KR20220090267A

KR20220090267A - Bacteriophage with E. Coli specificity and Composition for Treating Swine E. Coli Infection Using the Same

Info

Publication number: KR20220090267A
Application number: KR1020200181289A
Authority: KR
Inventors: 양창환; 한용희; 박형순
Original assignee: 주식회사 이신테크놀로지
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2022-06-29

Abstract

본 발명은 대장균인 E.coli Sw1 및 E.coli O157:H7l에 대해 특이적 사멸능을 갖는 박테리오파아지 EcSw 및 이를 이용한 돼지 대장균 감염증 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a bacteriophage EcSw having a specific killing ability against E. coli E. coli Sw1 and E. coli O157:H71 and a composition for treating E. coli infection in pigs using the same.

Description

Bacteriophage with E. coli specificity and composition for treating E. coli infection using the same

O157:H7과 같은 Escherichia.coli(대장균 균주)들은 사람과 동물에서 매우 낮은 농도에도 불구하고 심각한 장염과 설사 구토를 동반하는 질병을 유발하는 매우 중요한 감염원으로 작용한다. 또한 사람이나 특히나 동물에서의 항생제 남용의 결과로, E.coli 0157:H7은 다양한 항생제에 내성을 나타내는 것 또한 잘 알려진 사실이다. 이러한 항생제 내성인자를 가지는 대장균의 출현은 사람뿐만 아니라 동물의 건강을 위협하는 주요 인자로 여겨지고 있다. 이러한 항생제 내성 E.coli 0157:H7의 출현은 감염시 항생제 내성 때문에 치료가 불가능하고 또한 현재까지 E.coli 0157:H7에 대한 백신 또한 개발되어 있지 않은 현실이다.Escherichia.coli (Escherichia coli strains) such as O157:H7 act as a very important source of infection in humans and animals, causing severe enteritis and diseases accompanied by diarrhea and vomiting despite very low concentrations. It is also well known that E. coli 0157:H7 exhibits resistance to various antibiotics as a result of antibiotic abuse in humans and especially in animals. The emergence of E. coli having these antibiotic resistance factors is considered to be a major factor that threatens the health of animals as well as humans. The emergence of antibiotic-resistant E. coli 0157:H7 is a reality that cannot be treated due to antibiotic resistance during infection, and a vaccine against E. coli 0157:H7 has not been developed until now.

이러한 맥락에서 박테리오파아지(Bacteriophages)는 숙주 특이성이 매우 높기에 이러한 병원성 세균에 대한 효과적인 대책의 하나로 부각되고 있다. 하지만 특정 세균에만 작용하는 높은 숙주 특이성 때문에 박테리오파아지의 적용 또한 한계가 드러내고 있다. 다양한 숙주 영역을 나타내는 박테리오파아지의 분리 및 개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 이러한 항생제 내성이 높은 E.coli 0157:H7균주에 특이적으로 작용하는 박테리오파아지의 개발 또한 매우 중요한 숙제중 하나이다. 현재까지 동물 및 사람의 분변으로부터 대장균에 특이적인 박테리오파아지의 분리를 시도한 연구 결과가 몇몇 발표되었으며 좁은 숙주 영역을 가지는 이들 파아지를 이용한 phage therapy 기술의 적용이 시도되었다. In this context, bacteriophages (Bacteriophages) are emerging as one of the effective countermeasures against these pathogenic bacteria because their host specificity is very high. However, the application of bacteriophages is also limited due to the high host specificity that acts only on specific bacteria. Studies on the isolation and development of bacteriophages representing various host regions are being actively conducted, and the development of bacteriophages that specifically act on the E. coli 0157:H7 strain with high antibiotic resistance is also a very important task. To date, several research results have been published that attempted to isolate bacteriophages specific to E. coli from animal and human feces, and the application of phage therapy technology using these phages having a narrow host region was attempted.

