KR20220079643A - 산업적 규모로 현탁액 중의 세포 또는 미생물을 배양하기 위한 생물 반응기 또는 발효기 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 산업적 규모로 액체 배지에서 현탁액 중의 세포 또는 미생물을 배양하기 위한 생물 반응기 또는 발효기로서, 결정된 충전 높이를 갖는 액체 배지 중의 배양물을 함유하는 용기; 상기 액체 배지를 교반하기 위해 상기 용기 내에 제공되는 교반기; 상기 용기의 저부에 배치되는 제1 스파저; 및 추가의 공기 버블 및/또는 추가의 산소 기체 버블을 상기 액체 배지에 연속적으로 공급하기 위한 제2 스파저를 포함하고, 상기 제2 스파저는 상기 생물 반응기 또는 발효기에서 상기 제1 스파저 위로 거리 η의 위치에 위치되는, 생물 반응기 또는 발효기에 관한 것이다. 본 발명은 또한 적절한 수정된 기체 유량 qmod를 선택하여 용해된 CO2 및 O2를 독립적으로 관리하는 방법도 설명한다.
Description
본 발명은 산업적 규모로 현탁액 중의 세포 또는 미생물을 배양하기 위한 생물 반응기 또는 발효기에 관한 것이다.
생물제약 공정에서 산업적 규모에 도달하는 것은 항상 특별한 관심 대상이다. 배양 조건의 유지가 종종 대규모 배양을 수행할 가능성을 제한하기 때문에, 생물 반응기 용적의 규모가 증가되면 배양되는 세포의 세포 성능이 감소된다. 대규모의 생산 이외에 제조되는 생성물의 품질 기준을 충족해야 하며, 동시에 시장에 공급할 수 있는 안정적인 공급 능력이 제공되어야 한다. 따라서, 일관되게 높은 생성물 역가 및 높은 생성물 수율을 달성하기 위해, 세포 배양 성능의 크기 의존성을 감소시키거나 제거하는 것이 항상 관심 대상이다. 예상대로, 제공되는 증가된 생물 반응기 또는 발효기 용적의 더 높은 용량 활용은 개선된 생산성을 초래할 것이다.
세포 배양을 위해서는 이상적인 성장 조건을 보장하는 것이 매우 중요하다. 이와 관련하여 유리한 물리화학적 환경, 예를 들면, 원하는 용해된 산소 함량, 배양 pH 값, 온도 등을 유지하는 것이 중요하다. 그러나, 세포는 이의 환경에 대해 대사적으로 반응하는 것으로 알려져 있다. 특히 농도 구배는 대규모 생물 반응기에서 세포의 세포 성장을 억제할 수 있다. 또한, 예를 들면 pH 값은 주변 배지에 상당한 영향을 미친다. 교반된 생물 반응기 또는 발효기에서, 대사적으로 활성인 세포는 CO2를 분비하며 이는 주변 액체 배지에 용해되고, 주변 환경으로부터 O2를 흡수하여 세포 호흡을 완료한다. 예를 들면, 액체 배지에서 다음과 같은 CO2의 반응을 관찰할 수 있다(pH <8.0):
CO2(기체) + H2O ↔ H2CO3 ↔ HCO3 - + H+
따라서, 생물 반응기 또는 발효기의 액체상 내로 CO2가 들어가면 pH 값이 저하되어 산성 환경이 된다. 반대로, CO2의 배기는 pH 값을 상승시킨다. 따라서, 기체 공급 또는 "스파저(sparger)"라고 하는 기체 공급 유닛을 통해 생물 반응기 또는 발효기에 산소 기체를 제공하는 것이 일반적인 조치이다.
따라서, 일반적으로 높은 생성물 품질 및 효율성을 달성하기 위해, 일정한 산소 공급, 및 일명 (CO2-)스트리핑에 의한 용해된 이산화탄소의 명확한 고갈이 보장되어야 한다. 이는 모든 세포 또는 미생물이 배양될 수 있도록 모든 크기의 생물 반응기 또는 발효기에서 믿을만한 스케일 업이 가능해야 한다.
생물 반응기 또는 발효기의 기존의 기체 공급 유닛은, 기체 공급으로서 순수한 O2가 사용되는 경우, 초기에 순수 O2로 구성된 기체 버블이 액체상 내로 들어가게 한다. 반응기를 함유하는 세포 또는 미생물에서 버블이 체류 및 상승하는 동안, O2는 기체상으로부터 액체상 내로 이동하고(반응 (1)), 그 반대의 경우도 마찬가지로 대사 반응에서 형성된 CO2는 액체상으로부터 기체상 내로 즉 버블 내로 이동한다(반응 (2)). 헨리의 법칙 상수(예를 들면, 문헌[Christian Sieblist et al., Insights into large-scale cell-culture reactors: II. Gas-phase mixing and CO2 stripping, Biotechnol. J. 2011, 6, 1547-1556]에 정의됨)에 따라, O2 및 CO2의 전달은 각각 상이한 속도로 발생한다.
예를 들면, 생물 반응기 또는 발효기에서 발생하는 문제의 공정 및 반응이 도 1에 도시되어 있다. 도 1은 저부 및 교반기(도시되지 않음) 가까이에서, 예를 들면 순수한 O2를 제공하는 기체 공급을 갖는 개략적인 생물 반응기 또는 발효기 내에서의 용해된 CO2의 분포를 예시한다. 도 1에 도시된 버블(10)은 액체에서 상승하는 동안 3가지 상이한 조건, 즉 시작 나이브(naive) 버블(10.1), 중간 섹션에서의 버블(10.2) 및 생물 반응기 또는 발효기의 상부 섹션에서의 버블(10.3)을 도시한다. 따라서, 생물 반응기 하부에서 기체 공급으로부터 시작하여 O2 함유 버블(10.1)이 액체 배지의 표면까지 상승하기 시작한다. 도 1의 중간 부분에는, 발생하는 공정 및 반응이 개략적으로 도시된다: O2 기체는 버블(10.2)로부터 액체상 내로 이동하고(반응 (1)), CO2 기체는 액체상으로부터 버블(10.2) 내로 이동한다(반응 (2)). O2 기체 및 CO2 기체 각각에 대한 헨리의 법칙 상수는 상당히 상이하다(Sieblist et al.; loc.cit.). 동일한 조건 하에 계측했을 때 O2에 대한 값은 약 0.0013mol/(kg*bar)이고, CO2에 대한 값은 약 0.034mol/(kg*bar)로, 즉, 약 25배 더 높으며, 즉 CO2의 값이 더 커 가속 확산이 일어난다. 따라서, 반응(2)의 속도는 반응(1)의 속도에 비해 훨씬 빠르다(이는 상이한 두께의 화살표로 도 1에 도시됨). CO2에 대한 헨리 상수가 O2에 대한 해당 값보다 높기 때문에, 버블의 이산화탄소 농도는 O2에 대한 값이 감소하는 것보다 반응기를 통과하는 도중에 보다 더 빠르게 증가한다. 그 결과, 버블의 상승 동안 CO2 물질 전달의 추진력이 감소된다.
사실, 버블(10)은 몇 분 동안 액체상에 산소를 공급할 수 있지만, 이산화탄소 흡수는 CO2 포화로 인해 몇 초 이내에 정지된다. 버블이 CO2로 포화되면, CO2는 더 이상 흡수되지 않는다. 이는 도 1에 버블(10.3)로 나타낸다. 몇 초 후, 버블(10.3)은 여전히 배양물에 산소를 제공하지만, CO2를 흡수할 추가의 용량이 없다. 따라서, 생물 반응기의 액체 배지에 제공된 버블은 CO2 스트리핑에 대해 일시 활성(part-time-active)만 된다. 따라서, 버블은 생물 반응기 또는 발효기 내에서 구체적인 높이의 상승 후에 CO2의 포화 농도에 도달한다. 따라서, 도 1의 상단에서 버블(10.3)은 더 이상 CO2 기체를 흡수하지 않고 O2 기체만 버블(10.3)로부터 액체상 내로 통과한다. 그 결과, 도 1의 하부로부터 상부로, 조건 10.1의 버블로부터 조건 10.2를 거쳐 조건 10.3으로, O2의 액체 배지 내로의 전달은 감소하는 반면, 버블 내의 CO2 농도는 포화 농도에 도달할 때까지 증가한다. 이는 도 1의 우측에 있는 삼각형 형상의 화살표에 개략적으로 설명되어 있다: 넓은 부분으로부터 화살촉으로의 화살표(3)는 O2의 배양 배지로의, 즉 기체상으로부터 액체상 내로의 상대적인 전달 경향이 감소됨을 상징한다. 도 1의 화살표(4)는 화살촉 부분으로부터 넓은 부분으로의 CO2로 버블의 포화도가 증가하는 것을 상징하며, 이에 따라 CO2는 액체상으로부터 기체상 내로 통과하며, 이는 O2의 전달보다 훨씬 더 빠르게 진행된다. 사각형(5)은 버블(10.3)이 CO2의 포화 농도에 도달했기 때문에, 액체상으로부터 버블(10.3) 내로 용해된 CO2를 더 이상 흡수할 수 없는 영역을 설명한다.
따라서, 매우 짧은 시간 후에 버블(10.3)은 CO2 기체로 포화되고 액체상으로부터 더 이상 CO2를 더 이상 흡수할 수 없지만, 버블(10.3)은 여전히 O2 기체를 액체 환경 내로 방출할 수 있다. 기체 공급이 영구적으로 제공되는 생물 반응기 또는 발효기 내에는, 액체상으로 진입되어 액체상 내 CO2 구배에 기여하는 전체 일련의 버블이 제공된다. 하부에는 버블이 CO2를 흡수하는 능력이 있는데, 이 능력은 버블이 상부로 올라가는 과정에서 점점 더 손실된다.
특히, 대형 생산 생물 반응기 또는 발효기에서, 스트리핑은 기체 공급 시스템으로부터 상부로의 생물 반응기 또는 발효기를 통한 이동 동안 버블의 기체 조성 변화에 의해 주로 영향을 받기 때문에, 배양물로부터의 CO2 제거가 주요한 문제로 알려져 있다.
따라서, 상기 설명한 바와 같이 O2 농도 및 CO2 농도의 관리는 생물제약 공정, 특히 대규모의 생물제약 공정에서 특히 중요하다. 대규모 시스템에서 CO2의 스트리핑의 제어 및 조절을 개선할 수 있는 전략을 개발하기 위해, 산소 및 이산화탄소 물질 전달 성능을 자세히 평가해야 한다. CO2 기체와 관련하여 관찰해야 하는 파라미터는 (용적(volumetric)) 이산화탄소 물질 전달 계수인 kLaCO2이며, 여기서 kL은 CO2에 대한 전달 계수이고, a는 비계면 면적(specific interfacial area)이고, a = A/VL, 즉 배양 용적 VL당 총 물질 전달 단면 A이다(참조: Christian Sieblist et al., loc.cit.). O2 기체와 관련하여 관찰해야 하는 파라미터는 (용적) 산소 물질 전달 계수 kLaO2이다. 물질 전달 계수는 용적을 기반으로 할 수 있으며, 이는 용적 물질 전달 계수가 된다.
또한, 한편으로는, 과도한 농도 수준의 용해된 CO2를 피해야 하고, CO2를 스트리핑 제거해야 한다. 대형 생물 반응기 또는 발효기(즉, 높이가 높고 따라서 버블이 상승하는 긴 거리가 있는 것)에서 불충분한 CO2 스트리핑은 종종 용해된 CO2가 축적되어 액체상 중 CO2 농도가 높아지고, 이는 세포 성장 및 생성물 형성을 억제한다. 반면에, 이산화탄소는 핵산 합성에 필요하며, 그 양이 너무 적어서는 안된다. 따라서, CO2의 스트리핑은 배양되는 세포 또는 미생물에 어떠한 부정적인 영향도 미치지 않아야 한다는 점에 유의해야 한다.
결과적으로, 산소 물질 전달 계수 kLaO2에 큰 영향을 미치지 않으면서 대규모 시스템에 대한 이산화탄소 물질 전달 계수 kLaCO2를 향상시키고 제어하고 조절할 수 있는 전략이 개발되어야 한다.
CO2 및 O2 물질 전달의 상호 관계를 조사하고 설명하기 위해, 본 발명자들은 상이한 작업 조건의 영향을 식별하기 위한 다양한 연구를 수행했다. 특히, 실험실 규모 및 산업적 규모에서의 CO2의 혼합 효율 및 물질 전달 성능에 대해 자세히 조사했다. 결과는 도 2 및 도 3에 요약되어 있다.
도 2 및 도 3은 각각 실험실 규모 및 산업적 규모에서 수동으로 주어진 상이한 표면 기체 속도 w0 g에 대해 두 가지 상이한 용적에서 용적 교반기 전력 입력 P/V에 의존하는 이산화탄소에 대한 용적 물질 전달 계수 kLaCO2를 보여준다. 구체적으로, 도 2는 용적이 2L(cm 범위의 높이)인 폭기 교반 생물 반응기 또는 발효기에서의 실험실 규모의 실험을 보여준다. 도 3은 용적이 12,000L(m 범위의 높이)인 폭기 교반 생물 반응기 또는 발효기에서의 산업적 규모의 실험을 보여준다.
예상할 수 있듯이, 도 2 및 도 3은 두 실험, 즉 실험실 규모 및 산업적 규모에서 표면 기체 속도 w0 g가 증가하는 것과 동일한 정도로 이산화탄소의 용적 물질 전달 계수 kLaCO2가 증가함을 보여준다. 또한, 이산화탄소에 대한 물질 전달 성능은 산업적 규모의 공정에 비해 실험실 규모에서는 상당히 상이한 것으로 확인되었다. 그러나, 용적 교반기 전력 입력이 실험실 규모에는 상당한 영향을 미치지만 산업적 규모에는 최소한의 영향을 미친다는 것은 예상치 못한 일이었다. 도 2 및 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 산업적 규모의 반응기에 대한 용적 물질 전달 계수 kLaCO2는 실험실 규모의 반응기에 비해 최대 10배 낮다.
실험실 규모 실험과 산업적 규모 실험 간의 차이를 보다 더 잘 설명하기 위해, 실험실 규모와 산업적 규모 간의 이산화탄소에 대한 물질 전달 계수 비교 kLaCO2가 표시된 도 4를 참조한다. 도 4는 용적 전력 입력 P/V = 21Wm-3에서 계측된 용적 물질 전달 계수와 비교하여 용적 이산화탄소 물질 전달 계수에 대한 비전력 입력(specific power input)의 상대적 영향을 보여준다. 실험실 규모와 산업적 규모 사이의 용적 이산화탄소 물질 전달 계수 kLaCO2를 비교하면, 산업적 규모의 경우 용적 입력 P/V를 증가시키면 CO2에 대한 물질 전달 성능이 크게 향상될 수 없는 반면, 실험실 규모에서는 CO2에 대한 물질 전달 성능이 21Wm-3로부터 168Wm-3로 최대 70% 향상될 수 있다는 것이 분명해진다. 따라서, 도 4는 실험실 규모(2L 시스템)에서 교반기 투입량이 증가함에 따라 +70%의 kLaCO2 증가를 보여주는 반면, 산업적 규모(12,000L 시스템)에서는 +5%의 kLaCO2 증가만 관찰할 수 있다.
따라서, 도 2 내지 4에 기초한 산업적 규모의 생물 반응기 또는 발효기의 경우, CO2에 대한 물질 전달 성능은 용적 전력 입력 P/V를 증가시켜도 크게 향상될 수 없는 반면, 실험실 규모에서는 CO2에 대한 물질 전달 성능이 최대 70% 향상될 수 있음이 명확해진다(도 4 참조).
두 시스템의 상이한 거동은 상기 이미 설명한 바와 같이 기본적으로 시스템 내의 기체상의 체류 시간으로 설명할 수 있다. 산업적 규모에서, 버블과 액체 사이의 CO2 농도 평형은 버블이 표면에 도달하기 훨씬 전에 도달하는 반면, 실험실 규모에서는 체류 시간이 너무 짧아 평형에 도달할 수 없다. 따라서, 교반기 진동수의 증가로 계면 면적을 향상시키면 실험실 규모에서 보다 더 높은 물질 전달 계수를 초래하는 반면, 대규모에서는 "죽은 버블"(즉, CO2 포화됨)의 보다 더 강한 분산이 무용하다.
산소 물질 전달의 경우, 추가의 실험은 산업적 규모에서도 평형에 도달하지 못한다는 것을 보인다. 따라서, 용적 전력 입력이 높을수록 계면 면적이 더 커지므로 용적 물질 전달 계수 kLaO2가 높아진다. 따라서, 이산화탄소에 대한 용적 물질 전달 계수는 더 높은 기체 유량에서만 크게 향상될 수 있고, 더 높은 용적 전력 입력에서는 향상되지 않는다는 결론이 내려졌다.
산업적 규모에서 이산화탄소 스트리핑의 어려움은 기체상이 생물 반응기 또는 발효기의 저부에 또는 저부 근처에 제공된 침잠된(submersed) 기체 공급 바로 위에서만 이미 이산화탄소로 포화되었다는 사실과 대부분 관련이 있다. 따라서, 이산화탄소에 대한 물질 전달 성능을 높이는 가장 실현 가능한 옵션은 기체 유량을 높이는 것이다. 그러나, 이는 종종 원치 않는 산소 물질 전달 속도의 증가를 초래하므로, 생물 반응기 또는 발효기 내에서 O2 농도 및 CO2 농도의 독립적인 관리가 불가능하다.
선행 기술에 2개의 스파저를 갖는 반응기가 이미 공지되어 있고, 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들면, EP 0 099 634 A2에는 원통형 용기, 드래프트 튜브, 원추형 저부 및 기체 스파저 시스템을 포함하는 기체상, 고체상 및 액체상 사이의 다상 접촉을 위한 반응기 장치가 개시되어 있다. 기체 스파저(16)는 용기의 저부 말단에 위치하며, 적어도 하나의 버블 형태의 기체를 연속 액체상 내로 수용하기 위해 내벽과 원추형 표면 둘레 사이의 틈에 위치하며, 상기 연속 액체상은 미립자 고체상이 현탁되어 용기에 함유되어 있다. 링 스파저(34) 형태의 보조 기체 스파저는 드래프트 튜브를 둘러싸고, 버블 형태의 기체를 액체상 내로 방사상 외측으로 방출하도록 구성된다. EP 0 099 634 A2는 두 스파저 사이의 거리와 관련하여 완전히 침묵한다.
WO 2002/33048 A1에는, 발효 용기에서 호기성 조건 하에 미생물을 배양하는 방법으로서, 브로스(broth)의 혼돈 운동을 유발하는 불균일한 유동의 제1 산소-함유 기체의, 상기 용기의 저부 내로의 주입, 및 브로스의 유동 방향과 관계없이 가능한 모든 방향으로 용기 내에서 이동하여 주입 부위에 난류 조건을 만드는 기체 버블의 불균질한 유동으로서 그리고 불균일한 크기 및 폭넓은 크기 분포의 기체 버블 세트로서의 제2 산소-함유 기체의 도입을 특징으로 하는 제2 산소-함유 기체의 상기 용기에서의 도입을 포함하는 방법이 개시되어 있다. 두 스파저 사이의 거리는 언급되지 않았으며, 중요하지 않은데, 이는 명세서 4페이지의 1. 20-24에 개요된 제2 산소-함유 기체 스트림의 유입구 위치에 대한 제한이 없기 때문이다.
문헌[Sen Xu et al.: "A practical approach in bioreactor scale-up and process transfer using a combination of constant P/V and vvm as the criterion", Biotechnology Progress, Vol. 33, No. 4, 2017, pp. 1146-1159]에서, 단일클론성 항체(MAb)와 같은 치료 단백질 생산의 중요한 단계로서의 생물 반응기 스케일-업이 평가된다. 예를 들면, 상이한 스파저들이 있는 다양한 생물 반응기 스케일(3 내지 2,000L)로부터 스파저의 kLa 및 kLaCO2(CO2 용적 물질 전달 계수)를 검사한다. 이와 관련하여, 단일 및 이중 스파저 시스템이 이들의 기하학적 구조에 대한 어떠한 설명도 없이 개시된다. 일반적으로, 이중 스파저 시스템에서 두 스파저 모두 높이가 상이한 것이 아니라 대략 동일한 위치에 있다.
