KR20220093947A - Herbal Extracts-Inactivated Virus Vaccine And Preparation Methods Thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 생약 추출물에 의해 불활화된 바이러스를 포함하는 백신 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 자세하게는 마가목 추출물 또는 감초 추출물에 의해 불활화된 바이러스를 포함하는 백신 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a vaccine composition comprising a virus inactivated by a herbal extract and a method for preparing the same, and more particularly, to a vaccine composition comprising a virus inactivated by a rowan extract or a licorice extract and a method for preparing the same.
약독화 백신(attenuated vaccine; live vaccine)은 병원성은 약하지만 증식력이 있는 바이러스를 포함하는 백신으로, 투여한 개체에서 체액성 면역반응뿐만 아니라 세포성 면역반응을 일으킬 수 있다는 장점이 있다. 그러나, 약독화 백신은 증식력이 있는 바이러스를 포함하기 때문에 집단 내 순환감염되면서 역돌연변이(back mutation)에 의해 병원성이 회복될 가능성이 있고, 보관 및 이동 중에 미생물의 감염성을 유지하기가 어려운 단점이 있다. 반면, 불활화 백신(inactivated vaccine; killed vaccine)은 죽은 바이러스이기 때문에 병원성의 회복이 나타날 수 없으며, 살아있는 미생물의 혼입이 일어나지 않으므로 약독화 백신보다 안전성이 높고 증식력이 있는 바이러스에 열, 자외선, 포르말린(포름알데하이드), BEI(Bianry Ethyleneimine) 및 베타-프로피오락톤 등을 처리하여 생산하므로 개발기간이 비교적 짧고 대량 생산시 효율이 높기 때문에 매우 경제적이어서 최근까지도 지속적인 개발이 이루어지고 있다.An attenuated vaccine (live vaccine) is a vaccine containing a virus that has a weak pathogenicity but has proliferative power, and has the advantage that it can induce a cellular immune response as well as a humoral immune response in the administered subject. However, since the attenuated vaccine contains a proliferative virus, there is a possibility that pathogenicity may be recovered by back mutation while circulating within a population, and it is difficult to maintain the infectivity of microorganisms during storage and movement. . On the other hand, since the inactivated vaccine (killed vaccine) is a dead virus, recovery of pathogenicity cannot occur, and the incorporation of live microorganisms does not occur, so it is safer than an attenuated vaccine, Formaldehyde), BEI (Bianry Ethyleneimine) and beta-propiolactone are processed and produced, so the development period is relatively short and the efficiency is high in mass production, so it is very economical.
기존 불활화백신 혹은 사백신은 대부분 독성이 있는 화학합성물질인 포름알데하이드(formaldehyde, FA)나 베타프로피오락톤(beta-propiolactone, BPL)을 불활화제로 사용하여 바이러스백신을 제조한다. 그러나, 포름알데하이드와 베타프로피오락톤은 발암물질로 규정되어 있어 백신 제작과정에서 작업자에 노출될 경우 심각한 독성을 나타낸다. 특히, 포름알데하이드는 독성이 매우 강하여 37%의 포름알데하이드 30 ml는 성인을 죽음에 이르게 할 수 있을 정도이다. 포름알데하이드는 들숨이나 피부 또는 눈을 통해 흡수되며, 두통, 호흡곤란 등의 증상을 유발하고 호흡기에 손상을 줄 수 있다. 따라서, 포름알데하이드나 베타프로피오락톤을 이용한 불활화 백신을 우리 몸에 접종할 경우 잔류에 의한 과민반응 및 부작용의 가능성이 있다. Most of the existing inactivated or dead vaccines use toxic chemical compound formaldehyde (FA) or beta-propiolactone (BPL) as an inactivating agent to manufacture virus vaccines. However, formaldehyde and beta-propiolactone are regulated as carcinogens, so they show serious toxicity when exposed to workers during vaccine production. In particular, formaldehyde is very toxic, and 30 ml of 37% formaldehyde is enough to kill an adult. Formaldehyde is absorbed through inhalation, skin, or eyes, and can cause symptoms such as headaches and shortness of breath and damage the respiratory system. Therefore, when an inactivated vaccine using formaldehyde or beta-propiolactone is inoculated into our body, there is a possibility of hypersensitivity reaction and side effects due to residual.
또한, 최종 백신 제품에는 포름알데하이드와 베타프로피오락톤을 완벽히 제거해야 하므로, 상기 물질들은 불활화 과정 이후에 투석을 통해 제거되어야만 하므로 바이러스 정제, 불활화 외에 투석으로 인한 추가 생산비용이 많이 발생하는 문제도 발생한다.In addition, since formaldehyde and beta-propiolactone must be completely removed from the final vaccine product, these substances must be removed through dialysis after the inactivation process. also occurs
뿐만 아니라, 포름알데하이드와 베타프로피오락톤은 단백질을 구성하는 20종의 아미노산 중에서 각각 16종, 8종 이상의 아미노산과 교차결합(cross-linking)을 통해 바이러스 항원을 심각하게 변형시키는 것으로 보고되어 있다. 이는 항체가 생성될 수 있는 주요 에피톱을 변경시켜 백신의 항체 유도능력을 저해시킬 수 있다는 단점이 된다.In addition, it has been reported that formaldehyde and beta propiolactone seriously modify the viral antigen through cross-linking with 16 and 8 or more amino acids, respectively, among 20 amino acids constituting the protein. This is a disadvantage in that the antibody inducing ability of the vaccine can be inhibited by altering the major epitope from which the antibody can be generated.
그러므로, 기존에 불활화제로 사용되고 있는 포름알데하이드 및 베타프로피오락톤를 대체할 수 있는 새로운 불활화제 개발의 필요성이 있다.Therefore, there is a need to develop a new inactivator that can replace formaldehyde and beta propiolactone which are used as inactivators in the past.
이에, 본 발명자는 다양한 생리활성을 갖고 인체 독성이 없는 생약 추출물을 이용하여 바이러스를 불활화시키고 이를 백신으로 사용하여 백신의 안전성과 효능을 동시에 보장하는 새로운 형태의 바이러스백신 불활화제 개발하고자 하였다. 그 결과, 마가목 추출물 또는 감초 추출물을 이용하는 경우 인플루엔자 바이러스를 효과적으로 불활화시킬 수 있으며, 마가목 추출물 또는 감초 추출물로 불활화된 바이러스를 포함하는 조성물의 경우 IgG 항체 유도 활성, 항-헤마글루티닌 항체 유도 활성 및 마이크로중화 항체 유도 활성이 우수하여 바이러스 백신 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors tried to develop a new type of virus vaccine inactivating agent that inactivates viruses using herbal extracts having various physiological activities and is not toxic to the human body, and uses it as a vaccine to ensure the safety and efficacy of the vaccine at the same time. As a result, when using a rowan extract or licorice extract, influenza virus can be effectively inactivated, and in the case of a composition containing a virus inactivated by the rowan extract or licorice extract, IgG antibody-inducing activity, anti-hemagglutinin antibody induction The present invention was completed by confirming that it can be usefully used as a virus vaccine composition due to its excellent activity and micro-neutralizing antibody inducing activity.
따라서 본 발명의 목적은 인체 독성이 없는 바이러스 불활화제 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a virus inactivating agent composition that is not toxic to humans.
본 발명의 다른 목적은, 인체 독성이 없는 바이러스 불활화제 조성물을 이용한 백신 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a vaccine composition using a virus inactivating agent composition that is not toxic to humans.
본 발명의 또 다른 목적은, 인체 독성이 없는 바이러스 불활화제 조성물을 이용한 백신 조성물의 제조방법 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for preparing a vaccine composition using a virus inactivating agent composition that is not toxic to humans.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,In order to achieve the object of the present invention as described above,
본 발명은 마가목 추출물 또는 감초 추출물을 유효성분으로 포함하는, 바이러스 불활화제 조성물을 제공한다.The present invention provides a virus inactivating agent composition comprising a rowan extract or licorice extract as an active ingredient.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 물 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the extract may be extracted with one or more solvents selected from the group consisting of a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms, ethyl acetate, acetone, water and hexane.
또한, 본 발명은 마가목 추출물 또는 감초 추출물에 의해 불활화된 바이러스를 포함하는, 백신 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a vaccine composition comprising a virus inactivated by a rowan extract or a licorice extract.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 에탄올 추출물일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the extract may be an ethanol extract.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자 A, B, 또는 C 바이러스일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the virus may be influenza A, B, or C virus.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 백신 조성물은 IgG 항체 유도 활성, 항-헤마글루티닌 항체 유도 활성 및 마이크로중화 항체 유도 활성을 가질 수 있다.In one embodiment of the present invention, the vaccine composition may have an IgG antibody inducing activity, an anti-hemagglutinin antibody inducing activity and a microneutralizing antibody inducing activity.
또한, 본 발명은 증식력이 있는 바이러스에 마가목 추출물 또는 감초 추출물을 첨가하고 혼합한 후 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 불활화 바이러스 백신의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing an inactivated virus vaccine, comprising the step of adding and mixing a rowan extract or a licorice extract to a virus having proliferative power, followed by incubation.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 에탄올 추출물일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the extract may be an ethanol extract.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계에서 인큐베이션은 15-50℃의 온도에서 실시할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the incubation in the above step may be carried out at a temperature of 15-50 ℃.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계에서 인큐베이션은 1시간 이상 실시할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the incubation in the above step may be carried out for 1 hour or more.
