KR20220073659A

KR20220073659A - 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20220073659A
Application number: KR1020210160888A
Authority: KR
Inventors: 조유숙; 심현재; 표민주
Original assignee: 재단법인 아산사회복지재단; 울산대학교 산학협력단
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2021-11-22
Publication date: 2022-06-03

Abstract

본 발명은 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 유효성분으로 포함하는 폐 또는 기도 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것으로서, 프로그래뉼린 (Progranulin, PGRN) 및 이의 활성 단편이 폐 및 기도의 염증 및 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하여 완성된 것이다. 구체적으로, 본 발명자들은 폐 섬유화 동물모델에 프로그래뉼린 및 이의 활성 단편 (PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 및 PGRN-CDE)을 주입한 결과 폐 및 기관지 조직 내 염증세포의 침윤이 감소하고, 섬유아세포의 증식 및 콜라겐 생성이 감소할 뿐만 아니라 염증에 의한 조직 손상이 개선되는 것을 확인하였다. 또한, 폐상피세포주 및 폐섬유아세포에서 염증 반응을 유도한 후 프로그래뉼린 및 이의 활성 단편을 처리한 결과 섬유화 마커인 피브로넥틴, p-NFκB, COL1A1, 및 F-액틴 등의 수준 및 활성이 감소하는 것을 확인하였다. 상기 결과들은 프로그래뉼린 단백질 및 이의 활성 단편들이 폐 및 기도의 염증 및 섬유화를 개선하는 효과가 있음을 보여주는 바, 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 및 이의 활성 단편은 폐 및 기도 섬유화로 인한 다양한 질환의 치료 수단으로 활용될 것으로 기대된다.

Description

프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 {Pharmaceutical compositions for preventing or treating fibrotic diseases comprising progranulin or active fragments thereof as an active ingredient}

본 발명은 프로그래뉼린 (Progranulin, PGRN) 단백질 및 이의 단편의 섬유화 질환의 예방 또는 치료 용도 등에 관한 것이다.

섬유화증 (섬유증, fibrosis)이란 기관 또는 조직 내에 섬유질 결합조직이 과도하게 형성되는 현상으로, 정상조직이 파괴되고 섬유성 결합조직으로 대체되면서 조직의 구조 및 기능이 손상되는 것을 특징으로 한다. 섬유화증은 지속적인 감염, 자가면역 반응, 상처, 화학물질에 대한 노출 등으로 인해 일어날 수 있으며, 섬유화 과정이 초기에 통제되지 않을 경우 병리적 현상으로 이어지게 된다.

섬유화로 인한 호흡기의 만성 질환에는 대표적으로 폐 섬유화증 (pulmonary fibrosis) 및 기도 섬유화증 (기관지 섬유화증, airway fibrosis) 등이 있다. 폐 섬유화증은 여러 섬유화 질환의 가장 기본형 (prototype)이 되는 질환으로, 폐 조직 내 섬유질 결합조직의 과다누적으로 인해 폐가 단단해지면서 확장 및 이완이 둔해지고 호흡곤란이 초래되는 질환이다. 현재로서는 폐 섬유화증의 진행을 역전 또는 정지시킬 수 있는 치료방법은 없는 실정이다. 주요 치료 수단으로 스테로이드 등의 면역억제제가 주로 사용되고 있으나, 면역억제제는 환자의 전반적인 면역 기능을 저하시키므로 기타 질병에 취약해지는 부작용의 문제가 있다. 최근에는 이를 개선하기 위한 약물 성분으로 피르페니돈 (Pirfenidone) 등이 사용되고 있으나, 이는 폐 섬유화로 인한 폐기능 저하를 지연시키는 것에 불과하며 근본적인 질병 치료는 불가능하다. 따라서, 폐의 섬유화를 근본적으로 개선 및 치료할 수 있는 치료제의 개발이 필요하다.

최근에는 기도 섬유화증 또한 임상적으로 관심이 대상이 되고 있는데, 만성 기관지 염증성 질환인 천식 (asthma)에서 특히 기도 섬유화로 질병의 진행 및 예후를 악화시키는 원인이 되고 있다. 천식은 기관지에 염증이 발생하고 기관지 수축이 발생하여 호흡곤란이나 기침 등의 증상이 반복적, 발작적으로 나타나는 질환으로, 아직까지는 명확한 치료 방법이 없다. 특히 중증 천식을 앓는 환자 중 일부는 기도의 섬유화로 인한 비가역적 기도 폐쇄가 진행되는 것으로 알려져 있다. 이러한 환자군의 핵심적인 병리 조직 소견은 기관지 및/또는 소기관지의 섬유화이며, 기관지의 염증을 조절하는 것만으로는 섬유화가 개선되지 않는다. 실제로, 최근 중증 천식의 T2 염증을 타겟으로 개발된 새로운 생물학적 제제들은 스테로이드 저항성 염증에는 좋은 치료 효과를 보이고 있으나, 기도 섬유화로 진행된 비가역적 기도폐쇄에 대해서는 치료 효과가 불명확하다. 따라서 기관지 섬유화를 근본적으로 개선하여 천식의 치료 효과까지 기대할 수 있는 치료제의 발굴이 시급한 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-1957632호

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 프로그래뉼린 (Progranulin, PGRN) 및 이의 활성 단편이 조직의 염증 및 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하여 완성된 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 유효성분으로 포함하는 폐 또는 기도 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 포함하는 폐 또는 기도 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 폐 또는 기도 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 키트를 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 유효성분으로 포함하는 폐 또는 기도 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 포함하는 폐 또는 기도 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 활성 단편은 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:

(a) 프로그래뉼린 단백질의 C 그래뉼린 도메인;

(b) 프로그래뉼린 단백질의 FBAC 그래뉼린 도메인;

(c) 프로그래뉼린 단백질의 BACD 그래뉼린 도메인; 및

(d) 프로그래뉼린 단백질의 CDE 그래뉼린 도메인.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편은 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 폐 또는 기관지 조직의 섬유화 또는 염증을 억제할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 폐 또는 기도 섬유화 질환은 폐 섬유화증, 특발성폐섬유화증, 특발성간질성폐렴, 만성폐쇄성폐질환, 천식, 기도 섬유화증, 만성기관지염, 급성기관지염, 세기관지염, 만성폐쇄성기도질환, 및 폐쇄성세기관지염으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 만족할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:

(i) 염증세포의 조직 침윤을 억제함;

(ii) 조직 내 콜라겐 수준을 감소시킴; 및

(iii) 조직 내 하이드록시프롤린 수준을 감소시킴.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 피브로넥틴, 인산화된 NFκB, COL1A1, 및 F-액틴로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 수준 또는 활성을 억제할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 피브로넥틴, NFκB, COL1A1, 및 F-액틴로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 가진 환자의 치료를 위한 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 재조합 바이러스성 벡터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 폐 또는 기도 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편; 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및/또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 폐 또는 기도 섬유화 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편; 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및/또는 상기 벡터를 포함하는 세포의 폐 또는 기도 섬유화 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 폐 또는 기도 섬유화 질환의 치료용 약제를 제조하기 위한 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편; 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및/또는 상기 벡터를 포함하는 세포의 용도를 제공한다.

