KR20220096353A

KR20220096353A - 마황 발효물을 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR20220096353A
Application number: KR1020200188720A
Authority: KR
Inventors: 노향선; 김규래; 전기범
Original assignee: (주)뷰티언스
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2022-07-07
Also published as: KR102538762B1

Abstract

마황 발효물을 함유하는 미백, 항산화, 항염증, 항노화 또는 피부 탄력 증진용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 상기 마황 발효물은 독성은 낮으면서도 탄력 증진, 항산화, 항염증, 미백 효능이 뛰어나 화장료 조성물 및 약학 조성물로 사용될 수 있다.

Description

마황 발효물을 함유하는 조성물{Composition containing fermented Ephedra}

마황 발효물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

마황은 중국 북부와 몽골 등지에 분포하는 상록관목으로 그 길이는 30cm 내지 70cm이며 폭은 약 1m 가량이고 한약재로 잘 알려져 있다. 알려진 효능으로는 발열, 천식, 두통 및 비만 개선 등이 있다.

종래, 마황 유산균 발효물의 비만 개선 효과(J Korean Med Rehabil, 19(4); 37-57, 2009), 마황 나노 추출물을 이용한 발효물 제조방법(국내 등록특허 10-0965961), 마황 나노 입자화 방법(국내 등록특허 10-1065443), 마황근 추출물을 함유하는 화장료 조성물(국내 등록특허 10-0562348) 등과 같은 논문 및 특허문헌이 알려져 있다.

그러나, 마황은 에페드린의 강한 독성으로 인해 식품, 약품 또는 화장품의 재료로 사용하는데 많은 한계가 있다. 따라서, 에페드린의 함량을 낮추면서도 기능성을 향상시킬 수 있는 마황 가공방법의 개발이 필요한 실정이다.

일 양상은 마황 발효물을 함유하는 미백, 항산화, 항염증, 항노화 또는 피부 탄력 증진용 조성물을 제공한다.

다른 양상은 상기 조성물을 함유하는 미백, 항산화, 항염증, 항노화 또는 피부 탄력 증진용 화장료 조성물을 제공한다.

다른 양상은 상기 조성물을 함유하는 미백, 항산화, 항염증, 항노화 또는 피부 탄력 증진용 약학 조성물을 제공한다.

다른 양상은 마황을 하나 이상의 단계로 발효시켜 발효물을 수득하는 단계를 포함하는 마황 발효물 제조방법을 제공한다.

마황 발효물을 함유하는 미백, 항산화, 항염증, 항노화 또는 피부 탄력 증진용 조성물을 제공한다.

상기 마황은 마황속(Ephedra) 식물을 총칭하며 초마황, 목적마황, 중마황 등인 것일 수 있다.

상기 마황은 마황의 지상부, 지하부 또는 전체, 예를 들면, 줄기, 뿌리, 잎, 꽃, 열매 등인 것일 수 있다. 특히, 마황의 지상부는 알칼로이드가 풍부하다.

상기 발효물은 상기 마황을 발효한 결과물을 의미한다. 상기 발효는 좁은 의미로 산소를 사용하지 않고 에너지를 얻는 유기물 분해 과정을, 넓은 의미로는 미생물이나 균류 등을 이용해 인간에게 유용한 물질을 얻어내는 과정을 의미한다. 예를 들면, 상기 마황 발효물은 발효시키고자 하는 마황을 포함하는 배지에서 균과 함께 배양함으로써 다양한 효소작용 등을 통해 생산되는 인간에 이로운 물질을 포함하는 것일 수 있다.

상기 마황은 마황 식물체 원물 또는 이를 건조한 것일 수 있다.

상기 마황은 마황 추출물인 것일 수 있다. 상기 추출물은 원료를 물리적으로 또는 용매를 사용하여 추출한 것으로, 특정 성분이 제거 또는 분리되지 않은 착즙물, 농축물 등을 포함하는 것일 수 있다. 상기 추출물은 조추출물, 조추출물을 추가적으로 분획한 분획물, 건조물, 정제물 등을 포함하는 것일 수 있다.

상기 마황 추출물은 마황을 진탕 추출, 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 초음파 추출, 침지 추출 등의 추출 방법을 사용하여 수득한 것일 수 있다.

상기 마황 추출물은 건조된 마황을 추출 용매 대비 무게비 1% 내지 90%, 2% 내지 50%, 5% 내지 30% 또는 7% 내지 20%를 사용하여 수득한 것일 수 있다(무게비는 w/w로도 표기). 상기 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 4의 알코올은 메탄올, 에탄올, n-프로판올, iso-프로판올, n-부탄올, tert-부탄올 등이 있다.

