KR20220092730A - Amd1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Amd1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20220092730A
KR20220092730A KR1020200183668A KR20200183668A KR20220092730A KR 20220092730 A KR20220092730 A KR 20220092730A KR 1020200183668 A KR1020200183668 A KR 1020200183668A KR 20200183668 A KR20200183668 A KR 20200183668A KR 20220092730 A KR20220092730 A KR 20220092730A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amd1
leukemia
gene
protein
expression
Prior art date
Application number
KR1020200183668A
Other languages
English (en)
Inventor
권혁영
이타 노비타 사리
윙귀 양
Original Assignee
순천향대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 순천향대학교 산학협력단 filed Critical 순천향대학교 산학협력단
Priority to KR1020200183668A priority Critical patent/KR20220092730A/ko
Publication of KR20220092730A publication Critical patent/KR20220092730A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/308—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on cancer prevention
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/30—Other Organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Abstract

본 발명은 AMD1의 발현 또는 활성 억제제의 용도, AMD1의 발현 수준을 측정함으로써 백혈병을 진단하거나 예후를 예측하기 위한 방법, 또는 AMD1의 발현 수준을 억제하는 물질을 백혈병 치료를 위한 약물로서 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명자들은 백혈병 환자로부터 유래된 세포 또는 백혈병 세포주에서 AMD1 유전자 및 단백질의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인하고, 상기 증가된 AMD1 유전자 및 단백질의 발현을 억제하거나 AMD1 유전자를 녹다운시킨 세포에서 콜로니 형성이 억제되고, 백혈병 줄기세포의 세포분화가 억제되며 이는 미토콘드리아의 막 전위를 붕괴시키고 산화스트레스 관련 유전자 및 단백질의 발현을 유도함으로써 나타남을 확인하였다. 따라서, 상기로부터 본 발명의 AMD1의 발현 또는 활성 억제제가 백혈병의 치료에 유용하게 사용될 수 있고, AMD1의 유전자 또는 단백질의 발현을 측정함으로써 백혈병 진단에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

Description

AMD1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OF LEUKEMIA COMPRISING EXPRESSION OR ACTIVITY INHIBITOR OF AMD1 AS AN ACTIVE INGREDIENT}
본 발명은 AMD1의 발현 또는 활성 억제제의 용도, AMD1의 발현 수준을 측정함으로써 백혈병을 진단하거나 예후를 예측하기 위한 방법, 또는 AMD1의 발현 수준을 억제하는 물질을 백혈병 치료를 위한 약물로서 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.
백혈병(leukemia)은 백혈구가 종양성으로 증식하는 질환을 총칭한다. 백혈병의 종류는 백혈병이 기원하는 백혈구에 따라 골수성 백혈병과 림프구성 백혈병으로 나눌 수 있고, 진행속도에 따라 급성 또는 만성으로 나뉜다. 백혈병의 임상학적 양상은 질환의 유형과 침범한 세포의 성질에 따라 다양하다. 림프구성 백혈병은 림프계 혈액세포, 골수성 백혈병은 골수계 혈액세포, 그리고 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia, CML)은 변이가 생긴 조혈모세포(pluripotent hematopoietic stem cell)의 악성 클론들에 의해 발생한다.
특히, 만성 골수성 백혈병은 조혈모세포가 골수 내에서 대량 증식하여 비정상적으로 증가한 각종 혈구 세포가 말초 혈액이나 기타 장기를 침습하는 악성 혈액 질환으로 성인에서 주로 발병하는 악성 혈액암이다. 만성 골수성 백혈병은 염색체 검사를 통해 필라델피아 염색체를 확인함으로써 주로 진단한다. 실제 만성 골수성 백혈병 환자의 95% 정도에서 9번 염색체와 22번 염색체 사이의 전좌가 발견되며 전기 전좌는 9번 염색체의 q34 위치에 존재하는 abl(abelson oncogene) 유전자 일부가 22번 염색체 q11.2 위치에 존재하는 ber(break point cluster region) 유전자로 전위되어 형성된다.
이와 관련하여, 대한민국 특허공개 제10-2020-0125061호는 Cobll1, PACSIN2, SH3BP1 바이오마커 각각 또는 이들의 상호작용을 통해 CML의 진행 단계를 진단하고, CML 환자가 기존 CML 치료제인 타이로신 키나아제 억제제에 내성을 나타내는지 여부를 진단하는 방법을 개시하고 있다.
만성 골수성 백혈병은 골수이식이라 불리는 조혈모 세포이식으로 주로 치료되고 있으며, 최근에는 각종 타이로신 카이네이즈 억제제(tyrosine kinase inhibitor, TK1)도 많이 이용되고 있다. 그러나, 일부 환자들은 처음부터 또는 치료과정 중에 이에 대한 저항성을 갖기도 한다.
대한민국 특허공개 제10-2020-0125061호
본 발명의 목적은 AMD1의 발현 또는 활성 억제제의 용도, AMD1의 발현 수준을 측정함으로써 백혈병을 진단하거나 예후를 예측하기 위한 방법, 또는 AMD1의 발현 수준을 억제하는 물질을 백혈병 치료를 위한 약물로서 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 AMD1(adenosyl methionine decarboxylase 1)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 예방, 치료 또는 전이억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 AMD1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 AMD1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 치료제 민감성 증진용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 AMD1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 치료제 민감성 증진용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 AMD1의 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함하는 백혈병 진단용 또는 예후예측용 조성물 또는 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 시료로부터 AMD1의 유전자 또는 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 단계; 및 상기 검출된 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 백혈병 진단의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 시료로부터 AMD1의 유전자 또는 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 단계; 및 상기 검출된 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 백혈병 전이의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 시료로부터 AMD1의 유전자 또는 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 단계; 및 상기 검출된 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 백혈병 예후예측의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 AMD1을 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 후보물질이 처리된 세포에서 AMD1의 유전자 발현 또는 단백질 활성 수준을 측정하는 단계; 및 AMD1의 유전자 발현 및 단백질 활성 수준을 무처리 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 백혈병 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 AMD1 단백질에 후보물질을 처리하는 단계; 후보물질이 처리된 AMD1 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계; 및 AMD1 단백질의 활성 수준을 무처리 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 백혈병 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명자들은 백혈병 환자로부터 유래된 세포 또는 백혈병 세포주에서 AMD1 유전자 및 단백질의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인하고, 상기 증가된 AMD1 유전자 및 단백질의 발현을 억제하거나 AMD1 유전자를 녹다운시킨 세포에서 콜로니 형성이 억제되고, 백혈병 줄기세포의 세포분화가 억제되며 이는 미토콘드리아의 막 전위를 붕괴시키고 산화스트레스 관련 유전자 및 단백질의 발현을 유도함으로써 나타남을 확인하였다. 따라서, 상기로부터 본 발명의 AMD1의 발현 또는 활성 억제제가 백혈병의 치료에 유용하게 사용될 수 있고, AMD1의 유전자 또는 단백질의 발현을 측정함으로써 백혈병 진단에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
도 1은 조혈모세포 계통 및 백혈병 세포에서 AMD1 유전자의 발현 수준을 RT-qPCR 방법으로 확인한 결과 그래프이다.
도 2는 전체 백혈병 세포(total bcCML)를 KLS 또는 분화된 세포로 나누어 AMD1의 발현 수준을 RT-qPCR 방법(A) 및 웨스턴 블랏 방법(B 및 C)으로 확인한 결과 도면이다.
도 3은 KLS 세포에 AMD1 유전자에 대한 shRNA를 형질도입한 후, AMD1 유전자 발현(A) 및 형성된 콜로니 갯수(B)를 확인한 결과 그래프이다.
도 4는 AMD1 유전자가 녹다운된 lin- 세포의 콜로니 형성을 확인한 결과 그래프이다.
도 5는 AMD1 유전자가 녹다운된 lin- 세포의 유세포분석(A) 및 세포 계통확인(B 및 C) 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 AMD1 유전자가 녹다운된 lin- 세포의 계대배양에 따른 콜로니 형성을 확인한 결과 그래프이다.
도 7은 AMD1 유전자의 이소발현에 의한 AMD1 유전자(A) 및 단백질(B)의 발현 변화를 확인한 결과 도면이다.
도 8은 AMD1 유전자의 이소발현에 의한 세포의 계대배양에 따른 콜로니 형성 변화를 확인한 결과 그래프이다.
도 9는 AMD1 유전자가 이소발현된 세포의 유세포분석(A) 및 세포 계통확인(B 및 C) 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 AMD1 유전자가 녹다운된 K562 세포주에서 AMD1 유전자의 발현(A), AMD1 단백질의 발현(B) 및 세포 증식 변화(C)를 확인한 결과 도면이다.
도 11은 AMD1 유전자의 이소발현에 의한 AMD1 유전자의 발현(A), AMD1 단백질의 발현(B) 및 세포 증식 변화(C)를 확인한 결과 도면이다.
도 12는 AMD1 유전자가 녹다운된 K562 세포주의 폴리아민 함량을 HPLC 방법으로 분석한 결과 그래프이다.
도 13은 AMD1 유전자가 녹다운된 K562 세포주의 폴리아민 함량을 HPLC 그래프에 기초하여 계산한 결과 그래프이다.
도 14는 AMD1 유전자가 녹다운된 lin- 세포의 폴리아민 함량(A) 및 AMD1 유전자의 이소발현에 의한 폴리아민 함량 변화(B)를 확인한 결과 그래프이다.
도 15는 KLS 및 분화된 세포에서 폴리아민의 함량 변화를 확인한 결과 그래프이다.
도 16은 인간 유래 CML 세포주에서 폴리아민의 처리에 따른 세포증식 변화를 확인한 결과 그래프이다.
도 17은 lin- 세포에서 폴리아민의 처리에 따른 콜로니 형성을 촬영한 결과 사진(A) 및 형성된 콜로니 수를 타나낸 결과 그래프(B)이다.
도 18은 폴리아민이 처리된 lin- 세포의 유세포분석(A) 및 세포 계통확인(B 및 C) 결과를 나타내는 도면이다.
도 19는 백혈병 동물모델을 제작하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 22는 첫번째 이식 마우스로부터 분리된 bcCML 세포의 유세포분석(A) 및 세포 계통확인(B 및 C) 결과를 나타내는 도면이다.
도 23은 백혈병 동물모델에서 분리된 세포에서 AMD1 유전자 녹다운에 의한 유전자 발현 변화를 KEGG 기전을 이용하여 확인한 결과 도면이다.
도 24는 백혈병 동물모델에서 분리된 세포에서 AMD1 유전자 녹다운에 의한 유전자 발현 변화를 종양학 분석을 이용하여 확인한 결과 도면이다.
도 25는 백혈병 동물모델에서 분리된 세포에서 AMD1 유전자 녹다운에 의한 백혈병 줄기세포(A) 및 조혈모 줄기세포(B) 표지 유전자 발현 변화를 GSEA를 이용하여 확인한 결과 도면이다.
도 26은 백혈병 동물모델에서 분리된 세포에서 AMD1 유전자 녹다운에 의한 산화 스트레스 반응 유전자의 발현변화(A) 및 ER 스트레스에 의해 유도되는 UPR(B)을 확인한 결과 도면이다.
도 27은 bcCML 세포에서 AMD1 녹다운에 의한 ATF3, ATF4 및 Chop의 유전자(A) 및 단백질(B) 발현 변화를 확인한 결과 도면이다.
도 28은 K562 세포주에서 AMD1 녹다운에 의한 ATF3, ATF4 및 Chop의 유전자(A) 및 단백질(B) 발현 변화를 확인한 결과 도면이다.
도 29는 K562 세포주에서 AMD1 녹다운에 의한 ATF3, ATF4 및 Chop 단백질의 발현의 증가가 AMD1 이소발현에 의해 억제되는 것을 확인한 결과 도면이다.
도 30은 AMD1 유전자가 녹다운된 bcCML 세포에서 ROS 수준을 과산화수소를 이용하여 확인한 FACS 결과(A) 및 ROS 함량(B)을 확인한 결과 도면이다.
도 31은 AMD1 유전자가 녹다운된 bcCML 세포에서 NAC 처리에 따른 ROS 수준을 확인한 FACS 결과(A) 및 ROS 함량(B)을 확인한 결과 도면이다.
도 32는 AMD1 유전자가 녹다운된 세포에서 폴리아민의 처리에 따른 ROS 수준을 확인한 FACS 결과(A) 및 ROS 함량(B)을 확인한 결과 도면이다.
도 33은 폴리아민의 자유라디칼 제거 효과를 확인한 결과 그래프이다.
도 34는 AMD1 유전자가 녹다운된 세포에서 폴리아민의 처리에 따른 미토콘드리아 막 전위를 확인한 FACS 결과(A) 및 막전위 손실율(B)을 확인한 결과 도면이다.
도 35는 AMD1 유전자가 녹다운된 bcCML 세포에 NAC를 처리하고 콜로니 형성을 확인한 결과 그래프이다.
도 36은 AMD1 유전자가 녹다운되고, NAC가 처리된 bcCML 세포의 유세포분석(A) 및 세포 계통확인(B 및 C) 결과를 나타내는 도면이다.
도 37은 AMD1 유전자가 녹다운된 bcCML 세포에서 AMD1 이소발현에 의한 ROS 수준을 확인한 FACS 결과(A) 및 ROS 함량(B)을 확인한 결과 도면이다.
도 38은 H2O2 처리된 bcCML 세포의 유세포분석(A 및 B) 및 세포 계통확인(C) 결과를 나타내는 도면이다.
도 39는 폴리아민이 처리된 K562(A) 및 bcCML(B) 세포에서 ROS 수준을 확인한 결과 그래프이다.
도 40은 폴리아민이 처리된 bcCML 세포의 세포분화를 유세포분석 방법으로 확인한 결과 도면이다.
도 41은 폴리아민이 처리된 bcCML 세포의 세포분화를 유세포분석 방법으로 확인한 결과 도면이다.
