KR20220063252A - 혈관형성 섬유아세포 - Google Patents

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칸하이야 싱
사시와티 로이
머빈 씨 요더
사바 타바숨
아메드 사프와트 어바우-하쉬엠
서브하딥 가탁
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더 트러스티즈 오브 인디애나 유니버시티
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Abstract

생체내에서 혈관형성을 자극하는 능력을 포함하는 혈관형성 특성을 나타내도록 피부 섬유아세포를 재프로그래밍하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 일 구현예에 따르면, 이러한 조성물은 당뇨병 환자를 포함하는 만성 상처에 사용하기 위해 표준 치료와 함께 사용된다.

Description

혈관형성 섬유아세포
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 9월 20일에 출원된 미국 가출원 제62/903,130호 및 2019년 9월 26일에 출원된 미국 가출원 제62/906,140호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 개시내용은 본원에 명시적으로 포함되어 있다.
미국 정부 지원 성명서
본 발명은 미국 국립보건원에 의해 수여된 GM108014 하에서 미국 정부의 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가진다.
전자적으로 제출된 자료의 참조에 의한 통합
이와 동시에 제출되고 2020년 9월 18일에 생성된 "322025_ST25.txt"라는 이름의 1 킬로바이트 ACII(텍스트) 파일로 식별되는 컴퓨터 판독가능한 뉴클레오타이드/아미노산 서열 목록은 그 전체가 참조로 포함되어 있다.
본 개시내용의 배경
섬유아세포는 동물에서 가장 흔한 결합 조직의 세포이다. 신체 구조를 둘러싸는 상피 세포와 달리, 섬유아세포는 편평한 단층을 형성하지 않으며 분극 부착물에 의해 한쪽의 기저 판(basal lamina)에 국한되지 않는다. 섬유아세포의 주요 기능은 세포외 기질의 전구체를 지속적으로 분비하여 결합 조직의 구조적 완전성을 유지하는 것이다. 섬유아세포는 세포외 기질의 모든 구성요소, 주로 기저 물질 및 다양한 섬유의 전구체를 분비한다.
유의한 섬유아세포 이질성이 최근에 인간 및 뮤린 조직에서 설명되었다. 이것은 섬유아세포 행동 상태 변화가 조직 발달 및 항상성을 이해하는 데 어떻게 필요한지에 대한 추가적인 이해와 함께 조직 재생을 위한 새로운 전략을 제공하며 부적절하거나 바람직하지 않은 섬유아세포 활성과 관련된 질병 상태를 다룬다.
발달 동안 또는 손상에 반응하여 특정 행동 상태 변화를 나타내는 뚜렷한 섬유아세포 하위집단의 설명이 이제서야 등장하고 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 출원인은 단일 세포 RNA 서열분석과 상세한 계통 특이적 섬유아세포 기능 및 분자 분석과 조합하여 급성 손상 후 생리학적으로 후성유전학적으로 조절되는 신규한 섬유아세포 하위집단 상태 변화를 확인하였다.
본 개시내용의 일 구현예에 따르면, 인간 피부 섬유아세포(dermal fibroblast)를 혈관형성이 되도록 재프로그래밍하기 위한 조성물 및 방법으로서, 재프로그래밍된 피부 섬유아세포는 혈관의 형성을 유도하는 능력을 갖는 것인 조성물 및 방법이 제공된다. 방법은 생체내 또는 시험관내에서 피부 섬유아세포에서 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 방법은 섬유아세포 내의 miR-200b 존재비(abundance)를 감소시켜, 예를 들어 배양에서 및/또는 생체내에서 루멘화된(lumenized) 모세관 유사 구조를 형성하는 능력을 포함하는 혈관형성 특성을 나타내면서, 예를 들어 섬유아세포 특이적 단백질-1(Fsp-1)의 존재를 포함하는 섬유아세포 특징을 보유하는 세포를 생성하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 항-miR-200b 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 간섭 RNA)는 섬유아세포 특이적 단백질-1(Fsp-1)을 발현하는 인간 피부 섬유아세포(HADF) 내로 형질감염되어 HADF를 변형시켜 혈관형성 특성을 나타내는 혈관형성 섬유아세포를 생성한다. 일 구현예에서, 혈관형성 특성은 다음 특성 중 하나 이상을 포함한다:
내피 세포(EC) 유사 형태학적 형상의 변화;
세포 표면 혈관 내피 성장 인자 수용체-2(VEGFR2) 발현의 상향 조절;
분화 클러스터 31(CD31)로도 알려진 혈소판 내피 세포 부착 분자 1(PECAM-1)의 상향조절된 발현;
내피 산화질소 합성효소(eNOS)의 상향조절;
카드헤린 5(CDH5)의 상향조절, 및
아세틸화된 저밀도 지질단백질(Ac-LDL)의 향상된 흡수. 또한, 본원에 개시된 혈관형성 섬유아세포는 마트리겔(Matrigel) 상에 플레이팅시 관형 구조, 및/또는 3차원(D) 유형 1 콜라겐 겔에서 루멘화된 구조, 및/또는 제대혈 내피 콜로니 형성 세포와의 3D 겔 공동 배양에서 형성된 키메라성 루멘화된 모세관 유사 구조를 형성하는 능력을 나타낸다. 일 구현예에서, 혈관형성 섬유아세포가 제공되며, 혈관형성 섬유아세포는 본 출원에 기술된 바와 같이 재프로그래밍되지 않은 천연 피부 섬유아세포에 비해 도 2b에 표시된 바와 같이 상향조절되거나 하향조절된 하나 이상의 단백질을 발현한다.