이러한 좁은 숙주 영역의 문제를 해결하기 위하여 다양한 박테리오파아지를 혼합하여 사용하는 phage cocktail treatment의 적용이 시도되었다. 이러한 박테리오파아지를 이용한 치료법은 특정 세균 특히나 항생제에 내성을 지녀서 치료가 어렵거나 불가능한 세균의 처치법으로 중요하게 부각되고 있다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 Phage therapy 방법에 대한 많은 연구가 지속적으로 추진중이며, 특히나 이러한 박테리오파아지 치료법은 항생제의 사용을 현저히 줄여줄 수 있는 중요 방법중의 하나이다. 다양한 항생제에 내성을 가지는 슈퍼박테리아의 치료법의 일환으로 이러한 박테리오파아지 치료법은 사람 뿐 아니라 축산 산업에서도 중요하게 여겨질 것으로 전망된다.In order to solve the problem of such a narrow host region, the application of phage cocktail treatment using a mixture of various bacteriophages was attempted. Treatment using these bacteriophages is emerging as an important treatment method for bacteria that are difficult or impossible to treat because they have resistance to specific bacteria, especially antibiotics. Based on these research results, many studies on phage therapy methods are continuously being promoted, and in particular, such bacteriophage therapy is one of the important methods that can significantly reduce the use of antibiotics. As part of the treatment of super bacteria resistant to various antibiotics, such bacteriophage treatment is expected to be considered important not only in humans but also in the livestock industry.

종래의 특허문헌 KR 2014-0140698A (에세리키아 콜라이의 박테리오파아지 및 그 용도), KR 1101376 B1(대장균 또는 시겔라속 균에 특이적 사멸능을 갖는 박테리오파아지)에서도 특정 대장균에 대한 사멸능을 갖는 박테리오파아지가 발명되었으나, 박테리오파아지가 특이성을 갖는 대장균의 종류가 상이하여 E.coli Sw1 또는 E.coli O157:H7l에 사멸능을 갖는 박테리오파아지에 대해서는 아직 개발되어 있지 않은 실정이다.Conventional Patent Documents KR 2014-0140698A (Bacteriophage of Escherichia coli and its use), KR 1101376 B1 (Bacteriophage having a specific killing ability to Escherichia coli or Shigella genus) Bacterio having a killing ability against a specific E. coli Although the phage was invented, the type of E. coli having the specificity of the bacteriophage is different, so that the bacteriophage having the ability to kill E.coli Sw1 or E.coli O157:H71 has not yet been developed.

많은 대장균들은 최근에 다양한 항생제에 내성을 나타내어 사람뿐 아니라 동물의 건강에 매우 위협적인 존재로 나타나기 시작하였다. 이러한 항생제 내성을 나타내는 대장균뿐 아니라 다른 세균들 또한 다양한 항생제에 저항성을 나타내고 있는 현실이다. 이러한 항생제 내성 세균에 대한 특별한 대책이 없는 바, 이에 대한 대책 마련에 대한 다양한 연구가 진행되고 있다. 그 중의 하나로서 박테리오파아지의 다양성에 근거하여 박테리오파아지를 이용하는 방법이 매우 중요하게 부각되고 있다.Many Escherichia coli have recently become resistant to various antibiotics, and have begun to appear as a threat to the health of animals as well as humans. The reality is that not only E. coli, which exhibits such antibiotic resistance, but also other bacteria are also resistant to various antibiotics. There is no special countermeasure against such antibiotic-resistant bacteria, and various studies are being conducted on preparation of countermeasures. As one of them, a method of using bacteriophages based on the diversity of bacteriophages has been highlighted as very important.

상기 문제점을 해결하고자 돼지유래 항생제(ampicillin) 내성 대장균의 하나인 Sw1 및 O157:H7l에 매우 특이적으로 반응하는 박테리오파아지 EcSw를 개발하였다.In order to solve the above problems, a bacteriophage EcSw that responds very specifically to Sw1 and O157:H71, which is one of pig-derived antibiotic (ampicillin) resistant E. coli, was developed.