도 1a는 전장 인간 프로그래뉼린을 호중구 엘라스테이스 (NE)로 절단하여 생성된 절편을 SDS-PAGE로 분리한 후 CBB-R250으로 염색한 결과를 나타낸다. 각 라인은 NE에 의해 시간경과에 따라 절단된 프로그래뉼린을 나타내며 3시간 digestion 조건에서 생성된 프로그래뉼린 절편에 대해 N-말단 서열 분석을 수행하였다.
도 1b는 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편들의 발현벡터를 제조하기 위한 PGRN, PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 및 PGRN-CDE의 유전자 배열을 나타낸 개열지도이다.
도 1c는 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편을 과발현하는 발현벡터로 형질전환된 세포의 배양액으로부터 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편을 수득하여 친화성 크로마토그래피법으로 정제한 결과를 나타낸다.
도 2a는 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편 (PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 및 PGRN-CDE)의 섬유화 및 염증 억제 효과를 확인하기 위한 4주 동안의 블레오마이신 (BLM)-유도 폐 섬유화 마우스 모델의 제작 과정을 나타낸다 (동물모델 I).
도 2b는 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편 (PGRN-FBAC)의 섬유화 및 염증 억제 효과를 확인하기 위한 4주 동안의 블레오마이신-유도 폐 섬유화 마우스 모델의 제작 과정을 나타낸다 (동물모델 II).
도 2c는 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편 (PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 및 PGRN-CDE)의 섬유화 및 염증 억제 효과를 확인하기 위한 2주 동안의 블레오마이신-유도 폐 섬유화 마우스 모델의 제작 과정을 나타낸다 (동물모델 III).
도 3a는 폐 섬유화 마우스 모델 (동물모델 I)에서 프로그래뉼린 단백질 (FL) 및 이의 단편 (FBAC, BACD, CDE) 주입에 따른 기관지폐포세척액 내 염증세포 수 감소 효과를 나타낸다.
도 3b는 폐 섬유화 마우스 모델 (동물모델 II)에서 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편 (FBAC) 주입에 따른 기관지폐포세척액 내 염증세포 수 감소 효과를 나타낸다.
도 3c는 폐 섬유화 마우스 모델 (동물모델 III)에서 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편 (FBAC, BACD, CDE) 주입에 따른 기관지폐포세척액 내 염증세포 수 감소 효과를 나타낸다 (PFD: 피르페니돈을 주입한 마우스).
도 4a는 폐 섬유화 마우스 모델 (동물모델 I)의 폐 조직에 H&E 염색을 수행하여 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편 (FBAC, BACD, CDE)에 의한 염증세포의 폐 침윤 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸다 (100 배율).
도 4b는 폐 섬유화 마우스 모델 (동물모델 II)의 폐 조직에 H&E 염색을 수행하여 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편 (FBAC)에 의한 염증세포의 폐 침윤 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸다 (위, 12.5 배율; 아래, 100 배율).
도 4c는 폐 섬유화 마우스 모델 (동물모델 III)의 폐 조직에 H&E 염색을 수행하여 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편 (FBAC, BACD, CDE)에 의한 염증세포의 폐 침윤 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸다 (12.5 배율; PFD, 피르페니돈을 주입한 마우스).
도 4d는 폐 섬유화 마우스 모델 (동물모델 III)의 폐 조직의 손상 정도를 측정하여 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편의 조직 손상 개선 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5a는 폐 섬유화 마우스 모델 (동물모델 I)의 폐 조직에 M.T. 염색을 수행하여 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편 (FBAC, BACD, CDE)의 폐 섬유화 치료 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5b는 폐 섬유화 마우스 모델 (동물모델 II)의 폐 조직에 M.T. 염색을 수행하여 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편 (FBAC)의 폐 섬유화 치료 효과를 확인한 결과를 나타낸다 (위, 12.5 배율; 아래, 100 배율).
도 5c는 폐 섬유화 마우스 모델 (동물모델 III)의 폐 조직에 M.T. 염색을 수행하여 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편 (FBAC, BACD, CDE)의 폐 섬유화 치료 효과를 확인한 결과를 나타낸다 (12.5 배율; PFD, 피르페니돈을 주입한 마우스).
도 6은 폐 섬유화 마우스 모델 (동물모델 II)의 폐 조직 내 하이드록시프롤린 (Hyp) 수준을 측정하여 프로그래뉼린 및 이의 단편 (FBAC)의 폐 섬유화 치료 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 2주 동안의 블레오마이신-유도 폐 섬유화 마우스 모델 (동물모델 III)에서 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편 (PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 또는 PGRN-CDE)에 의한 체중변화를 나타낸 그래프이다.
도 8a는 A549 세포주에서 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편 (PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 및 PGRN-CDE)에 의한 섬유화 관련 마커 및 신호전달분자의 변화를 확인하기 위한 실험 과정을 나타낸다.
도 8b는 A549 세포주에 블레오마이신; 및 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편을 처리한 후 섬유화 마커인 피브로넥틴 (FN) 및 인산화된 NFκB (p-NFκB)의 수준을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 9a는 MRC-5 세포주를 이용한 3차원 배양 조건에서 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편 (PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 및 PGRN-CDE)에 의한 섬유화 마커의 변화를 확인하기 위한 실험 과정을 나타낸다.
도 9b는 MRC-5 세포주를 이용한 3차원 배양 조건에서 TFGβ1 (TGF); 및 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편을 처리한 후 섬유화 마커인 COL1A1의 수준을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 9c는 MRC-5 세포주를 이용한 3차원 배양 조건에서 TFGβ1 (TGF); 및 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편을 처리한 후 COL1A1의 분비 정도를 ELISA로 측정한 결과를 나타낸다.
도 9d는 MRC-5 세포주를 이용한 3차원 배양 조건에서 TFGβ1 (TGF); 및 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편을 처리한 후 섬유화 마커인 F-액틴의 수준을 면역형광염색법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 프로그래뉼린 단백질의 C 그래뉼린 도메인을 코딩하는 핵산 서열의 일예를 나타낸다.
도 11은 프로그래뉼린 단백질의 FBAC 그래뉼린 도메인을 코딩하는 핵산 서열의 일 예를 나타낸다.
도 12는 프로그래뉼린 단백질의 BACD 그래뉼린 도메인을 코딩하는 핵산 서열의 일 예를 나타낸다.
도 13은 프로그래뉼린 단백질의 CDE 그래뉼린 도메인을 코딩하는 핵산 서열의 일 예를 나타낸다.
도 14는 프로그래뉼린 전장 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 일 예를 나타낸다.

본 발명은 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 유효성분으로 포함하는 폐 또는 기도 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것으로서, 프로그래뉼린 (Progranulin, PGRN) 및 이의 활성 단편이 폐 및 기도의 염증 및 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하여 완성된 것이다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 전장 (full length) 프로그래뉼린 단백질을 발현하는 발현벡터를 제작하였으며, 이로부터 생성된 프로그래뉼린 단백질을 기반으로 세 가지 단편을 (PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 및 PGRN-CDE) 동정하고, 각각의 발현벡터를 제작하였다 (실시예 1).

본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편들의 폐 및 기도 섬유화 억제 효과를 검증하기 위해, 블레오마이신으로 폐 섬유화를 유도하면서 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편을 주입한 세 가지의 폐 섬유화 마우스 모델 (동물모델 I, II, 및 III)을 제작하였다 (실시예 2).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 실시예 2에서 제작한 동물모델로부터 기관지폐포세척액을 확보하여 염증세포의 수를 측정한 결과, 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편이 주입된 마우스는 대조군에 비해 염증세포 수가 유의하게 감소한 것을 확인하였다 (실시예 3).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 실시예 2에서 제작한 동물모델로부터 폐 조직을 확보하여 H&E 염색법을 수행한 결과, 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편이 주입된 마우스는 염증세포의 조직 내 침윤이 감소한 것을 확인하였다 (실시예 4).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 실시예 2에서 제작한 동물모델로부터 폐 조직을 확보하여 M.T. 염색법을 수행한 결과, 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편이 주입된 마우스는 섬유아세포 등의 증식이 감소하고 콜라겐 수준이 감소하였으며, 조직 손상이 개선된 것을 확인하였다 (실시예 5).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 실시예 2에서 제작한 동물모델로부터 폐 조직을 확보하여 콜라겐의 주요 성분인 하이드록시프롤린 수준을 측정한 결과, 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편이 주입된 마우스는 대조군에 비해 하이드록시프롤린 수준이 유의하게 감소한 것을 확인하였다 (실시예 6).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 실시예 2에서 제작한 동물모델의 시간에 따른 체중 변화를 확인한 결과, 폐 섬유화로 인한 마우스의 체중 감소가 PGRN-BACD 단편 주입에 의해 회복된 것을 확인하였다 (실시예 7).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 폐상피세포주에 블레오마이신과 함께 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편을 처리한 결과, 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편이 처리된 세포는 대조군에 비해 섬유화 마커인 피브로넥틴 수준이 감소하고, 섬유화 매개인자인 NFκB의 인산화가 감소한 것을 확인하였다 (실시예 8).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 폐섬유아세포주에 TGFβ1과 함께 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편을 처리한 결과, 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편이 처리된 세포는 대조군에 비해 섬유화 마커인 COL1A1 및 F-액틴의 수준 및 활성이 감소하는 것을 확인하였다 (실시예 9).

상기 실시예들은 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 및 이의 활성 단편들의 폐/기도에서의 뛰어난 염증 및 섬유화 억제 효과를 가진다는 것을 뒷받침하는 바, 따라서, 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편은 폐 및 기도 섬유화와 관련된 각종 질환의 예방 또는 치료를 위한 제제로 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

이하, 본 발명에 대해 구체적으로 설명한다.

본 발명은 프로그래뉼린 (progranulin) 단백질 또는 이의 활성 단편을 유효성분으로 포함하는 폐 또는 기도 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, “프로그래뉼린 (progranulin)”은 인간에서 GRN 유전자에 의해 코딩되는 분비 단백질로, CNS 및 다양한 유형의 조직에서 발현되며, 고도로 보존되어 있다 (conserved). 프로그래뉼린 단백질 또는 이로부터 생성된 그래뉼린 (granulin) 단백질은 세포의 성장, 생존, 복구 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. 프로그래뉼린 단백질에 대한 구체적인 정보는 단백질 데이터베이스 Uniprot (https://www.uniprot.org)에서 확인할 수 있다 (등록번호: P28799). 그래뉼린 단백질은 프로그래뉼린 단백질이 분해되어 생성된다. 전장 프로그래뉼린 단백질은 7개의 전장 그래뉼린 도메인 (즉, 그래뉼린 단백질) 및 1개의 절반 길이의 그래뉼린 도메인을 포함한다. 그래뉼린 도메인은 프로그래뉼린의 N 말단에서 C 말단까지의 순서로 p, G, F, B, A, C, D, 및 E로 명명된다 (“p”는 절반 길이의 파라그래뉼린 (paragranulin) 도메인을 나타낸다). 각 그래뉼린 도메인의 분자 구조는 공지되어 있다.