일 구현예에서, 혈관형성 섬유아세포가 제공되며, 상기 세포는 섬유아세포 특이적 단백질-1(Fsp-1) 및 혈관 내피 성장 인자 수용체-2(VEGFR2) 모두를 발현한다. 선택적으로, 상기 세포는 혈소판 내피 세포 부착 분자 1(CD31), 내피 산화질소 합성효소(eNOS), 및 카드헤린 5(CDH5)로 이루어진 군으로부터 선택된 내피 세포의 추가적인 마커를 발현할 수 있다. 본원에 개시된 혈관형성 섬유아세포는 환자의 원하는 부위에서 혈관형성을 자극하는 것을 돕도록 유도될 수 있다.
도 1a 및 1b: 항 miR-200b 올리고뉴클레오타이드에 의한 피부 섬유아세포의 혈관형성 상태로의 직접적인 재프로그래밍. 포스포로티오에이트 변형을 갖는 miR-200b를 표적으로 하는 잠금 핵산(LNA)인 5'-catcattaccaggcatatt-3'(서열번호: 1)이 사용되었다. 이러한 19-머 ASO의 성공적인 전달은 맞춤형(custom) 프라이머를 사용한 RT-qPCR에 의해 검증되었다. NCBI 및 miRBase 데이터베이스 내의 임의의 유기체의 임의의 서열에 대해 >70% 상동성의 히트(hit)를 갖지 않는 유사한 19-머 올리고뉴클레오타이드가 모의(sham) 대조군으로 사용되었다. 대조군 또는 miR-200b 억제제로 형질감염된 인간 성인 피부 섬유아세포(HADF) 세포의 FSP-1/CD-31 공동국소화의 면역세포화학이 관찰되었다. 세포는 DAPI로 반대염색되었다(n = 3; 결과는 표시되지 않음). 도 1a 7일에 대조군 또는 miR-200b 억제제로 형질감염된 HADF 세포에서 FSP1 및 CD31의 정량화. 도 1b miR-200b 억제 후 d7에 삼중 양성 FSP1+VEGFR2+CDH5+ 섬유아세포의 이미지가 관찰되었고, 계산된 APC 강도의 그래프가 제공된다.
도 2a 및 2b: 단일 세포 RNA-seq 분석은 신규한 섬유아세포 하위집단 상태 변화를 확인한다. 12880개의 FSP+VEGFR2- 섬유아세포 및 11333개의 FSP+VEGFR2+ 섬유아세포의 단일 세포 전사체(transcriptome)를 보여주는 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection) 플롯은 10x 유전체학 플랫폼(10x Genomics platform)을 사용하여 분석되었다. 비지도 클러스터링(unsupervised clustering)은 13개의 클러스터를 확인하였다. 도 2a는 섬유아세포(FSP+VEGFR2-) 및 혈관형성 섬유아세포(FSP+VEGFR2+)에 대한 각 클러스터에서의 세포 수를 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 단일 세포 분석은 miR-200b 억제 후 혈관형성 섬유아세포의 특정 클러스터에서 혈관형성 특징의 획득을 밝혀내었다. FSP+VEGFR2+ 섬유아세포에서 높은 수준의 혈관신생촉진(pro-angiogenic) 마커 CITED2, GLUL, RRAS 및 PDGFRB 및 낮은 수준의 항혈관신생 마커 SERPINE1, PGK1, PDCD10 및 ITGB1BP1이 검출되었다. miR-200b 억제 후 매일 증가된 다른 시그니처(signature) 유전자는 VEGFB, VEGFC, NRP1, NRP2, FLT1, VEGFR1, VEGFR2, MAP2K1, MAP2K2, RAF1, KRAS, NOS3 및 PTEN이었다. 혈관형성 섬유아세포의 분자 특징이 도 2b에 제공되어 있다.
도 3a 및 3b: miR-200b 억제에 의한 허혈성 조직 관류 증가. 도 3a는 허혈 후 d14에 C57BL/6 마우스에서 모의 처리된(좌측 패널) 및 miR-200b 처리된 뒷다리 허혈 조직(오른쪽 패널)의 레이저 스펙클 이미징(LSI) 관류 데이터(상단), 초음파(중간) 및 혈류 속도(하단)의 사진을 보여준다. 도 3b는 LSI 관류 데이터의 정량화를 나타내는 그래프이며, 점선은 LNA 대조군을 나타내고 실선은 LNA miRNA-200b를 나타낸다. 결과는 항 miRNA-200b 처리된 마우스에서의 관류 증가를 입증하는 LAN 항 miRNA-200b 처리된 마우스(평균 ± SEM (n = 11))를 나타낸다.
도 4a 및 4b: miR-200b 억제에 의한 당뇨병 상처 조직 관류 증가. 도 4a는 LNA 대조군 또는 miR-200b 억제제로 처리된 db/db 마우스의 0일 및 최대 10일 상처 가장자리 조직에서의 피부 혈액 관류 정량화를 나타낸다(n=4). 도 4b는 대조군 억제제(점선)에 비해 miR-200b 억제(실선) 후 당뇨병 상처 조직에서 8일 및 10일에 더 많은 상처 수축을 나타내는 디지털 상처 면적측정을 나타낸다.
정의
본 발명을 설명하고 주장할 때, 하기 용어가 하기에 제시된 정의에 따라 사용될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "약"은 명시된 값 또는 값의 범위보다 10% 더 크거나 작은 것을 의미하지만, 임의의 값 또는 값의 범위를 이러한 더 넓은 정의로만 제한하고자 하는 것이 아니다. 용어 "약"이 선행하는 각각의 값 또는 값의 범위는 또한 명시된 절대값 또는 값의 범위의 구현예를 포함하고자 하는 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "정제된" 및 유사 용어는 천연 또는 자연 환경에서 분자 또는 화합물과 통상적으로 연관된 오염물이 실질적으로 없는 형태의 분자 또는 화합물의 단리에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "정제된"은 절대 순도를 요구하지 않고, 오히려 상대적인 정의로 의도된다. 용어 "정제된 폴리펩타이드"는 비제한적으로 핵산 분자, 지질 및 탄수화물을 포함하는 다른 화합물로부터 분리된 폴리펩타이드를 기술하기 위해 본원에서 사용된다.
