생 포자형성이 저조할 경우 그 상업적 가치는 낮다고 할 수 있다. 도 4, 5 및 6과 같이 표준균주와 분리균주의 고체배양에서의 포자 생성능을 비교하였을 때, 본 발명의 KNU-26의 내생 포자 생성능이 가장 우수하다고 알 수 있다.In the commercial production of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis , the most costly factor in commercial production is a low rate of endospore formation. Even if the insecticidal power of a specific strain is excellent, if the endospore formation is low, its commercial value can be said to be low. As shown in FIGS. 4, 5 and 6, when the spore-producing ability of the standard strain and the isolated strain was compared in solid culture, it can be seen that the endospore-producing ability of KNU-26 of the present invention is the best.
실시예 3. 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스 (Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 균주의 내독소 단백질 암호화 유전자 서열 정보Example 3. Endotoxin protein coding gene sequence information of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis KNU-26 strain
본 발명자들은 상기 실시예 2에서 나방목 해충에 대한 방제 능력이 있는 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스 (Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 의 내독소 단백질을 암호화하는 유전자 염기 서열을 밝히기 위하여 균체로부터 유천제 DNA (genomic DNA)를 추출한 후 PacBio Seuquel sequencing 장비를 이용하여 전체 유전자 서열을 밝혔으며, 이 유전자 서열을 BtToxin_Digger(https://github.com/BMBGenomics/BtToxin_Digger)을 이용하여 도 7와 같이 해당 작용에 관여할 수 있는 역할을 하는 유전자 염기서열을 확인하였다.The present inventors in Example 2, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 with control ability against moth pests. After extracting genomic DNA, the entire gene sequence was revealed using PacBio Seuquel sequencing equipment, and the gene sequence was analyzed using BtToxin_Digger ( https://github.com/BMBGenomics/BtToxin_Digger ) as shown in FIG. 7 . Gene nucleotide sequences that play a role that can be involved in the action were identified.
바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스 (Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 균주의 전체 유전체를 이용하여 내독소 단백질을 암호화하고 있는 염기 서열을 확인한 결과 Cry4Aa, Cry4Ba, Cry10Aa, Cry11Aa, Cry60Aa, Cry60Ba, Cyt1Aa, Cyt1Ca, Cyt2Ba를 포함하고 있는 것으로 확인하였다. 상기 Cry4Aa, Cry4Ba, Cry10Aa, Cry11Aa, Cry60Aa, Cry60Ba, Cyt1Aa, Cyt1Ca, Cyt2Ba의 염기 서열은 다음과 같다:As a result of confirming the nucleotide sequence encoding the endotoxin protein using the entire genome of the Bacillus thuringiensis subsp. israelensis KNU-26 strain, Cry4Aa, Cry4Ba, Cry10Aa, Cry11Aa, Cry60Aa, Cry60Ba, Cyt1Aa , Cyt1Ca, was confirmed to contain Cyt2Ba. The base sequences of Cry4Aa, Cry4Ba, Cry10Aa, Cry11Aa, Cry60Aa, Cry60Ba, Cyt1Aa, Cyt1Ca, and Cyt2Ba are as follows:
기존의 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스 (Bacillus thuringiensis subsp. israelensis)는 Cry4Aa, Cry4Ba, Cry10Aa, Cry11Aa, Cyt1Aa, Cyt2Ba를 암호화 하고 있다고 알려져 있다 (Ben-Dov, Eitan. Toxins 6.4 (2014): 1222-1243). 본 실험에서 분리한 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스 (Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 균주와 일치성이 보이며 추가적으로 Cry60Aa, Cry60Ba, Cyt1Ca가 확인되었다. 특히나 Cyt 유전자는 단독으로는 낮은 독성을 보이지만 Cry 독소와 높은 상승작용을 하므로 이들의 조합은 높은 표적 독성을 보일 것으로 추측된다.It is known that the existing Bacillus thuringiensis subspecies Israelensis (Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) encodes Cry4Aa, Cry4Ba, Cry10Aa, Cry11Aa, Cyt1Aa, and Cyt2Ba (Ben-Dov, Eitan. Toxins 6.4 (2014): 1222- 1243). Bacillus thuringiensis subsp. israelensis isolated in this experiment is consistent with the KNU-26 strain, and additionally Cry60Aa, Cry60Ba, and Cyt1Ca were identified. In particular, the Cyt gene alone shows low toxicity, but has a high synergistic effect with the Cry toxin, so a combination thereof is expected to show high target toxicity.