본 발명에 있어서, “프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편”은 천현형 또는 재조합 전장 프로그래뉼린 단백질 또는 이와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질을 말한다. 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질에는 천연형 또는 재조합 프로그래뉼린 단백질은 물론, 이의 단편과 그 기능적 동등물 (functional equivalent) 및 기능적 유도체 (functional derivatives)가 포함된다. 프로그래뉼린 단백질의 “활성 단편”은 바람직하게는 프로그래뉼린 단백질의 그래뉼린 도메인을 의미한다. 즉, 본 발명에 있어서 프로그래뉼린 단백질의 활성 단편이란 p, G, F, B, A, C, D, E 그래뉼린 도메인, 또는 이들의 조합일 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 있어서 프로그래뉼린 단백질의 활성 단편이란 C 그래뉼린 도메인; FBAC 그래뉼린 도메인 (PGRN-FBAC); BACD 그래뉼린 도메인 (PGRN-BACD); 및 CDE 그래뉼린 도메인 (PGRN-CDE)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 본 명세서 전반에 있어서, “프로그래뉼린 단백질”은 달리 명시하지 않는 한 전장 (full length) 프로그래뉼린 단백질을 의미하며, PGRN, hPGRN (human PGRN), 또는 full length (FN) PGRN 등으로 표기될 수 있다. 또한, 본 명세서 전반에 있어서 “단편”은 “활성 단편”을 포함한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편은 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 상기 아미노산 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 즉, 본 발명의 서열번호 1 내지 5로 표시되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 (polypeptide)는 이를 구성하는 폴리펩티드의 작용성 등가물, 예를 들어, 폴리펩티드의 일부 아미노산 서열이 결실 (deletion), 치환 (substitution) 또는 삽입 (insertion)에 의해 변형되었지만, 상기 폴리펩티드와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체 (variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 코딩하는 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 5로 표시되는 어느 하나의 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리펩티드의 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질의 활성 단편, C 그래뉼린 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 상기 C 그래뉼린 도메인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 구체적인 예로, 상기 C 그레뉼린 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 전장 프로그래뉼린 단백질의 364번 내지 417번 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질의 활성 단편, FBAC 그래뉼린 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 상기 FBAC 그래뉼린 도메인은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 구체적인 예로, 상기 FBAC 그레뉼린 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 전장 프로그래뉼린 단백질의 95번 내지 427번 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질의 활성 단편, BACD 그래뉼린 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 상기 BACD 그래뉼린 도메인은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 구체적인 예로, 상기 BACD 그레뉼린 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 전장 프로그래뉼린 단백질의 201번 내지 505번 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질의 활성 단편, CDE 그래뉼린 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 상기 BACD 그래뉼린 도메인은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 구체적인 예로, 상기 CDE 그레뉼린 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 전장 프로그래뉼린 단백질의 352번 내지 593번 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 다른 전장 프로그래뉼린 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 상기 전장 프로그래뉼린 단백질은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, “폐 또는 기도 섬유화 질환”은 폐 및/또는 기도 (즉, 기관지)의 섬유화로 인해 유도될 수 있는 모든 질환을 포함한다. 본 명세서 전반에 있어서, “섬유화 질환 (fibrotic diseases)”은 간략히 “섬유화증” 또는 “섬유증”으로 표기될 수 있다. 아울러, 본 발명에 있어서 “폐” 또는 “폐 조직”은 달리 명시하지 않는 한 기관지 또는 기관지 조직을 포함하는 의미이다. 본 발명에 있어서 “섬유화 (fibrosis)”란 섬유질의 결합조직이 과도하게 형성되어 실질조직을 대체하면서 장기의 일부 또는 전부가 굳는 현상을 의미한다. 이는 상처를 회복하는 과정에서 나타나는 흉터조직의 형성과는 구별되는 것으로, 조직이 굳으면서 조직 및 해당 장기의 기능 및 구조 이상을 초래하며, 각종 질환을 유발할 수 있다. 본 발명에 있어서, “폐 또는 기도 섬유화 질환”은 폐 섬유화증, 특발성폐섬유화증, 특발성간질성폐렴, 만성폐쇄성폐질환, 천식, 기도 섬유화증, 만성기관지염, 급성기관지염, 세기관지염, 만성폐쇄성기도질환, 및/또는 폐쇄성세기관지염 등일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 조성물은 폐 또는 기관지 조직의 섬유화 및/또는 염증을 억제, 개선, 또는 치료하는 것을 특징으로 한다. 특히, 본 발명에 따른 조성물은 중증 천식에 동반된 비가역적 기도폐쇄를 억제, 개선, 또는 치료할 수 있다. 본 발명에 있어서 “중증 천식”은 임상적으로 폐기능 검사에서 FEV1/FVC 비율이 0.7 이하이며, FEV1이 지속적으로 감소하는 경우를 의미할 수 있고; 또는 2020년 GINA 지침에 따라 4단계 또는 5단계 치료를 해도 증상 조절이 되지 않는 천식을 의미할 수 있다. 이와 같은 중증 천식의 핵심 병리조직 소견은 기관지 및/또는 소기관지의 섬유화이다. 기관지의 섬유화는 염증 조절만으로는 개선되지 않을 수 있다. 본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편이 폐/기관지의 섬유화를 억제하는 것을 확인한 바, 이는 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편이 중증 천식의 기관지 섬유화를 개선하여 비가역적 기도폐쇄를 치료할 수 있음을 보여주는 것이다.

본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 폐 섬유화 동물 모델에 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편을 처리하였을 때 염증세포의 침윤이 감소하고 각종 섬유화 및 염증 인자들의 수준/활성이 감소하는 것을 확인하였다 (실시예 3 내지 9 참조). 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 만족할 수 있다: (i) 염증세포의 조직 침윤을 억제함; (ii) 조직 내 콜라겐 수준을 감소시킴; 및 (iii) 조직 내 하이드록시프롤린 수준을 감소시킴.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 피브로넥틴 (fibronectin), 인산화된 NFκB (phosphorylated NFκB, p-NFκB), COL1A1, 및 F-액틴 (F-actin)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 수준 또는 활성을 억제할 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 폐세포 또는 섬유아세포의 피브로넥틴, 인산화된 NFκB, COL1A1, 및 F-액틴로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 수준 또는 활성을 억제할 수 있다. 인산화된 NFκB의 수준을 억제한다는 것은 NFκB의 인산화를 억제한다는 것을 포함한다. 상기 단백질들은 모두 섬유화 또는 염증의 주요 마커이자 매개인자로, 이들의 수준/활성 증가는 염증 및 섬유화 증가와 양의 상관관계가 있다.

따라서, 본 발명에 따른 조성물은 피브로넥틴, NFκB, COL1A1, 및 F-액틴로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 가진 환자의 치료에 특히 효과적일 수 있다. 상기 돌연변이는 상기 염증 및 섬유화 마커들의 과활성 및/또는 과발현을 포함한다.

또한, 본 발명은 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 포함하는 폐 또는 기도 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 즉, 본 발명은 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “폴리뉴클레오티드”는 디옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA)을 포함한, 일반적으로 인산이에스테르 결합에 의해 서로 결합된 2 이상의 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 올리고머 또는 폴리머를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들면 뉴클레오티드 유사체, 또는 인산이에스테르 결합 이외의 “골격” 결합, 예를 들면 인산삼에스테르 결합, 포스포르아미데이트 결합, 포스포로티오에이트 결합, 티오에스테르 결합 또는 펩타이드 결합 (펩타이드 핵산)을 포함하는 DNA 및 RNA 유도체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)뿐만 아니라 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체들을 포함한다.

본 발명에 있어서, “재조합 벡터 (recombinant vector)”란 벡터 내에 삽입된 이종의 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 지칭하는 것으로, 바람직하게는 목적 단백질 (본 발명에서는, 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편들)을 발현할 수 있도록 제조된 벡터를 의미한다. 상기 “벡터”는 시험관 내, 생체 왜 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말하며, 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위 (replicon)일 수 있으며, “복제 단위”란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 말한다.

본 발명에 따른 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 재조합 바이러스성 벡터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 벡터는, 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등과 같은 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드, λgt4λB, λ-Charon, 및 M13 등과 같은 파지 또는 SV40 등과 같은 바이러스를 조작하여 제작될 수 있다. 본 발명의 경우 구체적인 실시예에서 pPM-C-His 벡터를 사용하였다.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터 (promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 폴리히스티딘 태그 (최소 5개 이상의 히스티딘 잔기로 구성된 아미노산 모티프), 신호 펩타이드 (signal peptide) 유전자, 소포체 잔류 신호 펩타이드 (endoplasmic reticulum retention signal peptide), 클로닝 사이트 (cloning site) 등을 추가로 포함할 수 있으며, 태그용 유전자, 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터에서 상기 각 유전자들의 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "작동적으로 연결된 (operatively linked)"은 프로모터 서열과 같은 뉴클레오티드 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

상기 재조합 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵세포를 숙주로 하는 경우, 벡터가 진핵세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

상기 태그용 유전자로는, 대표적으로 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, His 태그 (폴리히스티딘 태그), Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그, Xpress 태그 등이 포함될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 벡터는 FLAG 태그 또는 6X His 태그를 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 FLAG 태그는 서열번호 12의 염기서열로, 상기 6X His 태그는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 “신호 펩타이드 (signal peptide)”는 단백질의 N-말단에 위치하는 신호 펩타이드로서, 새롭게 합성된 단백질이 소포체 (endoplasmic reticulum, ER) 내부로 들어가도록 유도하는 역할을 한다. 본 발명에 따른 신호 펩타이드는 당업자에게 알려진 신호 펩타이드라면 그 종류 및 아미노산 서열이 제한되지 않으나, 바람직하게는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 벡터는 제한효소 부위를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제한효소 부위는 구체적인 종류로 제한되지 않으나, 예를 들면 HindIII, XhoI, SmaI, 및 HhaI 등이 있다.

본 발명에 따른 벡터는 신호 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; FLAG 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 6X His 태그가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 할 수 있으나, 상기 순서에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 따른 벡터는 각 유전자 사이에 제한효소 부위를 선택적으로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 포함할 수 있다. 상술한 폴리펩티드와 마찬가지로, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 이의 작용성 등가물을 포함한다. 따라서, 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질의 활성 단편, C 그래뉼린 도메인은 서열번호 6의 염기서열을 포함하거나, 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있고, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질의 활성 단편, FBAC 그래뉼린 도메인은 서열번호 7의 염기서열을 포함하거나, 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있고, 서열번호 7로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질의 활성 단편, BACD 그래뉼린 도메인은 서열번호 8의 염기서열을 포함하거나, 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있고, 서열번호 8로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질의 활성 단편, CDE 그래뉼린 도메인은 서열번호 9의 염기서열을 포함하거나, 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있고, 서열번호 9로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 다른 전장 프로그래뉼린 단백질은 서열번호 10의 염기서열을 포함하거나, 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있고, 서열번호 10으로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 세포라 함은, 상기 벡터에 의해 형질전환된 세포를 의미한다. 본 명세서에 있어서, “형질전환 (transformation)”이란 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭하며, “형질전환체 (transgenic organism)”란 분자유전학적 방법으로 외부의 유전자를 주입하여 제조된 세포 내지 생명체로서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의하여 형질전환된 세포를 의미한다. 상기 형질전환체는 형질전환 (transformation), 형질감염 (transfection), 아그로박테리움 (Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 초음파 처리법 (sonication), 전기충격법 (electroporation) 및 PEG (Polyethylen glycol)-매개 형질전환 방법 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 본 발명의 벡터를 주입할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.

