KR20220085428A - Method for Quantitative Analysis of Taurolidine by Using HPLC - Google Patents
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Abstract
본 발명은 적어도 정량 분석 시간동안 타우로리딘이 타우린아미드로 가수 분해되는 것을 억제하는 분석 용매를 제조하는 분석 용매 제조단계와, 상기 분석 용매에 상기 타우로리딘을 함유한 분석 시료를 혼합하여 분석 용액을 제조하는 분석 용액 제조단계 및 HPLC를 이용하여 상기 분석 용액의 타우로리딘의 함량을 정량 분석하는 타우로리딘 정량 분석단계를 포함하는 타우로리딘의 정량분석 방법을 개시한다.The present invention provides an analysis solvent preparation step of preparing an analysis solvent that inhibits hydrolysis of taurolidine to taurinamide for at least a quantitative analysis time, and an analysis solution by mixing the analysis sample containing the taurolidine with the analysis solvent Disclosed is a quantitative analysis method of taurolidine, which includes a step of preparing an assay solution for preparing a taurolidine and a quantitative analysis step of taurolidine quantitative analysis of the content of taurolidine in the assay solution using HPLC.
Description
본 발명은 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 의약품 원료인 타우로리딘의 정량 분석 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for quantitative analysis of taurolidine, a pharmaceutical raw material, using high-performance liquid chromatography.
타우로리딘(Taurolidine)은 아미노타우린 유도체이며, 감염 예방을 위한 약품으로서 전세계적으로 중요한 위치를 차지하고 있는 약물이다. 타우로리딘은 박테리아 세포벽 구조와의 생화학반응을 통하여 박테리아를 사멸시키며 방출된 독소(endotoxin)를 불활성화시키는 작용을 한다. 또한, 타우로리딘은 일정 시간이 지나면 인체에 무해한 타우린(Taurine)과 물로 전환되는 특성이 있는 매우 안전한 약물로 알려져 있다., 또한 타우로리딘은 최근에는 항암 효과 등에 다방면에서 의약품 원료로 사용 가능성에 대한 연구가 진행되고 있는 약물이다.Taurolidine is an aminotaurine derivative and is a drug that occupies an important position worldwide as a drug for preventing infection. Taurolidine kills the bacteria through a biochemical reaction with the bacterial cell wall structure and inactivates the released endotoxin. In addition, taurolidine is known as a very safe drug that has the property of being converted into taurine and water, which are harmless to the human body after a certain period of time. In addition, taurolidine has recently been shown to be used as a raw material for pharmaceuticals in various fields such as anti-cancer effect. It is a drug that is being researched.
타우로리딘은 국내에서 주사제의 형태로 판매되고 있으며, 삼진제약이 가이스트리히제약(Giestlich Pharma)으로부터 기술 제휴 및 원료 공급을 받아 1988년부터 식약처 허가를 받아 삼진타우로린™ 주사2%의 제품으로 시판되고 있다.Taurolidine is sold in the form of injections in Korea, and Samjin Pharmaceutical received technical cooperation and raw material supply from Giestlich Pharma, and obtained approval from the Ministry of Food and Drug Safety in 1988. It is marketed.
타우로리딘의 원료 의약품 합성은 많은 업체들이 시도하고 있으며, 원료 의약품으로 사용 허가를 득하기 위해서는 품질을 지속적으로 보증할 수 있는 자료를 작성해야 한다. 이에 따라 의약품 원료인 타우로리딘의 정량법의 개발은 의약품 개발에 있어 매우 중요한 과제이다.Many companies are trying to synthesize taurolidine as a drug substance, and in order to obtain permission for use as a drug substance, data that can continuously guarantee quality must be prepared. Accordingly, the development of a quantitative method for taurolidine, a raw material for pharmaceuticals, is a very important task in drug development.
일반적으로 원료 의약품은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여 정량 분석을 실시하고 있다. 그러나, 타우로리딘은 아래의 화학식 1과 같이 발색단 (Chromophore)이 존재하지 않아 HPLC로 정량 분석하는 것이 어렵다고 알려져 있다.In general, drug substance is quantitatively analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC). However, it is known that taurolidine is difficult to quantitatively analyze by HPLC because there is no chromophore as shown in Chemical Formula 1 below.
[화학식 1][Formula 1]
현재까지 개발된 타우로리딘을 정량 분석하는 방법은 전위차 적정 (potentiometric titration), 타우로리딘을 유도체화 시켜 HPLC로 정량하는 방법이 알려지고 있다.Methods for quantitative analysis of taurolidine developed so far are known as potentiometric titration, derivatization of taurolidine and quantification by HPLC.
전위차 적정법은 시험이 용이하여 원료 의약품의 정량에 많이 사용되는 방법이나, 특이성 (Specificity)에 문제가 있어 타우로리딘의 정량 분석에는 적절하지 않다는 사실을 본 연구자들에 의해 확인되었다.Potentiometric titration is a method widely used for quantification of drug substance because it is easy to test, but it has been confirmed by the researchers that it is not suitable for quantitative analysis of taurolidine due to a problem in specificity.
