KR20220064043A - 자궁경부암의 전이 진단용 바이오 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자궁경부암의 전이 진단용 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 항암방사선 치료를 받는 자궁경부암 환자들로부터 치료 전/후의 혈액에서 분리한 엑소좀 내에 포함된 microRNA를 분석한 결과, 자궁경부암의 전이(metastasis)과 관련된 마이크로 RNA들로 마이크로 RNA 1228-5p(hsa-miR-1228-5p), 마이크로 RNA 3200-3p(hsa-miR-3200-3p), 마이크로 RNA 146a-3p(hsa-miR-146a-3p), 마이크로 RNA 33a-5p(hsa-miR-33a-5p), 및 마이크로 RNA 6815-5p(hsa-miR-6815-5p)를 발굴하고, PCK1(Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1)의 mRNA, 및 FCGRA1(High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I)의 mRNA와 관련됨을 확인하였는 바, 상기 마이크로 RNA들 및 mRNA를 포함하는 자궁경부암의 전이 진단용 바이오 마커 조성물, 자궁경부암의 전이 진단용 조성물, 자궁경부암 전이 진단용 키트, 자궁경부암의 전이 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

Description

자궁경부암의 전이 진단용 바이오 마커 및 이의 용도{Biomarkers for diagnosing metastasis of cervical cancer, and uses thereof}

본 발명은 자궁경부암의 전이 진단용 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

자궁경부암(cervical cancer)은 여성에게 빈번하게 발생되는 악성 종양으로, 매년 전세계적으로 35만 명 이상의 환자가 자궁경부암으로 사망하고 있다. 자궁경부암은 0기에서 4기까지 나뉘고 0기 암을 상피내암이라고도 하며, 1기부터 4기 암을 침윤성 자궁경부 암이라고 한다. 상피내암은 침윤성 자궁경부암보다 10년 정도 빠르게 35~40세 정도에서 발병하며 침윤성 자궁경부암은 30세 이후부터 증가하기 시작하여 50대에 정점에 달한 후 급격히 감소하는 경향을 보이는 것으로 알려져 있다. 국내의 경우 자궁경부암의 유병률 수준은 10만 명당 31명 정도이고 사망률은 10만 명당 6.8명 수준으로 지난 10년간 큰 변화를 보이지 않았다. 발생률과 유병률의 빈도를 연령별로 보면 50대, 60대, 40대의 순이며, 발생률은 미국의 3배, 일본의 2.5배, 브라질의 1/3 수준이며 자궁경부암으로 인한 사망률이 암 사망률에서 차지하는 비율이 6%로 미국, 일본, 스위스 등의 2% 내외에 비하여 높은 실정이다. 현재 자궁경부암 발생에 관해서는 성적 접촉성 감염질환 모델이 가장 널리 인정되고 있으며 조기에 시작된 성적 활동, 다수의 성교 상대자, 남성 요인, 인유두종 바이러스(human papillomavirus, HPV) 감염, 에이즈 바이러스(human immunodeficiency virus) 감염 등이 자궁경부암 발생의 위험 요인으로 알려져 있다.

자궁경부암의 치료 후 재발률은 1년 내 50%, 2년 내 25%, 3년 내 15% 정도로서, 약 85%의 환자가 3년내 재발을 한다. 특히 자궁경부암의 방사선 치료 후의 재발율 또한 55%가 넘는다. 재발한 자궁경부암의 치료는 기존에 받았던 치료의 종류와 환자의 상태에 따라 다르게 결정되는데, 일반적으로 1차 치료로 수술을 했다면 재발시에는 방사선 치료를, 1차 치료로 방사선 치료를 했다면 수술을 고려하며, 두 가지 치료가 모두 불가능할 경우 항암화학요법을 시행하게 된다. 그러나 표준적인 치료법은 없으며 재발부위에 따라 각각에 대한 적절한 치료를 실시하는데, 일반적으로 병을 고치는 것보다 증상을 경감시기는 것을 목적으로 하는 치료법이다.

최근 보고에 따르면 자궁경부암의 골반 내전이 환자들과 (FIGO[International Federation of Gynecology and Obstetrics] stage IIIC1)과 복부림프절 전이 환자들의 (FIGO stage IIIC2) 5년 무진행 생존 기간은 27%의 차이를 보이고 있다. 그러므로 복부림프절 전이 여부를 판단하는 것은 환자의 치료성적을 예측하기 위해 중요하다. 이를 진단하기 위해서는 수술적으로 복부림프절들을 평가하는 방법과 PET/CT 또는 MRI를 이용한 평가방법이 모두 가능한데 항암방사선 치료 병기로 예상되는 환자들의 복부림프절을 침습적으로 평가하기 보다는 낮은 민감도에도 영상과 종양표지자에 의존하는 경우가 대부분이다 (PET-CT 민감도 85%, MRI 민감도 66%). 이는 수술적 비용 및 부작용을 감수해야 함에도 항암방사선 치료를 시행한 다는 것은 변함없기 때문이다. 방사선종양학과 의사들은 복부림프절을 포함하는 extended field radiotherapy (EBRT)여부를 결정하기 위해 영상 외에도 squamous cell carcinoma antigen이나 Carcinoembryonic antigen과 같은 종양표지자를 참고하지만 그 결정이 쉽지 않은 경우가 항상 존재한다. 그러므로 이러한 임상적 문제를 해결하기 위해서는 암의 전이 정도를 예측하기 위한 정확한 도구가 필요하다. 전이정도는 병기로 단순하게 표현될 수 있지만 그 이면에는 복잡한 생물학적인 의미를 내포하고 있으므로 좀 더 유의미한 상위레벨의 접근방법이 필요하다.

한편, 엑소좀(Exosome)은 암세포 혹은 다른 정상세포에 분비되는 40-150 nm의 세포외 소포(extracellular vesicles)로써, 세포와 세포간의 신호전달을 통한 여러 생리적 기능을 수행하며 암의 발생, 전이, 면역력, 염증 그리고 스트레스 반응의 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이들은 특이 non coding/coding RNA들을 포함하고 있으며 여러 coding RNA를 조절하는 miRNA가 이러한 기능들을 조절하는 핵심역할을 한다. 따라서 exosome miRNA는 현 시점에서 생각해 볼 수 있는 상위 레벨의 조절인자로서 고려될 수 있다. 특히 혈액 안에는 암세포뿐만 아니라 정상세포에서 기원한 exosome들도 풍부하기 때문에 암환자들의 신체적 반응과 암세포 간의 관련성을 알기 용이하며 동시에 miRNA와 coding gene 사이의 연관성을 살펴보는 것도 가능하다.