본 발명의 조성물 내의 상기 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편; 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 또는 상기 벡터를 포함하는 세포의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

또한, 본 발명은 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편; 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및/또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 폐 또는 기도 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 키트는 폐 또는 기도 섬유화 질환의 예방 또는 치료를 위한 것이라면 구체적인 형태에 제한이 없으며, 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편의 발현 또는 활성 증가를 위한 성분/기기나, 상기 벡터의 발현 또는 형질전환을 위한 임의의 성분 및 기기를 제한 없이 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편; 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및/또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 포함하는 폐 또는 기도 섬유화 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 포함한다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물을 포함한다.

본 발명의 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편; 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및/또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 성분들을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편; 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및/또는 상기 벡터를 포함하는 세포는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편을 발현하는 발현벡터의 제작

폐 섬유화가 유도된 동물모델에서 프로그래뉼린 (PGRN) 단백질 및 이의 단편의 염증 및 섬유화 억제 효과를 확인하기 위해, 상기 단백질들을 발현할 수 있는 발현벡터를 제작하였다.

먼저 전장 (full length) 인간 PGRN (human PGRN, hPGRN)의 단편을 확보하기 위해, 전장 PGRN을 활성 호중구 엘라스테이스 (Neutrophil elastase, NE; R&D systems)와 혼합하여 절단하였다. 구체적으로, NE 및 카텝신 C (Cathepsin C; R&D systems)를 활성화 버퍼 (50mM MES pH5.5, 50mM NaCl)에서 혼합한 후 37℃에서 3시간 동안 반응시켜 호중구 엘라스테이스를 활성화시켰다. 이어서 전장 hPGRN (R&D systems) 및 활성화된 NE를 절단 (digestion) 버퍼 (50mM Tris-HCl pH7.4, 1M NaCl, 0.05% Brij-35)에서 혼합한 뒤 37℃에서 12시간까지 반응시켜 hPGRN을 절단하였다.

생성된 절편은 SDS-PAGE 전기영동 및 CBB-R250 염색법으로 관찰하였다 (도 1a). SDS-PAGE 상의 절편을 PVDF 멤브레인 (Pore size: 0.2 ㎛)로 트렌스퍼 (transfer)한 후 CBB-R250으로 염색하였고, PGRN 절편을 잘라내어 Tufts University의 Core Facility의 N-말단 시퀀싱 (Edman분석법) 분석을 통해 NE에 의해 잘리는 PGRN의 절단부위를 예측하였다. 예측을 기반으로, NE에 의해 생성될 수 있는 PGRN 절편을 예상하였고, 결과적으로 총 3 종류의 단편 (PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 및 PGRN-CDE)을 확인하였다.

이어서, 전장 PGRN 및 상기 세 가지 단편을 포유류 세포에서 발현시킬 수 있는 발현벡터를 제작하였다 (도 1b). 구체적으로, pPM-C-his 벡터 (서열번호 11)(ABM)에 인간 PGRN 유전자의 전장 서열을 삽입하였으며, Insertion mutagenesis 방법을 이용하여 PGRN의 상류 (upstream)에 신호 펩티드 서열 (signal peptide sequence), Flag-tag, 및 Hind III 제한 효소 서열을 순서대로 삽입하였으며, PGRN 서열의 하류 (downstream)에 XhoI 제한 효소 서열 및 6X his tag 서열을 순서대로 삽입하여 전장 PGRN 발현벡터 (“pPM-flag-hPGRN full length-his 발현벡터”) 를 제조하였다.

전장 PGRN 발현벡터를 기반으로 PGRN-FBAC, PGRN-BACD 및 PGRN-CDE 서열의 프라이머를 제작하여 각 단편을 PCR로 증폭시킨 후, HindIII (NEB) 와 XhoI (NEB)로 절단하였다. pPM-flag-hPGRN full length-his 발현벡터도 HindIII 및 XhoI으로 절단하였으며, 상기 절단된 PCR 산물 및 절단된 벡터를 T4 DNA 라이게이스 (T4 DNA ligase; Invitrogen)를 이용하여 접합시켰다. 접합된 플라스미드는 XL2-BLUE에 형질전환시켜 단일 콜로니를 획득하였으며, LB (Amp) 배지에서 37℃의 온도로 18시간 배양한 후, DNA 추출 키트 (Promega)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 증식된 균주로부터 플라스미드를 추출하였다. 이어서 Lipofectamine 3000 reagent (ThermoFisher Scientific)를 사용하여 각각의 발현벡터를 HEK293 세포주에 형질전환 하였으며, 2일 후부터 네오마이신 (Neomycin)을 처리하여 안정적인 세포주 (stable cell line)를 선별하였다.

전장 PGRN 또는 이의 단편을 각각 과발현하는 세포주를 혈청 결핍 배지에서 4일간 배양하여 수득한 배양액을 Amicon tube로 농축하고, Flag-tag을 이용한 친화성 크로마토그래피법으로 정제하였다 (도 1c). 우선 농축된 배양액을 Anti-flag M2 affinity gel (Sigma-Aldrich)이 채워진 poly-prep mini column에 5회 흘려주고, TBS (50mM Tris-HCl (pH7.4), 150 mM NaCl) buffer를 흘려주어 젤 (gel)에 비특이적 결합을 하는 단백질을 제거하였다. 이후 젤에 특이적으로 결합한 단백질은 Flag 펩티드 (Sigma-Aldrich)로 추출하였다. 추출된 단백질 분획을 세포 및 마우스에 처리하기 위해 PBS로 24시간동안 투석한 후, BCA 방법으로 단백질을 정량하여 이후의 실험에 사용하였다.

실시예 2. 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편의 섬유화 억제 효능을 검증하기 위한 마우스 모델의 제작

전장 PGRN 및 이의 3가지 단편의 섬유화 억제 효과를 확인하기 위한 마우스 모델을 제작하였다 (동물모델 I). 특히, PGRN-FBAC의 경우 효과를 더욱 검증하기 위해 추가 마우스 모델을 제작하여 실험을 진행하였으며 (동물모델 II), 4주 모델이 아닌 2주 모델에서도 전장 PGRN 및 이의 단편의 섬유화 억제 효과를 검증하고자 추가 마우스 모델을 제작하였다 (동물모델 III).

동물모델의 폐 섬유화는 블레오마이신 (Bleomycin)을 이용하여 유도하였다. 구체적으로, 동물모델 I의 경우 7 내지 10주령 C57BL/6 마우스에 카테터를 이용하여 블레오마이신을 기도 내로 주입한 후 4주 동안 관찰하였다. 4주 동안 주마다 2회씩, 총 8회에 걸쳐 PGRN, PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 또는 PGRN-CDE 단편을 비강 내로 주입하였다 (도 2a). 동물모델 II의 경우, 마찬가지로 7 내지 10주령 C57BL/6 마우스에 카테터를 이용하여 블레오마이신을 기도 내로 주입한 후 4주 동안 관찰하였다. 3주 및 4주째에 주마다 2회씩, 총 4회에 걸쳐 PGRN 또는 PGRN-FBAC 단편을 비강 내로 주입하였다 (도 2b). 동물모델 III의 경우, 마찬가지로 7 내지 10주령 C57BL/6 마우스에 카테터를 이용하여 블레오마이신을 기도 내로 주입한 후 2주 동안 관찰하였다. 2주 동안 주마다 3회씩, 총 6회에 걸쳐 PGRN, PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 또는 PGRN-CDE 단편을 비강 내로 주입하였다. 이와 함께, PGRN 및 이의 단편의 폐 섬유화 억제 효과를 현재 폐섬유증 치료제로 사용중인 약물인 피르페니돈 (Pirfenidone, PFD)과 비교하기 위해 블레오마이신 주입 후 7일째부터 13일째까지 매일 경구투여로 주입하였다 (도 2c). 또한, 블레오마이신 주입 후 14일째까지 마우스의 체중 변화 관찰을 위해 체중을 측정하였다 (도 7).

블레오마이신-유도 폐 섬유화 모델 확립 후 4주째 (28일차) (동물모델 I, II) 또는 2주째 (14일차) (동물모데 III)에 마우스를 복강 마취하고 흉부를 절개한 후 26 게이지 주사기를 이용하여 심장채혈을 하여 안락사와 동시에 혈액 시료를 채취하였다. 또한, 카테터를 기도에 삽입하고, PBS를 1 ml씩 2번에 걸쳐 처리하여 기관지폐포세척액을 확보하였으며 추후 사이토카인 (cytokine) 등의 분석을 위해 -80℃에 보관하였다.

또한 PBS를 이용하여 재관류 (reperfusion)한 후 기관지 조직을 포함한 폐 조직을 확보하였다. 이 중 좌폐는 추후의 조직병리검사를 위해 슬라이드를 제작하였다. 구체적으로, 10 % 포르말린에 하루 동안 고정시킨 후, 61℃의 이하의 온도에서 녹인 파라핀을 이용하여 포매하고, 박절기를 사용해 4 μm의 두께로 박절하여 H&E 염색 또는 M.T 염색을 위한 슬라이드를 제작하였다. 좌폐 외의 나머지 조직은 단백질 및 RNA 추출을 위해 -80℃에 보관하였다.

실시예 3. 염증세포 분석을 통한 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편의 염증 억제 효과 확인

만성폐쇄성폐질환, 천식 등의 폐 섬유화 질환에서는 호중구, 대식세포, 림프구 등의 염증세포들이 폐와 기관지에 침투하여 염증을 유발한다. 따라서, 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편들의 폐 내의 염증세포에 미치는 영향을 관찰하여 이들의 폐 및 기도 섬유화증 치료 효과를 확인하였다. 기관지폐포세척액 (bronchoalveolar lavage fluid, BALF)은 기관지로부터 유래한 세포를 포함하고 있으므로 폐와 기관지 상태에 관한 정확한 정보를 제공한다. 따라서, 실시예 2에서 제작한 블레오마이신-유도 폐 섬유화 모델 (동물모델 I, II, 및 III) 각각으로부터 기관지폐포세척액을 확보한 후 혈구계산판 (hymocytometer)으로 세척액 내의 염증세포의 총 수를 측정함으로써 폐 및 기도의 염증 정도를 확인하였다.