도 42는 폴리아민이 처리된 bcCML 세포의 세포 계통을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 43은 폴리아민이 처리된 K562 세포에서 산화스트레스 관련 유전자(A) 및 단백질(B)의 발현 변화를 확인한 결과 도면이다.
도 44는 폴리아민이 처리된 bcCML 세포에서 산화스트레스 관련 유전자(A) 및 단백질(B)의 발현 변화를 확인한 결과 도면이다.
도 45는 KSL 또는 분화된 세포에서 산화스트레스 관련 유전자의 발현(A), 산화스트레스 관련 유전자가 과발현된 KSL 세포에서 ATF3 유전자 발현(B) 및 ATF4 유전자 발현(C)을 확인하고, 상기 세포의 콜로니 형성(D)을 확인한 결과 그래프이다.
도 46은 산화스트레스 관련 유전자가 과발현된 KSL 세포의 유세포분석(A 및 C) 및 세포 계통확인(B 및 D) 결과를 나타내는 도면이다.
도 47은 산화스트레스 관련 유전자가 과발현된 KSL 세포의 세포사멸을 유세포분석 방법으로 확인하고(A), 세포사멸율(B)을 나타낸 결과 도면이다.
도 48은 AMD1 유전자와 함께 ATF3 또는 ATF4 유전자를 녹다운시킨 KSL 세포에서 AMD1(A), ATF3(B) 또는 ATF4(C) 유전자의 발현을 확인한 결과 그래프이다.
도 49는 AMD1 유전자와 함께 ATF3 또는 ATF4 유전자를 녹다운시킨 KSL 세포의 콜로니 형성을 확인한 결과 그래프이다.
도 50은 AMD1 유전자와 함께 ATF3 또는 ATF4 유전자를 녹다운시킨 KSL 세포의 유세포분석 결과를 확인한 결과 도면이다.
도 51은 AMD1 유전자와 함께 ATF3 또는 ATF4 유전자를 녹다운시킨 KSL 세포의 세포 계통확인 결과를 나타내는 그래프이다.
도 52는 골수성 백혈병 환자의 데이터베이스(A) 또는 환자 샘플(B)에서 AMD1 유전자의 발현을 확인한 결과 그래프이다.
도 53은 3명의 골수성 백혈병 환자의 샘플에서 질병의 진행에 따른 AMD1 유전자의 발현을 확인한 결과 그래프이다.
도 54는 환자유래 골수성 백혈병 세포에 존재하는 폴리아민의 함량을 확인한 결과 그래프이다.
도 55는 약물에 내성을 갖는 K562 세포에서 AMD1 유전자의 발현(A) 및 폴리아민의 함량(B)을 확인한 결과 그래프이다.
도 56은 약물에 내성을 갖는 K562 세포에서 AMD1 유전자를 녹다운시킨 후, 콜로니 형성을 확인한 결과 사진(B) 및 그래프(B)이다.
도 57은 AMD1 유전자가 녹다운된 K562-NR(A) 또는 K562-IR(B) 세포에서 약물에 대한 민감성 변화를 확인한 결과 도면이다.
도 58은 AMD1 유전자의 발현과 골수성 백혈병 환자의 생존율을 확인한 결과 그래프이다.
도 59는 AMD1 유전자가 녹다운된 환자유래 bcCML 세포의 콜로니 형성을 확인한 결과 사진(A) 및 그래프(B 및 C)이다.
도 60은 AMD1 억제제인 AO476 화합물의 처리에 의한 골수성 백혈병 세포의 증식 억제를 확인한 결과 그래프이다.
도 61은 AMD1 억제제인 AO476 화합물이 처리된 골수성 백혈병 세포에서 산화스트레스 관련 단백질의 발현 변화를 확인한 결과 도면이다.
도 62는 AMD1 억제제인 AO476 화합물이 처리된 골수성 백혈병 세포의 유세포분석(A) 및 세포 계통확인(B 및 C) 결과를 나타내는 도면이다.
도 63은 AMD1 억제제인 AO476 화합물의 처리에 의한 만성(A) 또는 급성(B) 골수성 백혈병 환자 유래 세포의 증식 억제를 확인한 결과 그래프이다.
도 64는 AMD1 억제제인 AO476 화합물이 처리된 만성 골수성 백혈병 환자유래 bcCML 세포의 콜로니 형성을 확인한 결과 사진(A) 및 그래프(B 및 C)이다.
도 65는 AMD1 억제제인 AO476 화합물이 처리된 급성 골수성 백혈병 환자유래 세포의 콜로니 형성을 확인한 결과 사진(A) 및 그래프(B)이다.
도 66은 AMD1 억제제인 AO476 화합물이 처리된 약물에 내성을 갖는 K562 세포의 콜로니 형성을 확인한 결과 사진(A) 및 그래프(B)이다.
도 67은 마우스 동물모델에 AO476 화합물을 처리하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 68은 AO476 화합물이 처리된 마우스 동물모델로부터 수득된 골수 세포의 유세포분석(A) 및 세포 계통확인(B) 결과를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 AMD1(adenosyl methionine decarboxylase 1)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 예방, 치료 또는 전이억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "AMD1(adenosyl methionine decarboxylase 1)"은 S-아데노실메티오닌(S-adenosyl methionine)을 S-아데노실메티오닌아민(S-adenosylmethioninamine)으로 전환시키는 효소로서, DNA, RNA 및 단백질 합성 등을 포함하여 많은 세포내 기전에 작용한다. 상기 AMD1은 통상의 기술분야에 알려진 모든 AMD1 단백질을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 AMD1 단백질은 서열번호 16 또는 17로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 AMD1 단백질은 그 활성을 유지하는 한 서열번호 16 또는 17로 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 몇 개의 염기가 첨가, 결실 또는 치환된 것일 수 있다. 또한, 상기 AMD1 단백질은 서열번호 16 또는 17로 기재된 아미노산 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상 상동성을 가질 수 있다.
상기 AMD1의 발현 억제제는 AMD1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA(short interfering RNA) 및 shRNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 안티센스 뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA는 표적 유전자의 서열이 공지되어 있는 한, 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 AMD1의 발현 억제제는 AMD1 유전자에 대한 shRNA일 수 있다. 상기 shRNA는 서열번호 3 내지 5 및 15로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.
상기 AMD1의 발현 억제제는 이의 당 부분, 뉴클레오베이스 부분 또는 인터뉴클레오티드 구조 내에 최소한 1개의 화학적 변형을 포함할 수 있다. 이와 같은 변형은 생체 내에서 뉴클라아제에 의한 AMD1의 발현 억제제의 분해를 억제할 수 있다. 이에, 본 발명은 AMD1 발현 억제제의 안정성과 생체 적합성을 향상시킬 수 있는 모든 화학적 변형을 포함할 수 있다.
또한, AMD1의 활성 억제제는 AMD1 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머, 항체 및 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 AMD1 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머, 항체 또는 화합물은 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있다.
일례로, 상기 앱타머는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 단일가닥 핵산으로, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라는 공지의 방법으로 제작될 수 있다. 한편, 상기 항체는 AMD1 단백질의 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것을 모두 사용할 수 있다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 AMD1의 활성 억제제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다:
[화학식 1]
Figure pat00001
.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 이의 약학적으로 허용가능한 염의 형태를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 아세트산, 시트르산, 말리산, 숙신산, 아스코르빈산, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산 등과 같은 약학적으로 허용가능한 비독성 유기 및 무기산과의 부가염, 이의 금속염(예를 들어, 나트륨염 또는 칼륨염), 암모늄염, 아민염, 아미노산염 등일 수 있다.
또한, 약학적으로 허용가능한 염 이외에도 이와 동일하거나 유사한 활성을 갖는 등가물(equibalent)을 사용할 수 있고, 사용가능한 등가물의 예로는, 용매화물, 수화물, 무수물, 거울상이성질체, 유도체, 다형제, 전구약물 등이 포함될 수 있다.
상기 백혈병은 골수성 백혈병 또는 림프구성 백혈병일 수 있고, 구체적으로, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병 또는 만성 림프구성 백혈병일 수 있다. 구체적으로, 상기 백혈병은 만성 골수성 백혈병일 수 있다. 상기 만성 골수성 백혈병은 질병의 진행 단계에 따라 만성기, 가속기 또는 급성기로 구분할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 백혈병은 급성기의 만성 골수성 백혈병일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 ATF4(activating transcription factor 4) 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 상기 ATF4 단백질은 서열번호 18 또는 19로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 ATF4 단백질은 그 활성을 유지하는 한 서열번호 18 또는 19로 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 몇 개의 염기가 첨가, 결실 또는 치환된 것일 수 있다. 또한, 상기 ATF4 단백질은 서열번호 18 또는 19로 기재된 아미노산 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상 상동성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 AMD1의 발현 또는 활성 억제제를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 1,000 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 500 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 또는 수회일 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
또한, 본 발명은 AMD1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 건강기능식품에 포함되는 AMD1의 발현 또는 활성 억제제는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 AMD1의 발현 억제제는 AMD1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 AMD1의 발현 억제제는 shRNA일 수 있고, 더욱 구체적으로, 상기 shRNA는 서열번호 3 내지 5 및 15로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.
한편, 상기 AMD1의 활성 억제제는 AMD1 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티트 미메틱스, 기질유사체, 앱타머, 항체 및 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 AMD1 활성 억제제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00002
.
또한, 상기 백혈병은 골수성 백혈병 또는 림프구성 백혈병일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 ATF4 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 AMD1의 발현 또는 활성 억제제는 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.
건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 AMD1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 치료제 민감성 증진용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 AMD1의 발현 또는 활성 억제제는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 AMD1의 발현 억제제는 AMD1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 AMD1의 발현 억제제는 shRNA일 수 있고, 더욱 구체적으로, 상기 shRNA는 서열번호 3 내지 5 및 15로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.
한편, 상기 AMD1의 활성 억제제는 AMD1 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티트 미메틱스, 기질유사체, 앱타머, 항체 및 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 AMD1 활성 억제제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00003
.
또한, 상기 백혈병은 골수성 백혈병 또는 림프구성 백혈병일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 ATF4 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
상기 백혈병 치료제는 통상의 기술분야에 내성을 유발할 수 있다고 알려진 모든 백혈병 치료제를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 백혈병 치료제는 이마티닙(imatinib), 닐로티닙(nilotinib), 다사티닙(dasatinib), 보수티닙(bosutinib) 및 포나티닙(ponatinib)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 백혈병 치료제는 이마티닙 및 닐로티닙으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 AMD1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 치료제 민감성 증진용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 건강기능식품에 포함되는 AMD1의 발현 또는 활성 억제제는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 AMD1의 발현 억제제는 AMD1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 AMD1의 발현 억제제는 shRNA일 수 있고, 더욱 구체적으로, 상기 shRNA는 서열번호 3 내지 5 및 15로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.
한편, 상기 AMD1의 활성 억제제는 AMD1 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티트 미메틱스, 기질유사체, 앱타머, 항체 및 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 AMD1 활성 억제제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00004
.
또한, 상기 백혈병은 골수성 백혈병 또는 림프구성 백혈병일 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품은 ATF4 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
상기 백혈병 치료제는 통상의 기술분야에 내성을 유발할 수 있다고 알려진 모든 백혈병 치료제를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 백혈병 치료제는 이마티닙, 닐로티닙, 다사티닙, 보수티닙 및 포나티닙으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 건강기능식품은 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 AMD1의 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함하는 백혈병 진단용 또는 예후예측용 조성물 또는 키트를 제공한다.
상기 AMD1의 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 검출시약은 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 물질을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 AMD1 유전자에 특이적으로 결합하는 검출시약은 AMD1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 안티센스 뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA는 표적 유전자의 서열이 공지되어 있는 한, 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 AMD1 유전자에 특이적으로 결합하는 검출시약은 AMD1 유전자에 대한 shRNA일 수 있다. 상기 shRNA는 서열번호 3 내지 5 및 15로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.
한편, AMD1의 단백질에 특이적으로 결합하는 검출시약은 AMD1 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머, 항체 및 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 AMD1 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머, 항체 또는 화합물은 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있다.
일례로, 상기 앱타머는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 단일가닥 핵산으로, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라는 공지의 방법으로 제작될 수 있다. 한편, 상기 항체는 AMD1 단백질의 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것을 모두 사용할 수 있다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 백혈병의 진단, 전이 또는 예후예측용 조성물에 포함되는 AMD1의 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 검출시약은 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.
또한, 상기 AMD1의 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 검출시약은 이에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다. 본 발명의 검출용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 검출용 조성물을 포함하는 키트는 이에 포함되는 AMD1의 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 검출시약의 세척이나 복합체의 분리 등과 같은 이후 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다. 이때, 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 시료로부터 AMD1의 유전자 또는 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 단계; 및 상기 검출된 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 백혈병 진단의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 백혈병의 진단의 정보를 제공하기 위한 방법에 사용되는 AMD1의 유전자 또는 단백질의 검출은 AMD1의 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 검출시약을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 검출시약은 통상의 기술분야에 AMD1의 유전자 또는 단백질의 검출에 사용할 수 있다고 알려진 모든 물질을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 AMD1 유전자에 특이적으로 결합하는 검출시약은 AMD1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 안티센스 뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA는 표적 유전자의 서열이 공지되어 있는 한, 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 AMD1 유전자에 특이적으로 결합하는 검출시약은 AMD1 유전자에 대한 shRNA일 수 있다. 상기 shRNA는 서열번호 3 내지 5 및 15로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.
한편, AMD1의 단백질에 특이적으로 결합하는 검출시약은 AMD1 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머, 항체 및 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 AMD1 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머, 항체 또는 화합물은 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 유전자 또는 단백질의 발현 수준은 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 측정될 수 있다. 구체적으로, 상기 유전자 또는 단백질의 발현 수준은 면역형광법, 질량분석법, 단백질 칩, 웨스턴 블랏, ELISA, RT-PCR 및 실시간 PCR로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있다.
