KR20220077257A - 항암 광치료용 나노입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 말토덱스트린의 하이드록시기에 보론네이트기 및 형광염료를 접합시킨 고분자의 표면에 히알루론산을 코팅시킨 나노입자에 관한 것으로, 상기 나노입자를 포함하는 항암용 약학적 조성물, 항암 광치료용 조성물 및 혈관신생억제용 조성물로 사용될 수 있다.

Description

항암 광치료용 나노입자 및 이의 제조방법{Nanoparticles for using anticancer phototherapy and method for preparing the same}
본 발명은 말토덱스트린의 하이드록시기에 보론네이트기 및 형광염료를 접합시킨 고분자의 표면에 히알루론산을 코팅시킨 나노입자에 관한 것으로, 상기 나노입자를 포함하는 항암용 약학적 조성물, 항암 광치료용 조성물 및 혈관신생억제용 조성물에 관한 것이다.
암은 가장 생명을 위협하는 질병 중 하나로, 2018년에 전 세계적으로 960만 명이 암으로 인해 사망하였다. 기존의 암 치료 기법으로는 외과적 절제술, 화학요법 및 방사선 요법이 있으며, 최근에는 유전자 요법(gene therapy), 면역요법(immunotherapy) 및 광선요법(phototherapy)과 같은 치료 요법이 확립되었다.
그 중에서 광역학요법(photodynamic therapy, PDT)과 광열요법(photothermal therapy, PTT)과 같은 광선요법은 광감작제(photosensitizers)와 적절한 파장의 빛을 사용한다. PDT에서 광감작제는 빛을 조사하면 세포독성의 활성산소(reactive oxygen species, ROS), 특히 일중항산소(Singlet Oxygen, 1O2)를 생성하여 암세포를 직접 사멸한다. PTT에서 광감작제는 열을 생성하여 온도를 상승시켜 종양의 열 절제를 유도한다. 단일 근적외선(single near infraredm NIR) 레이저는 조직으로의 흡수 및 산란이 최소화되고 이후의 우수한 조직 침투 능력을 가지고 있어, PDT와 PTT 요법시 선호되는 외부 광원이다. PDT와 PTT는 기존의 치료 요법과 비교하였을 때 시공간적인 선택성과 비침습성의 장점을 가진다.
그러나 단일 치료방식으로서의 PDT와 PTT만으로는 치료 결과가 제한적이며, 종양에 광감작제를 명확히 전달하는 것도 매우 어려운 실정이다. 따라서 광선요법의 치료 효과를 향상시키기 위해, 통합된 PDT와 PTT 요법에서 광감작제 역할을 할 수 있는 종양표적 나노입자 개발의 필요성이 커지고 있다.
한편, 종양미세환경은 혈관 기형, 낮은 pH, 변화된 산화환원 균형 및 저산소 상태와 같은 여러 가지 요소로 특징되며, 항암 요법 치료 결과에 영향을 미친다. PDT는 산소를 소비하는 과정으로, 레이저 조사 중에 산소가 광감작제에 의해 세포독성이 높은 일중항산소로 변환된다. 그러므로 종양에서 낮은 수준의 산소는 기저 상태의 산소로부터 일중항 산소의 생성을 제한하여 PDT의 치료 효과와 면역 원성 효과를 약화시킨다. 더욱이 PDT에 의한 산소 소비는 종양의 저산소증을 악화시킬 수 있으려, 생성된 저산소 세포는 혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)와 같은 혈관신생유발(pro-angiogenic) 인자를 상향 조절하여 PDT 매개 손상으로부터 스스로를 보호한다. VEGF는 혈관신생조절제 중 하나로, VEGF의 과발현은 암환자의 부정적 예후와 밀접한 관련이 있다. 이러한 의미에서 전-혈관신생 VEGF의 역생산적인 상향 조절을 차단하는 것이 PDT의 치료결과를 좌우한다. 따라서 PDT를 혈관신생 억제제와 결합시켜 PDT 요법의 효과를 높이기 위한 유망한 전략으로 제안되었다.
또한, 과산화수소(H2O2)를 포함한 높은 수준의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 악성 암세포와 종양미세환경의 뚜렷한 특징 중 하나이다. 암세포는 종양형성 자극, 대사활동 증가 및 미토콘드리아 기능 장애로 인해 정상세포보다 더 높은 H2O2의 평형 상태 수준을 가진다. 높은 수준의 H2O2는 성장인자 수용체를 활성화를 강화시켜 암세포의 증식과 이동을 촉진한다. 또한 ROS는 종양 침입 및 종양이 발달하는데 중요한 역할을 한다. 특히, 과도한 H2O2는 암세포에 공격적인 표현형을 부여하여 혈관신생 VEGF를 발현하여 혈관신생 메커니즘을 유발하는 것으로 알려져 있다. 카탈라아제(catalase)와 수퍼옥시드 디스무타아제(superoxide dismutase, SOD)와 같은 ROS 제거제는 H2O2 신호를 약화시키고, 생존과 증식에 관련된 세포내 신호경로의 활성화를 억제함으로써 암세포의 성장을 감소시킬 수 있다. 따라서 악성 암세포에서 종양발생의 과도한 H2O2를 제거하는 것은 암세포의 성장을 억제하고 혈관 형성 VEGF 발현을 억제하여 항암 치료에 유익한 효과를 줄 수 있다.
현재 항암 치료를 위한 광선요법은 단일 치료 방식으로서 PTT 또는 PDT만을 사용하고 있으나, 단일 치료방식만으로는 항암 효과가 떨어지는 문제가 있다. 따라서, PTT와 PDT를 위한 광감작제 역할을 하면서, 종양 미세환경을 극복할 수 있는 치료제의 개발이 요구되고 있다.