예를 들면, 상기 마황 추출물은 70℃ 내지 150℃, 80℃ 내지 120℃ 또는 90℃ 내지 110℃에서 열수 추출을 사용하여 수득한 것일 수 있다. 상기 마황 추출물은 1시간 내지 100시간, 2시간 내지 70시간, 3시간 내지 50시간, 4시간 내지 40시간, 5시간 내지 30시간 또는 6시간 내지 24시간 동안 열수 추출을 사용하여 수득한 것일 수 있다. 상기 온도 및 시간 조건에서 추출한 경우, 수율이 높으면서도 안정적으로 마황 추출물을 수득할 수 있다.

상기 마황 발효물은 마황을 하나 이상의 단계로 발효시켜 발효물을 수득하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 것일 수 있다.

상기 마황이 마황 원물인 경우, 마황 원물은 발효 배지 대비 무게비 1% 내지 90%로 첨가되는 것일 수 있다. 상기 마황이 마황 건조물인 경우, 건조된 마황 분말은 발효 배지 대비 무게비 1% 내지 90%로 첨가되는 것일 수 있다. 또는, 상기 마황이 마황 추출물인 경우, 마황 추출물은 발효 배지 대비 부피비 10% 내지 90%로 첨가되는 것일 수 있다. 상기 비율 조건에서 유효성분의 종류 및 함량이 우수한 마황 발효물을 수득할 수 있다.

상기 마황 발효물은 마황을 Arthrobacter 속, Pseudomonas 속 또는 이의 혼합 균주, 및 유산균, 효모균 또는 이의 혼합 균주와 순차적으로 발효시켜 수득한 발효물을 포함하는 것일 수 있다. 즉, 상기 마황 발효물은 마황을 Arthrobacter 속, Pseudomonas 속 또는 이의 혼합 균주와 배양하여 발효시켜 1단 발효물을 수득하는 단계 및 상기 1단 발효물을 유산균, 효모균 또는 이의 혼합 균주와 배양하여 발효시켜 2단 발효물을 수득하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 것일 수 있다.

상기 1단 발효물을 수득하는 단계에서, 발효 균주는 Arthrobacter 속의 A. agilis, A. bambusae, A. enclensis, A. flavus, A. gandavensis, A. globiformis, A. ginkgonis, A. halodurans, A. ramosus, A. roseus, A. russicus 및 A. sanguinis로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 발효 균주는 Pseudomonas 속의 P. aeruginosa group, P. chlororaphis group, P. fluorescens group, P. pertucinogena group, P. putida group, P. stutzeri group, 및 P. syringae group로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.

상기 마황 발효물은 마황을 발효시켜 1단 발효물을 수득하는 단계 및 1단 발효물에 비하여 상대적으로 고온에서 발효시켜 2단 발효물을 수득하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 것일 수 있다.

상기 1단 발효물을 수득하는 단계는 마황을 10℃ 내지 50℃, 15℃ 내지 40℃ 또는 20℃ 내지 30℃에서 발효시키는 것일 수 있다. 상기 1단 발효물을 수득하는 단계는 마황을 1일 내지 30일, 2일 내지 25일, 5일 내지 20일, 7일 내지 15일 또는 8일 내지 12일 동안 발효시키는 것일 수 있다.

상기 2단 발효물을 수득하는 단계는 상기 1단 발효물을 20℃ 내지 70℃, 25℃ 내지 50℃, 30℃ 내지 45℃ 또는 35℃ 내지 40℃에서 발효시키는 것일 수 있다. 상기 2단 발효물을 수득하는 단계는 0.5일 내지 20일, 1일 내지 15일, 1.5일 내지 10일 또는 2일 내지 5일 동안 발효시키는 것일 수 있다. 상기 범위 내에서 에페드린 함량이 현저히 감소하면서도, 라디칼 소거능, 콜라겐 생성능, 티로시나제 활성 저해능, 나이트로옥사이드 생성 억제능이 우수한 발효물을 수득할 수 있다.

상기 2단 발효물을 수득하는 단계에서, 발효 균주는 Acetobacter 속, Aspergilus 속, Bacillus 속, Bifidobacterium 속, Lactobacillus 속, Lactococcus 속, Leuconostoc 속, Rhodopseudomonas 속, Saccharomyces 속 및 Streptococcus 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 균주와 배양하여 발효시킨 것일 수 있다.