상기 시료는 백혈병을 진단하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 시료는 포유동물 유래 시료일 수 있고, 구체적으로 우제류 동물 유래 시료일 수 있다. 또한, 상기 시료는 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포 및 조직으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 또한, 상기 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은, 대조군에서 측정된 AMD1의 유전자 또는 단백질의 발현 수준에 비해 시료에서 측정된 AMD1의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 증가하면 백혈병으로 진단할 수 있다.
또한, 본 발명은 시료로부터 AMD1의 유전자 또는 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 단계; 및 상기 검출된 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 백혈병 전이의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 백혈병 전이의 정보를 제공하기 위한 방법에 사용되는 AMD1의 유전자 또는 단백질의 검출은 AMD1의 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 검출시약을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 AMD1의 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 검출시약은 상기 서술한 바와 같은 기술적 특징을 가질 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 방법에서, 유전자 또는 단백질의 발현 수준은 상기 서술한 바와 같은 방법으로 측정될 수 있다. 상기 시료는 백혈병의 전이를 확인하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 시료는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있고, 상기 시료는 본 발명에 따른 방법에 사용되기 전에 상술한 바와 같은 방법으로 전처리될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은, 대조군에서 측정된 AMD1의 유전자 또는 단백질의 발현 수준에 비해 시료에서 측정된 AMD1의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 증가하면 백혈병의 전이를 예상할 수 있다.
또한, 본 발명은 시료로부터 AMD1의 유전자 또는 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 단계; 및 상기 검출된 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 백혈병 예후예측의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 백혈병 예후예측의 정보를 제공하기 위한 방법에 사용되는 AMD1의 유전자 또는 단백질의 검출은 AMD1의 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 검출시약을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 AMD1의 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 검출시약은 상기 서술한 바와 같은 기술적 특징을 가질 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 방법에서, 유전자 또는 단백질의 발현 수준은 상기 서술한 바와 같은 방법으로 측정될 수 있다. 상기 시료는 백혈병의 예후예측을 확인하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 시료는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있고, 상기 시료는 본 발명에 따른 방법에 사용되기 전에 상술한 바와 같은 방법으로 전처리될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은, 대조군에서 측정된 AMD1의 유전자 또는 단백질의 발현 수준에 비해 시료에서 측정된 AMD1의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 증가하면 백혈병의 예후가 좋지 않은 것으로 예상할 수 있다.
또한, 본 발명은 AMD1을 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 후보물질이 처리된 세포에서 AMD1의 유전자 발현 또는 단백질 활성 수준을 측정하는 단계; 및 AMD1의 유전자 발현 및 단백질 활성 수준을 무처리 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 백혈병 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 백혈병 치료제 스크리닝 방법에서, 상기 AMD1 단백질은 통상의 기술분야에 알려진 모든 AMD1 단백질을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 AMD1 단백질은 서열번호 16 또는 17로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 AMD1 단백질은 그 활성을 유지하는 한 서열번호 16 또는 17로 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 몇 개의 염기가 첨가, 결실 또는 치환된 것일 수 있다. 또한, 상기 AMD1 단백질은 서열번호 16 또는 17로 기재된 아미노산 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상 상동성을 가질 수 있다.
상기 AMD1의 유전자 발현 또는 단백질 활성 수준은 직접적으로 ADM1 유전자 또는 단백질의 수준을 측정하는 것과, AMD1의 유전자 또는 단백질과 관련된 신호 경로에 속하는 인자의 유전자 발현 또는 단백질 활성을 측정하여 간접적으로 측정하는 것을 모두 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 방법은 ATF4의 유전자 발현 또는 단백질 활성 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 ATF4 단백질은 서열번호 18 또는 19로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 ATF4 단백질은 그 활성을 유지하는 한 서열번호 18 또는 19로 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 몇 개의 염기가 첨가, 결실 또는 치환된 것일 수 있다. 또한, 상기 ATF4 단백질은 서열번호 18 또는 19로 기재된 아미노산 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상 상동성을 가질 수 있다.
상기 AMD1의 유전자 발현 또는 단백질 활성은 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법에 따라 측정될 수 있다. 구체적으로, 상기 ADM1의 유전자 발현은 혼성화 방법, 증폭 기반의 검출방법 등을 사용하여 측정될 수 있다. 일례로, 상기 혼성화 방법은 노던 블랏 분석(northern hybridization) 등을 포함할 수 있고, 상기 증폭 기반의 검출방법은 RT-PCR, 실시간 PCR 등을 포함할 수 있다. 한편, 상기 ADM1의 단백질 발현은 면역침전, 웬스턴 블롯, 면역조질화학 분석 등의 방법으로 측정될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 무처리 대조군에서 측정된 AMD1의 유전자 또는 단백질의 발현 수준에 비해 후보물질 처리군에서 측정된 AMD1의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 억제되면, 상기 후보물질을 백혈병 치료제로서 스크리닝할 수 있다.
나아가, 본 발명은 AMD1 단백질에 후보물질을 처리하는 단계; 후보물질이 처리된 AMD1 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계; 및 AMD1 단백질의 활성 수준을 무처리 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 백혈병 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 백혈병 치료제 스크리닝 방법은 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 AMD1 단백질은 통상의 기술분야에 알려진 모든 AMD1 단백질을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 AMD1 단백질은 서열번호 16 또는 17로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 ATF4의 유전자 발현 또는 단백질 활성 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 ATF4 단백질은 서열번호 18 또는 19로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 AMD1의 유전자 발현 또는 단백질 활성을 상기 서술한 바와 같은 방법으로 측정될 수 있다. 본 발명의 방법에서, 무처리 대조군에서 측정된 AMD1 단백질의 발현 수준에 비해 후보물질 처리군에서 측정된 AMD1 단백질의 발현 수준이 억제되면, 상기 후보물질을 백혈병 치료제로서 스크리닝할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예 1. 조혈모세포 계통 및 백혈병 세포에서 AMD1(adenosyl methionine decarboxylase) 발현 확인
AMD1이 골수성 백혈병의 진행에 필수적임을 확인하기 위해, 조혈모세포 계통 및 백혈병 세포에서 AMD1 유전자의 발현을 다음과 같이 확인하였다.
먼저, 조혈모세계 계통 및 백혈병 세포를 통상적인 방법으로 배양하여 준비하였다. 이후, 준비된 세포로부터 하이브리드 R(Hybrid R, Gene All, 한국)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 리버트라 에이스® qPCR 키트(ReverTra Ace® qPCR Kit, Toyobo, 일본)를 사용하여 cDNA로 제작하고, 이를 주형으로 사용하여 AMD1 유전자의 발현을 확인하였다. PCR은 qPCR 마스터 믹스 키트(qPCR Master Mix Kit, Toyobo, 일본), 정방향 프라이머(서열번호 1: 5'-TGAGCTTGACCCAGCAGTTA-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 2: 5'-GTGGCATCAATGACAGAACC-3')를 사용하여 통상적인 방법으로 수행하였다. 이때, 대조군으로서 B2M(beta-2 microlobulin) 유전자(정방향 프라이머, 서열번호 20: 5'-TGAAGCTGACAGCATTCGG-3'; 역방향 프라이머, 서열번호 21: 5'-CTGCTGGATGACGTGAGTAAA-3')의 발현을 측정하여 AMD1의 발현 수준을 표준화시킨 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 조혈모세포 계통의 세포들 중, KLS(hematopoietic stem/progenitor) 세포에서 AMD1 유전자의 발현이 가장 높았으며, B-220 양성 세포에서 그 다음으로 발현이 높았다. 또한, 정상 조혈모세포와 비교하여 전체 백혈병 세포(total bcCML)의 AMD1 유전자 발현 수준이 높았다.
실시예 2. KLS 또는 분화된 세포에서 AMD1 발현 확인
전체 백혈병 세포를 KLS 또는 분화된 세포로 나누어 AMD1의 발현에 차이가 있는지 확인하였다. 먼저, 전체 백혈병 세포를 lin+ 또는 lin- 세포로 통상적인 방법으로 분리한 후, 하기와 같이 AMD1 유전자 및 단백질의 발현 수준을 확인하였다.
2-1. AMD1 유전자 발현 수준 확인
구체적으로, lin+ 또는 lin- 세포로부터 RNA를 추출한 것을 제외하고 상기 실시예 1에 기재된 조건 및 방법으로 AMD1 유전자 발현 수준을 확인하고, 그 결과를 도 1A에 나타내었다.
도 1A에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자는 분화된 세포와 비교하여 KLS 세포에서 2 내지 3배 발현 수준이 높았다.
2-2. AMD1 단백질 발현 수준 확인
구체적으로, lin+ 또는 lin- 세포에 통상적인 세포 용해 완충액을 첨가하고 30분 동안 얼음에 방치한 뒤, 이를 13,000 rpm 및 4℃의 조건에서 5분 동안 원심분리하여 세포 용해물인 상층액을 수득하였다. 수득된 세포 용해물의 단백질 농도를 바이오래드 단백질 어세이(Bio-Rad Protein Assay, Bio-Rad Laboratories, Inc., 미국)를 이용하여 결정하였다. 30 ㎍의 단백질을 10% 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동한 후, 0.45 ㎛의 HATF(hybridization nitrocellulose filter) 막(Millipore, 미국)으로 옮겼다. 상기 막을 5% 스킴밀크(skim milk)로 전처리하고, AMD1 단백질에 대한 1차 항체(#PA5-441720, Invitrogen, 미국)를 처리하여 4℃에서 하룻밤동안 반응시켰다. 여기에 1:2,000의 비율로 희석된 HRP-결합된 2차 항체를 처리하고 1시간 동안 실온에서 반응시킨 뒤, 단백질 신호를 ECL(enhanced chemiluminescence, Thermo Fisher Scientific, 미국)을 사용하여 확인하였다. 단백질 신호를 확인하고 그 결과를 촬영한 사진을 도 2B에, 단백질 신호의 세기를 아머샴 이미저 600(Amersham Imager 600, GE Healthcare Life Sciences, 미국)으로 확인한 결과 그래프를 도 2C에 나타내었다.
도 2B 및 2C에 나타난 바와 같이, AMD1 단백질은 분화된 세포와 비교하여 KLS 세포에서 2 내지 3배 발현 수준이 높았다.
따라서, 상기 결과로부터 AMD1이 백혈병 줄기세포의 유지에 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.
실시예 3. KLS 세포에서 AMD1 유전자 녹다운(knock-down)에 의한 콜로니 형성 변화 확인
정상 조혈모세포에서 AMD1의 기능적 중요성을 확인하기 위해 KLS 세포에서 AMD1 유전자를 녹다운시킨 뒤, 콜로니 형성을 확인하였다.
먼저, AMD1 유전자에 대한 2 종류의 shRNA인 1-shAmd1(서열번호 3: 5'-TTGGTGGGACTTAAACAGAAA-3') 및 2-shAmd2(서열번호 4: 5'-CACAATGTAAGCTTCAATAAA-3'), 대조군으로서 LacZ 유전자에 대한 shRNA인 shLacZ를 통상적인 방법으로 제조하였다. 제조된 shRNA를 pLV-RNAi 렌티바이러스 벡터(Biosettia Inc., 미국)에 제조사의 프로토콜에 따라 클로닝하고 KLS 세포에 형질도입시켰다. 렌티바이러스가 형질도입된 KLS 세포는 메틸셀룰로오스 배지(methylcellulose medium, StemCell Technologies, 미국)를 이용하여 5% CO2 조건하에서 14일동안 배양하였다. 14일 후, 생성된 콜로니 갯수를 확인하여 도 3B에 나타내었다. 한편, shRNA가 형질도입된 KLS 세포에서 AMD1 유전자의 발현을 실시예 1에 기재된 바와 같은 방법으로 확인하여 도 3A에 나타내었다.
도 3A에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자에 대한 shRNA가 형질도입된 KLS 세포에서 AMD1 유전자의 발현이 억제되었다. 그러나, AMD1 유전자의 발현이 억제되어도 KLS 세포의 콜로니 형성은 약 17 내지 22% 정도로 약간 감소하였다.
실시예 4. KLS 세포에서 AMD1의 기능상실에 의한 변화 확인
전체 백혈병 세포 중, BCR-ABL/NUP98-HOX A9 유도된 급성기의 CML(blast crisis CML, bcCML) 세포인 lin- 세포를 대상으로 AMD1 유전자를 녹다운시켜 AMD1 유전자의 기능상실에 의한 변화를 확인하였다.
4-1 콜로닝 형성 확인
구체적으로, 실험은 lin- 세포를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 수행하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자가 녹다운된 lin- 세포에서는 대조군과 비교하여 생성된 콜로니 갯수가 약 2배 정도 적었다.
4-2. 세포분화 확인
AMD1 유전자가 녹다운된 lin- 세포의 세포분화를 유세포분석 방법을 이용하여 확인하였다. 실험은 FACS Canto 또는 FACS Aria III(BD Biosciences, 미국)을 사용하여 통상적인 방법으로 수행한 후, 결과 데이터를 플로우조 소프트웨어(FlowJo software, Tree Star Inc., 미국)로 분석하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자가 녹다운된 lin- 세포는 대조군과 비교하여 세포분화가 더 많이 발생하였다.
4-3. 세포계대에 의한 콜로니 형성 변화 확인
AMD1 유전자가 녹다운된 lin- 세포를 계대분양하면서 콜로니 형성을 확인하였다. 실험은 실시예 4-1과 동일하게 수행하되, 세포를 1 내지 3회 계대배양하면서 콜로니 형성을 확인하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 계대배양 횟수가 증가하면서 형성되는 콜로니 수가 유의적으로 감소하였다.