J. Noh et al., ACS Applied Materials & Interfaces, 10(47), 40424-40433, 2018 W. Yang et al., Biomaterials, 154, 48-59, 2018 P. Liu et al., Journal of Materials Chemistry B, 7(44), 6924-6933, 2019
본 발명의 목적은 말토덱스트린의 하이드록시기에 보론네이트기 및 형광염료를 접합시킨 고분자의 표면에 히알루론산을 코팅시킨 나노입자 및 상기 나노입자를 포함하는 항암용 약학적 조성물, 항암 광치료용 조성물 및 혈관신생억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 보론네이트기 및 형광염료를 말토덱스트린(maltodextrin)의 하이드록실(hydroxyl) 그룹에 접합시켜 하기 화학식 1로 표시되는 고분자를 제조하는 단계; 및 (b) 히알루론산 용액에 상기 (a)단계에서 제조된 고분자를 분산시켜 반응시킨 후 히알루론산으로 코팅된 나노입자를 수득하는 단계;를 포함하는 나노입자의 제조방법을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에서,
상기 R 중 어느 하나 이상은 하기 구조식 1로 표시되는 보론네이트기가 결합되고,
상기 보론네이트가 결합되지 않은 어느 상기 R 중 어느 하나 이상은 형광염료가 결합되며,
상기 n은 1 내지 2000이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 고분자 및 상기 고분자의 표면이 히알루론산으로 코팅된 나노입자를 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00002
상기 화학식 1에서, 상기 R 중 어느 하나 이상은 하기 구조식 1로 표시되는 보론네이트기가 결합되고,
상기 보론네이트기가 결합되지 않은 어느 상기 R 중 어느 하나 이상은 형광염료가 결합되며,
상기 n은 1 내지 2000이다.
[구조식 1]
Figure pat00003
또한, 본 발명은 상기 나노입자를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자를 포함하는 항암 광치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자를 포함하는 혈관신생억제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 보론네이트기 및 형광염료를 말토덱스트린(maltodextrin)의 하이드록실(hydroxyl) 그룹에 접합시켜 상기 화학식 1로 표시되는 고분자를 제조하는 단계; 및
(b) 히알루론산 용액에 상기 (a)단계에서 제조된 고분자를 분산시켜 반응시킨 후 히알루론산으로 코팅된 나노입자를 수득하는 단계;
를 포함하는 나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 나노입자는 단일 근적외선(single near infraredm NIR) 레이저 조사시, 열과 일중항산소를 동시에 생성하여 암세포를 사멸하고, 면역원성 암세포를 사멸하는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따른 나노입자는 H2O2를 제거하는 동시에 혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)와 암세포 전이를 억제하여 혈관신생억제하는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따른 나노입자는 나노입자 표면에 히알루론산을 부착하여, 다양한 암세포에서 과발현되는 CD44 수용체에 특이적으로 결합하여 암의 표적화가 가능한 효과가 있다.
도 1은 광치료제로서의 본 발명에 따른 나노입자(HA-FBM 나노입자)의 개략도로 (a)는 HA-FBM 나노입자의 제조 및 분해 과정을 나타낸 것이며(R은 아릴보론네이트기(arylboronate group)), (b)는 PTT 및 PDT 병용 요법을 통한 향상된 항암 치료를 도식화한 것이다.
도 2는 HA-FBM 나노입자의 특성분석 결과 데이터로, (a)는 HA-FBM 나노입자의 SEM 이미지 및 입도 분포, (b)는 PBS에 분산된 FBM 및 HA-FBM 나노입자의 제타 전위 분석, (c)는 레이저 조사(1 W/cm2) 중 HA-FBM 나노입자에 의한 온도변화, (d)는 5분 동안의 레이저 조사 후 다양한 농도의 HA-FBM 나노입자의 열화상 이미지(평균 ± SD(n=3))를 나타낸 것이다.
도 3은 FBM 및 FBA 고분자의 특성을 나타낸 것으로, (a)는 DMSO에 용해된 FBM 및 FBA의 흡광도, (b)는 동일한 농도의 FBM 및 FBA 나노입자의 온도 증가 측정 결과, (c)는 FBM 및 FBA 나노입자의 H2O2 소거능 비교(평균±SD (n=3)) 결과이다.
도 4는 NIR 레이저 조사하에서 SW620 세포에 대한 HA-FBM 나노입자의 in vitro 항암활성 결과를 나타낸 것으로, (a)는 SW620 세포에 의한 HA-FBM 나노입자의 세포 흡수 결과, (b)는 DMA 프로브를 사용하여 일중항 산소 생성 결과, (c)는 HA-FBM 나노입자로 처리되고 NIR 레이저 조사 후 유도된 SW620 세포의 세포사멸(평균 ± SD (n=3). ***p < 0.001(레이저 단독 대비), †††p < 0.001(레이저 조사되지 않은 HA-FBM 200 μg/mL 대비)결과, (d)는 Annexin V-FITC 및 PI로 염색된 SW620 세포의 유동 세포 계측법(Flow cytometric analysis) 수행 결과, (e)는 PI로 염색된 SW620 세포의 세포주기 분포 (f) JC-1로 염색된 세포의 미토콘드리아 막 전위 분 석 이미지, (g)는 JC-1 응집체 및 모노머의 정량 분석(평균 ± SD (n=3). ***p < 0.001(레이저 단독), †††p < 0.001(레이저 조사 없이 HA-FBM 200 μg/mL 단독)결과이다.
도 5는 NIR 레이저 노출 하에서 HA-FBM 나노입자의 면역원성 효과를 확인한 결과로, (a)는 CHOP 발현에 대한 HA-FBM 나노입자의 효과, (b)는 세포막에 대한 CRT 노출의 형광 이미지, (c)는 세포에서 증가된 HMGB-1 레벨(평균 ± SD (n=3). ***p < 0.001(무처리군 대비), †††p < 0.001(레이처 조사되지 않은 HA-FBM 대비))을 나타낸 것이다.