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.The above description of the present invention is for illustration, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Bacillus thuringiensis subsp. israelensis KNU-26 strain with high endospore germination rate and insecticidal properties against dipteran larvae <130> PN200373-P1 <150> KR 10-2020-0187765 <151> 2020-12-30 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1036 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus thuringiensis subsp. israelensis KNU-26 16s rRNA <400> 1 tgaaaggcgg cttcggctgt cacttatgga tggacccgcg tcgcattagc tagttggtga 60 ggtaacggct caccaaggca acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg 120 ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga 180 cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggc tttcgggtcg taaaactctg 240 ttgttaggga agaacaagtg ctagttgaat aagctggcac cttgacggta cctaaccaga 300 aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg 360 gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggtg gtttcttaag tctgatgtga aagcccacgg 420 ctcaaccgtg gagggtcatt ggaaactggg agacttgagt gcagaagagg aaagtggaat 480 tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagagat atggaggaac accagtggcg aaggcgactt 540 tctggtctgt aactgacact gaggcgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc 600 tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttaga gggtttccgc cctttagtgc 660 tgaagttaac gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggc cgcaaggctg aaactcaaag 720 gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag 780 aaccttacca ggtcttgaca tcctctgaaa accctagaga tagggcttct ccttcgggag 840 cagagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 900 ccgcaacgag cgcaaccctt gatcttagtt gccatcatta agttgggcac tctaaggtga 960 ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac 1020 ctgggctaca cacgtg 1036 <110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Bacillus thuringiensis subsp. israelensis KNU-26 strain with high endospore germination rate and insecticidal properties against dipteran larvae <130> PN200373-P1 <150> KR 10-2020-0187765 <151> 2020-12-30 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1036 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus thuringiensis subsp. israelensis KNU-26 16s rRNA <400> 1 tgaaaggcgg cttcggctgt cacttatgga tggacccgcg tcgcattagc tagttggtga 60 ggtaacggct caccaaggca acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg 120 ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga 180 cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggc tttcgggtcg taaaactctg 240 ttgttaggga agaacaagtg ctagttgaat aagctggcac cttgacggta cctaaccaga 300 aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg 360 gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggtg gtttcttaag tctgatgtga aagcccacgg 420 ctcaaccgtg gagggtcatt ggaaactggg agacttgagt gcagaagagg aaagtggaat 480 tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagagat atggaggaac accagtggcg aaggcgactt 540 tctggtctgt aactgacact gaggcgcgaa agcgtgggga gcaaacagga tagataccc 600 tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttaga gggtttccgc cctttagtgc 660 tgaagttaac gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggc cgcaaggctg aaactcaaag 720 gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag 780 aaccttacca ggtcttgaca tcctctgaaa accctagaga tagggcttct ccttcgggag 840 cagagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 900 ccgcaacgag cgcaaccctt gatcttagtt gccatcatta agttgggcac tctaaggtga 960 ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac 1020 ctgggctaca cacgtg 1036
Claims (4)
Bacillus thuringiensis subspecies Israel Rensis ( Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ) KNU-26 strain (accession number KCTC14383BP).
상기 균주는 서열 번호 1로 표시되는 16S rRNA gene 영역의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 균주.
According to claim 1,
The strain is characterized in that it comprises the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene region represented by SEQ ID NO: 1.
Claim 1 Bacillus thuringiensis subspecies Israel Rensis ( Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ) Using the culture solution of the KNU-26 strain (accession number KCTC14383BP), insecticidal composition.
상기 미생물 제제는 긴수염버섯파리 유충에 대해 살충 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 살충용 조성물.
4. The method of claim 3,
The microbial agent is characterized in that it has a pesticidal activity against the larvae of Mushroom fly larvae, insecticidal composition.
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