용어 "단리된"은 참조된 물질이 그의 원래의 환경(예컨대, 그것이 자연적으로 발생하는 경우 자연 환경)으로부터 제거될 것을 요구한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오타이드는 단리되지 않지만, 자연계의 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드는 단리된다.
조직 나노형질감염(TNT)은 핵산 서열과 단백질을 나노규모로 세포의 시토졸 내로 전달할 수 있는 전기천공 기반의 기술이다. 보다 구체적으로, TNT는 배열된 나노채널을 통해 매우 강하고 집중된 전기장을 사용하며, 이는 병치된 조직 세포 구성원을 부드럽게 나노천공하고, 화물(예컨대, 핵산 또는 단백질)을 세포 내로 전기영동적으로 주입시킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "제어 요소" 또는 "조절 서열"은 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 비번역 영역을 포함하는 기능성 유전자의 비번역 영역이다. 이러한 요소는 그의 강도와 특이성이 다를 수 있다. "진핵 조절 서열"은 포유류 세포를 포함하는 진핵 세포에서 전사 및 번역을 수행하기 위해 진핵 세포의 숙주 세포 단백질과 상호 작용하는 인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 비번역 영역을 포함하는 기능성 유전자의 비번역 영역이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "프로모터"는 유전자의 전사 시작 부위와 관련하여 상대적으로 고정된 위치에 있을 때 기능하는 DNA의 서열 또는 서열들이다. "프로모터"는 RNA 중합효소와 전사 인자의 기본적인 상호작용에 필요한 핵심 요소를 함유하며 상류 요소 및 반응 요소를 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "인핸서"는 전사 시작 부위로부터의 거리와 무관하게 기능하는 DNA의 서열이며 전사 유닛에 대해 5' 또는 3'일 수 있다. 또한, 인핸서는 인트론 내 뿐만 아니라 코딩 서열 자체 내에 있을 수 있다. 이들은 일반적으로 10 내지 300 bp 길이이며, 이들은 시스(cis)로 기능한다. 인핸서는 근처 프로모터로부터 전사를 증가시키는 기능을 한다. 프로모터와 같은 인핸서는 종종 전사의 조절을 매개하는 반응 요소를 함유한다. 인핸서는 종종 발현의 조절을 결정한다.
"내인성" 인핸서/프로모터는 게놈 내의 주어진 유전자와 자연적으로 연결된 것이다. "외인성" 또는 "이종" 인핸서/프로모터는 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 지시되도록 유전자 조작(즉, 분자 생물학적 기술)에 의해 유전자에 병치되어 위치하는 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 세포에 대한 외인성 서열은 세포 외부의 공급원으로부터 세포 내로 도입된 서열이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "비코딩된(비정규) 아미노산"은 다음 20개 아미노산 Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr 중 어느 것의 L-이성질체가 아닌 임의의 아미노산을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동일성"은 둘 이상의 서열 간의 유사성에 관한 것이다. 동일성은 동일한 잔기의 수를 잔기의 총 수로 나누고 결과물에 100을 곱하여 백분율을 얻음으로써 측정된다. 따라서, 정확히 동일한 서열의 2개의 사본은 100% 동일성을 갖는 반면, 서로에 대해 아미노산 결실, 부가 또는 치환을 갖는 2개의 서열은 더 낮은 정도의 동일성을 갖는다. 당업자는 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410)와 같은 알고리즘을 사용하는 프로그램과 같은 여러 컴퓨터 프로그램이 서열 동일성을 결정하는 데 이용가능하다는 것을 인식할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "엄격한 혼성화 조건"은 프로브와 표적 서열 사이에 적어도 95% 및 바람직하게는 적어도 97% 서열 동일성이 존재하는 경우 혼성화가 일반적으로 발생할 것임을 의미한다. 엄격한 혼성화 조건의 예는 50% 포름아미드, 5X SSC(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산 삼나트륨), 50 mM 인산 나트륨(pH 7.6), 5X 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 10% 덱스트란 설페이트 및 20 μg/ml 변성 전단 캐리어 DNA, 예컨대 연어 정자 DNA에서 밤새 인큐베이션 후 약 65℃에서 0.1 X SSC에서 혼성화 지지대를 세척하는 것이다. 다른 혼성화 및 세척 조건은 잘 알려져 있으며 문헌[Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), 특히 11장]에 예시되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 임의의 표준 약제학적 담체, 예컨대 인산염 완충 식염수 용액, 물, 유화액, 예컨대 유/수 또는 수/유 유화액, 및 다양한 유형의 습윤제를 포함한다. 이 용어는 또한 미국 연방 정부의 규제 기관에 의해 승인된 또는 인간을 포함한 동물에 사용하기 위해 미국 약전에 등재된 임의의 제제를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인산염 완충 식염수" 또는 "PBS"는 염화나트륨 및 인산나트륨을 포함하는 수용액을 지칭한다. PBS의 상이한 제제는 당업자에게 알려져 있지만, 본 발명의 목적을 위해 문구 "표준 PBS"는 137 mM NaCl, 10 mM 포스페이트, 2.7 mM KCl의 최종 농도 및 7.2-7.4의 pH를 갖는 용액을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료"는 특정 장애 또는 병태의 예방, 또는 특정 장애 또는 병태와 관련된 증상의 완화 및/또는 상기 증상을 예방 또는 제거하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 약물의 "유효"량 또는 "치료적 유효량"은 무독성이지만 원하는 효과를 제공하기 위해 충분한 약물을 지칭한다. "유효"량은 개체의 연령 및 일반적인 상태, 투여 방식 등에 따라 대상체마다 또는 심지어 시간이 지나면서 대상체 내에서 달라질 것이다. 따라서, 항상 정확한 "유효량"을 명시할 수 있는 것은 아니다. 그러나, 임의의 개별 사례에서 적절한 "유효"량은 일상적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 "치환"은 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보존적 아미노산 치환"은 본원에서 다음 5개 그룹 중 하나 내에서의 교환으로 정의된다:
I. 작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성 잔기:
Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;
II. 극성, 음으로 하전된 잔기 및 이들의 아미드:
Asp, Asn, Glu, Gln;
III. 극성, 양으로 하전된 잔기:
His, Arg, Lys; 오르니틴(Orn)
IV. 큰, 지방족, 비극성 잔기:
Met, Leu, Ile, Val, Cys, 노르류신(Nle), 호모시스테인(hCys)
V. 큰, 방향족 잔기:
Phe, Tyr, Trp, 아세틸 페닐알라닌, 나프틸알라닌(Nal)
본원에서 사용된 바와 같이, 추가 지정이 없는 용어 "환자"는 임의의 온혈 척추 길들여진 동물(예를 들어, 비제한적으로 가축, 말, 고양이, 개 및 기타 애완 동물 포함)과 인간을 포괄하기 위한 것이다.