도 6은 HA-FBM 나노입자가 SW620 세포에 미치는 항-이동(antimigratory) 및 혈관신생 억제 효과를 확인하기 위한 실험 결과로, (a)는 0 및 24시간 동안 항-이동 효과를 확인하기 위한 이미지, (b)는 상처 거리(wound distance)의 정량화(평균 ± SD (n=3), ***p < 0.001 (무처리 대비), †††p < 0.001 (HBA 대비)) 결과, (c)는 HBA 또는 HA-FBM 나노입자 처리 후 VEGF 발현 수준, (d)는 HA-FBA 또는 HA-FBM 나노입자를 처리한 PDT 및 PTT 병용 후 VEGF 발현 수준을 나타낸 것이다,
도 7은 HBA의 혈관신생 억제 효과를 확인하기 위한 실험 결과로, (a)는 HBA 및 카탈라아제에 의한 이동억제 효과, (b)는 wound 봉합의 정량화 결과, (c)는 다양한 농도의 HBA에서 VEGF 수준 억제 결과, (d)는 다양한 농도의 카탈라아제 및 HBA에서 VEGF 수준 억제(평균 ± SD (n=3), *** P<0.001) 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 HA-FBM 나노입자를 사용하여 PTT 및 PDT 병용에 따른 항암 효과(In vivo)를 나타낸 것으로, (a)는 FBM 또는 HA-FBM 나노입자의 정맥주사 후 시간에 따른 형광 이미지, (b)는 5분 NIR 레이저 조사 후 종양 마우스의 열 이미지, (c)는 30일 동안 종양 마우스와 절제된 종양의 사진, (d)와 (e)는 각각 30일 동안 종양 부피 및 체중 변화 그래프(평균 ± SD (n=3))로, 회색 화살표는 HA-FBM 또는 FBM 나노입자 주입 날짜를 나타내며, 주사 2일 후 종양에 NIR 레이저를 조사하였다. (f)는 30일째에 절제된 종양조직의 조직학적 평가(상단패널: H&E 염색, 하단 패널: TUNEL 염색)결과를 나타낸 것이다.
도 9의 (a)는 HA-FBM 나노입자(5 mg/kg, 100 μL) 투여 후 마우스의 형광 이미지, (b)는 주사 4일 후 절제된 종양에서 HBA의 LC/MS 분석결과를 나타낸 것이다.
도 10은 종양 조직에서 ICD 유도에 대한 조직학적 평가를 나타낸 것으로, (a) 및 (b)는 각각 CRT 항체 및 TNF-α 항체로 염색된 종양 조직의 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 11의 (a)는 HA-FBM 나노입자의 혈관 신생 억제 효과 확인을 위한 in vivo 실험 타임라인(HA-FBM 또는 HA-FBA 나노입자 (5 mg/kg)를 2회 정맥주사하고 NIR 레이저(1 W/cm2)를 조사 2일후 5분동안 조사하였다.)이고, (b)는 종양 조직에서 VEGF의 레벨(평균 ± SD (n=3). *** P<0.001)을 나타낸 것이다.
도 12는 HA-FBM 나노입자의 생체내 독성 결과로 (a)는 ALT 레벨(Values are mean ± SD (n=3). n.s. indicates non-significant.), (b)는 간과 심장의 TUNEL 염색, (c)는 주요 기관의 H&E 염색 결과이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 고분자 및 상기 고분자의 표면이 히알루론산으로 코팅된 나노입자를 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00004
상기 화학식 1에서,
상기 R 중 어느 하나 이상은 하기 구조식 1로 표시되는 보론네이트기가 결합되고,
상기 보론네이트기가 결합되지 않은 어느 상기 R 중 어느 하나 이상은 형광염료가 결합되며,
상기 n은 1 내지 2000이다.
[구조식 1]
Figure pat00005
상기 히알루론산은 도파민이 접합된 히알루론산일 수 있으며, 도파민이 히알루론산에 접합되어 카테콜화된 히알루론산(catecholized hyaluronic acid)이 합성되며, 다양한 기질의 표면에 대한 카테콜의 강한 결합력으로 인해 카테콜화된 히알루론산이 상기 고분자의 표면에 흡착될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 형광염료는 고분자와 결합하면서 부작용을 발생시키지 않는 어떠한 형광염료도 사용 가능하다. 상기 형광염료는 Cl기 또는 Br기가 결합된 것이 바람직하며, 그 예로는 IR780, IR820 및 IR1061 등이 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니며 인도시아닌 그린(Indocyanine green), 시아닌5 카복실산(Cyanine5 carboxylic acid), 시아닌7 카복실산(Cyanine7 carboxylic acid) 등의 형광염료 또한 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 나노입자는 근적외선 영역의 빛을 조사하여 광열 치료, 광역학 치료 또는 광열 및 광역학 병용 치료에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자를 포함하는 항암용 약학적 조성물을 제공한다.
여기서, 상기 "암"은 가성점액종, 간내담도암, 간모세포종, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 구순암, 균상식육종, 급성골수성백혈병, 급성림프구성백혈병, 기저세포암, 난소상피암, 난소생식세포암, 남성유방암, 뇌암, 뇌하수체선종, 다발성골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 만성골수성백혈병, 만성림프구백혈병, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 미만성거대B세포림프종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비부비동암, 비소세포폐암, 비호지킨림프종, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아뇌암, 소아림프종, 소아백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신경모세포종, 신우암, 신장암, 심장암, 십이지장암, 악성 연부조직 암, 악성골암, 악성림프종, 악성중피종, 악성흑색종, 안암, 외음부암, 요관암, 요도암, 원발부위불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관간질암, 윌름스암, 유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신융모질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성 골암, 전이성뇌암, 종격동암, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수암, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 카포시 육종, 파제트병, 편도암, 편평상피세포암, 폐선암, 폐암, 폐편평상피세포암, 피부암, 항문암, 횡문근육종, 후두암, 흉막암, 및 흉선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자를 포함하는 항암 광치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자를 포함하는 혈관신생억제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 다른 실시예에 따라, (a) 보론네이트기 및 형광염료를 말토덱스트린(maltodextrin)의 하이드록실(hydroxyl) 그룹에 접합시켜 상기 화학식 1로 표시되는 고분자를 제조하는 단계; 및
(b) 히알루론산 용액에 상기 (a)단계에서 제조된 고분자를 분산시켜 반응시킨 후 히알루론산으로 코팅된 나노입자를 수득하는 단계;
를 포함하는 나노입자의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 (b) 단계는 히알루론산을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC) 및 하이드록시벤조트리아졸(hydroxybenzotriazole, HOBt)이 포함된 물에 용해시킨 후, 도파민을 첨가하여 반응시켜 도파민이 접합된 히알루론산을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 제조방법에 있어서, 형광염료에 관한 정의는 앞서 정의하였던 것과 동일한 의미를 갖는다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 히알루론산으로 코팅된 나노입자(HA-FBM 나노입자) 제조
먼저, 하기 반응식 1에 도시된 바와 같이, 아릴보로산 피나콜 에스테르(arylboroic acid pinacol ester)와 IR780 요오드화물(iodide)을 말토덱스트린(maltodextrin)의 하이드록실(hydroxy) 그룹에 접합시켜 FBM 고분자를 합성하였다.
