KR20220092880A - 골수 중간엽 줄기세포 유래의 세포 군집 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

많은 TIMP-1 분비 및 낮은 MMP13 유전자 발현뿐만 아니라 CD90⁺; CD105⁺; CD45^-;인 MSC-유래 세포로 농축된 세포 집단이 제공된다. 상기 세포 집단은, MSC의 영양 또는 면역 억제 치료 효과를 이용하나 표현형 분화를 겪는 MSC의 능력과 연관된 활성을 회피하는 것이 바람직한 상황에서 약제로 유용하다. 본 발명의 세포 집단은, 골관절염; 심근 경색; 반월판 연골 손상(예컨대 파열된 반월판); 인대 손상(예컨대 파열된 인대); 피부 손상; 및 연조직 손상;으로 구성된 군에서 선택된 병태의 치료에 유용하다. 상기는 혈액학적 질환; 이식편 대 숙주 질환; 및 염증성 질환;으로 구성된 군에서 선택된 질병의 치료에 또한 사용될 수 있다.

Description

골수 중간엽 줄기 세포 유래의 세포 군집 및 이의 제조 방법

본 발명은 약제로 사용될 수 있는 세포 집단에 관한 것이다. 본 발명은 약제로 사용하기 위해 세포를 제조하는 방법과 또한 관련된다. 본 발명은 치료용 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell, MSC) 유래 세포를 선택하는 방법 및 MSC 유래 세포를 이용한 치료 방법과 더욱 관련된다.

MSC는, 조직 회복 및 재생 및 이식편 대 숙주 질환과 같은 병태의 개선을 포함한 광범위한 응용 분야에 사용하기 위한 치료제로 제안되어 왔다. MSC가 생체 내에서 이의 치료 효과를 달성하는 수단이 완전하게 이해된 것은 아니나, 일반적으로 조직 교체에 기여하는 새로운 세포를 생성하는 분화, 인접한 세포에 의해 회복을 자극하는 영양 효과 및 국소 면역 반응의 억제를 포함하는 것으로 여겨진다.

MSC 기반 치료의 활용을 제한해 왔던 하나의 요인은 치료적으로 유효한 수의 세포를 생성하는 능력이다. 많은 치료가, 오랜 기간의 세포 배양에 의해 가장 효과적으로 생산되는, 많은 수의 세포를 필요로 한다. 그러나, MSC의 치료적 용도와 관련된 특성이 배양 중 시간의 경과에 따라 상당히 변화할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 다른 치료적으로 관련 있는 특성은 유지될 수 있지만, 줄기 세포의 중요한 특성인 다중 표현형으로 분화하는 MSC의 능력(다분화능)은 장기간의 세포 배양 중 서서히 상실된다. 따라서, 많은 수의 세포를 생산하는 것이 바람직한 종류의 장기간의 배양은 생체 내에서 MSC의 치료 활성에 기여하는 특성의 보유, 또는 강력한 세포 기반 의약품에 필요한 종류의 균질한 집단의 생성과 양립할 수 없는 것으로 보인다.

발명의 요약

발명의 제1 측면에 따라, 약제로 사용하기 위한 하기를 나타내는 MSC-유래 세포로 농축된 세포 집단이 제공된다:

ㆍ CD90⁺; CD105⁺; CD45^-

ㆍ 많은 TIMP-1 분비 및

ㆍ 낮은 MMP13 유전자 발현

발명의 제1 측면에 의해 정의된 의학적 용도를 위한 세포 집단은, 명세서 내 다른 곳에서 보다 상세하게 논의된 바와 같이 영양 회복(tropic repair)을 자극할 수 있다. 의학적 용도를 위한 상기 세포 집단은 "발명의 세포 집단(a population of cells of the invention)"으로 지칭될 수 있고, 상기 집단의 구성 세포는 "발명의 세포(cells of the invention)"로 지칭될 수 있다. 발명의 세포 집단은, CD90⁺; CD105⁺; CD45^-이고; 많은 TIMP-1 분비 및 높은 MMP13 유전자 발현을 갖는 세포가 부재(free) (또는 실질적으로 부재)일 수 있다.

약제는 조직 회복을 촉진하고/하거나 치료적 면역 억제를 촉진하는 데 사용될 수 있다.

발명의 제2 측면에 따라, 하기를 포함하는, 약제로 사용하기 위한 세포의 제조 방법이 제공된다:

ㆍ MSC를 배양하여 MSC 유래 세포를 생성하는 단계;

ㆍ MSC 유래 세포를 하기인 집단으로 농축하는 단계; 및

ㆍ CD90⁺; CD105⁺; CD45^-

ㆍ 많은 TIMP-1 단백질 분비 및

ㆍ 낮은 MMP13 유전자 발현

ㆍ 약제로 사용하기 위해 세포를 제형화하는 단계.

발명의 제2 측면의 방법으로 제조된 세포 제형물로 생성된 약제는 "발명의 약제(a medicament of the invention)"로 지칭될 수 있다. 발명의 약제는: CD90⁺; CD105⁺; CD45^-이고; 많은 TIMP-1 분비 및 높은 MMP13 유전자 발현을 갖는 세포가 부재 (또는 실질적으로 부재)일 수 있다.

발명의 제3 측면에 따라, 하기를 포함하는, 치료용 MSC 유래 세포를 선택하는 방법이 제공된다:

ㆍ 세포에 의한 MMP13 유전자 발현 및 TIMP-1 단백질 분비 수준을 평가하는 단계, 및

ㆍ 세포가 낮은 수준의 MMP13 유전자 발현 및 높은 수준의 TIMP-1 단백질 분비를 나타낼 경우 표현형 분화 능력이 필요하지 않은 치료적 응용 분야에 사용하기 위해 세포를 선택하는 단계.

적합한 구현예에서, 발명의 제3 측면에 따른 방법은, 세포가 MMP13 유전자 발현 및 TIMP-1 단백질 분비 둘 다에서 높은 수준을 나타낼 경우 표현형 분화 능력이 필요한 치료적 응용 분야에 사용하기 위해 세포를 선택하는 단계를 임의로 더 포함할 수 있다.

발명의 제3 측면의 방법이 바람직한 특성을 갖는 세포 집단을 선택함으로써 실행될 수 있음이 이해될 것이다. 바람직한 세포 유형의 농축을 위한 기술을 포함하여 적합한 기술의 예가 본 명세서의 다른 곳에 기재된다.

발명의 제4 측면에 따라, 치료가 필요한 대상체에 하기를 나타내는 세포의 치료적 유효량을 제공함을 포함하는, 치료방법이 제공된다:

ㆍ CD90⁺; CD105⁺; CD45^-

ㆍ 많은 TIMP-1 단백질 분비 및

ㆍ 낮은 MMP13 유전자 발현.

대상체는 조직 회복이 필요하고/하거나 치료적 면역 억제가 필요한 대상체일 수 있다.

발명의 제5 측면에 따라, 하기를 나타내는 MSC 유래 세포로 농축된 세포 집단 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물이 제공된다:

ㆍ CD90⁺; CD105⁺; CD45^-

ㆍ 많은 TIMP-1 분비 및

ㆍ 낮은 MMP13 유전자 발현.

발명의 약학 조성물은, CD90⁺; CD105⁺; CD45^-이고; 많은 TIMP-1 분비 및 높은 MMP13 유전자 발현을 갖는 세포가 부재 (또는 실질적으로 부재)일 수 있다.

도 1. 4 명의 환자로부터의 MSC의 성장 및 표현형 특징
(a) 각 환자로부터의 MSC를 사용하여 각 계대 배양 후 도달된 집단이 배가(doubling)되는 수가 성장이 멈출 때까지 기록되었다(PN242 데이터의 경우 세포가 계속 성장한 30 계대까지 수집되었다). (b) 집단이 배가되는 시간은 4 명의 모든 환자의 경우 최대 17 계대인 것으로 나타난다. (c) 전형적인 세포 모폴로지가, PN251 MSC의 경우 4 계대 및 16 계대에서 나타나고(본 환자의 경우 17 계대에서 성장이 멈추었다), PN242의 경우 19 계대에서 나타난다(본 환자의 경우 성장의 정지가 관찰되지 않았다). 크기 바 = 200 ㎛. (d) MSC 마커 CD90 및 CD105 및 조혈 줄기 세포 마커 CD34 및 CD45를 발현하는 세포의 백분율이 형광 활성화 세포 분류로 결정되었다. 다른 곳에서 더 논의된 바와 같이, 발명의 세포는 CD90 및 CD105 양성 및 CD45 음성인 특징적인 조합을 입증한다.
도 2. 복수의 계대에서 4 명의 환자로부터의 MSC를 사용하여 이루어진 조직 엔지니어링된(tissue engineered) 연골의 육안 소견
2-16 계대의 MSC를, 연골 생성 분화를 겪도록 유도하기 전에 폴리글리콜산 스캐폴드 상에 시딩하였다. 각 이미지는 조사된 각 계대에서 각 환자로부터의 복제 샘플을 나타낸다.
도 3. 복수의 계대에서 4 명의 환자로부터의 MSC를 사용하여 이루어진 조직 엔지니어링된 연골의 생화학적 특성
다양한 계대에 걸친 각 환자로부터의 MSC를 사용하여 도 2에 도시된 바와 같이 연골을 조직 엔지니어링했다. (a-d) 조직 엔지니어링된 연골 구조물의 건조 중량 또는 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG) 함량과 조직 엔지니어링시 MSC의 집단 배가 사이의 관계가 각 환자에 대해 도시된다. 모든 그래프에서 각 점은, 단일 계대의 1 명의 환자로부터의 세포를 사용하여 이루어진 다중 조직 공학 복제물의 평균 값을 나타낸다. (e) 조직 엔지니어링된 연골 구조물의 건조 중량과 조직 엔지니어링시 MSC의 계대 수 사이의 관계가 4 명의 환자 모두에 대해 도시된다. 각 점은 단일 복제 샘플에 대한 결과이다. (f) 조직 엔지니어링된 연골 구조물의 GAG 함량과 조직 엔지니어링시 MSC의 계대 수 사이의 관계가 4 명의 환자 모두에 대해 도시된다. 각 점은 단일 복제 샘플에 대한 결과이다. 모든 그래프에서 선은 점에 맞추어진 1차 선형 모델을 나타내며, spearman 순위 상관 계수 및 이의 유의성은 우상단 모서리에 도시된다.
도 4. 복수의 계대에서 4 명의 환자로부터의 MSC에 의한 반월상 연골의 영양 회복 및 면역 조절
반월상 연골의 영양 회복을 위해, 미분화된 MSC를 콜라겐 스캐폴드 상에 시딩하고, 양(sheep) 반월판의 2 조각 사이에 삽입하고, 함께 클리핑하여 30 일 동안 배양하였다. 조직 형태 계측(histomorphometry)을 사용하여 반월판 조직의 2 조각 사이에서 융합 정도를 측정하였다. (a-c) 반월판 조직의 높은, 중간 및 불량한 융합의 전형적인 예시. 융합이 화살표 사이에서 측정되었다. 크기 바 = 1 mm. (d-g) 반월판 조직의 융합 %와 MSC의 집단 배가 사이의 관계가 각 환자에 대해 도시된다. 모든 그래프에서 각 점은, 단일 계대의 1 명의 환자로부터의 세포를 사용한 다중 실험 복제물의 평균 값을 나타낸다. (h) 반월판 조직의 융합 %와 MSC의 계대 수 사이의 관계가 4 명의 환자 모두에 대해 도시된다. 각 점은 단일 복제 샘플에 대한 결과이다. 모든 상관 관계 그래프 (a-h)에서, 선은 점에 맞추어진 1차 선형 모델을 나타내며, spearman 순위 상관 계수 및 이의 유의성은 우상단 모서리에 도시된다. (i) 면역 조절은, FACS로 정량화되고, 표지된 세포로부터 Cell-Trace Violet의 상실로 측정된 T 세포 증식의 억제 %로 결정되었다. 각 점은 풀링된 3 회 복제 웰(pooled triplicate well)에 대한 결과이다.
도 5. 전사체학 및 단백질체학
(a) 수행된 분석 단계의 개관. 전사체학 및 단백질체학 데이터가 데이터 표준에 따라 프로세싱되고 통합되었다. 통합된 데이터를 Ingenuity Pathway Analysis로 더 분석하여 계대 배양에 걸쳐 변화하는 중요한 유전자 및 단백질을 식별하고, 생물학적 기능에 대해 이들을 맵핑하고, 가능한 상류 조절자를 예측하였다(도 6 및 7 참조). (b) 모든 유전자 및 단백질의 2 개의 제1 주요 성분에 대한 주요 성분 분석(PCA, Principal Component Analysis) 점수 플롯. 골 형성 능력의 변화와 또한 연관될 수 있는 환자의 분리(segregation)(청색 및 오렌지색 타원 참조)가 존재하며(도 S2 참조), 계대와 관련된 변화가 주로 PC2에 포착된다. (c) 환자 그룹 변이 중 유의미하게 및 독립적으로 변화하는 338 개의 유전자 및 단백질을 밝히는 이원 분산 분석 검정 후 유의미한 변수의 벤 다이어그램. (d) 계대에 걸친 338 개의 유의미한 변수의 PCA. (분산의 약 70%를 캡쳐하는) 2 개의 제1 주요 성분의 점수 플롯이 도시된다. 예상된 바와 같이 계대에 걸쳐 뚜렷한 분리가 존재한다. 행으로 표현되고, Ward 계층형 클러스터링을 통해 클러스터링된 338 개의 유의미한 단백질 및 유전자로부터의 스케일링된 데이터의 히트맵. 컬럼들은 생물학적 샘플을 나타내고, 각 컬럼은 환자의 샘플이며, 이들은, 계대 1은 레드, 계대 5는 그린, 계대 10은 청록색 및 계대 15는 퍼플을 이용하여 계대에 의해 정렬된다.
도 6. 통합된 전사체학 및 단백질체학 데이터의 Ingenuity Pathway Analysis
(a) Ingenuity Pathway Analysis는 계대 수의 증가에 따라 변화하는 FOXM1 및 4 개의 다른 마스터 조절자 유전자(도 S5 참조)를 식별했다. 전사체학 분석으로부터의 FOXM1 데이터는 계대 수의 증가에 따른 유전자 발현의 억제를 나타낸다. 각각의 바는 4 명의 환자 각각의 MSC를 이용한 결과에 대한 평균 ± SEM이다. (b) 통합된 전사체학 및 단백질체학 데이터 세트의 Ingenuity Pathway Analysis는 FOXM1 정규 경로에서 6 개의 식별된 하류 조절자 중 5 개의 억제를 예상한다. (c) Ingenuity Pathway Analysis는 "세포 움직임(Cell Movement)", "세포 이동(Cell Migration)", 또는 "상처 치유(Wound Healing)"의 검색 용어에 대해 맵핑된 다중 유전자 및 단백질을 식별하였다. 상기 식별된 유전자 및 단백질 중 대부분이 ANOVA에 의해 결정된 바와 같이 계대에 걸쳐 유의미하게 변화하지 않았다. 가장 많이 발현된 유전자 및 단백질이 검색 용어 각각에 대해 나열된다. (d) 전사체학 분석으로부터의 CXCL12 데이터는 계대 수의 증가에 따른 지속적인 유전자 발현을 나타낸다. 각각의 바는 4 명의 환자 각각의 MSC를 이용한 결과에 대한 평균 ± SEM이다. (e) 단백질체학 분석으로부터의 CXCL12 데이터는 계대 수의 증가에 따른 지속적인 단백질 분비를 나타낸다. 각각의 바는 4 명의 환자 각각의 MSC를 이용한 결과에 대한 평균 ± SEM이다.
도 7. 시험관 내 MSC 노화 과정의 유전자 및 단백질 마커
MMP13 유전자가 시험관 내에서 MSC의 노화로 상실되는 초기 계대 배양 세포의 마커로 선택되었고, TIMP-1 단백질의 분비가 시험관 내 노화에 독립적인 MSC의 마커로 선택되었다. (a) 전사체학 분석으로부터의 MMP13 데이터는 계대 수의 증가에 따른 유전자 발현의 감소를 나타낸다. 각각의 바는 4 명의 환자 각각의 MSC를 이용한 결과에 대한 평균 ± SEM이다. (b) qPCR 분석으로부터의 MMP13 데이터는 계대 수의 증가에 따른 유전자 발현의 감소를 나타낸다. 각각의 바는 4 명의 환자 각각의 MSC를 이용한 결과에 대한 평균 ± SEM이다. (c) 단백질체학 분석으로부터의 TIMP-1 데이터는 계대 수의 증가에 따른 지속적인 단백질 분비를 나타낸다. 각각의 바는 4 명의 환자 각각의 MSC를 이용한 결과에 대한 평균 ± SEM이다. (d) ELISA 분석으로부터의 TIMP-1 데이터는 계대 수의 증가에 따른 지속적인 단백질 분비를 나타낸다. 각각의 바는 4 명의 환자 각각의 MSC를 이용한 결과에 대한 평균 ± SEM이다. (e) MSC/콜라겐 스캐폴드 구조물에 의해 분비된 TIMP-1의 ELISA 분석은, 신선한(fresh) 구조물의 경우 계대 수의 증가에 따른 지속적인 단백질 분비를 나타내나, 이의 생존 능력을 감소시키는 조건 하에서 동결-해동된 구조물에서는 분비의 감소를 나타낸다. 많은 TIMP-1 분비 및 낮은 MMP13 유전자 발현의 상기 패턴이 발명의 세포의 특징이다. 특히, (다른 곳에서 논의된 CD90 양성, CD105 양성, CD45 음성 발현 프로필과 조합하여) 이는 표현형 분화 능력이 필요하지 않은 치료적 응용 분야에 사용하기 적합한 세포를 나타낸다. 상기 응용 분야는 대신에 세포의 영양 활성 또는 치료적 면역 억제 활성을 이용할 수 있다. 각 세포 공급원에 대해, 동결된 구조물의 것과 비교된 신선한 것에 대한 결과가 도시된다.
(도 3과 관련된) 도 8. 골 형성 점수화를 위한 가이던스 템플릿 이미지
MSC를 골 형성 분화를 겪도록 유도한 뒤 알리자린 레드로 염색하였다. 각 슬라이드가 2 명의 독립적인 관찰자에 의해 - (CTL, 대조군 참조); +; ++; +++ 또는 ++++로 점수화되었다. 크기 바 = 200 ㎛.
(도 3과 관련된) 도 9. 복수의 계대에서 4 명의 환자로부터의 MSC의 골 형성 분화
다양한 계대에 걸쳐 각 환자로부터의 MSC가 시험관 내에서 골 형성 분화를 겪도록 유도되었고, 도 8에 도시된 바와 같이 점수화되었다. (a-d) MSC의 골 형성 점수와 누적 집단 배가(cumulative population doublings) 사이의 관계가 각 환자에 대해 도시된다. 모든 그래프에서 각 점은, 단일 계대에서 1 명의 환자로부터의 세포를 사용한 복수의00 복제물의 평균 값을 나타낸다. (e) MSC의 골 형성 점수와 계대 수 사이의 관계가 4 명의 환자 모두에 대해 도시된다. 각 점은 단일 복제 샘플에 대한 결과이다. 모든 그래프에서 선은 점에 맞추어진 1차 선형 모델을 나타내며, spearman 순위 관계 계수 및 이의 유의성은 우상단 모서리에 도시된다.
(도 3과 관련된) 도 10. 지방 형성 점수화를 위한 가이던스 템플릿 이미지
MSC를 지방 형성 분화를 겪도록 유도한 뒤 오일 레드 O로 염색하였다. 각 슬라이드가 2 명의 독립적인 관찰자에 의해 - (CTL, 대조군 참조); +; ++; +++ 또는 ++++로 점수화되었다. 크기 바 = 200 ㎛.
(도 3과 관련된) 도 11. 복수의 계대에서 4 명의 환자로부터의 MSC의 지방 형성 분화
다양한 계대에 걸쳐 각 환자로부터의 MSC가 시험관 내에서 지방 형성 분화를 겪도록 유도되었고, 도 S3에 도시된 바와 같이 점수화되었다. (a-d) MSC의 지방 형성 점수와 누적 집단 배가 사이의 관계가 각 환자에 대해 도시된다. 모든 그래프에서 각 점은, 단일 계대에서 1 명의 환자로부터의 세포를 사용한 다중 복제물의 평균 값을 나타낸다. (e) MSC의 지방 형성 점수와 계대 수 사이의 관계가 4 명의 환자 모두에 대해 도시된다. 각 점은 단일 복제 샘플에 대한 결과이다. 모든 그래프에서 선은 점에 맞추어진 1차 선형 모델을 나타내며, spearman 순위 상관 계수 및 이의 유의성은 우상단 모서리에 도시된다.
(도 5 및 6과 관련된) 도 12. 계대 증가에 따라 변화하는 유전자 및 단백질의 Ingenuity Pathway Analysis
Ingenuity Pathway Analysis로 계대 수의 증가에 따라 변화하는 FOXM1(도 6 참조) 및 4 개의 다른 마스터 조절자 유전자가 식별되었다. (a) 전사체학 분석으로부터의 MYOC 데이터와 계대 수 증가 사이의 관계 및 통합된 전사체학 및 단백질체학 데이터 세트의 Ingenuity Pathway Analysis. 각각의 바는 4 명의 환자 각각의 MSC를 이용한 결과에 대한 평균 ± SEM이다. (b) 전사체학 분석으로부터의 NUPR1 데이터와 계대 수 증가 사이의 관계 및 통합된 전사체학 및 단백질체학 데이터 세트의 Ingenuity Pathway Analysis. 각각의 바는 4 명의 환자 각각의 MSC를 이용한 결과에 대한 평균 ± SEM이다. (c) 전사체학 분석으로부터의 VEGF 데이터와 계대 수 증가 사이의 관계 및 통합된 전사체학 및 단백질체학 데이터 세트의 Ingenuity Pathway Analysis. 각각의 바는 4 명의 환자 각각의 MSC를 이용한 결과에 대한 평균 ± SEM이다. (d) 전사체학 분석으로부터의 PTGER2 데이터와 계대 수 증가 사이의 관계 및 통합된 전사체학 및 단백질체학 데이터 세트의 Ingenuity Pathway Analysis. 각각의 바는 4 명의 환자 각각의 MSC를 이용한 결과에 대한 평균 ± SEM이다.