용어 "담체"는 화합물 또는 조성물과 조합될 때 그의 의도된 용도 또는 목적을 위해 화합물 또는 조성물의 제조, 저장, 투여, 전달, 효과, 선택성 또는 임의의 다른 특징을 돕거나 용이하게 하는 화합물, 조성물, 물질 또는 구조를 의미한다. 예를 들어, 담체는 활성 성분의 임의의 분해를 최소화하고 대상체에서 임의의 부작용을 최소화하기 위해 선택될 수 있다.
용어 "억제하다"는 활성, 반응, 병태, 질병 또는 다른 생물학적 매개변수의 감소를 지칭한다. 이것은 비제한적으로 활성, 반응, 병태 또는 질병의 완전한 제거를 포함할 수 있다. 이것은 또한 예를 들어, 천연 또는 대조군 수준에 비해 활동, 반응, 병태 또는 질병의 10% 감소를 포함할 수 있다. 따라서, 감소는 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100%, 또는 이들 사이의 임의의 양의 감소일 수 있다.
용어 "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합 또는 변형된 펩타이드 결합에 의해 서로 결합된 아미노산, 예컨대 펩타이드 등배전자체(isostere) 등을 지칭하며, 이는 20개의 유전자 코딩된 아미노산 이외의 변형된 아미노산을 함유할 수 있다. 폴리펩타이드는 번역 후 처리와 같은 자연적 공정에 의해 또는 당업계에 널리 알려진 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 변형은 펩타이드 백본, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함하여 폴리펩타이드의 어느 곳에서나 발생할 수 있다.
용어 "아미노산 서열"은 펩타이드 결합을 통해 서로 연결된 일련의 2개 이상의 아미노산을 지칭하며, 여기서 아미노산 연결의 순서는 아미노산 잔기를 나타내는 약어, 글자, 문자 또는 단어의 목록에 의해 지정된다. 본원에 사용된 아미노산 약어는 아미노산에 대한 통상적인 하나의 글자 코드이며 다음과 같이 표현된다. A, 알라닌; B, 아스파라긴 또는 아스파르트산; C, 시스테인; D 아스파르트산; E, 글루타메이트, 글루탐산; F, 페닐알라닌; G, 글리신; H 히스티딘; I 이소류신; K, 라이신; L, 류신; M, 메티오닌; N, 아스파라긴; P, 프롤린; Q, 글루타민; R, 아르기닌 S, 세린; T, 트레오닌; V, 발린; W, 트립토판; Y, 티로신; Z, 글루타민 또는 글루탐산.
본원에 사용된 바와 같이 문구 "핵산"은 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 상보적인 핵산에 혼성화할 수 있는, DNA 또는 RNA 또는 DNA-RNA 혼성화물, 단일 가닥 또는 이중 가닥, 센스 또는 안티센스에 관계없이, 자연 발생 또는 합성 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 핵산은 또한 뉴클레오타이드 유사체(예컨대, BrDU), 및 비포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결(예컨대, 펩타이드 핵산(PNA) 또는 티오디에스테르 연결)을 포함할 수 있다. 특히, 핵산은 비제한적으로 DNA, RNA, cDNA, gDNA, ssDNA, dsDNA 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "뉴클레오타이드"는 염기 모이어티, 당 모이어티 및 인산염 모이어티를 함유하는 분자이다. 뉴클레오타이드는 인산염 모이어티와 당 모이어티를 통해 서로 연결되어 뉴클레오사이드간 결합을 생성할 수 있다. 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 때때로 서로 연결된 2개 이상의 뉴클레오타이드를 함유하는 분자를 지칭하는 데 사용된다. 뉴클레오타이드의 염기 부분은 아데닌-9-일(A), 시토신-1-일(C), 구아니-9-일(G), 우라실-1-일(U) 및 티민-1-일(T)일 수 있다. 뉴클레오타이드의 당 모이어티는 리보스 또는 데옥시리보스이다. 뉴클레오타이드의 인산염 모이어티는 5가 인산염이다. 뉴클레오타이드의 비제한적인 예는 3'-AMP(3'-아데노신 모노포스페이트) 또는 5'-GMP(5'-구아노신 모노포스페이트)이다. 뉴클레오타이드 유사체는 염기, 당 및/또는 인산염 잔기에 대한 일부 유형의 변형을 함유하는 뉴클레오타이드이다. 뉴클레오타이드에 대한 변형은 당업계에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어 5-메틸시토신(5-Me-C), 5 하이드록시메틸 시토신, 잔틴, 하이포잔틴 및 2-아미노아데닌뿐만 아니라 당 또는 인산염 모이어티에서의 변형을 포함한다.