상기 Acetobacter 속 균주는 A. xylinum, A. orleanensis, A. papayae, A. syzygii 및 A. thailandicus로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 Aspergillus 속 균주는 A. niger, A. acidus, A. caesiellus, A. ficuum, A. jaipurensis, A. nakazawae, A. sacchari 및 A. vitricola로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 Bacillus 속 균주는 B. stearothermophilus, B. subtilis 및 B. amyloliquefaciens로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 Bifidobacterium 속 균주는 B. animalis, B. bifidum, B. adolescentis 및 B. longum로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 Lactobacillus 속 균주는 L. acidophilus, L. brevis, L. bulgaricus, L. casei, L. delbrueckii, L. paracasei, L. plantarum, L. rhamnosus HK9, L. rhamnosus, L. diacetylactis 및 L. lactis로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 Leuconostoc 속 균주는 L. mesenteroides, L. carnosum, L. inhae 및 L. garlicum로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 Lactococcus 속 균주는 L. garvieae, L. diacetylactis 및 L. lactis로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 Rhodopseudomonas 속 균주는 R. palustris, R. faecalis, R. julia, R. palustris 및 R. rhenobacensis로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 Saccharomyces 속 균주는 S. cerevisiae, S. exiguus, S. bayanus, S. ellipsoideus, S. eubayanus, S. pastorianus, S. florentinus 및 S. fragilis로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 Streptococcus 속 균주는 S. thermophilus, S. zooepidemicus, S. sanguinis, S. salivarius 및 S. mitis로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.

상기 1단 발효물을 수득하는 단계는 해당 균들이 마황 내 존재하는 에페드린을 소비 및 생장하여 1단 발효물 내 에페드린 함량을 최대로 낮출 수 있고, 상기 2단 발효물을 수득하는 단계는 유산균이나 효모균 등 유익균이 1단 발효물 내 존재하는 유용 성분들을 소비 및 생장하여 유효성분의 종류 및 함량을 극대화할 수 있다.

상기 발효물을 수득하는 단계는, 일정 기간 동안 균주가 생장하도록 유도한 후, 수득된 균체, 균체가 생장하면서 분비한 물질 및 생장에 필요한 영양 성분이 혼합된 배양액 원액, 원심분리 또는 불순물을 걸러내는 과정을 거쳐 수득된, 균체, 원액, 상등액 또는 이의 혼합물인 것일 수 있다.

상기 조성물은 발효물의 파쇄물을 포함하는 것일 수 있다. 즉, 상기 제조방법은 수득한 발효물을 초음파 처리하여 마황 파쇄물을 수득하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 마황 파쇄물을 수득하는 단계는 발효물을 10kHz 내지 250kHz, 15kHz 내지 160kHz 또는 20kHz 내지 120kHz의 조건에서 초음파 처리하는 것일 수 있다. 상기 마황 파쇄물을 수득하는 단계는 10분 내지 20시간, 20분 내지 10시간 또는 30분 내지 6시간 동안 초음파 처리하는 것일 수 있다. 상기 마황 파쇄물을 수득하는 단계는 상온에서 초음파 처리하는 것일 수 있다. 상기 초음파 처리는 유산균, 효모균 등을 파쇄함으로써 발효물 분만 아니라 세포 내 유용 성분들까지 용출시킬 수 있다.

상기 조성물은 발효물의 농축물 및/또는 건조물을 포함하는 것일 수 있다. 즉, 상기 제조방법은 농축 및/또는 건조하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 농축하는 단계는 감압 농축, 증발 농축, 진공 농축 등인 것일 수 있다. 상기 건조하는 단계는 동결 건조, 열풍 건조, 자연 건조, 진공 건조, 분무 건조 등인 것일 수 있다.

상기 미백은 멜라닌(Melanin) 등의 색소의 과다로 인하여 명도가 감소된 피부의 명도를 증가시키거나 또는 피부의 명도를 일정 수준으로 유지하는 방법, 상기 방법으로 형성된 명도가 증가된 피부 등을 의미하는 것이다. 멜라닌은 피부, 머리카락, 눈동자 등 생물체에 널리 분포되어 있는 색소 성분으로 인체 표피층의 멜라닌 세포(Melanocyte) 내의 멜라노좀 (Melanosome)에서 합성되는데, 티로시나제(Tyrosinase)에 의해 티로신(Tyrosine)을 시발 물질로 하여 도파(3,4-dihydroxy-phenylalanine: DOPA) 또는 도파퀴논(Dopaquinone)으로 변환되는 산화 및 중합 반응으로 멜라닌이 생합성될 수 있다. 멜라닌의 과도한 합성은 기미, 주근깨, 검버섯과 같은 색소 침착을 일으키기 때문에 티로시나아제 활성 측정은 피부 미백 효과를 나타내는 하나의 중요한 지표가 될 수 있다. 상기 마황 발효물은 티로시나제 저해 활성을 통해 피부 미백 및 색소 침착에 대한 예방 및 개선 효과를 가지는 것일 수 있다.