본 발명은 본 명세서에서 처음으로 공개되는, 시험관 내에서 배양된 MSC가 노쇠(senescence) 전에 영양 활성 또는 면역 억제 활성이 아닌, 다분화능 잠재력의 선택적인 상실을 나타낸다는 발명자의 발견에 적어도 부분적으로 근거한다. 상기 발견 및 MSC 및 MSC 유래 세포의 많은 치료적 용도가 상기 세포의 표현형 분화를 통해서라기보다 상기 세포의 영양 또는 면역 억제 활성의 결과로 발생한다는 관찰은, 상기 응용 분야에서 이전에 무시되어온 배양 세포의 치료적 용도를 제공하는 새로운 가능성을 열어준다. 대규모로 배양된 세포가 상기 방식으로 치료적으로 사용될 수 있다는 점은, 이전에 가능할 것으로 여겨졌던 것보다 훨씬 더 많은 수의 치료적으로 유용한 세포의 생성을 허용한다는 점에서 상당한 이점을 부여한다.

더욱이, 발명자들은 영양 또는 면역 억제 활성을 보유하나 표현형 분화를 할 수 없는 세포들이 (영양 또는 면역 억제 활성을 갖거나 갖지 않는) 표현형 분화 능력을 보유하는 세포들과 구별될 수 있게 하는 특징적인 마커 패널을 식별하였다. 상기 특징적인 발현 프로필(세포가 CD90⁺; CD105⁺; CD45^-이고; 많은 TIMP-1 분비 및 낮은 MMP13 유전자 발현을 가짐)은 이전에 식별되지 않았다. 본원에서 이의 식별은 MSC 유래 세포의 의학적 용도의 실행에 상당한 장점을 제공한다.

발명의 제1 측면에 의해 정의된 의학적 용도를 위한 세포 집단의 일부에, 표현형 분화 잠재력은 없으나 영양 또는 면역 억제 활성의 보유가, 상기 세포들이 손상된 영역에서 새로운 세포 집단을 야기하지 않으면서 이의 치료적 활성을 달성할 수 있도록 보장한다는 것이 인식될 것이다. 이는 MSC 또는 MSC 유래 세포의 인 시츄(in situ) 분화와 잠재적으로 연관될 수 있는 바람직하지 않은 결과에 대한 가능성을 회피 또는 감소시키기 때문에 유리하다(발명의 다른 측면에 의해 공유되는 장점).

더욱이, 배양된 MSC (또는 MSC 유래 세포)의 치료적 특성이 시간의 경과에 따라 변화한다는 것이 이전에 인식되었다. 보다 오랜 기간 동안 (또는 보다 많은 계대 수로) 성장한 세포는 손상된 관절에서 통증을 완화시킬 수 있는 반면, 보다 초기의 계대 수에서의 세포는 이러한 통증을 악화시킬 수 있다. 주어진 세포 그룹은 이러한 과정에서 상이한 다양한 단계의 세포 집단을 함유할 수 있어서, 이들 집단 간의 구별 및 원하는 치료적 용도에 필요한 집단(특히 보다 "노화된(aged)" 집단)만을 선택할 수 있는 것이 중요하다.

배양된 MSC의 특성의 차이가 이전에 인식되었으나, 본 발명의 개시 전에는 복잡하거나 바람직하지 않은 특성(예컨대 표현형 분화에 대한 잠재력 또는 관절 통증의 악화)이 없으면서 치료적 영양 또는 면역 억제 활성을 갖는 세포 또는 세포 집단으로의 "전환(switch)"이 발생했는지를 결정할 신뢰성 있는 방법이 없었다. CD90⁺; CD105⁺; CD45^-; 많은 TIMP-1 분비 및 낮은 MMP13 유전자 발현 마커 프로필의 중요성을 식별함으로써 발명자들은 상기 유리한 세포 및 집단에 대한 신뢰할 만하고 강력한 선택을 할 수 있었다.

상기 마커 프로필의 식별로 상당한 실패와 연관된, 계대 수와 같은 기준에 근거한 선택을 할 필요가 없다. 단지 예로서, 이는 (동종 이계 및 자가 세포 출처 둘 다와 관련된) 상기 변화가 발생하는 시점에서 개체 간의 차이, 세포 배양물 내 세포 분열 속도의 차이, 및 현대의 생물 반응기 기반 배양 조건의 경우에 적절하지 않은 고려 사항, 예컨대 계대 수에 대한 의존의 영향을 포함한다.

CD90⁺; CD105⁺; CD45^-이고; 많은 TIMP-1 분비 및 낮은 MMP13 유전자 발현을 갖는 MSC 유래 세포로 농축된 세포 집단은, 실제로 예측 가능하고 재현 가능한 세포 기반 약제를 산출하는 능력에서 중요한 동질성(homogeneity)이 증가된 세포 집단을 나타낸다.

낮은 또는 높은 MMP13 유전자 발현에 근거한 세포 집단 간의 구별이, 표현형 분화 능력은 없으나 영양 또는 면역 억제 치료 활성을 갖는 세포 집단과 표현형 분화 능력(예컨대 연골 형성)을 보유한 세포 집단 사이의 차이가 도출되도록 하는 데 특히 중요하다는 것이 본원에 개시된 결과로부터 이해될 것이다. 상기 세포는, (CD90⁺; CD105⁺; CD45^-이고; 많은 TIMP-1 분비 및 낮은 MMP13 유전자 발현을 갖는) 발명의 세포와 대조적으로, CD90⁺; CD105⁺; CD45^-이고; 많은 TIMP-1 분비 및 높은 MMP13 유전자 발현을 가질 수 있다.

상기 관점에서, 본 발명이:

ㆍ 영양 회복 및 면역 조절이 장기간의 배양에서 유지되는 점;

ㆍ MSC 유래 세포가 광범위한 세포 증폭(expansion) 후 상기 치료 메커니즘을 발휘하는 능력을 보유하는 점; 및

ㆍ 상기 바람직한 특성을 갖는 세포가 덜 유리한 특성을 갖는 세포(예컨대 표현형 분화 능력의 보유)로부터 선택될 수 있는 수단을 제공하는 점;

을 처음으로 식별한다는 것이 인식될 것이다.

MSC는 혈액학적 질환, 이식편 대 숙주 질환 및 염증성 질환을 포함한 질병 변형뿐만 아니라 조직 재생을 위한 광범위한 임상적 응용 분야(예를 들어, 골 및 연골; 심혈관 질환)에 사용된다. 상기 임상적 접근 중 일부는 분화에 근거하는 반면, 다른 것은 영양 또는 면역 조절 기능에 의존한다.

시험관 내에서 MSC의 계대 증가에 따른 분화 능력의 상실을 기재한 몇몇 연구가 있으며, 다른 연구는 생체 내 노화가 노화된 세포의 생체 외 분리 후 분화 능력의 상실로 또한 이어진다는 것을 시사한다. 시험관 내 MSC의 노화와 함께 텔로미어 길이의 단축에 대한 병렬 관찰과 조합된 상기 관찰은, 세포 기능을 손상시키고 이의 임상적 유용성을 제한하는 빠른 노쇠 과정을 나타내는 것으로 해석되었다.

광범위하게 계대 배양된 MSC에서 유래된 세포가 다분화능 분화에 대한 잠재력을 상실했을 때에도 이의 영양 및 면역 억제 활성을 유지한다는 것을 처음으로 발견하고, 발명자들은 상기 세포가 유용한 치료 효과를 여전히 제공할 수 있음을 인식했다. 더욱이, 발명자들은 상기 치료적으로 유효한 세포들이 세포 배양을 거친 후에 약제로 인식, 선택 및 통합되도록 하는 마커의 특징적인 패턴을 식별했다.

이제 발명이 하기 단락을 참조하여 더 설명될 것이다.

발명의 세포 집단

본 목적을 위해, 하기 고려 사항들이 발명의 제2 측면의 방법에서 선택된 세포 집단뿐만 아니라 발명의 제1 측면에 따른 세포 집단 또는 발명의 제4 측면의 치료 방법에서의 용도에 적용 가능한 것으로 간주될 수 있다.

발명의 세포는 자가 세포일 수 있거나 동종이계 세포일 수 있다. 발명의 세포는 다분화능 분화 능력을 갖지 않을 수 있다. 당업자는 실시예에 논의된 것을 (비제한적으로) 포함하는, 다분화능 또는 다분화능의 부재를 결정할 수 있는 많은 방법을 알고 있을 것이다.

세포 마커에 관한 세포의 특성화

본 발명의 다양한 측면에 언급된 치료적으로 유용한 MSC 유래 세포는 많은 마커와 관련하여 특징적인 발현 패턴을 나타낸다. 이는 세포 표면 마커(CD90, CD105, 및 CD45) 및 기능성 마커(TIMP-1 및 MMP13)를 포함한다.

세포 표면 마커

CD90

Thy-1으로도 공지된 CD90은 단일 V-유사 면역글로불린 도메인을 갖는 세포 표면 단백질에 앵커링된 N-글리코실화된 글리코포스파티딜이노시톨(glycophosphatidylinositol, GPI)이다. 아래에서 더 논의된 바와 같이, 본 개시에 기재된 치료적으로 유용한 MSC 유래 세포는 특징적으로 CD90⁺이다.

CD105

엔도글린(endoglin)으로도 공지된 CD105는 유형 I 막 당단백질이다. 이는 세포 표면에 위치하며, 여기에서 TGF-β 수용체 복합체의 일부로 기능한다. 아래에서 더 논의된 바와 같이, 본 개시에 기재된 치료적으로 유용한 MSC 유래 세포는 특징적으로 CD105⁺이다.

CD45

단백질 티로신 포스파타제 수용체 유형 C(protein tyrosine phosphatase receptor type C, PTPRC)로도 공지된 CD45는 많은 세포 신호 전달 경로와 관련된 유형 I 막관통 단백질이다. 아래에서 더 논의된 바와 같이, 본 개시에 기재된 치료적으로 유용한 MSC 유래 세포는 특징적으로 CD45^-이다.

세포 표면 마커에 대한 양성 또는 음성으로 세포의 특성화

세포 집단에 의한 CD90, CD105 및 CD45를 포함한 세포 표면 마커의 발현(또는 발현의 부재)이 당업자에게 공지된 임의의 적절한 방법으로 조사될 수 있다. 단지 예로서, 세포 표면 마커가 적절한 시약, 예컨대 관심 세포 마커에 특이적인 항체로 표지 및 검출될 수 있다. 이러한 종류의 항체 표지 접근법은 하기에 더 논의된 종류의 세포 선택 기술과 조합으로 사용될 수 있다.

적절한 면역 형광 표지 후, 세포가 대응하는 대조군 항체, 예컨대 아이소타입-매칭된 대조군 항체로 처리된 세포의 90% 초과의 형광 수준을 가질 경우, 특정 세포 표면 마커(예컨대 CD90 또는 CD105)에 대해 양성("+ve" 또는 "⁺")으로 간주될 수 있다.

적절한 면역 형광 표지 후, 세포가 대응하는 대조군 항체, 예컨대 아이소타입-매칭된 대조군 항체로 처리된 세포의 10% 미만인 형광 수준을 가질 경우, 특정 세포 표면 마커(예컨대 CD45)에 대해 음성("-ve" 또는 "^-")으로 간주될 수 있다.

기능성 세포 마커

TIMP-1

TIMP 메탈로펩티다제 억제제 1로도 공지된 TIMP-1은 메탈로펩티다제 패밀리 중 조직 억제제의 멤버이다. 이는 매트릭스 메탈로프로틴아제의 억제제로 기능하는 당단백질이다. 아래에서 더 논의된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 치료적으로 유용한 MSC 유래 세포는 많은 TIMP-1 단백질 분비를 특징적으로 갖는다.