실시예 5. KLS 세포에서 AMD1 유전자의 이소발현에 의한 변화 확인
5-1. shRNA의 형질도입
AMD1 유전자에 대한 shRNA의 표적 외 효과를 배제하기 위하여, 3'-말단의 비번역부위(untranslated region)을 표적으로 하는 1-shAmd1에 면역화되도록 AMD1 유전자를 이소적으로(ectopically) 발현시켰다. 구체적으로, 1-shAmd1 shRNA를 lin- 세포에 형질도입하면서 동시에 AMD1 유전자를 과발현시켰다. 이때, 대조군으로서 shLacZ를 사용하였다. shRNA의 형질도입에 의한 세포 내에서 AMD1 유전자의 발현 변화를 상기 실시예 1에 기재된 바와 같은 방법으로 확인하고 그 결과를 도 7A에 나타내었다. 또한, AMD1 단백질의 발현 변화를 실시예 2-2에 기재된 바와 같은 방법으로 확인하고, 그 결과를 도 7B에 나타내었다.
도 7A 및 7B에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자에 대한 shRNA에 의해 억제된 AMD1 유전자 및 단백질의 발현이 이소적으로 도입된 AMD1 유전자에 의해 회복되었다.
5-2. 세포계대에 의한 콜로니 형성 변화 확인
실시예 5-1에서 AMD1 유전자가 이소발현된 세포를 계대분양하면서 콜로니 형성을 확인하였다. 실험은 실시예 4-3과 동일하게 수행되었으며 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자에 대한 shRNA에 의해 억제된 콜로니 형성이 이소적으로 도입된 AMD1 유전자에 의해 회복되었다.
5-3. 세포분화 확인
실시예 5-1에서 AMD1 유전자가 이소발현된 세포의 세포분화를 유세포분석 방법을 이용하여 확인하였다. 실험은 실시예 4-2와 동일한 방법으로 수행되었으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자에 대한 shRNA에 의한 세포분화가 이소적으로 도입된 AMD1 유전자에 의해 억제되었다.
따라서, 상기 결과로부터 AMD1 유전자에 대한 shRNA에 의한 변화가 AMD1 유전자의 결핍에 의한 것임을 확인하였다.
실시예 6. 인간 유래 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia, CML) 세포주에서 AMD1 유전자 녹다운에 의한 변화 확인
만성 골수성 백혈병 환자로부터 유래된 세포주인 K562 세포주를 이용하여 AMD1 유전자에 대한 shRNA를 형질주입하고 그에 따른 변화를 확인하였다.
구체적으로, K562 세포주(KCLB, 한국)에 1-shAmd1 shRNA를 형질도입하고, AMD1 유전자 및 단백질의 발현을 상기 서술한 바와 같은 방법으로 확인하고, 그 결과를 도 10A 및 10B에 나타내었다. 한편, AMD1의 녹다운에 의한 세포증식 변화를 MTT 분석 방법으로 확인하였다. MTT 분석은 세포증식 키트 I(Cell Proliferation Kit I, Roche, 네덜란드)을 사용하여 수행되었다. 먼저, 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 5×103개가 되도록 분주하고 96시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포에 10 ㎕의 MTT 용액을 첨가하고 4시간 동안 반응시키고, 100 ㎕의 가용화 용액(solubilization solution)을 첨가하고 하룻밤 동안 배양하였다. 배양 후, 575 ㎚의 파장에서 마이크로플레이트 리더(microplate leader)로 흡광도를 측정한 결과를 도 10C에 나타내었다.
그 결과, 도 10A 및 10B에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자를 녹다운시킨 K562 세포주에서 AMD1 유전자 및 단백질의 발현이 억제되었다. 또한, 도 10C에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자의 녹다운에 의해 세포의 증식이 억제되었다.
실시예 7. 인간 유래 CML 세포주에서 AMD1 유전자의 이소발현에 의한 변화 확인
인간 유래 CML 세포주인 K562 세포에서 AMD1 유전자에 녹다운에 의한 변화가 AMD1 유전자의 이소발현에 의해 회복되는지 확인하였다. 실험은 shRNA를 형질도입하면서 AMD1 유전자를 이소발현시킨 것을 제외하고는 실시예 6과 동일한 방법으로 수행되었다. 그 결과, AMD1 유전자의 발현 변화를 도 11A에, AMD1 단백질의 발현 변화를 도 11B에, AMD1 유전자의 이소발현에 의한 세포 증식 변화를 도 11C에 나타내었다.
도 11A 및 11B에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자가 녹아웃에 의해 억제된 AMD1 유전자 및 단백질의 발현이 AMD1 유전자의 이소발현에 의해 회복되었다. 또한, 도 11C에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자의 녹다운에 의해 억제된 K562 세포주의 증식이 회복되었다.
실시예 8. 인간 유래 CML 세포주에서 AMD1 유전자 녹다운에 의한 폴리아민 함량 변화 확인
인간 유래 CML 세포주인 K562 세포주에 AMD1 유전자에 대한 shRNA인 3-shAmd1(서열번호 5: 5'-GGACCAGTTCTACATGAAAGA-3')을 상기 서술한 바와 같이 형질도입시키고, HPLC(high-performance liquid chromatography)를 수행하여 폴리아민의 함량을 확인하였다. 이때, 대조군으로 shLacZ를 사용하였다.
구체적으로, 3-shAmd1이 형질도입된 K562 세포주를 1.5 ㎖ 튜브에 모아 1×106개가 되도록 하였다. 세포를 원심분리하여 상층액을 제거하고 수득한 펠렛에 0.14 M의 NaCl을 첨가하여 세포를 세척하고, 이를 2,400 g 및 4℃의 조건으로 20분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 세척 과정을 3회 반복하고, 수득된 세포 펠렛에 100 ㎕의 증류수를 첨가하고 4℃에서 30분 동안 방치하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 11,200 g 및 4℃의 조건으로 20분 동안 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 20 ㎕의 상층액에 80 ㎕의 FMOC 용액 및 60 ㎕의 0.1 M 보레이트 완충액(borate buffer)를 첨가하고, 이를 상온에서 45초 동안 반응시켰다. 반응 후, 100 ㎕의 40 mM 글리신(glycine)을 첨가하고 잘 섞은 뒤, 수득된 혼합물을 ODS2 또는 C8 컬럼을 사용하여 HPLC 분석을 수행하였다(여기(excitation) 264 ㎚, 방출(emission) 310 ㎚). 그 결과, HPLC 분석 그래프를 도 12에, 상기 그래프로부터 계산된 폴리아민의 함량을 도 13에 나타내었다.
그 결과, 도 12 및 13에 나타난 바와 같이, AMD1의 녹다운에 의해 K562 세포주에 존재하는 폴리아민, 예를 들어, 스페르미딘(spermidine) 및 스페르민(spermine)의 함량이 유의적으로 감소하였다.
실시예 9. KLS 세포에서 AMD1 유전자 녹다운에 의한 폴리아민 함량 변화 확인
KLS 세포 중, lin- 세포에서 AMD1 유전자를 녹다운 시킨경우, 폴리아민의 함량을 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 실험은 AMD1 유전자가 녹다운된 lin- 세포에 1-shAmd1 shRNA를 형질도입한 것을 제외하고는, 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 수행되었다. 또한, 1-shAmd1 shRNA를 형질도입하면서 AMD1 유전자를 이소발현시킨 세포에서의 폴리아민 함량 또한 동일한 방법으로 확인하였다.
그 결과, 도 14A에 나타난 바와 같이, 1-shAmd1이 형질도입된 K562 세포주에서는 스페르미딘 및 스페르민의 함량이 유의적으로 감소하였으나, 도 14B에 나타난 바와 같이, 이와 같은 감소는 AMD1 유전자의 이소발현에 의해 회복되었다.
따라서, 상기 결과로부터 AMD1이 체내에서 폴리아민의 생합성 과정에 필요함을 알 수 있었다.
실시예 10. KLS 및 분화된 세포에서 폴리아민 함량 변화 확인
전체 백혈병 세포를 KLS 또는 분화된 세포로 나누어 AMD1 녹다운에 의한 폴리아민의 함량 변화를 다음과 같이 확인하였다.
실험은 전체 백혈병 세포 중에서 lin- 세포를 분리하여 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 수행하고, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타난 바와 같이, lin+ 세포와 비교하여 lin- 세포에서 폴리아민의 함량이 높았다.
실시예 11. 인간 유래 CML 세포주에서 폴리아민의 처리에 따른 세포증식 변화 확인
인간 유래 CML 세포주인 K562 세포주에서 1-shAmd1 shRNA 형질도입에 의한 세포증식 억제가 폴리아민의 처리에 의해 회복되는지를 MTT 분석방법으로 확인하였다.
구체적으로, K562 세포주에 1-shAmd1 shRNA를 상기 서술한 바와 같이 형질도입하고, 동시에 10 μM의 스페르미딘 및 1 mM의 아미노구아니딘(aminoguanidine)을 처리하고 96시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 실시예 6에 기재된 바와 같은 방법으로 MTT 분석을 수행하고, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타난 바와 같이, AMD1의 녹다운에 의한 세포의 증식 억제가 폴리아민의 처리에 의해 회복되었다.
실시예 12. KLS 세포에서 폴리아민의 처리에 따른 세포 변화 확인
KLS 세포 중, lin- 세포에서 3-shAmd1 shRNA 형질도입에 의한 세포 변화가 폴리아민의 처리에 의해 회복되는지를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
12-1. 콜로니 형성 확인
구체적으로, lin- 세포에 3-shAmd1 shRNA를 상기 서술한 바와 같이 형질도입하고, 동시에 10 μM의 스페르미딘 및 1 mM의 아모니구아니딘(amoniguanidine)을 처리하고 96시간 동안 배양하였다. 배양 후, 메틸셀룰로오스 배지를 이용하여 5% CO2 조건하에서 7동안 배양하고, 콜로니 형성을 확인하였다. 그 결과, 형성된 콜로니를 촬영한 사진을 도 17A에 그 수를 확인한 결과를 도 17B에 나타내었다.
도 17A 및 17B에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자의 녹다운에 의한 콜로니 형성 억제가 폴리아민의 처리에 의해 회복되었다.
12-2. 세포분화 확인
실시예 12-1에서 AMD1 유전자가 녹다운되고, 동시에 폴리아민이 처리된 lin- 세포의 세포분화를 유세포분석 방법을 이용하여 확인하였다. 실험은 실시예 4-2와 동일한 방법으로 수행되었으며, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자의 녹다운에 의한 세포분화가 폴리아민의 처리에 의해 억제되었다.
따라서, 상기로부터 AMD1 유전자 및 폴리아민이 골수성 백혈병 세포의 증식 및 유지에 필수적임을 알 수 있었다.
실시예 13. 백혈병 동물모델에서 AMD1 유전자 녹다운에 의한 백혈병 진행상태 확인
13-1. 백혈병 동물모델의 제작
상기에서 확인한 AMD1의 영향이 생체 내에서도 동일한지 확인하기 위해 백혈병 동물모델을 다음과 같은 방법으로 제작하였다(도 19).
먼저, C57BL6/J 마우스로부터 골수 KLS 세포를 분리하여 통상적인 방법을 하룻밤 동안 배양하였다. 배양된 KLS 세포에 MSCV-BCR/ABL-IRES-YFP 및 MSCV-NUP98/HOXA9-NGFR 컨스트럭트(construct)를 레트로바이러스 벡터를 이용하여 형질도입시켜 bcCML 백혈병 세포를 제조하였다. 제조된 백혈병 세포를 치사량에 가깝게 방사선이 조사된 B6-CD45.1(B6.SJL-PtprcaPrepcb/BoyJ) 마우스에 이식하였다. 상기 마우스에서 lin- 세포를 통상적인 방법으로 분리하고, 분리된 세포에 1-shAmd1 shRNA를 형질주입하여 AMD1 유전자를 녹다운시켰다. 이때, 대조군으로는 shLacZ shRNA를 사용하였다. 48시간 후, 상기 세포 중, shRNA가 형질주입된 bcCML 백혈병 세포를 GFP 발현에 기초하여 확인하고, 분리하였다. 분리된 세포를 마우스 1마리당 1,000 내지 3,000개가 되도록 치사량에 가깝게 방사선이 조사된 B6-CD45.1 마우스에 첫번째 이식하였다. 두번째 이식을 위해 마우스에서 lin- 세포를 통상적인 방법으로 분리하고, 마우스 1마리당 2,000개의 세포를 치사량에 가깝게 방사선이 조사된 B6-CD45.1 마우스에 이식하였다. 백혈병 세포가 이식된 마우스는 항생제 물(설파메톡사졸 및 트리메소프림)을 이용하여 사육하였고 병의 진행상태, 체중, 털손질 및 비장비대(splenomegaly) 등을 매일 확인하였다.
13-2. AMD1 녹아웃에 의한 백혈병 동물모델의 생존율 확인
상기 실시예 13-1에서 제작된 백혈병 동물모델 중, AMD1 유전자를 녹아웃시킨 마우스의 생존율을 100일까지 확인하였다. 그 결과, 도 20A에 나타난 바와 같이, 첫번째 이식 마우스 중, 사육 60일까지 AMD1 유전자가 녹다운된 세포를 이식받은 마우스는, 13%의 생존율을 보인 대조군 마우스와 달리 50%의 생존율을 보였다. 한편, 도 20B에 나타난 바와 같이, 두번째 이식 마우스 중, AMD1 유전자가 녹다운된 세포를 이식받은 마우스는 모두 백혈병이 발병하지 않았다. 반면, 대조군 세포를 이식받은 마우스는 사육 22일째까지만 백혈병이 발병하지 않았다.
13-3. AMD1 이소발현에 의한 백혈병 동물모델의 생존율 확인
실시예 13-1에서 첫번째 이식 마우스로부터 분리한 lin- 세포를 두번째 이식하기 전, AMD1 유전자를 형질주입하였다. 이후, AMD1 유전자가 형질주입된 lin- 세포를 치사량에 가깝게 방사선이 조사된 B6-CD45.1 마우스에 이식하고, 생존율을 확인한 결과를 도 21에 나타내었다.