또한, 유기 화학 분야의 US 5 994 567은 버블 컬럼 반응기 내로의 직접적인 산소 주입, 즉 액체상 산화 공정에 관한 것으로, 여기서 제1 산소-함유 기체는 산화 가능한 유기 액체를 함유하는 버블 컬럼 반응기 용기의 저부 내로 주입된다. 제2 산소-함유 기체는 상기 액체가 상기 주입 전에 용해된 산소로 실질적으로 고갈되는 지점 또는 지점들에서 반응기 내로 추가로 주입된다. 제1 산소-함유 기체 및 제2 산소-함유 기체 둘 다로부터의 산소는 유기 액체, 예를 들면, 쿠멘 또는 사이클로헥산을 산화시키는 데 사용된다. 따라서, 세포 또는 미생물을 배양하기 위한 교반 탱크 생물 반응기 또는 발효기가 아닌, 배양된 살아있는 세포에 의해 생성된 CO2의 스트리핑이 전혀 중요하지 않은 화학 반응에 대해 개시되어 있다.
WO 2008/088371 A2의 개시는 화학적 반응, 생화학적 반응 및/또는 생물학적 반응을 수행하기 위한 반응기로서 사용될 수 있는 지지된 접을 수 있는(collapsible) 백을 포함하는 시스템 및 방법을 포함하여 유체를 함유하고 조작하기 위한 시스템에 관한 것이다. 일 측면에서, 용기에 함유된 유체는 예를 들면 유체가 용기의 컨테이너(container) 내로 향하도록 스파징될 수 있고, 일부 경우에, 필요에 따라 스파징 정도를 빠르게 활성화하거나 변경함으로써 스파징이 제어될 수 있다. 일부 경우 여러 스파저가 사용될 수 있다고 언급되어 있다. 그러나, 상기 문헌은 이의 구체적인 기하학적 배치에 대해서는 침묵한다. 기재된 바와 같은 상이한 스파저들(47 또는 301)은 도 1에 따라 반응기의 저부에서 동일한 높이에 위치되지만, 이의 물리화학적 영향과 관련된 구체적인 교시는 없다.
교반기와 관련된 스파저의 가능한 위치, 디자인 및 크기는 문헌[Sardeing et al.: "Gas-liquid mass transfer", Chemical Engineering Research and Design, Elsevier, Amsterdam, NL, Vol. 82, No. 9, 2004, pp. 1161-1168; Birch et al.: "The Influence of Sparger Design and Location on Gas Dispersion in Stirred Vessels", Chemical Engineering Research and Design, Elsevier, Amsterdam, NL, Vol. 75, No. 5, 1997, pp. 487-496 and Rewatkar V. B. et al.: "Role of sparger design on gas dispersion in mechanically agitated gas-liquid contactors", Canadian Journal of Chemical Engineering, 1993, Vol. 71, No. 2, pp. 278-291]에서 평가되고 논의된다. 효과를 평가하기 위해, 단일 스파저만 사용된다. 반응기에 동시에 2개의 스파저의 존재 및 이들 사이의 거리는 관련이 없으며 언급되지 않았다.
따라서, 본 발명의 목적은 선행 기술의 결점을 극복하고, 산업적 규모의 폭기 교반 생물 반응기 또는 발효기 내의 산소 농도와 독립적으로 이산화탄소 농도를 관리할 수 있는 변형된 생물 반응기 또는 발효기를 제공하는 것이다.
또한, 산업적 규모의 폭기 교반 생물 반응기 또는 발효기 내에서 이산화탄소 농도 및 산소 농도를 독립적으로 관리하여 세포 배양 또는 발효 공정을 제어하기 위한 방법을 제공하는 것이 추가의 목적이다.
놀랍게도, 선행 기술로부터 알려진 단점이 극복될 수 있다는 것이 발견되었으며, 특히 산업적 규모의 폭기 교반 생물 반응기 또는 발효기 내에서의 O2 농도 및 CO2 농도의 독립적인 관리는 제2 기체 공급(또는 임의로 보다 더 많은 기체 공급)이 생물 반응기 내의 제1 기체 공급 유닛으로부터 미리 정의된 거리에 배치되는 경우 달성될 수 있다.
따라서, 상기 언급된 단점들을 극복하기 위해, 산업적 규모로 액체 배지에서 현탁액 중의 세포 또는 미생물을 배양하기 위해 변형되고 이에 의해 개선된 생물 반응기 또는 발효기가 제공된다. 본 발명에 따라 산업적 규모로 액체 배지에서 현탁액 중의 세포 또는 미생물을 배양하기 위한 생물 반응기 또는 발효기(100)는
결정된 충전 높이를 갖는 액체 배지 중의 배양물을 함유하는 용기(102);
상기 액체 배지를 교반하기 위해 상기 용기 내에 제공되는 교반기(120);
기체 버블들(10, 10.1, 10.2, 10.3)을 상기 액체 배지에 연속적으로 공급하기 위해 제공되는, 상기 용기(102)의 저부(105)에 배치되는 제1 스파저(150)로서, 상기 기체는 공기 및/또는 산소 기체인, 상기 제1 스파저 및
상기 용기(102) 내에 배치되고 상기 제1 스파저(150) 위에 제공되어 추가의 공기 버블 및/또는 추가의 산소 기체 버블들(20, 20.1, 20.2, 20.3)을 상기 액체 배지에 연속적으로 공급하는 제2 스파저(160)를 포함하고,
상기 제2 스파저(160)는 상기 생물 반응기 또는 발효기(100) 내에서 상기 제1 스파저(150) 위로 거리 η의 위치에 위치되고, η는
상기 제1 스파저(150) 위로 적어도 약 0.4m로부터 상기 생물 반응기 또는 발효기(100)의 상기 충전 높이 아래로 최대 약 0.5m까지의 범위로부터 선택되거나,
상기 제1 스파저(150) 위로 약 0.4m로부터 상기 생물 반응기 또는 발효기(100)의 상기 충전 높이의 약 2/3까지의 범위로부터 선택되거나,
상기 제1 스파저(150) 위로 약 0.4m로부터 상기 생물 반응기 또는 발효기(100) 충전 높이의 약 1/2까지의 범위로부터 선택되거나,
상기 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 3.0m, 약 0.4 내지 약 2.5m, 약 0.4 내지 약 2.0m, 약 0.4 내지 약 1.5m, 약 0.4 내지 약 1.0m, 약 0.45 내지 약 0.90m, 약 0.5 내지 약 0.80m 또는 약 0.55 내지 약 0.70m의 범위로부터 선택되거나 또는 약 0.6m가 선택된다.
따라서, CO2에 대한 물질 전달 성능을 향상시키고 동시에 O2에 대한 물질 전달 성능이 불리한 영향을 받지 않도록 하기 위해, 본 발명에 따라 추가의 제2 기체 스파저가 생물 반응기 또는 발효기 내에 제1 스파저 위로 거리 η의 위치에 제공되어, 침잠 또는 제1 스파저로부터 제공되는 기체보다 훨씬 더 짧은 추가의 공급된 기체의 체류 시간이 달성된다. 제2 스파저에 의해 주입된 기체의 짧은 체류 시간으로 인해, 보다 더 적은 양의 산소가 액체상으로 전달되는 반면, 증가된 양의 CO2가 스트리핑될 수 있다.
일 양태에 따르면, 제2 스파저는 사이드(side) 스파저, 즉 측벽 근처에 추가의 기체 버블을 제공하는 스파저일 수 있다.
종래 기술 및 본 발명의 양태는 첨부 도면을 참조하여 예로서 설명되며, 첨부 도면은 개략적이고, 정확한 기하학적 값의 가정이 원래 크기에 대해 이루어질 수 있도록 축척으로 도시하고자 하는 것이 아니다. 본 발명의 도면들은 본원에 통합되고 본원의 일부를 구성하며, 또한 설명된 특정 양태로의 제한 없이 본 발명의 양태를 예시한다. 도면은, 일반적인 설명 및 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다. 동일한 특징적인 구성들은 도면 전체에 동일한 참조 부호로 표시된다. 도면에서,
도 1은 생물 반응기 또는 발효기에서 버블에서 발생하는 O2 및 CO2의 분포와 관련된 공정 및 반응의 개략도를 보여준다.
도 2는 실험실 규모에서 상이한 표면 기체 속도 w0 g에 대한 용적 교반기 전력 입력 P/V에 따른 이산화탄소에 대한 용적 물질 전달 계수 kLaCO2를 보여준다.
도 3은 산업적 규모에서 상이한 표면 기체 속도 w0 g에 대한 용적 교반기 전력 입력 P/V에 따른 이산화탄소의 용적 물질 전달 계수 kLaCO2를 보여준다.
도 4는 도 2 및 도 3에서 얻은 값을 기반으로 실험실 규모와 산업적 규모 사이의 이산화탄소에 대한 물질 전달 계수 kLaCO2의 비교를 보여준다.
도 5는 본 발명의 예시적인 양태에 따라 추가의 기체 주입(섹션 A) 없이 그리고 추가의 기체 주입(섹션 B; 버블(20))으로 생물 반응기 또는 발효기의 기체 버블(10)에서 발생하는 O2 및 CO2의 분포와 관련된 공정 및 반응의 개략도를 보여준다.
도 6a는 본 발명의 예시적인 양태에 따른 생물 반응기 또는 발효기 내에서의 제1 스파저(150) 및 제2 스파저(160) 각각의 위치를 도시한다.
도 6b는 본 발명의 예시적인 양태에 따른 생물 반응기 또는 발효기 내에서의 제1 스파저(150), 제2 스파저(160) 및 제3 스파저(170) 각각의 위치를 도시한다.
도 7은 본 발명의 예시적인 양태에 따른 스파저들(150, 160 및 170)의 유형을 도시한다.
도 8은 실시예 섹션(실시예 1)에 설명되어 있으며, 본 발명의 일 양태에 따라 cC02 = 14%의 포화 내지 cCO2 = 6%의 kLaCO2 값의 예시적인 평가를 보여준다.
도 9는 실시예 섹션(실시예 2)에 설명되어 있으며, 본 발명의 예시적인 양태에 따른 산업적 규모의 생물 반응기 및 추가의 제2 스파저(160)의 마운팅 위치의 수직 단면 개략도의 기술 도면을 보여준다.
도 10은 실시예 섹션(실시예 2 및 3)에 설명되어 있으며, 선행 기술 및 본 발명의 예시적인 양태에 따른 기체 유량에 따른 산소에 대한 물질 전달 계수(kLaO2)를 측정하기 위해 수행된 4가지 계측의 비교를 나타낸다.
도 11은 실시예 섹션(실시예 3)에 설명되어 있으며, 선행 기술 및 본 발명의 예시적인 양태에 따른 기체 유량에 따른 이산화탄소의 물질 전달 계수(kLaCO2)를 측정하기 위해 수행된 4가지 계측의 비교를 나타낸다.
도 12a는 실시예 섹션(실시예 3)에 설명되어 있으며, 본 발명에 따른 산소의 물질 전달 계수(kLaO2)에 대한 영향 계수 CO2의 측정을 보여준다.
도 12b는 실시예 섹션(실시예 3)에 설명되어 있으며, 본 발명에 따른 이산화탄소의 물질 전달 계수(kLaCO2)에 대한 영향 계수 CCO2의 측정을 보여준다.
도 13a는 실시예 섹션(실시예 4)에 설명되어 있으며, 선행 기술 및 본 발명의 예시적인 양태에 따라 사이드 스파저 유형 A 또는 사이드 스파저 유형 B를 사용하여 기체 유량에 따른 산소의 물질 전달 계수(kLaO2)를 측정하기 위해 수행된 4가지 계측의 비교를 보여준다.
도 13b는 실시예 섹션(실시예 4)에 설명되어 있으며, 선행 기술 및 본 발명의 예시적인 양태에 따라 사이드 스파저 유형 A 또는 사이드 스파저 유형 B를 사용하여 기체 유량에 따른 이산화탄소에 대한 물질 전달 계수(kLaCO2)를 측정하기 위해 수행된 4가지 계측의 비교를 보여준다.
도 14a는 실시예 섹션(실시예 5)에 설명되어 있으며, 교반기 진동수 및 침잠 기체 유량에 따른 이산화탄소에 대한 물질 전달 계수(kLaCO2)를 측정하기 위해 수행된 계측을 보여준다.
도 14b는 실시예 섹션(실시예 5)에 설명되어 있으며, 교반기 진동수 및 침잠 기체 유량에 따른 산소에 대한 물질 전달 계수(kLaO2)를 측정하기 위해 수행된 계측을 보여준다.
도 15a는 실시예 섹션(실시예 5)에 설명되어 있으며, 교반기 진동수 및 사이드 기체 유량에 따른 이산화탄소에 대한 물질 전달 계수(kLaCO2)를 측정하기 위해 수행된 계측을 보여준다.
도 15b는 실시예 섹션(실시예 5)에 설명되어 있으며, 교반기 진동수 및 사이드 기체 유량에 따른 산소에 대한 물질 전달 계수(kLaO2)를 측정하기 위해 수행된 계측을 보여준다.
도 16a는 실시예 섹션(실시예 6)에 설명되어 있으며, 단계 응답 방법, 특히 시스템에 대한 입력을 예시한다.
도 16b는 실시예 섹션(실시예 6)에 설명되어 있으며, 단계 응답 방법, 특히 시스템의 출력을 예시한다.
도 17은 실시예 섹션(실시예 6)에 설명되어 있으며, 단계 응답 계측에 사용되는 버블 캐처(깔때기)(180)를 예시한다.
도 18은 실시예 섹션(실시예 6)에 설명되어 있으며, 12kL 폭기 교반 탱크 반응기에 적용된 단계 응답 방법의 전형적인 입력 및 출력 신호를 보여준다.
도 19는 실시예 섹션(실시예 6)에 설명되어 있으며, 100% 및 50% 입력 단계로 인한 버블 캐처(깔때기)(180)에서의 단계 응답들의 비교를 보여준다.
도 20은 실시예 섹션(실시예 6)에 설명되어 있으며, 산업적 규모의 생물 반응기 또는 발효기(12,000L)와 비교한 실험실 규모의 생물 반응기 또는 발효기(30L)에서의 단계 기능 응답 방법(실시예 섹션에서 설명되는 "Sprungantwortmethode")에 의해 측정되는 기체상 체류 시간의 계측 결과를 보여준다.
도 21은 실시예 섹션(비교 실시예 1)에 설명되어 있으며, 상업적으로 입수 가능한 12.000L 생물 반응기에서 11일 동안의 유가식(fed-batch) 공정의 항체-유도체의 배양의 생존 세포 밀도, 세포 생존율, 역가 및 CO2 분압의 결과를 보여주며, 상기 생물 반응기는 1개의 스파저만을 포함한다.
일부 도면에 대한 자세한 범례는 본 명세서의 끝에 제공된다.
도 1은 생물 반응기 또는 발효기에서 버블에서 발생하는 O2 및 CO2의 분포와 관련된 공정 및 반응의 개략도를 보여준다.
도 2는 실험실 규모에서 상이한 표면 기체 속도 w0 g에 대한 용적 교반기 전력 입력 P/V에 따른 이산화탄소에 대한 용적 물질 전달 계수 kLaCO2를 보여준다.
도 3은 산업적 규모에서 상이한 표면 기체 속도 w0 g에 대한 용적 교반기 전력 입력 P/V에 따른 이산화탄소의 용적 물질 전달 계수 kLaCO2를 보여준다.
도 4는 도 2 및 도 3에서 얻은 값을 기반으로 실험실 규모와 산업적 규모 사이의 이산화탄소에 대한 물질 전달 계수 kLaCO2의 비교를 보여준다.
도 5는 본 발명의 예시적인 양태에 따라 추가의 기체 주입(섹션 A) 없이 그리고 추가의 기체 주입(섹션 B; 버블(20))으로 생물 반응기 또는 발효기의 기체 버블(10)에서 발생하는 O2 및 CO2의 분포와 관련된 공정 및 반응의 개략도를 보여준다.
도 6a는 본 발명의 예시적인 양태에 따른 생물 반응기 또는 발효기 내에서의 제1 스파저(150) 및 제2 스파저(160) 각각의 위치를 도시한다.
도 6b는 본 발명의 예시적인 양태에 따른 생물 반응기 또는 발효기 내에서의 제1 스파저(150), 제2 스파저(160) 및 제3 스파저(170) 각각의 위치를 도시한다.
도 7은 본 발명의 예시적인 양태에 따른 스파저들(150, 160 및 170)의 유형을 도시한다.
도 8은 실시예 섹션(실시예 1)에 설명되어 있으며, 본 발명의 일 양태에 따라 cC02 = 14%의 포화 내지 cCO2 = 6%의 kLaCO2 값의 예시적인 평가를 보여준다.
도 9는 실시예 섹션(실시예 2)에 설명되어 있으며, 본 발명의 예시적인 양태에 따른 산업적 규모의 생물 반응기 및 추가의 제2 스파저(160)의 마운팅 위치의 수직 단면 개략도의 기술 도면을 보여준다.
도 10은 실시예 섹션(실시예 2 및 3)에 설명되어 있으며, 선행 기술 및 본 발명의 예시적인 양태에 따른 기체 유량에 따른 산소에 대한 물질 전달 계수(kLaO2)를 측정하기 위해 수행된 4가지 계측의 비교를 나타낸다.
도 11은 실시예 섹션(실시예 3)에 설명되어 있으며, 선행 기술 및 본 발명의 예시적인 양태에 따른 기체 유량에 따른 이산화탄소의 물질 전달 계수(kLaCO2)를 측정하기 위해 수행된 4가지 계측의 비교를 나타낸다.
도 12a는 실시예 섹션(실시예 3)에 설명되어 있으며, 본 발명에 따른 산소의 물질 전달 계수(kLaO2)에 대한 영향 계수 CO2의 측정을 보여준다.
도 12b는 실시예 섹션(실시예 3)에 설명되어 있으며, 본 발명에 따른 이산화탄소의 물질 전달 계수(kLaCO2)에 대한 영향 계수 CCO2의 측정을 보여준다.
도 13a는 실시예 섹션(실시예 4)에 설명되어 있으며, 선행 기술 및 본 발명의 예시적인 양태에 따라 사이드 스파저 유형 A 또는 사이드 스파저 유형 B를 사용하여 기체 유량에 따른 산소의 물질 전달 계수(kLaO2)를 측정하기 위해 수행된 4가지 계측의 비교를 보여준다.
도 13b는 실시예 섹션(실시예 4)에 설명되어 있으며, 선행 기술 및 본 발명의 예시적인 양태에 따라 사이드 스파저 유형 A 또는 사이드 스파저 유형 B를 사용하여 기체 유량에 따른 이산화탄소에 대한 물질 전달 계수(kLaCO2)를 측정하기 위해 수행된 4가지 계측의 비교를 보여준다.
도 14a는 실시예 섹션(실시예 5)에 설명되어 있으며, 교반기 진동수 및 침잠 기체 유량에 따른 이산화탄소에 대한 물질 전달 계수(kLaCO2)를 측정하기 위해 수행된 계측을 보여준다.
도 14b는 실시예 섹션(실시예 5)에 설명되어 있으며, 교반기 진동수 및 침잠 기체 유량에 따른 산소에 대한 물질 전달 계수(kLaO2)를 측정하기 위해 수행된 계측을 보여준다.
도 15a는 실시예 섹션(실시예 5)에 설명되어 있으며, 교반기 진동수 및 사이드 기체 유량에 따른 이산화탄소에 대한 물질 전달 계수(kLaCO2)를 측정하기 위해 수행된 계측을 보여준다.
도 15b는 실시예 섹션(실시예 5)에 설명되어 있으며, 교반기 진동수 및 사이드 기체 유량에 따른 산소에 대한 물질 전달 계수(kLaO2)를 측정하기 위해 수행된 계측을 보여준다.
도 16a는 실시예 섹션(실시예 6)에 설명되어 있으며, 단계 응답 방법, 특히 시스템에 대한 입력을 예시한다.
도 16b는 실시예 섹션(실시예 6)에 설명되어 있으며, 단계 응답 방법, 특히 시스템의 출력을 예시한다.
도 17은 실시예 섹션(실시예 6)에 설명되어 있으며, 단계 응답 계측에 사용되는 버블 캐처(깔때기)(180)를 예시한다.
도 18은 실시예 섹션(실시예 6)에 설명되어 있으며, 12kL 폭기 교반 탱크 반응기에 적용된 단계 응답 방법의 전형적인 입력 및 출력 신호를 보여준다.
도 19는 실시예 섹션(실시예 6)에 설명되어 있으며, 100% 및 50% 입력 단계로 인한 버블 캐처(깔때기)(180)에서의 단계 응답들의 비교를 보여준다.