본 발명은 대장균에 대해 특이적 사멸능을 갖는 박테리오파아지 EcSw (KCTC 12989BP)을 제공한다.The present invention provides a bacteriophage EcSw (KCTC 12989BP) having a specific killing ability against E. coli.

상기 대장균은 ampicillin에 대해 내성을 갖는 것일 수 있다.The E. coli may be resistant to ampicillin.

상기 대장균은 E. coli Sw1 또는 E. coli O157:H7l 일 수 있다.The E. coli may be E. coli Sw1 or E. coli O157:H71.

상기 박테리오파아지는 서열번호1로 표시되는 holin 유전자 및 lysin 유전자를 포함할 수 있다.The bacteriophage may include a holin gene and a lysin gene represented by SEQ ID NO: 1.

본 발명은 박테리오파아지 EcSw (KCTC 12989BP) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 돼지 대장균 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating E. coli infection in pigs containing bacteriophage EcSw (KCTC 12989BP) or a culture thereof as an active ingredient.

본 발명은 박테리오파아지 EcSw (KCTC 12989BP) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제을 제공한다.The present invention provides a feed additive containing bacteriophage EcSw (KCTC 12989BP) or a culture thereof as an active ingredient.

본 발명인 박테리오파아지 EcSw는 돼지 대장균 감염증의 원인체인 대장균에 특이하게 반응하는 박테리오파아지로서, 특히 ampiciline에 저항성을 나타내는 대장균의 사멸을 유도하여 돼지 대장균 감염증 치료에 효과적으로 사용될 수 있다. Bacteriophage EcSw of the present invention is a bacteriophage that responds specifically to E. coli, which is the cause of E. coli infection in pigs, and can be effectively used to treat E. coli infection in pigs by inducing the death of E. coli, which is particularly resistant to ampiciline.

또한 박테리오파아지 EcSw로부터의 holin 및 lysin 단백질을 이용한 치료법 개발 또한 가능할 것으로 예상되며, 위에서 증명한 ampicillin 저항성을 나타내는 E. coli.Sw1 또는 E. coli O157:H7l 을 이용한 백신 개발 또한 가능할 것으로 예상된다.In addition, the development of a treatment using holin and lysin proteins from the bacteriophage EcSw is also expected to be possible, and E. coli showing ampicillin resistance demonstrated above. Vaccine development using Sw1 or E. coli O157:H71 is also expected to be possible.

도1은 박테리오파아지 EcSw의 전자현미경 이미지이다.
도2는 박테리오파아지 EcSw의 성장 곡선이다.
도3은 박테리오파아지 EcSw의 안정성 검사 결과이다(temperature (A), pH (B), Ca²⁺(C), and Mg²⁺ions(D))
도4는 박테리오파아지 EcSw의 E. coli Sw1에 대한 반응성 검사 결과이다.
도5는 박테이오파아지 EcSw의 E. coli 0157:H7에 대한 반응성 검사 결과이다.
도6은 박테리오파아지 EcSw의 숙주세균인 E. coli.Sw1 대장균에 대한 항생제 내성 및 감수성 검사 결과이다.
도7 및 도8은 박테리오파아지 EcSw에 의한 마우스 생존율 테스트 결과이다.
도9는 박테리오파아지 EcSw의 용균활성(lytic activity)를 나타내는 단백질인 holin 단백질과 lysin 단백질의 유전자 분석결과이다.1 is an electron microscope image of the bacteriophage EcSw.
Figure 2 is a growth curve of the bacteriophage EcSw.
Figure 3 is a stability test result of bacteriophage EcSw (temperature ( A ), pH ( B ), Ca ²⁺ ( C ), and Mg ²⁺ ions ( D ))
Figure 4 is a bacteriophage EcSw reactivity test results for E. coli Sw1.
Figure 5 is a bacteriophage EcSw of E. coli 0157: H7 reactivity test results.
Figure 6 is a host bacterium of the bacteriophage EcSw E. coli. Sw1 Antibiotic resistance and susceptibility test results for E. coli.
7 and 8 are mouse survival rate test results by bacteriophage EcSw.
9 is a gene analysis result of holin protein and lysin protein, which are proteins showing the lytic activity of the bacteriophage EcSw.