먼저 동물모델 I의 경우, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 블레오마이신 단독 처리군 (BLM)은 폐 섬유화가 유도됨에 따라 기관지폐포세척액 내 염증세포의 수가 대조군 (CON)에 비해서 현저하게 증가하였다. 그러나, 전장 프로그래뉼린 단백질 (FL)을 투여한 마우스는 염증세포의 수가 유의미하게 감소하였으며, 프로그래뉼린 단백질의 단편 (PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 또는 PGRN-CDE)을 처리한 경우에도 기관지폐포세척액 내의 염증세포 수가 두드러지게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 특히, PGRN-FBAC를 처리한 마우스는 블레오마이신 단독 처리군에 비해 염증세포 수준이 절반 정도로 감소한 것으로 나타났다.

동물모델 II의 결과는 도 3b에 나타냈다. 마찬가지로 대조군에 비해 블레오마이신 단독 처리군에서 기관지폐포세척액 내의 염증세포의 수가 크게 증가하였으나, 전장 프로그래뉼린 단백질을 처리한 경우 염증세포 수가 현저히 감소하였으며, PGRN-FBAC을 처리했을 때에는 염증세포 수준이 더욱 감소한 것으로 나타났다.

동물모델 III 역시, 블레오마이신 처리에 의해 기관지폐포세척액 내 염증세포 수가 증가하였으나, 전장 프로그래뉼린 단백질, PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 또는 PGRN-CDE을 처리한 마우스는 염증세포 수가 감소하였으며, 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편에 의한 염증 억제 효과는 기존의 폐섬유증 치료제인 피르페니돈 (PFD)에 필적하는 것으로 나타났다.

상기 결과들은 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편들이 폐 및 기관지에서 염증세포의 수준을 감소시키는 효과가 있으며, 이를 통해 염증 및 섬유화를 개선할 수 있음을 보여준다.

실시예 4. H&E 염색법을 통한 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편의 염증 및 조직 손상 개선 효과 확인

헤마톡실린 및 에오신 (Hematoxylin and Eosin, H&E) 염색법은 세포의 핵과 세포질을 염색하여 세포의 수와 모양을 관찰할 수 있는 실험 방법이다. 염증이나 섬유화가 일어난 폐는 혈관과 기도 주변에 염증세포들이 대량으로 유입되면서 세포가 밀집되어 있기 때문에, H&E 염색시 혈관 및 기도 주변에서 강한 염색이 나타난다. 따라서, 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편들의 폐 및 기도 섬유화 치료 효과를 확인하기 위해, 폐 섬유화 동물모델 의 폐 조직에 대해 H&E 염색법을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 2에서 제조한 조직 슬라이드를 자일렌 (xylene)에 5분씩 3회, 100% 에탄올에 5분, 50% 에탄올에 5분 담갔다. 자일렌에 의해 투명화된 조직에서 세포의 핵을 염색하기 위해 헤마톡실린으로 1분 40초간 염색하고, 0.3 % HCl/에탄올에 1-2회 담근 후 흐르는 증류수에 세척하였다. 그 후 0.3%　암모니아수에 2-3회 담근 후 흐르는 증류수에 세척하고, 대조염색을 위해 에오신에 10-20초간 담갔다. 염색이 완료된 후 50% 에탄올, 100% 에탄올의 순서로 3회씩 담그고, 자일렌에 3분씩 3회 담근 후, 슬라이드를 건조시켰다. 봉입 (mounting) 용액을 떨어트린 후 커버 슬라이드를 덮어 조직 프레파라트를 완성하였다. 염색된 조직은 광학현미경으로 관찰하였다.

동물모델 I의 경우 (도 4a), 블레오마이신 단독 처리군은 블레오마이신에 의해 폐 조직 내에 섬유화가 일어나면서 혈관 및 기도 주변으로 대량의 염증세포가 침윤하여 대조군에 비해 헤마톡실린 및 에오신이 강하게 염색된 것을 확인할 수 있었다. 반면, 전장 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편 (PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 또는 PGRN-CDE)을 처리한 마우스는 H&E 염색 정도가 상대적으로 감소한 바, 염증세포의 폐 조직으로의 침윤이 감소한 것을 알 수 있었다.

마찬가지로 동물모델 II의 경우 (도 4b), 블레오마이신 단독 처리군은 대조군에 비해 폐 조직의 혈관 및 기도 주변으로 H&E가 강하게 염색되어, 염증세포 침윤이 증가한 것을 확인하였다. 반면 전장 프로그래뉼린 단백질 또는 PGRN-FBAC을 주입한 마우스의 폐 조직은 블레오마이신 단독 처리군에 비해 H&E 염색 정도가 낮아진 바, 염증세포의 침윤이 상대적으로 억제된 것을 확인할 수 있었다.

동물모델 III에서도 (도 4c) 블레오마이신만 처리한 마우스는 대조군에 비해 폐 조직 내의 염증세포 침윤이 증가하였으나, 전장 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편 (PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 또는 PGRN-CDE)을 처리함에 따라 H&E 염색 정도가 상대적으로 감소하였으며, 피르페니돈을 투여한 마우스와 비교하여서도 염색 정도가 더 낮은 것을 확인하였다. 이는 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편들의 폐 염증 억제 효과가 피르페니돈보다 우수하다는 것을 시사한다.

추가로, 동물모델 III의 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편들의 처리 여부에 따른 폐 조직의 손상 정도를 추가로 비교하였다. 폐 조직의 손상 정도는 다음과 같은 기준으로 점수화했다: 1: 정상, 2: 미미한 섬유화, 3: 중간 정도의 섬유화, 4: 조금 심한 정도의 섬유화, 및 5: 매우 심한 정도의 섬유화. 그 결과, 블레오마이신만 처리한 마우스는 대조군에 비해 폐 조직이 크게 손상되었으나, 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편을 주입한 마우스는 폐 조직 손상 정도가 두드러지게 감소한 것을 확인하였다 (도 4d). 특히, 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편에 의한 폐 조직 손상 개선 효과는 피르페니돈에 필적하는 것으로 나타났다.

상기 결과들은 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편들이 폐 조직의 염증세포 침윤을 억제할 뿐만 아니라 조직 손상을 개선할 수 있으며, 따라서 폐 및 기도 섬유화 질환을 치료할 수 있음을 보여준다.

실시예 5. M.T. 염색법을 통한 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편의 섬유화 억제 효과 확인

Masson’s Trichrome (M.T.) 염색법은 섬유성 결합조직의 양을 평가하기 위한 염색법으로, 조직의 섬유화 정도를 확인하는데 활용된다. 구체적으로, M.T. 염색시 세포의 핵은 검정색으로, 근육조직 및 세포질은 붉은색으로 염색되며, 콜라겐 섬유는 청색으로 염색되는데, 섬유화가 많이 일어난 조직일수록 섬유아세포, 근섬유아세포 등의 세포와 함께 콜라겐을 포함한 세포외기질 (extracellular matrix)이 증가하므로 조직이 더욱 강하게 염색된다. 따라서, 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편들의 폐 및 기도 섬유화 치료 효과를 확인하기 위해, 폐 섬유화 동물모델 (동물모델 I, II, 및 III)의 폐 조직에 대해 M.T. 염색법을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 2에서 제조한 조직 슬라이드를 자일렌에 5분씩 2번, 100% 에탄올에 3분씩 2번, 95% 에탄올에 3분 담근 후 증류수로 세척하였다. 이어서 Bouin's Fixative 용액 (Polysciences)으로 15분간 조직을 고정하고 피크린산을 제거하기 위해 흐르는 증류수로 5분간 세척하였다. 세포 핵을 염색하기 위해 Weigert's Iron Hematoxylin 키트 (Polysciences)로 10분간 염색한 후 흐르는 증류수에 5분간 세척하였다. 근육 조직 및 세포질을 염색하기 위해 Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin (Polysciences)으로 5분간 염색 후 증류수에 3회 세척하였다. 마지막으로 콜라겐을 염색하기 위해, 포스포텅스텐산/인몰리브덴산 (Phosphotungstic/Phosphomolybdic acid) (Polysciences)으로 10분간 전처리를 하고, 슬라이드를 건조시켰으며, 아닐린 블루 (Aniline Blue) (Polyscience)로 10분간 염색한 후 증류수에 2회 세척하였다. 염색을 마친 조직은 1% 아세트산에 1분간 담근 후 증류수에 1회 세척하였고, 이어서 95% 에탄올, 100% 에탄올, 및 자일렌의 순서로 1분 30초간 담근 후에 슬라이드를 건조시켰다. 봉입 용액을 떨어트린 후 커버 슬라이드를 덮어 조직 프레파라트를 제작하였다. 염색된 조직은 광학현미경으로 관찰했다.

먼저 동물모델 I의 조직 슬라이드를 관찰한 결과 (도 5a), 블레오마이신을 투여한 마우스는 폐 및 기도 섬유화가 일어나면서 대조군에 비해 폐 조직이 전체적으로 강하게 염색된 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편 (PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 또는 PGRN-CDE)을 처리한 모델은 염색 강도가 감소한 바, 섬유아세포 등의 증식이 감소하고 콜라겐의 생산 및 분비 역시 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이는 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편들이 섬유아세포 및 근섬유아세포의 증식 및 콜라겐 생성을 효과적으로 억제하였음을 보여준다.

동물모델 II (도 5b)에서도, 블레오마이신을 투여 받은 마우스의 폐 조직은 폐 섬유화에 따른 근육 조직 및 섬유질 등이 증가로 인해 높은 강도로 염색되었으나, 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편 (PGRN-FBAC)을 주입한 마우스는 염색 강도가 두드러지게 감소한 바, 폐와 기도의 섬유화가 개선된 것을 확인할 수 있었다.

동물모델 III (도 5c)도 마찬가지로, 블레오마이신을 투여 받은 마우스의 폐 조직은 대조군에 비해 세포 및 섬유질이 매우 강하게 염색되었으나, 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편 (PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 또는 PGRN-CDE)을 투여한 마우스는 피르페니돈을 투여한 것과 유사하거나 더욱 낮은 수준으로 염색 정도가 감소한 것으로 나타났다.