도 20은 실시예 섹션(실시예 6)에 설명되어 있으며, 산업적 규모의 생물 반응기 또는 발효기(12,000L)와 비교한 실험실 규모의 생물 반응기 또는 발효기(30L)에서의 단계 기능 응답 방법(실시예 섹션에서 설명되는 "Sprungantwortmethode")에 의해 측정되는 기체상 체류 시간의 계측 결과를 보여준다.
도 21은 실시예 섹션(비교 실시예 1)에 설명되어 있으며, 상업적으로 입수 가능한 12.000L 생물 반응기에서 11일 동안의 유가식(fed-batch) 공정의 항체-유도체의 배양의 생존 세포 밀도, 세포 생존율, 역가 및 CO2 분압의 결과를 보여주며, 상기 생물 반응기는 1개의 스파저만을 포함한다.
일부 도면에 대한 자세한 범례는 본 명세서의 끝에 제공된다.
본원에서 구체적으로 정의되지 않은 용어는 본원 명세서 및 문맥에 비추어 당업자에 의해 부여되는 의미가 주어져야 한다.
"생물 반응기"는 살아있는 유기체, 특히 박테리아 및 진핵생물 세포가 유용한 물질을 성장 및/또는 합성하여 배양 배지로부터 영양소를, 그리고 호기성 세포 또는 미생물의 경우 스파저와 같은 기술 기관에서 제공하는 O2를 소비하는 장치 또는 기구이다. 본 발명에서 생물 반응기는 산업적 규모의 생물 반응기이다. 생물 반응기는, 화학적 방법 또는 생화학적 방법이 수행되고 유기체 및/또는 이러한 유기체로부터 유래된 생화학적 활성 물질을 포함하는 생체적합성 용기로 구성될 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 생물 반응기는 추가의 장비, 예를 들면 교반기, 배플, 하나 이상의 스파저(예를 들면, 본 발명에 가해지는 것) 및/또는 포트를 사용하며, 이는 특히 세포의 배양 및 증식을 허용한다. 일반적으로 생물 반응기는 2개의 말단부가 있는 원통형 튜브 형태이며, 말단부는 생물 반응기의 상단과 저부을 형성한다. 생물 반응기의 크기는 리터 내지 입방 미터로 다양하며, 종종 스테인리스 스틸로 만들어진다. 본 발명에 따른 생물 반응기는 대규모 생산에 사용된다.
배양되는 세포, 특히 중국 햄스터 난소(CHO) 또는 효모 세포와 같은 진핵 세포는 항체, 예를 들면, 단클론성 항체 및/또는 재조합 단백질, 예를 들면 치료 용도용 재조합 단백질을 생산하는 데 사용된다. 다르게는, 세포는 예를 들면 펩티드, 아미노산, 지방산 또는 기타 유용한 생화학적 중간체 또는 대사물 또는 임의의 다른 유용한 물질을 생산할 수 있다.
"발효기"는 미생물이 미생물의 성장에 적합한 조건이 유지되도록 유용한 물질을 합성하는 장치 또는 기구이다. 생물 반응기에 대해 상기 언급한 구체적인 사항은 필요한 부분만 수정하여 적용된다. 본 발명의 발효기는 대규모 발효에 사용된다. 대규모 발효기의 공지된 상업적 생성물은 예를 들면 항생제, 항체, 호르몬 또는 상기 세포 또는 미생물에 의해 합성된 효소이다.
생산된 미생물은 상이한 목적, 예를 들면, 폐수 처리, 식품 생산을 위한 식품 산업, 약물, 예를 들면, 항생제 또는 인슐린의 제조를 위한 생명 공학 분야, 해충 방제 또는 폐기물, 오염 물질, 예를 들면, 기름 오염의 생물 분해에 유용하다.
본 발명에서 표현 "산업적 규모" 또는 "대규모"는 상호 교환적으로 그리고 동의어로 사용되며, 규모가 증가함에 따라 단위 생산당 비용이 감소하는 종종 비용 이점이 있는 대량 생산으로 얻어지는 생성물에 관한 것이다. 대형 제조 유닛은 다른 모든 요소가 동일할 때 더 작은 유닛보다 생산 단위당 비용이 더 낮을 것으로 예상된다. 산업적 규모는 사용되는 생물 반응기의 용적이 약 2,000L 이상인 세포의 배양과 관련하여 이해될 수 있다. 산업적 규모는 사용되는 발효기의 용적이 약 1,000L 이상인 미생물의 배양과 관련하여 이해될 수 있다. 추가의 양태에 따르면, 산업적 규모로 사용되는 생물 반응기 또는 발효기의 용적은 6,000L, 8,000L, 10,000L, 12,000L, 15,000L 또는 그 이상일 수 있다.
"교반기"는 교반에 사용되는 물체 또는 기계 장치, 예를 들면, 자기 교반기이다. 세포 또는 미생물의 배양에 일반적으로 사용되는 모든 종류의 교반기가 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 교반기는 예를 들면 임펠러, 러쉬톤(Rushton) 터빈, 교반 패들, 블레이드 교반기, 예를 들면, 피치 블레이드 교반기 등이다.
"스파저"는, 산소 및/또는 기체 버블을 액체상 내로 제공하고 세포 또는 미생물이 배양되는 액체상에 존재하는 생물 반응기 또는 발효기에서 사용되는 기체 공급 또는 공급 장치이다. 선행 기술에 따른 생물 반응기 또는 발효기는, 일반적으로 저부 상에 또는 이에 가깝게 위치하는 1개의 스파저만을 갖는다. 본 발명에서, 이러한 스파저는 "제1 스파저" 또는 "침잠 스파저"로도 지정되며, 두 표현 모두 상호교환적으로 그리고 동의어로 사용된다.
본 발명에 따르면, 제1 스파저 위로 미리 정의된 거리 η의 위치에 위치되고 추가의 기체 버블 및/또는 추가의 산소 기체 버블을 액체 배지에 연속적으로 공급하는 추가의 스파저, 즉 제2 스파저를 제공하는 것은 배양 공정에 대한 다양한 이점을 가지며, 이는 상기 및 하기 설명으로부터 숙련가에게 명백하다.
하기에서, 본 발명에 따른 생물 반응기 또는 발효기에서 일어나는 공정 및 반응이 보다 더 상세히 기술된다.
일반적으로 생물 반응기 또는 발효기의 하부 또는 저부에 1개의 기체 공급 장치만 존재하는 생물 반응기 또는 발효기에서, 액체상 내로 진입하는 버블은 세포 배양 배지로부터 CO2를 흡수할 수 있는 능력을 갖지만, 이러한 능력은 버블의 상승 과정에서 점점 더 손실된다. 생물 반응기 또는 발효기의 상부 또는 상단부에서는 상기 설명한 높이에 따라 액체상으로부터 버블의 용해된 CO2 흡수가 더 이상 일어나지 않는다. 따라서, CO2 함량은 생물 반응기 또는 발효기의 저부으로부터 상부로 증가하여 액체상 내에 CO2 구배를 초래한다.
일반적으로 생물 반응기 또는 발효기의 액체상에 존재하는 CO2 구배, 및 CO2의 이러한 불균일한 분포와 관련된 단점은, 대규모의 생물 반응기 또는 발효기의 액체상에 있는 제1 스파저로부터 거리 η로 이격되어 제1 스파저 위로 제2 스파저가 제공되는 본 발명에 의해 극복될 수 있다. 제2 스파저는 더 이상 CO2를 흡수할 수 없는 버블의 CO2 포화의 수립을 상쇄하기 위해 제공된다. 제2 스파저는 새로운 버블을 액체상 내로 추가하여 O2 및 CO2를 통과하는 과정이 제1 스파저 위에서 추가로 다시 진행될 수 있게 한다.
예시의 방식으로, 대규모의 생물 반응기 또는 발효기에서 액체상에서 발생하는 문제의 공정 및 반응이 도 5에 개략적으로 표시되어 있다. 도 5의 좌측 섹션 A는 교반기(도시되지 않음) 근처에 1개의 기체 공급 장치 또는 스파저만 있는 개략적인 생물 반응기 또는 발효기를 예시한다. 스파저는 생물 반응기 또는 발효기의 저부에 또는 그 근처에 위치된다. 1개의 스파저만을 사용하는 표준 기체공급(gassing)은 CO2 구배를 분명히 초래한다. 특정 높이에 도달한 후 버블(10.2)이 CO2로 포화된다. 따라서, 도 5의 하부(섹션 A)에서는 CO2의 스트리핑 성능이 양호한 반면, 상부에서는 CO2-스트리핑이 불량하고 수용할 수 없다.
도 5의 우측 섹션 B는, 제1 스파저 위로 제공된 추가의 제2 기체 공급 장치 또는 제2 스파저의 결과로서 도식적인 대규모의 생물 반응기 또는 발효기에 용해된 CO2 분포를 예시한다. 도 5의 섹션 B로부터 유도될 수 있는 바와 같이, 제2 스파저는 액체 배지의 표면까지 상승하기 시작하는 버블(20.1)을 제공한다. 버블(20.2)에서 확인할 수 있듯이 O2 기체는 버블(20.2)로부터 액체상 내로 이동하고(반응 (1)), CO2 기체는 액체상으로부터 버블(20.2) 내로 이동하여(반응 (2)), 상이한 헨리 상수로 인해 반응(2) 속도는 반응(1) 속도보다 훨씬 더 빠르다(상이한 두께의 화살표로 도 5에 나와 있음). 따라서, 섹션 B에서 액체상의 중간부 및 상부에서의 CO2의 스트리핑은 도 5의 좌측의 섹션 A에서 나타낸 바와 같이 액체상의 하부에서의 CO2-스트리핑과 유사하다. 따라서, 액체 배지에서의 전체 상승 높이에 걸친 CO2 구배가 방지된다. 생물 반응기 또는 발효기에 존재하는 세포 또는 미생물은 보다 일관된 환경을 경험하고, 훨씬 더 적은 범위의 변동의 가해지며 이는 세포 또는 미생물의 대사적 반응에 영향을 미칠 수 있다.
버블이 액체상을 통한 상승 동안 CO2로 포화될 수 있는 것을 방지하는 방식으로 버블의 절대 상승 높이를 단축시키기 위해, 제2 스파저가 제1 스파저 위에 제공된다. 또한, 진탕기에 의해 분산되지 않기 때문에, 액체상 내의 제2 스파저로부터 발생하는 버블의 체류 시간이 감소되고, 버블이 액체 표면으로 상대적으로 빠르게 상승한다. 따라서, CO2 스트리핑 성능은 생물 반응기 또는 발효기의 상부에서도 양호하다.
추가의 양태에 따르면, 제3 스파저 및 또한 추가의 스파저들이 제2 스파저 등 위에 존재할 수 있어, 3개의 스파저, 4개의 스파저 또는 그 이상이 생물 반응기 또는 발효기에 동시에 존재한다. 따라서 제2 스파저에 대한 상기 설명은 제3 스파저, 제4 스파저, 제5 스파저 및 추가의 스파저에 적용된다.
결과적으로, 대규모 생물 반응기 또는 발효기는, 액체상의 CO2 분포에 직접적인 영향을 미치기 위해 스파저가 배치되는 상이한 하위 구획(subcompartment)들로 세분화된다. 대규모 생물 반응기 또는 발효기의 더 작은 유닛의 이러한 종류의 "분리"는 개선된 비교 가능성을 열어주어, 실험실 규모와 비교하여 산업적 규모의 배양에 대한 및 그 반대의, 유리하게는 대사율이 상승되고/되거나 생존율이 증가되고/되거나 생산성이 증가된 경우의 예측 가능성을 향상시킨다.
대형 생산 규모로 실행되는 생물 반응기 또는 발효기 내에 제2 스파저 또는 임의의 제3 스파저 및 추가의 스파저를 제공하면, 대형 용적의 사용에도 불구하고 배양되는 세포 또는 미생물의 물리화학적 환경 조건들의 조화에 영향을 미친다. 따라서, 본 발명의 개념은 CO2 분포가 전체 액체상에 걸쳐 보다 균일하게 분포된다는 점에서 산업적 규모을 실험실 규모에 적응시키는 접근 방식이다.
또한, 액체상 중 용해된 CO2 농도는 제2 스파저 또는 임의의 제3 스파저 및 추가의 스파저의 존재로 인해 적절한 농도 또는 수준으로 감소될 수 있다. CO2 농도는 특히 더 높은 농도에서 세포 배양 성능에 영향을 미치므로, 높은 CO2 농도가 호기성 세포의 성장을 억제한다는 점을 염두에 두고(문헌[David R. Grayet al., CO2 in large-scale and high-density CHO cell perfusion culture, Cytotechnology 1996, 22, 65-78] 참조), 높은 CO2 농도는 세포 배양 배지 자체에서 피해야 한다. 제2 스파저 및 추가의 제3 스파저 또는 추가의 다른 스파저는 이러한 바람직하지 않은 높은 액체상 중 CO2 함량의 발생을 방지하는 데 도움이 된다.
또한, 액체 배지에 추가의 공기 버블 및/또는 추가의 산소 기체 버블을 연속적으로 공급하는 추가의 제2 스파저 및 또한 제3 스파저 및 추가의 스파저는 전체 액체상에 걸쳐 보다 균일한 O2 분포도 초래한다.
따라서, 추가의 양태에 따르면 제1 스파저, 제2 스파저 및 제3 스파저 위에 제공되는 (하나의) 추가의 스파저(들)가 존재할 수 있다.
제2 스파저 및 또한 추가의 스파저의 위치가 액체상 중 O2 농도 및 CO2 농도 관리의 관점에서 배양의 성능 및 효율성에 긍정적인 영향을 미칠 수 있음이 확인되었다.
제1 스파저가 생물 반응기 또는 발효기의 저부 또는 하부에 또는 그 근처에 위치한다고 가정하면, 제2 스파저는 항상 제1 스파저 위에, 예를 들면 생물 반응기 또는 발효기의 중간 또는 상부에 위치한다. 제2 스파저의 위치를 추가로 확인하기 위해, 본질적으로 대규모의 생물 반응기 또는 발효기 내의 제2 스파저의 위치를 변경하는 두 가지 주방향이 있다. 하나의 주방향은 수직 방향, 즉 생물 반응기 또는 발효기의 저부으로부터 상단으로 스파저의 위치를 변경하는 것이다. 즉, 제2 스파저는 예를 들면 생물 반응기 또는 발효기의 저부에 더 가깝게, 상단에 더 가깝게 또는 이들 사이의 임의의 거리에 위치될 수 있다. 이와 관련하여, 존재하는 액체상 내에 기체 버블이 제공되어야 하기 때문에, 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이는 절대 용적이 아니라 관찰되어야 한다.
본 발명의 양태에 따르면, 생물 반응기 또는 발효기는 약 8 내지 약 20m, 약 9 내지 약 15m, 약 9.5 내지 약 12m의 범위 또는 약 10m의 충전 높이를 포함한다.
고려할 수 있는 두 번째 주방향은 수평 방향, 즉 생물 반응기 또는 발효기의 측벽과 중심 축 사이의 스파저의 위치이다. 중심 축은 원통형 기하학을 갖는 것으로 추정되고 주변 측벽과의 간격이 모든 곳에서 동일하거나 거의 모든 곳에서 동일한 것으로 추정되는 생물 반응기 또는 발효기 내의 가상의 선이다. 즉, 제2 스파저는 예를 들면 생물 반응기 또는 발효기의 측벽에 더 가깝게, 중심 축에 더 가깝게 또는 그 사이의 임의의 거리에 위치될 수 있다.
추가의 양태에 따르면, 연속적인 스파저들은 수직 방향으로 하나가 다른 것 위에 정확하게 위치될 수 있다. 다른 양태에 따르면, 연속적인 스파저들은 수직 방향으로 서로에 대해 측방향으로 이동하여 위치될 수도 있다.
따라서, 본 발명에 따르면 제2 스파저는 제1 스파저로부터 거리 η로 생물 반응기 또는 발효기의 용기 내의 일정 위치에 위치된다. 거리 η는 예를 들면 생물 반응기 또는 발효기의 측벽을 따르는 수직 거리로 이해되어, 제2 스파저는 제1 스파저 위로 거리 η의 위치에 위치된다. 거리 η는 각각 제1 스파저 위로 적어도 약 0.4m로부터 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이 아래로 최대 약 0.5m까지의 범위로부터 선택되거나,
제1 스파저 위로 적어도 약 0.4m로부터 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이의 약 2/3까지의 범위로부터 선택되거나,
제1 스파저 위로 적어도 약 0.4m로부터 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이의 약 1/2까지의 범위로부터 선택되거나,
제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 3.0m, 약 0.4 내지 약 2.5m, 약 0.4 내지 약 2.0m, 약 0.4 내지 약 1.5m의 범위로부터 선택되거나 또는
약 0.4 내지 약 1.0m, 약 0.45 내지 약 0.90m, 약 0.5 내지 약 0.80m, 약 0.55 내지 약 0.70m의 범위로부터 선택되거나 또는 약 0.6m로부터 선택된다.
따라서, 제1 스파저와 제2 스파저 사이의 거리 η는 제1 스파저 위로 약 0.4m의 하한값, 및 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이 아래로 약 0.5m까지의 상한값을 갖는다. '액체 높이'와 동의어로 사용되는 표현 "충전 높이"는 배양 공정 시작시 생물 반응기 또는 발효기에 존재하는 액체의 충전 수준을 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 이는 존재하는 액체의 표면 또는 액체의 공칭 용적에 의해 추가로 결정된다. 따라서, 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이 아래로 0.5m는 배양 공정 시작시 생물 반응기 또는 발효기에 존재하는 액체의 표면 아래로 0.5m와 동의어이다.
예를 들면, 전체 충전 높이가 10m인 경우, 충전 높이 아래로 0.5m는 9.5m이다. 그 다음, 거리 η는 약 0.4 내지 약 9.5m의 범위에서 선택된다. 이러한 범위의 하한 및 상한은 본 발명에 대한 임계값으로 간주된다.
생물 반응기 자체의 2개의 스파저의 존재는 CO2 스트리핑이 일어나는 액체 배지의 면적을 증가시킨다. 제2 스파저가 액체 표면 근처, 예를 들면, 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이 아래로 약 0.5m까지에 있는 경우, 다운스트림 영역을 스트리핑할 수 있는 반면, 생물 반응기 저부 근처에 배치되는 제1 스파저는 액체 배지의 업스트림 영역을 스트리핑할 수 있다. 요약하면, 생물 반응기 또는 발효기의 전체 충전 높이는 CO2-스트리핑에 가해진다.
거리 η는 제1 스파저 위로 적어도 약 0.4m로부터 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이의 약 2/3까지의 범위로부터 선택될 수 있다. 표현 "생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이의 약 2/3"는 제2 스파저가 총 충전 높이의 약 2/3가 달성되는 위치에 위치됨을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 총 충전 높이가 12m인 경우, 총 충전 높이의 2/3는 8.0m이다. 그 다음, 거리 η는 약 0.4 내지 약 8.0m의 범위에서 선택된다.
거리 η는 제1 스파저 위로 적어도 약 0.4m로부터 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이의 약 1/2 범위로부터 선택될 수도 있다. 표현 "생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이의 약 1/2"은 제2 스파저가 총 충전 높이의 약 1/2 또는 액체 용적의 약 0.5배가 존재하는 위치에 위치됨을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 총 충전 높이가 11m인 경우, 총 충전 높이의 1/2은 5.5m이다. 그 다음, 거리 η는 약 0.4 내지 약 5.5m의 범위에서 선택된다.
거리 η는 약 0.4 내지 약 3.0m, 약 0.4 내지 약 2.5m, 약 0.4 내지 약 2.0m, 약 0.4 내지 약 1.5m, 약 0.4 내지 약 1.0m, 약 0.45 내지 약 0.90m, 약 0.5 내지 약 0.80m, 약 0.55 내지 약 0.70m의 범위로부터 선택되거나 또는 약 0.6m가 선택될 수도 있다. 따라서, 거리 η는 각각 제1 스파저 위로 약 3.0m, 약 2.9m, 약 2.8m, 약 2.7m, 약 2.6m, 약 2.5m, 약 2.4m, 약 2.3m, 약 2.2m, 약 2.1m, 약 2.0m, 약 1.9m, 약 1.8m, 약 1.7m, 약 1.6m, 약 1.5m, 약 1.4m, 약 1.3m, 약 1.2m, 약 1.1m, 약 1.0m, 약 0.95m, 약 0.90m, 약 0.85m, 약 0.80m, 약 0.75m, 약 0.70m, 약 0.65m, 약 0.6m, 약 0.55, 약 0.45 및 약 0.4m가 선택될 수 있다.