MMP13

MMP13(콜라겐아제 3으로도 공지된 매트릭스 메탈로펩티다제 13(matrix metallopeptidase 13))은 세포외막 성분의 파괴와 관련된 메탈로프로틴아제 효소이다. 이는 인간에서 MMP13 유전자에 의해 암호화된다. 아래에서 더 논의된 바와 같이, 본 개시에 기재된 치료적으로 유용한 MSC 유래 세포는 낮은 MMP13 유전자 발현을 특징적으로 갖는다. 표현형 분화 능력은 없으나 영양 및 면역 억제 활성을 갖는 세포 집단의 선택을 가능하도록 함에 있어서 상기 마커의 관련성이 이전에 보고된 적이 없다. 본원에서 보고된 바와 같이, 본 발명자들은 상기 마커가 (CD90⁺; CD105⁺; CD45^-이고; 많은 TIMP-1 분비 및 낮은 MMP13 유전자 발현을 갖는) 발명의 세포를 (CD90⁺; CD105⁺; CD45^-이고; 많은 TIMP-1 분비 및 높은 MMP13 유전자 발현을 갖는) 표현형 분화 능력을 보유하나 동일한 치료적 장점을 제공하지 못하는 다른 세포 집단으로부터 구별하는 데 핵심적임을 발견했다.

기능성 세포 마커에 대해 높거나 낮은 것으로 세포의 특성화

발명의 세포는 높은 TIMP-1 단백질 분비를 갖는 것으로 특성화된다.

TIMP-1의 발현 및 분비가 당업자에게 공지된 단백질 분비의 평가를 위한 임의의 적절한 기술을 사용하여 조사될 수 있다. 단지 예로서, TIMP-1 단백질 발현이 ELISA(enzyme linked immunoassay) 접근법을 사용하여 조사될 수 있다. 관심 세포가 발명의 세포에 필요한 방식으로 TIMP-1 분비 양성인지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있는 TIMP-1 분비에 대한 적절한 ELISA의 예가 실시예에 더 기재된다.

발명의 세포는 낮은 MMP13 유전자 발현을 갖는 것으로 특성화된다.

MMP13 유전자 발현은 세포 내 MMP13 발현을 나타내는 전사체의 수준을 조사함으로써 평가될 수 있다. 적절하게, MMP13 유전자 발현이 MMP13 특이적 역전사 PCR에 의해 평가될 수 있다. 상기 기술에 근거한 특히 적합한 방법이 실시예에 더 기재된다.

세포 집단은 설정된 기간에 걸쳐 설정된 세포 수에 의해 분비된 상기 단백질의 양에 근거하여 많은 TIMP-1 분비를 갖는 것으로 식별될 수 있다. 적절하게, TIMP-1 단백질의 많은 분비는 24 시간의 기간에 (초기에 225만 세포/웰의 밀도로 플레이팅된) 세포로부터 100ng/ml (이상)의 TIMP-1의 분비로 표시될 수 있다. 상기 평가에 사용될 수 있는 적합한 조건의 추가 세부 사항이 도 7e에 보고된 연구와 관련하여 실시예에 제시된다.

세포 집단이 적합한 기준선과의 비교에 근거하여 낮은 MMP13 유전자 발현을 갖는 것으로 식별될 수 있다. 단지 예로서, Tata 결합 단백질과 같은 하우스키핑 유전자가 적합한 기준선을 제공할 수 있다. 상기 세포가 하우스키핑 유전자(예컨대 Tata 결합 단백질) 대비 MMP13 발현 수준이 신선하게 단리된 MSC에 의한 상대적인 발현량의 절반 또는 절반 미만을 나타낼 경우, 세포 집단은 낮은 MMP13 유전자 발현을 갖는 것으로 특성화될 수 있다. 비교 목적으로 신선하게 단리된 적합한 MSC가 발명의 세포의 그것과 적절하게 매칭되는 공급원으로부터 유래될 수 있다. (MMP13이든 또는 적절한 하우스키핑 유전자이든) 발현의 배수 비교가 실시예에 더 기재된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

세포의 농축(enrichment) 및 농축된 세포 집단

발명의 제1 측면에 따른 세포 집단이 자연 발생 세포 집단과 비교하여 치료적으로 유용한 MSC 유래 세포의 존재를 위해 농축된다. 발명의 제2 측면의 방법으로 제조된 세포가 상기 세포의 존재를 위해 농축되며, 발명의 제3 측면에 따른 세포의 선택이 동일한 방식으로 농축된 세포 집단을 야기할 수 있다.

집단 내에서 농축될 치료적으로 유용한 MSC 유래 세포가 이의 특징적인 마커의 발현(즉 CD90⁺, CD105⁺, CD45^-; 많은 TIMP-1 단백질 분비; 및 낮은 MMP13 유전자 발현)과 관련하여 식별될 수 있다.

당업자는 세포 집단의 맥락으로 사용된 바와 같은 용어 "농축된(enriched)"을 이해할 것이다. 농축은 바람직한 세포(즉 특징적인 마커의 발현을 갖는 세포)의 양성 선택 또는 바람직하지 않은 세포의 제거에 의해 달성될 수 있다.

단지 예로서, 농축 접근법은 바람직한 특질(예컨대 본원에서 논의된 특징적인 마커의 발현)을 갖는 세포의 증식을 장려하는 배양 조건 및/또는 바람직한 특질이 결여된 세포의 생존 능력을 감소시키는 조건을 이용할 수 있다. 상기 조건에서 성장한 세포를 모니터링하여 바람직한 집단이 농축되는 것을 담보할 수 있다. 단지 예로서, 발명에 따라 치료적으로 유효한 MSC 유래 세포 집단을 농축하는 데 사용될 수 있는 세포 배양 조건은 10% 태아 송아지 혈청의 사용 및 5ng/ml 섬유아세포 성장 인자(FGF2)의 보충을 포함할 수 있다.

대안적으로, 농축 또는 선택은 마커(예컨대 CD90, CD105, 및 CD45)의 발현에 근거한 세포의 선택을 허용하는 기술, 예컨대 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting, FACS)의 맥락으로 이해될 수 있다. 이어서 원하지 않는 세포는 폐기될 수 있다.

따라서, 발명의 제2 측면에 따른 약제로 사용하기 위한 세포의 제조 방법은, 하나 이상의 기재된 마커(CD90⁺; CD105⁺; CD45^-; 많은 TIMP-1 분비; 및 낮은 MMP13 유전자 발현)에 관하여 세포를 선택하여 특정된 세포 집단을 위해 MSC 유래 세포를 농축하는 단계를 포함할 수 있다. 적합한 선택 단계는, 표현형 분화 잠재력 없이 영양 활성을 보유하는 세포를 식별하는 데 특히 유용한 것으로 발명자들에 의해 발견된 마커인, 낮은 MMP13 유전자 발현에 근거한 선택을 포함할 수 있다.

적절하게 농축된 MSC 유래 세포 집단은 80% 이상의 CD90 및 CD105에 양성인 세포 및 10% 이하의 CD45에 양성인 세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 농축된 세포 집단은 기재된 특징적인 마커 프로필(즉 CD90⁺; CD105⁺; CD45^-; 많은 TIMP-1 분비; 및 낮은 MMP13 유전자 발현)을 갖는 70% 이상의 세포를 포함할 수 있다. 적절하게 농축된 세포 집단은 기재된 특징적인 마커 프로필을 갖는 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 세포를 포함할 수 있다. 농축된 세포 집단은 기재된 특징적인 마커 프로필(즉 CD90⁺; CD105⁺; CD45^-; 많은 TIMP-1 분비; 및 낮은 MMP13 유전자 발현)을 갖는 실질적으로 100%의 세포로 구성될 수 있다.

발명의 제1 측면에 따른 세포 집단 또는 발명의 제2 측면의 방법으로 선택된 세포 집단은 전적으로 기재된 특징적인 마커 프로필(즉 CD90⁺; CD105⁺; CD45^-; 많은 TIMP-1 분비; 및 낮은 MMP13 유전자 발현)을 갖는 세포로 실질적으로 구성될 수 있다.

발명의 제1 측면에 따른 세포 집단 또는 발명의 제2 측면의 방법으로 선택된 세포 집단은, CD90⁺; CD105⁺; CD45^-이고; 많은 TIMP-1 분비; 및 높은 MMP13 유전자 발현을 갖는 세포가 부재 또는 실질적으로 부재일 수 있다.

세포 농축 또는 세포 선택은 비제한적으로 본원에서 논의된 방법을 포함하는 임의의 적절한 방법으로 실행될 수 있다.

세포 선택 및 분석

발명의 세포의 특징적인 마커 프로필에 관해 잘 알게 되면, 당업자는 상기 프로필을 나타내는 세포를 선택할 수 있는 방법을 용이하게 식별할 수 있을 것이다. 유사하게, 당업자는 세포 집단을 조사하여 이들이 특징적인 발현 패턴을 나타내는지 여부를 결정할 수 있는 방법을 용이하게 식별할 것이다. 비제한적으로, 이는 유세포 분석; 형광 활성화 세포 분류(FACS); 및 자성 활성화 세포 분류(magnetic activated cell sorting, MACS);로 구성된 군에서 선택된 기술을 포함한다.

세포 배양

발명자들은 발명의 세포의 영양 및 면역 억제 활성이 장기간의 세포 배양에 걸쳐 유지된다는 것을 발견했다. 이는 매우 많은 수의 치료적으로 유효한 세포가 생성되도록 하는 장점을 갖는다. 명세서 내 다른 곳에 제시된 바와 같이, 발명의 세포는 최대 30 계대 동안 치료적으로 유효한 수준의 영양 또는 면역 조절 활성을 유지할 수 있다.

따라서, 발명의 세포 집단은 배양물 내 5 계대 이상, 배양물 내 10 계대 이상, 배양물 내 15 계대 이상, 배양물 내 20 계대 이상, 배양물 내 25 계대 이상, 또는 배양물 내 30 계대 이상을 거친 세포를 포함할 수 있다.

유사하게, 발명의 제2 측면에 따른 방법은 배양물 내 5 계대 이상, 배양물 내 10 계대 이상, 배양물 내 15 계대 이상, 배양물 내 20 계대 이상, 배양물 내 25 계대 이상, 또는 배양물 내에서 30 계대 이상 동안 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.

발명의 의학적 용도 및 치료 방법

발명의 제1 측면의 세포 집단, 발명의 제2 측면에 따라 제조된 세포로부터 제조된 약제, 발명의 제3 측면의 방법에 의해 선택된 세포 및 발명의 제4 측면의 치료 방법이 치료적 용도에 모두 적합하다. 특히, 치료적 용도는 조직 회복을 촉진하는 용도 또는 치료적 면역 억제를 촉진하는 용도일 수 있다. 상기 구현예의 추가 세부 사항이 하기에 제시된다.

조직 회복(tissue repair)

발명의 약제, 의학적 용도 또는 치료 방법을 이용하여 조직 회복을 촉진할 수 있다. 조직 회복을 촉진할 필요성이 조직 손상을 야기하는 임의의 조건의 결과로 발생할 수 있다. 예를 들어, 조직 회복을 촉진할 필요성은 골관절염; 심근 경색; 반월판 연골 손상(예컨대 파열된 반월판); 인대 손상(예컨대 파열된 인대); 피부 손상; 및 연조직 손상;으로 구성된 군에서 선택된 병태의 결과로 발생할 수 있다. 조직 회복은 치료적 영양 활성을 촉진함으로써 촉진될 수 있다. 조직 회복은 유병 또는 손상된 관절과 연관된 병리를 개선할 수 있다. 이는 적절한 방법, 예컨대 (생검 또는 실험적으로 처리된 관절의) 조직학적 검사 또는 적합한 영상화 기술로 평가될 수 있다.

적절하게는, 조직 회복은 조직 회복 속도를 개선하고/하거나 치료에 기인한 회복된 조직의 질을 개선함으로써 조직 회복을 촉진하기 위한 손상된 조직의 치료를 포함할 수 있다. 조직 회복의 촉진이 적절한 대조군을 참조하여 용이하게 평가될 수 있다.

발명의 세포, 치료 방법 또는 의학적 용도는 적절한 대조군에 비해 10% 이상 조직 회복을 촉진할 수 있다. 단지 예로서, 발명의 세포, 치료 방법 또는 의학적 용도는, 적절한 대조군과 비교하여 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 조직 회복을 촉진할 수 있다. 실제로, 발명의 세포, 치료 방법 또는 의학적 용도는 적절한 대조군에 비해 100% 이상 조직 회복을 촉진할 수 있다.

적절하게는, 조직 회복은 연골; 심혈관 조직; 골; 및 연조직, 예컨대 피부;로 구성된 군에서 선택된 손상된 조직의 치료를 포함할 수 있다.

적절하게는, 조직 회복은 파열된 연골의 치료, 예컨대 파열된 반월상 연골의 치료; 골관절염; 심근 경색; 반월상 연골 손상(예컨대 파열된 반월판); 인대 손상(예컨대 파열된 인대); 피부 손상; 및 연조직 손상의 치료로 구성된 군에서 선택된 병태의 치료를 포함할 수 있다.

MSC 유래 세포의 영양 활성이 조직 회복에 기여할 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 발명의 세포 집단 또는 약제를 이용하는 의학적 용도 또는 치료 방법은 영양 활성의 자극으로 조직 회복에 사용하기 위한 것일 수 있다. 상기 용도는, MSC 또는 MSC 유래 세포가 표현형 분화를 통해 (즉 조직 회복에 기여하는 대체 세포를 생산하는 분화를 통해) 이의 치료적 유용성을 달성한다고 이전에 기재되었던 응용 분야와 대조를 이룰 수 있다.

영양 활성

발명의 세포는 이들이 유래된 MSC로부터 유지된 영양 활성을 갖는다. 발명의 의학적 용도 및 치료 방법, 특히 조직 회복에 사용하기 위한 것은 상기 세포의 영양 활성을 이용할 수 있다. 실제로, 발명의 세포는 이의 영양 활성 (및 표현형 분화 능력의 부재)를 위해 선택될 수 있다.

영양 활성은 이식 후에 MSC 또는 MSC 유래 세포가 조직 회복 또는 재생에 기여하는 활성 분자를 분비하도록 인접한 세포를 유도할 수 있는 능력으로 간주될 수 있다. 영양 회복은 MSC 또는 MSC 유래 세포에 의한 다량의 성장 인자 및 다른 매개자(mediator)의 생성 결과로 발생할 수 있다. 영양 활성은 다른 예들 중 뇌졸중, 심근 경색 및 반월상 연골 회복의 치료에서 조직 회복 또는 재생에 기여하는 것으로 나타났다.

발명의 제2 또는 제3 측면의 방법은 세포를 평가하여 이의 영양 활성을 조사하는 단계를 더 포함할 수 있다. 적절하게는, 약제로 사용될 세포가 이의 영양 활성에 근거하여 선택될 수 있다. 발명의 제1 측면에 따른 세포 집단이 영양 활성을 갖는 MSC 유래 세포로 농축될 수 있다.

영양 활성의 존재 또는 부재가 당업자에게 공지된 임의의 적절한 방법으로 평가될 수 있다. 적합한 방법으로 유병 또는 손상된 관절의 병리를 개선하는 세포의 능력을 조사할 수 있다. 단지 예로서, 세포, 예컨대 발명의 제1 측면의 세포 또는 발명의 제2 측면의 방법으로 제조된 세포의 영양 활성이 연골의 분리된 영역을 융합하는 이의 능력을 테스트함으로써 평가될 수 있다. 적절하게는, 상기 융합을 촉진하는 능력이 시험관 내에서 입증될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로 상기 능력이 생체 내에서 입증될 수 있다.

연골의 분리된 영역의 융합을 통해 영양 활성의 평가를 가능하게 하는 에세이의 세부 사항이, 테스트 제제로 처리된 연골의 융합을 조사하기 위한 모델과 관련되는 한 이의 개시 내용이 참조로 포함된 문헌["Repair of torn avascular meniscal cartilage using undifferentiated autologous mesenchymal stem cells: from in vitro optimization to a first-in-human study", Whitehouse, et al., Stem Cells Translation Medicine, 2017; 6:1237-1248]에 제공된다. 적합한 기술의 세부 사항이 본 명세서의 실시예에 또한 제시된다.

발명의 세포의 영양 활성 또는 약제 또는 의학적 용도 또는 치료 방법이 유용할 수 있는 치료적 응용 분야는 조직 회복의 촉진이 유용할 치료적 응용 분야에 해당한다.

치료적 면역 억제

발명의 세포는 이들이 유래된 MSC로부터 유지된 면역 억제 활성을 또한 갖는다. 발명의 의학적 용도 및 치료 방법은 세포의 면역 억제 활성을 이용할 수 있고, 치료적 면역 억제에 사용하기 위한 것일 수 있다.

MSC 또는 MSC 유래 세포의 면역 억제 특성을 이용하는 것으로 공지된 다수의 치료적 응용 분야가 존재한다. 적절하게는, 치료적 면역 억제가 혈액학적 질환; 이식편 대 숙주 질환; 및 동종 반응성(alloreactive) 면역 질환, 자가 면역 질환 또는 염증성 질환;으로 구성된 군에서 선택된 질병의 치료에 이용될 수 있다.

발명의 세포, 치료 방법 또는 의학적 용도를 이용하는 치료적 면역 억제는 줄기 세포 이식, 예컨대 조혈 줄기 세포 이식을 받은 환자의 치료에 활용될 수 있다. 상기 이식을 받은 환자는 혈액학적 질환을 앓고 있을 수 있다.

치료적으로 유효한 면역 억제 활성을 달성하는 발명의 세포, 치료 방법 및 의학적 용도의 능력은 또한 이식편 대 숙주 질환의 치료에 유용하다. 상기 구현예에서, 발명의 세포 또는 약제로의 치료가 수여자의 면역 반응을 감소시킬 수 있어서 동종 이계 이식에 대한 반응을 완화시킬 수 있다.