도 21에 나타낸 바와 같이, AMD1 유전자의 녹아웃으로 100%의 생존율을 보였던 마우스에서 AMD1 유전자의 과발현으로 인해 백혈병이 발병하였다.
따라서, 상기 결과로부터 AMD1 유전자가 백혈병 줄기세포의 유지에 필수적임을 알 수 있었다.
실시예 14. 백혈병 동물모델에서 분리된 세포의 분화확인
실시예 13-1에서 첫번째 이식 마우스로부터 분리된 bcCML 세포의 세포분화를 유세포분석 방법을 이용하여 확인하였다. 실험은 실시예 4-2와 동일한 방법으로 수행되었으며, 그 결과를 도 22에 나타내었다.
도 22에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자가 녹아웃된 세포에서는 대조군과 비교하여 4 내지 5배 높은 수준으로 Gr1+ 및 MAC1+Gr1+ 세포가 존재하였다.
따라서, 상기로부터 생체 내에서 AMD1 유전자가 녹아웃된 백혈병 세포가 더 빠르게 분화됨을 알 수 있었다.
실시예 15. 백혈병 동물모델에서 분리된 세포에서 AMD1 유전자 녹다운에 의한 유전자 발현 변화 확인
실시예 13-1에서 제조된 백혈병 동물모델에서 bcCML 세포를 분리하여 AMD1 유전자 녹다운에 의한 다른 유전자의 발현 변화를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
15-1. 유전자 종양학(gene oncology) 분석 및 KEGG 기전 확인
구체적으로, 분리된 bcCML 세포로부터 알앤이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit, Qiagen, 독일)를 이용하여 전체 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA 1 ㎕를 이용하여 RNA의 순도를 나노드롭8000(NanoDrop800) 분광광도계로 측정하고, RNA의 온전함(integrity)을 RNA 인테그리티 번호(RNA integrity number, RIN) 값과 함께 아질런트 테크놀로지 2100 바이오아날라이저(Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer)를 사용하여 확인하였다. 한편, mRNA 서열 라이브러리는 일루미나 트루시큐 스트렌디드 mRNA 라이브러리 프렙 키트(Illumina Truseq stranded mRNA library prep kit)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 준비하였다. 증폭된 라이브러리의 질은 모세관 전기영동 방법(Bioanalyzer, Agilent, 미국)으로 확인하였고, 모든 라이브러리는 CFX96 실시간 시스템(CFX96 Real-Time System, Bio-Rad Laboratories, inc., 미국)을 사용하여 qPCR을 수행함으로써 그 양을 확인하였다. 분리된 mRNA의 서열은 2×100 bp 읽기 길이(read length)로 노바시큐 6000 시퀀싱 시스템(Novaseq 6000 sequencing system, Illumina)을 사용하여 분석하였다. 또한, 다른 생물학적 조건(condition) 사이의 다른 유전자 발현의 생물학적 기능을 확인하기 위해, 유전자 종양학 및 KEGG 기전의 생물학적 프로세스를 포함하여 분석된 다른 발현된 유전자 및 기능적으로 카테고리화된 유전자 사이의 유전자 세트 중복 테스트가 DAVID 툴(tool)을 사용하여 수행되었다.
그 결과, 도 23 및 24에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자의 녹다운으로 인해 상위 랭크된 이상 조절된 기전은 조혈모세포 계통, 면역반응 및 면역 시스템 프로세스에서 발견되었다.
15-2. GSEA(gene set enrichment analysis) 확인
GSEA의 수행에는 모든 발현된 유전자가 사용되었다. 유전자 세트 분석은 GSEA 소프트웨어(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp) 및 MSigDB(Molecular Signature Database)가 사용되었고, 각각의 유전자 세트 결정에는 NES(normalized enriched score)가 사용되었다. 유의적인 유전자 세트 농축(enrichment)는 NES>1의 절대값, NES≤0.05의 명목상 P-값, 및 FDR(false discovery rate)≤0.05에 기초하여 선택되었다. 그 결과, 백혈병 줄기세포 유전자에 대한 분석 결과를 도 25A에 조혈모 줄기세포의 유전자에 대한 분석 결과를 도 25B에 나타내었다.
도 25에 나타난 바와 같이, 대조군 세포와 달리, AMD1 유전자가 녹다운된 세포에서는 백혈병 줄기세포 및 조혈모 줄기세포의 표지 유전자들이 풍부하게 존재하지 않았다.
15-3. 마이크로어레이 분석
마이크로어레이 분석을 이용하여 스트레스 관련된 기전과 관련된 유전자 발현변화를 확인하였다. 실험은 통상적인 방법으로 수행되었으며, 그 결과, 산화 스트레스 반응 유전자의 발현변화 결과를 도 26A에, ER(endoplasmic reticulum) 스트레스에 의해 유도되는 UPR(unfolded protein response) 결과를 도 26B에 나타내었다.
도 26에 나타난 바와 같이, 다양한 스트레스 관련된 기전이 조절장애 기전(dysregulated pathway)으로부터 확인되었다. 특히, 산화 스트레스 및 ER 스트레스 모두에 관련된 ATF3 및 ATF4 유전자의 발현이 AMD1 유전자가 녹다운된 세포에서 유의적으로 증가하였다.
실시예 16. AMD1 유전자의 녹다운에 의한 ATF3 및 ATF4 발현변화 확인
16-1. AMD1 유전자 녹다운에 의한 ATF3 및 ATF4 발현변화 확인
상기 마이크로어레이 분석 결과 AMD1 유전자의 녹다운에 의해 유의적으로 발현이 증가한 것으로 확인된 ATF3 및 ATF4 유전자와 단백질의 발현 변화를 AMD1이 녹다운된 bcCML 세포 및 K562 세포주에서 확인하였다.
구체적으로, 유전자 발현은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 확인하였다. 이때, 각각의 유전자에 대한 프라이머는 하기 표 1에 기재된 바와 같은 프라이머를 사용하였다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
ATF3-forward CCTCTGCGCTGGAATCAGTC 서열번호 6
ATF3-reverse TTCTTTCTCGTCGCCTCTTTTT 서열번호 7
ATF4-forward ATGACCGAAATGAGCTTCCTG 서열번호 8
ATF4-reverse GCTGGAGAACCCATGAGGT 서열번호 9
chop-forward GGAAACAGAGTGGTCATTCCC 서열번호 10
chop-reverse CTGCTTGAGCCGTTCATTCTC 서열번호 11
한편, 단백질 발현은 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 확인되었고, 대조군으로 액틴(actin) 단백질을 사용하였다. 이때, 1차 항체로서 항-ATF3 항체(#sc-81189, Santa Cruz Biotechnology, 미국), 항-ATF4 항체(#11815S, Cell Signaling Technology, 미국), 항-chop 항체(#sc-7351, Santa Cruz Biotechnology, 미국) 및 항-액틴 항체(#ab8229, Abcam, 미국)를 사용하였다. 그 결과, bcCML 세포에서의 유전자 발현 확인 결과를 도 27A에, 단백질 발현 확인 결과를 도 27B에 나타내었고, K562 세포주에서의 유전자 발현 확인 결과를 도 28A에, 단백질 발현 확인 결과를 도 28B에 나타내었다.
도 27 및 28에 나타낸 바와 같이, AMD1의 녹다운에 의해 ATF3, ATF4 및 chop 유전자와 단백질의 발현이 bcCML 세포 및 K562 세포주에서 모두 유의적으로 증가하였다.
16-2. AMD1 이소발현에 의한 ATF3 및 ATF4의 발현 변화 확인
AMD1이 녹다운된 K562 세포주에 AMD1을 이소발현 시켰을 때, ATF3, ATF4 및 chop 단백질의 발현변화를 상기 실시예 16-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하여 확인하였다.
그 결과, 도 29에 나타난 바와 같이, AMD1의 녹다운에 의해 증가한 ATF3, ATF4 및 chop 단백질의 발현이 AMD1의 이소발현에 의해 억제되었다.
따라서, 상기 결과로부터 백혈병의 진행이 AMD1의 결핍과 긴밀히 관련되어 있으며, 여기에는 스트레스-관련 기전 또한 연관되어 있음을 알 수 있었다.
실시예 17. AMD1 유전자 녹다운에 의한 ROS(reactive oxygen species) 수준 변화 확인
17-1. 과산화수소에 의한 ROS 수준 확인
bcCML 세포에 1-shAmd1 shRNA를 상기 서술한 바와 같이 형질도입하여 AMD1 유전자가 녹다운된 세포를 제조하였다. 이때, 대조군으로서 shLacZ shRNA를 형질도입한 세포를 사용하였다. 제조된 세포에 H2O2를 첨가하고 3시간을 배양하였다. 배양된 세포에 2',7'-디클로로플루오레스세인 디아세테이트(2',7'-dichlorofluorescein diacetate, DCFDA, Abcam, 미국)를 첨가하고 37℃에서 30분 동안 암실에서 반응시켰다. 반응이 끝난 후, FACS Canto를 사용하여 형광을 측정하고, 플로우조 소프트웨어를 사용하여 측정값을 분석한 결과를 도 30에 나타내었다.
도 30에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자가 녹다운된 bcCML 세포에서 대조군과 비교하여 유의적으로 ROS 수준이 높았으며, 이는 H2O2의 존재유무에는 영향을 받지 않았다.
17-2. NAC(N-acetylcysteine)에 의한 ROS 수준 확인
실시예 17-1에서 확인된 AMD1 유전자 녹다운 세포에서의 높은 ROS 수준이 ROS 스캐빈저(scavenger)인 NAC에 의해 제거되는지 확인하였다. 실험은 H2O2를 첨가하고 3시간을 배양하는 대신 NAC(Abcam, 미국)을 첨가하고 2일을 배양한 것을 제외하고는 실시예 17-1과 동일하게 수행되었다.
그 결과, 도 31에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자의 녹다운으로 높아진 ROS의 수준이 NAC에 의해 유의적으로 감소되었다.
실시예 18. 폴리아민 처리에 의한 미토콘드리아의 ROS 수준변화 확인
18-1. 폴리아민 처리에 따른 미토콘드리아의 ROS 수준 확인
AMD1 유전자 녹다운에 의해 높아진 ROS 수준이 폴리아민의 처리에 의해 변하는지를 미토콘드리아의 ROS 수준을 측정함으로써 확인하였다.
실험은 미토속스™ 레드 미토콘드리알 수퍼옥사이드 측정기(MitoSox™ Red mitochondrial superoxide indicator, Molecular Probes, 미국)를 사용하여 제조사의 프로토콜을 약간 변형하여 수행되었다. 구체적으로, 1-shAmd1 shRNA가 형질도입되고, 동시에 AMD1이 이소발현된 bcCML 세포를 7일 동안 배양하면서, 배양 2, 5 및 7일째에 샘플을 수집하였다. 수집된 세포 3×105개에 5 μM의 미토속스를 처리하고 37℃에서 10분 동안 반응시켜 세포를 염색하였다. 염색된 세포를 HBSS 완충액으로 1회 세척하고, 2,500 g에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 수득된 펠렛을 300 ㎕의 3.7% 포름알데이드에 현탁시키고 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 이를 다시 2,500 g에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 수득된 펠렛을 250 ㎕의 HBSS 완충액에 현탁시키고 FACS Canto를 사용하여 형광을 측정하고, 플로우조 소프트웨어를 사용하여 측정값을 분석한 결과를 도 32에 나타내었다. 이때, 미토속스 레드는 488 ㎚에서 여기되었고, 데이터는 564 내지 606 ㎚ 채널에서 수집되었다.
도 32에 나타난 바와 같이, AMD1의 녹다운에 의해 미토콘드리아의 ROS가 유의적으로 증가하였으며, 이는 폴리아민의 처리에 의해 다시 억제되었다.
18-2. 폴리아민 처리 농도에 따른 ROS 수준 확인
AMD1 유전자가 녹다운된 bcCML 세포에서 폴리아민에 의해 ROS의 수준이 감소하는 것이 폴리아민이 자유라디칼을 제거함에 의한 것인지를 확인하기 위해 하이드록시 라디칼 스캐빈저 분석(hydroxyl radical scavenging assay)을 수행하였다.
구체적으로, 20 ㎕의 10 mM 황산암모늄(ferrous ammonium sulfate), 50 ㎕의 10 mM H2O2, 25 ㎕의 10 mM EDTA, 25 ㎕의 2-데옥시리보오스(2-deoxyribose 및 10, 100, 500 또는 1,000 μM의 스페르미딘을 포함하는 150 ㎕의 PBS(pH 7.4)를 혼합하여 반응물을 수득하였다. 이때, 양성 대조군으로서 아스코르브산을 사용하였다. 수득된 반응물릉 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 뒤, 250 ㎕의 2.8% TCA(trichloroacetic acid) 및 250 ㎕의 1% TBA를 첨가하였다. 이후, 이를 100℃에서 15분 동안 가열하고 식한다음 크로모젠(chromogen)을 멀티스칸 고 분광광도계(Multiskan GO spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific, 미국)를 이용하여 535 ㎚의 파장에서 정량하였다. 그 결과, 정량분석 결과를 도 33에 나타내었다.
도 33에 나타난 바와 같이, H2O2에 의해 생성된 하이드록시 라디칼이 첨가된 스페르미딘의 농도에 의존적으로 감소되었다.
실시예 19. AMD1 유전자 녹다운에 의해 붕괴된 미토콘드리아 막 전위(mitochondrial membrane potential, ΔΨ) 변화 확인
AMD1 유전자 녹다운과 미토콘드리아 막 전위의 손실 사이의 연관성을 확인하기 위해 미토프로브 DiC1(5) 분석 키트(MitoProbe DiC1(5) assay kit, Molecular Probe, 미국)를 사용하여 미토콘드리아 막 전위를 확인하였다.