추가의 양태에서, 거리 η는 제1 스파저 위로 적어도 약 0.6m로부터 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이 아래로 최대 약 0.5m까지의 범위로부터 선택될 수 있거나,
제1 스파저 위로 약 0.6m로부터 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이의 약 2/3까지의 범위로부터 선택될 수 있거나,
제1 스파저 위로 약 0.6m t로부터 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이의 약 1/2까지의 범위로부터 선택될 수 있거나,
제1 스파저 위로 약 0.6 내지 약 3.0m, 제1 스파저 위로 약 0.6 내지 약 2.5m, 제1 스파저 위로 약 0.6 내지 약 2.0m 또는 제1 스파저 위로 약 0.6 내지 약 1.5m의 범위로부터 선택될 수 있거나 또는
제1 스파저 위로 약 0.6 내지 약 1.0m, 제1 스파저 위로 약 0.6 내지 약 0.90m, 제1 스파저 위로 약 0.6 내지 약 0.80m, 제1 스파저 위로 약 0.6 내지 약 0.70m의 범위가 선택되거나 또는 제1 스파저 위로 약 0.6m가 선택될 수 있다.
값이 뒤따르는 용어 "약"은 상기 값±5%, 상기 값±4%, 상기 값±3%, 상기 값±2% 또는 상기 값±1%를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
거리 η를 결정하기 위해, 스파저(들)의 기체 배출구 개구부(들)의 위치, 즉 기체 버블이 액체상으로 들어가는 개구부(들)의 위치가 핵심 기준이 되는 것이 중요하다. 1개의 스파저에 여러 개의 개구부가 있는 경우, 평균값을 사용하여 적절한 거리를 결정할 수 있다.
거리 η에 대해 상기 언급한 범위 및 값은 수행된 다양한 실험, 계산 및 평가의 결과이며, 이에 따라 생물 반응기 또는 발효기 내에서 제2 스파저가 제1 스파저로부터 일정 거리에 또는 제1 스파저 위의 버블이 CO2 기체상 포화 농도에 도달했거나 곧 도달하는 상승된 높이에 제공된다.
산업적 규모의 폭기 교반 생물 반응기 또는 발효기의 높이에 걸친 CO2 기체상 포화 농도의 평가는 다음 고려 사항들을 기반으로 수행되었다:
본 발명자들의 실험(도 2 내지 4 참조)에 따라, 12,000L의 산업적 규모 폭기 교반 생물 반응기 또는 발효기에서 이산화탄소에 대한 용적 물질 전달 계수 kLaCO2는, 실험실 규모(2L)에서의 이산화탄소에 대한 용적 물질 전달 계수 kLaCO2보다 약 10배 더 낮다. 대조적으로, 두 시스템 모두에 대한 용적 산소 물질 전달 계수 kLaO2의 양은 비슷하다.
공지된 바와 같이 산소 물질 전달과 반대로, 연속 액체상으로부터 기체상 내로의 이산화탄소의 물질 전달은 짧은 시간 기간 후에 이미 완료되어 있다. 시스템에서 기체상의 체류 시간이 기체 버블의 포화가 발생할 때까지의 시간 기간보다 긴 경우, 상기 버블은 CO2 물질 전달에 더 이상 사용할 수 없다. 결과적으로 이러한 효과는 산업적 규모의 반응기에서만 발생하고 실험실 규모에서는 발생하지 않는다.
작업 동안 산업적 규모 시스템(예를 들면, 12,000L)에서 기체 버블이 CO2로 포화된 후 시간 기간의 평가의 경우, 상기 버블은 특정 공간 경계 계면인 CO2의 스트리핑에 더 이상 기여하지 않으며, CO2 물질 전달 계수 kLaCO2도 고려되어야 한다.
따라서, 먼저 기체상의 체류 시간 분포에 대한 평가는 다음과 같이 이루어졌다:
기체상 체류 시간은 실험 섹션에 자세히 설명된 바와 같이 단계 응답 방법("Sprungantwortmethode")에 의해 측정되었다. 자세한 결과는 실험 섹션에 나와 있다. 단계 기능 응답 방법은 2가지 상이한 기체의 사용에 기초하며, 산소와 같은 하나의 기체는 물과 같은 액체를 포화시키는 데 사용되고 이산화탄소 또는 질소 기체와 같은 다른 기체는 이를 대체하고 액체상으로부터 배출하는 데 사용된다. 기체의 추가는 생물 반응기 또는 발효기의 저부으로부터 수행되고, 배출된 기체는 반응기 상부 근처에서 액체상 내에서 계측된다. 당업자는 기체상 체류 시간을 계측하기 위한 이러한 방법에 친숙하다.
따라서, 단계 기능 응답 방법을 사용하여, 실험실 규모(30L)의 생물 반응기 또는 발효기의 기체상 체류 시간은 5초로 측정되었고 산업적 규모(12,000L)의 생물 반응기 또는 발효기의 기체상 체류 시간은 21초인 것으로 확인되었다.
이후, 실험 섹션에 설명된 추가의 실험 계측 및 평가에 따르면, CO2의 물질 전달 계수는 실험실 규모의 생물 반응기 또는 발효기(2L)에서 4±0.68h-1인 것으로 확인되었다.
12,000L 시스템에서 버블 크기의 단분산 분포가 d = 5mm라고 가정하면, 단일 버블에서의 이론적 이산화탄소 프로파일을 계산할 수 있다. 버블 내 CO2 농도 프로파일은 다음과 같이 이산화탄소 물질 전달 계수 kLaCO2 = 4±0.68h-1이 산업적 규모에 대해서도 적용된다는 가정 하에 계산할 수 있다:
실시예 6에 나타낸 실험(도 20 참조)으로부터, 약 3.5초 후에 약 95%의 기체 버블의 포화가 관찰될 수 있음을 추론할 수 있다.
동일한 실시예에 따른 산업적 규모의 생물 반응기 또는 발효기에서 계측된 약 21초(도 20)의 평균 기체상 체류 시간 및 3.6m의 버블에 의해 이동한 측정된 총 거리를 기준으로 하여, 평균 버블 상승 속도는 0.17m/s로 측정된다(속도 = 거리/시간). 결과적으로 약 h = 0.6m(3.5s x 0.17m/s)의 높이 이후, 기체상은 CO2로 포화되어 더 이상 CO2의 스트리핑이 관찰되지 않을 수 있다.
상기 평가, 계측 및 계산에는 일부 평가 및 추정이 포함되므로, 0.6m의 얻어진 결과는 거리 η에 대한 대략적인 값일 뿐이며, 이는 제1 스파저 위로 적어도 약 0.4m로부터 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이 아래로 최대 약 0.5m까지의 범위로 보다 양호하게 제시된다.
또한, 실험에서 거리 η에 제공된 제2 스파저의 존재가 산업적 규모로 액체 배지에서 현탁액 중의 세포 또는 미생물을 배양하는 데 특히 이점이 있음이 확인되었다. 제1 스파저 위로 상기 범위로부터 선택되는 거리 η의 위치에 위치되는 제2 스파저의 존재가 CO2 스트리핑에 긍정적인 영향을 미칠 것으로 예상할 수 있다. 제2 스파저의 존재는 생물 반응기 또는 발효기의 배양물(액체 배지)에서 CO2의 분압의 감소를 발생시키는 것으로 추정될 수 있다. 즉, 2개의 생물 반응기/발효기를 서로 비교하면, 이들 둘은 동일한 액체 배지를 사용하여 동일한 조건 하에 작동되고 동일한 세포 또는 미생물이 각각 배양되지만, 생물 반응기/발효기 둘 다 사이의 유일한 차이점은, 하나의 생물 반응기/발효기에서는 1개의 스파저가 사용되고(따라서 최신 기술을 반영함) 본 발명에 따른 다른 생물 반응기/발효기에서는 거리 η로 위치된 2개의 스파저가 사용된다는 것이다. 그러면, CO2의 분압이, 2개의 스파저를 갖는 생물 반응기/발효기에서, 1개의 스파저를 갖는 생물 반응기/발효기에 비해 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1%, 적어도 약 2% 최대 약 20% 감소할 것으로 예상할 수 있다. CO2 분압의 감소 정도는, 1개의 스파저로 수행된 실험(비교 실시예 1 및 도 21 참조)에 기초하여 2개의 스파저가 사용된 평가 계측(실시예 2 내지 6 참조)과 관련하여 추정할 수 있으며, 이는 생물 반응기 또는 발효기의 하부, 중간부 및 상부에 존재하는 O2 및 CO2 함량에 대한 결론을 도출할 수 있다.
또한, 본 발명에 따라 제2 스파저가 존재하는 경우, 1개의 스파저만이 사용되는 생물 반응기 또는 발효기에 비해 더 높은 생성물 역가 및 더 높은 생성물 수율이 예상될 수 있다. 생성된 생성물 역가 또는 생성물 수율은, 동일한 조건 등 하에 작동되는 1개의 스파저만이 사용되는 동일한 생물 반응기 또는 발효기에서보다 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10% 최대 약 30% 더 높은 것으로 추정될 수 있다. 생성물 역가 또는 수율의 정도는 1개의 스파저로 수행된 실험(비교 실시예 1 및 도 21 참조)에 기초하여 2개의 스파저가 사용된 평가 계측(실시예 2 내지 6 참조)과 관련하여 추정될 수 있으며, 이는 생물 반응기 또는 발효기의 하부, 중간부 및 상부에 존재하는 O2 및 CO2 함량에 대한 결론을 도출한다. 대규모로 상업적으로 사용되는 공정의 약간의 개선이 해결되어야 하는 가치 있는 기술적 문제를 나타낸다는 점에도 유의해야 한다. ml당 수백만 개의 예를 들면 단백질 생산 세포가 있는 10,000L 이상의 대표적인 대규모 생물 반응기의 총 용적을 고려할 때, 수율 또는 기타 산업적 특징의 작은 개선이라도 대규모 생산에서 매우 적절한 개선을 의미하며, 이는 상당한 것으로 간주되어야 한다.
따라서, 기재된 범위 또는 범위들 중 거리 η의 선택은 상당한 이점 및 기술적 효과 또는 이익, 특히 생물 반응기의 배양물(액체 배지)에서 CO2의 분압의 감소 및 생성물 역가의 증가 각각을 갖는다는 것이 본 발명에 따라 확인되었다.
본 발명에 따른 생물 반응기 또는 발효기 내 2개의 스파저의 존재는 CO2-스트리핑이 발생하는 액체 배지의 총 영역을 증가시킨다. 제2 스파저는 거리 η의 위치에 위치될 수 있으며, 상기 η는 제1 스파저 및 제2 스파저에 의해 CO2-스트리핑이 수행되는 영역이 어느 정도 중첩되도록 선택될 수 있다. 한편으로, 스파저들의 영역들의 중첩도(degree of overlapping)가 증가하면 유리한 효과가 크게 향상될 것으로 예상할 수 있다. 반면에 2개의 스파저가 너무 가까이 접근하는 경우, 예를 들면, 거리 η가 0.4m 미만 또는 0.3m 미만 또는 이보다 더 작은 경우, 제2 스파저는 제1 스파저에 대해 점점 더 작은 추가의 효과를 제공할 가능성이 가장 높다.
거리 η가 제1 스파저 위로 적어도 약 0.4m로부터 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이의 약 2/3까지의 범위로부터 선택되는 경우, 유리한 기술적 효과가 보다 더 두드러질 것으로 예상할 수 있다.
거리 η가 제1 스파저 위로 적어도 약 0.4m로부터 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이의 약 1/2까지의 범위로부터 선택되는 경우, 유리한 기술적 효과가 훨씬 더 두드러질 것으로 예상할 수 있다.
거리 η가 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 3.0m의 범위, 보다 바람직하게는 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 2.5m, 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 2.0m, 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 1.5m, 가장 바람직하게는 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 1.0m, 제1 스파저 위로 약 0.45 내지 약 0.90m, 제1 스파저 위로 약 0.5 내지 약 0.80m, 제1 스파저 위로 약 0.55 내지 약 0.70m의 범위가 선택되거나 또는 제1 스파저 위로 약 0.6m가 선택되는 경우, 유리한 기술적 효과가 특히 강해질 것으로 예상할 수 있다.
따라서, 제1 스파저와 제2 스파저 및 모든 추가의 스파저들 사이의 거리 η 각각은, 존재하는 경우, 상기한 바와 같은 범위 또는 범위들 내가 선택된다.
따라서, 여러 개의 스파저가 존재하는 경우, 일 양태에서 제2 스파저는 제1 스파저 위로 0.4 내지 10m의 거리 η1,2로 위치될 수 있고, 제3 스파저는 제2 스파저 위로 0.4 내지 10m의 거리 η2,3로 위치될 수 있는 등이다. 상이한 거리들을 구별하기 위해, 제1 스파저와 제2 스파저 사이의 거리 η를 η1,2로 지정하고, 제2 스파저와 제3 스파저 사이의 거리를 η2,3으로 지정하는 등이다.
따라서, 1개의 스파저가 다른 스파저 위에 위치되는 2개의 연속적인 스파저 사이의 거리는 η가 선택될 수 있다.
거리 η는 존재하는 모든 스파저들 사이에 동일할 수 있거나 상이할 수 있지만, 항상 개시된 범위로부터 선택된다.
보다 더 나은 이해를 위해, 다음의 예가 제시된다.
생물 반응기 또는 발효기는 10m의 충전 높이를 갖는 용기를 포함한다. 제1 스파저는 생물 반응기 또는 발효기의 저부 가까이에 존재한다. 제2 스파저는 제1 스파저와 제2 스파저 사이의 거리 η(또한 η1,2로도 지정됨)로 생물 반응기 또는 발효기에 위치될 수 있으며, 상기 거리 η1,2는 제1 스파저로부터 약 0.6m 이격되도록(버블이 액체상으로 들어가는 2개의 스파저 모두 각각의 개구부들 사이의 거리로 측정됨) 선택된다. 제3 스파저는 제2 스파저와 제3 스파저 사이의 거리가 η2,3인 위치에 위치된다. 이러한 예에서 η2,3도 0.6m의 양이다. 즉, 제2 스파저는 제1 스파저의 위치보다 0.6m 위에 위치되고, 제3 스파저는 제2 스파저 위로 0.6m에 위치된다. 따라서, 제3 스파저는 제1 스파저 위로 2 x η의 거리의 위치에 위치된다. 따라서, 스파저들 사이의 η1,2 및 η2,3은 동등하게 크다. 존재하는 추가의 스파저들은 η3,4, η4,5, η5,6, …일 수 있는 거리를 가질 수 있다.
그러나, 모든 거리들이 동일한 값을 가질 필요는 없으며, 상기 개시된 범위로부터 서로 독립적으로 선택될 수 있다. 즉, η1,2, η2,3, η3,4, η4,5, η5,6, … 는 서로 독립적으로 선택될 수 있으며, 동일하거나 상이할 수 있다.
제2 주방향에 따라, 제2 스파저는, 제2 스파저로부터 제공되는 기체 버블 및/또는 산소 기체 버블이 생물 반응기 또는 발효기의 측벽에 더 가깝게 또는 중심 축에 더 가깝게 액체상 내로 들어가도록, 생물 반응기 또는 발효기의 측벽에 더 가깝게 또는 중심 축에 더 가깝게 위치될 수 있다.
또 다른 양태에 따르면, 제2 스파저는, 스파저가 생물 반응기 또는 발효기의 측벽 및 중심 축에 대해 동시에 거의 동일한 거리를 갖는 위치에 위치될 수도 있다.
따라서, 일 양태에 따르면 스파저(들)는 센트럴(central) 스파저 또는 사이드 스파저일 수 있다.
"센트럴 스파저"는, 센트럴 스파저가, 스파저로부터의 공기 버블 및/또는 산소 기체 버블이 수평 방향과 관련하여 생물 반응기 또는 발효기의 측벽보다 중심 축에 더 가까운 액체상 내로 제공되는 방식으로 디자인된다는 의미로 본 발명에서 이해되어야 한다.
"사이드 스파저"는, 공기 버블 및/또는 산소 기체 버블이 수평 방향과 관련하여 생물 반응기 또는 발효기의 중심 축보다 측벽에 더 가깝게 제공되는 방식으로 디자인된 스파저로 본 발명에서 이해되어야 한다.
일 양태에 따르면, 제1 스파저는 센트럴 스파저 또는 사이드 스파저일 수 있다.
다른 양태에 따르면, 제1 스파저는 센트럴 스파저일 수 있고, 제2 스파저는 센트럴 스파저일 수 있다.
다른 양태에 따르면, 제1 스파저는 센트럴 스파저일 수 있고, 제2 스파저는 사이드 스파저일 수 있다.
추가의 양태에 따르면, 제1 스파저 및 제2 스파저는 각각 사이드 스파저일 수 있다.
일 양태에 따르면, 임의의 제3 스파저는 센트럴 스파저 또는 사이드 스파저일 수 있다.
다른 양태에 따르면, 제1 스파저는 센트럴 스파저일 수 있고, 제2 스파저는 센트럴 스파저일 수 있고, 임의의 제3 스파저는 센트럴 스파저일 수 있다.
다른 양태에 따르면, 제1 스파저는 센트럴 스파저일 수 있고, 제2 스파저는 사이드 스파저일 수 있고, 제3 스파저는 사이드 스파저일 수 있다.
다른 양태에 따르면, 제1 스파저는 센트럴 스파저일 수 있고, 다른 모든 스파저는 사이드 스파저일 수 있다.
다른 양태에 따르면, 제1 스파저는 사이드 스파저일 수 있고, 다른 모든 스파저는 사이드 스파저일 수 있다.
일 양태에서, 제2 스파저가 사이드 스파저인 경우, 본원에 개시된 바와 같은 유리한 기술적 효과가 상당히 증가될 수 있음이 확인되었다.
다른 양태에 따르면, 제2 스파저는 이의 개구부가 아래쪽을 향하는 방식으로, 즉 기체 버블이 생물 반응기 또는 발효기의 저부 방향으로 제공되는 방식으로 구성될 수 있다.
생물 반응기 또는 발효기의 총 스파저 수는 필요에 따라 그리고 존재하는 충전 높이에 따라 선택할 수 있다. 스파저는 생물 반응기 또는 발효기의 전체 충전 높이에 걸쳐서 또는 그 일부에만 존재할 수 있다. 사용되는 스파저의 수는 선택되는 세포 또는 미생물의 유형, 생물 반응기 또는 발효기의 치수, 배양 조건 등에 따른다. 당업자는 본원에 개시된 설명 및 진술에 따라 사용되는 임의의 배양 시스템에 대하여 적절한 수의 스파저를 쉽게 선택할 수 있다.
추가의 양태에 따르면, 생물 반응기 또는 발효기에 존재하는 교반기의 위치가 제1 스파저 및/또는 제2 스파저 및 임의의 추가의 스파저와 관련하여 고려되는 것이 유리한 것으로 확인되었다. 사용되는 교반기는 어떤 식으로든 제한되지 않지만, 선택된 임의의 교반기는 생물 반응기 또는 발효기를 통해 중심 축(A) 주위에 위치하는 교반기 반경(rs)을 갖는다. 많은 실험에 따르면, 제공되는 기체 버블이 교반기 반경(rs)과 같거나 이보다 작은 거리로 액체 매질에 들어가도록, 생물 반응기 또는 발효기의 중심 축(A)으로부터 일정 거리에 배치되는 경우가 유리한 것을 나타낸다. 이와 관련하여 제1 스파저가 센트럴 스파저인지 사이드 스파저인지는 중요하지 않다. 이러한 경우, 스파저는 교반기의 날개 팁(tip)에 최대 난류가 제공되도록 교반기 근처에 기체 버블을 제공한다. 이러한 형태의 액체와 기체의 고에너지 혼합은 세포 또는 미생물의 배양에 유리한 것으로 여겨진다.