한국등록특허 제10-2096498호 (2020.05.27 공고)

본 발명은 자궁경부암의 전이 진단용 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명자들은 항암방사선 치료를 받는 자궁경부암 환자들 중에서 치료 전/후로 혈액 샘플을 채취하고, 이로부터 혈장 엑소좀(exosome) RNA를 분리한 후, NGS 분석을 통해 자궁경부암의 전이(metastasis)과 관련된 마이크로 RNA들을 검출하고, 이들을 자궁경부암의 전이 진단용 바이오 마커로 제공하는 것이다.

본 발명은 마이크로 RNA 16-1-3p(hsa-miR-16-1-3p), 마이크로 RNA 15a-3p(hsa-miR-15a-3p) 및 마이크로 RNA 6826-5p(hsa-miR-6826-5p)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 자궁경부암의 전이 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 마이크로 RNA 16-1-3p(hsa-miR-16-1-3p), 마이크로 RNA 15a-3p(hsa-miR-15a-3p) 및 마이크로 RNA 6826-5p(hsa-miR-6826-5p)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 RNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자궁경부암의 전이 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 전이 진단용 조성물을 포함하는 자궁경부암 전이 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 대상체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로 RNA 16-1-3p(hsa-miR-16-1-3p), 마이크로 RNA 15a-3p(hsa-miR-15a-3p) 또는 마이크로 RNA 6826-5p(hsa-miR-6826-5p)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 자궁경부암의 전이 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 항암방사선 치료를 받는 자궁경부암 환자들로부터 치료 전/후의 혈액에서 분리한 엑소좀 내에 포함된 microRNA를 분석한 결과, 자궁경부암의 전이(metastasis)와 관련된 마이크로 RNA 16-1-3p(hsa-miR-16-1-3p), 마이크로 RNA 15a-3p(hsa-miR-15a-3p), 마이크로 RNA 6826-5p(hsa-miR-6826-5p), 조성물은 마이크로 RNA 605-5p(hsa-miR-605-5p), 및 마이크로 RNA 6780a-5p(hsa-miR-6780a-5p), 마이크로 RNA 6791-5p(hsa-miR-6791-5p)를 발굴하고, FAM168A(Family With Sequence Similarity 168 Member A)의 mRNA, RBP3(Retinol-binding protein 3, interstitial)의 mRNA, 및 C1QTNF1(Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 1)의 mRNA와 관련됨을 확인하였는 바, 상기 마이크로 RNA들 및 mRNA를 자궁경부암의 전이(metastasis)을 진단하는 수단으로 활용될 수 있으며, 치료 및 수술 후의 예후를 예측하는데 유용한 바이오 마커로써 임상에서 효율적으로 이용될 것으로 기대된다.

도 1은 자궁경부암의 전이(metastasis)에 관련된 마이크로 RNA들 및 mRNA의 메커니즘을 나타내는 그림이다.
도 2은 항암 방사선 치료를 시행한 자궁경부암 환자들에 대한 치료과정, 혈액의 채취 시점, MRI 촬영 시점, 및 추적 관찰 과정을 설명한 모식도이다.
도 3는 FIGO 2018(The 2018 International Federation of Gynecology and Obstetrics) 단계에 따른 암 전이 정도를 나타낸 그림이다.
도 4은 자궁경부암의 전이(metastasis) 정도와 관련이 있는 마이크로 RNA 16-1-3p 대비 마이크로 RNA 15a-3p의 발현량을 측정한 결과이다.
도 5는 자궁경부암의 전이(metastasis) 정도와 유의한 연관성을 가진 miRNA(log2FC)들의 서브그룹(Subgroup) 분석을 통한 miRNA의 선별 결과이다.
도 6는 상기 도 5에서 선별된 miRNA의 상관관계를 분석한 결과이다.
도 7은 상기 도 5에서 선별된 miRNA 변수들을 방향성에 따라 비교한 결과이다.
도 8은 선별된 miRNA 군 및 그들과 연관된 miRNA들을 네트워크 서브그룹(network subgroup)으로 나누어 네트워크(network)로 분석한 결과이다.
도 9은 선별된 miRNA 군과 연관 mRNA들 간의 구조를 파악한 network 분석한 결과이다.
도 10는 각 임상 요소와 높은 관련성이 있는 mRNA (A) 및 네트워크(network) 분석을 통해 얻어진 miRNA 및 mRNA(B)를 포함하여 관련 유전자들을 선별한 결과다.
도 11은 자궁경부암의 전이(metastasis)에 관련된 miRNA와 mRNA들을 IPA(Ingenuity pathway analysis) 분석한 결과이다.
도 12은 자궁경부암의 전이(metastasis)과 관련된 4개의 함수 범주(function category)들의 벤다이어그램을 그린 결과이다.
도 13는 상기 도 12에서 선별된 mRNA 및 miRNA들을 네트워크(network)로 분석한 결과이다.
도 14은 상기 도 13에 포함된 RNA들의 log2FC 값들을 IPA database로 분석하여 자궁경부암의 전이(metastasis) 여부에 따라 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 범주들을 분석한 결과이다.
도 15는 자궁경부암의 전이(metastasis)과 관련된 주 miRNA에 대하여 선별된 범주들의 상대적 비율을 그래프로 나타낸 결과이다.
도 16는 자궁경부암의 전이(metastasis)과 관련된 주 miRNA의 변화에 따라 유의미하게 변화된 mRNA 및 miRNA들을 그래프로 나타낸 결과이다.
도 17은 mRNA들을 대상으로 자궁경부암의 전이(metastasis)에 대한 서브그룹을 분석한 결과이다.
도 18은 상기 도 17에서 선별된 miRNA의 상관관계를 분석한 결과이다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 혈장 엑소좀 miRNA가 항암방사선 치료를 시행한 환자들에게서 나타나는 자궁경부암의 전이(metastasis)을 예측할 수 있는 바이오 마커인지 확인하기 위해, 방사선 치료 전/후(2주)간의 혈장 엑소좀 miRNA를 분석하여 fold change를 통해 임상 변수가 나타나는 miRNA를 검출하였다.