질병의 개시 또는 진행이 체내 면역 반응에 의해 매개되는 많은 병태가 또한 존재한다. 이는 동종 반응성 면역 질환, 자가 면역 질환 또는 염증성 질환을 포함한다. 상기 질병에 발명의 세포 또는 약제로의 치료 및 발명의 의학적 용도 또는 치료 방법에 의한 치료가 유익할 수 있다.

적절한 구현예에서, 발명에 따른 세포, 약제 또는 치료 방법은 면역 반응에 대한 면역 억제로 질병의 치료에 사용하기 위한 것이다.

면역 억제 활성

발명의 제2 또는 제3 측면의 방법은 세포를 평가하여 이의 면역 억제 활성을 조사하는 단계를 더 포함할 수 있다. 적절하게는, 약제로 사용될 세포가 이의 면역 억제 활성에 근거하여 선택될 수 있다. 발명의 제1 측면에 따른 세포 집단이 면역 억제 활성을 갖는 MSC 유래 세포로 농축될 수 있다.

면역 억제 활성의 존재 또는 부재가 당업자에게 공지된 임의의 적절한 방법으로 평가될 수 있다. 발명의 세포 또는 약제의 면역 억제 활성이 적절한 대조군의 그것과 비교될 수 있다. 발명의 세포 또는 약제는 적합한 에세이로 평가될 경우 대조군과 비교하여 10% 이상의 면역 활성의 억제를 달성할 수 있다. 발명의 세포 또는 약제는, 예를 들어 적절한 대조군과 비교하여 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 면역 활성의 억제를 달성할 수 있다. 실제로, 발명의 세포 또는 약제는 적절한 대조군과 비교하여 면역 활성의 100% 억제를 달성할 수 있다.

단지 예로서, 세포, 예컨대 발명의 제1 측면의 방법으로 제조된 세포의 면역 억제 활성이 T 세포 증식을 억제하는 이의 능력을 테스트함으로써 평가될 수 있다. 적합한 구현예에서, 면역 억제 활성이 80% 이상 T 세포 증식을 억제하는 능력으로 표시되며, 이는 도 4i에 제시된 결과와 일치한다.

표현형 분화 능력이 필요하거나 필요하지 않은 치료적 응용 분야

발명의 제3 측면은 적합한 MSC 유래 세포가 치료적 응용 분야를 위해 선택될 수 있는 방법을 제공한다. 상기 선택은 치료적 응용 분야의 성질 및 또한 MSC 유래 세포에 의한 특정 마커의 발현을 참조하여 수행된다.

발명의 제3 측면의 방법은, 표현형 분화 능력이 필요한 치료적 응용 분야에 사용될 세포와 표현형 분화 능력이 필요하지 않은 치료적 응용 분야에 사용될 세포 사이에 이루어질 구별을 가능하게 한다.

표현형 분화 능력이 필요한 치료적 응용 분야는, MSC 유래 세포의 치료 활성이 상기 세포가 치료 효과를 제공하는 새로운 세포를 분화 및 생성하는 능력에 의해 달성되는 것일 것이다. 상기 응용 분야의 예는, MSC가 분화하도록 유도됨으로써 관절 연골 또는 골을 생성하는 시험관 내 조직 공학 및 대체 조직의 인 시츄(in situ) 생성을 위해 연골 병변 또는 골 결손 내로의 이식을 위한 MSC의 사용을 포함한다.

그에 반해, 치료 효과를 달성하기 위해 표현형 분화 능력을 갖는 MSC 유래 세포가 필요하지 않은 다수의 치료적 응용 분야가 존재한다. 조직 회복을 유도하는 영양 효과를 이용하는 치료적 응용 분야는 표현형 분화 능력이 필요하지 않다는 것이 이해될 것인데, 이런 종류의 치료 활성을 매개하는 것이 MSC 또는 MSC 유래 세포에 의해 생성된 영양 인자이기 때문이다. 유사하게, MSC 유래 세포의 면역 억제 효과를 이용하는 치료적 응용 분야는 표현형 분화 능력이 필요하지 않다는 것이 인식될 것이다. 필요한 치료 활성을 달성하기 위해 영양 효과 또는 면역 억제 효과를 이용하는 치료적 응용 분야의 예가 본 명세서의 다른 곳에 기재된다. 발명의 제1 측면의 세포 집단, 발명의 제2 측면에 따라 제조된 세포, 및 발명의 제4 측면의 치료 방법은 표현형 분화 능력 또는 다분화능이 필요하지 않은 상기 응용 분야에 사용하기에 또한 매우 적합하다.

세포의 제형화

발명의 세포 집단이 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 실제로, 본 발명은 이의 주어진 용량 또는 분획으로 투여하기 위한 세포 수를 포함하는 단위 용량 형태 조성물과 같은 약학 조성물 및 제형을 포함하는, 발명의 세포를 포함한 조성물을 또한 제공한다. 약학 조성물 및 제형은 일반적으로 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 추가 치료제를 포함한다.　

용어 "약학 제형(pharmaceutical formulation)"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적일 수 있도록 하는 형태이고, 상기 제형이 투여될 대상체에 허용불가능하게 독성이 있는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.　

"약학적으로 허용 가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 대상체에 대해 무독성인, 활성 성분 이외의 약학 제형 내 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정제 또는 보존제를 포함하나 이에 국한되지 않는다.　

일부 측면에서, 담체의 선택은 특정 세포 및/또는 투여 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 적합한 다양한 제형이 존재한다. 예를 들어, 약학 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적합한 보존제는 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산 나트륨 및 염화 벤잘코늄을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 2 개 이상의 보존제 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 이의 혼합물은 전형적으로 전체 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 담체는 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수혜자에 무독성이며, 인산염, 구연산염 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염 형성 카운터 이온; 금속 착물(예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온 계면활성제를 포함하나 이에 국한되지 않는다.　

일부 측면에서 완충제는 조성물에 포함된다. 적합한 완충제는 예를 들어, 구연산, 구연산 나트륨, 인산, 인산 칼륨 및 다양한 다른 산 및 염을 포함한다. 일부 측면에서, 2 개 이상의 완충제 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이의 혼합물은 전형적으로 전체 조성물의 약 0.001 중량% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약학 조성물의 제조 방법이 공지되어 있다. 예시적인 방법이 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.　

제형은 수용액을 포함할 수 있다. 제형 또는 조성물은 세포로 치료될 특정 징후, 질병 또는 병태에 유용한 하나 이상의 활성 성분, 바람직하게는 세포에 상호 보완적인 활성을 가진 것을 또한 함유할 수 있으며, 여기서 각각의 활성이 서로 부정적인 영향을 미치지 않는다. 상기 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적절하게 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 약학 조성물은 화학 요법제, 예를 들어, 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 젬시타빈, 히드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 및/또는 빈크리스틴과 같은 다른 약학적 활성제 또는 약물을 더 포함한다.　

일부 구현예에서, 약학 조성물은 질병 또는 병태의 치료 또는 예방에 유효한 양, 예컨대 치료적 유효량 또는 예방적 유효량으로 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 치료적 또는 예방적 효능이 치료 대상체의 주기적인 평가에 의해 모니터링된다. 바람직한 투여량이 세포의 단일 볼루스 투여, 세포의 복수의 볼루스 투여 또는 세포의 지속적인 점적 투여로 전달될 수 있다.　

세포 및 조성물이 표준 투여 기술, 제형 및/또는 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 세포의 투여는 자가 조직 또는 이종일 수 있다. 예를 들어, 면역 반응성 세포 또는 전구체(progenitor)가 하나의 대상체에서 수득될 수 있고, 동일한 대상체, 또는 양립 가능한 상이한 대상체에 투여될 수 있다. (예를 들어, 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내 유래된) 말초 혈액 유래 면역 반응성 세포 또는 이의 자손(progeny)이 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥 주사 또는 비경구 투여를 포함하는 국소 주사를 통해 투여될 수 있다. 치료 조성물(예를 들어, 유전자 변형된 면역 반응성 세포를 함유하는 약학 조성물)을 투여할 경우, 이는 일반적으로 주사 가능한 단위 투여량 형태(용액, 현탁액, 유화액)로 제형화될 것이다.　

제형은 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 구강내, 설하 또는 좌약 투여를 위한 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 비경구적으로 투여된다. 본원에서 사용된 용어 "비경구(parenteral)"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 이용하여 대상체에 투여된다.　

일부 구현예에서, 조성물은 멸균 액체 제제, 예를 들어, 등장성 수용액, 현탁액, 유화액, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공되며, 이는 일부 측면에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액체 제제는 보통 겔, 기타 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조가 더 용이하다. 또한, 액체 조성물은 특히 주사에 의해 투여하기가 다소 더 편리하다. 반면에, 점성 조성물은 적절한 점도 범위 내에서 제형화되어 특정 조직과의 보다 긴 접촉 기간을 제공할 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은, 예를 들어, 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이의 적절한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매체일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.　

멸균 주사용 용액은 용매, 예컨대 적합한 담체, 희석제 또는 부형제, 예컨대 멸균수, 생리 식염수, 포도당, 덱스트로스 등과의 혼화물에 세포를 포함시킴으로써 제조될 수 있다. 조성물은 바람직한 투여 및 제조 경로에 따라 보조 물질, 예컨대 습윤제, 분산제 또는 유화제(예를 들어, 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 보존제, 향미제 및/또는 색소를 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 표준 텍스트를 참조하여 적합한 제제가 제조될 수 있다.　

항균 보존제, 항산화제, 킬레이팅제 및 완충제를 포함한 조성물의 안정성 및 무균 상태(sterility)를 향상시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 미생물 작용의 예방이 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 및 소르브산에 의해 보장될 수 있다. 주사 가능한 약학 형태의 장기간 흡수는, 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 초래될 수 있다.　

생체 내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 멸균된다. 무균 상태는 예를 들어, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.　

발명의 세포 제형은 CD90⁺; CD105⁺; CD45^-이고; 많은 TIMP-1 분비; 및 높은 MMP13 유전자 발현을 갖는 세포가 부재 또는 실질적으로 부재일 수 있다.

발명의 세포의 용량 및 치료적 유효량

발명의 세포의 치료적 유효량은 치료될 장애의 성질을 참조하여 또한 치료가 필요한 개체에서 질병의 중증도를 참조하여 선택될 수 있다. 수혜자의 연령 및 체중과 같은 고려 사항이 적절한 용량의 선택에 또한 영향을 미칠 수 있다.

(예컨대 발명의 약제 형태로) 발명의 세포의 치료적 유효량이 단일 치료 빈도 또는 다중 치료 빈도로 제공될 수 있다.

발명에 따른 용도를 위해 치료적으로 유효한 MSC 유래 세포의 적합한 수가 손상 부위 당 투여되는 세포 수에 근거하여 계산될 수 있다.

단지 예로서, 골관절염 또는 무릎에 대한 다른 손상의 치료를 위해 무릎 당 1천만 내지 2천만 개 세포의 용량이 치료적으로 유효한 것으로 입증될 수 있다. 상기 지침은 치료될 장기에 따라 또는 보다 크거나 보다 작은 손상 부위에 대해 조정될 수 있다.

이제 발명이 하기 실시예를 참조하여 더 설명될 것이다.

실시예

골수 유래 중간엽 간질 세포(MSC)는 이의 다분화능 분화 능력 때문에 부분적으로 줄기 세포로 정의되나, 보다 최근에 이들이 조직 회복을 촉진하는 데 중요할 수 있는 영양 및 면역 조절 특성을 또한 갖는 것으로 나타났다. MSC의 영양/면역 조절 기능과 비교하여 다분화능 분화의 계층적 중요성을 평가하기 위해, 우리는 상기 특성들이 세포의 시험관 내 노화에 따라 어떻게 변화하는지에 대해 상세한 분석을 수행하였다. 시험관 내 분화 및 회복 모델을 이용하고 Ingenuity Pathway Analysis를 사용한 전사체학 및 단백질체학 데이터를 통합함으로써, MSC의 다분화능 분화 능력이 계대 수의 증가에 따라 떨어지는 반면, 영양 회복 및 면역 조절 효능은 세포의 광범위한 시험관 내 노화 후에도 유지됨을 보였다. 상기 관찰은, 영양 회복 및 면역 조절이 MSC의 핵심적인 특성이고 따라서 일시적인 다분화능 분화보다 계층적으로 더 중요하다는 관점을 지지한다.

도입

다분화능 중간엽 줄기 세포(MSC)의 개념이, 골수 내 골 형성 전구체 세포의 존재를 입증하는 1960년 대 및 1970년 대에 Friedenstein의 중요한 연구 후(Friedenstein et al., 1970; Friedenstein et al., 1968; Friedenstein et al., 1966), 1990년 대 초반에 Caplan(Caplan, 1991)에 의해 확립되었다. 상기 초기 작업 위에 구축되어, 내배엽 및 외배엽 경로를 포함한 전분화능 분화에 대한 보다 제한적인 증거(Caplan, 1991; Kuroda et al., 2011)뿐만 아니라 골 형성(Gronthos et al., 1994; Pound et al., 2006; Pound et al., 2007; Simonsen et al., 2002), 연골 형성(Dickinson et al., 2017; Johnstone et al., 1998; Kafienah et al., 2002; Kafienah et al., 2007b; Kafienah et al., 2006; Martin et al., 1997; Solchaga et al., 2005; Yoo et al., 1998) 및 지방 형성(Dickinson et al., 2017; Mirmalek-Sani et al., 2006; Munir et al., 2017)을 포함한 다분화능 골격 계통 분화에 대한 명백한 증거(Kolf et al., 2007)를 가진 MSC의 시험관 내 분화 능력을 입증하는 많은 연구가 존재하였다. 상기 연구 중 일부가 골수 MSC의 클론 집단이 다분화능 분화 능력을 보유한다는 것을 입증했고(Dickinson et al., 2017; Muraglia et al., 2000), 이는 이질적인 골수 유래 집단 내 적어도 일부 개별적인 MSC가 줄기 세포 특성을 나타낸다는 것을 시사한다.

보다 최근에는 MSC가 이의 다중 분화능(multipotential) 분화 능력과 직접적인 관련이 없는 메커니즘을 통해 조직 회복을 지원할 수 있다는 증거가 증가했다(Prockop, 2007). Caplan은 이식 후 MSC가 예를 들어, 뇌졸중, 심근 경색의 치료 또는 반월상 연골 회복 시 활성 분자를 분비하도록 인접한 세포를 유도함으로써 "영양(trophic)" 능력을 갖는 것으로 설명했다(Caplan and Dennis, 2006). 영양 회복은 MSC에 의한 많은 양의 성장 인자 및 다른 매개자의 생성을 통해 매개될 가능성이 높다(Caplan and Correa, 2011; Caplan and Dennis, 2006; Kuroda et al., 2011; Prockop, 2009; Tolar et al., 2010). 본 발명자들은 전임상 및 임상 시험에서 효능이 일부 입증된(Whitehouse et al., 2017) MSC의 영양 특성에 근거한 반월상 연골 회복에 대한 치료 전략(Pabbruwe et al., 2010b)을 이전에 개발하였다. 다분화능 분화와 독립적인 조직 회복의 제2 메커니즘은 T 세포 증식의 하향조절을 포함한 다양한 메커니즘에 의해 면역 반응을 억제하는 MSC의 능력이다(Dickinson et al., 2017; Keating, 2012; Spaggiari et al., 2007; Tolar et al., 2010; Uccelli et al., 2006; Uccelli et al., 2007). MSC의 상기 중요한 특성이 기증된 조혈 세포의 생착을 지지하고 이식편 대 숙주 질환을 예방하도록 임상적으로 이용되었다(Lazarus et al., 2005; Tolar et al., 2010).

MSC의 생리학적 역할과 관련된 엄격한 증거의 부족에 대한 최근의 우려와 함께 MSC의 작용 메커니즘에 대한 이해의 복잡성 증가는 이들이 줄기 세포로 간주되어야 하는지에 대한 의문으로 이어졌다(Bianco et al., 2008; Caplan, 2017; Kuroda et al., 2011; Sipp et al., 2018). 상기 불확실성에도 불구하고, MSC가 혈액학적 질환, 이식편 대 숙주 질환 및 염증성 질환을 포함한 질병 변형뿐만 아니라 조직 재생(예를 들어, 골 및 연골; 심혈관 질환)을 위한 광범위한 임상적 조사에 사용되고 있는 경우가 있다(Squillaro et al., 2016). 상기 임상 접근 중 일부는 분화에 근거하며, 다른 것은 영양 또는 면역 조절 기능에 의존하지만(Caplan and Correa, 2011), 상기 상이한 작용 메커니즘이 서로 어떻게 관련되는지에 대해 거의 이해하지 못하고 있다.