타우로리딘은 발색단이 존재하지 않아 통상적인 230nm 이상의 파장에서는 흡광도를 가지지 않아 정량 분석이 어려운 것으로 알려지고 있다. 따라서 타우로리딘을 정량 분석하는 방법으로, 타우로리딘을 5-(디메칠아미노)나프탈렌-1-술포닐 클로라이드 (5-(dimethyamino)naphthalene-1-sulfonyl chloride, Dansyl chloride) 혹은 7-클로로-4-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸 클로라이드 (7-chloro-4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole chloride, NBD-HCl)과 같은 발색단과 반응시킨 후에 자외선 검출기 (UV detector)나 형광 검출기(Fluorescence detector)로 정량하는 분석 전 유도체화 HPLC 분석 (Pre-column derivatization & HPLC assay)법이 사용되고 있다. 분석 전 유도체화 HPLC 분석법은 분석 시료를 제조하는데 상당한 시간 및 비용이 소요되며, 유도체화 반응을 조절하는데 용이하지 않은 단점이 따르게 되며, 분석의 오차를 유발시키는 원인이 되기도 한다.Taurolidine is known to be difficult to quantitatively analyze because it does not have a chromophore and does not have absorbance at a wavelength of 230 nm or more. Therefore, as a method for quantitative analysis of taurolidine, taurolidine is converted to 5-(dimethylamino)naphthalene-1-sulfonyl chloride (5-(dimethyamino)naphthalene-1-sulfonyl chloride, Dansyl chloride) or 7-chloro- After reacting with a chromophore such as 4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole chloride (7-chloro-4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole chloride, NBD-HCl), an ultraviolet detector ( A pre-column derivatization & HPLC assay method is used before analysis, which is quantified with a UV detector) or a fluorescence detector. The derivatization HPLC method before analysis takes considerable time and cost to prepare an analysis sample, and it is not easy to control the derivatization reaction, which is followed by disadvantages, and it is also a cause of inducing analysis errors.
한편, 타우로리딘은 230nm 이하의 파장에서는 일정 흡광도를 가지게 되지만, 분석에 사용되는 분석 용매들도 흡광도를 가지게 되어 분석 중 간섭 현상에 의해 정확한 정량이 불가능하게 하는 요인으로 작용하게 된다. On the other hand, taurolidine has a certain absorbance at a wavelength of 230 nm or less, but the analysis solvents used for the analysis also have absorbance, which makes accurate quantification impossible due to interference during analysis.
또한, 타우로리딘을 HPLC로 분석하기 위해서는 분자의 극성 차이에 의해 분석 대상 물질을 분리하는 역상 크로마토그래피 (Reversed-phase chromatography)를 사용하게 되는데, 이때 분석 용매로서 유기 용매와 물을 적절히 혼합하여 이동상을 제조하여 사용하게 된다. In addition, in order to analyze taurolidine by HPLC, reversed-phase chromatography is used to separate analytes based on the difference in molecular polarity. is manufactured and used.
다만, 타우로리딘은 수용액내에서 매우 빠르게 분해되어 분해 산물인 타우린아미드로 변환될 수 있다. 즉, 타우로리딘은 수용액에서 불안정하여 가수 분해에 의하여 타우린아미드로 변환되면서 오차를 유발하여 정량 분석의 정확성을 저하시킬 수 있다.However, taurolidine can be very rapidly decomposed in aqueous solution and converted into a decomposition product, taurinamide. That is, taurolidine is unstable in aqueous solution and is converted to taurinamide by hydrolysis, thereby causing an error, thereby reducing the accuracy of quantitative analysis.
본 발명은 타우로리딘의 분해를 억제시킬 수 있는 분석 용매를 타우로리딘이 함유된 분석 시료와 혼합하여 분석 용액을 제조함으로써 정량 분석의 정확도를 증가시킬 수 있는 타우로리딘의 정량 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention provides a method for quantitative analysis of taurolidine, which can increase the accuracy of quantitative analysis by mixing an analysis solvent capable of inhibiting the decomposition of taurolidine with an analysis sample containing taurolidine to prepare an analysis solution aim to do
또한, 본 발명은 분석 용액에 함유된 타우로리딘에 발색단을 결합시키는 유도체화 공정을 생략하고 분석하여 정량 분석을 신속하게 진행할 수 있는 타우로리딘의 정량 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.Another object of the present invention is to provide a method for quantitative analysis of taurolidine in which the derivatization process of binding a chromophore to taurolidine contained in an analysis solution is omitted and the quantitative analysis can be performed quickly.
본 발명의 타우로리딘의 정량 분석 방법은 타우로리딘의 가수 분해를 억제시키는 분석 용매에 상기 타우로리딘이 함유된 분석 시료를 혼합하여 제조한 분석 용액에 대하여 HPLC를 이용하여 상기 타우로리딘을 정량 분석하는 것을 특징으로 한다.In the quantitative analysis method of taurolidine of the present invention, the taurolidine is analyzed using HPLC with respect to an analysis solution prepared by mixing the analysis sample containing the taurolidine with an analysis solvent that inhibits hydrolysis of taurolidine. It is characterized by quantitative analysis.
또한, 본 발명의 타우로리딘의 정량분석 방법은 적어도 정량 분석 시간동안 타우로리딘이 타우린아미드로 가수 분해되는 것을 억제하는 분석 용매를 제조하는 분석 용매 제조단계와, 상기 분석 용매에 상기 타우로리딘을 함유한 분석 시료를 혼합하여 분석 용액을 제조하는 분석 용액 제조단계 및 HPLC를 이용하여 상기 분석 용액의 타우로리딘의 함량을 정량 분석하는 타우로리딘 정량 분석단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.In addition, the quantitative analysis method of taurolidine of the present invention comprises the steps of preparing an analysis solvent that inhibits hydrolysis of taurolidine to taurinamide for at least a quantitative analysis time, and adding the taurolidine to the analysis solvent. It characterized in that it comprises an analysis solution preparation step of preparing an analysis solution by mixing an analysis sample containing
또한, 상기 분석 용매는 아세토니트릴과 물의 비율이 94:6 내지 96:4의 부피비로 혼합될 수 있다.In addition, the analysis solvent may be mixed at a volume ratio of acetonitrile and water in a volume ratio of 94:6 to 96:4.