본 발명은 대장균에 대해 특이적 사멸능을 갖는 박테리오파아지 EcSw (KCTC 12989BP)에 대한 것이다.The present invention relates to a bacteriophage EcSw (KCTC 12989BP) having a specific killing ability against E. coli.

본 발명은 박테리오파아지 EcSw(KCTC 12989BP) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 돼지 대장균 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다.The present invention relates to a bacteriophage EcSw (KCTC 12989BP) or a pharmaceutical composition for preventing or treating porcine E. coli infection containing a culture thereof as an active ingredient.

본 발명은 박테리오파아지 EcSw (KCTC 12989BP) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제에 대한 것이다.The present invention relates to a feed additive containing bacteriophage EcSw (KCTC 12989BP) or a culture thereof as an active ingredient.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

지속적인 설사 소견을 보이는 인천지역의 양돈장에 있는 자돈으로부터 분변 1g을 채취하여 이 샘플로부터 대장균을 분리하였다. 여러 가지 다른 생화학적 검사결과뿐 아니라 유전자 분석을 통하여 이 세균이 대장균 중 Escherichia. coli 0157:H7임이 확정되었다. 또한 대장균과 매우 비슷한 생화학적 성상을 지니는 Shigella와의 분별을 위하여, Kovac's reagent (25 ml of concentrated HCl, 75 ml of Amyl alcohol, 5g of paradimethylamino-benzaldehyde)로 처리하였고, 그 결과 대장균으로 확정되었다. Escherichia coli was isolated from this sample by collecting 1 g of feces from piglets in a pig farm in Incheon with persistent diarrhea. Genetic analysis as well as various other biochemical test results showed that this bacterium was identified as Escherichia in Escherichia. coli 0157:H7 confirmed. In addition, for separation from Shigella having a biochemical property very similar to E. coli, it was treated with Kovac's reagent (25 ml of concentrated HCl, 75 ml of Amyl alcohol, 5 g of paradimethylamino-benzaldehyde), and as a result, it was confirmed as E. coli.

그리고 특정 대장균에 기생하는 박테리오파아지를 분리하여 이를 EcSw라고 명명하고 이에 대한 특성 분석을 실시하였다. And by separating the bacteriophage parasitic on a specific E. coli, it was named EcSw, and the characteristics were analyzed.

박테리오파아지 EcSw의 형태학적 분석 Morphological analysis of bacteriophage EcSw

박테리오파아지 EcSw의 형태 분석을 위하여 전자현미경 (SEM)을 이용하여 도1의 이미지를 얻을 수 있었다. The image of Figure 1 was obtained using an electron microscope (SEM) for the morphology analysis of the bacteriophage EcSw.

박테리오파아지 EcSw의 성장곡선 Growth curve of bacteriophage EcSw

박테리오파아지 EcSw의 증식성상 분석을 위하여 도2과 같은 성장 곡선값을 얻었다. 이 박테리오파아지 EcSw는 배향후 약 20분을 기준으로 증식이 빠르게 일어났음을 알 수 있다. For the analysis of the proliferative properties of the bacteriophage EcSw, a growth curve value as shown in FIG. 2 was obtained. This bacteriophage EcSw can be seen that the proliferation occurred rapidly based on about 20 minutes after orientation.