시험관 내에서 MSC의 계대 증가에 따른 분화 능력의 상실을 설명하는 몇몇 연구들이 있었으며(Bonab et al., 2006; Muraglia et al., 2000; Yang, 2018; Yang et al., 2018), 다른 연구들은 노화된 세포의 생체 외 단리 후 생체 내 노화가 분화 능력의 상실로 또한 이어진다는 것을 시사하였다(Choudhery et al., 2014; Ganguly et al., 2017; Stenderup et al., 2003). MSC의 시험관 내 노화에 따른 텔로미어 길이의 단축(Baxter et al., 2004)에 대한 병렬 관찰과 결합된 상기 관찰은, 세포 기능을 손상시키고 이의 임상적 유용성을 제한하는 빠른 노쇠 과정을 나타내는 것으로 해석되었다. 반대로, 비교를 통한 노화 관련 데이터는 영양 회복 또는 면역 조절에 대해 보고되지 않았다. 따라서, 세포의 노화에 따른 분화 능력의 감소가 노쇠에 접근함에 따라서 MSC의 기능적 능력의 일반적인 감소를 반영하는지 또는 다분화능 분화의 선택적인 상실이 있는 것인지가 현재 불분명하다.

본 발명자들은 본원에서 MSC의 시험관 내 노화가, 일시적인 기능적 특성인 것과 세포의 수명 전체에 걸쳐 유지되는 핵심적인 특성인 것을 식별함으로써 이의 상이한 생물학적 측면 사이의 관계를 이해하는 프레임워크를 제공할 것을 제안한다. 따라서, 본 연구의 목적은, MSC의 시험관 내 노화가 증가함에 따라 이들 기능이 감소하는 속도를 결정함으로써 분화 잠재력 및 영양 회복/면역 조절의 상대적인 계층적 중요성을 결정하는 것이었다.

결과

환자 특성 및 MSC 성장 잠재력

외상성 무릎 손상의 치료를 위한 인공 관절 수술을 받는 환자로부터 골수가 수집되었다. 모든 환자가 고지에 입각한 동의를 했으며, 연구는 지역 윤리 지침(Southmead Research Ethics Committee Ref 078/01)에 완전히 부합되게 수행되었다. 표 S1은 환자 특성을 나타낸다. 4 명 모두 수술 시에 평균 연령 49 세(38-70 세 범위)의 남성이었다. MSC를 플라스틱 부착에 의해 각 골수에서 단리하였고, 더 이상 증식하지 못할 때까지 표준 배양 조건 하에서 성장시켰다. PN241 및 PN242로부터의 MSC는 PN251 및 PN264로부터의 MSC보다 더 큰 계대 수로 증식을 계속했고, PN242 세포는 30 계대에서조차 성장 정지의 징후를 나타내지 않았다(도 1a 및 표 S1). 도 1b는 최대 17 계대에서 각 환자에 대한 각 계대의 MSC 집단 배가 시간(population doubling time, PDT)을 도시한다. 4 명의 환자 모두로부터 MSC의 PDT가 계대 초기에는 유사했고, 계대 후기에 더 길어졌으며, 한 명의 환자(PN264)로부터의 MSC가 보다 큰 계대 수에서 특히 느린 성장을 나타냈다. 계대 초기 MSC는 세포가 더 노쇠해가면서 상실된 전형적인 별모양 외관을 가졌다(도 1c, PN251). 그러나, PN242 세포는 매우 큰 계대 수에서조차 가늘고 긴 별모양(spindly, stallate) 외관을 가졌고, 이 때 이들은 계속하여 잘 증식하였다(도 1c, PN242).

세포 표면 마커 발현이 각각의 P1, P5, P10 및 P15 계대에서 4 명의 환자 모두의 MSC를 사용하여 FACS에 의해 결정되었다. MSC 마커 CD105 및 CD90의 발현이 4 명의 환자 모두의 MSC에서 계대 후기에 >90%으로 유지되었다. 조혈 줄기 세포 마커 CD45는 모든 계대에서 <10%로 유지되었으나, 2 명의 환자에서 계대 수가 증가함에 따라 조혈 줄기 세포 마커 CD34의 발현에 약간의 증가가 있었다(도 1d).

MSC의 3-계통(tri-lineage) 분화 잠재력이 계대 수의 증가에 따라 감소한다

각 환자의 선택된 계대로부터의 MSC를 3 차원 연골 조직 공학 에세이로 이의 연골생성 잠재력에 대해 테스트하였고, 엔지니어링된 연골의 양이 조직의 건조 중량으로 측정되었고, 연골의 질이 건조 중량의 %로 표현된 글리코사미노글리칸 함량으로 측정되었다. 세포의 시험관 내 노화에 따른 연골생성 잠재력의 상실에 대한 명백한 증거가 있었다. 각 환자로부터의 MSC에 대해 다양한 계대에 걸쳐 조직 엔지니어링된 연골의 전형적인 육안 소견을 도 2에서 볼 수 있고, 이는 후기 계대의 MSC를 이용하여 생성될 경우 연골 구조물의 평균 크기가 감소함을 명백하게 입증한다. 상기 육안 관찰이 양적 분석에 의해 지지되었다. 4 명의 환자 중 3 명에 대한 조직 엔지니어링시 기록된 형성된 연골의 평균 건조 중량과 기록된 MSC의 누적 집단 배가 사이에 유의미한 음의 상관 관계, 및 4 명의 환자 모두에 대한 조직 엔지니어링시 기록된 평균 연골 글리코사미노글리칸 함량과 MSC의 누적 집단 배가 사이에 유의미한 음의 상관 관계가 있었다(도 3a-d). 더욱이, 모든 개체의 조직 엔지니어링된 연골 구조물의 건조 중량 및 글리코사미노글리칸 함량 둘 다가 조직 공학에 사용된 MSC의 계대 수와 유의미한 음의 상관 관계가 있었다(도 3e 및 3f).

MSC가 알리자린 레드에 대한 염색의 반-정량(semi-quantitative) 분석에 의해 단층 배양으로 이의 골 형성 잠재력에 대해 또한 테스트되었다. 염색 패턴의 전형적인 이미지와 사용된 점수화 시스템이 도 S1에 도시된다. MSC의 골 형성 효능의 점진적인 상실에 대한 일부 증거가 있었으나, 결과가 환자 사이에 일관적이지 않았다. PN241 환자의 경우, 누적 집단 배가에 따른 평균 골 형성 점수에 명백한 변화가 없었다(도 S2a). PN242 환자의 경우, 누적 집단 배가에 따른 골 형성 잠재력의 유의미한 하락이 있었다(도 S2b). PN251 골 형성 점수가 10 집단 배가에 의해 0으로 감소했고 보다 큰 배가에서 0으로 유지되었으나, 상기 변화는 통계적으로 유의미하지 않았다(도 S2c). PN264 환자는 가장 초기의 집단 배가 수에서조차 관찰 가능한 골 형성 활성을 나타내지 않았다(도 S2d). 전반적으로, 반복된 에세이에 대한 개별 골 형성 점수는 사용된 MSC의 계대 수와 유의미한 상관 관계가 없었으나(도 S2e), 각 환자에서 관찰된 상이한 패턴은, 세포의 시험관 내 노화에 따른 골 형성의 가변적인 감소가 있다 하더라도 점진적임을 나타낸다.

MSC의 지방 형성 잠재력이 Oil-Red-O 염색에 대한 반-정량 분석에 의해 단층 배양으로 테스트되었다. 염색 패턴의 전형적인 이미지와 사용된 점수화 시스템이 도 S3에 도시된다. PN251 환자의 경우, 누적 집단 배가에 따른 지방 형성 잠재력에서 작지만 유의미한 하락이 있었던 반면(도 S4c), 다른 3 명의 환자의 경우 유의미한 변화가 없었다(도 S4a, S4b 및 S4c). 전반적으로, 반복된 에세이에 대한 개별 지방 형성 점수는 사용된 MSC의 계대 수와 유의미한 상관 관계가 없었고(도 S4e), 따라서 세포의 시험관 내 노화에 따른 지방 형성의 하락에 대해 매우 제한적인 증거만이 있었다.

총괄하여, 상기 데이터는 MSC의 분화 잠재력의 명백한 상실을 나타내며, 초기 계대 세포는 완전한 3-계통 잠재력을 나타내는 경향이 있고, 후기 계대 세포는 연골 생성 잠재력은 없고 단지 지방 형성 잠재력, 또는 지방 형성 및 골 형성 잠재력을 유지하는 경향이 있다. 상기 데이터는 다분화능 분화가 CD105+ve, CD90+ve, CD34-ve, CD45-ve MSC의 근본적인 특성이라기보다는, 시험관 내 세포 증폭으로 상실되는 신선하게 단리된 MSC의 특징임을 시사한다.

MSC에 의한 영양 회복 및 면역 조절이 계대 증가에 따라 유지된다

본 발명자들은 시험관 내, 생체 내 양(sheep) 모델 및 파열된 반월판을 갖는 환자에서 상기 시스템에 대한 우리의 이전 연구에 근거한 영양 회복 모델로서 MSC에 의한 2 조각의 반월상 연골의 시험관 내 융합을 사용했다(Whitehouse et al., 2017). 각 17 계대에서 모든 4 명의 환자로부터의 MSC가 우리의 반월판 회복 효능 에세이에서 이의 효능에 대해 테스트되었다. 상기 연구에서 반월판의 융합 %의 편차가, 전형적인 조직학적 이미지에 도시된 바와 같이, 이전에 기재된 것과 동일한 범위에 있었다(도 4a-c). 3-잠재력 분화에 대한 본 발명자들의 관찰(상기 참조)과는 대조적으로, 4 명의 환자 중 누구에 대해서도 누적 집단 배가에 따른 반월판 회복의 평균 효능에 유의미한 변화가 없었다(도 4d-g). 더욱이, 개별 반월판 구조물에 대해 측정된 융합 %는 사용된 MSC의 계대 수와 상관 관계를 나타내지 않았다(도 4h).

조직 회복 반응의 자극뿐만 아니라, MSC는 T 세포 증식의 억제 및 다른 메커니즘을 통해 면역을 또한 억제할 수 있었다. 따라서, 본 발명자들은 모든 4 명의 환자에 대해 선택된 계대로부터의 MSC에 의한 T 세포 증식의 억제 %를 측정했다. 반월판 회복에서와 같이, 계대 증가에 따른 MSC의 면역 조절 능력에 유의미한 변화가 없었다(도 4i).

종합하면, 영양 반월판 회복 및 T 세포 증식의 억제에 대한 본 발명자들의 관찰은 MSC의 보호 및 회복 효과가 광범위한 시험관 내 증폭 후에도 유지되는 CD105+ve, CD90+ve, CD34-ve, CD45-ve MSC의 근본적인 특징임을 나타낸다.

전사체학 및 단백질체학 데이터는 다분화능의 상실과 연관될 수 있는 계대에 걸친 유의미한 차이를 나타낸다

본 발명자들은 각 계대에서 4 명의 환자 모두의 미분화된 MSC로부터의 mRNA를 남겨 두었다. 성장 및 분화 특성에 근거하여, 유전자 배열 비교를 위해 P1, P5, P10 및 P15 계대로부터의 mRNA를 선택했다. 각각의 상기 계대에 대해 단백질체 비교를 위한 조정 배지(conditioned medium)를 또한 수집하였다. 유전체 및 단백질체 데이터를 조합했고, 관련된 유전자 및 단백질의 변화 패턴에 대해 분석했다. 전사체학 및 단백질체 분석에 대한 방법론적 접근법이 도 5a에 도시된다. 데이터 구조를 주요 성분 분석(PCA)을 통해 평가했다. 2 개의 제1 주요 성분의 점수 플롯이 도 5b에 도시된다. 계대에 걸쳐 포착된 변화가 PC2에 설명되고, PC1은 (블루 및 오렌지 타원으로 표시된) 2 개의 그룹으로 계층화될 수 있는 환자 사이의 상당한 변이를 포착한다. 상기 2 그룹의 환자는 골 형성 능력에서 또한 차이를 나타낸다(상기 참조). 이러한 환자의 가변성과는 독립적으로, 계대에 걸쳐 단독으로 변화하는 유전자 및 단백질을 식별할 목적으로, 본 발명자들은 방법 섹션에 기재된 바와 같이 각 변수에 대해 이원 분산 분석(2-way ANOVA)을 수행했다. 도 5c는 상기 테스트의 유의미한 변수를 도시한다. 338 개의 유전자 및 단백질만이 환자 대 환자 편차 또는 임의의 관련된 반복과 독립적으로 계대에 걸쳐 독특하게 유의미하다. 상기 338 개의 유전자 및 단백질을 사용하여 PCA를 계산하고, PCA의 2 개의 제1 주요 성분이 선택된 338 개의 변수의 히트맵과 함께 도 5d에 도시하였다. 예상된 바와 같이, 상기 유전자 및 단백질은 계대에 의해 모든 환자 샘플의 매우 명백한 분리를 나타내며, 일 서브세트는 계대에 걸쳐 이의 발현/존재도가 감소(히트맵의 상반부)하는 반면, 다른 것은 이의 발현/존재도가 증가(히트맵의 하반부)한다.

상기 각각의 338 개의 유의미한 단백질 및 유전자에 대해 1 계대에 관한 배수 변화를 계산했고, IPA(Ingenuity Pathway Analysis)(QIAGEN Inc, https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis)로 상기 데이터를 분석했다. 소프트웨어 내의 세계적인 분자 네트워크와 중첩된 IPA의 핵심 분석으로, 상기 목록 내에서 유의미하게 과-표현되고, 따라서 세포의 다분화능 분화 능력의 상실과 연관된 것으로 밝혀진 많은 정규 경로(canonical pathway), 기능 및 상류 조절자를 식별하였다. FOXM1 유전자 자체의 하향 조절에 대한 전사체학 데이터로부터의 명백한 증거(도 6a) 및 IPA에 의해 하향 조절되는 것으로 또한 예측된 이의 하류 이펙터 7 개 중 6 개로(도 6b), 세포 주기 마스터 조절자 FOXM1 유전자 경로에서 가장 크고 가장 유의미한 변화가 있었다. 비활성화될 것으로 예측된 다른 상류 조절자는 프로스타글란딘 수용체 PTGER2 및 VEGF 패밀리의 멤버였으며, 계대에 걸쳐 양성 활성화될 것으로 또한 예측된 상류 조절자는 증식 조절자 NUPR 및 세포 골격 조절자 MYOC를 포함했다. 우리의 전사체 분석으로부터의 양적 데이터 및 상기 조절자의 하류 이펙터에서의 변화의 관련 IPA 예측이 도 S5에 도시되나, 변화 및 예측된 하류 효과 중 어떤 것도 FOXM1에 대한 것만큼 명백하지 않았다.

세포 이동 및 상처 치유의 조절자가 MSC의 영양 특성과 연관될 수 있다

도 4에 도시된 바와 같이, MSC의 영양 회복 능력이 계대 증가에 따라 변함없이 유지된다. 상기 현상을 더 조사하기 위해, (a) 상기 기능의 조절에 관련된 단백질 및 유전자가 계대에 걸쳐 존재도/발현에 상당한 변화를 나타내어서는 아니되고, (b) 세포 움직임, 세포 이동 및 상처 치유와 관련된 기능이 영양 회복에 매커니즘적으로 관련될 가능성이 있다고 가정했다. 상기 가설을 조사하기 위해, IPA 데이터베이스를 사용하여 상기 나열된 3 개의 용어 내 관련된 단백질 및 유전자를 식별했다. 이어서 우리의 데이터에 상기 목록을 맵핑했고, 중복되는 변수를 추출하였으며, 계대에 걸쳐 이의 중요성을 평가했다. 상기 검색 용어에 맵핑된 단백질 및 유전자 대부분이 계대에 걸쳐 변화하지 않고 우리의 MSC 배양의 4 계대 모두에 걸쳐 일정한 수준으로 발현되는 것으로 밝혀졌으며(도 6b), 이는 영양 회복에 필요한 것으로 예상되는 유전자 및 단백질이 다분화능 분화 능력은 상실되었으나 영양 회복 능력은 여전히 높은 노화 세포에서 계속 발현된다는 가설을 지지한다. 본 발명자들은 CXCL12(또는 간질 세포 유래 인자 1로도 명명됨)가 우리의 검색 용어 3 개 모두와 연관(도 6c)되고 유전자 및 단백질 수준 둘 다에서 일관적으로 높게 발현(도 6d 및 e)되었기 때문에 특히 중요하다고 간주했다.

마커 유전자 및 단백질

상기 약술된 IPA 분석으로 계대 증가에 따른 FOXM1 정규 경로의 하향 조절/다분화능 분화의 상실 및 계대 증가에 따른 CXCL12 및 다른 세포 이동 및 상처 치유 유전자 및 단백질의 지속적인 발현이 입증되었다. 그러나, 본 발명자들은 정규 경로 또는 유전자/단백질 패밀리의 일부가 아닐수 있으나 시험관 내 세포 노화의 특정 마커로 사용될 수 있는 유전자 및 단백질을 식별하는 것이 또한 필요하다고 생각한다. 상기 마커가 실험실 간 세포 연구의 비교 또는 치료용으로 사용될 MSC 집단의 기능성을 결정하는 데 도움이 될 것이다. 따라서, 우리는 유전자 배열 및 단백질 데이터를 분석하여 후보 마커를 식별했다.