또한, 본 발명의 타우로리딘의 정량 분석 방법은 상기 분석 용액에 함유된 상기 타우로리딘에 발색단을 결합시키는 상기 타우로리딘의 유도체화 과정을 생략하고 직접 정량 분석할 수 있다.In addition, in the quantitative analysis method of taurolidine of the present invention, the derivatization process of taurolidine in which a chromophore is bound to the taurolidine contained in the analysis solution can be omitted and quantitative analysis can be performed directly.
또한, 상기 HPLC의 분석 조건은 검출 파장 210 내지 220 nm, 컬럼 C8, 컬럼 온도 25℃, 시료온도 5℃, 유속이 0.5 내지 1.0 mL/min일 수 있다.In addition, the analysis conditions of the HPLC may be a detection wavelength of 210 to 220 nm, a column C8, a column temperature of 25°C, a sample temperature of 5°C, and a flow rate of 0.5 to 1.0 mL/min.
본 발명에 따른 타우로리딘의 정량 분석 방법은 적어도 정량 분석 시간동안 타우로리딘의 가수 분해를 억제시킬 수 있는 분석 용매를 타우로리딘이 함유된 분석 시료와 혼합하여 분석 용액을 제조함으로써 정량 분석의 정확도를 증가시킬 수 있다.The quantitative analysis method of taurolidine according to the present invention is to prepare an analysis solution by mixing an analysis solvent capable of inhibiting hydrolysis of taurolidine for at least a quantitative analysis time with an analysis sample containing taurolidine. accuracy can be increased.
본 발명에 따른 타우로리딘의 정량 분석 방법은 분석 용액에 함유된 타우로리딘에 발색단을 결합시키는 유도체화 과정을 생략하고 정량 분석을 신속하게 진행할 수 있는 효과가 있다.The quantitative analysis method of taurolidine according to the present invention has the effect of omitting the derivatization process of binding a chromophore to taurolidine contained in the analysis solution and rapidly performing quantitative analysis.
또한, 본 발명에 따른 타우로리딘의 정량 분석 방법은 타우로리딘의 정량 분석 과정에서 타우로리딘이 타우린아미드로 가수 분해되는 것을 억제하여 정량 분석의 정확성을 증가시킬 수 있다.In addition, the quantitative analysis method of taurolidine according to the present invention can increase the accuracy of quantitative analysis by inhibiting the hydrolysis of taurolidine to taurinamide in the process of quantitative analysis of taurolidine.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 타우로리딘의 정량 분석 방법에 대한 공정도이다.
도 2는 실시예의 분석 용매를 사용한 분석 용액들에 대한 타우로리딘과 타우린아미드의 정량 분석에 대한 크로마토그램이다.
도 3은 비교예의 분석 용매를 사용한 분석 용액들에 대한 타우로리딘의 정량 분석에 대한 크로마토그램이다.
도 4는 서로 다른 타우로리딘 함량을 갖는 타우로리딘 혼합 분석 용액의 타우로리딘에 대한 정량 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 타우로리딘 정량 분석 방법의 타당성을 확인하기 위하여 분석법 검증을 실시한 결과이다.
도 6은 아세토니트릴과 물의 부피비가 다른 블랭크 분석 용액에 대한 정량 분석의 크로마토그램이다.
도 7은 분석 용매의 종류에 따른 타우로리딘에 대한 정량 분석의 크로마토그램이다.1 is a flowchart of a method for quantitative analysis of taurolidine according to an embodiment of the present invention.
2 is a chromatogram of quantitative analysis of taurolidine and taurinamide for analysis solutions using the analysis solvent of Example.
3 is a chromatogram for quantitative analysis of taurolidine for analysis solutions using the analysis solvent of Comparative Example.
4 is a quantitative analysis result for taurolidine in a taurolidine mixed analysis solution having different taurolidine contents.
5 is a result of performing the assay verification to confirm the validity of the taurolidine quantitative analysis method of the present invention.
6 is a chromatogram of quantitative analysis of blank analytical solutions having different volume ratios of acetonitrile and water.
7 is a chromatogram of quantitative analysis for taurolidine according to the type of analysis solvent.
이하에서 본 발명의 실시예들에 따른 고성능 액체 크로마토그래피를 이용한 타우로리딘의 정량 분석 방법에 대하여 구체적으로 설명한다.Hereinafter, a method for quantitative analysis of taurolidine using high performance liquid chromatography according to embodiments of the present invention will be described in detail.
먼저, 본 발명의 일 실시예에 따른 타우로리딘의 정량 분석 방법을 설명한다. First, a method for quantitative analysis of taurolidine according to an embodiment of the present invention will be described.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 타우로리딘의 정량 분석 방법에 대한 공정도이다.1 is a flowchart of a method for quantitative analysis of taurolidine according to an embodiment of the present invention.
상기 타우로리딘의 정량 분석 방법은, 도 1을 참조하면, 분석 용매 제조단계(S10)와 분석 용액 제조단계(S20) 및 타우로리딘 정량 분석단계(S30)를 포함하여 이루어질 수 있다.The quantitative analysis method of taurolidine may include, with reference to FIG. 1 , an analysis solvent preparation step (S10), an analysis solution preparation step (S20), and a taurolidine quantitative analysis step (S30).