[반응식 1]
Figure pat00006
상기 FBM 고분자는 직접용해방법에 의해 제조하였으며, 100 μL의 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF)에 용해된 FBM 100 mg을 1 ml의 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)에 첨가하고, 초음파처리기(Sonic Dismembrator 500, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 초음파처리하였으며, THF 용액은 회전 농축기를 사용하여 제거하였다. FBM 고분자는 원심분리후 얻어졌다.
IR780은 물리적, 화학적 안정성이 높고, 광열 수렴과, 일중항산소를 생성 능력이 있어 PTT 및 PDT의 광감제로 사용되었다. 아릴보로산 피나콜 에스테르는 하기 반응식 2에 도시된 바와 같이, 소수성과 H2O2 트리거로 하이드록시벤질 알코올Hhydroxybenzyl alcohol, HBA)을 방출하는 능력 때문에 다당류에 접합되었다.
[반응식 2]
Figure pat00007
말토덱스트린의 하이드록시기에 대한 H2O2 반응성 아릴보로네이트기 및 IR780의 접합 비율은 각각 80 및 5 중량%였고, FBM의 HBA 함량은 최대 20중량%로 결정되었다.
여기서, HBA는 당근과 천마의 페놀 성분 중 하나로, 허혈성 손상시 항산화, 항염증 및 혈관신생효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.
FBM 고분자를 히알루론산(hyaluronic acid, HA)으로 코팅하기 위해 하기 반응식 3에 도시된 같이, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC) 및 하이드록시벤조트리아졸(hydroxybenzotriazole, HOBt)을 사용하여 도파민을 HA에 접합시켜 도파민이 접합된 HA(catecholized HA)를 제조하였다.
[반응식 3]
Figure pat00008
HA 1 g을 EDC 0.489 g 및 HOBt 0.344 g을 포함하는 물에 용해시켰다. 30분 후, 도파민 0.372 g을 HA용액에 첨가하고, 실온에서 24시간동안 반응시켰다. 도파민이 접합된 HA는 물에 투석(dialysis)시켜 얻어졌다. FBM 나노입자의 표면을 HA로 코팅시키기 위해 FBM 나노입자 10 mg을 도파민이 접합된 HA 용액(1 mg/10 mL)에 분산시키고 30분 동안 반응시켰다. 남아있는 도파민이 접합된 HA는 원심분리기로 제거함으로써 HA 코팅된 형광 IR780 접합 붕소화 다당류(HA-coated fluorescent IR780-conjugated boronated polysaccharide, HA-FBM) 나노입자를 제조하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, 상기 HA-FBM 나노입자는 특정 종양을 표적으로 삼고, 단일 근적외선(single near infraredm NIR) 레이저 조사를 하여 높은 세포독성의 일중항 산소와 열을 생성함으로써 직접적으로 암세포를 사멸하는 광감작제 역할을 할 것으로 예상하였다. 또한 HA-FBM 나노 입자는 혈관신생을 억제하고 암세포 생존 신호 분자인 H2O2를 제거하고 면역원성 효과를 이끌어냄으로써 광선요법의 장점을 극대화하는데 도움이 될 것으로 사료된다.
비교예 1. HBA 방출 능력이 없는 FBA 고분자 합성
하기 반응식 4에 도시한 같이, FBM 고분자와 IR780의 함량은 동일하지만 H2O2 반응성 보로네이트 에스테르나 HBA 방출 능력이 없는 FBA 고분자를 합성하였다.
Figure pat00009
실시예 1. HA-FBM 나노입자의 특성평가
HA-FBM 나노입자의 형태 및 입도분포는 각각 SEM 주사 현미경(JSM-6400, JEOL, 일본) 및 동적광산란(90Plus, Brookhaven Instrument Corp, Holtsville, NY)을 사용하여 결정되었다. HA에 의한 FBM 나노입자의 표면 개질은 제타 전위 분석기(zeta potential analyzer, ELS-8000, OTSUKA, Japan)를 사용하여 확인되었다. HA-FBM 나노입자에 의해 유도된 온도변화는 808 nm 레이저(1 W/cm2)의 연속 NIR 레이저 조사 동안 모니터링 되었다. 열화상은 열검출기(Therm-App, Opgal Optronic Industries Ltd, Israel)를 사용하여 5분 동안 NIR 레이저 조사 후 얻었다.
HA-FBM 나노입자는 평균 직경이 200 nm이하인 분산 콜로이드 구체이다(도 2a). HA를 포함하는 FBM 나노입자의 표면 코팅은 제타 전위 분석에 의해 확인되었다. FBM 나노입자와 달리 HA-FBM 나노입자는 음으로 하전된 다수의 카르복실기 때문에 음의 제타 전위(-34 mV)를 나타냈다(도 2b). 이것은 다양한 기질의 표면에 대한 카테콜의 강한 결합력으로 인해 카테콜화된 HA가 FBM 나노입자의 표면에 흡착되었음을 시사한다.
HA-FBM 나노입자는 PBS에 잘 분산되고, 농도 의존적으로 연속 808 nm의 NIR 레이저 노출 하에서 온도를 높일 수 있다. HA-FBM 나노입자의 농도가 500 μg/mL인 경우에, 5분 동안 NIR 레이저 조사 후 PBS의 온도가 50℃까지 상승하였다. 그러나 500 μg/mL의 HA-FBM 나노입자와 동일한 농도의 유리 IR780은 수성 조건에서 응집하고, 낮은 광열 변환으로 인해 현저히 낮은 열효과(△8°C)를 나타냈다(도 2c). 열화상은 HA-FBM 나노입자의 농도의존적 온도 증가를 보여주었다(도 2d).
도 3의 a 및 b에 도시된 바와 같이, DMSO에 용해된 동일한 농도의 FBM 및 FBA는 NIR 레이저 노출에서 거의 동일한 수준의 흡수 및 광열 변환을 보여 FBM 및 FBA가 동일한 함량의 IR780을 포함하고 있음을 보여준다. 보로네이트 에스테르기가 없는 FBA는 H2O2를 제거할 수 없었고(도 3c), 반대로 보로네이트 에스테르기의 H2O2에 의해 트리거된 산화 동안 FBM이 H2O2를 소비함을 확인하였다.