상기 항산화는 산화를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 인체는 산화촉진물질(prooxidant)과 산화억제물질(antioxidant)이 균형을 이루고 있으나 여러 가지 요인들에 의하여 불균형을 이루게 되고 산화가 촉진되면, 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되어 잠재적인 세포 손상 및 질환을 일으킬 수 있다. 이러한 산화적 스트레스의 직접적 원인이 되는 활성 산소종(reactive oxygen species: ROS)은 불안정하고 반응성이 높아 여러 생체 물질과 쉽게 반응하고, 체내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나 돌연변이, 세포독성, 발암 등을 초래할 수 있다. NO, HNO₂, ONOO-와 같은 활성 질소종(reactive nitrogen species: RNS)은 염증반응 시 대식세포 호중구 및 다른 면역세포의 면역반응으로 인해 다량 생성되며, 이 때 ROS도 같이 생성된다. 또한, 상기 항산화는 세포 대사 또는 자외선으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼(free radical) 또는 활성 산소종에 의한 세포의 산화를 억제하는 기능을 의미하며, 자유 라디칼 또는 활성 산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함하는 것일 수 있다. 상기 마황 발효물은 항산화 작용을 통해 활성 산소종 또는 활성 질소종으로 발생하는 질환, 피부를 포함한 인체의 노화, 아토피 피부염과 같은 염증성 질환에 대한 예방 및 개선 효과를 가지는 것일 수 있다.

상기 항염증은 염증을 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 염증반응은 생체 내 복구 체계의 증강 및 손상을 감소시키기 위한 것일 수 있다. 활성 산소종과 활성 질소종은 염증반응과 깊이 관련되어 있다. 염증 과정 중에는 많은 양의 염증유도 사이토카인(Proinflammatory cytokines), 나이트로옥사이드(Nitiric oxide: NO) 등이 생성될 수 있다. 상기 마황 발효물은 항염증 작용을 통해 염증성 피부 질환을 포함한 다양한 염증성 질환에 대한 예방 및 개선 효과를 가지는 것일 수 있다.

상기 항노화는 연령이 증가함에 따라 세포, 신체 등의 능력이 퇴화하는 정도를 완화시키는 작용을 의미한다. 콜라겐은 천연 단백질로 피부와 결합조직의 구성 성분이며, 피부, 힘줄, 인대, 각막, 연골, 뼈, 혈관, 내장 등에 존재한다. 상기 마황 발효물은 콜라겐 합성을 증진시키고 동시에 콜라겐 분해 효소 합성을 저해하여 피부와 결합조직 재생 효과를 가지는 것을 알 수 있다.

상기 피부 탄력 증진은 피부가 쳐지거나 늘어지는 정도를 완화시키거나 탄력을 복원하는 것으로, 엘라스틴으로 구성된 탄력섬유가 콜라겐이라고 하는 교원섬유와 함께 존재하는데, 엘라스틴과 콜라겐이 충분히 존재하는 상태를 의미한다. 상기 피부 탄력 증진은 주름 개선 효과를 동반하는데, 상기 주름 개선은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 의미한다. 상기 마황 발효물은 콜라겐 합성을 증진시키고 동시에 콜라겐 분해 효소 합성을 저해하여 피부 탄력을 증진함에 따라 피부쳐짐 및 주름 개선 효과를 가지는 것일 수 있다.

다른 양상은 상기 마황 조성물을 유효성분으로 함유하는 미백, 항산화, 항염증, 항노화 또는 피부 탄력 증진용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 마황 발효물은 하기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 에페드린 함량이 현저히 감소하면서도, 라디칼 소거능, 콜라겐 생성능, 티로시나제 활성 저해능, 나이트로옥사이드 생성 억제능이 우수하여, 기능성 화장료 조성물로서 적합하다.

상기 마황 발효물에 대하여는 상술한 바와 같다.

상기 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물은 일반 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들면, 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 배합한 것일 수 있다.

상기 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다. 상기 화장료 조성물의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우, 담체 성분은 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 포함하는 것일 수 있다. 상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우, 담체 성분은 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등을 포함하는 것일 수 있다. 상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우, 담체 성분은 용매, 용해화제, 유탁화제 등을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들면, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일, 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우, 담체 성분은 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜 등과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 등과 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라칸트 등을 포함하는 것일 수 있다. 상기 화장료 조성물의 제형이 비누인 경우, 담체 성분은 지방산의 알칼리 금속염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등을 포함하는 것일 수 있다.

다른 양상은 상기 마황 조성물을 유효성분으로 함유하는 미백, 항산화, 항염증, 항노화 또는 피부 탄력 증진용 약학 조성물을 제공한다.

상기 마황 발효물에 대하여는 상술한 바와 같다.

상기 마황 발효물은 하기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 에페드린 함량이 현저히 감소하면서도, 라디칼 소거능, 콜라겐 생성능, 티로시나제 활성 저해능, 나이트로옥사이드 생성 억제능이 우수하여, 색소 침착 질환, 활성 질소 또는 활성 산소로 인해 발생하는 질환 또는 염증성 질환, 노화(aging), 피부 손상을 예방, 개선 및 치료하는 약학 조성물로서 적합하다.