먼저, 1-shAmd1 shRNA가 형질도입되고, 동시에 10 μM의 스페르미딘이 처리된 bcCML 세포를 7일 동안 배양하면서, 배양 2, 5 및 7일째에 샘플을 수집하였다. 수집된 세포 3×105개에 2.5 ㎕의 10 μM DiC1(5)을 첨가하고 37℃에서 10분 동안 반응시킨 후, PBS 완충액으로 세포를 세척하였다. 세척된 세포를 2,500 g에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 수득된 펠렛을 300 ㎕의 3.7% 포름알데이드에 현탁시키고 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 이를 다시 2,500 g에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 수득된 펠렛을 250 ㎕의 PBS 완충액에 현탁시키고 FACS Canto를 사용하여 형광을 측정하고, 플로우조 소프트웨어를 사용하여 측정값을 분석한 결과를 도 34에 나타내었다. 이때, DiC1(5)의 여기 및 흡수 피크는 각각 638 및 658 ㎚이었다.
도 34에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자의 녹다운에 의해 미토콘드리아 막 전위가 붕괴되었으나, 이는 스페르미딘의 처리에 의해 회복되었다.
실시예 20. AMD1 유전자 녹다운 세포에서 NAC 처리에 의한 변화 확인
AMD1 유전자 녹다운에 의한 영향을 NAC의 처리에 의해 회복시킬 수 있는지 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
20-1. 콜로니 형성 확인
bcCML 세포에 1-shAmd1 shRNA를 형질도입하면서, NAC를 48시간 동안 처리한 후, 실시예 3에 기재된 바와 같은 방법으로 콜로니 형성을 확인하고, 그 결과를 도 35에 나타내었다.
도 35에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자 녹다운에 의한 콜로니 형성 억제가 NAC의 처리에 의해 회복되었다.
20-2. 세포분화 확인
실시예 20-1에서 AMD1 유전자가 녹다운되고, NAC가 처리된 세포의 세포분화를 유세포분석 방법을 이용하여 확인하였다. 실험은 실시예 4-2와 동일한 방법으로 수행되었으며, 그 결과를 도 36에 나타내었다.
도 36에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자 녹다운에 의한 세포분화가 NAC의 처리에 의해 억제되었다.
실시예 21. AMD1 이소발현에 의한 ROS 수준 확인
AMD1 유전자 녹다운에 의해 증가한 ROS 수준이 ADM1 이소발현에 의해 변하는지를 다음과 같이 확인하였다. 구체적으로, 실험은 1-shAmd1 shRNA를 형질도입하면서 AMD1 유전자를 이소발현시킨 bcCML 세포를 이용한 것을 제외하고는 실시예 17-1과 동일한 방법으로 수행되었다.
그 결과, 도 37에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자 녹다운으로 높아진 ROS 수준이 AMD1 이소발현에 의해 유의적으로 감소되었다.
실시예 22. 높은 수준의 ROS에 의한 세포분화 촉진 확인
높은 수준의 ROS가 bcCML 세포의 세포분화에 직접 영향을 미치는지를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 25 μM의 H2O2가 처리된 bcCML 세포의 세포분화를 유세포분석 방법을 이용하여 확인하였다. 실험은 실시예 4-2와 동일한 방법으로 수행되었으며, 그 결과를 도 38에 나타내었다.
도 38에 나타난 바와 같이, H2O2의 처리에 의해 bcCML 세포가 골수계통(myeloid lineage)으로 분화가 유도되었다.
따라서, 상기 결과로부터 AMD1 유전자의 녹다운에 의한 폴리아민의 감소가 ROS 스케빈져를 중단시켜 ROS의 축적을 유도하고, ROS가 미토콘드리아에서 세포질로 방출됨으로써, 백혈병 줄기세포의 분화를 유도함을 알 수 있었다.
실시예 23. 폴리아민 처리에 따른 세포 변화 확인
23-1. ROS 수준 변화 확인
폴리아민의 처리에 따른 ROS의 수준 변화를 다음과 같은 방법으로 확인하였다. 구체적으로, 실험은 K562 또는 bcCML 세포에 10, 100 또는 500 μM의 스페르미딘을 3시간 동안 처리한 것을 제외하고는 실시예 17-1과 동일한 방법으로 수행되었다.
그 결과, 도 39에 나타난 바와 같이, 처리된 폴리아민 농도에 의존적으로 두 세포 모두에서 ROS의 수준이 감소되었다.
23-2. 세포분화 확인
실시예 23-1에서 폴리아민이 처리된 bcCML 세포의 세포분화를 유세포분석 방법을 이용하여 확인하였다. 실험은 실시예 4-2와 동일한 방법으로 수행되었으며, 그 결과를 도 40 내지 42에 나타내었다.
도 40 내지 42에 나타난 바와 같이, 처리된 폴리아민 농도에 의존적으로 bcCML 세포의 세포분화가 억제되었다.
실시예 24. 폴리아민 처리에 의한 산화스트레스 관련 유전자 및 단백질 발현 변화 확인
폴리아민의 처리에 따른 산화스트레스 관련 유전자 및 단백질의 발현 변화를 다음과 같은 방법으로 확인하였다. 구체적으로, 실험은 K562 또는 bcCML 세포에 10, 100 또는 500 μM의 스페르미딘 및 H2O2를 3시간 동안 처리하고, 상기 서술한 바와 같이 RT-qPCR을 수행하여 유전자 발현 변화를, 웨스턴 블랏을 수행하여 단백질 발현 변화를 확인함으로써 수행되었다. 그 결과, K562 세포에서의 유전자 및 단백질 발현 변화를 각각 도 43A 및 43B에, bcCML 세포에서의 유전자 및 단백질 발현 변화를 각각 도 44A 및 44B에 나타내었다.
도 43 및 44에 나타난 바와 같이, K562 및 bcCML 세포 모두에서 H2O2에 의해 증가된 산화스트레스 관련 유전자 및 단백질의 발현이 폴리아민에 의해 감소하였다.
따라서, 상기 결과로부터 AMD1이 ROS에 의해 유도되는 산화스트레스 반응으로부터 bcCML 세포를 보호하는데 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.
실시예 25. KLS 또는 분화된 세포에서 산화스트레스 관련 유전자의 발현 확인
전체 백혈병 세포를 KLS 또는 분화된 세포로 나누어 산화스트레스 관련 유전자인 ATF3, ATF4 및 Chop 유전자의 발현에 차이가 있는지 확인하였다. 먼저, 전체 백혈병 세포를 lin+ 또는 lin- 세포로 통상적인 방법으로 분리한 후, 실시예 16-1에 기재된 바와 같은 방법으로 ATF3, ATF4 및 Chop 유전자의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 45A에 나타난 바와 같이, 분화된 세포인 lin+ 세포에서 ATF3, ATF4 및 Chop 유전자의 발현이 현저히 유의적으로 높았다.
실시예 26. 산화스트레스 관련 유전자의 과발현에 의한 변화 확인
26-1. 콜로니 형성 확인
실시예 25에서 산화스트레스 관련 유전자의 발현이 낮은 것으로 확인된 lin- 세포에 ATF3 또는 ATF4 유전자를 통상적인 방법으로 과발현시킨 후, 과발현된 세포의 콜로니 형성을 확인하였다. 그 결과, 도 45B 및 45C에 ATF3 또는 ATF4가 이소발현된 세포에서 ATF3 및 ATF4 유전자 발현을 각각 확인한 결과를, 도 45D에 콜로니 형성을 확인한 결과를 나타내었다.
도 45B 및 45C에 나타난 바와 같이, ATF3 또는 ATF4 이소발현된 세포에서 ATF3 및 ATF4 유전자의 발현이 확인되었다. 또한, 도 45D에 나타난 바와 같이, ATF3와 달리 ATF4가 이소발현된 lin- 세포의 콜로니 형성이 유의적으로 억제되었다.
26-2. 세포분화 확인
실시예 26-1에서 ATF3 또는 ATF4 유전자를 과발현하도록 제조된 lin- 세포를 이용하여 세포분화를 유세포분석 방법을 이용하여 확인하였다. 실험은 실시예 4-2와 동일한 방법으로 수행되었으며, 그 결과를 도 46에 나타내었다.
도 46에 나타난 바와 같이, ATF3 또는 ATF4 이소발현에 의해서 Mac1+/Grl+ 및 계통 양성(lineage positive)인 세포가 증가하였다.
따라서, 상기로부터 ATF3 또는 ATF4의 과발현에 의해 골수성 백혈병 세포의 분화가 유도됨을 알 수 있었다.
26-3. 세포사멸 유도 확인
실시예 26-1에서 ATF3 또는 ATF4 유전자를 과발현하도록 제조된 lin- 세포의 세포사멸을 통상의 기술분야에 알려진 바와 같이 유세포분석을 수행하여 확인하였다.
그 결과, 도 47에 나타난 바와 같이, ATF3 또는 ATF4 이소발현된 세포가 대조군 세포에 비해 세포사멸율이 유의적으로 높았다.
실시예 27. 산화스트레스 관련 유전자의 녹다운에 의한 변화 확인
AMD1 유전자 녹다운에 의한 영향이 ATF3 또는 ATF4 이소발현에 의해서도 나타나는지 확인하기 위해, ATF3 또는 ATF4 유전자를 녹다운시키고 그에 따른 변화를 확인하였다.
27-1. AMD1, ATF3 또는 ATF4 유전자 발현 변화 확인
bcCML 세포에 1-shAmd1 shRNA를 형질도입하면서, 하기 표 2에 나타난 바와 같은 ATF3 또는 ATF4 유전자에 대한 shRNA를 함께 형질도입하고, 각 세포에서 AMD1, ATF3 또는 ATF4 유전자의 발현을 상기 서술한 바와 같이 확인하였다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
1-shAtf3 shRNA GCAGAAAGAGTCAGAGAAACT 서열번호 12
2-shAtf3 shRNA GGAGCTGAAGAATGAGAAACA 서열번호 13
1-shAtf4 shRNA TGCTGCTTACATTACTCTAAT 서열번호 14
그 결과, 도 48A에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자의 발현이 ATF3 또는 ATF4 유전자의 녹다운에 의해 증가하였다. 한편, 도 48B 및 48C에 나타난 바와 같이, ATF3 및 ATF4 유전자의 발현은 AMD1 유전자의 녹다운에 의해 유의적으로 현저히 증가하였다.
27-2. 콜로니 형성 확인
실시예 27-1에서 AMD1 유전자와 함께 ATF3 또는 ATF4 유전자가 녹다운된 bcCML 세포의 콜로니 형성을 상기 서술한 바와 같이 확인하고, 그 결과를 도 49에 나타내었다.
도 49에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자 녹다운에 의해 억제된 콜로니 형성이 ATF3 또는 ATF4 유전자를 함께 녹다운시키면 증가하였다.
27-3. 세포분화 확인
실시예 27-1에서 AMD1 유전자와 함께 ATF3 또는 ATF4 유전자가 녹다운된 bcCML 세포의 세포분화를 상기 서술한 바와 같이 유세포분석 방법으로 확인하였다.
그 결과, 도 50 및 51에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자의 녹다운으로 인해 유도되는 세포분화가 ATF3 또는 ATF4 유전자를 함께 녹다운시킴으로 억제되었다.
따라서, 상기 결과로부터 ATF3 및 ATF4 유전자의 결핍이 AMD1 유전자 녹다운으로 인한 변화를 부분적으로 회복시킴으로써, AMD1 유전자의 결핍에 의한 골수성 백혈병 세포의 분화 및 손상에의 영향이 ROS-유도된 ATF3 또는 ATF4를 통해 나타나는 것임을 알 수 있었다.
실시예 28. 환자로부터 유래된 골수성 백혈병 세포에서 AMD1 유전자 발현 확인
만성 골수성 백혈병 환자에서 유래된 골수성 백혈병 세포에서 AMD1 유전자 발현을 생명윤리위원회로부터 승인받은 방법에 따라 다음과 같이 확인하였다.
먼저, 한국 백혈병은행으로부터 환자의 샘플을 제공받아 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell)를 분리하고, 분리된 세포에서 상기 서술한 바와 같이 RNA를 수득하였다. 수득된 RNA를 주형으로 AMD1 유전자의 발현을 RT-qPCR 방법으로 확인하고, 그 결과를 도 52B에 나타내었다. 한편, 42명의 만성기(CP) 환자, 17명의 가속기(accelerated phase, AP) 환자, 31명의 급성기(blast crisis phase) 환자로부터의 프레드 허친슨(Fred Hutchison) 분석의 미국 환자 샘플에서 AMD1 유전자 발현을 확인하였다. 유전자 발현 데이터는 로제타 플랫폼(Rosetta platform)을 사용하여 수득하였고, 데이터 값은 만성 골수성 백혈병 환자의 풀(pool)에서 AMD1 유전자의 발현을 각각의 환자 샘플에서의 정규화된 AMD1 유전자 발현과 비교하여 로그 값으로 계산하여 도 52A에 나타내었다.
도 52에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자의 발현은 골수성 백혈병이 만성기에서 급성기로 진행됨에 따라 유의적으로 현저히 증가하였다.
실시예 29. 질병의 진행에 따른 AMD1 유전자 발현 변화 확인
3명의 골수성 백혈병 환자를 선택하여 4년 동안 병의 진행상태와 AMD1 유전자의 발현 변화를 확인하였다. 실험은 병의 진행에 따라 환자로부터 샘플을 수득하여 사용한 것을 제외하고는, 상기 서술된 바와 같은 방법을 RT-qPCR 방법으로 수행되었다.
그 결과, 도 53에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자의 발현은 급성기에서 현저히 증가하였고, 이는 만성기 동안에 감소하였다. 특히, 골수성 백혈병이 급성기로 들어가는 시기에 AMD1 유전자의 발현이 극도로 높아졌다.
따라서, 상기로부터 AMD1 유전자 발현으로 골수성 백혈병의 진행을 알 수 있음을 확인하였다.
실시예 30. 환자로부터 유래된 골수성 백혈병 세포에서 폴리아민의 함량 확인
환자로부터 유래된 골수성 백혈병 세포에 존재하는 폴리아민의 함량을 상기 서술한 바와 같은 방법으로 확인하였다. 이때, 대조군으로서 CD34+ 세포를 사용하였다.