본 발명은 마이크로 RNA 16-1-3p(hsa-miR-16-1-3p), 마이크로 RNA 15a-3p(hsa-miR-15a-3p) 및 마이크로 RNA 6826-5p(hsa-miR-6826-5p)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 자궁경부암의 전이 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.

암을 진단시 암세포가 퍼진 정도에 따라 암의 진행단계를 결정할 때에 TNM법에 의해 몸의 다른 장기로 암이 퍼졌는지 여부를 검사하는데, 상기 자궁경부암의 전이(metastasis)는 자궁경부암의 암세포가 림프액이나 혈류를 타고 다른 장기로 이동하여 그곳에서 증식되어 자궁경부암으로 진단받은 환자에게서 자궁경부 이외의 다른 부위에서 암이 발견되는 상태를 의미한다.

자궁경부암의 전이 여부는 예후를 예측하거나 이후 추가적인 치료 여부를 결정하는데 도움을 줄수 있다. 특히 골반을 벗어난 전이가 존재하는 지 여부는 (병기 IIIC2 이상) 치료 성적에 크게 영향을 준다. 현 시점에서 여러 영상도구를 이용하여 전이 정도를 평가하고 있지만 영상에서 관찰하기 힘든 병변이나 전이가 되었다고 판단하기 어려운 경우들이 적지 않다. 만약 추가적으로 전이 정도를 판단하는데 도움을 줄수 있는 도구가 있다면 방사선 치료 범위나 추가적인 항암치료를 시행할 여부를 결정하여 환자들에게 더욱 적절한 치료를 제공할 수 있을 것이다.

상기 마이크로 RNA 16-1-3p(hsa-miR-16-1-3p)는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 15a-3p(hsa-miR-15a-3p))는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 마이크로 RNA 6826-5p(hsa-miR-6826-5p)는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진다.

상기 바이오 마커 조성물은 마이크로 RNA 605-5p(hsa-miR-605-5p), 마이크로 RNA 6780a-5p(hsa-miR-6780a-5p), 마이크로 RNA 6791-5p(hsa-miR-6791-5p), FAM168A(Family With Sequence Similarity 168 Member A)의 mRNA, RBP3(Retinol-binding protein 3, interstitial)의 mRNA, 및 C1QTNF1(Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 1)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 마이크로 RNA 605-5p(hsa-miR-605-5p)는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 6780a-5p(hsa-miR-6780a-5p)는 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 6791-5p(hsa-miR-6791-5p)는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 FAM168A(Family With Sequence Similarity 168 Member A)의 mRNA는 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 RBP3(Retinol-binding protein 3, interstitial)의 mRNA는 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 C1QTNF1(Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 1)의 mRNA는 서열번호 9로 표시되는 염기서열로 이루어진다.

또한, 본 발명은 마이크로 RNA 16-1-3p(hsa-miR-16-1-3p), 마이크로 RNA 15a-3p(hsa-miR-15a-3p) 및 마이크로 RNA 6826-5p(hsa-miR-6826-5p)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 RNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자궁경부암의 전이 진단용 조성물을 제공한다.

상기 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 마이크로 RNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.

상기 프라이머는 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.

상기 프로브는 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.

상기 진단용 조성물은 마이크로 RNA 605-5p(hsa-miR-605-5p), 마이크로 RNA 6780a-5p(hsa-miR-6780a-5p), 마이크로 RNA 6791-5p(hsa-miR-6791-5p), FAM168A(Family With Sequence Similarity 168 Member A)의 mRNA, RBP3(Retinol-binding protein 3, interstitial)의 mRNA, 및 C1QTNF1(Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 1)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 RNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 전이 진단용 조성물을 포함하는 자궁경부암 전이 진단용 키트를 제공한다.

상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다. 예컨대, 상기 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 키트에 추가로 포함될 수 있다.

또한, 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 대상체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로 RNA 16-1-3p(hsa-miR-16-1-3p), 마이크로 RNA 15a-3p(hsa-miR-15a-3p) 또는 마이크로 RNA 6826-5p(hsa-miR-6826-5p)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 자궁경부암의 전이 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈장 유래 엑소좀이다.

상기 발현 수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.

상기 정보 제공 방법은 대상체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로 RNA 605-5p(hsa-miR-605-5p), 마이크로 RNA 6780a-5p(hsa-miR-6780a-5p), 마이크로 RNA 6791-5p(hsa-miR-6791-5p), FAM168A(Family With Sequence Similarity 168 Member A)의 mRNA, RBP3(Retinol-binding protein 3, interstitial)의 mRNA, 및 C1QTNF1(Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 1)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 RNA의 발현 수준을 측정하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.

상기 대상체는 자궁경부암을 치료하기 위한 방사선 치료를 받는 환자일 수 있다.

상기 진단은 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다. 상기 예후는 병세의 진행, 회복에 관한 예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다.

상기 진단을 위한 정보 제공 방법은 진단 또는 예후 예측을 위한 예비적 단계로써 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예]

1. 환자 및 검체

자궁경부암으로 진단된 후 항암 방사선 치료를 받은 환자들을 대상으로 하였다. 아주 대학교 병원 연구위원회 (Institutional Review Board)는 기증자로부터 정보제공에 대한 동의를 받고, 이 연구를 승인하였다.

자궁경부암의 병기는 FIGO 2018(The 2018 International Federation of Gynecology and Obstetrics) 단계를 기준으로 설정하였으며, 각 병기 그룹마다 암의 전이 정도를 충분히 반영하였고 이를 임상 종료점으로 (Clinical end point) 하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 항암 방사선 치료를 시행한 28명의 자궁경부암 환자들에 대한 치료과정, 혈액의 채취 시점, MRI 촬영 시점, 및 추적 관찰 과정을 실시하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, FIGO stage (2018) IB-IIIC1에 해당하는 환자들(18명)은 골반내에만 병변이 있는 경우이고 IIIC2, IVA 병기의 환자들(7명)은 복부림프절에 병변이 있었던 경우이고, IVA 환자는 복부림프절에 병변이 있었고 자궁경부종양이 방광을 침범한 경우였다. IVB 병기의 환자들(3명)로 좌측 쇄골 상부에 전이된 경우가 1명 폐 좌측 하엽에 1개의 병변이 전이된 경우가 1명, 우측 쇄골 상부와 좌측 겨드랑이에 전이된 경우가 1명이었다. 이들 중 좌측 폐에 전이된 환자는 복부림프절 전이가 없었고 골반림프절 전이만 확인되었다. 복부림프절까지 전이된 경우는 골반과 함께 복부림프절에 방사선 치료를 시행하였고, IVB 환자들은 전이된 부위에 국소적 방사선 치료를 치료기간동안 동시에 시행하였다. 상기 환자들의 임상 결과는 하기 표 1과 같다.