실시예 2. HA-FBM 나노입자의 광열 및 광역학 효과 확인(in vitro)
SW620세포를 FBM 나노입자로 처리하고, 6시간동안 배양하였다. 배양후 세포를 레이저(1 W/cm2)에 5분동안 노출시키고 일중항 산소 마커인 9,10-디메틸안스라센(9,10-dimethylanthracene, DMA)으로 처리하였다. 세포배양배지를 수집하고 형광분광계(FP-6500, JASCO Corp., Japan)를 사용하여 형광을 측정하였다.
50 μg/mL의 HA-FBM 나노입자로 24시간 배양한 후, 도 4의 (a)에 도시된 바와 같이 세포질에서 강한 적색 형광이 관찰되었으며, 이는 HA-FBM 나노입자가 내포작용을 통해 SW620 세포에 의해 즉시 흡수되는 것을 나타낸다.
일중항 산소 생성 확인 결과, 도 4의 (b)에 도시된 바와 같이 무처리 세포는 DMA의 강항 형광을 보였으나, DMA의 형광은 HA-FBM 나노입자에 레이저 조사후 생성된 일중항산소에 의한 DMA의 형광 소광으로 인해 크게 감소하였다.
HA-FBM 나노입자 (50 μg/mL)가 NIR 레이저 조사 동안 기저 상태의 산소 분자를 일중한 산소로 전환하고, 일중항 산소는 50℃까지 온도가 올라감으로써 급냉각되지 않은 결과를 보였다. 도 2의 c 및 d와 함께 광열효과에 대한 결과를 살펴보면, HA-FBM 나노입자는 NIR 레이저 조사시 PTT 및 PDT 병용을 위한 광감작제 역할을 할 수 있음을 보여준다.
FBM 나노입자의 세포독성은 4-(4,5-다이메틸아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT) 어세이에 의해 결정되었다. SW620 세포를 웰당 3×105개 세포로 접종하고 다양한 농도의 FBM 나노입자로 처리하였다. 6시간 배양 후, 1 W/cm2 출력의 레이저를 조사하고 세포를 18시간동안 배양하였다. MTT 용액을 각 웰에 첨가하고 3시간동안 배양하여 포르마잔 결정(formazan crystal)을 형성하였다. 포르마잔 결정은 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 용해시켰고, 흡광도는 마이크로플레이트 리더(microplate reader, Biotek Instruments, Winooski, VT, USA)를 사용하여 570 nm 파장에서 검출되었다.
암세포에 대한 HA-FBM 나노입자는 암세포 생존 및 증식을 위한 세포내 신호전달에 중요한 H2O2를 제거함으로써 세포독성 결과를 나타내는 것으로 설명할 수 있다. 도 4의 c에 도시된 바와 같이, 200 μg/mL의 HA-FBM 나노입자에 해당하는 HBA는 무시할 수 있을 정도의 세포 독성을 나타냈다. 광열 및 광역학 효과에 의해 HA-FBM 나노입자와 레이저 조사의 시너지 효과가 나타남으로써 암세포가 사멸되었다. 100 μg/mL의 HA-FBM 나노입자에 레이저 조사한 것은 같은 농도의 HA-FBM을 단독으로 사용한 것보다 유의하게 더 높은 세포독성을 나타냈다. 대부분의 암세포는 200 μg/mL의 HA-FBM과 레이저 조사가 함께 이루어짐으로써 사멸됐다. 강력한 암세포 사멸 효과는 단일 레이저 조사와 HA-FBM 나노입자의 광열 및 광역학 효과의 시너지를 통해 나타나는 것으로 설명될 수 있다.
세포사멸 분석을 위해 세포는 MTT 분석과 동일하게 처리되었다. Annexin V 및 PI는 세포 사멸을 감지하는 마커로 사용되었다. 세포주기 분포를 정량화하기 위해, 세포를 RNase A로 처리한 후 PI로 염색하였다. 모든 염색된 세포를 수집하고 유세포분석법(FACs Caliber Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)으로 분석하였다. 미토콘드리아 막 전위의 손실은 JC-1 키트(Invitrogen, CA, USA)를 사용하여 측정되었다. 염색된 세포는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM880, Carl Zeiss Inc, Germany)으로 쵤영되었다. 적색과 녹색의 비율을 Image J 소프트웨어(미국 메릴랜드주 국립 보건원)로 정량화되었다.
HA-FBM 나노입자와 NIR 레이저 조사의 조합이 세포사멸을 유도하는지의 여부를 조사하기 위해, FITC 접합된 Annexin V를 세포사멸 마커로 사용하여 유동 세포 계측 분석을 수행하였다. 도 4d에서 볼 수 있듯이, FBM 나노입자와 NIR 레이저 조사의 조합은 오른쪽 상단 사분면의 증가를 통해 세포 사멸을 유도하는 것을 확인하였다.
FBM 나노입자와 NIR 레이저의 조합에 의해 유도된 세포주기 분포 변화를 확인하기 위해 세포주기 분석을 수행하였고, NIR 레이저를 사용한 FBM 나노입자는 약간의 G2/M 주기의 정지를 유도하였지만, sub-G0 단계를 크게 증가시켜, 이를 통해 세포 사멸을 유도함을 확인하였다(도 4e)
HA-FBM 나노입자 매개 광열 및 광역학 효과에 의해 유도된 세포 사멸을 추가로 입증하기 위해 미토콘드리아 막전위 프로브(미토콘드리아 막의 탈분극/파괴 시 녹색 형광을 나타냄)인 JC-1 염료를 사용하여 세포분석을 실시하였다. HA-FBM 나노입자는 녹색 형광으로 나타남을 확인하여, 미토콘드리아 막의 탈분극 및 파괴를 유도함을 확인하였다. 그러나 레이저 조사와 HA-FBM 나노입자의 시너지를 통해 미토콘드리아 막을 파괴함을 확인하였다.(도 4f 및 g) 이러한 결과는 HA-FBM 나노입자의 강력한 항암 활성이 PDT 및 PTT 병용에 의한 상승효과를 위한 광감작제로서의 역할을 하는 것으로 설명될 수 있다.