본 발명의 마가목 추출물 또는 감초 추출물은 바이러스를 효과적으로 불활화시킬 수 있으며, 상기 마가목 추출물 또는 감초 추출물로 불활화된 바이러스를 포함하는 조성물의 경우 IgG 항체 유도 활성, 항-헤마글루티닌 항체 유도 활성 및 마이크로중화 항체 유도 활성이 우수한바, 바이러스 백신 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.The rowan extract or licorice extract of the present invention can effectively inactivate viruses, and in the case of a composition comprising the virus inactivated by the rowan extract or licorice extract, IgG antibody inducing activity, anti-hemagglutinin antibody inducing activity and Since it has excellent microneutralizing antibody inducing activity, it can be usefully used as a virus vaccine composition.
도 1a는 마가목 에탄올 추출물의 농도별 항산화 활성을 나타낸 것이며; 1b는 감초 에탄올 추출물의 농도별 항산화 활성을 나타낸 것이고; 1c는 산수유 에탄올 추출물의 농도별 항산화 활성을 나타낸 것이며; 1d는 마가목, 감초 및 산수유 에탄올 추출물의 항산화 활성을 비교한 그래프이며; 1e는 마가목, 감초 및 산수유 에탄올 추출물의 폴리페놀함량을 비교한 그래프이다.
도 2a 내지 2c는 마가목, 감초 및 산수유 에탄올 추출물 각각의 세포독성을 평가한 결과이다(2a: 마가목 추출물, 2b: 감초 추출물, 2c: 산수유 추출물).
도 3은 마가목, 감초 및 산수유 에탄올 추출물 각각의 인플루엔자바이러스 A/Puerto Rico/8/34(H1N1, PR8)에 대한 사멸 활성을 평가한 것이다.
도 4a는 마가목 에탄올 추출물 또는 감초 에탄올 추출물로 불활화된 백신 조성물의 마우스 복강 투여 후 시간 경과에 따른 체중변화를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 4b는 마가목 에탄올 추출물 또는 감초 에탄올 추출물로 불활화된 백신 조성물의 마우스 복강 투여 후 시간 경과에 따른 생존율을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 5a는 마가목 에탄올 추출물 또는 감초 에탄올 추출물로 불활화된 백신 조성물의 마우스 복강 투여 후 혈청 내 IgG 항체 역가를 측정한 결과이다.
도 5b는 마가목 에탄올 추출물 또는 감초 에탄올 추출물로 불활화된 백신 조성물의 마우스 복강 투여 후 혈청 내 헤마글루티닌 억제(hemagglutinin-inhibition, HI) 항체 역가를 측정한 결과이다.
도 5c는 마가목 에탄올 추출물 또는 감초 에탄올 추출물로 불활화된 백신 조성물의 마우스 복강 투여 후 혈청 중화항체 역가를 측정한 결과이다.
도 6a는 마가목 에탄올 추출물 또는 감초 에탄올 추출물로 불활화된 백신 조성물의 마우스 복강 투여하고, 이후 야생형 인플루엔자바이러스를 비강투여하여 공격접종한 후 시간 경과에 따른 마우스의 체중변화를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 6b는 마가목 에탄올 추출물 또는 감초 에탄올 추출물로 불활화된 백신 조성물의 마우스 복강 투여하고, 이후 야생형 인플루엔자바이러스를 비강투여하여 공격접종한 후 시간 경과에 따른 마우스의 생존율을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.Figure 1a shows the antioxidant activity according to the concentration of the ethanol extract of Rowan; 1b shows the antioxidant activity of each concentration of licorice ethanol extract; 1c shows the antioxidant activity by concentration of the ethanol extract of Cornus officinalis; 1d is a graph comparing the antioxidant activity of rowan, licorice and cornus ethanol extracts; 1e is a graph comparing the polyphenol content of the ethanol extracts of rowan, licorice, and cornus oil.
Figures 2a to 2c are the results of evaluating the cytotoxicity of each of the ethanol extracts of rowan, licorice, and cornus oil (2a: rowan extract, 2b: licorice extract, 2c: cornus extract).
Figure 3 is an evaluation of the killing activity against the influenza virus A/Puerto Rico/8/34 (H1N1, PR8), respectively, of rowan, licorice and cornus ethanol extracts.
Figure 4a is a graph showing the change in body weight measured over time after intraperitoneal administration of a vaccine composition inactivated with an ethanol extract of Rowan or licorice ethanol extract.
Figure 4b is a graph showing the measurement of the survival rate over time after intraperitoneal administration of a vaccine composition inactivated with an ethanol extract of rowan or licorice ethanol extract.
Figure 5a is a result of measuring the IgG antibody titer in serum after intraperitoneal administration of a vaccine composition inactivated with an ethanol extract of Rowan or licorice ethanol extract.
Figure 5b is a result of measuring the hemagglutinin-inhibition (HI) antibody titer in serum after intraperitoneal administration of a vaccine composition inactivated with an ethanol extract of Rowan or licorice ethanol extract.
Figure 5c is a result of measuring the serum neutralizing antibody titer after intraperitoneal administration of a vaccine composition inactivated with an ethanol extract of Rowan or licorice ethanol extract.
Figure 6a is intraperitoneal administration of a vaccine composition inactivated with a rowan ethanol extract or licorice ethanol extract, and then, after intranasal administration of wild-type influenza virus to challenge inoculation, the change in body weight of the mouse over time is measured and shown as a graph.
Figure 6b is a graph showing the intraperitoneal administration of a vaccine composition inactivated with an ethanol extract of rowan or licorice ethanol extract, and then intranasal administration of wild-type influenza virus to measure the survival rate of mice over time after challenge inoculation.
본 발명은 마가목 추출물 또는 감초 추출물을 유효성분으로 포함하는, 바이러스 불활화제 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.The present invention is characterized by providing a virus inactivating composition comprising a rowan extract or licorice extract as an active ingredient.
본 발명의 ‘마가목’은 장미과의 낙엽활엽소교목으로 학명은 SORBUS COMMIXTA 이다. 높이 10m까지 자라는 낙엽소교목이지만 고산지대에서는 2~3m의 관목상으로 자라고 어린가지에 털이 거의 없으며 2년지는 흑갈색으로 되고 수간은 회색으로 되며 큰 피목이 있다. 잎은 길이 12~24cm의 우상복엽으로 소엽은 5~7쌍인데 가운데 있는 소엽이 가장 크고 길이는 2.5~8cm로 장타원형으로 예첨두, 예저이며 엽병이 없고 복거치가 있고 양면에 털이 없다. 꽃은 6~7월에 가지 끝에 지름 8~12cm의 복산방화서에 달리며 털이 있거나 없고 지름은 6~10mm로 백색이고 화경이 짧다. 꽃받침은 술잔 형이고 5개로 갈라지며, 열편은 넓은 삼각형이고, 꽃잎은 5개로 편원형이고 안쪽에 털이 있다. 수술은 20개, 화주는 3~4개로 기부에 털이 있으며 열매는 구형으로 지름 5~6mm정도인데 가을에 적색으로 익는다. 한방에서 마가목의 수피는 마아피라 하여 기관지염, 류마티스관절염, 중풍, 위염, 보신, 골통에 사용하며, 열매는 차로 이용하거나 생식할 수 있다.The 'Ranunculus' of the present invention is a deciduous broad-leaved small arboreous tree of the Rosaceae family, and the scientific name is SORBUS COMMIXTA It is a small deciduous tree that grows up to 10m in height, but grows as a shrub of 2~3m in alpine areas, has few hairs on young branches, turns blackish-brown at 2 years old, and has gray stems with large bark. Leaves are 12-24cm long, right-sided bilobed leaves, 5-7 pairs of leaflets. The central leaflet is the largest, 2.5-8cm long, long oval, sharp-pointed, acute-bottomed, without petioles, ventral teeth, and hairless on both sides. Flowers hang on the periwinkle of 8-12cm in diameter at the tip of branches in June-July, with or without hair, 6-10mm in diameter, white, and short peduncle. The calyx is in the shape of a wine glass, divided into 5 pieces, the lobe is wide triangular, and the petals are 5, flat-circular, with hairs on the inside. There are 20 stamens and 3 to 4 flowers, hairs on the base, and the fruits are spherical, 5-6mm in diameter, and ripen in red in autumn. In oriental medicine, the bark of the rowan tree is called maafira and is used for bronchitis, rheumatoid arthritis, stroke, gastritis, bosomnia, and bone pain. The fruit can be used as tea or raw.