상기 색소 침착 질환은 주근깨, 노인성 반점, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 푸른 흑피증(Cyanic melasma), 임신성 갈색반 (Gravidic chloasma), 경구 피임약을 복용한 여성에서의 흑피증, 찰상 및 화상을 비롯한 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소 침착, 광독성 반응 등을 포함하는 것일 수 있다.

상기 활성 질소 또는 활성 산소로 인해 발생하는 질환은 동맥경화증, 루게릭병, 파킨슨병, 알츠하이머, 근위축색경화증 및 헌팅톤병을 포함하는 퇴행성 신경질환, 심근경색, 협심증, 관상동맥질환, 허혈성 심장질환을 포함하는 심혈관 질환, 뇌졸중을 포함하는 허혈성 뇌질환, 당뇨병, 위염 및 위암을 포함하는 소화기계 질환, 암, 백혈병, 노화, 류마티스 관절염, 간염, 아토피성 피부염, 노화 등을 포함하는 것일 수 있다.

상기 염증성 질환은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 것으로서, 알러지성 천식, 알러지성 비염, 알러지성 점막염, 두드러기 및 아나필락스(anaphylax)를 포함하는 알러지성 질환, 경피증(systemic sclerosis), 피부근염(dermatomyositis) 및 포함체 근육염(inclusion body myositis)을 포함하는 근병증, 관절염, 아토피성 피부염, 건선, 천식, 다발성 경화증, 바이러스 감염증, 패혈증, 다발성 연골염, 경피증, 습진, 통풍, 치주질환, 베체트 증후군, 부종, 맥관염, 가와사키병, 당뇨병성 망막염, 자가 면역 췌장염, 혈관염, 사구체 신염, 급성 및 만성 기관지염 등을 포함하는 것일 수 있다.

상기 노화는 연령이 증가하면서 세포, 신체 등의 능력이 퇴화하는 것을 의미한다.

상기 피부 손상은 찰상 및 화상을 비롯한 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 피부 괴사 등을 포함하는 것일 수 있다.

상기 약학 조성물은 단일제 또는 유사한 효과를 가진다고 알려진 약학 조성물을 추가로 포함한 복합제인 것일 수 있다.

상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가하여, 약제학적 단위 투여용으로 제형화된 것일 수 있다. 상기 "약학적으로 허용가능한"은 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미하며, 상기 투여는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 상기 약학 조성물을 도입하는 것을 의미한다.

상기 조성물은 경구 또는 비경구 제형인 것일 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 사용하여 조제된 것일 수 있다.

경구 투여를 위한 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하는 것일 수 있다. 상기 고형 제제는 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴과 같은 부형제, 스테아린산 마그네슘, 탈크와 같은 윤활제 등을 더 포함하는 것일 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제는 현탁제, 유제, 시럽제 등을 포함하는 것일 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등을 포함하는 것일 수 있다. 비수성용제 및 현탁용제는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등을 더 포함하는 것일 수 있다. 좌제는 기제로 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등을 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 약학 조성물은 투여 목적에 따라 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 횟수, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자 등에 따라 다르게 적용할 수 있다.

다른 양상은 마황을 하나 이상의 단계로 발효시켜 발효물을 수득하는 단계를 포함하는 마황 발효물 제조방법을 제공한다. 상기 제조방법은 마황을 Arthrobacter 속, Pseudomonas 속 또는 이의 혼합 균주와 배양하여 발효시켜 1단 발효물을 수득하는 단계 및 상기 1단 발효물을 유산균, 효모균 또는 이의 혼합 균주와 배양하여 발효시켜 2단 발효물을 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 제조방법은 수득한 발효물을 초음파 처리하여 마황 파쇄물을 수득하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 마황, 마황 추출물, 마황 발효물을 수득하는 단계, 마황 파쇄물에 대하여는 상술한 바와 같다.

상기 마황 발효물은 종래 독성을 가지는 에페드린의 함량이 낮으면서도, 미백, 항산화, 항염증, 항노화 및 탄력 증진과 같은 효능이 우수하여, 화장료 조성물 및 약학 조성물로 응용될 수 있다.