실시예 3. HA-FBM 나노입자 매개 광선요법의 면역원성 효과 확인(in vitro)
면역원성 세포 사멸(immunogenic cell death, ICD)은 죽어가는 세포가 항암 면역 체계를 자극하는 손상 관련 분자 패턴(damage-associated molecular patters, DAMPs)을 방출하는 능력으로 정의된다. 면역원성을 확인하기 위해 SW620 세포(3×106 well/cell)를 다양한 농도의 HA-FBM 나노입자로 처리하였다. 6시간의 배양 후 세포에 NIR 레이저를 조사하고 추가로 18시간 동안 배양하였다.
HA-FBM 나노입자 매개 광선요법의 ICD 관련 면역원성을 증명하기 위해, ER 스트레스 마커로서 CHOP, CRT 및 HMGB-1과 같은 DAMPs의 발현을 조사하였다. 도 5a에서 볼 수 있듯이, HA-FBM 나노입자 단독과 비교하여 NIR 레이저가 조사된 HA-FBM 나노입자는 CHOP의 상당한 과발현을 유발하였다.
또한, C/EBP-상동 단백질(CHOP)의 수준을 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하여 ROS 관련 소포체(ER) 스트레스를 조사하였다. 칼레 티 쿨린(calreticulin, CRT) 노출을 평가하기 위해 고정된 세포를 Alexa Fluor 488-CRT 항체 (Enzo Life Science, dilution ration 1:100) 및 4',6-디아미노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)로 염색하였다. CRT 노출은 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 모니터링되었다. Human HMGB-1 ELISA 키트(arigo Biolaboratories, Taiwan)를 사용하여 상층액상의 염증매개물질인 high mobility group box 1 (HMGB-1) 수준을 결정하였다.
도 5b 및 c를 보면, CRT 및 HMGB-1의 수준은 NIR 레이저가 조사된 HA-FBM 나노입자에서 크게 증가함을 확인하였다. 이러한 결과는 HA-FBM 나노입자 매개 광선요법이 면역원성 암세포 사멸을 유도하기 위해 ER 스트레스를 상당히 증가시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 4. HA-FBM 나노입자의 항-이동(antimigratory) 효과 및 혈관신생 억제 효과 확인(in vitro)
과도한 H2O2는 혈관신생과 암세포의 전이를 촉진하고, HA-FBM 나노입자는 H2O2를 제거하고 혈관신생 억제제인 HBA를 방출하도록 설계되었기 때문에, HA-FBM 나노입자가 암세포에 미치는 항-이동(antimigratory) 및 혈관신생 억제 효과를 평가하였다.
HA-FBM 나노입자가 암세포 이동에 미치는 영향을 조사하기 위해 세포스크래치 분석을 먼저 수행하였다. SW620 세포를 3×106 cell/well의 밀도로 6웰 플레이트에 접종하고 20%의 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함한 RPMI 배지에서 완전히 융합(confluency)시키기 위해 배양하였다. 200 μL의 옐로우 팁을 사용하여 스크래치를 만들었다. 세포를 스크래치한 후 HBA 100 μM과 FBM 나노입자 25 μg/mL 및 50 μg/mL를 각 웰에 처리하고 이미지를 24시간 후에 캡처했다. 폐쇄(closure) 비율은 Image J 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.
도 6의 a 및 b에 도시된 바와 같이, 상처(Wound)는 암세포의 본질적인 이동 능력에 의해 완전히 폐쇄되었다. HA-FBM 나노입자는 농도의존적으로 암세포의 이동을 억제하였다. 세포 이동은 50 μg/mL의 HA-FBM 나노입자에 의해 거의 억제되었다. 그러나 50 μg/mL의 HA-FBM 나노입자에서 방출되는 동일한 양의 HBA는 암세포 이동을 45%까지 감소시켰다.
이 결과로부터 H2O2 제거 카탈라아제(H2O2 scavenging catalase)가 HBA와의 시너지 효과를 발휘하여 암세포 이동을 억제한다는 것을 확인하였다(도 7a 및, b). 따라서 HA-FBM 나노입자의 현저한 암세포 이동 저해 활성은 보로네이트 에스테르의 H2O2 제거 효과와 HBA 고유 활성의 시너지 효과에 기인한 것으로 판단된다.
또한, HA-FBM 나노입자가 암세포에서 혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF) 발현을 억제하는지 여부를 평가하였다. 세포를 5분 동안 NIR 레이저를 조사하여 HA-FBM 나노입자를 처리했다. 처리 24시간 후, 세포를 용해시키고 세포 상층액을 취하여 ELISA 키트(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 VEGF 레벨을 측정했다.
HBA는 농도의존적으로 SW620 세포에서 VEGF 발현을 억제하였으며(도 7c), VEGF 발현을 억제하는 HBA의 능력은 H2O2 제거 카탈라아제에 의해 더욱 향상됨을 확인하였다(도 7d). 이러한 결과로부터 HA-FBM 나노입자는 H2O2 제거 및 방출된 혈관신생 억제제인 HBA로 인해 VEGF 발현을 상당히 억제함을 확인하였다(도 6c)
산소를 소모하는 PDT는 종양에서 저산소증을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 이는 VEGF와 같은 다양한 혈관신생유발 인자를 상향조절함으로써 혈관 신생을 촉진한다(도 6d). H2O2를 제거하거나 HBA를 방출할 수 없는 HA-FBA 나노입자를 대조군으로 사용하였다. 5분 레이저 조사로 결합된 HA-FBA 나노입자의 처리 24시간 후, VEGF 발현이 상당히 상승하였다. 그러나 HA-FBM 나노입자는 광선요법 이후 VEGF발현을 유의하게 억제하였다.
도 4에서 알 수 있듯이, HA-FBM 나노입자는 NIR 레이저 노출하에서 열과 일중항 산소를 동시에 생성하여 암세포를 사멸시킨다. 따라서 HA-FBM 나노입자는 광감작제 및 혈관신생 억제제로서의 복합적인 기능으로 인해 산소를 소모하는 PDT의 한계를 극복할 수 있는 전략이 될 것으로 예상된다.