2. 엑소좀 miRNA 및 mRNA에 대한 dataset 구성

방사선 치료 전과 방사선 치료 2주차일 때, 환자들로부터 혈액을 5-10cc 채집하였다. 채집된 혈액으로부터 혈장을 분리하고, 추가적으로 인체 유래물 보관소에 보관되어 있던 29명의 혈장 샘플 3-5cc를 분양 받아 실험에 사용하였다. 혈장 샘플들로부터 엑소좀(exosome)을 분리하고, NGS(Next Generation Sequencing) 분석을 시행하였다. 혈장으로부터 발현량이 낮은 샘플은 분석에서 제외하였다.

2-1. Small RNA 라이브러리 구축 및 시퀀싱

혈장을 Exo2D RNA 용액(Exosomeplus)과 혼합하여 엑소좀을 분리하였다. 제조사의 지침에 따라 miRNeasy Serum / Plasma Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 혈장 유래 엑소좀의 엑소좀 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA의 농도는 Quant-IT RiboGreen (Invitrogen)에 의해 계산되었다. RNA의 크기는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Boblingen, Germany)에서 Agilent RNA 6000 Pico Kit 및 Small RNA Kit를 사용하여 확인하였다.

각 샘플에서 분리된 10ng의 RNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 Illumina 용 SMARTer smRNA-Seq 키트로 시퀀싱 라이브러리를 구성하는 데 사용되었다. 입력 RNA는 올리고 (dT) 프라이머에 대한 프라이밍 서열을 제공하기 위해 먼저 폴리아데닐화되었다. cDNA 합성은 각 RNA 주형의 5 '끝에 어댑터 서열을 통합하는 3'smRNA dT Primer에 의해 프라이밍되며, LNA(locked nucleic acid) 기술로 강화된 SMRT smRNA Oligo에 의해 결합된 비주형 뉴클레오티드를 추가되었다. 템플릿 전환 단계에서 PrimeScript RT는 SMART smRNA Oligo를 각 첫 번째 가닥 cDNA 분자의 3 '말단에 두 번째 어댑터 시퀀스를 추가하기위한 템플릿으로 사용하였다. 이 후, PCR 증폭 중에 샘플 멀티플렉싱용 인덱스 시퀀스를 포함하는 전체 길이 Illumina 어댑터를 추가하였다. Forward PCR Primer는 SMART smRNA Oligo에 의해 추가된 서열에 결합하는 반면 Reverse PCR Primer는 3’smRNA dT Primer에 의해 추가된 서열에 결합하였다.

증폭된 라이브러리를 6% Novex TBE-PAGE 겔(Thermo Fisher, MA)에서 정제하여 138bp(cDNA 18bp 이상 + 어댑터 120bp 이상) 이상의 분획을 절제하였다. 결과 라이브러리 cDNA 분자에는 Illumina 플로우 셀의 클러스터링에 필요한 시퀀스를 포함시켰다.

라이브러리는 겔 정제되었으며 Agilent Bioanalyzer에서 크기, 순도 및 농도를 확인하여 검증되었다. 라이브러리는 qPCR Quantification Protocol Guide (Illumina Sequecing 플랫폼 용 KAPA Library Quantificatoin 키트)에 따라 qPCR을 사용하여 정량화되었고, TapeStation D1000 ScreenTape (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)를 사용하여 검증되었다. 라이브러리를 등 몰량으로 풀링하고 Illumina HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, USA) 기기에서 시퀀싱하여 51 개의 염기 읽기를 생성하였다. 이미지 분해 및 품질 값 계산은 Illumina 파이프 라인의 모듈을 사용하여 수행되었다.

2-2. 어댑터 트리밍(Adapter trimming)

서로 다른 실험 샘플에서 얻은 small RNA의 raw 서열 read은 miRDeep2로 전처리하고 분석되었다. 어댑터 트리밍은 cutadapt 프로그램을 사용하여 smRNA 라이브러리 구축 과정에서 miRNA이 부착된 어댑터 서열이 존재하면 제거하였다. 모든 read의 첫 번째 3nt는 SMART template-switching 활동 프로세스 중에 삽입된 추가 염기를 제거하기 위해 트리밍되었다. 어댑터 서열과 어댑터의 모든 3’도 제거되었다. 읽기가 3’어댑터 서열의 처음 5 bp 이상 일치하는 경우, 서열이 실제로 어댑터 서열인 것으로 간주한 후, read에서 트리밍되었다. 분석을 위해, 트리밍된 read이 최소 18bp 이상인 경우만 신뢰하는 것으로 간주하였다. 나머지는 어댑터 서열은 비 어댑터 읽기로 분류하였다. 이 분석에서 트리밍 및 비 어댑터 읽기가 결합되고 다운 스트림 분석을 위해 처리된 read으로 간주되었다.

2-3. 클러스터링(Clustering)

서열 특이성(sequence uniqueness) 및 계산 강도를 최소화하기 위해 어댑터 서열로 처리된 read을 수집하여 클러스터를 형성하였다. 이 클러스터에는 서열 ID 및 read 길이와 100% 일치하는 read을 포함하며, 임시 클러스터 ID 및 보유 read 수가 제공되었다.

2-4. 리보솜 RNA 필터링

대부분의 RNA 구성은 rRNA로 알려져 있다. 다량의 rRNA의 효과를 제거하기 위해 읽기를 Homo sapiens의 45S pre-rRNA 및 미토콘드리아 rRNA에 정렬하고 일치시켰다.

2-5. miRNA read

miRDeep2 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 microRNA의 서열 정렬 및 검출을 수행하였다. 서열 정렬을 수행하기 전에 Homo sapiens reference genome release hg19를 UCSC 게놈 브라우저에서 검색하고 시퀀싱 read을 참조 서열에 정렬하기 위한 Bowtie (1.1.2)를 사용하여 인덱싱하였다. miRBase v21에서 얻은 전구체 miRNA을 참조 서열과 정렬하였다. miRDeep2 알고리즘은 miRNA biogenesis 모델을 기반으로 하며, Dicer 처리와 일치하는 방식으로 잠재적인 헤어핀 구조에 읽기를 정렬하고 헤어핀이 진정한 miRNA 전구체일 가능성을 나타내는 점수를 할당하였다.