상기 타우로리딘의 정량 분석 방법은 타우로리딘을 적어도 정량 분석하는 동안 타우로리딘이 타우린아미드로 가수 분해되는 것을 억제하는 분석 용매에 타우로리딘이 함유된 분석 시료를 혼합하여 제조한 분석 용액에 대하여 타우로리딘을 HPLC를 이용하여 정량 분석하는 방법이다. 상기 타우로리딘의 정량 분석 방법은 분석 용매의 조성 조건에 의해 타우로리딘의 분해 산물인 타우린아미드의 생성이 없으며, 분석 대상 성분인 타우로리딘의 유도체화 공정을 생략하여 신속, 정확하게 정량 분석하는 방법이다.The quantitative analysis method of taurolidine is an analysis solution prepared by mixing an analysis sample containing taurolidine with an analysis solvent that inhibits hydrolysis of taurolidine to taurinamide during at least quantitative analysis of taurolidine. This is a method for quantitative analysis of taurolidine using HPLC. In the quantitative analysis method of taurolidine, there is no generation of taurinamide, a decomposition product of taurolidine, depending on the compositional conditions of the analysis solvent. way.
본 발명의 발명자들은 수용액내에서 타우로리딘이 타우린아미드로 가수 분해되는 반응 메커니즘을 면밀히 검토한 바, 분석 용매의 비율을 세밀히 조절하면 타우로리딘의 가수 분해가 억제된다는 사실을 확인하였다.The inventors of the present invention closely examined the reaction mechanism of hydrolysis of taurolidine to taurinamide in aqueous solution, and confirmed the fact that hydrolysis of taurolidine was inhibited by finely controlling the ratio of the analysis solvent.
상기 분석 용매 제조단계(S10)는 타우로리딘을 분해시켜 타우린아미드의 생성하는 것을 억제하는 분석 용매를 제조하는 단계이다. 상기 분석 용매는 적어도 정량 분석의 시간 동안 분석 용액내에서 타우로리딘이 타우린아미드로 가수 분해되는 것을 억제할 수 있다.The step of preparing the analysis solvent (S10) is a step of preparing an analysis solvent that inhibits the generation of taurinamide by decomposing taurolidine. The assay solvent is capable of inhibiting hydrolysis of taurolidine to taurinamide in the assay solution at least for the duration of the quantitative assay.
상기 분석 용매는 아세토니트릴과 물이 혼합되어 제조될 수 있다. 상기 아세토니트릴과 물의 혼합비율은 94:6 내지 96:4 부피비의 비율로 조절될 수 있다. 혼합비율이 94:6 보다 낮으면 분석 중에 타우로리딘이 가수분해되어 분해산물인 타우린아미드가 생성되어 타우로리딘의 정량성을 저하시키는 문제점이 발생하게 되며, 아세토니트릴과 물의 비율이 94:6보다 작거나 96:4 보다 크게 되면 타우로리딘 피크 위치에서 용매에 기인하는 고스트 피크 (ghost peak)가 발생하거나, 용매 피크의 간섭 현상에 의해 정량성의 저해요인으로 작용하게 된다.The analysis solvent may be prepared by mixing acetonitrile and water. The mixing ratio of acetonitrile and water may be adjusted to a ratio of 94:6 to 96:4 by volume. If the mixing ratio is lower than 94:6, taurolidine is hydrolyzed during analysis to generate taurinamide, a decomposition product, which causes a problem that lowers the quantitativeness of taurolidine, and the ratio of acetonitrile to water is 94:6 If it is smaller than or greater than 96:4, a ghost peak caused by the solvent is generated at the taurolidine peak position, or it acts as an inhibitor of quantitation due to the interference of the solvent peak.
상기 분석 용액 제조단계(S20)는 분석 용매에 분석 시료를 혼합하여 분석 용액을 제조하는 단계이다. 상기 분석 시료는 타우로리딘이 혼합된 원료 의약품일 수 있다. 상기 분석 시료는 분석 시료에 포함되어 있는 타우로리딘의 개략적인 함량을 고려하여 소정 양으로 혼합될 수 있다. 상기 분석 용액 제조 단계는 HPLC 의 타우로리딘의 정량 한계를 고려하여 분석 시료를 적정한 양으로 혼합할 수 있다. 예를 들면, 상기 HPLC의 정량 한계가 1.30ⅹ10-4M일 수 있다. 따라서, 상기 분석 시료는 분석 용매에 1.30ⅹ10-4M ~ 7.0ⅹ10-2M의 혼합량 범위로 혼합될 수 있다.The analysis solution preparation step (S20) is a step of preparing an analysis solution by mixing an analysis sample with an analysis solvent. The analysis sample may be a drug substance mixed with taurolidine. The analysis sample may be mixed in a predetermined amount in consideration of the approximate content of taurolidine included in the analysis sample. In the step of preparing the analysis solution, an appropriate amount of the analysis sample may be mixed in consideration of the quantitative limit of taurolidine in HPLC. For example, the limit of quantitation of the HPLC may be 1.30×10 -4 M. Accordingly, the analysis sample may be mixed with the analysis solvent in a mixing amount ranging from 1.30×10 −4 M to 7.0×10 −2 M.
상기 타우로리딘 정량 분석단계(S30)은 HPLC를 이용하여 분석 용액의 타우로리딘의 함량을 정량 분석하는 단계이다. The quantitative analysis of taurolidine (S30) is a step of quantitatively analyzing the content of taurolidine in the analysis solution using HPLC.