추가의 실험은 제2 스파저 및 임의의 추가의 스파저가 중심으로부터 교반기 반경(rs)보다 더 먼 거리에 피팅되어 제공되는 기체 버블이 교반기 운동의 외부 또는 명확하게 외부에 제공되게 하는 것이 바람직함을 보여주었다. 즉, 제2 스파저 및 임의의 추가의 스파저는 제공되는 버블이 교반기 반경(rs)보다 큰 거리에서 액체상으로 들어가도록, 중심 축(A)으로부터 일정 거리에 배치된다. 이와 관련하여 제2 스파저(및 추가의 스파저)가 센트럴 스파저인지 사이드 스파저인지는 중요하지 않다. 이러한 경우에 제2 스파저는 교반기로부터 이격된 기체 버블을 제공하여, 제공된 기체 버블을 변형시키거나 손상시킬 수 있는 난류를 방지한다. 따라서 액체와 기체의 고에너지 혼합은, 유익한 기술적 효과, 예를 들면, CO2 스트리핑 성능 및 생성물의 수율이 부정적인 영향을 받을 수 있기 때문에, 제2 스파저 및 임의의 추가의 스파저의 효율성에 불리한 것으로 간주된다.
도 6a에, 생물 반응기 또는 발효기(100)의 용기(102) 내의 제1 스파저(150) 및 제2 스파저(160)의 위치가 예시적으로 도시되어 있다. 생물 반응기 또는 발효기(100)는 저부(105) 및 측벽(110)을 가지며 직경(D)을 갖는다. 기체 공급 튜브(140) 또는 여러 개의 기체 공급 튜브(도시되지 않음)는 제1 스파저(150) 및 제2 스파저(160)를 형성하는 방식으로 측벽(110) 근처에 배치되고 디자인되고 설치된다. 제1 스파저(150)는 생물 반응기 또는 발효기(100)의 저부(105)에 또는 그 근처에 하부에 위치된다. 도시된 양태에서, 제1 스파저(150)는 센트럴 스파저이며, 즉 기체 버블은 수평 방향에 대해 측벽(110)보다 중심 축(A)에 더 가깝게 액체상으로 들어간다. 그러나, 이미 설명된 바와 같이 제1 스파저(150)가 사이드 스파저일 수 있는 것도 가능하다.
제2 스파저(160)는 제1 스파저(150) 위에 제공된다. 도시된 양태에서, 제2 스파저(160)는 사이드 스파저이며, 즉 액체상으로 들어가는 기체 버블이 수평 방향에 대해 중심 축(A)까지의 간격을 비교시 생물 반응기 또는 발효기(100)의 측벽(110)에 더 가깝게 위치된다. 그러나, 이미 설명된 바와 같이 제2 스파저(160)가 센트럴 스파저일 수 있는 것도 가능하다.
도 7은 사이드 스파저(150, 160, 170)로서 사용될 수 있는 예시적인 유형의 스파저의 개략도를 도시한다. 물론 다른 유용한 스파저 유형도 상업적으로 입수 가능하고 사용될 수 있다.
도 6a에서 제2 스파저(160)는 생물 반응기 또는 발효기(100) 내에서 제1 스파저(150)보다 일정 높이 또는 거리 η1,2 위에 위치된다. 거리 η1,2는 제1 스파저(150) 위로 적어도 약 0.4m로부터 생물 반응기 또는 발효기(100)의 충전 높이 아래로 약 0.5m까지의 범위로부터 선택되거나,
제1 스파저 위로 적어도 약 0.4m로부터 생물 반응기 또는 발효기(100)의 충전 높이의 약 2/3까지의 범위로부터 선택되거나,
제1 스파저 위로 적어도 약 0.4m로부터 생물 반응기 또는 발효기(100)의 충전 높이의 약 1/2까지의 범위로부터 선택되거나,
제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 3.0m, 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 2.5m, 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 2.0m, 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 1.5m, 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 1.0m, 제1 스파저 위로 약 0.45 내지 약 0.90m, 제1 스파저 위로 약 0.5 내지 약 0.80m, 제1 스파저 위로 약 0.55 내지 약 0.70m의 범위로부터 선택되거나 또는 제1 스파저 위로 약 0.6m가 선택된다. 도 6a에서, 제2 스파저(160)는 생물 반응기 또는 발효기(100)의 충전 높이의 약 1/2에 위치된다. 도 6a에 도시된 바와 같이, 제2 스파저(160)는 액체상으로부터 CO2를 흡수할 수 있는 "새로운" 버블을 사용할 수 있게 한다. 그 결과, 용해된 CO2를 보다 더 잘 제거할 수 있다. 액체상에서 CO2의 전체 구배는 피할 수 있는 상당한 정도가 된다. 따라서, 산업적 규모의 생물 반응기 또는 발효기의 환경 조건은, 버블이 위쪽으로 가는 방식에서 CO2 포화 농도에 도달하지 않는 소규모 생물 반응기 또는 발효기와 보다 더 유사하도록 조절된다. 따라서, 성장을 억제하는 용해된 CO2의 배양 현탁액으로부터의 스트리핑이 보다 효율적으로 수행된다. 따라서, 도 6a의 우측에 넓은 부분으로부터 화살촉 방향의 2개의 화살표(6)는 각각 액체상으로부터 기체상으로의 감소하는 CO2 흡수 용량을 상징한다. 도 6a의 화살표(7)는 화살촉으로부터 넓은 부분으로 CO2로 버블의 포화의 증가를 상징하며, 이에 따라 CO2는 액체상으로부터 기체상으로 이동하며, 이는 O2의 전달보다 훨씬 더 빠르게 진행된다. 추가의 스파저의 존재로 인해, 배양되는 세포 또는 미생물의 환경적 환경이 보다 균일하게 조절된다.
또한, 도 6a 및 예시적인 양태를 참조하면, 교반기 반경(rs)을 갖는 교반기(120)가 제공되며, 교반 축 또는 회전 축은 중심 축(A)에 해당한다. 교반기(120)는 3개의 교반기(R1, R2, R3)로 구성된다. 제1 교반기(R1)는 생물 반응기 또는 발효기(100)의 저부(105) 또는 하부에 위치한 제1 스파저(150) 위에 위치된다. 또한, 제1 교반기(R1) 이외에 2개의 추가의 교반기(R2 및 R3)가 제공되며, 추가의 교반기(R2 및 R3)는 제2 스파저(160) 위 및 아래에 위치된다. 다른 양태에 따르면, 제1 교반기(R1)만을 제공하거나, 제1 교반기(R1) 및 제2 교반기(R2)를 동시에 제공하는 것도 가능하다. 또한, 3개 초과의 교반기를 갖는 양태도 가능하다.
도 6a에 도시된 양태에서, 교반기(120)는, 생물 반응기 또는 발효기(100)를 통해 중심 축(A) 주위에 대칭 방식으로 위치된 교반기 반경(rs)을 가져, 교반기 직경(ds)을 초래한다. 제1 스파저(150)는, 도 6a의 점선 d1 및 d2로 개략적으로 예시되어 있는 바와 같이, 제공되는 기체 버블이 교반기 직경(ds) 또는 교반기 반경(rs) 이하인 거리에서 액체상으로 들어가도록, 중심 축(A)으로부터 일정 거리로 배치된다(즉, 제1 스파저의 개구부가 일정 거리에 배치됨). 이러한 발견은 문헌[Klaas Van't Riet, Review of Measuring Methods and Results in Mass Transfer in Stirred Vessels Nonviscous Gas-Liquid, Ind. Eng. Chem. Process Des. Dev., Vol. 18, No. 3, 1979, p. 357-364]에 기초하며, 여기서 스파저는 교반기 반경보다 큰 중심으로부터의 거리에 피팅될 수 없다고 명시되어 있다. 제1 스파저가 중심 축으로부터 교반기 반경(rs) 이하의 거리에 피팅되는 경우, 교반기의 날개 팁에 최대 난류가 제공되는 것이 유리한 것으로 간주된다. 또한, 액체와 기체의 고에너지 혼합은 세포 또는 미생물의 배양에 유리하다고 생각된다. 따라서, 본 양태는 이점이 있는 것으로 간주된다.
도 6a에서, 모든 교반기(R1, R2 및 R3)는, 교반기 반경(rs) 및 직경(ds)가 생물 반응기 또는 발효기(100)의 전체 용적에 걸친 3개의 교반기(R1, R2 및 R3) 모두에 대해 동일하도록 동일한 치수를 갖는다. 기타 양태도 적용 가능하다.
도시된 예시적인 양태에서, 교반기는 교반기 반경(rs)을, 따라서 생물 반응기 또는 발효기(100)를 통과하여 중심 축(A) 주위에 대칭 방식으로 위치된 교반기 직경(ds)을 가지며, 제2 스파저(160)는, 제공된 버블이 교반기 반경(rs) 또는 교반기 직경(ds)보다 큰 거리에서 액체상으로 들어가도록, 중심 축(A)으로부터 일정 거리에 배치된다. 제2 스파저 및 임의의 추가의 스파저(들)가 교반기로부터 이격된 기체 버블을 제공하는 경우, 제공된 기체 버블을 변형할 수 있거나 손상시킬 수 있는 난류가 방지된다. 따라서 액체와 기체의 고에너지 혼합은, 유익한 기술적 효과, 예를 들면, CO2 스트리핑 성능 및 생성물의 수율이 부정적인 영향을 받을 수 있기 때문에, 제2 스파저 및 임의의 추가의 스파저의 효율성에 대해 덜 유리한 것으로 간주된다.
여러 교반기가 있는 경우, 교반기 반경 또는 직경은 일반적으로 해당 스파저 옆에 위치된 교반기에 해당한다.
도 6b를 참조하면, 제1 스파저(150) 및 제2 스파저(160) 이외에, 제3 스파저(170)가 제공되어 제3 스파저(170)가 생물 반응기 또는 발효기(100) 내에서 제2 스파저(160)보다 높이 또는 거리 η2,3 위에 위치된다. 거리 η2,3은 제2 스파저(160)보다 위로 본원에 정의된 범위로부터 선택될 수 있다. 도 6b에서, 제2 스파저(160)는 생물 반응기 또는 발효기(100)의 충전 높이의 약 1/3에 위치되고, 제3 스파저(170)는 생물 반응기 또는 발효기(100)의 충전 높이의 약 2/3에 위치된다.
본 발명에 따른 제2 스파저의 존재는 CO2의 분압을 1개의 스파저만 있는 생물 반응기/발효기(최신 기술 반영)와 비교하여 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1% 또는 적어도 약 2% 내지 약 20% 이하로 상당히 감소시킬 것으로 예상된다. 또한, 1개의 스파저만 사용하는 생물 반응기 또는 발효기와 비교하여 적어도 약 1%, 적어도 약 5% 또는 적어도 약 10% 내지 약 30% 이하의 증가된 생성물 역가 및 증가된 생성물 수율이 얻어질 것으로 예상된다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명에서와 같이 산업적 규모에서 사용되는 공정의 약간만의 개선도 예를 들면, 전체 공정의 가능한 기간(유가식 공정을 몇 시간에서 1일, 2일 또는 심지어 3일까지 연장), 살아있는 세포 밀도(세포의 생존율) 또는 생성물의 결과 역가와 관련하여 상당한 개선을 나타낸다.
또한, 대규모로 작업되는 생물 반응기 또는 발효기에서 제1 스파저 이외에 제2 스파저 및 임의로 추가의 스파저의 제공은, 생물 반응기 또는 발효기 내의 O2 농도 및 CO2 농도의 독립적인 관리를 설정할 수 있는 가능성을 이미 제공한다.
따라서, 액체 배지 중의 배양물을 함유하는 용기(102)를 포함하는, 산업적 규모로 현탁액 중의 세포 또는 미생물을 배양하기 위한 생물 반응기 또는 발효기(100) 내의 액체 배지 중의 용해된 CO2의 함량 및 용해된 O2의 함량을 제어 및 조절하는 방법으로서,
액체 배지를 교반하는 단계;
용기(102)의 저부(105)에 배치되는 제1 스파저(150)로부터 액체 배지로 기체 버블들(10, 10.1, 10.2, 10.3)을 연속적으로 공급하는 단계로서, 상기 기체는 공기 및/또는 산소 기체로부터 선택되는, 상기 단계;
용기(102) 내에 배치되는 제2 스파저(160)로부터 액체 배지로 기체 버블들(20, 20.1, 20.2, 20.3)을 연속적으로 공급하는 단계로서, 상기 기체는 공기 및/또는 산소 기체로부터 선택되고, 상기 제2 스파저(160)는 상기 제1 스파저(150) 위에 위치되고, 상기 제2 스파저(160)는 사이드 스파저인, 상기 단계;
침잠 또는 제1 스파저(150)의 기체 유량 qsub 및 사이드 또는 제2 스파저(160)의 기체 유량 qside에 기초하여, 수정된 기체 유량 qmod(O2)를 선택 및 조절하고 수정된 기체 유량 qmod(CO2)를 선택 및 조절하고, 상기 수정된 기체 유량 둘 다는 배양 공정에 대해 적합하고, 상기 수정된 기체 유량들에 의해 다음 등식이 적용되는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
상기 등식 1a 및 1b에서,
qsub는 침잠 또는 제1 스파저(150)의 기체 유량을 나타내고;
qside는 사이드 또는 제2 스파저(160)의 기체 유량을 나타내고;
CO2는 용적 산소 물질 전달의 영향 계수 C를 나타내며, 여기서 CO2 = 0.15이고;
CCO2는 용적 이산화탄소 물질 전달의 영향 계수 C를 나타내며, 여기서 CCO2 = 0.6이다.
산업적 규모로 현탁액 중의 세포 또는 미생물을 배양하기 위한 생물 반응기 또는 발효기에서 액체 배지 중의 용해된 CO2 함량 및 용해된 O2 함량을 제어 및 조절하기 위한 상기 방법은 다음과 같이 상세하게 설명될 것이다.
산업적 규모의 폭기 교반 생물 반응기 또는 발효기의 산소 물질 전달 성능 및 이산화탄소 물질 전달 성능에 대한 보다 정확한 예측은 상세한 연구를 기반으로 할 때에만 이루어질 수 있는 것이 인식되었다. 따라서, 제1 스파저만 존재하는 여러 실험이 수행되었다. 다르게는, 추가의 제2 스파저의 영향이 조사되었다. 산소 물질 전달 계수 kLaO2는 1개의 스파저만 있는 경우 기체 유량에 정비례하는 것을 발견하였다. 즉, 기체 유량이 2배가 되면 물질 전달 계수도 거의 2배가 된다. 이는 1개의 스파저가 배양물의 산소 요구량을 충족시키기 위해 충분한 산소 물질 전달(kLaO2로 특성 확인됨)을 이미 제공할 수 있다는 것이다.
또한, 놀랍게도, 추가의 사이드 스파저의 존재 및 이에 따른 추가의 사이드 폭기가 산소 물질 전달 계수 kLaO2에 대해 거의 영향을 미치지 않거나 작은 영향만을 미친다는 것이 확인되었다. 따라서, 생물 반응기 또는 발효기에서 침잠 또는 제1 스파저의 기체 유량만이 산소의 물질 전달 계수 kLaO2와 관련하여 중요하다. 결과적으로, 침지 폭기의 영향이 산소 물질 전달에 대해 지배적인 것으로 간주될 수 있다.
또한, 사이드 주입은 산소에 대한 물질 전달 성능을 약간 증가시키는 반면, 이산화탄소에 대한 물질 전달 성능은 크게 증가시키는 것으로 관찰되었다. 본 발명의 다른 측면을 입증하는 이러한 발견은 또한 완전히 예상치 못한 것이었다. 사실, 사이드 스파저는 이산화탄소의 물질 전달 계수에 대해 매우 강한 영향을 미치며, 이는 사이드 주입이 증가함에 따라 훨씬 더 강하게 증가한다. 그 결과, 사이드 폭기의 영향이 이산화탄소 물질 전달에 대해 지배적인 것으로 간주될 수 있다.
산업적 규모의 폭기 교반 생물 반응기 또는 발효기에서 기체의 사이드 주입은 산소의 물질 전달 계수 및 이산화탄소의 물질 전달 계수에 대해 상이한 영향을 미치므로, 산소 농도 및 이산화탄소 농도를 독립적으로 관리하는 것이 가능하다. 독립적인 관리는 두 가지 원칙, 즉 총 기체 유량이 일정하면 CO2 물질 전달이 거의 일정하다는 것 및 사이드 폭기가 CO2 물질 전달 및 O2 물질 전달에 대해 상이한 영향을 미친다는 것에 기초할 수 있다.
여러 평가 계측에서, 기체의 사이드 주입의 기체 유량을 침잠 기체 유량에 단순히 추가할 수 없다는 것이 확인되었다. 사실, "수정된" 기체 유량이 가정되어야 한다. 따라서 이산화탄소에 대한 수정된 기체 유량(qmod(CO2)) 및 산소에 대한 수정된 기체 유량(qmod(O2))이 고려되어야 하며, 수정된 기체 유량은 각각의 물질 전달 계수(kLaO2 또는 kLaCO2)에 비례하는 것으로 간주된다. 따라서, 기체 유량이 배양 공정의 CO2 물질 전달 및 O2 물질 전달 각각에 대해 직접적인 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다. 실험(도 10 및 11에 도시됨)은 "수정된" 기체 유량이 다음 등식으로 표현될 수 있음을 보여준다.
산소의 경우:
상기 등식 1a에서,
CO2 = 0.15이다.
이산화탄소의 경우:
상기 등식 1b에서,
CCO2 = 0.6이다.
상기 수정된 기체 유량은 영향 계수 C로 수정되고 가중된 침지 폭기 qsub 및 사이드 폭기 qside를 포함한다. 계수 C가 높을수록 물질 전달 성능에 대한 사이드 폭기의 영향이 더 커진다. 계수 C는 물질 전달이 침잠 기체 유량에 대해 선형 비례한다는 가정으로 계산할 수 있다. 영향 계수 C의 자세한 계산은 실시예 섹션(실시예 3)에 설명 및 시연된다.
결과는, 기체의 사이드 주입이 단 0.15의 영향 계수 CO2에 의해 산소에 대한 물질 전달 계수의 증가로 이어지는 반면, 이산화탄소에 대한 물질 전달 계수는 0.6의 영향 계수 CCO2에 의해 향상될 수 있음을 보여준다. 즉, 산소에 대한 물질 전달 성능의 약간의 증가가 관찰되는 반면, 이산화탄소에 대한 물질 전달 성능은 크게 증가된다.
이러한 접근 방식을 사용하면, 산업적 규모의 폭기 교반 생물 반응기 또는 발효기에서 이산화탄소 및 산소를 독립적으로 관리할 수 있다. 즉, 이산화탄소에 대한 영향 인자(kLaCO2)는 침지 폭기에 비해 기체의 사이드 주입에서 약 4배 더 높다. 따라서, 배양 시스템에서 최적의 조건을 갖게 하기 위해 산소 및 이산화탄소의 실제 또는 수정된 기체 유량을 선택할 수 있고 조절할 수 있다.
다음의 예시적인 경우들은 상기 발견들을 다음과 같이 명확히 한다.
침잠 또는 제1 스파저의 기체 유량 qsub은 다음 값을 갖도록 선택된다: qsub = 120L/min.
제2 스파저 또는 사이드 스파저의 기체 유량 qside은 다음 값을 갖도록 선택된다: qside = 60L/min.
이후, 산소 물질 전달에 대한 수정된 기체 유량 qmod(O2)은 다음과 같이 등식 1a에 따라 계산될 수 있다:
또한, 이산화탄소 물질 전달에 대한 수정된 기체 유량 qmod(CO2)은 다음과 같이 등식 1b에 따라 계산할 수 있다:
qmod(O2)는 물질 전달 계수 kLaO2에 비례하는 것으로 간주되는 수정된 총 기체 유량을 나타내기 때문에, 당업자는 산소의 물질 전달에 대한 영향에 대해 직접 계측할 수 있다. 또한, qmod(CO2)는 물질 전달 계수 kLaCO2에 비례하는 것으로 간주되는 수정된 총 기체 유량을 나타내며, 당업자는 이산화탄소의 물질 전달에 대한 영향에 대해서도 직접적인 계측을 할 수 있다. 결과적으로, 상기 언급한 등식 1a 및 1b를 통해 선택된 기체 유량에 따라 O2 함량 및 CO2 함량 각각을 제어하고 조절할 수 있다. 당업자는 개별 배양 공정에 대해 최적이고 세포 또는 미생물 배양 성능에 대해 직접적인 영향을 미치는 적합하고 원하는 qmod(O2) 및 qmod(CO2)를 쉽게 선택하고 조절할 수 있다.
따라서, 이러한 접근 방식을 사용하면, 사이드 스파저 형태의 제2 스파저가 제공되는 경우, 산업적 규모의 폭기 교반 생물 반응기 또는 발효기에서 이산화탄소 및 산소의 독립적인 관리를 실행할 수 있다. 또한, 당업자는 kLaO2 및 kLaCO2가 세포 또는 미생물의 임의의 특정 배양 공정에 대해 제어 및 조절될 수 있도록 제1 스파저 및 제2 스파저의 기체 유량을 조절 및 선택할 가능성이 있다.