2-6. miRNA 및 기타 RNA 범주 비율

클러스터링 된 읽기는 알려진 miRNA 및 기타 유형의 RNA를 식별하기 위해, 참조 게놈, miRBase v21 및 비 코딩 RNA 데이터베이스 RNAcentral release 10.0에 순차적으로 정렬되었다.

모든 데이터 및 시각화는 R 4.0.2 version(www.r-project.org)을 이용하여 수행되었으며 모든 비교 분석은 비모수를 가정하였다. 상기 NGS data는 small RNA, non- mRNA, 및 mRNA을 포함하고 있었으며, 이 중 miRNA 및 mRNA을 분석에 이용하였다. 이 중 14명이상에서 read count가 0인 경우는 분석에서 제외되었다. 분석에 이용된 miRNA는 586건, mRNA은 15324 건으로 통계되었다. 모든 전사체 데이터의 값들은 치료 전의 혈장 엑소좀의 read count값들 대비 방사선 치료 시작 2주 후의 read count 값들의 log2 fold change (log2FC) 값을 사용하였다. 28명의 환자들에 각 각에 대해 방사선 치료 전의 read count 값을 control로 사용하였고, 방사선 치료 후 2주의 read count 값의 변화를 log2 fold change (log2FC) 값으로 계산하였다. edgeR을 사용하여 TMM normalization 하고 log2FC 값을 구하였다.

3. 분석과정 및 결과

바이오마커를 선별하기 위한 분석 과정 및 결과는 다음의 단계로 진행되었다.

I 단계

임상 종료점(Clinical end point)을 예측할 수 있는 miRNA들을 선별하고,이들의 상관관계를 분석하였다(도 4, 4 및 5). 상관 관계(Correlation) 분석은 다음 3단계로 이루어졌다.

1 단계: Hmisc package - rcorr function - pearson’s correlation

2 단계: Leaps package - regsubsets function - exhaustive algorithm (최대 변수 설정 10 또는 7)

3 단계: Mean comparison (Wincoxon rank sum test or Kruskal-Wallis test) and boxplots

도 4에 나타난 바와 같이, miR-16-1-3p (log2FC) 값 중 발현이 없는 값들이 있어 cluster gene에서의 발현을 대체하는 것인지를 확인하였다. 방사선 치료 전 발현량 RPM[reads per million]을 정규 변환하여 miR-16-1-3p와의 연관성을 살펴본 결과 cluster gene 인 miR-15a-3p가 가장 높은 연관성을 보였다. 이 결과에 근거하여 miR-16-1-3p (log2 FC) 값을 측정하지 못한 경우에 miR-15a-3p(log2FC)로 대체하였고 앞으로의 분석에서 사용하였다. miR-16-1-3p [or15a-3p]로 표기하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 자궁경부암의 단계 (IB, IIB-IIIC1, IIIC2-IVA, IVB) 및 전이 여부(IB-IIIC1 vs. IIIC-IVB)에 유의한 연관성(|R|>0 & |R|>0)을 가진 miRNA(log2FC)들의 서브그룹(Subgroup) 분석을 통해 miRNA을 선별하였다. Adjusted R 값을 기준으로 가능한 모든 경우의 조합을 연산했을 때 지속적으로 포함되는 miRNA들을 선별하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 상기 miRNA 변수들의 다중선형회귀 조합으로 방향성을 얻은 후, 각 miRNA(log2FC) 값들을 miR-605-5p+miR-6780a-5p+miR-6791-5p+miR-6826-5p-miR-16-1-3p[or 15a-3p] 순으로 더하고 빼서 값을 구하였다. 값이 클수록 높은 병기 단계와 연관된 것으로 나타났으며, 특히 IIB-IIIC1과 IIIC2-IVA 사이의 차이가 현저하게 나타났다.

도 7에 나타난 바와 같이, 상기 miRNA 변수들을 방향성에 따라 miR-16-1-3p [or 15a-3p] (log2FC)와 miR-605-5p+miR-6780a-5p+miR-6791-5p+miR-6826-5p (log2FC)으로 비교했을 때 전자가 감소할 수로 후자가 증가할 수록 골반 밖으로의 전이되는 경우가 더 많음을 보여주고 있다.

II 단계

주 miRNA 군 및 그들과 연관된 miRNA들을 네트워크 서브그룹(network subgroup)으로 나누어 네트워크(network) 분석하였다. 임상 종료점(Clinical end point)에 따라 주 miRNA 군의 및 서브그룹의 영향력을 기술하였다.

Network 분석은 Igraph package - prim algorithm을 사용하고, 모든 network에서 붉은 색 edge는 양의 방향, 푸른색 edge는 음의 방향을 의미하도록 시각화 하였다. miRNA 그룹 층화는 A group은 주 miRNA 군을 의미하고, B group은 여러 주 miRNA 군과 연관된 miRNA 군을 의미한다.

도 8에 나타난 바와 같이, 자궁경부암의 단계(Stage)에 관련된 miRNA들을 이용하여 네트워크(network)로 분석한 결과, 주 miRNA가 포함된 Stage IB-IIIC1 및 Stage IIIC2-IVB에서 각 miRNA의 수준이 증가한 개수 및 감소한 개수를 비교하였다(증가: log2FC>1.5, 감소: log2FC <-1.5). A level은 도 7과 같은 방향성으로 유의미하게 증가 혹은 감소하였으며 이는 level A의 miRNA들이 각각 독립적으로 Stage에 기여하고 있음을 의미한다. 특히 stage IIIC2-IVB의 miR-16-1-3p[or 15a-3p] 이 감소할 때 B level의 miRNA들이 유의하게 증가하는 양상으로 하부 miRNA로 추측하였다. stage IIIC2-IVB의 miR-605-5p가 증가할 때 B level의 miRNA들이 증가하는 경향으로 나타났다.