전사체학 분석에 의해 식별된 유의미한 가변 유전자 내에서, 매트릭스 메탈로프로틴아제 13(matrix metalloproteinase 13, MMP13; 콜라겐아제 3; 도 7a 및 표 S2)에서 계대 증가에 따른 유전자의 유의미한 감소, 및 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5(IGF 결합 단백질 5; 표 S3)에서 계대 증가에 따른 유전자의 유의미한 증가가 있었다. 다른 MMP 유전자(표 S2) 또는 IGFBP 유전자(표 S3) 또는 형질 전환 성장 인자 패밀리 유전자 중 어떠한 것(표 S4)에서도 유의미한 변화가 없었다. 전사체학 데이터가, 계대에 따른 MMP13 유전자 발현의 하락 속도가 연골 생성 잠재력의 하락을 밀접하게 반영한다는 것을 나타냈기 때문에(도 7a와 도 3 비교), 본 발명자들은 정량적 PCR을 사용하여 상기 결과를 검증하여 계대 증가에 따른 MMP13 유전자 발현의 변화를 보다 정확하게 결정했다. 결과가 계대 증가에 따른 MMP13 유전자 발현의 지속적인 감소를 확인하였고(도 7b), 이는 MMP13 유전자 발현의 상실이, MSC가 시험관 내 증식을 통해 노화된 정도를 결정하는 것을 돕는 데 이용될 수 있음을 입증한다.

단백질체 데이터세트 내에서, 모든 계대에서 가장 높은 존재도로 발현된 단백질들을 식별했다(표 S5). 상기 단백질들 중 가장 풍부한 것은 메탈로프로틴아제 억제제 1(메탈로프로틴아제의 조직 억제제 1; TIMP1(Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 1); 표 S5 및 도 7c)이었다. 본 발명자들은 ELISA 키트 에세이를 사용하여 상기 결과를 검증하여 계대 증가에 따른 TIMP-1 단백질 분비의 변화를 보다 정확하게 결정하였고(도 7d), 이는 TIMP-1의 발현이 시험관 내 증식을 통해 노화된 정도와 무관하게 MSC를 규정하는 특성임을 입증한다. 더욱이, MSC가 콜라겐 스캐폴드 상에 시딩되고 24 시간 동안 배양되었을 때, 세포는 세포/스캐폴드 구조물로부터 이의 배양 배지 내로 높은 수준의 MSC를 계속 분비했으나, 생존 능력을 감소시키는 조건 하에서 구조물이 동결-해동된 경우, TIMP 분비 수준이 실질적으로 감소했다(도 7e).

본 발명자들은 높은 수준의 MMP13 유전자를 발현하면서 풍부한 TIMP-1을 분비하는 MSC가 표현형 분화 또는 영양/면역 조절 회복 중 어느 하나를 수반하는 치료 과정에 잠재적으로 이용될 수 있다고 결론을 내렸다. 그러나, 낮은 수준의 MMP13 유전자를 발현하면서 풍부한 TIMP-1을 분비하는 MSC는 오직 영양/면역 조절 회복을 수반하는 과정에 사용될 수 있으며, 분화를 수반하는 과정에는 신뢰성있게 사용될 수 없었다.

논의

MSC의 2 가지 다른 중요한 특성(영양 회복 및 면역 조절)이 매우 큰 수의 집단 배가 후에조차 유의미하게 감소하지 않았고, 분화 능력의 감소가 증식이 멈추기 전 많은 계대 배양에서 관찰되었기 때문에, 본 발명자들은 시험관 내에서 광범위한 계대 배양에 따른 MSC의 다분화능 분화 능력의 상실이 MSC의 노쇠에 따른 일반화된 세포 기능 상실의 결과일 수 없음을 보여주었다. 더욱이, 다양한 중요한 신호 전달 경로의 유전자 및 단백질 패밀리가 계대 수의 증가 및 분화의 상실과 상관 관계가 있는 명백한 변화를 나타낸 반면, 상처 회복 및 세포 움직임/이동과 관련된 것으로 공지된 유전자 및 단백질은 계대 수의 증가에 따라 유의미하게 변화하지 않는다. FOXM1(Forkhead Box M1) 정규 경로의 하향 조절이 계대 수와 명백한 관련을 나타냈고, 이는 유지 및 이어서 다분화능의 상실에 있어 FOXM1의 잠재적인 역할을 시사한다. 상기 관찰은 이의 생물학적 기능에 대한 이전 연구와 일치한다. 암 줄기 세포의 생존에 중요한 마스터 조절자는 원-종양유전자(proto-oncogene)이다(Nakano, 2014; Xie et al., 2010). 이는 다분화능 및 전분화능 줄기 세포에서 고도로 발현되고, 줄기 세포 효능의 유지(Besharat et al., 2018; Youn et al., 2017) 및 재프로그래밍을 통한 전분화능의 유도(Jeong et al., 2017)에 중요한 것으로 또한 나타났다. CXCL12(SDF-1으로도 공지)는 영양 회복과 관련된 우리의 검색 용어 중 3 개 모두와 연관된 것으로 밝혀졌고, 이의 유전자 및 단백질 수준이 매우 큰 계대 수에서조차 유지되었으며, 이는 MSC 매개 영양 회복에서 CXCL12의 잠재적인 역할을 나타낸다. 상기 관찰은, 시험관 내 신경 세포 생존의 향상(Chalasani et al., 2003) 및 내피 세포와 종양 세포 사이의 영양 기능(trophism) 매개(Rao et al., 2012) 뿐만 아니라 척수 회복(Stewart et al., 2017) 및 심근 회복(Dong et al., 2012)에 대한 MSC 매개 유도에서 이의 중요한 역할을 입증해온 이전 연구와 일치한다. 상기 매커니즘적 관계에 더하여, 본 발명자들은 시험관 내에서 MSC의 노화와 관련된 2 가지 기능성 마커, 즉 계대 증가에 따라 하향 조절되는 MMP13(콜라겐아제 3) 유전자 및 모든 계대의 분비체(secretome)에서 가장 풍부한 단백질인 TIMP-1 단백질을 식별했다. 서로 독립적으로 식별된(하나는 전사체학 데이터 유래이고 하나는 단백질체학 데이터 유래임) 상기 2 개의 마커가, TIMP-1이 다른 메탈로프로틴아제뿐만 아니라 MMP13의 억제제인 것과 같이 생물학적으로 서로 관련되어 있다는 점이 특히 흥미롭다.

이전 연구에서 MSC의 다분화능이 시험관 내 및 생체 내 노화에 따라 감소하는 것으로 명백하게 나타났다(Bonab et al., 2006; Choudhery et al., 2014; Ganguly et al., 2017; Muraglia et al., 2000; Stenderup et al., 2003; Yang, 2018; Yang et al., 2018). 보다 큰 계대 수에서 연골 발생이 감소하고, 골 형성이 감소하는 경향이 있으나 지방 형성이 유지된다는 본 발명자들의 관찰은 문헌[Yang et al., 2018]의 연구와 일치한다. Muraglia 등(Muraglia et al., 2000)은 계대에 따른 다분화능 분화의 상실을 또한 보여주었으나, 이의 실험에서 골 형성은 지방 형성의 초기 상실에도 불구하고 유지되었다. 그러나, 그들은 MSC의 클론 세포주를 이용하여 연구했으나 본원 및 Yang 등에 의해 보고된 연구는 MSC의 전체 집단을 조사했다.

Haynesworth 등은 MSC의 고유한 사이토카인 발현 패턴을 처음으로 설명했고(Haynesworth et al., 1996), 이들은 덱사메타손을 이용한 분화 자극 후 사이토카인 생성의 감소를 입증했다. 10 년 후, Caplan 및 Dennis는 "인접한 세포에 주로 이의 효과를 나타내고 이의 효과는 생산자 세포의 분화를 초래하지 않는 생물 활성 인자로서 세포에서 나오는 주화성(chemotactic), 유사 분열(mitotic) 및 분화 조절 효과"로 정의되는 "영양 효과(trophic effect)"라는 용어를 만들었다(Caplan and Dennis, 2006). 이들은 조혈 세포의 성장 및 분화를 위한 골수 니치(niche)에서 MSC에 의해 제공되는 지지를 상기 효과의 전형적인 예로 인용했다. 이들은 뇌졸증, 심근 경색 및 반월상 연골 재생의 치료를 포함한 다양한 세포 요법 환경에서 영양 지지를 제공하는 MSC에 대한 증거를 또한 요약했다. 수많은 다른 연구들이 MSC-유도된 영양 회복의 중요성을 계속 설명해 왔다(Caplan and Correa, 2011; Caplan and Dennis, 2006; Kuroda et al., 2011; Prockop, 2009; Tolar et al., 2010). 본 발명자들은 손상된 조직의 융합을 촉진하도록 줄기 세포/콜라겐-스캐폴드 이식을 이용하는 신선한 반월상 연골 열상의 치료에 대한 새로운 방법을 고안함에 있어서 MSC의 영양 효과를 이용했다. 본 발명자들의 최초 시험관 내 연구로 이식 조직에서 주변 조직으로 세포의 이동 및 내인성 반월판 세포와의 상호 작용에 방법이 의존한다는 것이 입증되었다(Pabbruwe et al., 2009; Pabbruwe et al., 2010b). 중요하게, 본 발명자들은 연골 형성 분화를 겪도록 형질 전환 성장 인자 β로 자극된 MSC가 미분화 MSC보다 반월판 회복을 촉진하는 데 훨씬 덜 강력하다는 것을 발견했다(Pabbruwe et al., 2010b). 본 발명자들은 양(sheep) 전-임상 모델 및 최초의 인체 시험에서 반월판 손상을 복구하기 위한 콜라겐 스캐폴드 상에 시딩된 미분화 MSC의 사용을 기술했다(Whitehouse et al., 2017). 현재 연구에서, 본 발명자들은 영양 회복을 위한 모델로 우리의 시험관 내 반-정량적 반월상 연골 융합 에세이(Pkabbruwe et al., 2010b)를 사용했고, 최대 30 계대 동안 배양되어 온 MSC가 매우 초기 계대의 세포와 동일한 영양 회복 능력을 유지한다는 매우 놀라운 관찰을 했다. 상기 기능적 데이터가 세포 움직임 및 이동 및 상처 치유와 관련된 유전자 및 단백질에 대한 우리의 분석에 의해 지지되었으며, 이는 분화와 연관된 것과 달리 계대 증가에 따른 이의 발현에 유의미한 변화가 없었음을 나타낸다.

MSC의 면역 조절 효과가 광범위하게 설명되어 왔으며, 다양한 메커니즘이 관련되나, T 세포 증식의 억제가 이의 억제 활성의 중요한 구성 요소임이 명백하다(Dickinson et al., 2017; Keating, 2012; Spaggiari et al., 2007; Tolar et al., 2010; Uccelli et al., 2006; Uccelli et al., 2007). 인간 T 세포는 항-CD3 및 항-CD28 항체의 조합을 이용하여 증식하도록 강력하게 자극될 수 있다(Verhagen and Wraith, 2014). 이의 증식 속도가, 이어서 각각의 세포 분열에 의해 50%씩 희석되고, FACS에 의해 추적되는 형광 염료를 이용하여 세포 내 분자를 공유 결합으로 표지함으로써 모니터링될 수 있다(Quah et al., 2007). 표지되고, 자극된 T 세포의 배양물 내로 MSC의 첨가가 림프구 증식을 억제하여 염료의 축적이 연장된다(Dickinson et al., 2017). 현재 연구에서, 본 발명자들은 상기 방법을 이용하여 초기 및 후기 계대에서 MSC의 면역 조절 효과를 측정했고, 계대 증가에 따라 효능이 상실되지 않음을 발견했다. 인간 MSC의 경우, T 세포 억제 메커니즘은 인돌아민 2,3-디옥시게나제-매개의 트립토판 분해를 수반하는 것으로 설명되어 왔다(Meisel et al., 2004). 종합하면, 상기 결과는 영양 회복에서와 같이 면역 조절이 계대 증가에 따라 상실되지 않는 MSC의 근본적인 특성임을 입증한다.

이전 연구는 계대 증가에 따른 MSC의 다분화능 분화 능력의 상실을 강조했고, 이러한 결핍은 노쇠된 최종 상태로의 세포의 진행과 관련된 것으로 추정되었다(Bonab et al., 2006; Muraglia et al., 2000; Yang, 2018; Yang et al., 2018). 그러나, 본원에 기재된 결과는 광범위한 시험관 내 계대 배양 후에 조차 영양 회복 또는 면역 조절 효능의 명백한 상실이 없음을 입증하고, 이는 상기 관점에서 MSC가 증식을 멈추기 바로 며칠 전까지도 완전히 기능적으로 유지된다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은 MSC의 측정 가능한 기능에 대한 계층(hierarchy)이 존재하며, 시험관 내에서 영양 회복 및 면역 조절은 핵심적인 특징인 반면 다분화능은 일시적인 특징이라고 결론지을 수 있다.

용어 "중간엽 줄기 세포(Mesenchymal Stem Cell)"는, "부상 약국(An injury Drugstore)"으로 MSC를 설명해왔고(Caplan and Correa, 2011), 보다 최근에는 "의학적 신호 전달 세포(Medicinal Signaling Cell)"로 이의 명칭 변화를 옹호(Caplan, 2017)한 Caplan에 의해 만들어졌다(Caplan, 1991). 다른 연구들은 엄격한 확증적인 생물학적 증거의 부족 때문에 MSC를 줄기 세포로 정의하는 데 의문을 제기하였으며(Bianco et al., 2008; Javazon et al., 2004; Keating, 2012; Kuroda et al., 2011; Prockop, 2009), 상기 모든 연구는 학명에 대한 결론에 이르기 전에 더 많은 실험적 데이터가 필요하다. 다른 사람들은 MSC가 줄기 세포가 아니라는 결론에 보다 솔직했고, "기적의 치료제(miracle cures)"로서의 MSC에 대한 과장된 마케팅을 회피하기 위해 즉각적인 학명의 변화를 요구했다(Caulfield et al., 2016; Sipp et al., 2017; Sipp et al., 2018). Prockop은 줄기 세포의 본질이 단일 시점에서 이의 상태에 의해 결정되어서는 안된다는 점을 강조했다(Prockop, 2009). 그의 통찰력있는 검토는 본원에 보고된 데이터에 대한 유용한 맥락을 제공한다. 상기 연구에서, 본 발명자들은 시간의 경과에 따라 많은 계대에 걸친 MSC의 시험관 내 분화 및 영양 거동을 조사해 왔고, 상기 방식으로 다분화능의 특성이 상대적으로 일시적인 반면 상기 세포의 영양 효과는 성장 정지시까지 내내 명백하게 영구적이라는 결론에 도달했다.

결론적으로, 우리의 발견은 다분화능에 비해 영양 회복의 계층적 중요성을 강조하고, MSC를 중간엽 줄기 세포라기보다 회복 세포(repair cell)로 정의하는 데 유리한 일부 추가 증거를 제공한다.

STAR 방법

시약 및 자원 공유를 위한 연락

시약에 대한 추가 요청은 Lead Contact, Anthony Hollander(A.Hollander@Liverpool.ac.uk)에게 전달될 수 있으며, 이에 의해 이행될 것이다.

실험 모델 및 주제 세부 사항

시험관 내 연구를 위한 인간 골수 유래 MSC의 단리 및 증폭

여기에 보고된 모든 실험의 근거로 사용된 모델은 인간 골수 유래 MSC의 장기 배양물이었다. 골수 플러그가 전체 고관절 대치술을 받는 환자의 대퇴골두에서 수집되었다. 모든 환자가 고지에 입각한 동의를 했으며, 연구는 지역 윤리 지침(North Bristol NHS Trust Research Ethics Committee)에 따라 수행되었다. 환자 세부 사항은 표 S1로 알 수 있다. 세포를 10% (v/v) 태아 소 혈청(FBS, Thermo Scientific Hyclone, Loughborough, UK)으로 보충된 낮은 포도당 Dulbecco's Modified Eagles Medium(Sigma), 1% (v/v) Glutamax(Sigma) 및 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신(Sigma)으로 구성된 줄기 세포 증폭 배지에 현탁했다. 혈청 배치가 선택되어 MSC의 성장 및 분화를 촉진했다(Kafienah et al., 2007a). 배지를 10 ng/ml FGF-2(Peprotech)로 또한 보충했다. 상기 성장 인자는 이전에 시험관 내에서 MSC 증식을 향상시키고(Bianchi et al., 2003; Solchaga et al., 2005), 증식 중 미분화 세포로 MSC를 유지시키며(Kafienah et al., 2006; Martin et al., 1999), FGF-2 증폭된 MSC가 후속적으로 분화 조건에 노출된 경우 연골 생성 분화를 향상(Bianchi et al., 2003; Solchaga et al., 2005)시키는 것으로 나타났다. 세포 현탁액이 배지를 이용한 반복된 세척에 의해 샘플 중 임의의 뼈와 분리되었다. 세포가 5 분 동안 500 g에서 원심분리되었고 상청액/지방이 제거되었다. 생성된 세포 펠릿이 배지에 재현탁되었고, 이어서 cm² 당 1.5-2.0x10⁵ 유핵 세포의 시딩 밀도로 플레이팅되었다. 상기 플라스크가 5% CO₂ 및 95% 공기의 가습 대기에서 37℃로 인큐베이션되었다. 첫 번째 배지 교환 전에 4 일을 두었고, 이어서 부착 세포가 90% 합류(confluence)에 도달하고 계대 배양을 위해 준비될 때까지 배지를 격일로 바꾸었다.