박테리오파아지 EcSw의 안정성평가Stability evaluation of bacteriophage EcSw

박테리오파아지 EcSw에 대해 안정성 검사를 실시하였다. 이러한 검사는 박테리오파아지 EcSw의 bio-control agent로서의 가능성을 검사하는 것으로, 이 박테리오파아지에 대해서 4개의 항목에 대하여 실시하였다. 안정성검사는 구체적으로 temperature (A), pH (B), Ca²⁺(C), and Mg²⁺ions(D)에 대하여 실시하였고, 그 결과는 도3과 같다.Stability tests were performed on the bacteriophage EcSw. This test is to examine the potential as a bio-control agent of the bacteriophage EcSw, it was carried out for four items for this bacteriophage. The stability test was specifically carried out for temperature ( A ), pH ( B ), Ca ²⁺ ( C ), and Mg ²⁺ ions ( D ), and the results are shown in FIG. 3 .

안정성평가를 실시한 결과, 온도에 대하여는 4-20℃ 사이에서 안정함을 나타내었고, 37℃에서 또한 안정성을 나타내었다. 그러나 60℃에서는 67%의 안정성 80℃에서는 완전 사멸함을 나타냈다 (도3-A). EcSw의 최적 pH는 7.0~7.5이었으며, pH 3~9 사이에서 매우 안정함을 나타내었다 (도3-B). 박테리오파아지는 Mg²⁺와같은 이온의 첨가에도 안정성을 유지하였으나 Ca²⁺이온의 첨가로는 안정성을 잃음을 나타내었다(도3-C, D). 이러한 모든 결과를 바탕으로 박테리오파아지 EcSw는 매우 안정한 파아지임을 알게되었다. As a result of carrying out the stability evaluation, it showed stability between 4-20 °C with respect to temperature, and also showed stability at 37 °C. However, the stability of 67% at 60 °C was shown to be complete at 80 °C (Fig. 3-A). The optimal pH of EcSw was 7.0~7.5, indicating that it was very stable between pH 3~9 (Fig. 3-B). Bacteriophage maintained stability even with the addition of ions such as Mg ²⁺ , but lost stability with the addition of Ca ²⁺ ions (Fig. 3-C, D). Based on all these results, it was found that the bacteriophage EcSw is a very stable phage.

박테리오파아지 EcSw의 숙주영역평가Host region evaluation of bacteriophage EcSw

박테리오파아지 EcSw가 어떤 세균에 작용하는지에 대한 숙주영역을 평가를 실시하였다. 그 결과, 하기에 기재된 표1에 기재된 바와 같이 박테리오파아지는 특정 대장균인 E. coli Sw1, Escherichia coli 0157:H7, 및 Escherichia fergusonii Sw2 에 매우 특이적으로 반응함을 알 수 있었다.The host region for the bacteriophage EcSw acting on which bacteria was evaluated. As a result, as described in Table 1 described below, the bacteriophage was found to react very specifically to specific E. coli Sw1, Escherichia coli 0157:H7, and Escherichia fergusonii Sw2.

박테리오파아지 EcSw의 숙주세균 (Host bacteria of the bacteriophage EcSw ( E. coliE. coli )에 대한 사멸능력 평가 ) to evaluate the ability to kill

박테리오파아지 EcSw의 특정 숙주세균인 E. coli Sw1에 대한 반응성 검사를 실시하였다. E. coli Sw1을 37℃에서 박테리오파아지 EcSw(MOIs 0.01, 0.1, 1 및 10)와 동시에 배양하였다. E. coli Sw1의 성장 곡선은 6시간동안 매시간마다 흡광도(OD₆₂₀)를 측정하여 작성하였다. A specific host bacterium, E. coli Sw1, of the bacteriophage EcSw was tested for reactivity. E. coli Sw1 was co-cultured with bacteriophage EcSw (MOIs 0.01, 0.1, 1 and 10) at 37°C. The growth curve of E. coli Sw1 was prepared by measuring absorbance (OD ₆₂₀ ) every hour for 6 hours.