도 1은 마황 발효물의 세포독성을 나타낸다.
도 2는 마황 발효물의 1,1-다이페닐-2-파이크릴하이드라질(2,2-Dipheny-1-picrylhydrazyl: DPPH) 자유 라디칼 소거능을 나타낸다.
도 3은 마황 발효물의 콜라겐 합성능을 나타내는 도이다.
도 4는 마황 발효물의 매트릭스 메탈로프로테이나아제(Matrix metalloproteinase: MMP-1) 생성 저해율을 나타낸다.
도 5는 마황 발효물의 타이로시나제 효소 활성 저해율을 나타낸다.
도 6은 마황 발효물의 대식세포의 나이트로옥사이드 생성 억제능 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예. 마황 다단 발효 및 발효물 수득

국내산 마황 지상부 전체를 건조시키고 분말로 제조하였다. 증류수에 무게비 10% 마황 분말을 첨가한 후 100℃에서 24시간 환류 냉각 추출을 수행하였다. 여과지를 이용해 추출물에서 마황 찌꺼기를 제거하고 순수 용액만을 수득하였다.

증류수 1L에 상기 마황 추출물과 TSB 배지 분말 10g을 첨가한 후 멸균하였다. 이어서, Arthrobacter globiformis(ATCC 8010) 또는 Pseudomonas putida(ATCC 12633) 종균액(25℃, TSA 배지에서 배양)을 1%(v/v) 내지 10%(v/v)로 접종하였다. 접종 후, 25℃에서 100rpm으로 10일 동안 발효시켜 1단 발효물을 수득하였다.

1단 발효물에 유산균 배지인 MRS 배지가 함유된 배양액을 1:1(v/v)로 혼합하고, 이 혼합액에 Lactobacillus plantarum (ATCC 14917) 종균액(37℃, MRS 배지 분말이 1:10(w/v)로 함유된 배지에서 3일 동안 배양)을 1%(v/v) 내지 5%(v/v)로 접종하였다. 접종 후, 37℃에서 120rpm으로 5일 동안 발효시켜 2단 발효물을 수득하였다.

그 후, 2단 발효물을 실온에서 20kHz 내지 120 kHz로 30분 내지 4시간 동안 초음파로 파쇄하여 파쇄물을 수득하였다. 이어서, 파쇄물을 순차적으로 감압 여과, 감압 농축, 동결 건조하여 분말 발효물을 제조하였다.

실시예 1. 마황 발효물 내 에페드린 함량 확인

추출물, 1단 발효물 및 2단 발효물을 회전 진공 증발기에서 부피비 1/10로 감압 농축하고 동결 건조하여 분말을 수득하고, 분말에 잔존한 에페드린 농도를 측정하였다.

우선, 에페드린(ephedrine) 표준품 20 mg을 메탄올에 희석하여 1000 mg/L의 표준용액 스톡을 만들었다. 이어서, 표준용액을 희석하여 1mg/L 내지 100mg/L의 에페드린 용액을 제조하였다.

추출물, 1단 발효물 및 2단 발효물 분말 1g을 취하여 50mL 플라스크에 넣고 이어서 메탄올:이동상 A(7:3) 30mL를 넣은 후, 약 30분간 초음파 진탕 추출을 실시하였다. 그 다음, 메탄올:이동상 A(7:3)으로 정용하고 여과하였다.

분석에 사용된 액체크로마토그래프의 측정 조건은, 컬럼은 C18 (4.6mm × 250mm, 5μm) 또는 이와 동등한 것이며, 40℃에서 두 개의 이동상, 즉 이동상 A: 0.5mM의 소듐-1-헥세인-설포네이트(sodium-1-hexane sulfonate)를 함유한 0.1%의 인산 용액과 이동상 B: 95%의 아세토니트릴을 아래와 같은 방법으로 컬럼에 흐르게 하였다. 이 때, 이동상의 속도는 1.0mL/min 이며 UV 검출기 파장은 210nm, PDA 검출기 파장은 200nm 내지 400nm로 설정하였다.

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	90	10
2	90	10
30	50	50
42	0	100
50	90	10

표 2는 마황 추출물, 마황 1단 발효물 및 마황 2단 발효물에 존재하는 에페드린 함량을 비교한 결과를 나타낸다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 1단 발효물 및 2단 발효물은 추출물에 비하여 에페드린의 함량이 현저하게 낮은 것을 알 수 있다.

마황 추출물과 마황 1,2단 발효물에 존재하는 에페드린 함량 비교
추출물	1단 발효물	2단 발효물	단위
27.53	15.29	1.04	mg/g

실시예 2. 마황 발효물의 세포독성 평가

마황 발효물의 세포독성 여부를 MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) 어세이로 확인하였다.

인간 피부 섬유아세포(CCD-986sk)는 10%의 우태아혈청(Fetal bovine serum:FBS)을 첨가한 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle' medium)에서 배양하였다. 세포를 플레이트에 접종하고 2일마다 배지를 교환해주면서 37℃, 5%의 CO₂의 배양기에서 배양하면서 유지하였다.