그 결과, 도 54에 나타난 바와 같이, 대조군 세포와 달리 골수성 백혈병 세포에는 폴리아민, 특히 스페르미딘의 함량이 유의적으로 높았다.
실시예 31. 약물 내성을 나타내는 골수성 백혈병 세포에서 AMD1 유전자 발현 및 폴리아민 함량 변화 확인
상기 실시예에서 AMD1 유전자의 발현이 골수성 백혈병의 진행과 관련있음을 확인하여, AMD1이 약물 저항성과 관련있는지 여부를 다음과 같이 확인하였다.
먼저, 만성 골수성 백혈병 환자의 치료에 사용되는 이마티닙(imatinib) 또는 닐로티닙(nilotinib)에 저항성을 나타내는 K562 세포(각각, K562-IR 또는 K562-NR)에서 상기 서술한 바와 같이 AMD1 유전자 발현과 폴리아민의 함량 변화를 확인하였다. 이때, 대조군으로서 K562 세포를 사용하였다. 그 결과, AMD1 유전자 발현 변화를 도 55A에, 폴리아민 함량 변화를 도 55B에 나타내었다.
도 55에 나타난 바와 같이, 약물에 내성을 갖는 세포주에서 AMD1 유전자의 발현과 폴리아민의 함량이 현저히 증가하였다.
실시예 32. 약물 내성을 나타내는 골수성 백혈병 세포에서 AMD1 녹다운에 의한 변화 확인
32-1. 콜로니 형성 확인
닐로티닙에 내성을 나타내는 K562-NR 세포에 3-shAmd1 shRNA를 형질도입하여 AMD1 유전자를 녹다운시킨 뒤, 상기 세포의 콜로니 형성을 확인하였다. 그 결과 형성된 콜로니를 관찰한 사진을 도 56A에, 생성된 콜로니 수를 확인한 결과를 도 56B에 나타내었다.
도 56에 나타난 바와 같이, 약물에 내성을 나타내는 K562 세포에서 AMD1 유전자를 녹다운 시키면 콜로니 형성이 유의적으로 억제되었다.
32-2. 약물 민감성 증진 확인
닐로티닙에 내성을 나타내는 K562-NR 또는 이마타닙에 내성을 나타내는 K562-IR 세포에 3-shAmd1 shRNA를 형질도입하여 AMD1 유전자를 녹다운시킨 뒤, 닐로타닙 또는 이마타닙을 처리하고 세포사멸을 통상적인 방법으로 확인하였다. 그 결과, K562-NR 세포의 세포사멸율을 도 57에 나타내었다.
도 57에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자가 녹다운된 세포는 닐로타닙 또는 이마타닙에 대한 민감성이 증진되어 세포사멸이 증가하였다.
실시예 33. AMD1 유전자의 발현과 골수성 백혈병의 예후와의 상관관계 확인
AMD1 유전자의 발현과 골수성 백혈병 환자의 생존율과의 상관관례를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 골수성 백혈병 환자로부터 수득된 샘플의 AMD1 유전자 발현 정도를 낮음(<25%), 중간(25~75%) 또는 높음(>75%)의 3 그룹으로 분류하였다. 한편, 환자의 생존율을 로그 순위법(log-rank test)로 비교되었다. 그 결과 수득된 환자의 카플란-마이어 플룻(Kaplan-Meier plot)를 도 58에 나타내었다.
도 58에 나타난 바와 같이, AMD1 유전자의 발현 정도가 낮을수록 생존율이 높았으며, AMD1 유전자의 발현이 높을수록 그 예후가 좋지 않았다.
따라서, 상기 결과로부터 AMD1이 골수성 백혈병의 진행을 평가하기 위한 바이오마커로서 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 34. AMD1 유전자가 녹다운된 환자유래 세포의 콜로니 형성 확인
2명의 환자로부터 분리된 bcCML 세포에 3-shAmd1 또는 4-shAmd1(서열번호 15: 5'-GGGAATTTAGCCTCTCTTTTA-3')을 형질도입하고, 상기 세포의 콜로니 형성을 상기 서술한 바와 같은 방법으로 확인하였다. 그 결과, 콜로니 형성을 확인한 결과를 도 59A에 첫번째 환자의 콜로니 수를 확인한 결과를 도 59B에 두번째 환자의 콜로니 수를 확인한 결과를 도 59C에 나타내었다.
도 59에 나타난 바와 같이, 환자 유래 bcCML 세포에서 AMD1 유전자가 녹다운되어 상기 세포의 콜로니 형성이 유의적으로 억제되었다.
따라서, 상기로부터 AMD1이 골수성 백혈병 세포에서 기능적으로 중요할뿐만 아니라 골수성 백혈병의 예후와도 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다.
실시예 35. AMD1 억제제의 골수성 백혈병 세포 증식 억제 확인
AMD1 억제제로 최근에 보고된 AO476 화합물의 골수성 백혈병 세포 증식 억제를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
먼저, 만성 골수성 백혈병 세포주인 K562 세포주 및 급성 골수성 세포주인 HL60 세포주, 간성상세포주(hepatic stellate cell line)인 LX2 세포주, 및 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast)인 MEF 세포를 통상적인 방법으로 배양하여 준비하였다. 준비된 세포에 AO476 화합물을 10, 20, 40, 60 또는 100 μM의 농도로 96시간 동안 처리한 후, 상기 서술한 바와 같이 MTT 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 60에 나타난 바와 같이, 골수성 백혈병 세포주인 K562 및 HL60 세포주만 처리된 AO476 화합물의 농도에 의존적으로 세포의 증식이 억제되었다.
실시예 36. AMD1 억제제에 의한 골수성 백혈병 세포에서 산화스트레스 관련 단백질의 발현 변화 확인
bcCML 세포주에 AO476 화합물을 처리하고 0, 2, 8 또는 16시간 뒤 샘플을 채취하여 산화스트레스 관련 단백질인 Chop, ATF3 및 ATF4 단백질의 발현 변화를 상기 서술한 바와 같이 웨스턴 블랏을 수행하여 확인하고, 그 결과를 도 61에 나타내었다.
도 61에 나타낸 바와 같이, AO476 화합물의 처리에 의해 AMD1의 발현이 억제됨으로써, Chop, ATF3 및 ATF4 단백질의 발현이 유의적으로 증가하였다.
실시예 37. AMD1 억제제에 의한 골수성 백혈병 세포의 세포분화 확인
AO476 화합물을 처리한 bcCML 세포주의 세포분화를 유세포분석 방법으로 확인하였다. 실험은 상기 서술한 바와 같이 수행되었으며, 그 결과를 도 62에 나타내었다.
도 62에 나타낸 바와 같이, AO476 화합물의 처리에 의해 bcCML 세포의 세포 분화가 촉진되었다.
실시예 38. AMD1 억제제의 환자유래 세포 증식 억제 확인
만성 또는 급성 골수성 백혈병 환자로부터 분리된 세포에 AO476 화합물을 10, 20 또는 40 μM의 농도로 96시간 동안 처리한 후, 상기 서술한 바와 같이 MTT 분석을 수행하고, 그 결과를 도 63에 나타내었다.
도 63에 나타난 바와 같이, 만성 및 급성 골수성 백혈병 환자로부터 유래된 세포가 AO476 화합물의 농도에 의존적으로 세포증식이 억제되었다.
실시예 39. AMD1 억제제에 의한 환자유래 세포 콜로니 형성 확인
만성 또는 급성 골수성 백혈병 환자로부터 분리된 세포에 AO476 화합물을 20 μM의 농도로 처리하고 7일 후, 상기 서술한 바와 같이 콜로니 형성을 확인하였다.
그 결과, 도 64 및 65에 나타난 바와 같이, AO476 화합물의 처리에 의해 만성 또는 급성 골수성 백혈병 환자 유래 세포의 콜로니 형성이 유의적으로 억제되었다.
실시예 40. 약물 내성을 나타내는 골수성 백혈병 세포에서 AMD1 억제제에 의한 콜로니 형성 확인
닐로티닙에 내성을 나타내는 K562-NR 세포에 AO476 화합물을 20 또는 40 μM의 농도로 처리하고 7일 후, 상기 서술한 바와 같이 콜로니 형성을 확인하였다.
그 결과, 도 66에 나타난 바와 같이, AO476 화합물의 처리 농도에 의존적으로 K562-NR 세포의 콜로니 형성이 유의적으로 억제되었다.
실시예 41. 마우스 동물모델에서 AMD1 억제제의 효과 확인
마우스 동물모델에서 AMD1 억제제에 의한 효과를 다음과 같은 방법으로 확인하였다(도 67).
먼저, 치사량에 가깝게 방사선이 조사된 NSG(Nod Scid IL2 receptor gamma) 마우스에 K562 세포를 정맥주사(IV)하고, 다음날부터 AO476 화합물을 복강으로 투여하였다. 투여는 마우스 무게에 대해 40 ㎎/㎏의 투여량으로 2일에 10회 진행되었다. 4주동안 투여 후, 마우스를 희생하여 골수의 키메리즘(chimerism)을 상기 서술한 바와 같이 유세포 분석 방법으로 확인하고, 그 결과를 도 68에 나타내었다.
도 68에 나타난 바와 같이, 대조군 마우스와 비교하여 AO476 화합물을 처리한 마우스에서 백혈병 세포의 생착(engraftment)이 6.2배 정도 낮았다.
따라서, 상기 결과로부터 AO476 화합물이 백혈병 세포를 다른 심각한 독성 없이 시험관 내 및 생체 내에서 효과적으로 억제함으로써, 골수성 백혈병의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
<110> SOONCHUNHYANG UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION FOUNDATION <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OF LEUKEMIA COMPRISING EXPRESSION OR ACTIVITY INHIBITOR OF AMD1 AS AN ACTIVE INGREDIENT <130> DP-2020-0277-KR <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMD1 forward primer <400> 1 tgagcttgac ccagcagtta 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMD1 reverse primer <400> 2 gtggcatcaa tgacagaacc 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-shAmd1 <400> 3 ttggtgggac ttaaacagaa a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-shAmd1 <400> 4 cacaatgtaa gcttcaataa a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3-shAmd1 <400> 5 ggaccagttc tacatgaaag a 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-forward primer <400> 6 cctctgcgct ggaatcagtc 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-reverse primer <400> 7 ttctttctcg tcgcctcttt tt 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF4-forward primer <400> 8 atgaccgaaa tgagcttcct g 21 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF4-reverse primer <400> 9 gctggagaac ccatgaggt 19 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chop-forward primer <400> 10 ggaaacagag tggtcattcc c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chop-reverse primer <400> 11 ctgcttgagc cgttcattct c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-shAtf3 shRNA <400> 12 gcagaaagag tcagagaaac t 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-shAtf3 shRNA <400> 13 ggagctgaag aatgagaaac a 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-shAtf4 shRNA <400> 14 tgctgcttac attactctaa t 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-shAmd1 <400> 15 gggaatttag cctctctttt a 21 <210> 16 <211> 334 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humam AMD1 <400> 16 Met Glu Ala Ala His Phe Phe Glu Gly Thr Glu Lys Leu Leu Glu Val 1 5 10 15 Trp Phe Ser Arg Gln Gln Pro Asp Ala Asn Gln Gly Ser Gly Asp Leu 20 25 30 Arg Thr Ile Pro Arg Ser Glu Trp Asp Ile Leu Leu Lys Asp Val Gln 35 40 45 Cys Ser Ile Ile Ser Val Thr Lys Thr Asp Lys Gln Glu Ala Tyr Val 50 55 60 Leu Ser Glu Ser Ser Met Phe Val Ser Lys Arg Arg Phe Ile Leu Lys 65 70 75 80 Thr Cys Gly Thr Thr Leu Leu Leu Lys Ala Leu Val Pro Leu Leu Lys 85 90 95 Leu Ala Arg Asp Tyr Ser Gly Phe Asp Ser Ile Gln Ser Phe Phe Tyr 100 105 110 Ser Arg Lys Asn Phe Met Lys Pro Ser His Gln Gly Tyr Pro His Arg 115 120 125 Asn Phe Gln Glu Glu Ile Glu Phe Leu Asn Ala Ile Phe Pro Asn Gly 130 135 140 Ala Ala Tyr Cys Met Gly Arg Met Asn Ser Asp Cys Trp Tyr Leu Tyr 145 150 155 160 Thr Leu Asp Phe Pro Glu Ser Arg Val Ile Ser Gln Pro Asp Gln Thr 165 170 175 Leu Glu Ile Leu Met Ser Glu Leu Asp Pro Ala Val Met Asp Gln Phe 180 185 190 Tyr Met Lys Asp Gly Val Thr Ala Lys Asp Val Thr Arg Glu Ser Gly 195 200 205 Ile Arg Asp Leu Ile Pro Gly Ser Val Ile Asp Ala Thr Met Phe Asn 210 215 220 Pro Cys Gly Tyr Ser Met Asn Gly Met Lys Ser Asp Gly Thr Tyr Trp 225 230 235 240 Thr Ile His Ile Thr Pro Glu Pro Glu Phe Ser Tyr Val Ser Phe Glu 245 250 255 Thr Asn Leu Ser Gln Thr Ser Tyr Asp Asp Leu Ile Arg Lys Val Val 260 265 270 Glu Val Phe Lys Pro Gly Lys Phe Val Thr Thr Leu Phe Val Asn Gln 275 280 285 Ser Ser Lys Cys Arg Thr Val Leu Ala Ser Pro Gln Lys Ile Glu Gly 290 295 300 Phe Lys Arg Leu Asp Cys Gln Ser Ala Met Phe Asn Asp Tyr Asn Phe 305 310 315 320 Val Phe Thr Ser Phe Ala Lys Lys Gln Gln Gln Gln Gln Ser 325 330 <210> 17 <211> 334 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Amd1 <400> 17 Met Glu Ala Ala His Phe Phe Glu Gly Thr Glu Lys Leu Leu Glu Val 1 5 10 15 Trp Phe Ser Arg Gln Gln Ser Asp Ala Ser Gln Gly Ser Gly Asp Leu 20 25 30 Arg Thr Ile Pro Arg Ser Glu Trp Asp Val Leu Leu Lys Asp Val Gln 35 40 45 Cys Ser Ile Ile Ser Val Thr Lys Thr Asp Lys Gln Glu Ala Tyr Val 50 55 60 Leu Ser Glu Ser Ser Met Phe Val Ser Lys Arg Arg Phe Ile Leu Lys 65 70 75 80 Thr Cys Gly Thr Thr Leu Leu Leu Lys Ala Leu Val Pro Leu Leu Lys 85 90 95 Leu Ala Arg Asp Tyr Ser Gly Phe Asp Ser Ile Gln Ser Phe Phe Tyr 100 105 110 Ser Arg Lys Asn Phe Met Lys Pro Ser His Gln Gly Tyr Pro His Arg 115 120 125 Asn Phe Gln Glu Glu Ile Glu Phe Leu Asn Ala Ile Phe Pro Asn Gly 130 135 140 Ala Ala Tyr Cys Met Gly Arg Met Asn Ser Asp Cys Trp Tyr Leu Tyr 145 150 155 160 Thr Leu Asp Phe Pro Glu Ser Arg Val Ile Ser Gln Pro Asp Gln Thr 165 170 175 Leu Glu Ile Leu Met Ser Glu Leu Asp Pro Ala Val Met Asp Gln Phe 180 185 190 Tyr Met Lys Asp Gly Val Thr Ala Lys Asp Val Thr Arg Glu Ser Gly 195 200 205 Ile Arg Asp Leu Ile Pro Gly Ser Val Ile Asp Ala Thr Leu Phe Asn 210 215 220 Pro Cys Gly Tyr Ser Met Asn Gly Met Lys Ser Asp Gly Thr Tyr Trp 225 230 235 240 Thr Ile His Ile Thr Pro Glu Pro Glu Phe Ser Tyr Val Ser Phe Glu 245 250 255 Thr Asn Leu Ser Gln Thr Ser Tyr