방법 세부 사항

세포 계대 배양 및 집단 배가 및 배가 시간의 계산

각 계대 배양 말기에 MSC를 0.25% 트립신-EDTA(Invitrogen)를 사용하여 수확, 풀링, 계수했고, 이어서 재시딩 및 추가 성장, 반월상 연골의 융합 % 계산에 즉시 사용, 유전자 및 단백질 분석뿐만 아니라 분화 프로토콜에서의 후속 사용을 위한 액체 질소 보관을 위해 상이한 원심 분리 튜브 내로 분주했다. 각 환자에 대한 세포가, 계대 배양 사이에 세포 수의 검출 가능한 증가가 없는 것으로 정의되는 성장 정지까지 동결없이 지속적으로 계대 배양되었다(표 S1 참조). 각 계대에서, 수확된 MSC의 총 수가 결정되었다. 신선한 골수의 시딩 후 제1 세포 수확이 계대 0으로 간주되었다. 계대 1의 시작에서 재시딩된 세포 수가 계대 1의 말기에 제1 집단 배가 수치의 계산을 위한 기준선으로 사용되었다. MSC의 하류 분석이 계대 1부터 계속 수행되었다.

집단 배가(Population doubling, PD) 수가 하기 공식을 사용하여 계산되었다:

PD = [log(수확된 MSC의 수) - log(시딩된 MSC의 수)]/log(2)]

각 계대에 대한 PD가 계산되고 이전 계대의 PD에 더해져서 각 계대의 누적 PD에 대한 데이터가 생성되었다.

집단 배가 시간(Population doubling time, PDT)이 하기 공식을 사용하여 각 계대에 대해 계산되었다:

PDT = t x log(2)/log(수확된 세포/시딩된 세포)

(t = 세포 시딩과 세포 수확 사이의 시간)

세포 표면 표현형 마커의 검출

MSC(각 계대 1, 5, 10 및 15에서 각 환자 유래 100,000 개의 세포)가 1:500 희석의 Zombie(Biolegend), 생/사(live/dead) 세포 염료에 현탁되었고, 어둠 속에서 20 분 동안 인큐베이션되었다. 이어서 실온에서 1 시간 동안 1% (wt/vol) BSA(Sigma-Aldrich), 5% (vol/vol) FCS(Sigma-Aldrich), 및 10% (vol/vol) 인간 혈청(Sigma-Aldrich)에서 세포를 인큐베이션함으로써 비특이적 항원을 차단하였다. 세포를 3 배 부피의 PBS에 원심 분리하여 세척했고, 세포 펠릿을 차단 용액 중 20-100㎍/ml의 항체를 함유하는 100㎕의 1차 항체 용액에 현탁했다. 모든 1차 항체는 형광 표지된 마우스 항-인간 IgG이었다: 항-CD105-FITC(fluorescein isothiocyanate), 항-CD90-PE(phycoerythrin), 항-CD45-PE는 R&D Systems 제품이었고; 항-CD34-FITC는 BD Bioscience 제품었으며; IgG1-FITC 및 IgG1-PE 아이소타입 대조군은 R&D Systems 제품이었다. 4 ℃에서 40 분 동안 인큐베이션 후, 생존불가능한 세포 제거 후, 세포를 세척했고, Canto 유세포 분석기(BD FACSCanto II) 상에서 분석하기 위해 1 ml의 PBS에 현탁했다. 데이터를 FlowJo(Treestar)를 사용하여 분석했다. 상응하는 아이소타입-매칭된 대조군 항체의 95% 초과의 형광 수준으로 양성 발현이 정의되었다.

연골 형성

연골 조직 공학

각 계대 유래 MSC의 연골 형성 능력이 앞서 기재된 바와 같이 3 차원 연골 조직 공학을 수행하여 평가되었다(Kafienah et al., 2007a). 간략히, 300,000 개의 세포가 100 ㎍/ml 피브로넥틴(Sigma)으로 사전 코팅된 5 mm 직경 x 2 mm 두께 PGA(polyglycolic acid) 스캐폴드 디스크(Biomedical Structures, Warwick, RI, USA) 상에 한 방울씩 로딩되었다. 이어서 구조물을 10 ng/ml의 형질 전환 성장 인자-β3(TGF-β3; R&D Systems), 100 nM 덱사메타손, 80 μM 아스코르브산 2-인산염, 1 mM 나트륨 피루베이트, 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신(모두 Sigma-Aldrich 제품), 1% 인슐린-트렌스페린-셀레늄-G(ITS) 및 2 mM Glutamax-I(둘 다 Invitrogen 제품)으로 보충된, 4500 mg/L 포도당(Sigma-Aldrich)을 함유하는 DMEM으로 구성된 연골 생성 분화 배지에서 배양했다. 7 일 후, 배지를 배양 종료까지 10 ㎍/ml 소 췌장 인슐린(Sigma-Aldrich)으로 더 보충했다. 구조물을 총 35 일 동안 회전 플랫폼 상에서 37 ℃로 인큐베이션했고, 배지를 3 일 간격으로 바꾸었다.

생화학 분석

연골 구조물을 35 일의 조직 공학 기간 종료 시에 동결 건조하여 칭량하였다. 세포 외 매트릭스를 2 mg/ml의 소 췌장 트립신(Sigma-Aldrich)으로 밤새 분해하여 완전히 가용화시켰고, 이어서 15 분 동안 이를 끓여 효소의 작용을 억제시켰다(Dickinson et al., 2005). 구조물 내 세포 외 매트릭스의 건조 중량을 얻기 위해, 남은 분해되지 않은 스캐폴드 물질을 동결 건조했고, 칭량하였으며, 원래 건조 중량에서 차감했다. 분해물 내 프로테오글리칸의 양이 디메틸메틸렌 블루(Sigma-Aldrich) 비색 에세이를 이용하여 황산화된 글리코사미노글리칸(GAG)으로 측정되었다(Handley and Buttle, 1995).

골 형성 및 지방 형성

전체 MSC 집단 또는 MSC 클론을 골 형성 분화 전 50-70% 합류까지 또는 지방 형성 분화 전 100% 합류까지 단층으로 성장시켰다. 두 경우 모두, 이어서 대조군 세포를 10% FBS, 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신 및 2 mM Glutamax-I을 함유하는 α-MEM(Invitrogen) 기본 배지에서 배양했다. 분화를 겪도록 자극된 세포를 21 일 동안 골 형성 보충제 또는 지방 형성 보충제(둘 다 R&D Systems 제품) 중 어느 하나를 함유하는 기본 배지에서 배양했다. 골 형성 분화 후, 세포를 70% 에탄올로 고정했고, 5 분 동안 pH 4.1, 40 mM 알리자린 레드 S(Sigma-Aldrich)로 염색했다. 지방 형성 분화 후, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정했고, 30 분 동안 0.3% 오일 레드 O(Sigma-Aldrich)로 염색했다. 분화 정도를 맹검 조건 하에서 점수화했고, 골 형성 분화 후 미네랄화된 침전물의 영역 및 수의 증가(도 S1 참조) 및 지방 형성 분화 후 지방 액적 수의 증가(도 S3 참조)에 따라 -(염색 없음), +, ++ 또는 +++로 분류했다.

반월판 회복

양(sheep) 반월상 연골 준비

양의 다리를 Edge & Son 정육점, Wirral, Merseyside에서 구매했고, 반월상 연골을 무균 조건 하에서 제거했다. 반월상 연골 실린더(직경 5.0 mm 및 두께 3.0 mm)를 진피 생검 펀치를 사용하여 양 반월판의 무혈관(백색 구역)에서 수확했다. 이를 헹구고, 10% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신(Sigma-Aldrich) 및 1% (v/v) 250 ㎍/ml 암포테리신 B(Sigma-Aldrich)를 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS; Invitrogen Ltd, Paisley, UK)로 20 분 동안 인큐베이션했다. 섬유 연골 디스크(fibrocartilage disc)의 생존 능력이 10mM Hepes 완충제(Sigma), 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신, 비필수 아미노산(NEAA; Sigma), 1% (v/v) Glutamax 및 10% 암포테리신 B와 함께 저-포도당 DMEM으로 구성된 기본 배지에서 37 ℃, 5% CO₂ 환경으로 배양함으로써 유지되었다. 외식편(explant)이 배양 3 일 내에 융합 실험에 사용되었다.

세포 시딩

콜라겐 스캐폴드(Ultrafoam Collagen Sponge; Bard, UK, www.barduk.com)를 6mm 직경 디스크로 절단하고, 1 x 10⁶ 개의 세포/cm² 농도의 인간 MSC로 시딩했다. 현탁액을 24-웰 플레이트의 초-저 부착 웰(Corning®, Acton, USA)에 위치된 스캐폴드 상으로 한 방울씩 로딩했다. 4 시간 후, 10 ng/ml FGF-2를 함유하는 1.5 ml의 증폭 배지를 첨가했고, 매일 교환했다. 시딩된 스캐폴드를 50 rpm의 궤도형 쉐이커에서 37℃로 48 시간 동안 인큐베이션했다.

구조물의 조립(assembling) 및 배양

시딩된 스캐폴드가 사이에 놓인 2 개의 양 반월상 연골 디스크의 샌드위치 구조물이 스킨 클립을 사용하여 이전에 기재된 바와 같이(Whitehouse et al., 2017) 조립되었고, 시험관 내에서 10 ng/mL FGF-2를 포함하는 증폭 배지 중에서 초-저 부착 6-웰 플레이트에서 7 일 동안 배양된 뒤, 10% (v/v) FBS, 1% (v/v), Glutamax, 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신, 인슐린 및 아스코르베이트-6-포스페이트(50㎍/ml; Sigma)를 함유하는 고 포도당 DMEM으로 구성된 융합 배지에서 33 일 동안 배양되었다. 배지를 매주 2 회 보충했다. 구조물을 배양 기간 내내 회전 플랫폼 상에서 37 ℃로 인큐베이션했다. 배양 종료 시, 조직학적 분석을 위해 구조물을 10% (v/v) 중성 완충 포르말린 내 고정으로 준비했다.

조직 형태 계측 분석

이전 연구에서 본 발명자들이 개발하고 특성화한 방법을 사용하여 조직 형태 계측(histomorphometry)을 수행했다(Pabbruwe et al., 2009; Pabbruwe et al., 2010a; Whitehouse et al., 2017). 고정된 구조물이 탈수되었고, 파라핀 포매(embedding)되었다. 샘플을 형태학적 세부 사항 연구를 위해 4㎛ 섹션으로 절단하고, H&E(hematoxylin and eosin)로 염색했다. 모든 조직학적 섹션을 Leica Aperio 슬라이드 스캐너를 사용하여 스캐닝했고, ImageScope 소프트웨어(Leica)를 사용하여 맹검 조건 하에서 조직 형태 계측 분석을 수행했다. 각 구조물의 2 개의 수직 섹션, 모서리에서의 하나 및 중앙에서의 또 다른 하나가 사용되었다. 각 섹션에 대해, 이식물/반월판 경계면의 전체 길이 및 경계면에서 임의의 융합 영역의 길이가 측정되었다. 이어서 회복 지수(repair index)가 하기와 같이 결정되었다:

융합 % = 융합된 경계면의 길이/전체 경계면의 길이 ⅹ 100

면역 억제

인간 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)가 건강한 지원자의 공여자 혈액 샘플에서 단리되었다. 모든 지원자가 고지에 입각한 동의를 했으며, 연구는 지역 윤리 지침(University of Liverpool Research Ethics sub-committee for Physical Interventions)에 따라 수행되었다. PBMC가 1.077 g/mL Ficoll-Paque(GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK)로 혈액을 원심 분리하여 단리되었고, L-글루타민을 함유하고 10% 인간 AB 혈청 및 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 RPMI-1640에서 배양되었다. PBMC를 CellTrace™ Violet(ThermoFisher Scientific)으로 염색하여 T 세포 증식을 모니터링했다. 이어서 표지된 PBMC를 3.75㎍/ml 항-인간 CD3(HIT3a) 및 2㎍/ml 항-인간 CD28(CD28.2)(둘 다 Fisher Scientific Affymetrix eBioscience, Cheshire, UK 제품)을 이용하여 자극하였고, 1, 5, 10 및 15 계대의 4 명의 개별 공여자로부터의MSC와 함께 72 시간 동안 공배양하였다. 7-아미노-악티노마이신 D(7-amino-actinomycin D, 7-AAD; BD Biosciences)로 염색된 생존불가능 세포의 제거 후 각 집단에 대한 T 세포 증식 프로필을 유세포 분석으로 분석하였다.

정량적 PCR

MMP13 mRNA 및 하우스키핑 유전자 TBP(Tata Binding Protein)에 대한 실시간 정량적 PCR(RT-qPCR)이 CellsDirect™ One-Step qRT-PCR 키트(ThermoFisher)를 사용하여 수행되었고, 역전사 및 PCR 증폭이 동일한 반응 튜브에서 상기를 이용하여 수행되었다. MMP13 (Hs00942584_m1) 및 TBP (Hs00427621_m1)에 특이적인 프라이머를 ThermoFisher TaqMan®에서 구매했다. 50℃에서 15 분 동안 cDNA를 합성함으로써 반응이 시작되었고, RNA-cDNA 하이브리드를 변성시키고 역전사 효소를 비활성화시키는 95℃에서 2 분으로 이어졌다. 열 주기 프로그램은 15 분 동안 50℃, 2 분 동안 95℃, 및 10초 동안 95℃ 및 30초 동안 60℃인 2-단계 40 주기로 구성되었다. TBP에 대한 MMP13 발현이 각각의 MSC 샘플에 대해 4 개의 시점 각각에 결정되었고, 결과가 1.0의 배수-발현으로 간주된 시간(계대 2)에 대해 정규화되었다.

TIMP-1 ELISA

TIMP-1 단백질이 인간 TIMP-1에 대해 Quantikine® ELISA 키트(R&D Systems)를 사용하여 MSC의 분비체(secretome)에서 측정되었다. MSC가 225만 개의 세포/웰로 6-웰 플레이트 내에 시딩되었고(3 개의 복제물), 2ml의 DMEM으로 24 시간 동안 배양되었다. 이어서 배지를 추가 24 시간 동안 1 ml의 페놀-부재 배양 배지로 교체하였고, 그 후에 분비체를 수집하였으며, ELISA 키트를 사용하여 적절한 희석으로 분석했다.

게놈 및 단백질체 데이터의 수득

전사체학

P1, P5, P10 및 P15에서 4 명의 환자 모두의 mRNA에서 추출된 mRNA에 대해 게놈 연구 센터(Centre for Genomic Research)에 의해 전사체학이 수행되었다. MSC가 각 계대 배양 종료 시에 수확되었을 때, 1x10⁶ 개의 세포가 단리되었고, RNAprotect Cell Reagent(Qiagen)에 재현탁되었다. 모든 공여자 및 시점으로부터 샘플의 완전한 세트가 수집될 때가지 세포를 -80℃에 보관하였다. 이어서 RNA가 제조사 지침에 따라 RNeasy Plus Mini 키트(Qiagen)를 사용하여 선택된 시점에 추출되었다. 추출물 내 RNA의 농도가 NanoDrop 2000 분광 광도계(Thermo)를 사용하여 결정되었다. 추출된 RNA가 분석 전 -80℃에 보관되었다.

리보솜 RNA의 고갈이 Ribo-Zero™ H/M/R 키트(Illumina)를 사용하여 수행되었고, 이어서 RNASeq 라이브러리가 NEB Next Ultra Directional RNA Library Prep 키트(Illumina)를 사용하여 제조되었다. RNASeq 라이브러리에 대한 쌍-말단 시퀀싱(paired-end sequencing)이 V4 화학을 이용하여 Illumina HiSeq4000 플랫폼에 의해 수행되었다.

단백질체학

단백질체학이 P1, P5, P10 및 P15에서 4 명의 환자 모두의 MSC로부터 제조된 분비체에 대해 수행되었다. MSC가 각 계대 배양 종료 시에 수확되었을 때, 1x10⁶ 개의 세포가 단리되었고, 4500 mg/L 포도당, 1% (v/v) Glutamax(Sigma), 1% (v/v) P/S(Sigma) 및 2 mM Glutamax-I로 보충된 4 mL의 무혈청, 페놀 레드-부재의 DMEM(Sigma) 중에서 37℃에서 24 시간 동안 재현탁되었다. 인큐베이션 종료 시에 회수된 조정 배지가 각 플라스크에서 수확되었고, 분석 전에 -80℃에 보관되었다.