실시예 5. HA-FMB 나노입자를 사용한 영상유도 광선요법 결과(in vivo)
암 이종이식 마우스 모델을 확립하기 위해, SW620 세포(3.0×106 cells/100 μL in PBS)를 암컷 마우스 옆구리에 피하이식 하였다. 종양의 크기가 300 mm3이 된 후에 FBM 또는 HA-FBM 나노입자를 정맥주사하여 생체 분포를 조사하였다. 형광 이미지는 NIR 광을 여기하는 형광 바이오이미징 시스템(fluorescence bioimaging system, FOBI, Cellgentek, Korea)을 사용하여 얻었다. HA-FBM 나노입자 주입하고 3일 후, 마우스를 NIR 레이저(1 W/cm2)에 5분동안 노출시켜 열 검출기를 사용하여 생체내 광열 이미지를 얻었다.
이종 이식 마우스 모델을 사용하여 HA-FBM 나노입자의 잠재력(translational potential)을 평가하였다. 먼저, HA-FBM 나노입자 (5 mg/kg)을 마우스에 정맥투여한 후 형광이미징을 수행하여 용양 표적화 능력을 확인하였다. 형광이미징은 HA-FBM 나노입자가 같은 용량의 FBM 나노입자보다 더 높은 효율로 종양에 축적되어 HA-FBM 나노입자가 암세포에서 과발현된 CD44와 바인딩하여 표적종양에 대한 리간드 역할을 함을 시사한다. 최대 형광강도는 HA-FBM 나노입자 주입 2일 후에 관찰되었고(도 8a), 신호는 7일 이상 지속될 수 있으며(도 9a), 이는 영상 유도 항암 광선 요법으로의 가능성을 시사한다. FBM보다 높은 표적화 효율로, HA-FBM 나노입자는 NIR 레이저 조사 5분 후 종양 부위의 온도를 크게 상승시켰다(도 8b).
항암효과를 확인하기 위해, HBA 2.5 mg/kg 및 HA-FBM 나노입자 2.5 mg/kg를 0, 3, 5일째에 정맥주사 하였다. 주사한 후 48시간 뒤에 종양에 808 nm 및 1 W/cm2의 NIR laser를 5분동안 조사하였다. 종양의 크기와 체중은 30일동안 3일마다 측정하였다. 종양 부피(V)는 다음 방정식에 의해 계산되었다.
V=(L×W2)/2 (L은 종양의 가장 긴 부분이고, W는 종양의 가장 넓은 부분의 길이 이다.)
또한, 종양과 간, 심장, 폐, 비장 및 신장을 포함한 주요 기관을 절제하고 조직학적 평가를 위해 4%의 포름알데히드로 고정시켰다. 종양을 6 μm 두께로 절편하고, 헤마톡실린-에오신(hematoxylin and eosin, H&E) 및 TUNEL 어세이(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, Promega, WI, USA)를 이용하여 염색하여 광유발 치료효과를 확인하였다.
종양 마우스에 HA-FBM 나노입자 투여하고 광선요법을 3회 실시후 종양 크기를 모니터링하여 치료 효능을 평가한 결과, 도 8의 c 및 d에 도시된 바와 같이, HA-FBM 나노입자(5 mg/kg)에서 방출된 동일한 양의 HBA는 치료효과가 거의 없는 것으로 나타났다. HA-FBM(5 mg/kg) 만으로는 종양 성장을 현저하게 억제할 수 없었으나, 레이저를 조사한 경우에는 HA-FBM 나노입자의 용량에 따라 상당한 종양 억제 효과를 나타냈다.
또한, 5 mg/kg의 HA-FBM 나노입자 및 NIR 레이저로 처리된 마우스는 체중에 상당한 변화 없이 종양이 거의 억제된 것을 확인하였으며(도 8e), HA-FBM 나노입자의 우수항 항암활성과 허용가능한 생물학적 안전성을 입증하였다.
조직학적 평가는 HA-FBM 나노입자 및 레이저로 처리된 마우스의 종양이 레이저 조사 없이 HA-FBM 나노입자만 처리한 그룹에 비해 심각한 구조적 손상과 세포사멸을 나타냈다(도 8f). 이러한 결과는 HA-FBM 나노입자와 PTT 및 PDT를 동시에 사용하는 것이 매우 강력한 항암 활성을 발휘하는 것을 시사한다.
HA-FBM 나노입자의 면역원성 세포사멸 및 혈관신생 억제 효과를 확인하기 위해 CRT 및 종양 괴사 인자 알파(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)를 사용한 면역 형광 염색도 수행되었다.
HA-FBM 나노입자 기반 광선 요법이 ICD를 유도하는지 여부를 확인하기 위해, 핵 주위 ER에서 원형질막으로 전이되고 항암 면역 반응을 촉진하기 위한 “eat me” 신호로서 필수적인 역할을 하는 CRT의 수준을 평가하였다. HBA와 HA-FBM 나노입자는 CRT의 발현에 영향을 미치지 않았으나, HA-FBM과 NIR 레이저가 처리된 그룹은 CRT 수준이 크게 증가하였다(도 10a).
전 염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 중 하나인 TNF-α는 ICD 동안 방출되고 면역반응을 촉진하여 항암효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다. HA-FBM 나노입자 주입 후 NIR 레이저를 저리하였을 때 TNF-α의 발현이 현저히 증가하는 것으로 나타났다(도 10b). 이러한 결과를 통해 ICD 가 HA-FBM 나노입자 매개 광선요법의 항암활성에 기여한다고 판단된다.
실시예 6. HA-FBM 나노입자의 혈관신생 억제 활성 확인(in vivo)
HA-FBM 나노입자가 혈관 신생 억제 광감작제로 개발됨에 따라, 다른 마우스 이종 이식 모델 세트에서 혈관 신생 억제 효과를 평가하였다. 도 11a에 도시된 바와 같이, 종양의 부피가 300 mm3까지 도달한 후 동일한 용량의 HA-FBM 또는 HA-FBA 나노입자를 14일 및 17일째에 정맥주사하고, 종양에 16일 및 19일째에 NIR 레이저를 조사하였다.
HA-FBA 나노입자를 사용한 광선 치료 후 종양에서 VEGF의 레벨이 크게 증가하였다. 그러나 HA-FBM 나노입자 기반 광선 치료 후에는 VEGF의 레벨이 상승되지 않았다(도 11b). 이러한 결과는 HA-FBM 나노입자가 혈관 신생을 유도하는 H2O2를 소거하고 혈관 신생 억제 HBA를 방출하는 기능으로 인해 VEGF의 발현을 현저하게 억제하는 결과를 가져온 것을 강력하게 시사한다.