상기 결과들은 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편들이 섬유아세포 및 근섬유아세포 등의 증식을 억제하고 이들에 의한 콜라겐 생성을 저해함으로써 폐와 기도의 섬유화를 효과적으로 개선할 수 있음을 보여준다.

실시예 6. 하이드록시프롤린 측정을 통한 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편의 섬유화 억제 효과 확인

하이드록시프롤린 (Hydroxyproline)은 콜라겐의 주요 구성 성분인 아미노산으로, 콜라겐 생합성 과정 중 프롤린의 번역 후 하이드록시화 (post-translational hydroxylation)에 의해 합성된다. 혈장, 소변, 신체 조직 등의 하이드록시프롤린의 수준은 콜라겐 축적 정도를 반영하므로, 콜라겐 축적에 의한 질환, 특히 섬유화를 확인하는데 활용된다. 따라서, 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편들의 섬유화 치료 효과를 확인하기 위해, 폐 섬유화 동물모델 의 폐 및 기도 조직의 하이드록시프롤린 수준을 측정하였다.

구체적으로, 실시예 2에 따라 폐 섬유화 모델 (동물모델 II)로부터 분리하여 -80℃에 보관한 조직을 조직 분쇄기로 분쇄 (100 mg/ml, dH₂O)한 후, 100 μl의 조직 분쇄액에 100 μl의 HCl (~12N)을 가하여 120℃에서 3시간 동안 가수분해 시켰다. 가수분해된 조직 시료 중 10 μl를 취해 Chloramine T reagent (Biovision)를 처리하여 상온에서 5분간 반응시킨 후, 100 μl의 DMAB (Biovision)를 처리하여 60℃에서 90분간 반응시켰다. 반응이 완성된 시료는 마이크로플레이트 리더기로 560nm에서 흡광도를 측정하여 시료 내 하이드록시프롤린의 양을 측정했다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 블레오마이신을 투여한 마우스는 폐 섬유화가 진행됨에 따라 폐 조직의 하이드록시프롤린 수준이 대조군에 비해 크게 증가하였다. 반면, 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편 (PGRN-FBAC)을 주입한 마우스는 폐 조직의 하이드록시프롤린 수준이 현저하게 감소하였으며, 특히 PGRN-FBAC 처리시 블레오마이신 단독 처리군에 비해 50% 이상 감소한 것으로 나타났다.

상기 결과는 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편이 콜라겐 축적을 억제하는 효과가 있으며 따라서 폐 및 기도 섬유화 관련 질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 보여준다.

실시예 7. 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편 주입에 의한 마우스의 체중 변화 확인

폐 섬유화 동물모델 III를 이용하여 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편의 주입에 따른 마우스의 체중 변화를 확인하였다. 구체적으로, 마우스에 블레오마이신을 주입한 후 1일, 3일, 6일, 8일, 10일, 13일 째에 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편; 또는 피르페니돈을 중비하면서 마우스의 체중을 측정했다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 블레오마이신을 주입한 후 14일이 경과했을 때 블레오마이신만을 처리한 마우스는 대조군에 비해 평균적으로 1 g 정도의 체중 감소 경향을 보였으나, PGRN-BACD를 주입한 마우스는 체중 감소가 상대적으로 적은 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 폐 및 기도 섬유화 질환에서 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 단편이 체중 회복 효과가 있음을 보여준다.

실시예 8. 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편에 의한 섬유화 관련 마커 및 신호전달분자의 변화 확인

대표적인 섬유화 마커 중 하나인 피브로넥틴 (fibronectin)의 발현 정도는 섬유화의 진행 정도와 양의 상관관계를 나타내므로, 섬유화의 수준을 확인하는데 이용된다. 또한, 블레오마이신-유도 폐 섬유화 마우스 모델에서는 TNFα의 증가에 의한 NFκB의 인산화 증가가 폐 섬유화를 유발시키는 중요한 요인으로 작용한다. 따라서 폐상피세포주인 A549 세포를 이용하여 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편이 섬유화 관련 마커 및 신호전달분자에 미치는 영향을 구체적으로 확인하였다.

구체적으로, 도 8a에 나타낸 바와 같이 A549 세포에 전장 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편 (PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 또는 PGRN-CDE)을 2 μg/ml의 농도로 함유한 배지 (10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 RPMI 1640)를 1시간 동안 처리하였다. 그 후, 상기 세포에 블레오마이신을 50 μg/ml의 농도로 처리하고 37℃ 및 5% CO₂ 조건의 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 배양을 마친 세포는 RIPA 버퍼로 용해하여 단백질을 추출하였으며, BCA 방법으로 추출된 단백질의 농도를 정량했다. 40 μg의 단백질을 8% SDS-PAGE에 전기영동한 후, PVDF 멤브레인에 트랜스퍼했다. 트랜스퍼를 마친 멤브레인은 5% skim milk로 블로킹 (blocking)하고, 셰이커 (shaker) 상에서 1차 항체와 밤새 반응시켰다 (4℃). 그 후 멤브레인을 셰이커 상에서 TBS-T 버퍼로 7분씩 2회 세척하고, 멤브레인에 2차 항체를 처리하여 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 이어서 멤브레인을 셰이커 상에서 TBS-T 버퍼로 7분씩 2회 세척하고 화학발광 (chemiluminescence)을 측정했다.

그 결과, 도 8b에 나타난 바와 같이, 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편을 처리하지 않은 세포는 블레오마이신에 의해 섬유화 마커인 피브로넥틴 수준이 대조군에 비해 크게 증가하였으며, 섬유화를 촉진하는 인산화된 NFκB (p-NFκB)의 수준 또한 크게 증가한 것으로 나타났다. 반면, 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편을 처리한 세포에서는 블레오마이신의 처리에도 불구하고 피브로넥틴이 및 p-NFκB의 수준이 큰 폭으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과는 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편이 섬유화를 매개하는 신호전달분자들의 수준 및 활성을 저해하여 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다.

실시예 9. 폐섬유아세포주에서의 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편에 의한 섬유화 마커 변화 확인

섬유아세포에 의한 COL1A1의 분비 및 축적 정도; 및 F-액틴 (F-actin)의 발현 정도는 섬유화의 진행정도와 양의 상관관계를 나타내므로, 섬유화의 정도를 확인하는데 활용된다. 따라서 폐섬유아세포를 TGF-β로 자극한 후, 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편을 처리하여 섬유화 마커 COL1A1의 변화를 웨스턴 블롯 및 ELISA로 확인하였다.

도 9a 나타낸 바와 같이, 폐섬유아세포주인 MRC-5 세포를 rat tail collagen type I에서 3차원 배양하였다. 구체적으로, 콜라겐 젤에 세포를 섞은 후 (seeding) φ35 컨포칼 디쉬 (confocal dish)에서 1시간 동안 굳혔다. 이후 전장 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편 (PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 또는 PGRN-CDE)을 2 μg/ml의 농도로 함유한 혈청 결핍 MEM 배지 (1% 페니실린/스트렙토마이신)를 1시간 동안 처리하였다. 1시간 후, TGF-β을 10 ng/ml의 농도로 처리하고 37℃ 및 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양했다. 24시간 후, 세포로부터 분비된 단백질의 양을 웨스턴 블롯으로 측정하기 위해 배양액을 획득하였으며, 40 μl의 배양액을 8% SDS-PAGE에 전기영동한 후, PVDF 멤브레인에 트랜스퍼했다. 트랜스퍼를 마친 멤브레인은 5% skim milk로 블로킹한 후, 셰이커 (shaker) 상에서 1차 항체 (COL1A1 항체)와 밤새 반응시켰다 (4℃). 그 후 멤브레인을 셰이커 상에서 TBS-T 버퍼로 7분씩 2회 세척하고, 멤브레인에 2차 항체를 처리하여 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 이어서 멤브레인을 셰이커 상에서 TBS-T 버퍼로 7분씩 2회 세척하고 화학발광 (chemiluminescence)을 측정했다.

또한 ELISA 방법으로 폐섬유아세포의 COL1A1의 분비 정도를 측정하기 위해 hCOL1A1 capture 항체를 96웰 이뮤노플레이트 (immunoplate)에 처리하여 상온에서 밤새 플레이트를 코팅하였다. 이후 PBS-T 버퍼로 플레이트를 3번 세척한 후 1시간 동안 블로킹하였다. 이후 PBS-T 버퍼로 3번 세척한 후 100 μl의 배양액을 상온에서 2시간 동안 처리하였다. 다시 PBS-T 버퍼로 3번 세척한 후 검출 항체와 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이어서 PBS-T 버퍼로 3번 세척한 후 스트렙타아비딘-HRP (streptavidin-HRP) 항체와 상온에서 20분간 반응시켰다. PBS-T 버퍼로 3번 세척한 후 발색 시약으로 20분간 반응시키고, 반응 중지 버퍼 (stop buffer)를 처리한 후 450 nm에서 흡광도를 측정했다. 또한, 배양액을 제거하고 남은 세포가 포함된 콜라겐 젤을 PBS로 5분간 3번 세척 후 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)로 상온에서 밤새 고정시켰다. 이후 PBS로 3번 세척 후 0.2% triton-X100/PBS에 상온에서 30분간 반응시켰다. 콜라겐 젤을 PBS로 10분간 3번 세척한 후, 3% BSA/PBS에 상온에서 30분간 블로킹했다. 이어서 콜라겐 젤을 PBS로 20분간 3번 세척한 후, 1 U/ml의 농도의 팔로이딘-로다민 (Phalloidin-Rhodamine)으로 1시간 동안 염색했다. 염색을 마친 콜라겐 젤을 PBS로 10분간 3번 세척한 후 DAPI가 포함되어 있는 마운팅 용액으로 마운팅하였다. 이후 F-액틴의 발현정도를 공초점 레이저 현미경 (confocal microscopy)으로 관찰했다.