본 발명의 ‘감초(甘草, Glycyrrhizaeradix)’는 많은 복합 처방에 빈번히 응용되는 일반적으로 안전한 한약제이다. 다년생 초본으로 근경(根莖)은 원주상(圓柱狀)인데 주근(主根)은 매우 길고 거칠고 크며, 외피(外皮)는 적갈색에서 암갈색이다. 뿌리는 단맛이 나서 감미료, 한약재로 사용하여, 중국 동북부와 시베리아, 몽골 등지에 분포한다. 감초의 근(根)과 근경(根莖)에는 트리테르펜(triterpene) 계(系) 사포닌(saponin), 글리시르히진(glycyrrhizin)이 함유되어 있는데, 이것은 글리시르히진산의 2-글루쿠론(glucuron)산 배당체로 감초의 감미성분이다. 이 배당체에는 혈액작용은 없으나 글리시르헤틴(glycyrrhetin)산에는 있다. 감초(根)의 가수분해 성분 중에는 우랄렌(uralen)산이 추출되어 이것이 18α-글리시르헤틴 산이라는 것이 증명되었다 (정보섭 외 1인,향약대사전, 영림사, pp684-687, 1988).'Licorice (Glycyrrhizaeradix)' of the present invention is a generally safe herbal medicine that is frequently applied to many complex prescriptions. It is a perennial plant, and the rhizome is columnar, and the main root is very long, rough and large, and the outer skin is reddish brown to dark brown. The root has a sweet taste and is used as a sweetener and herbal medicine, and is distributed in northeastern China, Siberia, and Mongolia. The root and rhizome of licorice contain triterpene-based saponin and glycyrrhizin, which is a 2-glucuron of glycyrrhizic acid. It is an acid glycoside and is a sweetening component of licorice. This glycoside has no blood activity, but is present in glycyrrhetin acid. Among the hydrolyzed components of licorice, uralenic acid was extracted, and it was proved that it is 18α-glycyrrhetinic acid (Bobo-seop et al.
본 발명자들은 상기와 같은 특징을 갖는 마가목 추출물 또는 감초 추출물이 바이러스를 효과적으로 불활화시킬 수 있다는 사실을 규명하였다(도 3 참조).The present inventors have identified the fact that a rowan extract or licorice extract having the above characteristics can effectively inactivate the virus (see FIG. 3 ).
그러므로 마가목 추출물 또는 감초 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 바이러스 불활화제로 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the composition of the present invention comprising a rowan extract or licorice extract as an active ingredient can be usefully used as a virus inactivating agent.
본 발명에 따른 마가목 추출물 또는 감초 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된‘추출물’은 적절한 용매를 이용하여 마가목 또는 감초로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 마가목 또는 감초의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다. As the rowan extract or licorice extract according to the present invention, those obtained by extraction and separation from nature using extraction and separation methods known in the art can be used, and the 'extract' as defined in the present invention is an extract using an appropriate solvent. It is extracted from rowan or licorice, and includes, for example, a crude extract of rowan or licorice, a polar solvent-soluble extract, or a non-polar solvent-soluble extract.
상기 마가목 또는 감초로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 에탄올(주정)을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 70% 에탄올을 사용하는 것이 좋다.As a suitable solvent for extracting the extract from the rowan tree or licorice, any pharmaceutically acceptable organic solvent may be used, and water or an organic solvent may be used, but is not limited thereto, for example, purified water, Alcohols having 1 to 4 carbon atoms, including methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, etc., acetone, ether, benzene, Various solvents such as chloroform, ethyl acetate, methylene chloride, hexane and cyclohexane may be used alone or in combination. Preferably, ethanol (ethanol) can be used, and more preferably, 70% ethanol is used.
추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 마가목 추출물 또는 감초 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.As the extraction method, any one of methods such as hot water extraction, cold extraction, reflux cooling extraction, solvent extraction, steam distillation, ultrasonic extraction, elution, and compression may be selected and used. In addition, the desired extract may be further subjected to a conventional fractionation process, and may be purified using a conventional purification method. There is no limitation on the method for preparing the rowan extract or licorice extract of the present invention, and any known method may be used.
예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 마가목 추출물 또는 감초 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.For example, the rowan extract or licorice extract included in the composition of the present invention is prepared in a powder state by an additional process such as distillation under reduced pressure and freeze drying or spray drying, the primary extract extracted by the hot water extraction or solvent extraction method described above. can do. In addition, the first extract was further purified using various chromatography methods such as silica gel column chromatography, thin layer chromatography, high performance liquid chromatography, etc. you may get
따라서 본 발명에 있어서 마가목 추출물 또는 감초 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.Therefore, in the present invention, the rowan extract or licorice extract is a concept including all extracts, fractions and purified products obtained in each step of extraction, fractionation or purification, and their dilutions, concentrates, or dried products.
본 발명의 일실시예에 따른 마가목 추출물 또는 감초 추출물을 제조하는 방법을 조금 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.A method for preparing a rowan extract or licorice extract according to an embodiment of the present invention will be described in more detail as follows.
본 발명에서는 건조된 마가목 또는 감초를 분쇄하여 분말화한 후, 상기 분말에 에탄올을 첨가하여 27℃에서 180 rpm 조건에서 10시간 동안 추출한 다음, 이러한 에탄올 추출물을 원심분리를 통해 상층액을 분리하고 여과 진행 후 동결건조하는 제조하는 과정을 거쳐 마가목 또는 감초 추출물을 수득할 수 있다.In the present invention, dried rowan or licorice is pulverized and pulverized, then ethanol is added to the powder, extracted at 27° C. and 180 rpm for 10 hours, and then the ethanol extract is centrifuged to separate the supernatant and filtered. After the progress, it is possible to obtain a rowan or licorice extract through a manufacturing process of freeze-drying.
또한, 본 발명은 마가목 추출물 또는 감초 추출물에 의해 불활화된 바이러스를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a vaccine composition comprising a virus inactivated by a rowan extract or a licorice extract.
본 발명에서 ‘백신’은 대상(subject)의 면역 반응에 긍정적으로 영향을 주는 조성물을 의미하는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 백신 조성물은 대상에게 세포성 면역 반응, 예를 들어 CTL(Cytotoxic T Lymphocyte) 또는 체액성 면역 반응, 예를 들어 항체에 의해 유발되는 향상된 전신적 또는 국소적 면역 반응을 제공한다.In the present invention, 'vaccine' is used in the broadest sense to mean a composition that positively affects the immune response of a subject. The vaccine composition provides the subject with an enhanced systemic or local immune response elicited by a cellular immune response, eg, a Cytotoxic T Lymphocyte (CTL) or a humoral immune response, eg, an antibody.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 바이러스는 외피 바이러스(enveloped virus) 또는 비-외피 바이러스(non-enveloped virus)이다. 본 발명의 외피 바이러스는 폭스 비리다애(Poxviridae, 예컨대 백시니아(Vaccinia) 및 천연두), 이리도비리다애(Iridoviridae), 헤르페스비리다애(Herpesviridae, 예컨대 단순포진, 바리셀라 바이러스, 사이토메갈로바이러스 및 엡스타인-바 바이러스), 플라비비리다애(Flaviviridae, 예컨대 황열 바이러스, 틱-본 뇌염 바이러스 및 C형 간염 바이러스), 토가바리다애(Togaviridae, 예컨대 풍진 바이러스 및 신드비스 바이러스), 코로나비리다애[Coronaviridae, 예컨대 인간 코로나바이러스(SARS 중증급성호흡기증후군 바이러스), 닭 전염성 기관지염 바이러스(Infectious Bronchitis Virus, IBV)], 파라믹소비리다애(Paramyxoviridae, 예컨대 파라인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스 및 호흡기 세포융합 바이러스), 랍도비리다애(Rabdoviridae, 예컨대 소포 구내염 바이러스 및 광견병 바이러스), 필로비리다애(Filoviridae, 예컨대 마버그 바이러스 및 에볼라 바이러스), 오르토믹소비리다애(Orthomyxoviridae, 예컨대 인플루엔자 A 및 B 바이러스), 버니아비리다애(Bunyaviridae, 예컨대 브왐바(Bwamba) 바이러스, 캘리포니아 뇌염 바이러스, 샌드플라이 열 바이러스 및 계곡열 바이러스), 아레나비리다애(Arenaviridae, 예컨대 LCM 바이러스, 라사 바이러스, 주닌 바이러스), 헤파드나비리다애(Hepadnaviridae, 예컨대 B형 간염 바이러스), 및 레트로비리다애(Retroviridae, 예컨대 HTLV 및 HIV)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 비-외피 바이러스는 노로 바이러스, 로타 바이러스, 아데노 바이러스, 폴리오 바이러스, 및 레오 바이러스(Reovirus)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 바이러스는 외피 바이러스이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다. 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 포유동물 또는 조류에 감염할 수 있는 인플루엔자 바이러스를 포함하며, 예를 들어 조류, 사람, 개, 말, 돼지, 고양이 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 자체 및 종래 공지된 다양한 인플루엔자 바이러스-유래 항원을 포함한다. 상기 항원은 바이러스의 구성성분 중 면역기능을 일으킬 수 있는 항원 성분을 말하며, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 뉴클레오프로틴(NP: neucleoprotein), 헤마글루티닌(HA: Hemagglutinin), 뉴라미니다제(NA: neuraminidase) 또는 이들의 단편이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 A형 인플루엔자 바이러스, B형 인플루엔자 바이러스 또는 C형 인플루엔자 바이러스이다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 A형 인플루엔자 바이러스로 A/H1N1, A/H3N2, A/H5N2, A/H9N2 바이러스이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 A/H1N1 바이러스는 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스, A/Chile/1/83(H1N1) A/NWS/33, 또는 A/Korea/01/2009(H1N1) 바이러스이다. 