III 단계

network 분석을 통해 주 miRNA 군, 연관 mRNA들 및 II 단계에 포함된 miRNA를 포함하여 전체적인 miRNA-mRNA 간의 구조를 파악하였다. 주 miRNA 간을 연결하는 가장 짧은 pathway를 기술하고, II 단계의 network 상에서 임상적 연관성이 있는 subgroup miRNA들의 위치를 확인하였다. Network 분석은 상기 II 단계와 동일한 조건으로 시각화하였다.

도 9에 나타난 바와 같이, A level의 miRNA와 연관된 (|R| >0.6) mRNA들과 figure3D의 miRNA들을 합쳐 network를 구성하였으며 A level miRNA들 (화살표) 상의 최단 거리는 붉은 선으로 표시되었다. miR-6780a-5p, miR-6826-5p, miR-605-5p, miR-6791-5p, miR-16-1-3p[or15a-3p]는 PLCXD3 (별표시)를 중심으로 연결되어있다. (F5, FAM168A, ACIN1, CMTR2, CCDC88B, RNF216, ARHGEF2, ALDH2, PLCXD3, FCHO2, ATE1, SMAD9, ADCY10, RBP3, PERP이상 15개를 통해 연결된다) Figure 3D에서 B level의 일부가 network 상에서 관찰됨을 알 수 있으며 이를 통해 miRNA-mRNA의 구조가 적절함을 알 수 있다.

IV 단계

임상 종료점(Clinical end point)과 관련성 있는 mRNA들과 III 단계의 network에 포함된 miRNA 및 mRNA들이 포함되도록 선별(도 10)하고, 기존 IPA (Ingenuity Pathway Analysis) database로부터 유의한 질환(disease)/ 함수 범주(function category) 및 하위 범주(subcategories) 들을 추출(도 11)하였다.

도 10에 나타난 바와 같이, 각 임상 요소와 높은 관련성이 있는 mRNA (A) 및 네트워크(network) 분석을 통해 얻어진 miRNA 및 mRNA(B)를 포함하여 관련 유전자들을 선별하였다.

도 11에 나타난 바와 같이, 자궁경부암 단계(Stage)에 관련된 miRNA 및 mRNA들로 IPA (Ingenuity Pathway Analysis) 분석하여 유의한 함수 범주를 30개 선별하였다. 선별된 30개의 범주 중에서 암(cancer), 세포이동(cellular movement), 세포 간 신호전달/상호작용(cell to cell signaling and interaction), 세포 사멸 및 생존(cell death and survival)을 선택하였고, 상기 범주들의 구체적 하위 범주(subcategories)로 종양 세포의 전이 (Metastasis of tumor cell lines), 골수 세포의 이동 (Cell movement of myeloid cells), 내피세포의 이동 (Cell movement of endothelial cells), 신경세포의 이동 (Migration of neurons), 대식세포의 이동 (Migration of phagocytes), 혈중 혈소판의 활성화 (Activation of blood platelets), 내피세포의 세포자멸사 (Apoptosis of endothelial cells), 상피세포의 괴사 (necrosis of epithelial cells)를 선택하였다.

V 단계

유의성 정도 및 임상 종료점(Clinical end point)과의 연관 가능성이 있는 질환(disease)/ 함수 범주(function category)를 선별하고, 각 그룹에 해당하는 mRNA 및 miRNA들을 이용 벤다어그램을 도시하였다(도 12). 도시된 벤다이어그램을 통해 암과 특정기능에 공통적으로 연관된 mRNA 및 miRNA들을 재선별 하였다.

도 12에 나타난 바와 같이, 전이(metastasis) 단계와 관련되어 선별된 4개의 함수 범주(function category)들의 벤다이어그램을 그리고 cancer 영역과 중복된 항목들의 mRNA 및 miRNA를 선택하였다.

VI 단계

도 9의 주 miRNA의 short pathway를 이용하여 재선별된 mRNA 및 miRNA들을 network로 형성하였다. Network 분석은 상기 II 단계와 동일한 조건으로 시각화하였다.

도 13에 나타난 바와 같이, 도 12에서 선별된 miRNA 및 mRNA들과 도 9에 기술된 주 miRNA들을 포함한 short pathway를 이용하여 network를 형성하였고 각 주 miRNA의 변화 (log2FC>1.5 (up), log2FC < -1.5 (down), others - no change)에 따라 통계적의 유의하게 변화한 mRNA 및 miRNA들을 표시하였다(붉은색 숫자는 감소, 푸른색 숫자는 증가를 의미). 주 miRNA들은 miR-16-1-3p[or15a-3p] -> miR-6780a-5p -> miR-6826-5p -> miR-6791-5p <-> miR605-5p의 방향으로 연관된 것으로 나타났다. 특히 miR-6826-5p의 증가는 miR-605-5p의 증가와 유의미하게 연관되었다. miR-605-5p의 변화는 가장 많은 mRNA의 변화와 관련이 있는 것으로 나타났다.

VII 단계

VI 단계의 network를 구성하는 RNA들의 log2FC 값들을 28명 별로 IPA database에 올리고, 유의미한 질환(disease)/ 함수 범주(function category)의 z-score를 구하였다. 모든 환자들에서 유의미한 z score가 구해진 항목만을 선별하여 clinical end point에 따라 통계적으로 유의하게 차이가 있었던 항목들을 분석하였다.

도 14에 나타난 바와 같이, 도 13의 network에 포함된 RNA들의 log2FC 값들을 모두 각 환자 별로 IPA database에서 분석하여 카테고리 별로 z score를 얻은 후 골반 외 전이 여부에 따라 (Stage IB-IIIC1 vs. StageIIIC2-IVB) 통계적으로 유의한 차이를 보이는 항목들을 기술한 결과 내피세포(endothelial)/신경세포(neuronal)/상피세포(epithelial)/골수세포(myeloid)들의 이동/생존, 및 혈액 세포의 활성화(blood cell activation)가 자궁경부암의 전이 정도와 연관되었다.

VIII 단계

모든 network에서 유의미하게 변한 RNA 그룹에 대하여 주 miRNA에 대한 상기 선별된 하위 범주(subcategories)들에 대한 RNA들의 비율 변화를 분석하였다.