상기 타우로리딘 정량 분석단계(S30)는 HPLC를 이용한 일반적인 분석 조건으로 진행될 수 있다. 또한, 상기 타우로리딘 정량 분석단계(S30)는 본 발명의 실시예에 따른 분석 용액을 이용한 타우로리딘의 정량 분석에 적합한 조건을 설정하여 진행될 수 있다. 예를 들면 상기 타우로리딘 정량 분석단계는 분석 용액의 소정량을 HPLC 샘플 장치에 주입하고, 검출파장은 210 내지220 nm, 컬럼은 C8, 컬럼 온도 25℃, 시료온도 5℃, 유속은 0.5 내지 1.0 mL/min 조건으로 정량 분석할 수 있다. 상기 HLPC의 분석 조건은 분석 장비에 따라 변경될 수 있다.The taurolidine quantitative analysis step (S30) may be performed under general analysis conditions using HPLC. In addition, the quantitative analysis of taurolidine (S30) may be performed by setting conditions suitable for quantitative analysis of taurolidine using the analysis solution according to an embodiment of the present invention. For example, in the taurolidine quantitative analysis step, a predetermined amount of the analysis solution is injected into the HPLC sample device, the detection wavelength is 210 to 220 nm, the column is C8, the column temperature is 25°C, the sample temperature is 5°C, and the flow rate is 0.5 to Quantitative analysis can be performed under the condition of 1.0 mL/min. The analysis conditions of the HPLC may be changed according to analysis equipment.
다음은 본 발명의 타우로리딘의 정량 분석 방법에 따른 분석 용액의 정량 분석 결과에 대하여 설명한다.Next, the quantitative analysis result of the analysis solution according to the quantitative analysis method of taurolidine of the present invention will be described.
본 평가에서는 다양한 조성의 분석 용액에 대한 정량 분석을 통하여 분석 용액에 대한 타우로리딘의 유도체화 공정이 없이 신속하고 정확하게 타우로리딘의 정량 분석이 가능한지 여부를 확인하였다. 즉, 분석 용액에 포함되는 타우로리딘이 정량 분석 과정에서 타우로리딘이 타우린아미드로 분해되는지 여부를 확인하였다. 또한, 본 평가에서는 분석 용매에 혼합된 타우로리딘의 함량이 정량 분석에 영향을 주는지 여부를 확인하였다. 또한, 분석 용액에 포함되는 타우로리딘의 함량에 따라 정량 분석 과정에서 타우로리딘이 타우린아미드로 분해되는지 여부를 확인하였다. 또한, 본 평가에서는 상기 타우로리딘 정량 분석 방법의 정량 분석 특이성에 대한 검증도 실시하였다. 또한, 상기 타우로리딘 정량 분석 방법의 정량 분석 조건에 대한 밸리데이션 시험을 통하여 특이성, 정확성, 직선성, 정밀성 등을 확인하였다.In this evaluation, through quantitative analysis of analysis solutions of various compositions, it was confirmed whether quantitative analysis of taurolidine was possible quickly and accurately without the derivatization process of taurolidine in the analysis solution. That is, it was confirmed whether taurolidine contained in the analysis solution was decomposed into taurinamide during the quantitative analysis process. In addition, in this evaluation, it was confirmed whether the content of taurolidine mixed in the analysis solvent affects quantitative analysis. In addition, it was confirmed whether taurolidine was decomposed into taurinamide in the process of quantitative analysis according to the content of taurolidine included in the analysis solution. In addition, in this evaluation, the quantitative analysis specificity of the taurolidine quantitative analysis method was also verified. In addition, specificity, accuracy, linearity, precision, etc. were confirmed through validation tests for quantitative analysis conditions of the taurolidine quantitative analysis method.
본 평가에서 분석 용액에 대한 정량 분석은 HPLC를 이용하여 진행하였다. HPLC는 Agilent 1260 infinity II 시스템을 사용하였다. 분석 조건은 Capcell Pak 컬럼 UG120 (5 um, 4.5 x 150 mm), 분석 시료의 유속은 0.5 mL/min으로 일정하게 유지하였다. 분석 용액 5uL를 HPLC 샘플 장치에 주입하고 컬럼 온도 25℃, 샘플온도는 5℃로 유지하면서 정량 분석을 진행하였다. 분석 용액은 검출 파장 210 nm에서 분석 용매의 조성에 따른 분석 간섭(interference)를 확인하였다.In this evaluation, quantitative analysis of the analysis solution was performed using HPLC. HPLC was performed using an Agilent 1260 infinity II system. Analysis conditions were kept constant at a Capcell Pak column UG120 (5 um, 4.5 x 150 mm), and the flow rate of the analysis sample was 0.5 mL/min. 5uL of the analysis solution was injected into the HPLC sample device, and quantitative analysis was performed while maintaining the column temperature at 25°C and the sample temperature at 5°C. Analysis interference was confirmed according to the composition of the analysis solvent at a detection wavelength of 210 nm in the analysis solution.