세포를 48웰 플레이트에 1×10⁴ 세포/웰로 접종하고, 마황 추출물, 마황 1단 발효물 및 마황 2단 발효물 각각을 농도별(무게비 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%)로 투여하고, 24시간 동안 배양한 후, 세포 생존율을 확인하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 마황 발효물 투여군은 마황 추출물 투여군에 비하여 독성이 현저하게 낮았으며, 특히 마황 2단 발효물 투여군은 0.01% 내지 0.04%의 농도로 투여한 경우 대조군에 비하여 세포 생존율이 증가하였다. 또한, 최고 투여 농도인 0.05%의 농도에서도 세포 생존율이 약 93%로 독성이 낮은 것을 확인하였다. 즉, 마황 발효물은 세포 독성이 거의 없는 것을 알 수 있다. 이에 반해 마황 추출물은 모든 투여 농도에서 세포 생존율이 30% 이하로 상대적으로 독성을 보였다.

실시예 3. 마황 발효물의 항산화능 확인

마황 발효물의 항산화 활성을 DPPH 어세이로 확인하였다.

양성 대조군으로 Trolox를 사용하였으며 마황 추출물, 마황 1단 발효물 및 마황 2단 발효물 각각을 농도별(무게비 0.0078%, 0.0156%, 0.0312%, 0.0625%, 0.125%, 0.25%) 제조한 시료에 0.2mM의 DPPH 용액을 가하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 520nm에서 흡광도를 측정하여 농도에 따른 DPPH 라디칼 소거능을 하기 식으로 확인하였다. 시료를 첨가하지 않은 음성 대조군과 비교하여 자유 라디칼 소거 활성을 백분율로 나타내었다.

자유 라디칼 소거 활성률(%)=[1-(A-B)/C] x 100

A: 시료군의 흡광도

B: Blank의 흡광도

C: 음성 대조군 흡광도

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 마황 발효물 투여군은 마황 추출물 투여군에 비하여 자유 라디칼 소거 활성이 유의미하게 높았다. 특히, 0.125%의 마황 2단 발효물 투여군에서 95% 이상의 자유 라디칼 소거능을 보였으며, 0.125% 및 0.25%의 마황 2단 발효물 투여군에서 양성 대조군과 동등한 자유 라디칼 소거 활성을 보였다.

실시예 4. 마황 발효물의 탄력 증진 확인

실시예 4-1. 마황 발효물의 콜라겐 합성능 확인

마황 발효물의 콜라겐 합성능은 PICP EIA(Procollagen Type I C-peptide (PIP) EIA) 어세이로 확인하였다.

섬유아세포를 48웰 플레이트에 웰당 1×10⁴ 세포/웰로 접종하고, 마황 추출물, 마황 1단 발효물 및 2단 발효물 각각을 농도별(무게비 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02% 및 0.01%)로 투여하고 24시간 배양한 후, 배양액을 수거하여 세포 배양액 내 콜라겐 합성량을 측정하였다(PICP EIA Takara biomedical Co. 키트). 양성 대조군으로는 0.1ng/mL의 TGF-베타 1(TGF-β 1)을 투여한 것을 사용하였다.

플레이트 각 웰에 항체-PpD 콘쥬게이트 용액 100㎕를 넣은 다음, 시료 및 표준 용액 20㎕를 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 각 웰의 반응액을 제거하고 세척 버퍼(PBS: phosphate buffer saline)로 4회 세척하였다. 기질 용액 100㎕를 첨가하고 상온에서 15분 동안 반응시켰다. 이어서, 1N의 황산(H₂SO₄) 100㎕를 첨가하여 반응을 중지시킨 후, ELISA 리더기로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 마황 발효물 투여군은 60% 이상의 콜라겐 합성능을 보였다. 특히, 마황 2단 발효물 투여군은 콜라겐 합성이 음성 대조군 대비 20% 이상, 양성 대조군과 동등한 수준으로 현저하게 증가하였다.

앞서 마황 발효물 투여군은 마황 추출물 투여군에 비하여 세포독성이 매우 낮은 것으로 나타났는데, 마황 발효물은 그 독성이 미미하거나 거의 없고 마황 추출물은 자체 독성을 가지고 있어 그 영향인 것으로 볼 수 있다.

실시예 4-2. 마황 발효물의 콜라겐 분해효소 억제능 확인

마황 발효물의 콜라겐 분해효소 억제능은 MMP-1 생성 정도로 확인하였다.

섬유아세포를 48웰 플레이트에 웰당 1×10⁴ 세포/웰로 접종하고, 마황 추출물, 마황 1단 발효물 및 2단 발효물 각각을 농도별(무게비 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02% 및 0.01%)로 투여하고 24시간 배양한 후, 배양액을 수거하여 세포 배양액 내 콜라겐 분해효소 MMP-1 양을 측정하였다(Human MMP-1 ELISA Abcam 키트). 양성 대조군으로는 0.1ng/mL의 TGF-베타 1(TGF-β 1)을 투여한 것을 사용하였다.