도 15에 나타난 바와 같이, 도 13의 network는 세포이동(cellular movement)와 연관된 RNA들이 50%, 세포 사멸 및 생존(cell death and survival)과 연관된 RNA들이 30%, 세포 간 신호 및 상호작용(Cell to cell signaling and interaction)과 연관되 RNA들이 20%였다. miR-605-5p 및 miR-6826-5p의 변화에 따라 유의미하게 변화한 RNA들은 전체적인 RNA들의 기능 분포와 유사했다. miR-6780a-5p의 경우는 세포 간 신호 및 상호작용(Cell to cell signaling and interaction)의 비중이 높았으며, miR-6791-5p의 경우는 세포 사멸 및 생존(cell death and survival)과 연관된 RNA들의 비중이 높았다. miR-16-1-3p[or 15a-3p]의 경우는 세포이동(cellular movement)이 30%, 세포 사멸 및 생존(cell death and survival)이 70% 정도였지만 특정 하위 범주(subcategory)는 전혀 포함하고 있지 않았다.

IX 단계

주 miRNA의 변화에 따라 유의미하게 변화된 mRNA 및 miRNA들을 분석하였다.

도 16에 나타난 바와 같이, 주 miRNA의 변화에 따른 mRNA 및 miRNA의 변화를 분석하였다. 같은 방향의 변화는 붉은 색으로 반대방향의 변화는 푸른 색으로 p 값의 변화를 표시하였으며 1.5 log2FC를 넘어서는 변화는 음영으로 표시하였다. CM은 세포이동(cellular movement), CCSI는 세포 간 신호 및 상호작용(Cell to cell signaling and interaction), CDS는 세포 사멸 및 생존(cell death and survival)을 의미한다. 하위 범주(subcategories)들은 다음과 같다 : 종양 세포주의 전이(Metastasis of tumor cell line, (Meta), 골수 세포의 세포 이동(Cell movement of myeloid cells, CM (m)), 내피 세포의 세포 이동(Cell movement of endothelial cells, CM (e)), 뉴런의 이동(Migration of neurons, CM (n)), 식세포의 이동(Migration of phagocytes, CM (p)), 세포 운동-기타(Cellular movement-others, CM(o)), 혈소판 활성화(Activation of blood platelets, CCSI (p)), 세포 간 신호 및 상호 작용-기타(Cell to cell signaling and interaction-others, (CCSI (o)), 내피 세포의 세포사멸(Apoptosis of endothelial cells, CDS (en)), 상피 조직 괴사(Necrosis of epithelial tissue, CDS (ep)), 및 세포 사멸/생존-기타(Cell death and survival -others, CDS (o)).

X 단계

도 13에서 얻어지 mRNA들을 이용하여 임상 종료점(Clinical end point)을 예측할 수 있는 mRNA들을 추출하고, 이들과 주 miRNA들 간의 임상성 유의성을 분석하였다.

도 17에 나타난 바와 같이, 추출된 mRNA들을 대상으로 자궁경부암의 전이(metastasis) 단계(stage)에 대한 서브그룹을 분석하였다. Adjusted R 값을 기준으로 가능한 모든 경우의 조합을 연산했을 때 지속적으로 포함되는 mRNA들을 선별하였다. FAM168A, RBP3과 C1QTNF1이 선별되었으며 FAM168A은 miR-16-1-3p[or 15a-3p]의 community에 속했으며 RBP3는 miR-6826-5p에 속했으며, C1QTNF1은 miR-6791-5p에 속한 것으로 나타났다.

도 18에 나타난 바와 같이, RBP3- C1QTNF1- FAM168A (log2FC)값은 stage가 증가할 수로 유의하게 높게 나타났다. FAM168A, RBP3, C1QTNF1, miR-605-5p, miR-6780a-5p, miR-6791-5p, miR-6826-5p, miR-16-1-3p[or 15a-3p]를 이용하여 subgroup 분석을 하여 miR-605-5p+RBP3- miR-16-1-3p[or 15a-3p]- C1QTNF1 (log2FC)는 증가할 수록 stage에 따른 차이를 더욱 크게 나타났다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

<110> Ajou University <120> Biomarkers for diagnosing metastasis of cervical cancer, and uses thereof <130> ADP-2020-0419 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-16-1-3p <400> 1 ccaguauuaa cugugcugcu ga 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-15a-3p <400> 2 caggccauau ugugcugccu ca 22 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-6826-5p <400> 3 ucaauaggaa agagguggga ccu 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-605-5p <400> 4 uaaaucccau ggugccuucu ccu 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-6780a-5p <400> 5 uugggaggga agacagcugg aga 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-6791-5p <400> 6 ccccuggggc ugggcaggcg ga 22 <210> 7 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM168A mRNA <400> 7 atgaaccctg tttacagccc cgtgcagcct ggggctcctt atggcaaccc 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gaggcgcact ctctgtgggc 2640 atctaccagg tgggcagcag ccccttatat gcatccatgc ccacccagat ggccatgagt 2700 gccaccacag gcaaggcctg ggacctggct ggtgtggagc ccgacatcac tgtgcccatg 2760 agcgaagccc tttccatagc ccaggacata gtggctctgc gtgccaaggt gcccacggtg 2820 ctgcagacgg ccgggaagct ggtggctgat aactatgcct ctgccgagct gggggccaag 2880 atggccacca aactgagcgg tctgcagagc cgctactcca gggtgacctc agaagtggcc 2940 ctagccgaga tcctgggggc tgacctgcag atgctctccg gagacccaca cctgaaggca 3000 gcccatatcc ctgagaatgc caaggaccgc attcctggaa ttgtgcccat gcagatccct 3060 tcccctgaag tatttgaaga gctgatcaag ttttccttcc acactaacgt gcttgaggac 3120 aacattggct acttgaggtt tgacatgttt ggggacggtg agctgctcac ccaggtctcc 3180 aggctgctgg tggagcacat ctggaagaag atcatgcaca cggatgccat gatcatcgac 3240 atgaggttca acatcggtgg ccccacatcc tccattccca tcttgtgctc ctacttcttt 3300 gatgaaggcc ctccagttct gctggacaag atctacagcc ggcctgatga ctctgtcagt 3360 gaactctgga cacacgccca ggttgtaggt gaacgctatg gctccaagaa gagcatggtc 3420 attctgacca gcagtgtgac ggccggcacc gcggaggagt tcacctatat catgaagagg 3480 ctgggccggg ccctggtcat tggggaggtg accagtgggg gctgccagcc accacagacc 3540 taccacgtgg atgacaccaa cctctacctc actatcccca cggcccgttc tgtgggggcc 3600 tcggatggca gctcctggga aggggtgggg gtgacacccc atgtggttgt ccctgcagaa 3660 gaggctctcg ccagggccaa ggagatgctc cagcacaacc agctgagggt gaagcggagc 3720 ccaggcctgc aggaccacct gtag 3744 <210> 9 <211> 846 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C1QTNF1 mRNA <400> 9 atgggctccc gtggacaggg actcttgctg gcgtactgcc tgctccttgc ctttgcctct 60 ggcctggtcc tgagtcgtgt gccccatgtc cagggggaac agcaggagtg ggaggggact 120 gaggagctgc cgtcgcctcc ggaccatgcc gagagggctg aagaacaaca tgaaaaatac 180 aggcccagtc aggaccaggg gctccctgct tcccggtgct tgcgctgctg tgaccccggt 240 acctccatgt acccggcgac cgccgtgccc cagatcaaca tcactatctt gaaaggggag 300 aagggtgacc gcggagatcg aggcctccaa gggaaatatg gcaaaacagg ctcagcaggg 360 gccaggggcc acactggacc caaagggcag aagggctcca tgggggcccc tggggagcgg 420 tgcaagagcc actacgccgc cttttcggtg ggccggaaga agcccatgca cagcaaccac 480 tactaccaga cggtgatctt cgacacggag ttcgtgaacc tctacgacca cttcaacatg 540 ttcaccggca agttctactg ctacgtgccc ggcctctact tcttcagcct caacgtgcac 600 acctggaacc agaaggagac ctacctgcac atcatgaaga acgaggagga ggtggtgatc 660 ttgttcgcgc aggtgggcga ccgcagcatc atgcaaagcc agagcctgat gctggagctg 720 cgagagcagg accaggtgtg ggtacgcctc tacaagggcg aacgtgagaa cgccatcttc 780 agcgaggagc tggacaccta catcaccttc agtggctacc tggtcaagca cgccaccgag 840 ccctag 846