그 결과 도4과 같이 EcSw 박테리오파아지의 첨가로 숙주 세균의 사멸도가 매우 높아짐을 알 수 있었고, 박테리오파아지 감염후 약 1시간대부터 사멸도가 나타냄을 알 수 있었다. 또한 이러한 사멸 능력은 감염후 6시간이 지나도 유지함을 알 수 있었고, 박테리오파아지의 농도를 높일수록 사멸도는 높아짐을 알 수 있었다. As a result, it was found that the degree of death of the host bacteria was very high by the addition of EcSw bacteriophage as shown in FIG. 4, and it was found that the degree of death appeared from about 1 hour after infection with the bacteriophage. In addition, it was found that this killing ability was maintained even after 6 hours after infection, and it was found that the higher the concentration of bacteriophage, the higher the degree of death.

또한 박테이오파아지EcSw의 특정 숙주세균인 E. coli 0157:H7에 대한 반응성 검사를 실시하였고, 그 결과는 도5에 도시하였다. In addition, the bacteriophage EcSw was tested for reactivity against E. coli 0157:H7, a specific host bacterium, and the results are shown in FIG. 5 .

본 검사를 위해 2 × 10⁷CFU/ ml E. coli Sw1 및 E. coli O157:H7 를 2 × 10⁷ PFU/ml의 박테리오파아지 EcSw (MOI-1)로 처리하였다. E. coli Sw1, E. coli O157:H7 및 박테리오파아지 EcSw을 37℃ 에서 12 시간 배양하고 매 2시간마다 측정하였다. For this test, 2 × 10 ⁷ CFU/ml E. coli Sw1 and E. coli O157:H7 were treated with 2 × 10 ⁷ PFU/ml of bacteriophage EcSw (MOI-1). E. coli Sw1, E. coli O157:H7 and bacteriophage EcSw were cultured at 37° C. for 12 hours and measured every 2 hours.

그 결과, 박테리오파아지 EcSw가 E. coli 0157:H7에 대해 사멸능력을 갖고 있음을 알 수 있었다.As a result, it was found that the bacteriophage EcSw has the ability to kill E. coli 0157:H7.

숙주 대장균의 항생제 내성평가 Antibiotic resistance evaluation of host E. coli

박테리오파아지 EcSw의 숙주세균인 E. coli.Sw1 대장균이 어떤 항생제에 내성 및 감수성을 나타내는지에 대한 평가를 실시하였다. E. coli, a host bacterium of the bacteriophage EcSw. Sw1 E. coli was evaluated for resistance and sensitivity to which antibiotics.

E. coli Sw1 (0.2 - OD₆₂₀)에 항생제(ampicillin, tetracycline, penicillin 및 kanamycin)를 처리하고 각각 박테리오파아지 EcSw (최종농도 100 ug/ul, MOI-1)를 처리하였다. E. coli Sw1 (0.2 - OD ₆₂₀ ) was treated with antibiotics (ampicillin, tetracycline, penicillin and kanamycin), and each bacteriophage EcSw (final concentration 100 ug/ul, MOI-1) was treated.

그 결과, 아래 도6에서 나타나듯이 E. coli Sw1은 ampicillin에 강한 내성을 나타냄을 알 수 있었고, kanamycin, tetracyclin, penicillin에는 감수성을 나타냄을 알 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 6 below, it was found that E. coli Sw1 exhibited strong resistance to ampicillin, and showed sensitivity to kanamycin, tetracyclin, and penicillin.

또한 항생제에 대한 평가와 동시에 항생제와 박테리오파아지 EcSw 를 같이 처리했을 때는 어떤 결과를 나타내는지 평가하였다. 도6에서 나타내듯이 감수성이 있는 항생제 뿐 아니라 내성을 나타내는 ampicillin과 함께 박테리오파아지 EcSw를 처리하면 모두 똑같이 E. coli Sw1의 강한 사멸이 나타남을 알 수 있었다.In addition, when the antibiotic and the bacteriophage EcSw were treated together at the same time as the evaluation of the antibiotic, what kind of result was evaluated. As shown in FIG. 6 , it was found that when bacteriophage EcSw was treated together with ampicillin showing resistance as well as sensitive antibiotics, strong killing of E. coli Sw1 was equally evident.