프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편에 의한 COL1A1 변화는 도 9b 및 9c에 나타냈다. TGF-β을 단독으로 처리한 폐섬유아세포에서는 대조군과 비교하여 COL1A1의 수준이 증가하였으나, 전장 프로그래뉼린, PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 또는 PGRN-CDE을 함께 처리한 세포는 COL1A1 발현이 크게 감소한 것을 확인할 수 있었다 (도 9b). ELISA 방법을 통해 분비된 COL1A1의 양을 정량하였을 때에도 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편에 의해 폐섬유아세포의 COL1A1 분비가 크게 억제된 것을 확인할 수 있었다 (도 9c).

프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편에 의한 F-액틴 변화는 도 9d에 나타냈다. 면역형광염색법으로 폐섬유아세포 내 F-액틴 수준을 확인한 결과, TGF-β 단독 처리군은 음성대조군에 비해 F-actin의 수준이 크게 증가하였으나 전장 프로그래뉼린, PGRN-FBAC, PGRN-BACD, 또는 PGRN-CDE을 함께 처리함에 따라 F-액틴 수준이 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있었다.

즉, 상기 결과로부터 섬유화의 주요 매개체인 섬유아세포에 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편을 처리하는 경우 섬유화 마커의 수준이 크게 감소하는 것을 알 수 있는 바, 이는 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편의 섬유화 치료 효과를 뒷받침하는 것이다.

이상의 실시예를 종합하여, 본 발명자들은 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편이 폐 또는 기도의 섬유화가 일어난 동물 모델에서 조직 내 염증을 현저히 개선할 뿐만 아니라 섬유화를 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 또한 폐 세포주 및 섬유아세포를 이용한 in vitro 실험을 통해 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편에 의한 섬유화 마커들의 수준 및 활성 억제 효과를 명확히 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 프로그래뉼린 단백질 및 이의 단편은 폐 및 기도 섬유화와 관련된 질환의 예방 또는 치료제로 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

<110> THE ASAN FOUNDATION University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Pharmaceutical compositions for preventing or treating fibrotic diseases comprising progranulin or active fragments thereof as an active ingredient <130> MP20-230P1 <150> KR 10-2020-0161571 <151> 2020-11-26 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-granule in hPGRN <400> 1 Val Pro Cys Asp Asn Val Ser Ser Cys Pro Ser Ser Asp Thr Cys Cys 1 5 10 15 Gln Leu Thr Ser Gly Glu Trp Gly Cys Cys Pro Ile Pro Glu Ala Val 20 25 30 Cys Cys Ser Asp His Gln His Cys Cys Pro Gln Gly Tyr Thr Cys Val 35 40 45 Ala Glu Gly Gln Cys Gln 50 <210> 2 <211> 333 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hPGRN-FBAC <400> 2 Gly His His Cys Cys Pro Arg Gly Phe His Cys Ser Ala Asp Gly Arg 1 5 10 15 Ser Cys Phe Gln Arg Ser Gly Asn Asn Ser Val Gly Ala Ile Gln Cys 20 25 30 Pro Asp Ser Gln Phe Glu Cys Pro Asp Phe Ser Thr Cys Cys Val Met 35 40 45 Val Asp Gly Ser Trp Gly Cys Cys 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Glu Ala Pro Arg Trp Asp Ala Pro Leu Arg Asp Pro Ala Leu Arg Gln 225 230 235 240 Leu Leu <210> 5 <211> 593 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> full length hPGRN <400> 5 Met Trp Thr Leu Val Ser Trp Val Ala Leu Thr Ala Gly Leu Val Ala 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Pro Asp Gly Gln Phe Cys Pro Val Ala Cys Cys Leu 20 25 30 Asp Pro Gly Gly Ala Ser Tyr Ser Cys Cys Arg Pro Leu Leu Asp Lys 35 40 45 Trp Pro Thr Thr Leu Ser Arg His Leu Gly Gly Pro Cys Gln Val Asp 50 55 60 Ala His Cys Ser Ala Gly His Ser Cys Ile Phe Thr Val Ser Gly Thr 65 70 75 80 Ser Ser Cys Cys Pro Phe Pro Glu Ala Val Ala Cys Gly Asp Gly His 85 90 95 His Cys Cys Pro Arg Gly Phe His Cys Ser Ala Asp Gly Arg Ser Cys 100 105 110 Phe Gln Arg Ser Gly Asn Asn Ser Val Gly Ala Ile Gln Cys Pro Asp 115 120 125 Ser Gln Phe Glu Cys Pro Asp Phe Ser Thr Cys Cys Val Met Val Asp 130 135 140 Gly Ser Trp Gly Cys Cys Pro Met Pro Gln Ala Ser Cys Cys Glu Asp 145 150 155 160 Arg Val His Cys Cys Pro His Gly Ala Phe Cys Asp Leu Val His Thr 165 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380 Glu Trp Gly Cys Cys Pro Ile Pro Glu Ala Val Cys Cys Ser Asp His 385 390 395 400 Gln His Cys Cys Pro Gln Gly Tyr Thr Cys Val Ala Glu Gly Gln Cys 405 410 415 Gln Arg Gly Ser Glu Ile Val Ala Gly Leu Glu Lys Met Pro Ala Arg 420 425 430 Arg Ala Ser Leu Ser His Pro Arg Asp Ile Gly Cys Asp Gln His Thr 435 440 445 Ser Cys Pro Val Gly Gln Thr Cys Cys Pro Ser Leu Gly Gly Ser Trp 450 455 460 Ala Cys Cys Gln Leu Pro His Ala Val Cys Cys Glu Asp Arg Gln His 465 470 475 480 Cys Cys Pro Ala Gly Tyr Thr Cys Asn Val Lys Ala Arg Ser Cys Glu 485 490 495 Lys Glu Val Val Ser Ala Gln Pro Ala Thr Phe Leu Ala Arg Ser Pro 500 505 510 His Val Gly Val Lys Asp Val Glu Cys Gly Glu Gly His Phe Cys His 515 520 525 Asp Asn Gln Thr Cys Cys Arg Asp Asn Arg Gln Gly Trp Ala Cys Cys 530 535 540 Pro Tyr Arg Gln Gly Val Cys Cys Ala Asp Arg Arg His Cys Cys Pro 545 550 555 560 Ala Gly Phe Arg Cys Ala Ala Arg Gly Thr Lys Cys Leu Arg Arg Glu 565 570 575 Ala Pro Arg Trp Asp Ala Pro Leu Arg Asp Pro Ala Leu Arg Gln Leu 580 585 590 Leu <210> 6 <211> 162 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-granule in hPGRN <400> 6 gtcccctgtg ataatgtcag cagctgtccc tcctccgata cctgctgcca actcacgtct 60 ggggagtggg gctgctgtcc aatcccagag gctgtctgct gctcggacca ccagcactgc 120 tgcccccagg gctacacgtg tgtagctgag gggcagtgtc ag 162 <210> 7 <211> 999 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPGRN-FBAC <400> 7 ggccatcact gctgcccacg gggcttccac tgcagtgcag acgggcgatc ctgcttccaa 60 agatcaggta acaactccgt gggtgccatc cagtgccctg atagtcagtt cgaatgcccg 120 gacttctcca cgtgctgtgt tatggtcgat ggctcctggg ggtgctgccc catgccccag 180 gcttcctgct gtgaagacag ggtgcactgc tgtccgcacg gtgccttctg cgacctggtt 240 cacacccgct gcatcacacc cacgggcacc caccccctgg caaagaagct ccctgcccag 300 aggactaaca gggcagtggc cttgtccagc tcggtcatgt gtccggacgc acggtcccgg 360 tgccctgatg gttctacctg ctgtgagctg cccagtggga agtatggctg ctgcccaatg 420 cccaacgcca cctgctgctc cgatcacctg cactgctgcc cccaagacac tgtgtgtgac 480 ctgatccaga gtaagtgcct ctccaaggag aacgctacca cggacctcct cactaagctg 540 cctgcgcaca cagtggggga tgtgaaatgt gacatggagg tgagctgccc agatggctat 600 acctgctgcc gtctacagtc gggggcctgg ggctgctgcc cttttaccca ggctgtgtgc 660 tgtgaggacc acatacactg ctgtcccgcg gggtttacgt gtgacacgca gaagggtacc 720 tgtgaacagg ggccccacca ggtgccctgg atggagaagg ccccagctca cctcagcctg 780 ccagacccac aagccttgaa gagagatgtc ccctgtgata atgtcagcag ctgtccctcc 840 tccgatacct gctgccaact cacgtctggg gagtggggct gctgtccaat cccagaggct 900 gtctgctgct cggaccacca gcactgctgc ccccagggct acacgtgtgt agctgagggg 960 cagtgtcagc gaggaagcga gatcgtggct ggactggag 999 <210> 8 <211> 915 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPGRN-BACD <400> 8 gccttgtcca gctcggtcat gtgtccggac gcacggtccc ggtgccctga tggttctacc 60 tgctgtgagc tgcccagtgg gaagtatggc tgctgcccaa tgcccaacgc cacctgctgc 120 tccgatcacc tgcactgctg cccccaagac actgtgtgtg acctgatcca gagtaagtgc 180 ctctccaagg agaacgctac cacggacctc ctcactaagc tgcctgcgca cacagtgggg 240 gatgtgaaat gtgacatgga ggtgagctgc ccagatggct atacctgctg ccgtctacag 300 tcgggggcct ggggctgctg cccttttacc caggctgtgt gctgtgagga ccacatacac 360 tgctgtcccg cggggtttac gtgtgacacg cagaagggta cctgtgaaca ggggccccac 420 caggtgccct ggatggagaa ggccccagct cacctcagcc tgccagaccc acaagccttg 480 aagagagatg tcccctgtga taatgtcagc agctgtccct cctccgatac ctgctgccaa 540 ctcacgtctg gggagtgggg ctgctgtcca atcccagagg ctgtctgctg ctcggaccac 600 cagcactgct gcccccaggg ctacacgtgt gtagctgagg ggcagtgtca gcgaggaagc 660 gagatcgtgg ctggactgga gaagatgcct gcccgccggg cttccttatc ccaccccaga 720 gacatcggct gtgaccagca caccagctgc ccggtggggc agacctgctg cccgagcctg 780 ggtgggagct gggcctgctg ccagttgccc catgctgtgt gctgcgagga tcgccagcac 840 tgctgcccgg ctggctacac ctgcaacgtg aaggctcgat cctgcgagaa ggaagtggtc 900 tctgcccagc ctgcc 915 <210> 9 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPGRN-CDE <400> 9 ctcagcctgc cagacccaca agccttgaag agagatgtcc cctgtgataa tgtcagcagc 60 tgtccctcct ccgatacctg ctgccaactc acgtctgggg agtggggctg ctgtccaatc 120 ccagaggctg tctgctgctc ggaccaccag cactgctgcc cccagggcta cacgtgtgta 180 gctgaggggc agtgtcagcg aggaagcgag atcgtggctg gactggagaa gatgcctgcc 240 cgccgggctt ccttatccca ccccagagac atcggctgtg accagcacac cagctgcccg 300 gtggggcaga cctgctgccc gagcctgggt gggagctggg cctgctgcca gttgccccat 360 gctgtgtgct gcgaggatcg ccagcactgc tgcccggctg gctacacctg caacgtgaag 420 gctcgatcct gcgagaagga agtggtctct gcccagcctg ccaccttcct ggcccgtagc 480 cctcacgtgg gtgtgaagga cgtggagtgt ggggaaggac acttctgcca tgataaccag 540 acctgctgcc gagacaaccg acagggctgg gcctgctgtc cctaccgcca gggcgtctgt 600 tgtgctgatc ggcgccactg ctgtcctgct ggcttccgct gcgcagccag gggtaccaag 660 tgtttgcgca gggaggcccc gcgctgggac gcccctttga gggacccagc cttgagacag 720 ctgctg 726 <210> 10 <211> 1761 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> full length hPGRN <400> 10 acgcggtgcc cagatggtca gttctgccct gtggcctgct gcctggaccc cggaggagcc 60 agctacagct gctgccgtcc ccttctggac aaatggccca caacactgag caggcatctg 120 ggtggcccct gccaggttga tgcccactgc tctgccggcc actcctgcat ctttaccgtc 180 tcagggactt ccagttgctg ccccttccca gaggccgtgg catgcgggga tggccatcac 240 tgctgcccac ggggcttcca ctgcagtgca gacgggcgat cctgcttcca aagatcaggt 300 aacaactccg tgggtgccat ccagtgccct gatagtcagt tcgaatgccc ggacttctcc 360 acgtgctgtg ttatggtcga tggctcctgg gggtgctgcc ccatgcccca ggcttcctgc 420 tgtgaagaca gggtgcactg ctgtccgcac ggtgccttct gcgacctggt tcacacccgc 480 tgcatcacac ccacgggcac ccaccccctg gcaaagaagc tccctgccca gaggactaac 540 agggcagtgg ccttgtccag ctcggtcatg tgtccggacg cacggtcccg gtgccctgat 600 ggttctacct gctgtgagct gcccagtggg aagtatggct gctgcccaat gcccaacgcc 660 acctgctgct ccgatcacct gcactgctgc ccccaagaca ctgtgtgtga cctgatccag 720 agtaagtgcc tctccaagga gaacgctacc acggacctcc tcactaagct gcctgcgcac 780 acagtggggg atgtgaaatg tgacatggag gtgagctgcc cagatggcta tacctgctgc 840 cgtctacagt cgggggcctg gggctgctgc ccttttaccc aggctgtgtg ctgtgaggac 900 cacatacact gctgtcccgc ggggtttacg tgtgacacgc agaagggtac ctgtgaacag 960 gggccccacc aggtgccctg gatggagaag gccccagctc acctcagcct gccagaccca 1020 caagccttga agagagatgt cccctgtgat aatgtcagca gctgtccctc ctccgatacc 1080 tgctgccaac tcacgtctgg ggagtggggc tgctgtccaa tcccagaggc tgtctgctgc 1140 tcggaccacc agcactgctg cccccagggc tacacgtgtg tagctgaggg gcagtgtcag 1200 cgaggaagcg agatcgtggc tggactggag aagatgcctg cccgccgggc ttccttatcc 1260 caccccagag acatcggctg tgaccagcac accagctgcc cggtggggca gacctgctgc 1320 ccgagcctgg gtgggagctg ggcctgctgc cagttgcccc atgctgtgtg ctgcgaggat 1380 cgccagcact gctgcccggc tggctacacc tgcaacgtga aggctcgatc ctgcgagaag 1440 gaagtggtct ctgcccagcc tgccaccttc ctggcccgta gccctcacgt gggtgtgaag 1500 gacgtggagt gtggggaagg acacttctgc catgataacc agacctgctg ccgagacaac 1560 cgacagggct gggcctgctg tccctaccgc cagggcgtct gttgtgctga tcggcgccac 1620 tgctgtcctg ctggcttccg ctgcgcagcc aggggtacca agtgtttgcg cagggaggcc 1680 ccgcgctggg acgccccttt gagggaccca gccttgagac agctgctgtg cccaactttc 1740 ttgtacaaag tggttgatat c 1761 <210> 11 <211> 4734 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pPM-C-His <400> 11 ttttggattg aagccaatat gataatgagg gggtggagtt tgtgacgtgg cgcggggcgt 60 gggaacgggg cgggtgacgt agtagtgtgg cggaagtgtg atgttgcaag tgtggcggaa 120 cacatgtaag cgacggatgt ggcaaaagtg acgtttttgg tgtgcgccgg tgtacacagg 180 aagtgacaat tttcgcgcgg ttttaggcgg atgttgtagt aaatttgggc gtaaccgagt 240 aagatttggc cattttcgcg ggaaaactga ataagaggaa gtgaaatctg aataattttg 300 tgttactcat agcgcgtaat acggcagacc tcagcgctag attattgaag catttatcag 360 ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 420 gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtta actataacgg tcctaaggta 480 gcgaaagctc agatctggat ctcccgatcc cctatggtcg actctcagta caatctgctc 540 tgatgccgca tagttaagcc agtatctgct ccctgcttgt gtgttggagg tcgctgagta 600 gtgcgcgagc aaaatttaag ctacaacaag gcaaggcttg accgacaatt gcatgaagaa 660 tctgcttagg gttaggcgtt ttgcgctgct tcgcgatgta cgggccagat atacgcgttg 720 acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 780 atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 840 cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 900 tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 960 agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 1020 gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 1080 agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg 1140 gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg 1200 gaaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat 1260 gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctctcccta tcagtgatag 1320 agatctccct atcagtgata gagatcgtcg acgagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc 1380 ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagagct agcgatatca acaagtttgt 1440 acaaaaaagt tggcgtttaa accgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc 1500 atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt 1560 cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 1620 ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc 1680 tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accagcagat cgatctgcat 1740 ctatgtcggg tgcggagaaa gaggtaatga aatggcatta 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agattacgcg cagaaaaaaa 2640 ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 2700 tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 2760 aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 2820 taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 2880 gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 2940 agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 3000 cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 3060 tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 3120 gttgttgaaa aaggatcttc acctagatcc ttttcacgta gaaagccagt ccgcagaaac 3180 ggtgctgacc ccggatgaat gtcagctact gggctatctg gacaagggaa aacgcaagcg 3240 caaagagaaa gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg atagctagac tgggcggttt 3300 tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc 3360 cctgcaaagt aaactggatg gctttctcgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa 3420 gctctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg 3480 caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa 3540 tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg 3600 tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt 3660 ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa 3720 gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc 3780 ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg 3840 ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg 3900 aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg 3960 aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg 4020 gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact 4080 gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg 4140 ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc 4200 ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attttgttaa 4260 aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa catcccttat 4320 aaatcaaaag aatagaccgc gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca 4380 ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc 4440 ccactacgtg aaccatcacc caaatcaagt tttttgcggt cgaggtgccg taaagctcta 4500 aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg 4560 gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg 4620 gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcg cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtcca 4680 ttcgccattc aggatcgaat taattcttaa ttaacatcat caataatata cctt 4734 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG tag <400> 12 gactacaaag acgatgacga caag 24 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6X His tag <400> 13 catcatcacc atcaccat 18 <210> 14 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide <400> 14 atgtggaccc tggtgagctg ggtggcctta acagcagggc tggtggctgg a 51