상기 인플루엔자 바이러스는 사람에서 독감, 감기, 인후염, 기관지염 또는 폐렴을 일으킬 수 있으며, 특히 조류독감, 돼지독감 또는 염소독감을 야기시킬 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the virus of the present invention is an enveloped virus or a non-enveloped virus. Enveloped viruses of the present invention include Poxviridae, such as Vaccinia and smallpox, Iridoviridae, Herpesviridae, such as herpes simplex, varicella virus, cytomegalovirus and Epstein-Barr. viruses), Flaviviridae (such as yellow fever virus, tick-borne encephalitis virus and hepatitis C virus), Togaviridae (such as rubella virus and sindbis virus), Coronaviridae (such as human Coronavirus (SARS Severe Acute Respiratory Syndrome Virus), Chicken Infectious Bronchitis Virus (IBV)], Paramyxoviridae, such as parainfluenza virus, mumps virus, measles virus and respiratory syncytial virus), lab Rabdoviridae (such as vesicular stomatitis virus and rabies virus), Filoviridae (such as Marburg virus and Ebola virus), Orthomyxoviridae (such as influenza A and B viruses), verniviridae (Bunyaviridae, such as Bwamba virus, California encephalitis virus, sandfly fever virus and valley fever virus), Arenaviridae such as LCM virus, Lassa virus, Junin virus), Hepadnaviridae such as hepatitis B virus), and Retroviridae (such as HTLV and HIV). Non-enveloped viruses of the present invention include, but are not limited to, norovirus, rotavirus, adenovirus, poliovirus, and Reovirus. According to another embodiment of the present invention, the virus of the present invention is an enveloped virus. According to a specific embodiment of the present invention, the virus of the present invention is an influenza virus. The influenza virus of the present invention includes an influenza virus that can infect mammals or birds, for example, birds, humans, dogs, horses, pigs, cats, etc., but is not limited thereto. The influenza virus of the present invention includes the influenza virus itself and various previously known influenza virus-derived antigens. The antigen refers to an antigen component capable of causing immune function among the components of the virus, and according to a specific embodiment of the present invention, nucleoprotein (NP: neucleoprotein), hemagglutinin (HA: Hemagglutinin), neuraminid agent (NA: neuraminidase) or a fragment thereof. According to another embodiment of the present invention, the influenza virus of the present invention is influenza A virus, influenza B virus or influenza C virus. According to one embodiment of the present invention, the influenza virus of the present invention is an influenza A virus, which is A/H1N1, A/H3N2, A/H5N2, and A/H9N2 viruses. According to a specific embodiment of the present invention, the A/H1N1 virus of the present invention is A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) virus, A/Chile/1/83 (H1N1) A/NWS/33, or A/Korea /01/2009 (H1N1) virus. The influenza virus may cause influenza, cold, sore throat, bronchitis or pneumonia in humans, and in particular may cause bird flu, swine flu or goat flu.
본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 바이러스는 코로나 바이러스이다. 본 발명의 코로나 바이러스는 사람을 비롯한 포유류, 조류 등의 동물에 감염하여 호흡기 또는 위장관에 질병을 일으키는 코로나 바이러스를 포함하며, 숙주에 감염하여 체중감소, 콧물, 발열, 기침, 두통, 설사 등의 임상증상을 일으킬 수 있다. 상기 코로나 바이러스는 중중급성호흡기증후군 바이러스(SARS-CoV), 중동호흡기증후군 바이러스(MERS-CoV)전염성 기관지염 바이러스(IBV), 돼지의 전염성 위장염 바이러스(TGE), 돼지 유행성 설사 바이러스(PED), 소 코로나바이러스(BCoV), 고양이/개 코로나 바이러스(FCoV/CCoV), 마우스 간염 바이러스(MHV) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 코로나 바이러스는 전염성 기관지염 바이러스(IBV) strain M14로, 2003년 아시아에서 발생한 뒤 전 세계로 확산되며 800명 가까운 사망자를 낸 중증급성호흡기증후군 바이러스(SARS-CoV) 및 주로 사우디와 아랍에미리트, 요르단, 카타르 등 중동 지역에서 감염자가 발생하다가 2015년 5월부터 우리나라 전역에서 100명이 넘는 감염자가 발생했던 중동호흡기증후군 바이러스(MERS-CoV)와 같은 속에 속하여 유전적으로 유사하다 (Travis R. Ruch 등, 2012. The Coronavirus E Protein: Assembly and Beyond. Viruses 4(3), 363-382/ Xing-Yi Ge 등, 2013. Isolation and characterization of a bat SARS-like coronavirus that uses the ACE2 receptor. Nature 503, 535-538). According to certain embodiments of the present invention, the virus of the present invention is a corona virus. The corona virus of the present invention includes a coronavirus that infects animals such as humans, mammals, birds, etc. and causes diseases in the respiratory or gastrointestinal tract, and infects the host to cause clinical symptoms such as weight loss, runny nose, fever, cough, headache, diarrhea, etc. can cause symptoms. The corona virus is moderate to acute respiratory syndrome virus (SARS-CoV), Middle East respiratory syndrome virus (MERS-CoV), infectious bronchitis virus (IBV), swine infectious gastroenteritis virus (TGE), swine epidemic diarrhea virus (PED), bovine corona virus (BCoV), feline/canine coronavirus (FCoV/CCoV), mouse hepatitis virus (MHV), and the like. According to a specific embodiment of the present invention, the coronavirus of the present invention is an infectious bronchitis virus (IBV) strain M14, which originated in Asia in 2003 and spread around the world, causing close to 800 deaths (SARS-) CoV) and the Middle East Respiratory Syndrome Virus (MERS-CoV), which occurred in the Middle East, such as Saudi Arabia, the United Arab Emirates, Jordan and Qatar, and had more than 100 infections across Korea since May 2015. (Travis R. Ruch et al., 2012. The Coronavirus E Protein: Assembly and Beyond. Viruses 4(3), 363-382/ Xing-Yi Ge et al., 2013. Isolation and characterization of a bat SARS-like coronavirus that uses the ACE2 receptor. Nature 503, 535-538).
본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 바이러스는 인유두종 바이러스이다. 본 발명의 인유두종바이러스는 사람에서 사마귀을 유발하는 바이러스의 일종으로, 약 100여종 이상이 있으며, 피부 표면에 감염되어 손과 발 및 생식기 점막에 사마귀를 발생시키며 여성의 경우 자궁경부암을 일으킬 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 인유두종 바이러스는 구체적으로는 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66번 유형일 수 있고, 보다 구체적으로는 16번 유형일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the virus of the present invention is a human papilloma virus. The human papillomavirus of the present invention is a kind of virus that causes warts in humans, and there are about 100 or more types. It infects the skin surface and causes warts on the hands, feet, and genital mucosa, and can cause cervical cancer in women. According to a specific embodiment of the present invention, the human papillomavirus may specifically be
본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 바이러스는 노로바이러스이다. 본 발명의 노로바이러스는 사람에서 심한 구역질과 구토, 설사, 복통, 오한, 38℃ 정도의 발열 등을 유발하며, 노르워크(Norwalk) 바이러스를 포함한다.According to one embodiment of the present invention, the virus of the present invention is a norovirus. The norovirus of the present invention causes severe nausea and vomiting, diarrhea, abdominal pain, chills, and fever of about 38°C in humans, and includes Norwalk virus.
본 발명의 상기 마가목 추출물 또는 감초 추출물은 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 물 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출된 추출물일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올 추출물일 수 있다.The rowan extract or licorice extract of the present invention may be an extract extracted with one or more solvents selected from the group consisting of lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms, ethyl acetate, acetone, water and hexane, preferably an ethanol extract. have.
본 발명의 백신 조성물은 IgG 항체 유도 활성, 항-헤마글루티닌 항체 유도 활성 및 마이크로중화 항체 유도 활성를 갖는다(도 5a 내지 5c 참조)The vaccine composition of the present invention has an IgG antibody inducing activity, an anti-hemagglutinin antibody inducing activity and a microneutralizing antibody inducing activity (see FIGS. 5A to 5C ).
본 발명의 백신 조성물은 약제학적 유효량의 본 발명의 마가목 추출물 또는 감초 추출물에 의해 불활화된 바이러스를 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 명세서의 용어 "약제학적 유효량"은 바이러스에 의해 유발되는 질병 또는 병리학적 증상에 대한 예방, 경감 또는 치료적 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다. 본 발명인 백신 조성물은 기타 구성성분, 예컨대 안정화제, 부형제, 기타 약학적 허용 화합물 또는 임의의 기타 항원 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 백신은 냉동 건조된 제제 또는 현탁액의 형태로서 존재할 수 있으며, 이들은 모두 백신 생성 분야에 일반적인 것들이다.The vaccine composition of the present invention contains a pharmaceutically effective amount of virus inactivated by the rowan extract or licorice extract of the present invention. The vaccine composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier. As used herein, the term “pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to achieve prevention, alleviation, or therapeutic efficacy for a disease or pathological condition caused by a virus. Pharmaceutically acceptable carriers that may be included in the composition of the present invention are commonly used in formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, silicic acid. calcium, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like. it is not The composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like, in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and agents are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995). The vaccine composition of the present invention may contain other components, such as stabilizers, excipients, other pharmaceutically acceptable compounds or any other antigen or portion thereof. Vaccines may be in the form of freeze-dried preparations or suspensions, all of which are common in the art of vaccine production.