1. 분석 용매의 타우로리딘 분해 억제에 대한 평가1. Evaluation of the inhibition of taurolidine degradation of analytical solvents
본 평가에서는 타우로리딘과 분석 용매가 혼합된 분석 용액에서 타우로리딘이 타우린아미드로 분해되는지 여부에 대하여 평가하였다. 실시예의 분석 용매는 아세토니트릴과 물을 부피비로 95:5로 혼합하여 제조하였으며, 전체 부피가 2L가 되도록 제조하였다. 제조된 분석 용매는 블랭크 분석 용액으로 사용하였다. 또한, 분석 용매에 1,000ppm의 타우로리딘을 용해시켜 타우로리딘 혼합 분석 용액을 제조하였다. 또한, 타우로리딘 혼합 용액에 100ppm의 타우린아미드를 용해시켜 타우린아미드 혼합 분석 용액을 제조하였다. 블랭크 분석 용액과 타우로리딘 혼합 분석 용액과 타우린아미드 혼합 분석 용액에 대하여 타우로리딘과 타우린아미드에 대한 정량 분석을 진행하였다.In this evaluation, it was evaluated whether taurolidine was decomposed into taurinamide in an analysis solution in which taurolidine and an analysis solvent were mixed. The analysis solvent of Example was prepared by mixing acetonitrile and water in a volume ratio of 95:5, and the total volume was prepared to be 2L. The prepared analysis solvent was used as a blank analysis solution. In addition, a taurolidine mixed analysis solution was prepared by dissolving 1,000 ppm of taurolidine in an analysis solvent. In addition, 100 ppm of taurinamide was dissolved in a taurolidine mixed solution to prepare a taurinamide mixed analysis solution. Quantitative analysis of taurolidine and taurinamide was performed on the blank analysis solution, taurolidine mixed analysis solution, and taurinamide mixed analysis solution.
또한, 비교예의 분석 용매는 아세토니트릴과 물을 부피비로 50:50으로 혼합하여 제조하였으며, 분석 용매에 1,000ppm의 타우로리딘을 용해시켜 타우로리딘 혼합 분석 용액을 제조하였다.In addition, the analysis solvent of Comparative Example was prepared by mixing acetonitrile and water in a volume ratio of 50:50, and 1,000 ppm of taurolidine was dissolved in the analysis solvent to prepare a taurolidine mixed analysis solution.
도 2는 실시예의 분석 용매를 사용한 분석 용액들에 대한 타우로리딘과 타우린아미드의 정량 분석에 대한 크로마토그램이다. 2 is a chromatogram for quantitative analysis of taurolidine and taurinamide for analysis solutions using the analysis solvent of Example.
블랭크 분석 용액은, 도 2의 (A)에서 보는 바와 같이, 타우로리딘과 타우린아미드의 피크가 검출되지 않았다. 타우로리딘 혼합 분석 용액은, 도 2의 (B)에서 보는 바와 같이, 타우로리딘의 피크(3.4분대)만 검출되고 타우린아미드의 피트가 검출되지 않았다. 따라서, 타우로리딘은 분석 용매에서 타우린아미드로 분해되지 않은 것을 확인할 수 있다. 또한, 타우로리딘과 타우린아미드 혼합 분석 용액은 타우로리딘의 피크(3.4분대)과 타우린아미드의 피크(2.0분대)가 함께 검출되었다. In the blank analysis solution, as shown in FIG. 2A , peaks of taurolidine and taurinamide were not detected. In the taurolidine mixed analysis solution, as shown in FIG. 2B , only the taurolidine peak (3.4 component) was detected and the taurinamide pit was not detected. Therefore, it can be confirmed that taurolidine is not decomposed into taurinamide in the analysis solvent. In addition, in the mixed analysis solution of taurolidine and taurinamide, the peak of taurolidine (square 3.4) and the peak of taurinamide (square 2.0) were detected together.
도 3은 비교예의 분석 용매를 사용한 분석 용액들에 대한 타우로리딘의 정량 분석에 대한 크로마토그램이다.3 is a chromatogram for quantitative analysis of taurolidine for analysis solutions using the analysis solvent of Comparative Example.
도 3에서 보는 바와 같이, 타우로리딘 함유 분석 용액은 타우로리딘의 피크와 함께 타우린아미드의 피크도 함께 검출되고 있다. 따라서, 비교예의 분석 용매를 사용한 타우로리딘 혼합 분석 용액은 타우로리딘이 타우린아미드로 분해되는 것을 확인할 수 있다.As shown in FIG. 3 , in the analysis solution containing taurolidine, the peak of taurinamide is also detected together with the peak of taurolidine. Therefore, it can be confirmed that the taurolidine mixed analysis solution using the analysis solvent of Comparative Example decomposes taurolidine into taurinamide.
따라서, 본 평가로부터 분석 용매의 조성은 타우로리딘의 정량 분석에 영향을 주는 인자인 것을 확인할 수 있다. 본 발명의 분석 용매의 조성은 정량 분석 과정에서 분석 용액에 포함되어 있는 타우로리딘이 타우린아미드로 분해되는 것을 억제한다고 판단할 수 있다.Therefore, it can be confirmed from this evaluation that the composition of the analysis solvent is a factor affecting the quantitative analysis of taurolidine. The composition of the analysis solvent of the present invention can be determined to inhibit the decomposition of taurolidine contained in the analysis solution into taurinamide during the quantitative analysis process.
2. 타우로리딘의 함량에 따른 영향 평가.2. Evaluation of the effect of the content of taurolidine.
본 평가에서는 분석 용매에 혼합되는 타우로리딘의 함량이 타우로리딘의 정량 분석에 영향을 주는지 여부를 평가하였다.In this evaluation, it was evaluated whether the content of taurolidine mixed in the analysis solvent affects the quantitative analysis of taurolidine.