Claims (15)

1. 마이크로 RNA 16-1-3p(hsa-miR-16-1-3p), 마이크로 RNA 15a-3p(hsa-miR-15a-3p) 및 마이크로 RNA 6826-5p(hsa-miR-6826-5p)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 자궁경부암의 전이 진단용 바이오 마커 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 마이크로 RNA 16-1-3p(hsa-miR-16-1-3p)는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 15a-3p(hsa-miR-15a-3p))는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 마이크로 RNA 6826-5p(hsa-miR-6826-5p)는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 바이오 마커 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 바이오 마커 조성물은 마이크로 RNA 605-5p(hsa-miR-605-5p), 마이크로 RNA 6780a-5p(hsa-miR-6780a-5p), 마이크로 RNA 6791-5p(hsa-miR-6791-5p), FAM168A(Family With Sequence Similarity 168 Member A)의 mRNA, RBP3(Retinol-binding protein 3, interstitial)의 mRNA, 및 C1QTNF1(Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 1)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 마커 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 마이크로 RNA 605-5p(hsa-miR-605-5p)는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 6780a-5p(hsa-miR-6780a-5p)는 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 6791-5p(hsa-miR-6791-5p)는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 FAM168A(Family With Sequence Similarity 168 Member A)의 mRNA는 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 RBP3(Retinol-binding protein 3, interstitial)의 mRNA는 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 C1QTNF1(Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 1)의 mRNA는 서열번호 9로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 바이오 마커 조성물.
5. 마이크로 RNA 16-1-3p(hsa-miR-16-1-3p), 마이크로 RNA 15a-3p(hsa-miR-15a-3p) 및 마이크로 RNA 6826-5p(hsa-miR-6826-5p)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 RNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자궁경부암의 전이 진단용 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 마이크로 RNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 전이 진단용 조성물.
7. 제5항에 있어서, 상기 진단용 조성물은 마이크로 RNA 605-5p(hsa-miR-605-5p), 마이크로 RNA 6780a-5p(hsa-miR-6780a-5p), 마이크로 RNA 6791-5p(hsa-miR-6791-5p), FAM168A(Family With Sequence Similarity 168 Member A)의 mRNA, RBP3(Retinol-binding protein 3, interstitial)의 mRNA, 및 C1QTNF1(Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 1)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 RNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 전이 진단용 조성물.
8. 제5항에 있어서, 상기 마이크로 RNA 16-1-3p(hsa-miR-16-1-3p)는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 15a-3p(hsa-miR-15a-3p))는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 마이크로 RNA 6826-5p(hsa-miR-6826-5p)는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 전이 진단용 조성물.
9. 제7항에 있어서, 상기 마이크로 RNA 605-5p(hsa-miR-605-5p)는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 6780a-5p(hsa-miR-6780a-5p)는 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 6791-5p(hsa-miR-6791-5p)는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 FAM168A(Family With Sequence Similarity 168 Member A)의 mRNA는 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 RBP3(Retinol-binding protein 3, interstitial)의 mRNA는 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 C1QTNF1(Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 1)의 mRNA는 서열번호 9로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 전이 진단용 조성물.
10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 전이 진단용 조성물을 포함하는 자궁경부암 전이 진단용 키트.
11. 대상체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로 RNA 16-1-3p(hsa-miR-16-1-3p), 마이크로 RNA 15a-3p(hsa-miR-15a-3p) 또는 마이크로 RNA 6826-5p(hsa-miR-6826-5p)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 자궁경부암의 전이 진단을 위한 정보 제공 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈장 유래 엑소좀인 것을 특징으로 하는 정보 제공 방법.
13. 제11항에 있어서, 상기 발현 수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는 정보 제공 방법.
14. 제11항에 있어서, 상기 정보 제공 방법은 대상체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로 RNA 605-5p(hsa-miR-605-5p), 마이크로 RNA 6780a-5p(hsa-miR-6780a-5p), 마이크로 RNA 6791-5p(hsa-miR-6791-5p), FAM168A(Family With Sequence Similarity 168 Member A)의 mRNA, RBP3(Retinol-binding protein 3, interstitial)의 mRNA, 및 C1QTNF1(Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 1)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 RNA의 발현 수준을 측정하는 단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 전이 진단을 위한 정보 제공 방법.
15. 제11항에 있어서, 상기 대상체는 자궁경부암을 치료하기 위한 방사선 치료를 받는 환자인 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 전이 진단을 위한 정보 제공 방법.

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