본 발명인 백신 조성물의 투여 형태는 장용피 사용 단위체의 형태, 복강내, 근육내 또는 피하 투여용 접종, 에어로졸 분무, 경구 또는 비강내 용도일 수 있다. 음용수 또는 식용 펠렛으로 투여하는 것도 가능하다. 본 발명의 백신 조성물은 이종 항원 및 시토킨과 같은 면역 조절 분자를 동일한 재조합체내에서 발현시켜 단일 백신으로 전달할 수도 있으며, 상이한 외래 유전자 또는 면역증강제를 보유하는 2 이상의 바이러스벡터를 포함하는 "칵테일"로서 투여할 수 있다. 본 명세서의 용어, "면역증강제(adjuvant)"는 일반적으로 항원에 대한 체액 또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질(예컨대, alum, 프로인트 완전 어주번트, 프로인트 불완전 어주번트, LPS, poly IC, poly AU 등)을 의미한다.The dosage form of the vaccine composition of the present invention may be in the form of an enteric coating unit, inoculation for intraperitoneal, intramuscular or subcutaneous administration, aerosol spray, oral or intranasal use. It is also possible to administer in drinking water or as edible pellets. The vaccine composition of the present invention can be delivered as a single vaccine by expressing heterologous antigens and immune modulatory molecules such as cytokines in the same recombinant, and as a "cocktail" comprising two or more viral vectors carrying different foreign genes or adjuvants. can be administered. As used herein, the term "adjuvant" generally refers to any substance that increases a humoral or cellular immune response to an antigen (eg, alum, Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, LPS, poly IC , poly AU, etc.).
또한, 본 발명은 증식력이 있는 바이러스에 마가목 추출물 또는 감초 추출물을 첨가하고 혼합한 후 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 불활화 바이러스 백신의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing an inactivated virus vaccine, comprising the step of adding and mixing a rowan extract or a licorice extract to a virus having proliferative power, followed by incubation.
본 발명의 상기 마가목 추출물 또는 감초 추출물은 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 물 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출된 추출물일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올 추출물일 수 있다.The rowan extract or licorice extract of the present invention may be an extract extracted with one or more solvents selected from the group consisting of lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms, ethyl acetate, acetone, water and hexane, preferably an ethanol extract. have.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 인큐베이션은 1시간 이상 실시할 수 있다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 인큐베이션은 1-96시간, 1-72시간, 1-48시간, 1-36시간, 1-30시간, 1-24시간, 3-96시간, 3-72시간, 3-48시간, 3-36시간, 3-30시간, 3-24시간, 6-96시간, 6-72시간, 6-48시간, 6-36시간, 6-30시간, 6-24시간 실시하며, 최소 1시간 이상 실시하면 본 발명의 실시예에서와 같이 바이러스의 증식이 억제되어 바이러스 불활화의 목적을 달성할 수 있고 그 이상의 시간 동안 실시하여도 바이러스를 불활화하는 목적을 달성할 수 있음은 당업자에게 자명한 사실이다. 하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 바이러스에 마가목 추출물 또는 감초 추출물을 1mg/ml(0.1% wt/vol) 농도로 처리하여 35℃에서 24시간 인큐베이션을 실시한 결과 바이러스를 완벽하게 사멸하는 것을 확인하였다(도 3 참조).According to another embodiment of the present invention, the incubation of the present invention may be carried out for 1 hour or more. According to certain embodiments of the present invention, the incubation of the present invention is 1-96 hours, 1-72 hours, 1-48 hours, 1-36 hours, 1-30 hours, 1-24 hours, 3-96 hours, 3 -72 hours, 3-48 hours, 3-36 hours, 3-30 hours, 3-24 hours, 6-96 hours, 6-72 hours, 6-48 hours, 6-36 hours, 6-30 hours, 6 It is carried out for 24 hours, and if carried out for at least 1 hour, the propagation of the virus is suppressed as in the embodiment of the present invention, so that the purpose of virus inactivation can be achieved. It is apparent to those skilled in the art that this can be achieved. As demonstrated in the examples below, it was confirmed that the virus was completely killed as a result of incubation at 35 ° C. see Fig. 3).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 인큐베이션 단계 이후에 부형제를 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 명세서에서 용어 “부형제”는 상기한 약제학적으로 허용되는 담체 외, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 및 면역보강제 등을 포함하는 의미로, 본 발명의 백신 제조와 관련된 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 부형제를 포함한다.According to one embodiment of the present invention, the present invention may further include the step of adding an excipient after the incubation step. As used herein, the term “excipient” is meant to include, in addition to the pharmaceutically acceptable carriers, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and immune adjuvants, etc., and All excipients commonly used in the relevant field are included.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 인큐베이션 단계 이후, 여과, 멸균, 및 희석하는 단계를 더 포함할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the present invention may further include the steps of filtration, sterilization, and dilution after the incubation step.
상기 여과, 멸균, 및 희석 단계는 본 발명의 마가목 추출물 또는 감초 추출물에 의해 불활화된 바이러스를 포함하는 조성물에 포함된 이물질을 제거하는 여과 단계와, 불활화된 바이러스 및 부형제 이외에 백신 보관용기에 혼입될 수 있는 미생물(바이러스, 세균, 및 곰팡이를 포함한다)을 멸균하는 단계 및 불활화된 바이러스를 포함하는 조성물을 약제학적 유효농도에 맞추어 희석하는 단계로서, 본 발명의 백신 제조와 관련된 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 여과, 멸균, 및 희석 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. The filtration, sterilization, and dilution steps are a filtration step of removing foreign substances contained in the composition containing the virus inactivated by the Rowan extract or licorice extract of the present invention, and the inactivated virus and excipients in addition to the vaccine storage container. Sterilizing possible microorganisms (including viruses, bacteria, and fungi) and diluting the composition containing the inactivated virus to a pharmaceutically effective concentration, which is common in the field related to the preparation of the vaccine of the present invention Any filtration, sterilization, and dilution method used in the present invention can be used without limitation.
본 발명의 제조방법은 상술한 백신 조성물과 마가목 추출물 또는 감초 추출물, 바이러스 및 백신을 공통으로 하기 때문에, 상기 백신 조성물과의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.Since the manufacturing method of the present invention has the above-described vaccine composition and the Rowan extract or licorice extract, virus and vaccine in common, the description of common contents in relation to the vaccine composition is omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification. .
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These Examples are for explaining the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited to these Examples.
<실시예><Example>
1. 실험재료 및 실험방법1. Experimental materials and methods
<1-1> 동물세포, 바이러스, chicken RBC, 마우스<1-1> Animal cells, virus, chicken RBC, mouse
MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 세포와 RAW 264.7 세포는 각각 ATCC(American Type Culture Collection)와 KCLB(Korea Cell Line Bank, 대한민국)로부터 구입하였고, 10% FBS(Fetal Bovine Serum, Hyclone, 미국)가 포함된 MEM(Minimal Essential Medium, Hyclone, 미국) 배지를 이용하여 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. 인플루엔자바이러스 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)는 11일된 유정란에 접종하여 37℃ 인큐베이터에서 4일 동안 배양한 후 요막액(allantoic fluid)을 채취하여 원심분리로 불순물을 제거하고 -80℃ 냉동시설에서 보관하였다. 5% chicken RBC (Innovative Research, 미국)를 구매하여 PBS에 희석하여 1% 농도로 사용하였다. 5주령 balb/c Female 마우스를 오리엔트바이오(대한민국)에서 구입하여 1주일 동안 순화 기간을 거친 후 실험을 진행하였다. 모든 마우스 실험 과정은 국제백신연구소(IVI) 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 가이드라인에 따라 수행하였다.MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) cells and RAW 264.7 cells were purchased from ATCC (American Type Culture Collection) and KCLB (Korea Cell Line Bank, Korea), respectively, and contained 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Hyclone, USA). MEM (Minimal Essential Medium, Hyclone, USA) medium was used to 5% CO 2 , and cultured at 37°C. Influenza virus A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) was inoculated into 11-day-old fertilized eggs, incubated for 4 days in an incubator at 37°C, allantoic fluid was collected, impurities were removed by centrifugation, and frozen at -80°C. kept at the facility. 5% chicken RBC (Innovative Research, USA) was purchased and diluted in PBS and used at a concentration of 1%. Five-week-old balb/c female mice were purchased from Orient Bio (Korea) and acclimatized for one week before the experiment. All mouse experimental procedures were performed in accordance with the guidelines of the International Vaccine Institute (IVI) Animal Experimental Ethics Committee (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC).