뉴클레오타이드 대체물은 뉴클레오타이드와 유사한 기능적 특성을 갖지만 펩티드 핵산(PNA)과 같은 인산염 모이어티를 함유하지 않는 분자이다. 뉴클레오타이드 대체물은 왓슨-크릭 또는 후그스틴 방식으로 핵산을 인식할 분자이지만, 인산염 모이어티 이외의 모이어티를 통해 서로 연결된다. 뉴클레오타이드 대체물은 적절한 표적 핵산과 상호작용할 때 이중 나선 유형 구조를 따를 수 있다.
용어 "벡터" 또는 "작제물"은 벡터 서열이 연결된 또 다른 핵산을 세포 내로 운반할 수 있는 핵산 서열을 지정한다. 용어 "발현 벡터"는 세포에 의한 발현에 적합한(예컨대, 전사 제어 요소에 연결된) 형태의 유전자 작제물을 함유하는 임의의 벡터(예컨대, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 염색체)를 포함한다. 플라스미드는 벡터의 일반적으로 사용되는 형태이기 때문에, "플라스미드"와 "벡터"는 상호교환적으로 사용된다. 또한, 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 다른 벡터를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산과 또 다른 핵산 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 프로모터, 인핸서, 전사 및 번역 정지 부위 및 기타 신호 서열은 다른 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 핵산 서열의 예이다. 예를 들어, 전사 제어 요소에 대한 DNA의 작동가능한 연결은 이러한 DNA의 전사가 DNA를 특이적으로 인식, 결합 및 전사하는 RNA 중합효소에 의해 프로모터로부터 개시되도록 하는 DNA와 프로모터 사이의 물리적 및 기능적 관계를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "간섭 RNA"는 전사 후 유전자 침묵에 관여하는 임의의 RNA이며, 이 정의는 비제한적으로 센스 및 안티센스 가닥으로 구성되는 이중 가닥 RNA(dsRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 및 마이크로RNA(miRNA)를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "잠금 핵산"(LNA)은 리보스 모이어티가 2' 산소 및 4' 탄소를 연결하는 여분의 다리(bridge)로 변형되는 변형된 RNA 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 잠금 핵산 서열은 다음과 같은 구조의 뉴클레오타이드를 포함한다:
Figure pct00001
.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "혈관형성(vasculogenesis)"은 전구체 세포(혈관모세포)의 내피 세포로의 분화 및 원시 혈관망의 드 노보 형성으로 정의된다.
구현예
본 개시내용은 생체내에서 혈관형성을 유도할 수 있는 혈관형성 섬유아세포에 관한 것이다. 본원에 개시된 혈관형성 섬유아세포는 혈관형성을 유도하는 능력을 갖도록 조작된 섬유아세포 특이적 단백질-1(Fsp-1)을 발현하는 검증된 인간 피부 섬유아세포(HADF)로부터 유래된다. 이러한 재프로그래밍된 섬유아세포는 세포 표면 혈관 내피 성장 인자 수용체-2(VEGFR2) 발현(및 다른 내피 세포 관련 단백질 및 내피 세포의 다른 분자 시그니처를 나타냄)의 상향 조절뿐만 아니라 섬유아세포 특이적 단백질-1(Fsp-1)의 지속적인 발현을 나타낸다. 이러한 FSP-1+/VEGFR2+ 세포는 놀랍게도 HADF 세포만큼 효율적으로 콜라겐 겔을 계속 리모델링하고 수축시켰으며, 대조군 인간 미세 혈관 내피 세포(HMEC)는 그러한 활성을 나타내지 않았다. 따라서, 본 개시내용은 혈관형성 특성을 갖도록 유도된 섬유아세포에 관한 것이다.
출원인은 miR-200b 존재비가 전체 두께 피부 손상 후 처음 7일 동안 일시적으로 감소된다는 것을 관찰하였고, 본원에 개시된 바와 같이, 이러한 손실은 인접한 각질세포 또는 조직 대식세포가 아닌 상처 가장자리에 존재하는 피부 섬유아세포로 국한된다. 이 발견의 생물학적 중요성을 평가하기 위해, 섬유아세포 특이적 단백질-1(Fsp-1)을 발현하는 검증된 인간 피부 섬유아세포(HADF)에 (ASO)를 시험관내 적용은 ASO 형질감염된 세포의 >25%가 내피 세포(EC) 유사 형태학적 형상의 변화 및 세포 표면 혈관 내피 성장 인자 수용체-2(VEGFR2) 발현의 상향조절을 겪도록 자극하였다. FSP-1+/VEGFR2+ 세포는 또한 혈소판 내피 세포 부착 분자 1(CD31), 내피 산화질소 합성효소(eNOS), 카드헤린 5(CDH5)의 발현을 상향조절하였고, 아세틸화된 저밀도 지질단백질(Ac-LDL)의 흡수를 향상시켰으며, 정상적인 섬유아세포에서는 볼 수 없는 내피 세포(EC)의 정상적인 특징을 나타내었다. FSP-1+/VEGFR2+ 세포는 또한 마트리겔에 플레이팅시 관형 구조, 3차원(D) 유형 1 콜라겐 겔에서 루멘화된 구조, 및 제대혈 내피 콜로니 형성 세포와 함께 3D 겔 공동 배양에서 형성된 키메라성 루멘화된 모세관 유사 구조를 형성하였고, 모두 EC 유사 행동을 나타내었다.