Asp Asp Leu Ile Arg Lys Val Val 260 265 270 Glu Val Phe Lys Pro Gly Lys Phe Val Thr Thr Leu Phe Val Asn Gln 275 280 285 Ser Ser Lys Cys Arg Thr Val Leu Ser Ser Pro Gln Lys Ile Asp Gly 290 295 300 Phe Lys Arg Leu Asp Cys Gln Ser Ala Met Phe Asn Asp Tyr Asn Phe 305 310 315 320 Val Phe Thr Ser Phe Ala Lys Lys Gln Gln Gln Gln Gln Ser 325 330 <210> 18 <211> 351 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human ATF4 <400> 18 Met Thr Glu Met Ser Phe Leu Ser Ser Glu Val Leu Val Gly Asp Leu 1 5 10 15 Met Ser Pro Phe Asp Gln Ser Gly Leu Gly Ala Glu Glu Ser Leu Gly 20 25 30 Leu Leu Asp Asp Tyr Leu Glu Val Ala Lys His Phe Lys Pro His Gly 35 40 45 Phe Ser Ser Asp Lys Ala Lys Ala Gly Ser Ser Glu Trp Leu Ala Val 50 55 60 Asp Gly Leu Val Ser Pro Ser Asn Asn Ser Lys Glu Asp Ala Phe Ser 65 70 75 80 Gly Thr Asp Trp Met Leu Glu Lys Met Asp Leu Lys Glu Phe Asp Leu 85 90 95 Asp Ala Leu Leu Gly Ile Asp Asp Leu Glu Thr Met Pro Asp Asp Leu 100 105 110 Leu Thr Thr Leu Asp Asp Thr Cys Asp Leu Phe Ala Pro Leu Val Gln 115 120 125 Glu Thr Asn Lys Gln Pro Pro Gln Thr Val Asn Pro Ile Gly His Leu 130 135 140 Pro Glu Ser Leu Thr Lys Pro Asp Gln Val Ala Pro Phe Thr Phe Leu 145 150 155 160 Gln Pro Leu Pro Leu Ser Pro Gly Val Leu Ser Ser Thr Pro Asp His 165 170 175 Ser Phe Ser Leu Glu Leu Gly Ser Glu Val Asp Ile Thr Glu Gly Asp 180 185 190 Arg Lys Pro Asp Tyr Thr Ala Tyr Val Ala Met Ile Pro Gln Cys Ile 195 200 205 Lys Glu Glu Asp Thr Pro Ser Asp Asn Asp Ser Gly Ile Cys Met Ser 210 215 220 Pro Glu Ser Tyr Leu Gly Ser Pro Gln His Ser Pro Ser Thr Arg Gly 225 230 235 240 Ser Pro Asn Arg Ser Leu Pro Ser Pro Gly Val Leu Cys Gly Ser Ala 245 250 255 Arg Pro Lys Pro Tyr Asp Pro Pro Gly Glu Lys Met Val Ala Ala Lys 260 265 270 Val Lys Gly Glu Lys Leu Asp Lys Lys Leu Lys Lys Met Glu Gln Asn 275 280 285 Lys Thr Ala Ala Thr Arg Tyr Arg Gln Lys Lys Arg Ala Glu Gln Glu 290 295 300 Ala Leu Thr Gly Glu Cys Lys Glu Leu Glu Lys Lys Asn Glu Ala Leu 305 310 315 320 Lys Glu Arg Ala Asp Ser Leu Ala Lys Glu Ile Gln Tyr Leu Lys Asp 325 330 335 Leu Ile Glu Glu Val Arg Lys Ala Arg Gly Lys Lys Arg Val Pro 340 345 350 <210> 19 <211> 349 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Atf4 <400> 19 Met Thr Glu Met Ser Phe Leu Asn Ser Glu Val Leu Ala Gly Asp Leu 1 5 10 15 Met Ser Pro Phe Asp Gln Ser Gly Leu Gly Ala Glu Glu Ser Leu Gly 20 25 30 Leu Leu Asp Asp Tyr Leu Glu Val Ala Lys His Leu Lys Pro His Gly 35 40 45 Phe Ser Ser Asp Lys Ala Gly Ser Ser Glu Trp Pro Ala Met Asp Asp 50 55 60 Gly Leu Ala Ser Ala Ser Asp Thr Gly Lys Glu Asp Ala Phe Ser Gly 65 70 75 80 Thr Asp Trp Met Leu Glu Lys Met Asp Leu Lys Glu Phe Asp Phe Asp 85 90 95 Ala Leu Phe Arg Met Asp Asp Leu Glu Thr Met Pro Asp Glu Leu Leu 100 105 110 Thr Thr Leu Asp Asp Thr Cys Asp Leu Phe Ala Pro Leu Val Gln Glu 115 120 125 Thr Asn Lys Glu Pro Pro Gln Thr Val Asn Pro Ile Gly His Leu Pro 130 135 140 Glu Ser Leu Ile Lys Val Asp Gln Val Ala Pro Phe Thr Phe Leu Gln 145 150 155 160 Pro Phe Pro Cys Ser Pro Gly Val Leu Ser Ser Thr Pro Glu His Ser 165 170 175 Phe Ser Leu Glu Leu Gly Ser Glu Val Asp Ile Ser Glu Gly Asp Arg 180 185 190 Lys Pro Asp Ser Ala Ala Tyr Ile Thr Leu Ile Pro Pro Cys Val Lys 195 200 205 Glu Glu Asp Thr Pro Ser Asp Asn Asp Ser Gly Ile Cys Met Ser Pro 210 215 220 Glu Ser Tyr Leu Gly Ser Pro Gln His Ser Pro Ser Thr Ser Arg Ala 225 230 235 240 Pro Pro Asp Asn Leu Pro Ser Pro Gly Gly Ser Arg Gly Ser Pro Arg 245 250 255 Pro Lys Pro Tyr Asp Pro Pro Gly Val Ser Leu Thr Ala Lys Val Lys 260 265 270 Thr Glu Lys Leu Asp Lys Lys Leu Lys Lys Met Glu Gln Asn Lys Thr 275 280 285 Ala Ala Thr Arg Tyr Arg Gln Lys Lys Arg Ala Glu Gln Glu Ala Leu 290 295 300 Thr Gly Glu Cys Lys Glu Leu Glu Lys Lys Asn Glu Ala Leu Lys Glu 305 310 315 320 Lys Ala Asp Ser Leu Ala Lys Glu Ile Gln Tyr Leu Lys Asp Leu Ile 325 330 335 Glu Glu Val Arg Lys Ala Arg Gly Lys Lys Arg Val Pro 340 345 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M forward primer <400> 20 tgaagctgac agcattcgg 19 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M reverse primer <400> 21 ctgctggatg acgtgagtaa a 21

Claims (21)

  1. AMD1(adenosyl methionine decarboxylase 1)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 예방, 치료 또는 전이억제용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, AMD1의 발현 억제제는 AMD1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 백혈병 예방, 치료 또는 전이억제용 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 shRNA는 서열번호 3 내지 5 및 15로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열로 구성되는, 백혈병 예방, 치료 또는 전이억제용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, AMD1의 활성 억제제는 AMD1 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티트 미메틱스, 기질유사체, 앱타머, 항체 및 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 백혈병 예방, 치료 또는 전이억제용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인, 백혈병 예방, 치료 또는 전이억제용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00005
    .
  6. 제1항에 있어서, 상기 백혈병은 골수성 백혈병 또는 림프구성 백혈병인, 백혈병 예방, 치료 또는 전이억제용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, ATF4(activating transcription factor 4) 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는, 백혈병 예방, 치료 또는 전이억제용 약학적 조성물.
  8. AMD1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  9. AMD1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 치료제 민감성 증진용 약학적 조성물.
  10. 제10항에 있어서, 상기 백혈병 치료제는 이마티닙(imatinib), 닐로티닙(nilotinib), 다사티닙(dasatinib), 보수티닙(bosutinib) 및 포나티닙(ponatinib)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 백혈병 치료제 민감성 증진용 약학적 조성물.
  11. AMD1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 치료제 민감성 증진용 건강기능식품.
  12. AMD1의 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함하는 백혈병 진단, 전이 또는 예후예측용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, AMD1의 유전자에 특이적으로 결합하는 검출시약은 AMD1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 백혈병 진단, 전이 또는 예후예측용 조성물.
  14. 제12항에 있어서, AMD1의 단백질에 특이적으로 결합하는 검출시약은 AMD1 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티트 미메틱스, 기질유사체, 앱타머, 항체 및 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 백혈병 진단, 전이 또는 예후예측용 조성물.
  15. 제12항의 조성물을 포함하는 백혈병 진단, 전이 또는 예후예측용 키트.
  16. 시료로부터 AMD1의 유전자 또는 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 단계; 및
    상기 검출된 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 백혈병 진단의 정보를 제공하기 위한 방법.
  17. 시료로부터 AMD1의 유전자 또는 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 단계; 및
    상기 검출된 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 백혈병 전이의 정보를 제공하기 위한 방법.
  18. 시료로부터 AMD1의 유전자 또는 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 단계; 및
    상기 검출된 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 백혈병 예후예측의 정보를 제공하기 위한 방법.
  19. AMD1을 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
    후보물질이 처리된 세포에서 AMD1의 유전자 발현 또는 단백질 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    AMD1의 유전자 발현 및 단백질 활성 수준을 무처리 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 백혈병 치료제 스크리닝 방법.
  20. 제19항에 있어서, ATF4의 유전자 발현 또는 단백질 활성 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는, 백혈병 치료제 스크리닝 방법.
  21. AMD1 단백질에 후보물질을 처리하는 단계;
    후보물질이 처리된 AMD1 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    AMD1 단백질의 활성 수준을 무처리 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 백혈병 치료제 스크리닝 방법.
KR1020200183668A 2020-12-24 2020-12-24 Amd1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 약학적 조성물 KR20220092730A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200183668A KR20220092730A (ko) 2020-12-24 2020-12-24 Amd1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200183668A KR20220092730A (ko) 2020-12-24 2020-12-24 Amd1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220092730A true KR20220092730A (ko) 2022-07-04

Family

ID=82399097

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200183668A KR20220092730A (ko) 2020-12-24 2020-12-24 Amd1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20220092730A (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200125061A (ko) 2019-04-25 2020-11-04 주식회사 대웅제약 만성 골수성 백혈병의 진단용 바이오마커

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200125061A (ko) 2019-04-25 2020-11-04 주식회사 대웅제약 만성 골수성 백혈병의 진단용 바이오마커

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200397812A1 (en) Inhibitors of human ezh2, and methods of use thereof
US11279760B2 (en) Inhibition of cytokine-induced SH2 protein in NK cells
Martin et al. Hint2, a mitochondrial apoptotic sensitizer down-regulated in hepatocellular carcinoma
Zhou et al. Neddylation pathway promotes myeloid-derived suppressor cell infiltration via NF-κB-mCXCL5 signaling in lung cancer
EP3828269A1 (en) Composition for prevention or treatment of intractable epilepsy comprising mtor inhibitor
US9752151B2 (en) Composition for treatment or metastasis suppression of cancers which includes p34 expression inhibitor or activity inhibitor as active ingredient
KR20220092730A (ko) Amd1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2021219009A1 (zh) Piwi和/或nmd复合体蛋白在高表达piwi的癌症中的诊断与治疗
Vanvitelli PhD Days
Yin et al. Inhibition of METTL3 in macrophages provides protection against intestinal inflammation
US20100113557A1 (en) Method for prevention of tumor
CN118236491A (zh) Pdk4作为细胞衰老干预靶点及其在化疗抗癌中的应用
JP2008230977A (ja) ニチジンを成分とする抗癌剤、および該抗癌剤の感受性増強剤

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application