본 평가에서는 타우로리딘의 함량이 각각 200ppm, 500ppm, 800ppm, 1000ppm, 1200ppm이 되도록 복수 개의 타우로리딘 혼합 분석 용액을 제조하였다. 제조된 복수의 타우로리딘 혼합 분석 용액에 대하여 각각 타우로리딘에 대한 정량 분석을 진행하였다. In this evaluation, a plurality of taurolidine mixed analysis solutions were prepared so that the content of taurolidine was 200 ppm, 500 ppm, 800 ppm, 1000 ppm, and 1200 ppm, respectively. Quantitative analysis of taurolidine was performed for each of the prepared plural taurolidine mixed analysis solutions.
도 4는 서로 다른 타우로리딘 함량을 갖는 타우로리딘 혼합 분석 용액의 타우로리딘에 대한 정량 분석 결과이다.4 is a quantitative analysis result for taurolidine in a taurolidine mixed analysis solution having different taurolidine contents.
타우로리딘 혼합 분석 용액은, 도 4에서 보는 바와 같이, 타우로리딘의 함량에 따라 타우로리딘이 비례적으로 정량 분석되는 것을 확인할 수 있다. 본 평가에서 분석 용매에 혼합된 타우로리딘에 대한 정량 분석은 타우로리딘 함량에 대하여 양호한 직선성(R2 = 0.999)을 가지는 것을 확인하였다.In the taurolidine mixed analysis solution, as shown in FIG. 4 , it can be confirmed that taurolidine is proportionally quantitatively analyzed according to the content of taurolidine. Quantitative analysis of taurolidine mixed in the analysis solvent in this evaluation confirmed that it had good linearity (R 2 = 0.999) with respect to the taurolidine content.
도 5는 본 발명의 타우로리딘 정량 분석 방법의 타당성을 확인하기 위하여 분석법 검증을 실시한 결과이다. 5 is a result of performing the assay verification to confirm the validity of the taurolidine quantitative analysis method of the present invention.
상기에서 진행된 다양한 분석 용액에 대한 정량 분석 과정에서 본 발명의 타우로디린 정량 분석 방법에 대한 검증을 함께 진행하였다. 도 5에서 보는 바와 같이 본 발명의 타우로리딘 정량 분석 방법은 특이성, 정확성, 직선성, 정밀성 등 의약품 개발에 있어 갖추어야 할 검증 기준내에 있으며, 분석 방법 타당성이 있음을 확인하였다.In the process of quantitative analysis of various analysis solutions performed above, verification of the taurodirin quantitative analysis method of the present invention was performed together. As shown in FIG. 5 , it was confirmed that the taurolidine quantitative analysis method of the present invention is within the verification criteria to be equipped in drug development such as specificity, accuracy, linearity, and precision, and the analysis method has validity.
3. 분석 용매의 조성에 따른 영향 평가3. Evaluation of the effect of the composition of the analysis solvent
본 평가에서는 분석 용매의 조성이 타우로리딘의 정량 분석에 영향을 주는지 여부를 평가하였다.In this evaluation, it was evaluated whether the composition of the analysis solvent affects the quantitative analysis of taurolidine.
분석 용매는 아세토니트릴과 물의 비율(부피비)을 각각 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 70:30, 50:50, 30:70, 20:80, 15:85, 10:90 및 5:95가 되도록 제조하였다. 제조된 분석 용매는 블랭크 분석 용액으로 사용하여 정량 분석을 진행하였다. 이때, 블랭크 분석 용액에 대하여 타우로리딘의 피크와 타우린아미드의 피크가 존재하는 영역을 중심으로 정량 분석을 진행하였다.Analytical solvents have acetonitrile and water ratios (volume ratio) of 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 70:30, 50:50, 30:70, 20:80, 15:85, 10, respectively. :90 and 5:95 were prepared. Quantitative analysis was performed using the prepared analysis solvent as a blank analysis solution. At this time, quantitative analysis was performed with respect to the blank analysis solution focusing on the region where the taurolidine peak and the taurinamide peak exist.
도 6은 아세토니트릴과 물의 부피비가 다른 블랭크 분석 용액에 대한 정량 분석의 크로마토그램이다.6 is a chromatogram of quantitative analysis of blank analytical solutions having different volume ratios of acetonitrile and water.
도 6의 (A)에서 보는 바와 같이, 아세토니트릴과 물의 비율이 95:5인 블랭크 분석 용액은 아무런 피크도 확인되지 않았다. 그러나, 도 6의 (B), (C), (D)에서 보는 바와 같이 아세토니트릴과 물의 비율이 85:15, 70:30, 20:80인 블랭크 분석 용액은 3, 4분대에서 고스트 피크(ghost peak)가 확인되었다. 3, 4분대의 고스트 피크는 타우로리딘의 피크와 일부 겹치게 되거나 인접하여 타우로리딘의 함량을 정량 분석하는데 방해 인자로 작용할 소지가 있다.As shown in (A) of FIG. 6 , no peak was observed in the blank analysis solution in which the ratio of acetonitrile to water was 95:5. However, as shown in (B), (C) and (D) of FIG. 6 , the blank analysis solution having the ratio of acetonitrile to water of 85:15, 70:30, and 20:80 had ghost peaks ( ghost peak) was confirmed. The ghost peaks of
따라서, 아세토니트릴과 물의 비율이 본 발명의 범위를 벗어나는 분석 용매는 타우로리딘의 정량 분석에 부적절한 것으로 판단된다.Therefore, an analysis solvent having a ratio of acetonitrile to water outside the scope of the present invention is judged to be inappropriate for quantitative analysis of taurolidine.