일 구현예에 따르면, 원래의 섬유아세포에 비해 하나 이상의 혈관형성 특성을 나타내도록 인간 피부 섬유아세포를 재프로그래밍하는 방법으로서, 방법은 상기 세포에서 기능성 miR-200b의 농도를 감소시키는 단계를 포함하는 것인 방법이 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, 기능성 miRNA-200b의 농도를 감소시키는 것은 세포내 miRNA-200b 농도의 실제 감소, 및/또는 유전자 발현의 조절과 같은 천연 miRNA-200b 기능을 수행할 수 있는 세포에 존재하는 miRNA-200b의 백분율의 감소를 포함한다. 일 구현예에서, 방법은 표적화된 피부 섬유아세포에서의 검출가능한 miR-200b의 실제 감소를 포함한다. 일 구현예에서, 재프로그래밍된 섬유아세포는 섬유아세포 특이적 단백질-1(Fsp-1)을 계속 발현하고, 적어도 다음의 특성: 내피 세포(EC) 유사 형태학적 형상의 변화; 세포 표면 혈관 내피 성장 인자 수용체-2(VEGFR2) 발현의 상향 조절; 혈소판 내피 세포 부착 분자 1(CD31)의 상향조절된 발현; 내피 산화질소 합성효소(eNOS)의 상향조절; 카드헤린 5(CDH5)의 상향조절 및 아세틸화된 저밀도 지질단백질(Ac-LDL)의 향상된 흡수를 나타낸다.
일 구현예에 따르면, 원래의 섬유아세포에 비해 하나 이상의 혈관형성 특성을 나타내도록 인간 피부 섬유아세포를 재프로그래밍하는 방법으로서, 방법은 ETV2, FOXC2 및 FLI1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질, 또는 ETV2, FOXC2 및 FLI1 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 섬유아세포 내로 세포내로 전달하는 단계, 또는 ETV2, FOXC2 및 FLI1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질, 또는 ETV2, FOXC2 및 FLI1 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하거나 발현하는 세포로부터 생산되는 세포외 소포에 섬유아세포를 노출시키는 단계를 포함하는 것인 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 섬유아세포를 재프로그래밍하는 방법은 세포내 miR-200b 농도를 감소시키는 단계를 포함하며, miR-200b 농도는 세포를 간섭 올리고뉴클레오타이드로 형질감염시킴으로써 감소된다. 형질감염은 생체내 또는 시험관내에서 발생할 수 있다. 일 구현예에서, 항-miR-200b 올리고뉴클레오타이드는 인간 피부 섬유아세포 세포의 시토졸 내로 전달되며, 선택적으로 항-miR-200b 올리고뉴클레오타이드는 생체내에서 인간 피부 섬유아세포 세포의 시토졸 내로 전달된다. 일 구현예에서, 항-miR-200b 올리고뉴클레오타이드는 서열번호: 1의 서열 또는 이의 RNA 대응물을 포함한다.
본 발명에 따르면, 핵산 및/또는 단백질은 피부 섬유아세포의 시토졸 내로 도입되어 표적 세포의 재프로그래밍을 유도한다. 거대분자를 세포 내로 도입하기 위한 임의의 표준 기술이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 공지된 전달 방법은 광범위하게 두 가지 유형으로 분류될 수 있다. 첫 번째 유형에서, 기계적, 열적 또는 전기적 수단을 포함하는 막 파괴 기반 방법이 원하는 거대분자의 직접 침투를 위해 향상된 투과성으로 세포막의 연속성을 파괴하는 데 사용될 수 있다. 두 번째 유형에서, 다양한 바이러스, 엑소좀, 소포 및 나노입자 캡슐을 사용하는 담체 기반 방법은 담체 페이로드의 전달을 위해 세포의 엔도시토시스 및 융합 과정을 통해 담체의 흡수를 허용한다.
일 구현예에서, 세포내 전달은 바이러스 벡터, 또는 세포막과 상호작용하여 세포 내로 그의 내용물을 전달할 수 있는 다른 전달 비히클을 통해 이루어진다. 일 구현예에서, 세포내 전달은 3차원 나노채널 전기천공, 조직 나노형질감염 장치에 의한 전달, 또는 심부 국소 조직 나노전기주입 장치에 의한 전달을 통해 이루어진다. 일 구현예에서, 재프로그래밍 조성물은 실리콘 중공 바늘 어레이를 사용한 조직 나노형질감염(TNT)을 통해 생체내에서 섬유아세포의 시토졸 내로 전달된다.
투과 기반 파괴 전달 방법 중에서, 전기천공은 이미 보편적인 도구로서 확립되었다. 고효율 전달은 전기장 분포의 주의 깊은 제어에 의해 최소 세포 독성으로 달성될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 핵산 서열은 조직 나노형질감염(TNT)의 사용을 통해 체세포의 시토졸에 전달된다. 조직 나노 형질감염(TNT)은 플라스미드, RNA 및 올리고뉴클레오타이드를 살아있는 조직에 전달하여 임의의 실험실 절차의 필요 없이 면역 감시 하에서 생체 내에서 조직 기능의 직접적인 전환을 유발하는 전동 유전자 전달 기술이다. 생체내 조직 재프로그래밍에 일반적으로 사용되는 바이러스 유전자 전달과 달리, TNT는 바이러스 벡터의 필요를 제거하여 게놈 통합 또는 세포 형질전환의 위험을 최소화한다.
현재 생체내 재프로그래밍 방법은 생체내 또는 시험관내에서 세포를 형질감염시킨 후 이식하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예는 세포의 시험관내 재프로그래밍 후 이식을 수반하지만, 세포 이식물은 종종 낮은 생존 및 불량한 조직 통합에 직면한다. 또한, 시험관내에서 세포를 형질감염시키는 것은 추가적인 규제 및 실험실 장애를 수반한다.