제1 스파저의 기체 유량 qsub이, 본 발명의 일 양태에 따라, 제2 스파저의 기체 유량 qside보다 크게 선택될 수 있지만, qsub가 qside보다 크게 조절되도록 선택할 수도 있다(qside > qsub).
양태들에 따르면 그리고 이미 설명된 바와 같이, 제1 침잠 스파저와 제2 사이드 스파저 사이의 거리 η1,2는 본원에 정의된 범위 내에 있도록 선택될 수 있다. 따라서, 버블이 CO2 기체상 포화 농도에 도달했거나 곧 도달하는 제1 스파저 위의 높이에 제2 스파저를 배치할 수 있다.
추가의 양태에서, 제3 스파저(170) 및 임의의 (하나의) 추가의 스파저(들)는 생물 반응기 또는 발효기(100) 내에서 제1 스파저(150) 및 제2 스파저(160) 위에 제공되며, 하나가 다른 하나 위에 배치되는 2개의 연속 스파저(150, 160 및/또는 160, 170) 사이의 거리는 η가 선택된다.
제1 침잠 스파저 및 제2 사이드 스파저 이외에 추가의 스파저가 이미 기재된 바와 같이 생물 반응기 또는 발효기에 존재할 수 있다. 스파저들 사이의 거리들 η1,2, η2,3, η3,4는 이미 개시된 바와 같이 상기 범위에서 선택될 수 있다. 추가의 스파저는 센트럴 스파저 또는 사이드 스파저일 수 있으며, 각각의 스파저에 대해 개별적으로 결정된다. CO2 및 O2의 독립적인 관리에 관한 상기 발견 및 설명에 기초하여, 일 양태에 따르면, 추가의 스파저는 모두 사이드 스파저이다.
따라서, 추가의 양태에 따르면, 제1 스파저는 센트럴 스파저 또는 사이드 스파저이고, 제2 스파저 및 임의의 제3 스파저 및 추가의 스파저는 사이드 스파저이다. 추가의 양태에 따르면, 제1 스파저는 센트럴 스파저이고, 제2 스파저 및 임의의 제3 스파저 및 추가의 스파저는 사이드 스파저이다.
사용되는 스파저의 기체 유량의 변화 이외에 세포 또는 미생물 등의 배양 성능을 개선하는 데 도움이 될 수 있는 다른 파라미터 및 조건, 예를 들면, 온도, pH 또는 특정 영양소의 농도, 교반기 유형, 교반기 속도, 스파저 유형, 스파저 크기, 스파저 형상...이 있다. 숙련가는 이러한 파라미터 및 이의 수정 방법에 대해 잘 알고 있다.
당업자는 선행 기술로부터 공지된 세포 또는 미생물의 배양 공정에 사용되는 임의의 스파저를 선택할 수 있다. 그러나, 사용되는 스파저의 유형은 산소 및 이산화탄소의 물질 전달 성능에 영향을 미칠 수 있다. 존재하는 개구부의 수 및 크기, 선택된 스파저의 기하학적 형상 및 크기가 역할을 할 수 있다. 보다 더 큰 개구부, 높은 버블 상승 속도 및 이에 따른 기체와 매질 사이의 짧은 접촉 시간의 결과로 더 큰 기체 버블이 발생하면, 약한 산소 공급만으로도 이산화탄소를 보다 더 강력하게 제거할 수 있을 것으로 추정된다. 따라서, 당업자는 각각의 배양 공정에 대해 유리한 당업계의 평균 기술에 기초하여 적합한 스파저를 쉽게 선택할 수 있다.
일 양태에 따르면, 제1 스파저, 제2 스파저 및 임의의 추가의 스파저는 파이프-기하학적 형상을 갖는 스파저, 예를 들면 튜브형 스파저, 예를 들면, 개방-튜브 스파저, 소결 플레이트, 천공 슬래브, 링 스파저, 스파이더형 스파저, 디스크형 스파저, 시트형 스파저, 컵형 스파저 및 부싱형 스파저로부터 선택되는 정적(static) 스파저이다.
추가의 양태에서, 제1 스파저, 제2 스파저 및 임의의 추가의 스파저는 동일한 스파저 또는 상이한 스파저이다.
추가의 양태에 따르면, 제1 스파저, 제2 스파저 및 임의의 추가의 스파저는 파이프-기하학적 형상을 갖는 스파저, 예를 들면 튜브형 스파저, 예를 들면, 개방-튜브 스파저이다.
추가의 양태에서, 제1 스파저, 제2 스파저 및 임의의 추가의 스파저는 각각 초승달 튜브형 스파저이다.
추가의 양태에 따르면, 제1 스파저, 제2 스파저 및 임의의 추가의 스파저는 각각 초승달형 개방-튜브 스파저이다.
튜브형 스파저, 특히 개방형 튜브형 스파저, 예를 들면, 초승달 개방형 튜브형 스파저는 세척 용량이 우수한 이점이 있으며, 현장 세척(CIP: cleaning in place) 및 현장 멸균(SIP: sterilisation in place)이 용이한 이익도 제공한다.
또한, 생물 반응기 또는 발효기는 본 발명에 따라 제한되지 않는다. 공지된 임의의 폭기 및 교반 생물 반응기 또는 발효기가 사용될 수 있다. 또한 버블 컬럼 트리클 베드 반응기, 루프 반응기 등이 사용될 수 있다.
또한, 사용되는 세포는 본 발명에 따라 제한되지 않는다. 본 발명의 양태에서, 세포는 진핵 세포, 예를 들면 포유동물 세포, 특히 효모(에스. 세레비시아(S. cerevisia), 피치아 파스테리스(Pichia pasteris)), 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 세포(예를 들면, HEK 293) 또는 곤충 세포일 수 있다. 또한, 다른 세포가 사용될 수 있다.
미생물도 본 발명에 따라 제한되지 않는다. 본 발명의 일 양태에서, 미생물은 원핵 세포, 예를 들면, 이. 콜리(E. coli) 또는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)일 수 있다.
본 발명은 또한 이미 기재된 바와 같이 생물 반응기 또는 발효기에서 세포 또는 미생물을 배양하는 방법으로서, 제2 스파저가 배양되는 세포 또는 미생물의 성장, 생존율, 생산성 및/또는 임의의 다른 대사 상태를 촉진하기 위해 정의된 거리 η로 생물 반응기 또는 발효기에 제공되는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 이미 기재된 바와 같이 생물 반응기 또는 발효기에서 세포 또는 미생물을 배양하는 방법으로서, 제1 스파저 및 제2 스파저 이외에, (하나의) 추가의 스파저(들)가 배양되는 세포 또는 미생물의 성장, 생존율, 생산성 및/또는 임의의 다른 대사 상태를 촉진하기 위해 정의된 거리 η로 생물 반응기 또는 발효기에 각각 제공되는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 이미 기재된 바와 같이 세포 또는 미생물을 배양하기 위한 생물 반응기 또는 발효기에 제공되는 제2 스파저에 관한 것이며, 상기 제2 스파저는 배양되는 세포 또는 미생물의 성장, 생존율, 생산성 및/또는 임의의 다른 대사 상태를 촉진하기 위해 생물 반응기 또는 발효기에 제공되고, 상기 제2 스파저는 생물 반응기 또는 발효기에서 제1 스파저 위로 거리 η의 위치에 위치되고, η는
각각 제1 스파저 위로 적어도 약 0.4m로부터 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이 아래로 최대 약 0.5m까지의 범위로부터 선택되거나,
제1 스파저 위로 적어도 약 0.4m로부터 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이의 약 2/3의 범위로부터 선택되거나,
제1 스파저 위로 적어도 약 0.4m로부터 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이의 약 1/2의 범위로부터 선택되거나,
제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 3.0m, 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 2.5m, 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 2.0m, 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 1.5m, 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 1.0m, 제1 스파저 위로 약 0.45 내지 약 0.90m, 제1 스파저 위로 약 0.5 내지 약 0.80m, 제1 스파저 위로 약 0.55 내지 약 0.70m의 범위로부터 선택되거나 또는 제1 스파저 위로 약 0.6m가 선택된다.
본 발명은 또한 이미 기재된 바와 같이 세포 또는 미생물을 배양하기 위해 생물 반응기 또는 발효기에 제공되는 제2 스파저 및 (하나의) 추가의 스파저(들)에 관한 것으로, 상기 제2 스파저 및 (하나의) 추가의 스파저(들)는 배양되는 세포 또는 미생물의 성장, 생존율, 생산성 및/또는 임의의 다른 대사 조건을 촉진하기 위해 생물 반응기 또는 발효기에 제공되고, 상기 제2 스파저는 생물 반응기 또는 발효기에서 제1 스파저 위로 거리 η의 위치에 위치되고, η는
각각 제1 스파저 위로 적어도 약 0.4m로부터 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이 아래로 최대 약 0.5m까지의 범위로부터 선택되거나,
제1 스파저 위로 적어도 약 0.4m로부터 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이의 약 2/3의 범위로부터 선택되거나,
제1 스파저 위로 적어도 약 0.4m로부터 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이의 약 1/2의 범위로부터 선택되거나,
제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 3.0m, 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 2.5m, 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 2.0m, 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 1.5m, 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 1.0m, 제1 스파저 위로 약 0.45 내지 약 0.90m, 제1 스파저 위로 약 0.5 내지 약 0.80m, 제1 스파저 위로 약 0.55 내지 약 0.70m의 범위로부터 선택되거나 또는 제1 스파저 위로 약 0.6m가 선택된다.
결과적으로, 더 높은 위치에서의 기체의 추가의 주입, 예를 들면, 큰 기체 버블, 높은 버블 상승 속도 및 이에 따른 기체와 배지 사이의 짧은 접촉 시간이 있는 추가의 사이드 주입은 세포 배양 공정의 성능의 향상으로 이어진다.
또한, 지금부터 본 발명에 따라 산소 물질 전달 계수 kLaO2에 큰 영향을 미치지 않으면서 대규모 시스템에 대한 용적 이산화탄소 물질 전달 계수 kLaCO2를 향상시킬 수 있다. 따라서, 단순화된 형태에서 제1 스파저는 O2 물질 전달을 제어하고 조절하는 데 사용되고, 제2 스파저는 사이드 스파저 형태로 사용되며, 임의의 (하나의) 추가의 스파저는 CO2 물질 전달을 제어하고 조절하기 위해 사용될 수 있다. 상세하게는, 제1 스파저는 배양 공정에 보다 더 많은 O2를 제공하기 위해 주로 사용될 수 있는 반면, 제2 스파저 및 임의의 (하나의) 추가의 스파저(들)는 CO2 함량을 낮추기 위해 주로 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1: k
L
a
CO2
의 측정
용적 물질 전달 계수 kLaCO2를 측정하기 위해 동적 방법이 사용된다. 사용되는 방법에서, 생물 반응기는 15%의 포화도에 도달할 때까지 이산화탄소로 기체공급된다. 후속적으로, 원하는 교반기 진동수 n 및 원하는 기체공급 속도 q가 설정되고 이산화탄소 농도의 감소가 기록된다. 상응하는 시간 t에 대해 기록된 이산화탄소 수준의 플롯은 등식 2를 따르고, 용적 물질 전달 계수 kLaCO2 및 포화 농도 c*로 다음과 같이 설명할 수 있다.
상기 등식은 시간 t'에서의 농도 c'CO2 및 시간 t''에서의 농도 c''CO2로 다음과 같이 로그 표현식으로 변환될 수 있다.
등식 3은 이산화탄소 플롯의 대수 함수의 기울기로서 kLaCO2 값을 제공한다. 예시적인 평가는 도 8에서 확인할 수 있다. 도 8을 참조하면, kLaCO2 값의 평가는 cCO2 = 14%의 농도로부터 cCO2 = 6%까지 수행되었다. 따라서 kLaCO2는, CO2의 감소가 일어나므로 음의 값으로 나타난다. 결과적으로 kLa 값은 측정된 곡선의 대수 표현의 기울기로부터 파생된다.
실시예 2: 1차 평가 계측
산업적 규모의 폭기 교반 생물 반응기 또는 발효기의 산소 물질 전달 성능을 조사하기 위해, 사이드 스파저 형태의 제2 스파저가 디자인되고 반응기에 설치되었다. 계측은 약 12kL(아래 표 1 참조)의 용적의 0.9%(w/v) NaCl/H2O로 충전된 15kL 생물 반응기에서 수행되었다. 사용된 15kL 생물 반응기의 기술적 도면 및 추가의 사이드 스파저의 마운팅 위치는 도 9에 나와 있다. 이러한 계측에서, 추가의 사이드 스파저(160)는 충전 높이가 반응기 용적의 절반을 나타내는 위치에 마운팅된다. VFill은 생물 반응기(100)의 용기의 충전 용적을 나타낸다. 즉, 사이드 스파저(160)는 충전 용적의 0.5배(½ VFill)를 나타내는 위치에 위치되며, 본 경우에는 생물 반응기 또는 발효기의 형태가 원통 형상이기 때문에 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이의 약 1/2이다.
본 계측에 사용되는 침잠 또는 제1 스파저(도시되지 않음)는 31 x 2mm 드릴, 즉 각각의 개구부의 직경이 2mm인 31개의 개구부가 있는 튜브형 스파저 형태의 사이드 스파저이다.
본 계측에 사용되는 제2 스파저는 15 x 3mm 드릴, 즉, 각각의 개구부의 직경이 3mm인 15개의 개구부가 있는 튜브형 스파저 형태의 사이드 스파저이다.
침잠형 스파저(1차 스파저) 및 사이드 스파저(제2 스파저)에 사용되는 기체는 공기이다.
1차 평가 계측은 n = 60rpm의 교반기 진동수에 대한 기체 유량에 따라 산소에 대한 물질 전달 속도를 계측하기 위해 수행되었다. 조사된 작업 조건 및 기체공급 전략에 대한 자세한 개요는 표 1에 나와 있다.
따라서, 계측 1 내지 4는 교반기 속도가 일정하게 유지되는 동안 기체 유량이 변경되었다.
계측 1에서 침잠 스파저 또는 제1 스파저의 기체 유량은 120L/min으로 설정되었다. 사이드 스파저 또는 제2 스파저는 액체 배지에 공기를 제공하지 않는다, 즉, 제2 스파저의 기체 유량은 0L/min이다. 따라서 계측 1의 전체 또는 총 기체 유량(qtotal)은 다음과 같다:
계측 2에서 침잠 스파저 또는 제1 스파저의 기체 유량은 100L/min으로 설정되었고, 사이드 스파저 또는 제2 스파저의 기체 유량은 20L/min으로 설정되었으며, 총 기체 유량은 120L/min이다.
계측 3에서 침잠 스파저 또는 제1 스파저의 기체 유량은 120L/min으로 설정되었고, 사이드 스파저 또는 제2 스파저의 기체 유량은 20L/min으로 설정되었으며, 총 기체 유량은 140L/min이다.
계측 4에서 침잠 스파저 또는 제1 스파저의 기체 유량은 120L/min으로 설정되었고, 사이드 스파저 또는 제2 스파저의 기체 유량은 60L/min으로 설정되었으며, 총 기체 유량은 180L/min이다.
사이드 기체공급이 발생하지 않는 계측 1을 표준으로 삼고, 계측 2 내지 4의 용적 물질 전달 계수 kLaO2가 상기 표준 계측과 비교하여 측정되었다. 용적 물질 전달 계수 kLaO2는 산소의 물질 전달 속도에 대한 직접적인 계측값을 나타낸다.
추가의 계측에서, 물질 전달 계수 kLaO2는 기체 유량에 정비례한다는 것이 확인되었다. 기체 유량이 2배가 되면 물질 전달 계수도 거의 2배가 된다. 이러한 발견은 침잠 스파저의 기체 유량이 120L/min로부터 100L/min으로 감소되는 계측 2에서 확인된다. 총 기체 유량이 계측 1 및 계측 2에서 각각 120L/min의 일정한 수준으로 유지되지만, 물질 전달 계수 kLaO2는 계측 1과 비교하여 계측 2에서 -18%의 값으로 감소된다. 20L/min의 기체 유량을 갖는 사이드 스파저는 물질 전달 계수 kLaO2에 대해 실질적으로 영향을 미치지 않는다. 따라서, 침잠 스파저(제1 스파저)의 기체 유량만이 kLaO2에 대한 역할을 한다. 따라서, 침지 폭기의 영향은 산소 물질 전달에 대해 지배적인 것으로 간주된다.
사실, 계측 1 내지 4에서 물질 전달 계수는 기체의 추가의 사이드 주입에 의해 크게 영향을 받지 않는다. 따라서, 사이드 폭기는 산소 물질 전달 계수 kLaO2에 대해 거의 영향을 미치지 않거나 약간만 영향을 미치는 것으로 확인되었다.
설명을 위해, 표 1에서 얻은 결과는 도 10에 나와 있으며, 이는 수행된 4가지 계측의 비교를 보여준다. 도 10에서, 계측 1에 비해 계측 2에서 침지 폭기의 16% 감소는, 계측 1 및 2에서 총 폭기 속도가 일정하더라도 O2의 물질 전달 계수에 상당한 영향을 미친다는 것을 확인할 수 있다. 그러나, 계측 1에 비해 계측 3의 사이드 주입의 16% 향상은, 계측 3에서 산소 물질 전달 계수 kLaO2의 2% 증가 및 계측 4에서 8%만의 50% 향상만을 나타낸다.
따라서 1차 평가 계측은 공기의 사이드 주입이 산소 물질 전달 성능에 작은 영향을 미친다는 것을 확인한다.
실시예 3: 2차 평가 계측
1차 평가 계측과 동일한 계측이 수행되었지만, 이산화탄소에 대한 용적 물질 전달 계수 kLaCO2가 측정되었다(도 11 참조). 이산화탄소에 대한 물질 전달 계수는 산소에 대한 물질 전달 계수(8%)(도 10 참조)에 비해 사이드 주입이 증가함에 따라(계측 4에서 최대 23%) 훨씬 더 강하게 증가한다는 것을 도 11로부터 도출할 수 있다.
1차 평가 계측 및 2차 평가 계측은 사이드 주입이 산소의 물질 전달 계수 및 이산화탄소의 물질 전달 계수에 대해 상이한 영향을 미치므로, 단순히 침잠 기체 유량에 추가할 수 없음을 확인한다. 결과적으로, 산업적 규모의 폭기 교반 생물 반응기 또는 발효기에서 기체의 사이드 주입을 통해 산소 농도 및 이산화탄소 농도를 각각 독립적으로 관리할 수 있다.
상기 설명된 평가로부터 "수정된" 기체 유량이 존재한다는 결론을 내릴 수 있다. "수정된" 기체 유량에 대한 보다 더 나은 설명을 위해, 다음 등식으로 표현할 수 있다.
즉, 영향 계수 C로 가중된 침지 폭기 qsub 및 사이드 폭기 qside를 포함하는 수정된 기체 유량이 도입될 수 있다. 계수 C가 높을수록 사이드 폭기가 물질 전달 성등에 대해 미치는 영향이 높아진다. 계수 C는 물질 전달이 침지 기체 유량에 대해 선형 비례한다는 가정으로 계산할 수 있다. 이러한 발견은 도 12a 및 12b에 설명되어 있다. 도 12a 및 12b로부터 CO2 = 0.15의 사이드 주입 계수는 산소의 용적 물질 전달 계수 kLaO2에 대해 계산할 수 있는 반면, 이산화탄소에 대한 계수(kLaCO2)는 CCO2 = 0.6일 때 4배 더 높다는 것을 유도할 수 있다.
결과적으로, 추가의 사이드 주입은 산소에 대한 물질 전달 성능을 약간 증가시키는 반면, 이산화탄소에 대한 물질 전달 성능은 크게 증가시킨다. 실제로, 기체의 사이드 주입은 산소에 대한 물질 전달 계수를 0.15배만 증가시키는 반면, 이산화탄소에 대한 물질 전달 계수는 0.6배 향상시킬 수 있다.
실시예 4: 3차 평가 계측
1차 평가 계측 및 2차 평가 계측에서와 동일한 측정이 수행되었지만 상이한 사이드 스파저(제2 스파저)가 사용되었다. 사이드 스파저 유형 A에는 10 x 3mm 드릴이 있고, 사이드 스파저 유형 B에는 32 x 5mm 드릴이 있다. 사이드 스파저 유형 B는 더 많은 개구부를 가지며, 각각의 개구부의 직경은 유형 A보다 더 크다.