분비체 샘플에 대한 단백질체 분석이 Liverpool 대학교의 "단백질체 연구 센터(Centre for Proteome Research)" 시설에서 수행되었다. 10㎕의 Strataclean 비드(Stratagene®, Hycor Biomedical Ltd., Edinburgh, UK)에 각 샘플의 연속적인 1 mL 분취량을 첨가함으로써 단백질 용액을 농축하였다. 각 분취량이 첨가된 후에, 샘플을 1 분 동안 와동시켰고, 2 분 동안 2,000 x g로 원심 분리하였으며, 단백질이 고갈된 상청액을 제거했다. 마지막 분취량이 첨가된 후에, 비드를 분해 전 1 mL의 25mM ambic으로 2x 세척했다. 비드 상 분해(on-bead digestion)를 위해, 비드를 80 ㎕의 25 mM ambic에 재현탁하였고, 5 ㎕의 25 mM ambic 중 1%(w/v) Rapigest(Waters Limited, Hertfordshire, UK)를 첨가하였다. 샘플을 10 분 동안 80℃에서 가열하였고, 이어서 5 ㎕의 DTT(dithiothreitol, 25mM ambic 중 9.2mg/mL)의 첨가 및 10 분 동안 60℃에서의 가열에 의해 환원시켰다. 냉각 후, 5 ㎕의 요오도아세트아미드(25mM ambic 중 33mg/mL)를 첨가하였고, 샘플을 30 분 동안 실온에서 어둠 속에 인큐베이션하였다. 돼지 트립신(시퀀싱 등급, Promega) (1㎍)을 첨가하고, 샘플을 로터리 믹서 상에서 밤새 37℃로 인큐베이션하였다. 분해물을 1 ㎕의 TFA(trifluoracetic acid)의 첨가로 산성화시켰고, 45 분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서 샘플을 30 분 동안 17,200 x g로 원심 분리하였고, 상청액을 0.5 mL 로우-바인딩 튜브로 옮겼다. 이를 추가 30 분 동안 원심 분리하였고, 10 ㎕를 LC-MS 분석을 위해 토탈 리커버리 바이알로 옮겼다.

데이터 의존적 LC-MSMS 분석이 Dionex Ultimate 3000 RSLC 나노-액체 크로마토그래피와 커플링된 QExactive HF quadrupole-Orbitrap 질량 분석계(Hemel Hempstead, UK) 상에서 수행되었다. 샘플 분해물(1-2㎕)이, 12㎕ min^-1의 유속으로 7 분 동안 0.1%(v/v) TFA, 2%(v/v) 수 중 아세토니트릴의 로딩 완충제를 사용하여 트래핑 컬럼(Acclaim PepMap 100 C18, 75㎛ x 2cm, 3㎛ 패킹 물질, 100Å) 상에 로딩되었다. 이어서 트래핑 컬럼이 분석 컬럼(EASY-Spray PepMap RSLC C18, 75㎛ x 50cm, 2㎛ 패킹 물질, 100Å)과 직렬로 설정되었고, 펩티드가 300nL min^-1의 유속으로 90 분에 걸쳐 96.2% A(0.1 %[v/v] 포름산): 3.8% B(수 중 0.1% [v/v] 포름산: 아세토니트릴 [80:20] [v/v])로부터 50% A:50% B로의 선형 구배를 이용하여 용출된 뒤, 5 분 동안 1% A : 99% B로 세척 및 초기 조건으로 컬럼이 재평형화되었다. 컬럼이 40℃로 유지되었고, 용출물이 양이온 모드로 작동하는 통합된 나노-전기분무 이온화 공급원 내로 직접 도입되었다. 질량 분석계는 m/z 200에서 60,000 (FWHM)의 질량 분해능으로 수득된 m/z 350-2000 사이의 측량 스캔으로 DDA 모드에서 작동되었다. 최대 주입 시간은 100ms이었고, 자동 수득 제어는 3e6으로 설정되었다. 2+ 내지 5+의 전하 상태를 갖는 가장 강렬한 전구 물질 이온 16 개가 2m/z 단위의 단리 창을 가진 MS/MS에 대해 선택되었다. 최대 주입 시간은 45ms이었고, 자동 수득 제어는 1e5로 설정되었다. 펩티드의 단편화는 30%의 정규화된 충돌 에너지를 사용하는 더 높은 에너지 충돌 해리에 의한 것이었다. 동일한 펩티드의 반복적인 단편화를 방지하기 위한 m/z 값의 동적 배제가 20s의 배제 시간으로 사용되었다. 질량 분석법의 미가공 데이터 파일을 정렬 및 피크 검출을 위해 Proteomics v.2.0 소프트웨어에 대한 Progenesis QI(Waters Ltd, Newcastle upon Tyne, UK) 내로 불러왔다. 누락된 값이 없도록 실험 내 모든 실행 유래 모든 피크를 함유한 집계 파일이 생성되었다. 데이터가 필터링되었고, +1 및 ≥+8 전하가 제거되었다. msms 단편화 데이터가 Mascot v. 2.4.1 소프트웨어를 사용하는 UniProt 인간 검토 DB(Matrix Science, London, UK)에 대해 검색되었다. 전구 물질 이온 질량 공차가 10ppm으로 설정되었고, 생성물 이온 공차는 0.01Da으로 설정되었다. 메티오닌의 산화가 동적 변형으로 선택되었고, 카르바미도메틸 시스테인이 고정 변형으로 선택되었다. 하나의 누락된 절단이 허용되었다. Mascot 검색은 2.17% FDR(상동성 이상의 psms)로 2,594 개의 단백질을 반환했다. 1% FDR이 설정되었고, 2,366 개의 단백질이 .xml 파일(FDR 유형: 별개의 psms)로 보냈졌으며, Progenesis 내로 도입되었고, 펩티드가 단백질로 배정되었다. 단백질 정량화는 각 계대에서 공여자 당 각 단백질에 대한 개별 존재도의 평균 및 4 계대 사이에서 차별적으로 발현된 단백질의 비교에 근거했다.

정량화 및 통계적 분석

생물정보학

데이터 가공, 통합 및 분석이 Liverpool 대학교의 전산 생물학 시설에 의해 수행되었다. RNAseq 데이터가 상기 기재된 바와 같이 수득되었다. 미가공 Fastq 파일이 Cutadapt 버전 1.2.1, 옵션 -O 3을 이용하여 Illumina 어댑터 서열의 존재에 대해 트리밍(trimming)되었다. 판독체들(reads)이 20의 최소 윈도우 품질 점수를 갖는 Sickle 버전 1.200을 이용하여 더 트리밍되었다. 트리밍 후 10 개의 염기쌍보다 더 짧은 판독체들이 제거되었다. 서열 품질 메트릭스가 FastQC 버전 0.11.4를 이용하여 평가되었다. 어떤 샘플도 제거되지 않았다. 서열 데이터가 권장 매개 변수를 갖는 Bowtie2 버전 1.1.2(Langdon, 2015)를 사용하는 NCBI의 인간 게놈 버전 GRCh38에 대해 정렬되었다. 유전자 수준 수치 데이터가 htseq-카운트 버전 0.9.0을 사용하여 Bowtie2 정렬로부터 생성되었다. R 라이브러리 DESeq2를 사용하여 rlog 변환된 카운트 데이터가 생성되었다. 이들을 필터링하여 1 미만의 평균 카운트를 갖는 유전자가 제거되었다. 통계적 분석이 R 버전 3.4.4로 수행되었고, 시각적 표현이 R 패키지 ggplot2를 이용하여 이루어졌다.

정규화된 단백질체학 및 전사체학 데이터가 통합되었고, 예비 탐색 분석으로 환자 간 관련 이질성(heterogeneity)이 밝혀졌다. 환자 이질성과 관련된 변화와 계대 배양과 관련된 변화를 구별하기 위해, 계대에 걸쳐 차별적으로 발현된 변수가 이원 분산 분석으로 계산되어 교란 변수(confounder)로서 환자 가변성을 설명하였다. 이는 Benjamin-Hochberg 방법을 이용한 다중 테스트 보정으로 이어졌다. 계대에 걸쳐 독특하게 유의미한 변수 338 개(이 중 38 개는 단백질이었고 300 개는 유전자이었음)가 Ingenuity Pathway Database(IPA, Qiagen, Analysis 2015)에서 추가 분석하기 위해 선택되었다.

338 개의 유의미한 변수들의 기본 로그 2 배수 변화가 계대 1과 관련하여 계산되었고, IPA(Qiagen)에 사용되었으며, 여기서 분석이 매뉴얼에 따라 수행되어 관찰된 변화와 관련된 가능한 상류 조절자, 영향을 받는 가능한 경로 및 유의미하게 강화된 다수의 기능 및 용어들을 예측했다(2018년 12월 9일에 데이터베이스 접속). IPA가 선택된 주요 프로세스, 즉 (A) 중간엽 줄기 세포에서 세포의 이동 (B) 중간엽 줄기 세포에서 세포의 움직임 및 (C) 상처 치유와 관련된 지식 용어를 다운로드하는 데 또한 사용되었다. 상기 모든 변수들이 우리의 실험 데이터에 맵핑되었다. 이어서 우리는 상기 용어 내 계대 배양에 걸쳐 변화하는 변수의 수를 평가했고, 생물학적 발견의 맥락과 관련지었다.

주요 성분 분석이 통계 소프트웨어 R 내 함수 prcomp를 사용하는 특이값 분해를 통해 평균 중심 및 스케일링된 데이터로 수행되었다.

통계학

분화 변수(TE, GAG, 및 골 형성 및 지방 형성 점수)가 R의 통계 패키지 내 함수 cor.test에 내포된 비모수 Spearman 상관 관계를 계산함으로써 계대에 걸쳐 비교되었다. 골 형성 및 지방 형성 능력이 이미지 분석에 근거한 반-정량적 데이터로 측정되었다. 상기가 계산을 수행하기 위해 정수 0 내지 1로 변환되었다.

[표 S1]

도 1 관련; 환자 세부 사항 및 MSC 배양. 골수가 외상성 손상 후 수술을 받는 4 명의 공여자 각각에서 수득되었다. 성장 정지가, 세포 수의 증가가 기록된 마지막 계대로서 기록되었다. PN242로부터의 세포가 P30에서 계속 증식하였고, 이 후 실험이 종료되었다.

[표 S2]

도 7 관련; 매트릭스 메탈로프로틴아제 패밀리 유전자 관련 전사체 데이터 로부터의 각 계대에서의 평균 유전자 발현 수준. ANOVA를 사용하여 P1에서 P15까지 유의미한 변이를 테스트했다. 유의미한 변화가 이탤릭체 문자로 강조되었다.

[표 S3]

도 7 관련; 인슐린 유사 성장 인자 패밀리 유전자 관련 전사체 데이터로부터의 각 계대에서의 평균 유전자 발현 수준. ANOVA를 사용하여 P1에서 P15까지 유의미한 변이를 테스트했다. 유의미한 변화가 이탤릭체 문자로 강조되었다.

[표 S4]

도 7 관련; 형질 전환 성장 인자 β 유전자 관련 전사체 데이터로부터의 각 계대에서의 평균 유전자 발현 수준. ANOVA를 사용하여 P1에서 P15까지 유의미한 변이를 테스트했다. 어떠한 유의미한 변화도 관찰되지 않았다.

[표 S5]

도 7 관련; 모든 계대에서 풍부하게 발현된 단백질에 대한 단백질체 데이터 로부터의 각 계대의 평균 단백질 발현 수준

Claims (29)

1. 약제로 사용하기 위한, 하기를 나타내는 MSC-유래 세포로 농축된, 세포 집단:
   ㆍ CD90⁺; CD105⁺; CD45^-
   ㆍ TIMP-1 분비⁺("많은 TIMP-1 분비") 및
   ㆍ MMP13 유전자 발현^-("낮은 MMP13 유전자 발현").
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 세포는 실질적으로 다분화능 잠재력(multipotent potential)을 갖지 않는 것인, 세포 집단.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 약제는 조직 회복(tissue repair)에 사용하기 위한 것인, 세포 집단.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 약제는 연골; 심혈관 조직; 및 골로 구성된 군에서 선택된 조직의 치료에 사용하기 위한 것인, 세포 집단.
5. 제 4 항에 있어서,
   상기 약제는 연골 및 골로 구성된 군에서 선택된 조직의 치료에 사용하기 위한 것인, 세포 집단.
6. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
   상기 약제는 골관절염; 심근 경색; 반월판 연골 손상(예컨대 파열된 반월판); 인대 손상(예컨대 파열된 인대); 피부 손상; 및 연조직 손상;으로 구성된 군에서 선택된 병태의 치료에 사용하기 위한 것인, 세포 집단.
7. 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 약제는 영양 회복(trophic repair)의 자극에 의한 조직 회복에 사용하기 위한 것인, 세포 집단.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 약제는 혈액학적 질환; 이식편 대 숙주 질환; 및 염증성 질환으로 구성된 군에서 선택된 질병의 치료에 사용하기 위한 것인, 세포 집단.
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 약제는 면역 반응의 면역 억제에 의한 질병의 치료에 사용하기 위한 것인, 세포 집단.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 집단은, CD90⁺; CD105⁺; CD45^-; TIMP-1 분비⁺; 및 MMP13 유전자 발현^-인 세포를 15% 이상 포함하는 것인, 세포 집단.
11. 하기를 포함하는, 약제로 사용하기 위한 세포의 제조 방법:
    ㆍ MSC를 배양하여 MSC-유래 세포를 생성하는 단계;
    ㆍ 상기 MSC-유래 세포를 하기를 나타내는 집단으로 농축하는 단계; 및
    ㆍ CD90⁺; CD105⁺; CD45^-
    ㆍ TIMP-1 분비⁺("많은 TIMP-1 분비") 및
    ㆍ MMP13 유전자 발현^-("낮은 MMP13 유전자 발현")
    ㆍ 약제로 사용하기 위해 상기 세포를 제형화하는 단계.
12. 제 11 항의 방법으로 제조된 약제로서,
    상기 약제는 조직 회복에 사용하기 위한 것인, 약제.
13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    상기 약제는 연골; 심혈관 조직; 및 골로 구성된 군에서 선택된 조직의 치료에 사용하기 위한 것인, 제 11 항의 방법으로 제조된 약제 또는 제 12 항의 약제.
14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제는 골관절염; 심근 경색; 반월판 연골 손상(예컨대 파열된 반월판); 인대 손상(예컨대 파열된 인대); 피부 손상; 및 연조직 손상;으로 구성된 군에서 선택된 병태의 치료에 사용하기 위한 것인, 제 11 항의 방법으로 제조된 약제 또는 제 12 항 또는 제 13 항의 약제.
15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제는 영양 회복의 자극에 의한 조직 회복에 사용하기 위한 것인, 약제.
16. 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제는 혈액학적 질환; 이식편 대 숙주 질환; 및 염증성 질환;으로 구성된 군에서 선택된 질병의 치료에 사용하기 위한 것인, 제 11 항의 방법으로 제조된 약제 또는 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 약제.
17. 제 16 항에 있어서,
    상기 약제는 면역 반응의 면역 억제에 의한 질병 치료에 사용하기 위한 것인, 약제.
18. 하기를 포함하는, 치료용 MSC-유래 세포를 선택하는 방법:
    ㆍ 세포에 의한 MMP13 유전자 발현 및 TIMP-1 단백질 분비 수준을 평가하는 단계; 및
    ㆍ 상기 세포가 낮은 수준의 MMP13 유전자 발현 및 높은 수준의 TIMP-1 단백질 분비를 나타내는 경우, 표현형 분화 능력이 필요하지 않은 치료적 응용 분야에 사용하기 위해 상기 세포를 선택하는 단계.
19. 제 18 항에 있어서,
    상기 세포가 MMP13 유전자 발현 및 TIMP-1 단백질 분비 둘 다에 대해 높은 수준을 나타내는 경우, 표현형 분화 능력이 필요한 치료적 응용 분야에 사용하기 위해 상기 세포를 선택하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
20. 제 19 항에 있어서,
    표현형 분화 능력이 필요한 상기 치료적 응용 분야는, 시험관 내 조직 공학(tissue engineering); 및 생체 내 분화에 의해 새로운 조직을 생성하는 이식;으로 구성된 군에서 선택되는 것인, 방법.
21. 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표현형 분화 능력이 필요하지 않은 상기 치료적 응용 분야는, 영양 활성을 통한 조직 회복의 촉진; 및 치료적 면역 억제의 촉진;으로 구성된 군에서 선택되는 것인, 방법.
22. 제 18 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 MSC의 계대 배양에 의한 MSC에서 유래된 것인, 방법.
23. 치료가 필요한 대상체에게 하기를 나타내는 세포의 치료적 유효량을 제공함을 포함하는, 치료 방법:
    ㆍ CD90⁺; CD105⁺; CD45^-
    ㆍ TIMP-1 단백질 분비⁺("많은 TIMP-1 분비") 및
    ㆍ MMP13 유전자 발현^-("낮은 MMP13 유전자 발현").
24. 제 23 항에 있어서,
    상기 방법은 조직 회복의 촉진을 위한 것인, 치료 방법.
25. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서,
    상기 방법은 치료적 면역 억제를 위한 것인, 치료 방법.
26. 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제공된 상기 세포에는, CD90⁺; CD105⁺; CD45^-이고; 많은 TIMP-1 분비 및 높은 MMP13 유전자 발현을 갖는 세포가 부재 또는 실질적으로 부재인, 치료 방법.
27. 하기를 나타내는 MSC-유래 세포로 농축된 세포 집단 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약학 조성물:
    ㆍ CD90⁺; CD105⁺; CD45^-
    ㆍ 많은 TIMP-1 분비 및
    ㆍ 낮은 MMP13 유전자 발현.
28. CD90⁺; CD105⁺; CD45^-이고; 많은 TIMP-1 분비 및 높은 MMP13 유전자 발현을 갖는 세포가 실질적으로 부재인, 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 세포 집단 또는 제 27 항의 약학 조성물.
29. 제 28 항에 있어서,
    CD90⁺; CD105⁺; CD45^-이고; 많은 TIMP-1 분비 및 높은 MMP13 유전자 발현을 갖는 세포가 부재인, 세포 집단 또는 약학 조성물.

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