Claims

프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 유효성분으로 포함하는 폐 또는 기도 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 활성 단편은 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:
(a) 프로그래뉼린 단백질의 C 그래뉼린 도메인;
(b) 프로그래뉼린 단백질의 FBAC 그래뉼린 도메인;
(c) 프로그래뉼린 단백질의 BACD 그래뉼린 도메인; 및
(d) 프로그래뉼린 단백질의 CDE 그래뉼린 도메인.
제1항에 있어서,
상기 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편은 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 폐 또는 기관지 조직의 섬유화 또는 염증을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 폐 또는 기도 섬유화 질환은 폐 섬유화증, 특발성폐섬유화증, 특발성간질성폐렴, 만성폐쇄성폐질환, 천식, 기도 섬유화증, 만성기관지염, 급성기관지염, 세기관지염, 만성폐쇄성기도질환, 및 폐쇄성세기관지염으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 만족하는 것인, 약학적 조성물:
(i) 염증세포의 조직 침윤을 억제함;
(ii) 조직 내 콜라겐 수준을 감소시킴; 및
(iii) 조직 내 하이드록시프롤린 수준을 감소시킴.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 피브로넥틴, 인산화된 NFκB, COL1A1, 및 F-액틴로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 수준 또는 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 피브로넥틴, NFκB, COL1A1, 및 F-액틴로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 가진 환자의 치료를 위한 것인, 약학적 조성물.
프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 포함하는 폐 또는 기도 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 활성 단편은 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:
(a) 프로그래뉼린 단백질의 C 그래뉼린 도메인;
(b) 프로그래뉼린 단백질의 FBAC 그래뉼린 도메인;
(c) 프로그래뉼린 단백질의 BACD 그래뉼린 도메인; 및
(d) 프로그래뉼린 단백질의 CDE 그래뉼린 도메인.
제9항에 있어서,
상기 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편은 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 재조합 바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 폐 또는 기도 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 키트.