얻어진 결과를 도 13a 및 13b에 나타내었다. 도 13a 및 13b를 참조하면, 총 기체 유량이 일정하면 CO2 물질 전달도 거의 일정함을 확인할 수 있다. 또한, 사이드 폭기는 O2 물질 전달에 비해 CO2 물질 전달에 대해 더 큰 영향을 미친다. 자세하게는, 사이드 스파저 유형 B의 이산화탄소에 대한 용적 물질 전달 계수 kLaCO2는 이산화탄소에 대한 물질 전달 계수의 2차 평가 계측과 비교하여 사이드 주입이 증가함에 따라 훨씬 더 강하게 증가한다(도 13b 참조: 계측 4에서 최대 30%). 즉, 스파저 유형 B를 선택하여 CO2 물질 전달을 더욱 증가시킬 수 있다.
결과적으로, 더 많은 수의 더 큰 버블, 즉 더 높은 버블 상승 속도 및 이에 따른 기체와 배지 사이의 짧은 접촉 시간으로 더 높은 위치에서의 기체의 추가의 사이드 주입이 세포 배양 공정의 개선된 성능으로 이어지는 것으로 추정된다.
실시예 5: 4차 평가 계측
이산화탄소의 물질 전달 계수 kLaCO2 및 산화물의 물질 전달 계수 kLaO2의 교반기 진동수 및 기체 유량에 대한 의존성을 확인하기 위해 추가의 측정을 수행하였다. 결과는 도 14a 및 14b 및 도 15a 및 15b에 도시되어 있다.
도 14a, 14b, 15a, 15b에 대한 범례(명세서 끝에 제공됨)에서, 결과는 더하기 기호("+")를 사용하여 요약된다. 범례의 더하기 기호는 다음과 같은 의미를 갖는다.
+ .........작은 영향
++++ ......큰 영향
도 14a 및 14b에서 용기 저부에 위치한 침지 스파저인 1개의 스파저만이 사용된다.
다른 실험에 따르면, 도 14a에서 비전력 입력은 더하기 기호(+)로 표시되는, 이산화탄소의 물질 전달 계수 kLaCO2에 대해 작은 영향을 미치는 반면, 표면 기체 유량은 이산화탄소에 대한 물질 전달 계수 kLaCO2에 대해 큰 영향(+++)을 미친다는 것을 알 수 있다.
도 14b를 참조하면 산화물에 대한 물질 전달 계수 kLaO2는 비전력 입력이 증가하고 표면 기체 유량이 증가함에 따라 증가한다.
도 15a 및 15b에서, 사용되는 제2 스파저는 사이드 스파저이다. 다른 실험에 따르면 비전력 입력은 더하기 기호(+)로 표시되는, 이산화탄소의 물질 전달 계수 kLaCO2에 대해 작은 영향을 미치는 반면, 표면 기체 유량은 이산화탄소에 대한 물질 전달 계수 kLaCO2에 대해 큰 영향(+++)을 미친다는 것을 도 15a에서 확인할 수 있다.
도 15b를 참조하면 산화물에 대한 물질 전달 계수 kLaO2는 비전력 입력이 증가함에 따라 증가한다. 그러나, 증가하는 표면 기체 유량은 산화물에 대한 물질 전달 계수 kLaO2에 대해 작은 영향을 미친다.
이러한 접근 방식에 기초하여, 산업적 규모의 폭기 교반 생물 반응기 또는 발효기에서 이산화탄소 및 산소의 독립적인 관리가 가능하다. 독립적인 관리는 두 가지 원칙, 즉 총 기체 유량이 일정하면 CO2 물질 전달이 거의 일정하다는 것과, 사이드 폭기가 CO2 물질 전달 및 O2 물질 전달에 대해 상이한 영향을 미친다는 두 가지 원칙에 기초할 수 있다.
실시예 6: 거리 η의 평가
제1 스파저와 제2 스파저 사이의 거리 η는 η1,2로도 지정되며, 기체 버블의 CO2 포화 농도 및 기체 버블이 산업적 규모의 생물 반응기 또는 발효기에서 CO2 포화 농도에 도달하는 시간에 의해 결정된다. 따라서, 반응기 높이에 대한 기체상 체류 시간은 단계 응답 방법("Sprungantwortmethode")에 의해 측정되었으며, 이러한 방법의 핵심 문제는 이후에 설명된다.
6.1. 단계 반응 방법에 의한 폭기 교반 탱크 반응기의 기체상 체류 시간의 계측
기체상 체류 시간의 측정을 다루는 극히 일부의 출판물만이 입수 가능하다(Wachi S. and Nojima Y., Gas-Phase Dispersion in Bubble Columns, Chemical Engineering Science, Vol. 45, No. 4, pp 901-905, 1990; Yianatos J.B. and Bergh L.G., International Journal of Mineral Processing, 36(1992), p. 81-91). 2상 유동에서 기체상 체류 시간 분포는 임펄스 응답 방법 또는 단계 응답 방법에 의해 측정할 수 있다. 그러나, 설명된 임펄스 응답 방법은 방사성 또는 독성 추적 기체가 사용되기 때문에 적용하기 어렵다. 또한, 폭기 교반 탱크 반응기의 기체상 체류 시간 분포에 대한 조사는 지금까지 발표되지 않았습니다. 따라서, 기체상 체류 시간을 측정하기 위해 단계 응답 방법에 기초하는 수정된 계측 기술이 본원에서 사용된다.
제어 이론에 따르면, 시스템의 거동은 임펄스 응답 방법 또는 단계 응답 방법에 의해 측정될 수 있다. 두 방법의 차이점은 시스템에 대해 얻는 정보이다. 체류 시간 분포는 임펄스 응답 방법에 의해 측정될 수 있는 반면, 체류 시간 자체는 단계 응답 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 단계 입력에 대한 응답으로의 시스템의 출력이 도 16a 및 16b에 나와 있다. 도 16a 및 16b는 단계 응답 방법을 예시한다: 이는 Leigh, J. R.(2004) Control Theory 2. ed., IET control engineering serie, London에 따른 시스템에 대한 입력(도 16a) 및 시스템의 출력(도 16b)을 보여준다.
시스템의 출력에서 계측된 신호로서, 방사성 기체 추적기(Yianatos J.B., Bergh, L.G., Duran, O.U., Diaz, F.J., Heresi, N.M. (1994), Measurement of Residence Time Distribution of the Gas Phase in Flotation Columns, Minerals Engineering Vol. 7, p. 333-344) 또는 디클로로디플루오로메탄(Wachi S. and Nojima Y., loc. cit.)이 사용된다. 실제적인 이유로, 방사성 기체 추적기를 사용하여 입력 임펄스를 실현하는 것은 종종 불가능하다. 또한, 본 경우에는 체류 시간에 대한 정보만(분포가 아님)이 충분하다.
따라서, 12kL 아크릴 유리 교반 탱크 반응기에서의 본 발명자들의 적용에 대해 폭기 동안 기체 유형만 변경하여 시스템 으로 단계 신호를 유도한다.
단계 반응 방법의 적용을 위해, 폭기 교반 탱크 반응기는 일정(steady) 공정 조건 하에 작업되어야 하며, 예를 들면 용해된 산소 농도의 평형에 도달할 때까지 폭기되어야 한다. 일정 작업 동안 후속적으로 폭기는 순수한 질소로 전환된다. 산소 농도는 반응기의 유입구 및 유출구에서 연속적으로 계측된다. 반응기의 헤드스페이스 내에서 기체 혼합의 영향을 최소화하기 위해, 깔때기가 수면에 "버블 캐처"로서 설치된다. 반응기의 헤드스페이스의 영향을 최소화하는 이러한 버블 캐처(깔때기)(180)가 도 17에 예시적으로 도시되어 있다. 버블 캐처(깔때기)(180)는 단면에 걸쳐 버블을 흡수하고 수집된 기체를 기체 센서로 안내하도록 디자인된다. 반응기의 유입구 및 유출구의 기체 센서로서 광학 산소 센서 스폿(PreSens Precision Sensing GmbH)이 이 경우에 사용되었으며, tresponse <2초의 매우 낮은 응답 시간으로 사용되었다. 도 17의 예시된 버블 캐처(깔때기)(180)에서 PreSens 포트(185) 및 오프기체(189)가 도시된다.
침지 스파저 및 깔때기 각각의 산소 농도로부터 12kL 폭기 교반 탱크 반응기에 적용된 단계 응답 방법으로부터의 상응하는 출력 신호가 있는 일반적인 입력 신호는 도 18에 나와 있다.
체류 시간 규모가 물질 전달 시간 규모보다 훨씬 더 작다고 가정하면, 기체상 체류 시간은 단계 입력과 배기 공기 중의 산소 농도가 1% 이상 강하하는 시간과의 사이의 시간으로 정의된다. 이러한 가정은 100% 및 50% 단계 입력에서 발생한 시스템 응답을 비교하여 입증할 수 있다. 도 19에는 100% 및 50% 입력 단계에서 발생하는 깔때기에서의 단계 응답 비교 각각이 나와 있다. 도 19와 관련하여, 출력 산소 신호가 처음으로 강하하는 시간에 관해서는 응답 신호의 차이를 검출할 수 없다.
응답 단계 방법은 다음과 같은 이유로 본 경우에는 약간만 중요한 몇 가지 결함과 관련이 있다:
- 제1 버블이 깔때기에 도달하면 신호가 강하하기 시작한다. 버블 크기 분포에 따라 이는 (큰 크기의 버블에 의해) 매우 일찍 발생할 수 있는 반면, 가장 많은 양의 작은 버블은 시스템 내에서 훨씬 더 오래 머무를 수 있다. 그러나, PBS 및 플루로닉을 용매로 사용하기 때문에(포스페이트-완충 식염수 + 1g/L 플루로닉), 버블 크기 분포가 매우 좁고, 이 방법은 허용 가능한 정확도를 가져야 한다.
- 이질적인 유동 조건 하에, 주요 버블 플룸이 깔때기에 의해 포착되지 않는 일이 발생할 수 있다. 이 경우 체류 시간이 과대 평가된다.
- 산소 버블과 질소 버블 사이에 용해된 산소 및 질소의 교환이 일어날 수 있으며, 추가적으로 유착 및 분해가 일어날 수 있다. 이러한 효과는 무시할 수 있다고 가정한다.
요약하면, 기체상 체류 시간을 측정하기 위한 단계 응답 방법은 설명된 시스템 및 조건에 대해 허용 가능한 정확도로 쉽게 적용할 수 있는 방법이다.
단계 반응 방법에 사용되는 용매는 PBS(포스페이트-완충 식염수) 및 1.0g/L 플루로닉이었다.
단계 응답 방법의 결과는 도 20에 나와 있다. 도 20에서 [%] 단위의 산소 농도는 [s] 단위의 샘플링 시간 t에 대해 플롯팅된다. 30L의 실험실 규모의 생물 반응기 또는 발효기를 12,000L의 산업적 규모의 생물 반응기 또는 발효기와 비교하였다. 각각의 시스템에 대해 필적할 만한 전력 입력을 얻기 위해, [rpm] 단위의 교반기 진동수 n 및 [L h-1] 단위의 기체 유량을 실험실 규모로부터 산업적 규모로 변경하였다. 따라서, 산업적 규모 시스템의 교반기 진동수는 300rpm이고, 실험실 규모의 교반기 진동수는 80rpm이다. 실험실 시스템의 기체 유량은 1L min-1이고 산업적 규모의 기체 유량은 60L min-1이다.
도 20에는 실험실 규모(30L)에 대한 2개의 곡선 및 산업적 규모(12,000L)에 대한 2개의 곡선 각각이 표시되어 있다. 곡선 1 및 2는 산업적 규모의 계측을 보여주고, 곡선 3 및 4는 실험실 규모의 계측을 보여준다. 기체 농도는 생물 반응기 또는 발효기(공급물)의 저부 및 생물 반응기 또는 발효기(상단)의 상단에서의 기체 공급물에서 측정된다. 체류 시간 tr이 다음과 같다면 곡선으로부터 파생될 수 있다.
tr, 30L = 5초
tr,12kL = 21초.
따라서, 실험실 규모의 생물 반응기 또는 발효기의 기체상 체류 시간은 5초로 측정되었고, 산업적 규모의 생물 반응기 또는 발효기의 기체상 체류 시간은 21초인 것으로 확인되었다.
6.2. CO
2
물질 전달 계수 k
L
a
CO2
의 평가
CO2 물질 전달 계수 kLaCO2의 평가는 다음과 같이 수행되었다.
2L 생물 반응기 또는 발효기에서 특정 기체 경계 계면 및 용적 CO2 물질 전달 계수 kLaCO2에 대한 계측을 수행하였다. 그 결과를 하기 표 2에 요약하였다.
상기 계측에 기초하여, CO2의 물질 전달 계수는 2L 생물 반응기 또는 발효기에서 4±0.68h-1인 것으로 확인되었다.
6.3. 평균 버블 상승 속도의 추정
12,000L 시스템에서 버블 크기의 단분산 분포가 d = 5mm이고, 상기 언급한 이산화탄소 물질 전달 계수 kLaCO2 = 4±0.68h-1이 산업적 규모에 대해서도 적용된다는 가정 하에, 37℃에서 단일 버블의 이론적 이산화탄소 프로파일은 다음과 같이 계산할 수 있다.
CCO2
이산화탄소의 농도
C*CO2
이산화탄소의 포화 농도
kL
물질 전달 계수
a
특이적 계면 면적, 여기서 a = A/V
Abubble
버블의 버블 표면
Vbubble
버블의 용적
t
시간
이로부터 약 3.5초 후에 기체 버블의 95% 포화에 도달함을 추론할 수 있다.
약 21초의 산업적 규모 생물 반응기 또는 발효기에서 계측된 평균 기체상 체류 시간 및 3.6m의 버블이 이동한 총 계측 거리에 기초하여, 평균 버블 상승 속도는 다음과 같이 계산할 수 있다:
속도 u = 거리/시간: u = 0.17m/s.
결과적으로, 대략 h = 0.6m(3.6m x 0.17m/s)의 높이 이후 기체상은 CO2로 포화되어 CO2 스트리핑이 더 이상 관찰되지 않을 수 있다.
상기 평가, 계측 및 계산에는 일부 평가 및 추정이 포함되므로, 0.6m의 얻어진 결과는, 주장된 것과 같은 범위로 보다 더 잘 표현되는 거리 η에 대한 대략적인 값일 뿐이다.
비교 실시예 1: 1개의 스파저만을 포함하는 생물 반응기
항체 유사 단백질을 발현하는 독점적인 BI HEX(Boehringer-Ingelheim High Expression) CHO-DG44 유래 세포주를 상업적으로 입수 가능한 12,000L 생물 반응기에서 11일 동안 통상적인 유가식 공정으로 배양했다. 생물 반응기는 러쉬톤 및 피치형 블레이드 교반기로 구성되고 2:1의 H/D(높이/직경 비)를 가졌다. 하부 임펠러와 상부 임펠러 사이의 거리는 1.8m였다. 공칭 용적에서 생물 반응기 내의 액체 높이(= 충전 높이)는 4.2m였다. 스파저는 가장 낮은 교반기 아래에 위치된다. 독점적인 BI-HEX® 플랫폼에서 파생된 성장, 생산 및 공급물 배지가 본 실험에 사용되었다. 배양은 9,000L에서 시작하고 공급물을 추가하여 약 1,100L에서 종료되었다. 이 과정 동안 배양 온도는 36.5±0.5℃, pH는 7±0.6, 포도당 농도는 0 내지 10g/L의 범위로 유지되었다. 산소 공급은 공기 및 산소를 스파징하여 제공되었다. 용해된 산소 농도는 30%로 유지하였다.
결과는 하기 표 A 내지 D에 제시되어 있고, 도 21a 내지 21d에 그래프로 도시되어 있다. 세포는 5일까지 기하급수적으로 성장한 후, 세포 수가 거의 일정하게 유지되었다. 세포 생존율은 11일의 배양 동안 지속적으로 감소하여 80% 약간 미만으로 종료되었다. 생성물 역가는 3일부터 계측되었고 11일까지 상당히 증가했다. 배양의 pCO2 프로파일은 약 10%에서 시작하여 4일까지 급격히 감소한 후, 11일에 pCO2가 시작 값에 도달할 때까지 다시 증가했다.
[표 A]
표 A: 표준화된 생존 세포 성장 곡선. 데이터는 이 실행에 대해 도달한 최대 세포 밀도의 백분율로 제공된다.
[표 B]
표 B: 세포 생존율
[표 C]
표 C: 세포에 의해 생성된 항체 유도체의 농도 곡선. 값은 실행에서 도달한 최대 생성물 농도의 백분율로 제공된다.
[표 D]
표 D: 생물 반응기 내의 CO2의 분압
상기 표 A 내지 D의 결과가 도 21에 예시되어 있다. 상기 도면은 비교 실시예 1에 따른 예시적인 12,000L 제조 실행으로부터의 배양 데이터를 나타낸다. 데이터는 본 실행에서 도달한 최대 세포 밀도가 백분율로 제공된다. (B)에는 배양을 위한 세포 생존율이 예시되어 있다. (C)는 세포에 의해 생성된 항체 유도체의 농도 곡선을 나타낸다. 값은 실행에서 도달한 최대 생성물 농도가 백분율로 제공된다. (D)에서는 생물 반응기 내의 CO2의 분압이 주어진다.
실시예 7: 제1 스파저 및 제2 스파저를 포함하는 생물 반응기
비교 실시예 1에 따른 실험이 수행될 수 있지만, 본 발명에 따라 1개의 스파저만 대신 2개의 스파저가 사용될 수 있다. 제1 스파저는 가장 낮은 교반기 아래에 위치될 수 있으며, 중앙 스파저 또는 사이드 스파저가 될 수 있다. 제2 스파저는 생물 반응기 또는 발효기에서 제1 스파저 위로 거리 η의 위치에 위치될 수 있으며, η는 적어도 약 0.4m 내지 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이 아래로 최대 약 0.5m까지의 범위로부터 선택된다. 제2 스파저는 중앙 스파저 또는 사이드 스파저이다.
생물 반응기에 2개의 스파저의 존재는 CO2 스트리핑이 일어나는 액체 배지의 면적을 증가시킨다. 제2 스파저가 액체 표면 근처에 있는 경우, 예를 들면, 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이 아래로 약 0.5m까지에 있는 경우, 생물 반응기 저부 근처에 배치되는 제1 스파저가 액체 배지의 업스트림 영역을 스트리핑할 수 있는 동안 다운스트림 영역을 스트리핑할 수 있다. 요약하면, 생물 반응기 또는 발효기의 전체 충전 높이는 CO2-스트리핑에 가해진다.
제1 스파저 위로 상기 나타낸 범위로부터 선택되는 거리 η의 위치에 위치되는 제2 스파저의 존재는 CO2 스트리핑에 대해 상당한 영향을 미칠 것으로 예상할 수 있다. 즉, 비교 실시예 1의 실시예에 비해 생물 반응기의 배양물(액체 배지) 중 CO2의 분압의 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1% 또는 적어도 약 2% 약 20% 이하 감소되는 것으로 추정할 수 있다.
또한, 비교 실시예 1에 비해 높은 생성물 역가 및 높은 생성물 수율을 기대할 수 있다. 세포에 의해 생산된 항체 또는 항체 유도체의 농도는 비교 실시예 1의 양태에 비해 적어도 약 1%, 적어도 약 5% 또는 적어도 약 10% 약 30% 이하 증가된 것으로 추정될 수 있다.
또한, 본 경우와 같이 대규모로 상업적으로 사용되는 공정의 작은 개선, 예를 들면, 적어도 약 0.5% 또는 적어도 약 1%가 의미 있는 기여를 나타낸다. 스트리핑 성능 및 수율과 같은 공정의 작은 개선조차도 대규모 생산에서 매우 적절한 개선이며 중요한 것으로 간주되어야 한다.
제2 스파저가 사이드 스파저로 선택되는 경우, 본원에 개시된 유리한 기술적 효과, 특히 생물 반응기의 배양물(액체 배지) 중 CO2 분압의 감소 및 생성물 역가의 증가가 보다 더 우세해지는 것 각각을 기대할 수 있다.