마우스 생존율 테스트(mouse survival test ( In vivo in vivo study in mice (study in mice ( E. coli E. coli O157:H7))O157:H7))

E. coli Sw1 과 O157:H7 치사율을 측정한 결과 마우스당 3 × 10⁹ CFU(in 200 ul) 인 것으로 밝혀졌다. 이에 E. coli Sw1 및 E. coli O157:H7 를 20 ml LB broth에서 배양하였다. 이후 OD₆₂₀가 0.5에 이를 때, E. coli Sw1 과 O157:H7 을 수집하여 PBS로 옮겼다. 2개의 그룹(각각 마우스 5마리)에 박테리오파아지 EcSw (3×10¹¹PFU per mice) (MOI-100) 또는 negative control에 PBS를 접종하였다. 그 결과 E. coli O157:H7 균주로 감염되었으나 박테리오파아지 EcSw를 접종한 마우스중 40%가 회복되었다(도7, 도8참조).As a result of measuring the lethality of E. coli Sw1 and O157:H7, it was found to be 3 × 10 ⁹ CFU (in 200 ul) per mouse. Accordingly, E. coli Sw1 and E. coli O157:H7 were cultured in 20 ml LB broth. Then, when OD ₆₂₀ reached 0.5, E. coli Sw1 and O157:H7 were collected and transferred to PBS. Bacteriophage EcSw (3×10 ¹¹ PFU per mice) (MOI-100) or PBS was inoculated in two groups (5 mice each) as a negative control. As a result, although infected with the E. coli O157:H7 strain, 40% of the mice inoculated with the bacteriophage EcSw were recovered (see FIGS. 7 and 8).

holin과 lysin 단백질의 유전자 분석Genetic analysis of holin and lysin proteins

박테리오파아지의 용균활성(lytic activity)를 나타내는 단백질인 holin 단백질과 lysin 단백질의 유전자 분석 및 이들의 다른 대장균 유래 단백질과의 유전자 비교 분석을 실시하였다. 유전자 분석을 위하여 2개의 universal bacterial primers, 27F (5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R (5'-GGTACCTTGTTACGACTT-3')를 이용하여 16s 리보조멀 RNA 유전자을 증폭하여 유전자 분석을 실시하였다. 다음은 유전자 분석에 대한 결과물이다.Genetic analysis of holin protein and lysin protein, which are proteins showing lytic activity of bacteriophage, and gene comparison analysis of these proteins with other E. coli-derived proteins were performed. For gene analysis, two universal bacterial primers, 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') and 1492R (5'-GGTACCTTGTTACGACTT-3') were used to amplify the 16s ribosomal RNA gene and perform gene analysis. The following is the result of genetic analysis.

유전자 분석 결과(서열번호 1 참조), EcSw 박테리오파아지의 lytic genes인 holin 및 lysin은 다른 Myoviridae family에 속한 박테리오파아지의 유전자와 매우 높은 상동성을 나타내어, Enterobacteria phages HK630, DE3, Lambda와 99%, CUS-3와 98%, mEp 235, IME10, sf6와 97% 상동성을 나타내었다.As a result of genetic analysis (see SEQ ID NO: 1), holin and lysin, the lytic genes of EcSw bacteriophage, exhibit very high homology with genes of bacteriophages belonging to other Myoviridae family, Enterobacteria phages HK630, DE3, Lambda 99% and CUS 98% with -3 and 97% homology with mEp 235, IME10, and sf6.