플레이트 각 웰에 항체-PpD 콘쥬게이트 용액 100㎕를 넣은 다음 시료 및 표준 용액 50㎕를 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 각 웰의 반응액을 제거하고 세척 버퍼로 4회 세척하였다. 기질 용액 100㎕를 첨가하고 상온에서 15분 동안 반응시켰다. 이어서, 1N의 황산(H₂SO₄) 100㎕를 첨가하여 반응을 중지시킨 후, ELISA 리더기로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 마황 발효물 투여군은 MMP-1 생성이 현저하게 감소하였다. 마황 1단 발효물 투여군은 양성 대조군과 동등 또는 그 이상으로 MMP-1 생성이 저해되었으며, 특히 마황 2단 발효물 투여군은 MMP-1 생성이 40% 이상 저해되었다.

실시예 5. 마황 발효물의 미백능 확인

마황 발효물의 미백능은 티로시나제 활성 저해 정도로 확인하였다.

우선 버섯 유래 티로시나제(sigma aldrich)를 0.1M의 인산 완충 용액에 2000 유닛/mL로 녹여 동결 보존하고, 기질은 L-3,4-디하이드록시페닐 알라닌(L-3,4-dihydroxylphenyl alanine: L-DOPA)을 분석 직전에 조제하여 사용하였다.

티로시나제를 1/15M의 인산 완충 용액에 78 유닛/mL로 첨가하고 25℃에서 5분간 미리 반응(preincubation) 시키고, 마황 추출물, 마황 1단 발효물 및 2단 발효물 각각을 농도별(무게비 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02% 및 0.01%)로 투여한 후, L-DOPA를 첨가하였다. 양성 대조군으로는 알부틴을 투여한 것을 사용하였다. 475nm에서 10분 동안 흡광도를 측정하고, 티로시나제 저해도를 하기 식으로 확인하였다.

티로시나제 저해도(%)=[(A-B)-(C-D)/(A-B)] x 100

A: 시료가 없는 대조군의 475nm에서 흡광도

B: 시료와 효소가 없는 대조군의 475nm에서 흡광도

C: 시료와 효소를 넣은 실험군의 475nm에서 흡광도

D: 효소가 없는 대조군의 475nm에서 흡광도

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 마황 발효물 투여군은 티로시나제 억제가 양성 대조군과 유사한 수준을 보였고 마황 추출물 투여군에 비하여 현저히 높았다.

실시예 6. 마황 발효물의 염증 개선 확인

마황 발효물의 피부 면역 증진 효과는 대식세포에서 NO 생성 저해 정도로 확인하였다.

마우스 대식세포(RAW 264.7)를 96웰 플레이트에 웰당 1.5×10⁵ 세포/mL로 접종하고 24시간 배양한 다음, 1㎍/mL의 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide: LPS)를 처리한 군(+ 표시) 및 처리하지 않은 군(- 표시)으로 나눈 후, 리포폴리사카라이드 처리군에 마황 추출물, 마황 1단 발효물 및 2단 발효물 각각을 농도별(0.2mg/mL, 0.4mg/mL, 0.6mg/mL, 0.8mg/mL, 1mg/mL)로 200㎕를 첨가하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양액 상층액 50㎕를 새로운 96웰 플레이트에 옮긴 다음, Griess 시약 50㎕을 첨가하고 25℃에서 20분 동안 반응시킨 후, 540nm에서 흡광도를 측정하였으며 NaNO₂를 이용한 정량법을 이용하여 NO 생성량을 정량하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 마황 발효물 투여군은 마황 추출물 투여군에 비하여 NO 생성이 현저하게 감소하였다. 특히, 마황 2단 발효물 투여군은 NO 생성이 10% 이하로 더욱 저해되었다.

이제까지 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 특히 발효물을 얻기 위해 사용될 수 있는 다양한 종류의 균들을 이용한 발효물들도 같은 기능을 가지고 있어 본 실시예 대상에서 제외되지 않는다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

마황 발효물을 함유하는 미백, 항산화, 항염증, 항노화 또는 피부 탄력 증진용 조성물
청구항 1에 있어서, 상기 마황은 마황 지상부, 지하부 또는 전체인 것인 조성물
청구항 1에 있어서, 상기 마황 발효물은 마황을 Arthrobacter 속, Pseudomonas 속 또는 이의 혼합 균주, 및 유산균, 호모균 또는 이의 혼합 균주와 순차적으로 발효시켜 수득한 발효물을 포함하는 것인 조성물
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 조성물을 유효성분으로 함유하는 미백, 항산화, 항염증, 항노화 또는 피부 탄력 증진용 화장료 조성물
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 조성물을 유효성분으로 함유하는 미백, 항산화, 항염증, 항노화 또는 피부 탄력 증진용 약학 조성물