<1-2> 생약 에탄올 추출물 제조<1-2> Preparation of herbal ethanol extract
동우당제약(주)에서 제공받은 마가목, 감초, 산수유를 분쇄하여 분말화하여 추출물 제조에 사용했다. 에탄올 추출법을 이용하여 추출을 진행하였으며, 시료와 시료 무게의 10배수 에탄올을 혼합하여 27℃, 180 rpm 조건에서 10시간 동안 추출하였다. 추출 후 원심분리(4,000 xg, 30 min)를 통해 상층액을 분리하여 Whatman filter paper No.1 (pore size : 11 μm)여과지를 사용하여 여과 진행 후 동결건조하였다.Rowan, licorice, and cornus oil provided by Dongwoodang Pharmaceutical Co., Ltd. were crushed and powdered and used to prepare the extract. Extraction was performed using the ethanol extraction method, and the sample was mixed with
<1-3> 인플루엔자 바이러스 불활화 백신 제조<1-3> Manufacturing of influenza virus inactivated vaccine
상기 <1-2>를 통해 제조한 생약 에탄올 추출물(마가목, 감초, 산수유) 각각을 1mg/ml(0.1% wt/vol) 농도가 되도록 PBS에 희석하여 사용하였다. 상기 0.1%(w/v) 농도의 추출물과 A/Puerto Rico/8/34(H1N1, PR8) 2.5×106 내지 5×107 plaque forming units (PFUs)가 포함된 용액을 부피비 1:1로 혼합하고 35℃에서 24시간 동안 반응시켜 인플루엔자 불활화 백신을 제조하였다.Each of the herbal ethanol extracts (Ranunculus, Licorice, and Cornus officinalis) prepared through <1-2> was diluted in PBS to a concentration of 1 mg/ml (0.1% wt/vol) and used. The extract at a concentration of 0.1% (w/v) and A/Puerto Rico/8/34 (H1N1, PR8) 2.5×10 6 to A solution containing 5×10 7 plaque forming units (PFUs) was mixed at a volume ratio of 1:1 and reacted at 35° C. for 24 hours to prepare an influenza inactivated vaccine.
<1-4> 추출물의 항산화 활성 측정<1-4> Measurement of antioxidant activity of extracts
생약 추출물의 항산화 활성을 확인하기 위하여 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 시험법을 사용하였다. 실험에 사용된 생약 추출물 시료는 에탄올에 녹여 각각 1,250, 2,500, 5,000, 10,000, 15,000, 20,000 ppm (mg/L)으로 사용했다. 96 웰 플레이트(well plate)에 100 μM DPPH reagent 180 μL와 생약 추출물 시료 20 μL를 각 웰(well)에 분주하여 30분 동안 반응시킨 후 마이크로 리더(micro-reader)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정한다. 음성 대조군 그룹은 시료의 용매인 에탄올을 분주하였다. 생약 추출물 시료의 DPPH 라디칼 소거 활성(%)은 아래의 식을 이용하여 계산하였다.To confirm the antioxidant activity of the herbal extract, DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) test method was used. The herbal extract samples used in the experiment were dissolved in ethanol and used at 1,250, 2,500, 5,000, 10,000, 15,000, and 20,000 ppm (mg/L), respectively. In a 96-well plate, 180 µL of 100 µM DPPH reagent and 20 µL of herbal extract sample were dispensed into each well, reacted for 30 minutes, and then absorbance was measured at 517 nm using a micro-reader. measure In the negative control group, ethanol, the solvent of the sample, was dispensed. The DPPH radical scavenging activity (%) of the herbal extract sample was calculated using the following formula.
<1-5> 추출물의 폴리페놀 함량 측정<1-5> Measurement of polyphenol content of extract
생약 추출물의 폴리페놀 함량을 측정하기 위하여 Folin-Ciocalteu 시험법을 사용하였다. 96 웰 플레이트(well plate)에 생약 추출물 시료 10 μL와 2% Na2CO3 200 μL를 각 웰(well)에 분주하여 3분 동안 반응시킨 후 50% Folin reagent를 10 μL 분주하여 30분 반응시킨다. 마이크로 리더(Micro-reader)를 사용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질은 갈산(gallic acid)을 사용하여 표준 검량 곡선을 구하여 계산하였다. 총 폴리페놀 함량은 gallic acid equivalents (mg/g GAE)로 나타냈다.The Folin-Ciocalteu test method was used to measure the polyphenol content of herbal extracts. In a 96-well plate, 10 µL of the herbal extract sample and 200 µL of 2% Na 2 CO 3 are dispensed into each well and reacted for 3 minutes, then 10 µL of 50% Folin reagent is dispensed and reacted for 30 minutes. . Absorbance was measured at 760 nm using a micro-reader, and the standard material was calculated by obtaining a standard calibration curve using gallic acid. Total polyphenol content was expressed in gallic acid equivalents (mg/g GAE).
<1-6> 추출물의 세포독성 측정<1-6> Measurement of cytotoxicity of extracts
생약 추출물이 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 (Korea Cell Line Bank, KCLB, Korea)에서 세포독성을 나타내는지 확인하기 위하여 MTT assay 실험법을 사용하여 세포독성을 측정하였다. 96 웰 플레이트(well plate)에 RAW 264.7을 1×104 cells/well로 분주하여 37℃, 5% CO2 조건의 세포 배양기에서 24시간 동안 배양하고 생약 추출물 시료를 각 웰(well)에 처리하였다. 시료는 에탄올에 녹여 각 25, 100, 250, 500 ppm으로 처리하였으며, 대조군은 시료의 용매인 에탄올을 동일 용량 처리하여 24시간 배양하였다. 1 mg/mL MTT 용액을 처리하여 4시간 동안 반응시킨 후 상등액을 제거하였다. 각 웰(well)에 형성된 포르마잔(formazan)은 DMSO 100 μL에 녹여 마이크로 리더(micro-reader)에서 15분간 obiral shaking (87.9 rpm)한 뒤 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 아래의 식을 이용하여 백분율로 결과를 나타내었다.Cytotoxicity was measured using the MTT assay method to confirm whether the crude drug extract showed cytotoxicity in the mouse macrophage cell line RAW 264.7 (Korea Cell Line Bank, KCLB, Korea). RAW 264.7 was dispensed into a 96-well plate at 1×10 4 cells/well, and cultured for 24 hours in a cell incubator at 37° C. and 5% CO 2 conditions, and a herbal extract sample was treated in each well. . The samples were dissolved in ethanol and treated at 25, 100, 250, and 500 ppm, respectively, and the control group was treated with the same dose of ethanol, the solvent of the sample, and incubated for 24 hours. After treatment with 1 mg/mL MTT solution and reacting for 4 hours, the supernatant was removed. Formazan formed in each well was dissolved in 100 μL of DMSO, obiral shaking (87.9 rpm) for 15 minutes in a micro-reader, and absorbance was measured at 540 nm. Cell viability was expressed as a percentage using the following formula.
<1-7> 인플루엔자바이러스 역가 측정을 위한 플락어세이<1-7> Plaque assay for measuring influenza virus titer
플락어세이를 실시하기 하루 전날 6-well 플레이트에 MDCK 세포를 분주하여 다음 날 세포가 100% 차 있는 것을 확인한 후 플락어세이를 실시하였다. 플레이트의 각 well을 PBS로 세척한 후 1/10배씩 희석된 바이러스 용액을 각 웰(well)에 500 ul씩 첨가하였다. 상온에서 45분 동안 바이러스가 세포에 감염할 수 있도록 한 후 PBS로 세척한 후 액체상태의 오버레이(1x DMEM, 0.001% Trypsin, 1% agarose)를 각 웰(well)에 3 ml씩 첨가하였다. 오버레이가 고체로 굳은 후에 플레이트를 5% CO2, 37℃ 인큐베이터안으로 이동시켰다. 3 ~ 4일 후에 바이러스 감염에 의해 형성된 플락의 개수를 확인하여 바이러스 역가를 측정하였다.The day before the plaque assay, MDCK cells were dispensed in a 6-well plate to confirm that the cells were 100% filled the next day, and then the plaque assay was performed. After washing each well of the plate with PBS, a 1/10-fold diluted virus solution was added to each well by 500 ul. After allowing the virus to infect the cells at room temperature for 45 minutes, after washing with PBS, 3 ml of liquid overlay (1x DMEM, 0.001% Trypsin, 1% agarose) was added to each well. After the overlay hardened to a solid, the plate was transferred into a 5% CO 2 , 37° C. incubator. After 3 to 4 days, the number of plaques formed by virus infection was checked to measure the virus titer.
<1-8> 마우스 백신 접종, 혈액 채취, 공격접종<1-8> Mouse vaccination, blood collection, and challenge vaccination
그룹 당 다섯 마리의 마우스에 각각 0.1%(w/v) 마가목 추출물, 0.1%(w/v) 감초 추출물, 또는 0.1%(w/v) FA(formaldehyde)로 불활화한 PR8 바이러스 2.5× 106 PFUs/100 ul 또는 PBS를 복강주사(IP)를 통해 2주 간격으로 2회 투여하였다. 각 투여 2주 후에 마우스 혈액을 채취하여 원심분리를 통해 혈청을 수집하여 항체 면역원성 분석을 위해 사용하였다. 마우스에 공격접종은 마우스 반수 치사량(MLD50)의 10배에 해당하는 104 PFUs의 야생형 PR8 바이러스를 비강투여하였으며 2주 동안 마우스의 체중변화 및 생존율을 관찰하였다. 공격접종 후 체중이 75% 이하로 감소한 마우스는 사망으로 간주하여 안락사시켰다.PR8 virus 2.5×10 6 inactivated with 0.1% (w/v) rowan extract, 0.1% (w/v) licorice extract, or 0.1% (w/v) FA (formaldehyde), respectively, to 5 mice per group PFUs/100 ul or PBS was administered twice with an interval of 2 weeks via intraperitoneal injection (IP). Two weeks after each administration, mouse blood was collected, and serum was collected through centrifugation and used for antibody immunogenicity analysis. For challenge inoculation, 10 4 PFUs of wild-type PR8 virus corresponding to 10 times the half lethal dose (MLD50) of mice was intranasally administered, and the weight change and survival rate of mice were observed for 2 weeks. Mice whose body weight decreased to 75% or less after challenge inoculation were considered dead and euthanized.