실시예 8: 제1 스파저와 제2 스파저 사이의 거리 η의 변화
실시예 7에 따른 실험이 수행될 수 있으며, 여기서 제1 스파저와 제2 스파저 사이의 거리 η가 변한다. 제1 스파저는 가장 낮은 교반기 아래에 위치될 수 있고, 제2 스파저는 생물 반응기 또는 발효기에서 제1 스파저 위로 거리 η의 위치에 위치될 수 있다. 제2 스파저는 제1 스파저 위로 거리 η의 위치에 위치하며, 상기 거리 η는 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이의 약 2/3, 생물 반응기 또는 발효기의 충전 높이의 약 1/2, 약 3.0m, 약 2.9m, 약 2.8m, 약 2.7m, 약 2.6m, 약 2.5m, 약 2.4m, 약 2.3m, 약 2.2m, 약 2.1m, 약 2.0m, 약 1.9m, 약 1.8m, 약 1.7m, 약 1.6m, 약 1.5m, 약 1.4m, 약 1.3m, 약 1.2m, 약 1.1m, 약 1.0m, 약 0.95m, 약 0.90m, 약 0.85m, 약 0.80m, 약 0.75m, 약 0.70m, 약 0.65, 약 0.6m, 약 0.55, 약 0.45 또는 약 0.4m이다.
생물 반응기에 2개의 스파저의 존재는 CO2 스트리핑이 일어나는 액체 배지의 면적을 증가시킨다. 제2 스파저는 거리 η의 위치에 위치될 수 있으며, η는 제1 스파저 및 제2 스파저에 의해 CO2-스트리핑이 수행되는 영역이 어느 정도 중첩되도록 선택될 수 있다.
따라서, 제1 스파저 위로 상기 언급한 값들 중 하나를 갖는 거리 η의 위치에 위치된 제2 스파저의 존재는 CO2 스트리핑에 대해 상당한 영향을 미칠 것으로 예상할 수 있다. 즉, 생물 반응기의 배양물(액체 배지) 중 CO2의 분압이 비교 실시예 1의 실시예에 비해 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1% 또는 적어도 약 2% 약 20% 이하 감소하는 것으로 추정할 수 있다.
또한, 비교 실시예 1에 비해 높은 생성물 역가 및 높은 생성물 수율을 기대할 수 있다. 세포에 의해 생성된 항체 유도체의 농도는 비교 실시예 1의 양태에 비해 적어도 약 1%, 적어도 약 5% 또는 적어도 약 10% 약 30% 이하 증가될 것으로 추정될 수 있다.
또한, 본 경우에서와 같이 대규모로 상업적으로 사용되는 공정의 작은 개선, 예를 들면, 적어도 약 0.5% 또는 적어도 약 1%는 의미 있는 기여를 나타낸다. 스트리핑 성능 및 수율과 같은 공정의 작은 개선조차도 대규모 생산에서는 매우 적절한 개선이며 중요한 것으로 간주되어야 한다.
제2 스파저가 사이드 스파저로 선택되는 경우, 본원에 개시된 바와 같은 유리한 기술적 효과, 특히 생물 반응기의 배양물(액체 배지) 중 CO2 분압의 감소 및 생성물 역가의 증가가 보다 우세해질 것을 기대할 수 있다.
비교 실시예 2: 2개의 스파저를 포함하지만 거리 η가 청구된 범위 밖에 있는 생물 반응기
제1 스파저와 제2 스파저 사이의 거리 η가 청구된 범위 밖에 있는 실시예 7에 따른 실험이 수행될 수 있다. 구체적으로, 거리 η는 0.4m 미만, 예를 들면, 0.35m, 0.3m, 0.2m 또는 0.1m이다. 제2 스파저의 존재로 인한 기술적 효과는 달성되지 않을 것으로 예상할 수 있다, 즉 생물 반응기의 배양물(액체 배지) 중 CO2의 분압의 감소 및 더 높은 생성물 역가 및 더 높은 생성물 수율로부터의 이점은 얻어지지 않을 것이다. 생물 반응기에 동시에 존재하는 2개의 스파저의 긍정적인 효과가 발생하지 않는다. 실제로, 생물 반응기의 성능은 비교 실시예 1과 같이 1개늬 스파저만 있는 생물 반응기에 근접한다. 따라서 0.4m 이하의 값을 임계값으로 간주할 수 있다.
10, 10.1, 10.2, 10.3
제1 스파저로부터의 버블(들)
20, 20.1, 20.2, 20.3 제2 스파저로부터의 버블(들)
100 생물 반응기 또는 발효기
102 용기
105 저부
110 측벽
120 교반기
140 기체 공급 튜브
150 제1 스파저
160 제2 스파저
170 제3 스파저
180 버블 캐처(깔때기)
185 PreSens 포트
189 오프기체
A 중심 축
rs 교반기 반경
ds 교반기 직경
d1, d2 교반기 반경(rs)에 의해 정의된 거리
D 생물 반응기 또는 발효기의 직경
R1, R2, R3, R4 교반기
η 두 스파저 사이의 거리
η1,2 제1 스파저와 제2 스파저 사이의 거리
η2,3 제2 스파저와 제3 스파저 사이의 거리
η3,4 제3 스파저와 제4 스파저 사이의 거리
일부 도면에 대한 범례:
도 2:
물질 전달 계측:
시스템: 0.9% NaCl - 물/공기
교반기: 러쉬톤/피치 블레이드
용적: 2L
온도: 37℃
도 3:
물질 전달 계측:
시스템: 0.9% NaCl - 물/공기
교반기: 러쉬톤/피치 블레이드
용적: 12,000L
온도: 37℃
도 4:
물질 전달 계측:
시스템: 0.9% NaCl - 물/공기
교반기: 러쉬톤/피치 블레이드
표면 기체 속도: 0.96mm s-1
용량: 12,000L 및 2L
온도: 37℃
도 14a:
도 14b:
도 15a:
도 15b:
도 18:
체류 시간 계측:
충전 용적: 12㎥
교반기: 러쉬톤/피치 블레이드
교반기 진동수: 60rpm
기체 유량: 60L/min
매질: 탈이온수
온도: T = 37℃
도 19:
체류 시간 계측:
충전 용적: 12㎥
교반기: 러쉬톤/피치 블레이드
교반기 진동수: 60rpm
기체 유량: 60L/min
매질: 탈이온수
온도: T = 37℃
도 20:
-1- n = 300rpm/q = 1L min-1 공급물
-2- n = 300rpm /q = 1L min-1 상부
-3- n = 80rpm /q = 60L min-1 공급물
-4- n = 80rpm /q = 60L min-1 상부
20, 20.1, 20.2, 20.3 제2 스파저로부터의 버블(들)
100 생물 반응기 또는 발효기
102 용기
105 저부
110 측벽
120 교반기
140 기체 공급 튜브
150 제1 스파저
160 제2 스파저
170 제3 스파저
180 버블 캐처(깔때기)
185 PreSens 포트
189 오프기체
A 중심 축
rs 교반기 반경
ds 교반기 직경
d1, d2 교반기 반경(rs)에 의해 정의된 거리
D 생물 반응기 또는 발효기의 직경
R1, R2, R3, R4 교반기
η 두 스파저 사이의 거리
η1,2 제1 스파저와 제2 스파저 사이의 거리
η2,3 제2 스파저와 제3 스파저 사이의 거리
η3,4 제3 스파저와 제4 스파저 사이의 거리
일부 도면에 대한 범례:
도 2:
물질 전달 계측:
시스템: 0.9% NaCl - 물/공기
교반기: 러쉬톤/피치 블레이드
용적: 2L
온도: 37℃
도 3:
물질 전달 계측:
시스템: 0.9% NaCl - 물/공기
교반기: 러쉬톤/피치 블레이드
용적: 12,000L
온도: 37℃
도 4:
물질 전달 계측:
시스템: 0.9% NaCl - 물/공기
교반기: 러쉬톤/피치 블레이드
표면 기체 속도: 0.96mm s-1
용량: 12,000L 및 2L
온도: 37℃
도 14a:
도 14b:
도 15a:
도 15b:
도 18:
체류 시간 계측:
충전 용적: 12㎥
교반기: 러쉬톤/피치 블레이드
교반기 진동수: 60rpm
기체 유량: 60L/min
매질: 탈이온수
온도: T = 37℃
도 19:
체류 시간 계측:
충전 용적: 12㎥
교반기: 러쉬톤/피치 블레이드
교반기 진동수: 60rpm
기체 유량: 60L/min
매질: 탈이온수
온도: T = 37℃
도 20:
-1- n = 300rpm/q = 1L min-1 공급물
-2- n = 300rpm /q = 1L min-1 상부
-3- n = 80rpm /q = 60L min-1 공급물
-4- n = 80rpm /q = 60L min-1 상부
Claims (18)
- 산업적 규모로 액체 배지에서 현탁액 중의 세포 또는 미생물을 배양하기 위한 생물 반응기 또는 발효기(100)로서,
상기 생물 반응기 또는 발효기는
결정된 충전 높이를 갖는 액체 배지 중의 배양물을 함유하는 용기(102);
상기 액체 배지를 교반하기 위해 상기 용기 내에 제공되는 교반기(120);
기체 버블들(10, 10.1, 10.2, 10.3)을 상기 액체 배지에 연속적으로 공급하기 위해 제공되는, 상기 용기(102)의 저부(105)에 배치되는 제1 스파저(sparger)(150)로서, 상기 기체는 공기 및/또는 산소 기체인, 상기 제1 스파저 및
상기 용기(102) 내에 배치되고 상기 제1 스파저(150) 위에 제공되어 추가의 공기 버블 및/또는 추가의 산소 기체 버블들(20, 20.1, 20.2, 20.3)을 상기 액체 배지에 연속적으로 공급하는 제2 스파저(160)를 포함하고,
상기 제2 스파저(160)는 상기 생물 반응기 또는 발효기(100) 내에서 상기 제1 스파저(150) 위로 거리 η의 위치에 위치되고, η는
상기 제1 스파저(150) 위로 적어도 약 0.4m로부터 상기 생물 반응기 또는 발효기(100)의 상기 충전 높이 아래로 최대 약 0.5m까지의 범위로부터 선택되거나,
상기 제1 스파저(150) 위로 약 0.4m로부터 상기 생물 반응기 또는 발효기(100)의 상기 충전 높이의 약 2/3까지의 범위로부터 선택되거나,
상기 제1 스파저(150) 위로 약 0.4m로부터 상기 생물 반응기 또는 발효기(100) 충전 높이의 약 1/2까지의 범위로부터 선택되거나,
상기 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 3.0m, 상기 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 2.5m, 상기 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 2.0m 또는 상기 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 1.5m의 범위로부터 선택되거나 또는
상기 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 1.0m, 상기 제1 스파저 위로 약 0.45 내지 약 0.90m, 상기 제1 스파저 위로 약 0.5 내지 약 0.80m, 상기 제1 스파저 위로 약 0.55 내지 약 0.70m의 범위로부터 선택되거나 또는 상기 제1 스파저 위로 약 0.6m가 선택되는, 생물 반응기 또는 발효기(100). - 제1항에 있어서,
상기 생물 반응기 또는 발효기(100)가 약 8 내지 약 20m, 약 9 내지 약 15m, 약 9.5 내지 약 12m의 범위 또는 약 10m의 충전 높이를 포함함을 특징으로 하는, 생물 반응기 또는 발효기(100). - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 제2 스파저(160)가 사이드(side) 스파저임을 특징으로 하는, 생물 반응기 또는 발효기(100). - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
제3 스파저(170) 및 임의의 (하나의) 추가의 스파저(들)가 상기 생물 반응기 또는 발효기(100) 내에 상기 제1 스파저(150) 및 상기 제2 스파저(160) 위에 제공되고, 하나가 다른 하나의 위에 배치된 2개의 연속 스파저들(150, 160)(160, 170) 사이의 거리가 η가 선택됨을 특징으로 하는, 생물 반응기 또는 발효기(100). - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 교반기(120)가, 상기 생물 반응기 또는 발효기(100)를 통과하여 중심 축(A) 주위에 위치하는 교반기 반경(rs)을 갖고/갖거나
상기 제1 스파저(150)가, 제공된 상기 기체 버블들(10, 10.1, 10.2, 10.3)이 상기 교반기 반경(rs) 이하의 거리에서 상기 액체 배지로 들어가도록, 상기 생물 반응기 또는 발효기(100)의 상기 중심 축(A)으로부터 일정 거리로 배치되고/되거나
상기 제2 스파저(160) 및 임의의 추가의 스파저들이, 제공된 상기 버블들(20, 20.1, 20.2, 20.3)이 교반기 반경(rs) 초과의 거리에서 액체상으로 들어가도록, 상기 중심 축(A)으로부터 일정 거리로 배치됨을 특징으로 하는, 생물 반응기 또는 발효기(100). - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
(하나의) 추가의 교반기(들)(R2, R3, R4)가 상기 교반기(120, R1)에 추가로 제공되고, 상기 추가의 교반기(들)(R2, R3, R4)가 상기 제2 스파저(160) 위 및/또는 아래에 위치함을 특징으로 하는, 생물 반응기 또는 발효기(100). - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 스파저(150), 상기 제2 스파저(160) 및 임의의 추가의 스파저(170)가 튜브형 스파저, 예를 들면, 개방-튜브 스파저, 소결 플레이트, 천공 슬래브, 링 스파저, 스파이더형 스파저, 디스크형 스파저, 시트형 스파저, 컵형 스파저 및 부싱형 스파저로부터 선택되는 정적(static) 스파저임을 특징으로 하는, 생물 반응기 또는 발효기(100). - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 스파저(150)가 센트럴(central) 스파저 또는 사이드 스파저이고, 상기 제2 스파저(160) 및 상기 임의의 제3 스파저(170) 및 추가의 스파저가 사이드 스파저임을 특징으로 하는, 생물 반응기 또는 발효기(100). - 액체 배지 중의 배양물을 포함하는 용기(102)를 포함하는 산업적 규모로 현탁액 중의 세포 또는 미생물을 배양하기 위한 생물 반응기 또는 발효기(100) 내의 액체 배지 중의 용해된 CO2의 함량 및 용해된 O2의 함량을 제어 및 조절하는 방법으로서,
상기 액체 배지를 교반하는 단계;
상기 용기(102)의 저부(105)에 배치된 제1 스파저(150)로부터 상기 액체 배지로 기체 버블들(10, 10.1, 10.2, 10.3)을 연속적으로 공급하는 단계로서, 상기 기체는 공기 및/또는 산소 기체로부터 선택되는, 상기 공급 단계;
상기 용기(102) 내에 배치된 제2 스파저(160)로부터 상기 액체 배지로 기체 버블들(20, 20.1, 20.2, 20.3)을 연속적으로 공급하는 단계로서, 상기 기체는 공기 및/또는 산소 기체로부터 선택되고, 상기 제2 스파저(160)는 상기 제1 스파저(150) 위에 배치되고, 상기 제2 스파저(160)는 사이드 스파저인, 상기 공급 단계;
침잠(submerse) 또는 제1 스파저(150)의 기체 유량 qsub 및 사이드 또는 제2 스파저(160)의 기체 유량 qside에 기초하여, 수정된 기체 유량 qmod(O2)를 선택 및 조절하고 수정된 기체 유량 qmod(CO2)를 선택 및 조절하고, 상기 수정된 기체 유량 둘 다는 배양 공정에 대해 적합하고, 상기 수정된 기체 유량들에 의해 다음 등식이 적용되는 단계를 포함하는, 방법.
[1a]
[1b]
상기 등식 1a 및 1b에서,
qsub는 침잠 또는 제1 스파저(150)의 기체 유량을 나타내고,
qside는 사이드 또는 제2 스파저(160)의 기체 유량을 나타내고,
CO2는 용적(volumetric) 산소 물질 전달의 영향 계수 C를 나타내며, 여기서 CO2 = 0.15이고,
CCO2는 용적 이산화탄소 물질 전달의 영향 계수 C를 나타내며, 여기서 CCO2 = 0.6이다. - 제9항에 있어서,
qsub가 qside보다 크도록 조절됨을 특징으로 하는, 방법. - 제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 생물 반응기 또는 발효기(100) 내에서 상기 제2 스파저(160)의 위치가 상기 제1 스파저(150) 위로 거리 η의 위치가 되도록 선택되고, η는
상기 제1 스파저(150) 위로 적어도 약 0.4m로부터 상기 생물 반응기 또는 발효기(100)의 충전 높이 아래로 최대 약 0.5m까지의 범위로부터 선택되거나,
상기 제1 스파저(150) 위로 약 0.4m로부터 상기 생물 반응기 또는 발효기(100)의 상기 충전 높이의 약 2/3까지의 범위로부터 선택되거나,
상기 제1 스파저(150) 위로 약 0.4m로부터 상기 생물 반응기 또는 발효기(100) 충전 높이의 약 1/2까지의 범위로부터 선택되거나,
상기 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 3.0m, 상기 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 2.5m, 상기 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 2.0m, 상기 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 1.5m의 범위로부터 선택되거나 또는
상기 제1 스파저 위로 약 0.4 내지 약 1.0m, 상기 제1 스파저 위로 약 0.45 내지 약 0.90m, 상기 제1 스파저 위로 약 0.5 내지 약 0.80m, 상기 제1 스파저 위로 약 0.55 내지 약 0.70m의 범위로부터 선택되거나 또는 상기 제1 스파저 위로 약 0.6m가 선택됨을 특징으로 하는, 방법. - 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
제3 스파저(170) 및 임의의 (하나의) 추가의 스파저(들)가 상기 생물 반응기 또는 발효기(100) 내에 상기 제1 스파저(150) 및 상기 제2 스파저(160) 위에 제공되고, 하나가 다른 하나의 위에 배치된 2개의 연속 스파저들(150, 160)(160, 170) 사이의 거리가 η가 되도록 선택됨을 특징으로 하는, 방법. - 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 교반기(120)가, 상기 생물 반응기 또는 발효기(100)를 통과하여 중심 축(A) 주위에 위치하는 교반기 반경(rs)을 갖고/갖거나,
상기 제1 스파저(150)가, 제공된 상기 기체 버블들(10, 10.1, 10.2, 10.3)이 상기 교반기 반경(rs) 이하의 거리에서 상기 액체 배지로 들어가도록, 상기 생물 반응기 또는 발효기(100)의 상기 중심 축(A)으로부터 일정 거리로 배치되고/되거나,
상기 제2 스파저(160)가, 제공된 상기 버블들(20, 20.1, 20.2, 20.3)이 교반기 반경(rs) 초과의 거리에서 상기 액체상으로 들어가도록, 상기 중심 축(A)으로부터 일정 거리로 배치됨을 특징으로 하는, 방법. - 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
(하나의) 추가의 교반기(들)(R2, R3, R4)가 상기 제1 교반기(120, R1) 이외에 추가로 제공되고, 상기 추가의 교반기(들)(R2, R3, R4)가 상기 제2 스파저(160) 위 및/또는 아래에 위치함을 특징으로 하는, 방법. - 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 스파저(150)가 센트럴 스파저 또는 사이드 스파저이고, 상기 제2 스파저(160) 및 상기 임의의 제3 스파저(170) 및 임의의 추가의 스파저가 사이드 스파저임을 특징으로 하는, 방법. - 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 스파저(150), 상기 제2 스파저(160) 및 임의의 추가의 스파저(170)가 파이프-기하학적 형상을 갖는 스파저, 예를 들면 튜브형 스파저, 예를 들면, 개방-튜브 스파저, 소결 플레이트, 천공 슬래브, 링 스파저, 스파이더형 스파저, 디스크형 스파저, 시트형 스파저, 컵형 스파저 및 부싱형 스파저로부터 선택되는 정적 스파저임을 특징으로 하는, 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 생물 반응기 또는 발효기(100)에서 세포 또는 미생물을 배양하는 방법으로서, 배양되는 세포 또는 미생물의 성장, 생존율, 생산성 및/또는 임의의 다른 대사 조건을 촉진하기 위해 제2 스파저(160) 및 임의의 제3 스파저(170) 및 임의의 (하나의) 추가의 스파저(들)가 상기 생물 반응기 또는 발효기(100)에 제공되는, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 세포 또는 미생물을 배양하기 위한 생물 반응기 또는 발효기(100) 내에 제공되는 제2 스파저(160), 임의의 제3 스파저(170) 및 임의의 (하나의) 추가의 스파저(들)로서, 상기 스파저들(160, 170)은 배양되는 세포 또는 미생물의 성장, 생존율, 생산성 및/또는 임의의 다른 대사 조건을 촉진하기 위해 상기 생물 반응기 또는 발효기(100)에 제공되는, 스파저.
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