4. 분석 용매의 종류에 따른 영향 평가4. Evaluation of the effect of different types of analysis solvents
본 평가에서는 분석 용매의 종류가 타우로리딘의 정량 분석에 영향을 주는지 여부를 평가하였다.In this evaluation, it was evaluated whether the type of analysis solvent affects the quantitative analysis of taurolidine.
비교예의 분석 용매는 아세토니트릴 대신에 에탄올과 메탄올을 사용하였으며, 물과의 혼합 비율은 부피비로 95:5로 하였다. 제조된 분석 용매에 1,000ppm의 타우로리딘을 용해시켜 타우로리딘 혼합 분석 용액을 제조하였다. 또한, 대비를 위하여 본 발명의 분석 용매(아세토니트릴:물=95:5)에 1,000ppm의 타우로리딘을 용해시켜 타우로리딘 혼합 분석 용액을 제조하였다. 제조된 타우로리딘 혼합 분석 용액에 대하여 각각 타우로리딘의 함량을 정량 분석하였다.As the analysis solvent of the comparative example, ethanol and methanol were used instead of acetonitrile, and the mixing ratio with water was 95:5 by volume. A taurolidine mixed analysis solution was prepared by dissolving 1,000 ppm of taurolidine in the prepared analysis solvent. In addition, for comparison, a taurolidine mixed analysis solution was prepared by dissolving 1,000 ppm of taurolidine in the analysis solvent of the present invention (acetonitrile:water=95:5). For the prepared taurolidine mixed analysis solution, the content of each taurolidine was quantitatively analyzed.
도 7은 분석 용매의 종류에 따른 타우로리딘에 대한 정량 분석의 크로마토그램이다. 7 is a chromatogram of quantitative analysis for taurolidine according to the type of analysis solvent.
도 7의 (A)와 (B)에서 보는 바와 같이, 에탄올 또는 메탄올이 혼합된 타우로리딘 혼합 분석 용액은 용매의 간섭 효과로 인하여 타우로리딘의 피크가 관찰되지 않았다. 반면에, 도 7의 (C)에서 보는 바와 같이, 아세토니트릴이 혼합된 타우로리딘 혼합 용액은 타우로리딘의 피크가 관찰되었다.As shown in (A) and (B) of Figure 7, the taurolidine peak was not observed in the taurolidine mixed analysis solution mixed with ethanol or methanol due to the interference effect of the solvent. On the other hand, as shown in (C) of FIG. 7 , in the taurolidine mixed solution mixed with acetonitrile, a peak of taurolidine was observed.
따라서, 에탄올 또는 메탄올은 타우로리딘의 정량 분석을 위한 용매로 적정하지 않은 것을 확인할 수 있다.Therefore, it can be confirmed that ethanol or methanol is not titrated as a solvent for quantitative analysis of taurolidine.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 의해 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.Advantages and features of the present invention, and methods for achieving them, will become apparent with reference to the embodiments described below in detail. However, the present invention is not limited by the embodiments disclosed below, but will be implemented in a variety of different forms, and only these embodiments make the disclosure of the present invention complete, and common knowledge in the art to which the present invention pertains It is provided to fully inform those who have the scope of the invention, and the present invention is only defined by the scope of the claims.
Claims (5)
상기 분석 용매에 상기 타우로리딘을 함유한 분석 시료를 혼합하여 분석 용액을 제조하는 분석 용액 제조단계 및
HPLC를 이용하여 상기 분석 용액의 타우로리딘의 함량을 정량 분석하는 타우로리딘 정량 분석단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 타우로리딘의 정량분석 방법.An analysis solvent preparation step of preparing an analysis solvent that inhibits hydrolysis of taurolidine to taurinamide for at least a quantitative analysis time;
An analysis solution preparation step of preparing an analysis solution by mixing the analysis sample containing the taurolidine with the analysis solvent; and
Quantitative analysis of taurolidine, characterized in that it comprises a taurolidine quantitative analysis step of quantitatively analyzing the content of taurolidine in the analysis solution using HPLC.
상기 분석 용매는 아세토니트릴과 물의 비율이 94:6 내지 96:4의 부피비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 타우로리딘의 정량분석 방법.3. The method of claim 1 or 2,
The analytical solvent is a quantitative analysis method of taurolidine, characterized in that the ratio of acetonitrile and water is mixed in a volume ratio of 94:6 to 96:4.
상기 분석 용액에 함유된 상기 타우로리딘에 발색단을 결합시키는 상기 타우로리딘의 유도체화 과정을 생략하고 직접 정량 분석하는 것을 특징으로 하는 타우로리딘의 정량분석 방법.3. The method of claim 1 or 2,
A method for quantitative analysis of taurolidine, characterized in that the derivatization process of taurolidine, which binds a chromophore to the taurolidine contained in the analysis solution, is omitted and quantitative analysis is performed directly.
상기 HPLC의 분석 조건은 검출 파장 210 내지 220 nm, 컬럼 C8, 컬럼 온도 25℃, 시료온도 5℃, 유속이 0.5 내지 1.0 mL/min인 것을 특징으로 하는 타우로리딘의 정량분석 방법.5. The method of claim 4,
The analysis conditions of the HPLC are a detection wavelength 210 to 220 nm, column C8, column temperature 25 ℃, sample temperature 5 ℃, taurolidine quantitative analysis method, characterized in that the flow rate is 0.5 to 1.0 mL / min.
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| KR20200045078A (en) * | 2018-10-19 | 2020-05-04 | 주식회사 엔지켐생명과학 | Methods for the analysis of taurolidine, taurultam and taurinamide |
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