일 구현예에 따르면, 피부 섬유아세포는 본원에 개시된 바와 같은 재프로그래밍 조성물로 생체내에서 형질감염된다. 대량 생체내 형질감염을 위한 일반적인 방법은 바이러스 벡터의 전달 또는 전기천공이다. 바이러스 벡터는 재프로그래밍 조성물을 피부 섬유아세포로 전달하기 위해 본 개시내용에 따라 사용될 수 있지만, 바이러스 벡터는 잠재적으로 원하지 않는 면역 반응을 개시하는 단점을 겪는다. 또한, 많은 바이러스 벡터는 유전자의 장기 발현을 유발하며, 이는 유전자 요법의 일부 적용에 유용하지만, 지속적인 유전자 발현이 불필요하거나 심지어 원치않는 적용의 경우 일시적인 형질감염은 실행가능한 선택사항이다. 바이러스 벡터는 또한 원치않는 부작용이 있을 수 있는 삽입 돌연변이유발 및 게놈 통합을 수반한다. 그러나, 일 구현예에 따르면, 리포좀 또는 엑소좀과 같은 특정한 비바이러스 캐리어가 생체내에서 체세포에 재프로그래밍 칵테일을 전달하는 데 사용될 수 있다.
TNT는 임의의 실험실 절차의 필요 없이 면역 감시 하에서 생체내에서 조직 기능의 직접적인 전환을 유발하는 국소화된 유전자 전달 방법을 제공한다. 플라스미드를 이용한 TNT를 사용함으로써, 유전자의 과발현을 시간적 및 공간적으로 제어하거나 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다. TNT를 이용한 공간 제어는 다른 조직의 형질감염 없이 피부 조직의 일부와 같은 표적 영역의 형질감염을 허용한다. TNT 장치에 대한 세부사항은 미국 공개 특허출원 제20190329014호 및 제20200115425호에 기재되었고, 이의 개시내용은 명시적으로 참조로 포함되어 있다. 조직 나노형질감염은 배열된 나노채널을 통해 매우 강하고 집중된 전기장을 인가함으로써 세포 내로 화물(예를 들어, 재프로그래밍 인자)의 직접적인 시토졸 전달을 허용하며, 이는 병치된 조직 세포 구성원을 부드럽게 나노천공하고, 화물을 세포 내로 전기영동적으로 주입한다.
일 구현예에 따르면, 본원에 개시된 어느 하나의 방법에 의해 생산되는 혈관형성 섬유아세포가 제공되며, 혈관형성 섬유아세포는 섬유아세포 특이적 단백질-1(Fsp-1), 및 혈관 내피 성장 인자 수용체-2(VEGFR2) 발현, 혈소판 내피 세포 부착 분자 1(CD31), 내피 산화질소 합성효소(eNOS) 및 카드헤린 5(CDH5)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질을 발현한다. 일 구현예에서, 혈관형성 섬유아세포는 CITED2, GLUL, RRAS, PDGFRB, VEGF, VEGFR, MAP2K, RAF1, KRAS 중 하나 이상의 상승된 발현, 선택적으로 CITED2, GLUL, RRAS, PDGFRB, VEGF, VEGFR, MAP2K, RAF1, KRAS 모두의 상승된 발현 및/또는 COL1A1, MMP1, SERPINE1, PGK1, PDCD10, ITGB1BP1 및 COL1A2 중 하나 이상의 낮은 발현, 선택적으로 COL1A1, MMP1, SERPINE1, PGK1, PDCD10, ITGB1BP1 및 COL1A2 모두의 낮은 발현을 특징으로 한다.
일 구현예에서, 혈관형성 섬유아세포가 제공되며, 섬유아세포는 섬유아세포 특이적 단백질-1(Fsp-1), 및 혈관 내피 성장 인자 수용체-2(VEGFR2) 발현, 혈소판 내피 세포 부착 분자 1(CD31), 및 내피 산화질소 합성효소(eNOS) 및 카드헤린 5(CDH5)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질을 발현한다. 선택적으로, 본 개시내용의 혈관형성 섬유아세포는 miRNA-200b를 표적화하는 간섭 RNA 및/또는 ETV2, FOXC2, 및 FLI1 중 하나 이상을 코딩하는 외인적으로 도입된 핵산을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 혈관형성 섬유아세포는 단리되거나 정제된 상태이다. 일 구현예에서, 혈관형성 섬유아세포는 또한 내피 세포(EC) 유사 형태학적 형상을 나타내고, 천연 피부 섬유아세포에 비해 아세틸화된 저밀도 지질단백질(Ac-LDL)의 향상된 흡수를 갖는다. 일 구현예에서, 혈관형성 섬유아세포는 상기 혈관 내피 성장 인자 수용체-2(VEGFR2) 발현, 혈소판 내피 세포 부착 분자 1(CD31), 내피 산화질소 합성효소(eNOS) 및 카드헤린 5(CDH5) 각각을 발현한다.
본 발명에 따르면, 본원에 개시된 임의의 혈관형성 섬유아세포는 환자 조직에서 신생혈관형성을 자극하는 데 사용될 수 있으며, 상기 방법은 생체내에서 피부 섬유아세포를 혈관형성이 되도록 재프로그래밍하는 단계, 또는 혈관형성이 되도록 시험관내에서 재프로그래밍된 혈관형성 섬유아세포를 도입하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 피부 섬유아세포는 상기 핵산 서열의 세포 흡수를 향상시키는 조건 하에서 상기 피부 섬유아세포를 항-miRNA-200b 올리고뉴클레오타이드 및/또는 ETV2, FOXC2, 및/또는 FLI1을 코딩하는 핵산 서열과 접촉시킴으로써 재프로그래밍되었다. 일 구현예에서, 재프로그래밍은 항-miR-200b 올리고뉴클레오타이드를 인간 피부 섬유아세포 세포의 시토졸 내로 전달하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 당뇨병 환자에서 상처 회복을 향상시키는 방법으로서, 방법은 혈관형성 섬유아세포를 도입하는 단계 또는 상기 상처에 가까운 조직에서 혈관형성이 되도록 섬유아세포를 재프로그래밍하는 단계를 포함하는 것인 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 방법은 피부 섬유아세포를 miR-200b의 억제제로 형질감염시키는 단계 및/또는 피부 섬유아세포에서 FLI1의 발현을 향상시키는 단계를 포함한다.