<1-9> ELISA 항체역가 측정<1-9> ELISA antibody titer measurement
96-well 플레이트 각 웰(well) 마다 PR8 바이러스 105 PFUs/100 ul 씩 첨가하고 4℃에서 하루 동안 코팅하였다. 바이러스가 코팅된 플레이트를 PBST로 세척한 후, 1% BSA로 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. PBST 버퍼로 플레이트를 세척한 후, 마우스 혈청 100 μl/well 씩을 항원이 코팅된 플레이트에 첨가하여 상온에서 1시간 처리하였다. PBST 버퍼로 세척한 후, HRP-conjugated anti-mouse IgG 2차 항체를 1:10,000으로 희석하여 100 μl/well씩 첨가하여 상온에서 1시간 처리하였다. PBST 버퍼로 세척한 후, TMB 용액을 100 μl/well씩 첨가하고 빛을 차단한 상태에서 30분 동안 발색반응을 유도하였다. 2N H2SO4를 50 ul/well 처리하여 발색반응을 정지시킨 후 450 nm UV 흡광도를 측정하였다.For each well of a 96-well plate, 10 5 PFUs/100 ul of PR8 virus was added and coated at 4°C for one day. After washing the virus-coated plate with PBST, blocking was performed for 1 hour at room temperature with 1% BSA. After washing the plate with PBST buffer, 100 μl/well of mouse serum was added to the antigen-coated plate and treated at room temperature for 1 hour. After washing with PBST buffer, HRP-conjugated anti-mouse IgG secondary antibody was diluted 1:10,000, added at a rate of 100 μl/well, and treated at room temperature for 1 hour. After washing with PBST buffer, 100 μl/well of TMB solution was added and a color reaction was induced for 30 minutes while blocking light. 2N H 2 SO 4 was treated with 50 ul/well to stop the color reaction, and then UV absorbance at 450 nm was measured.
<1-10> 헤마글루티닌 억제 에세이(Hemagglutinin inhibition (HI) assay)<1-10> Hemagglutinin inhibition (HI) assay
마우스 혈청에 receptor destroying enzyme(Cosmos Biomedical, UK)을 추가하여 37℃에서 18시간 처리한 후 56℃에서 30분 동안 비동화하였다. 1/2배씩 희석된 혈청을 96-well 플레이트에 25 ul/well 넣어준 후 PR8 바이러스 4 hemagglutinin units/25μl를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1%의 cRBC 50 μl를 각 웰(well)에 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 반응시키고 50% 혈구응집반응을 억제하는 항체의 희석배율을 측정하였다.A receptor destroying enzyme (Cosmos Biomedical, UK) was added to mouse serum and treated at 37° C. for 18 hours, followed by non-assimilation at 56° C. for 30 minutes. After 25 ul/well of serum diluted 1/2-fold was added to a 96-well plate, 4 hemagglutinin units/25 μl of PR8 virus were added and reacted at 37° C. for 1 hour. 50 μl of 1% cRBC was added to each well, reacted at 4° C. for 1 hour, and the dilution factor of the antibody inhibiting 50% hemagglutination was measured.
<1-11> 마이크로중화 에세이(Microneutralization (MN) assay)<1-11> Microneutralization (MN) assay
마우스 혈청을 1:20으로 희석하고 56℃에서 30분 동안 비동화한 후 1/2배씩 희석하였다. 희석된 혈청에 PR8 바이러스 100 TCID50를 추가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 바이러스와 혈청 혼합액을 MDCK 세포가 배양된 96-well 플레이트에 추가한 후 37℃에서 45분 동안 반응시켰다. PBS 버퍼로 플레이트를 세척한 후 0.001% 트립신이 첨가된 MEM을 100 ul/well 씩 넣은 뒤 CO2 인큐베이터에서 4일 동안 배양하였다. 플레이트의 세포를 4% 포름알데하이드로 고정하고 0.5% 크리스탈바이올렛으로 염색하여 바이러스의 감염이 완벽히 억제된 항체의 희석배율을 측정하였다.The mouse serum was diluted 1:20, and after immobilization at 56°C for 30 minutes, it was diluted 1/2-fold.
2. 실험결과2. Experimental results
<2-1> 생약추출물의 항산화활성과 폴리페놀 함량 분석<2-1> Analysis of antioxidant activity and polyphenol content of herbal extracts
본 발명의 마가목, 감초, 산수유 에탄올 추출물 농도에 따른 항산화활성을 DPPH assay를 통해 분석한 결과 도 1a 내지 1c에서 나타낸 바와 같이, 3가지 추출물은 우수한 항산화활성을 나타내었다. 한편, 도 1d는 마가목, 감초, 산수유 각각의 에탄올 추출물 농도 5,000 ug/ml에서의 항산화활성을 나타내었으며, 마가목 추출물과 산수유 추출물이 감초 추출물 대비 상대적으로 항산화 활성이 우수한 것으로 나타났다.As a result of analyzing the antioxidant activity according to the concentration of the ethanol extracts of rowan, licorice, and cornus oil of the present invention through DPPH assay, as shown in FIGS. 1a to 1c , the three extracts exhibited excellent antioxidant activity. On the other hand, FIG. 1d shows antioxidant activity at an ethanol extract concentration of 5,000 ug/ml of rowan, licorice, and cornus oil, respectively, and the rowan extract and cornus extract showed relatively superior antioxidant activity compared to the licorice extract.
한편, 생약추출물의 폴리페놀 함량을 분석한 결과, 도 1e에서 나타낸 바와 같이, 산수유>감초>마가목 순으로 폴리페논 함량이 높은 것으로 나타났다. 폴리페놀 성분이 항산화활성과 깊은 관련이 있다고 보고되었으나 마가목 추출물의 높은 항산화활성은 폴리페놀함량 이외에 다른 요인이 있을 것으로 추정된다.On the other hand, as a result of analyzing the polyphenol content of the herbal extract, as shown in FIG. 1e , it was found that the polyphenone content was high in the order of Cornus officinalis > Licorice > Rowan. It has been reported that polyphenols are closely related to antioxidant activity, but it is estimated that there are other factors other than polyphenol content in the high antioxidant activity of rowan extract.
<2-2> 생약추출물의 세포독성 테스트<2-2> Cytotoxicity test of herbal extracts
MTT assay를 통해 마가목, 감초, 산수유 에탄올 추출물의 농도에 따른 세포독성을 마우스 대식세포주인 RAW 264.7에서 테스트한 결과, 도 2에서 나타낸 바와 같이, 마가목과 감초 추출물은 500 ug/ml에서 20% 이상의 세포를 죽이는 세포독성을 나타냈으며(도 2a 및 2b 참조), 산수유는 모든 시험농도 조건에서 세포독성을 나타내지 않았다(도 2c 참조).As a result of testing the cytotoxicity according to the concentration of the ethanol extract of Ranunculus, licorice, and cornus oil by MTT assay in RAW 264.7, a mouse macrophage cell line, as shown in FIG. It exhibited cytotoxicity to kill (see FIGS. 2a and 2b), and cornflower oil did not exhibit cytotoxicity in all test concentration conditions (see FIG. 2c).
<2-3> 생약추출물의 인플루엔자바이러스 사멸활성<2-3> Influenza virus killing activity of herbal extracts
본 발명의 마가목 추출물(5.369mg/ml), 감초 추출물(39.605mg/ml), 산수유 추출물(62.759mg/ml)을 각각 1mg/ml(0.1% wt/vol) 농도가 되도록 PBS에 희석하였다. 각 추출물 0.1% 용액과 인플루엔자바이러스 A/Puerto Rico/8/34(H1N1, PR8) 5×107 plaque forming units (PFUs)가 포함된 용액을 부피비 1:1로 혼합하여 35℃에서 24시간 동안 인큐베이션 한 후 혼합액을 MDCK 세포주에 플락어세이를 실시하였다.The rowan extract (5.369mg/ml), licorice extract (39.605mg/ml), and cornus extract (62.759mg/ml) of the present invention were each diluted in PBS to a concentration of 1mg/ml (0.1% wt/vol). A 0.1% solution of each extract and a solution containing influenza virus A/Puerto Rico/8/34 (H1N1, PR8) 5×10 7 plaque forming units (PFUs) were mixed at a volume ratio of 1:1 and incubated at 35°C for 24 hours. After that, the mixed solution was subjected to a plaque assay on the MDCK cell line.