종양에서 HA-FBM 나노입자로부터 HBA의 방출을 확인하기 위해 LC/MS 분석을 수행하였다. 도 9b에 도시된 바와 같이, 주사 후 4일째에 종양에서 HBA의 뚜렷한 피크가 관찰됐으며, 이는 HA-FBM 나노입자가 암세포를 표적으로 하고, 종양에서 HBA를 방출함을 입증한다.
실시예 7. HA-FBM 나노입자의 생체내 독성 평가(in vivo)
HA-FBM 나노입자의 안전성을 평가하기 위해 30일째에 혈액과 주요 기관을 채취하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, 알라닌 아미노 전이효소(alanine aminotransferase, ALT)의 레벨에는 큰 차이가 없었다. HA-FBM 나노입자 및 레이저 처리된 마우스의 주요 기관 조직 절편에서는 조직학적 변화와 세포사멸이 관찰되지 않았으며, 이는 HA-FBM 나노입자가 허용 가능한 생물학적 안정성 프로파일을 가지고 있음을 시사한다.
본 발명에서는 PTT와 PDT의 병용요법을 위한 감감작제 역할을 하면서, 종양미세환경을 극복할 수 있는 HA-FBM 나노입자를 개발했다. 단일 근적외선(single near infraredm NIR) 레이저 조사에서, HA-FBM 나노입자는 열과 단일 산소를 동시에 생성하여 암세포를 사멸하고, 면역원성 암세포 사멸을 유도하였다. 광감작제로서의 근본적인 역할 외에도 HA-FBM 나노입자는 혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)와 암세포 전이를 억제하여 혈관신생억제 효과를 나타냈다. 마우스 이종 이식 모델에서, 정맥주사된 HA-FBM 나노입자는 CD44 과발현된 암세포에 결합하여 종양을 타겟팅 하였고, 레이저 조사시, HA-FBM 나노입자는 종양을 현저하게 제거하고 혈관 신생 VEGF 발현을 억제함을 확인하였다. 종양을 표적하는 혈관신생 억제 HA-FBM 나노입자는 영상유도 항암 광 치료제로서 큰 잠재력을 가질 것으로 예상된다.
이상과 같이 실시예를 통하여 본 발명을 설명하였다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 상술한 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 한다. 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 고분자 및 상기 고분자의 표면이 히알루론산으로 코팅된 나노입자
    [화학식 1]
    Figure pat00010

    상기 화학식 1에서,
    상기 R 중 어느 하나 이상은 하기 구조식 1로 표시되는 보론네이트기가 결합되고,
    상기 보론네이트기가 결합되지 않은 어느 상기 R 중 어느 하나 이상은 형광염료가 결합되며,
    상기 n은 1 내지 2000이다.
    [구조식 1]
    Figure pat00011
  2. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산은 도파민이 접합된 히알루론산인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 형광염료는 인도시아닌 그린(Indocyanine green), 시아닌5 카복실산(Cyanine5 carboxylic acid), 시아닌7 카복실산(Cyanine7 carboxylic acid), IR780, IR820 및 IR1061로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 근적외선 영역의 빛을 조사하여 광열 치료, 광역학 치료 또는 광열 및 광역학 병용 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 나노입자를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 나노입자를 포함하는 항암 광치료용 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 나노입자를 포함하는 혈관신생억제용 조성물.
  8. (a) 보론네이트기 및 형광염료를 말토덱스트린(maltodextrin)의 하이드록실(hydroxyl) 그룹에 접합시켜 하기 화학식 1로 표시되는 고분자를 제조하는 단계; 및
    (b) 히알루론산 용액에 상기 (a)단계에서 제조된 고분자를 분산시켜 반응시킨 후 히알루론산으로 코팅된 나노입자를 수득하는 단계;
    를 포함하는 나노입자의 제조방법
    [화학식 1]
    Figure pat00012

    상기 화학식 1에서,
    상기 R 중 어느 하나 이상은 하기 구조식 1로 표시되는 보론네이트기가 결합되고,
    상기 보론네이트가 결합되지 않은 어느 상기 R 중 어느 하나 이상은 형광염료가 결합되며,
    상기 n은 1 내지 2000이다.
    [구조식 1]
    Figure pat00013
  9. 제8항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 히알루론산을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC) 및 하이드록시벤조트리아졸(hydroxybenzotriazole, HOBt)이 포함된 물에 용해시킨 후, 도파민을 첨가하여 반응시켜 도파민이 접합된 히알루론산을 제조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 형광염료는 인도시아닌 그린(Indocyanine green), 시아닌5 카복실산(Cyanine5 carboxylic acid), 시아닌7 카복실산(Cyanine7 carboxylic acid), IR780, IR820 및 IR1061로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101963327B1 (ko) * 2017-10-17 2019-03-28 전북대학교산학협력단 보로네이트가 결합된 고분자 및 그 용도
KR102032277B1 (ko) * 2018-04-09 2019-10-16 서강대학교산학협력단 화학 및 광열 치료를 위한 금 나노 점 함유 중공 실리카 나노입자 및 그 제조 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101963327B1 (ko) * 2017-10-17 2019-03-28 전북대학교산학협력단 보로네이트가 결합된 고분자 및 그 용도
KR102032277B1 (ko) * 2018-04-09 2019-10-16 서강대학교산학협력단 화학 및 광열 치료를 위한 금 나노 점 함유 중공 실리카 나노입자 및 그 제조 방법

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Noh et al., ACS Applied Materials & Interfaces, 10(47), 40424-40433, 2018
P. Liu et al., Journal of Materials Chemistry B, 7(44), 6924-6933, 2019
W. Yang et al., Biomaterials, 154, 48-59, 2018
고창곤, 근 적외선 광증감 말토덱스트린을 이용한 이중 영상 및 광온열 항암 치료, 전북대학교 학위논문(2019.2.26.) 1부.* *
박경은 등, Carbohydrate Polymers, 157(2017), pp.476-483(2016.10.08.) 1부.* *
이정욱 등, Carbohydrate Polymers, 164(2017), pp.309-316(2017.02.04.) 1부.* *

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