<110> ISIN TECHNOLOGY CO.,LTD. <120> Bacteriophage with E. Coli specificity and Composition for Treating Swine E. Coli Infection Using the Same <130> P1220-477 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 784 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Bacteriophage EcSw <400> 1 atgaagatgc cagaaaaaca tgacctgttg gccgccattc tcgcggcaaa ggaacaaggc 60 atcggggcaa tccttgcgtt tgcaatggcg taccttcgcg gcagatataa tggcggtgcg 120 tttacaaaaa cagtaatcga cgcaacgatg tgcgccatta tcgcctggtt cattcgtgac 180 cttctcgact tcgccggact aagtagcaat ctcgcttata taacgagcgt gtttatcggc 240 tacatcggta ctgactcgat tggttcgctt atcaaacgct tcgctgctaa aaaagccgga 300 gtagaagatg gtagaaatca ataatcaacg taaggcgttc ctcgatatgc tggcgtggtc 360 ggagggaact gataacggac gtcagaaaac cagaaatcat ggttatgacg tcattgtagg 420 cggagagcta ttcactgatt actccgatca ccctcgcaaa cttgtcacgc taaacccaaa 480 actcaaatca acaggcgccg gacgctacca gcttctttcc cgttggtggg atgcctaccg 540 caagcagctt ggcctgaaag acttctctcc gaaaagtcag gacgctgtgg cattgcagca 600 gattaaggag cgtggcgctt tacctatgat tgatcgtggt gatatccgtc aggcaatcga 660 ccgttgcagc aatatctggg cttcactgcc gggcgctggt tatggtcagt tcgagcataa 720 ggctgacagc ctgattgcaa aattcaaaga agcgggcgga acggtcagag agattgaggt 780 atga 784 <110> ISIN TECHNOLOGY CO.,LTD. <120> Bacteriophage with E. Coli specificity and Composition for Treating Swine E. Coli Infection Using the Same <130> P1220-477 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 784 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Bacteriophage EcSw <400> 1 atgaagatgc cagaaaaaca tgacctgttg gccgccattc tcgcggcaaa ggaacaaggc 60 atcggggcaa tccttgcgtt tgcaatggcg taccttcgcg gcagatataa tggcggtgcg 120 tttacaaaaa cagtaatcga cgcaacgatg tgcgccatta tcgcctggtt cattcgtgac 180 cttctcgact tcgccggact aagtagcaat ctcgcttata taacgagcgt gtttatcggc 240 tacatcggta ctgactcgat tggttcgctt atcaaacgct tcgctgctaa aaaagccgga 300 gtagaagatg gtagaaatca ataatcaacg taaggcgttc ctcgatatgc tggcgtggtc 360 ggagggaact gataacggac gtcagaaaac cagaaatcat ggttatgacg tcattgtagg 420 cggagagcta ttcactgatt actccgatca ccctcgcaaa cttgtcacgc taaacccaaa 480 actcaaatca acaggcgccg gacgctacca gcttctttcc cgttggtggg atgcctaccg 540 caagcagctt ggcctgaaag acttctctcc gaaaagtcag gacgctgtgg cattgcagca 600 gattaaggag cgtggcgctt tacctatgat tgatcgtggt gatatccgtc aggcaatcga 660 ccgttgcagc aatatctggg cttcactgcc gggcgctggt tatggtcagt tcgagcataa 720 ggctgacagc ctgattgcaa aattcaaaga agcgggcgga acggtcagag agattgaggt 780 atga 784

Claims

Bacteriophage EcSw (KCTC 12989BP) having a specific killing ability against E. coli

The method of claim 1,
The E. coli is a bacteriophage, characterized in that it has resistance to ampicillin.

The method of claim 1,
The E. coli is E. coli Sw1 or E. coli O157: Bacteriophage, characterized in that H71.

According to claim 1,
The bacteriophage bacteriophage EcSw, characterized in that it comprises a holin gene and a lysin gene represented by SEQ ID NO: 1.

A pharmaceutical composition for preventing or treating porcine E. coli infection comprising the bacteriophage or a culture thereof of any one of claims 1 to 3 as an active ingredient.

A feed additive containing the bacteriophage of claim 1 or a culture thereof as an active ingredient.