그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 생약추출물이 미포함된 에탄올 컨트롤에서는 105 ~106 PFUs의 고농도 바이러스가 잔존하였으나, 마가목과 감초추출물이 포함된 용액에서는 바이러스 플락이 전혀 검출되지 않아, 마가목 추출물과 감초 추출물이 완벽하게 바이러스의 감염성을 제거하는 것을 확인하였다. 한편, 산수유 추출물의 바이러스 사멸활성은 마가목과 감초의 활성보다 약하여 컨트롤에 비해 1/100로 바이러스 농도를 감소시키는 것으로 나타났다.As a result, as shown in FIG. 3, in the ethanol control containing no herbal extract, high-concentration virus of 10 5 to 10 6 PFUs remained, but virus plaque was not detected at all in the solution containing rowan and licorice extract. It was confirmed that the licorice extract completely removed the infectivity of the virus. On the other hand, the virus killing activity of the cornflower extract was weaker than that of rowan and licorice, and it was shown to reduce the virus concentration by 1/100 compared to the control.
<2-4> 생약추출물 불활화 인플루엔자백신의 동물모델 독성시험<2-4> Animal model toxicity test of inactivated influenza vaccine from herbal extracts
각 추출물 0.1%(w/v) 용액과 인플루엔자바이러스 PR8 2.5×106 PFUs를 혼합하여 35℃에서 24시간 동안 처리하여 바이러스를 모두 사멸시킨 후, 동일한 혼합액 100 ul를 마우스 복강을 통해 투여하였다.Each extract 0.1% (w/v) solution and influenza virus PR8 2.5 × 10 6 PFUs were mixed and treated at 35° C. for 24 hours to kill all viruses, and then 100 ul of the same mixture was administered through the mouse abdominal cavity.
그 결과 도 4a 및 4b에서 나타낸 바와 같이, 투여 후 7일 동안 마우스의 체중과 생존률을 관찰하여 추출물 혼합액의 독성을 측정한 결과, 체중감소 등의 독성효과가 전혀 관찰되지 않았다.As a result, as shown in Figures 4a and 4b, the toxicity of the extract mixture was measured by observing the weight and survival rate of mice for 7 days after administration, and no toxic effects such as weight loss were observed.
<2-5> 생약추출물 불활화 인플루엔자백신 동물모델 중화항체 유도 능력<2-5> Inducing ability of neutralizing antibody in animal model of inactivated influenza vaccine from herbal extracts
본 발명의 마가목 추출물 또는 감초 추출물 불활화 인플루엔자백신과 포름알데하이드(FA) 불활화백신 마우스에 백신 투여 후 혈청 중화황체 역가 측정하였다.After administration of the vaccine to mice inactivated influenza vaccine and formaldehyde (FA) inactivated influenza vaccine or licorice extract of the present invention, neutralized corpus luteum titers were measured.
그 결과 도 5a에서 나타낸 바와 같이, ELISA 항체(IgG 항체)의 경우 백신 모든 그룹에서 백신 접종에 따라 항체역가가 증가하였으며, 2회 접종 후의 항체역가는 마가목 추출물 또는 감초 추출물 불활화 백신과 포름알데하이드(FA) 불활화 백신 그룹에서 비슷한 수준의 높은 항체역가 관찰되었다.As a result, as shown in Figure 5a, in the case of ELISA antibody (IgG antibody), the antibody titer increased according to the vaccination in all vaccine groups, and the antibody titer after two inoculations was the inactivated vaccine of rowan extract or licorice extract and formaldehyde ( FA) A similar high antibody titer was observed in the inactivated vaccine group.
또한, 도 5b에서 나타낸 바와 같이, 인플루엔자 헤마글루티닌(Hemagglutinin) 단백질을 저해하는 헤마글루티닌 억제(Hemagglutinin inhibition, HI) 항체의 경우, 감초 추출물 불활화 백신이 포름알데하이드(FA) 불활화 백신보다 약간 더 높은 수준의 항체를 유도하였으며, 마가목 불활화 백신은 다른 두 그룹보다는 헤마글루티닌 억제(HI) 항체 유도능력이 약한 것을 확인하였다.In addition, as shown in Figure 5b, in the case of hemagglutinin inhibition (HI) antibody that inhibits influenza hemagglutinin protein, licorice extract inactivated vaccine is formaldehyde (FA) inactivated vaccine A slightly higher level of antibody was induced, and it was confirmed that the rowan inactivated vaccine had a weaker ability to induce hemagglutinin inhibitory (HI) antibody than the other two groups.
또한, 도 5c에서 나타낸 바와 같이, 바이러스 감염을 억제하는 마이크로중화(microneutralization, MN) 항체의 경우, 감초 추출물 불활화 백신이 포름알데하이드(FA) 불활화 백신보다 높거나 유사한 수준의 항체를 유도하였으며, 마가목 추출물 불활화 백신은 다른 두 그룹보다는 약한 것을 확인하였다.In addition, as shown in Figure 5c, in the case of microneutralization (MN) antibody that inhibits virus infection, the licorice extract inactivated vaccine induced a higher or similar level of antibody than the formaldehyde (FA) inactivated vaccine, It was confirmed that the rowan extract inactivated vaccine was weaker than the other two groups.
<2-6> 생약추출물 불활화 인플루엔자백신 동물모델 방어효능 평가<2-6> Evaluation of protective efficacy in animal model of inactivated influenza vaccine with herbal extracts
백신접종된 마우스에 야생형 인플루엔자바이러스 PR8 바이러스 104 PFUs (10 mouse lethal dose 50)를 비강투여로 공격접종하여 백신의 방어효능을 검증하였다.The vaccinated mice were challenged with wild-type influenza
그 결과 도 6b에서 나타낸 바와 같이, 백신비접종(PBS)그룹은 공격접종 후 급격한 체중감소를 보이며 5일 만에 모든 마우스가 사망하였으나, 본 발명의 생약추출물 불활화 백신 투여그룹은 모두 생존하여 100% 방어효능을 나타내는 것을 확인하였다. 마가목 추출물 불활화 백신 접종군에서는 공격접종 후 10% 정도의 체중감소를 나타내었으며, 이는 마가목 추출물 불활화 백신이 항체유도능력이 가장 약한 도면 5의 결과로 설명될 수 있다. 반면, 감초 추출물 불활화 백신과 포름알데하이드(FA) 불활화 백신은 공격접종 후 체중감소 전혀 없이 완벽한 방어능력을 나타내었다(도 6a).As a result, as shown in FIG. 6b , the non-vaccinated (PBS) group showed rapid weight loss after challenge inoculation, and all mice died within 5 days. It was confirmed that the % protective effect was shown. The rowan extract inactivated vaccine group exhibited a weight loss of about 10% after the attack inoculation, which can be explained by the result of FIG. On the other hand, the licorice extract inactivated vaccine and the formaldehyde (FA) inactivated vaccine showed perfect protective ability without any weight loss after the challenge inoculation (FIG. 6a).
이러한 결과를 통해, 본 발명의 마가목 추출물 불활화 백신 및 감초 추출물 불활화 백신의 경우 인플루엔자바이러스의 백신으로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.Through these results, it was confirmed that the rowan extract inactivated vaccine and the licorice extract inactivated vaccine of the present invention can be usefully used as a vaccine for influenza virus.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far, the present invention has been looked at with respect to preferred embodiments thereof. Those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention can be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments are to be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is indicated in the claims rather than the foregoing description, and all differences within the scope equivalent thereto should be construed as being included in the present invention.
Claims (10)
상기 추출물은 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 물 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출된 것을 특징으로 하는 바이러스 불활화제 조성물.According to claim 1,
The extract is a virus inactivating agent composition, characterized in that extracted with one or more solvents selected from the group consisting of lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms, ethyl acetate, acetone, water and hexane.
상기 추출물은 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.4. The method of claim 3,
The extract is a vaccine composition, characterized in that the ethanol extract.
상기 바이러스는 인플루엔자 A, B, 또는 C 바이러스인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.4. The method of claim 3,
The virus is a vaccine composition, characterized in that the influenza A, B, or C virus.
상기 백신 조성물은 IgG 항체 유도 활성, 항-헤마글루티닌 항체 유도 활성 및 마이크로중화 항체 유도 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.4. The method of claim 3,
The vaccine composition is a vaccine composition, characterized in that it has an IgG antibody inducing activity, an anti-hemagglutinin antibody inducing activity and a microneutralizing antibody inducing activity.
상기 추출물은 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 불활화 바이러스 백신의 제조방법.8. The method of claim 7,
The extract is a method for producing an inactivated virus vaccine, characterized in that the ethanol extract.
상기 인큐베이션은 15-50℃의 온도에서 실시하는 것을 특징으로 하는 불활화 바이러스 백신의 제조방법. 8. The method of claim 7,
The incubation method for producing an inactivated virus vaccine, characterized in that carried out at a temperature of 15-50 ℃.
상기 인큐베이션은 1시간 이상 실시하는 것을 특징으로 하는 불활화 바이러스 백신의 제조방법. 8. The method of claim 7,
The incubation is a method for producing an inactivated virus vaccine, characterized in that carried out for 1 hour or more.
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| Nature, 1979, vol. 281, pages 689-690.* * |
| Osong Public Health Res Perspect 2017, vol. 8, no. 6, pp. 415-420.* * |
| Phytotherapy Research. 2018, vol. 32, pp. 2475-2479.* * |
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