실시예 1
혈관형성 섬유아세포 상태의 확인
섬유아세포 특이적 단백질-1(Fsp-1)을 발현하는 검증된 인간 피부 섬유아세포(HADF)에 대한 항-miR-200b 올리고뉴클레오타이드(ASO)의 시험관내 적용은 ASO 형질감염된 세포의 >25%가 내피 세포(EC) 유사 형태학적 형상의 변화 및 세포 표면 혈관 내피 성장 인자 수용체-2(VEGFR2) 발현의 상향 조절을 겪도록 자극하는 것으로 결정되었다. FSP-1+/VEGFR2+ 세포는 또한 혈소판 내피 세포 부착 분자 1(CD31), 내피 산화질소 합성효소(eNOS), 카드헤린 5(CDH5)의 발현을 상향조절하였고, 아세틸화된 저밀도 지질단백질(Ac-LDL)의 흡수를 향상시켰으며, 정상적인 섬유아세포에서는 볼 수 없는 EC의 정상적인 특징을 나타내었다. FSP-1+/VEGFR2+ 세포는 또한 마트리겔에 플레이팅시 관형 구조, 3차원(D) 유형 1 콜라겐 겔에서 루멘화된 구조, 및 제대혈 내피 콜로니 형성 세포와 함께 3D 겔 공동 배양에서 형성된 키메라성 루멘화된 모세관 유사 구조를 형성하였고, 모두 EC 유사 행동을 나타내었다. 그러나, FSP-1+/VEGFR2+ 세포는 놀랍게도 HADF 세포만큼 효율적으로 콜라겐 겔을 계속 리모델링하고 수축시켰으며, 대조군 인간 미세 혈관 내피 세포(HMEC)는 이러한 활성을 나타내지 않았다.
따라서, HADF의 ASO 처리는 miR-200b 존재비를 감소시키고 일부 EC 행동의 증가와 관련이 있지만, 고전적인 HADF 기능의 유지; 새로운 섬유아세포 상태 변화와 관련이 있다. ASO 유도된 HADF 전사 변화를 조사하기 위해, FSP-1+/VEGFR2+ 및 FSP-1+/VEGFR2- 세포에서 단일 세포 RNA 서열분석을 수행하였다. Seurat 패키지를 사용한 비지도 클러스터링(unsupervised clustering)은 13개의 세포 클러스터를 확인하였다. FSP-1+/VEGFR2+ 세포는 혈관신생촉진 유전자의 높은 발현을 갖는 클러스터 0과 4로의 향상된 국소화 및 수많은 섬유아세포 및 항혈관신생 유전자가 고도로 발현된 클러스터 5, 6 및 8로의 감소된 국소화를 나타내었다. 10개의 구성원 유전자 시그니처는 클러스터 0 및 4에서 FSP-1+/VEGFR2+ 세포를 확인하였고 이러한 향상된 혈관신생촉진 세포의 프로그래밍 궤적은 슈도타임(pseudotime) 분석을 사용하여 별도의 분기로서 확인되었다. 이러한 결과는 miR-200b 존재비의 손실을 유발하는 HADF의 ASO 처리가 중요한 섬유아세포 하위집단 상태 변화를 초래하여 HADF가 EC 유사 기능의 획득으로 혈관형성 섬유아세포(VF)가 되었음을 나타낸다.
이러한 VF 상태 변화의 분자 조절을 확인하기 위해, 본 발명자들은 인실리코 분석을 수행하여 잠재적으로 관련된 miR-200b 표적 유전자를 확인하였다. 본 발명자들은 3' 비번역 영역(3'-UTR)에서 miR-200b 결합 부위를 갖는 후보로서 내피 분화 및 수많은 신생혈관 반응에 대한 중요한 것으로 알려진 전사 인자인 Fli1(Friend leukemia integration 1)을 확인하였다. miR-200b 모방체의 전달은 Fli1-3'-UTR 리포터 루시페라아제 활성을 현저히 억제했지만, 이 효과는 돌연변이된 Fli1-3'-UTR을 가진 세포에서 폐지되었다. miR-200b가 HADF에서 Fli1을 표적화한다는 개념에 대한 직접적인 뒷받침은 miR-200b 모방체(감소된 FLI1 존재비) 또는 억제제(증가된 FLI1 존재비)를 사용한 연구로부터 얻어졌다. 마지막으로, Fli1 전사체 존재비의 억제는 VF에서 FLI1을 상향조절하는 miR-200b의 능력뿐만 아니라 뒤이어 일어나는 마트리겔™ 튜브 형성의 기능에서 혈관형성 획득을 현저하게 둔화시켰다. 이러한 관찰은 시험관내에서 HADF에서 miR-200b의 억제가 FLI1 의존적인 VF 상태 변화를 유도하기 위해 내피 분화 및 혈관신생에 일반적인 분자 경로를 활용한다.
온전한 뮤린 피부에서 miR-200b 억제의 효과를 평가하기 위해, LNA 항 miR-200b를 국소적으로 적용하여 피부 관류의 일시적인 증가만을 유발하였고, 이는 miR-200b 억제 단독이 잘 관류된 정상산소(normoxic) 온전한 피부에서 지속적인 혈관신생 결과를 유발하지 않는다는 것을 입증한다. 그러나, 생성된 상처에서와 같은 파괴된 피부 혈관계의 조건 하에서, 상처 가장자리 조직에서의 miR-200b 억제는 치유 캐스케이드의 구성요소로서 생리적 반응을 구성하고 9일에 상처 가장자리에서 최고조에 달하는 증가된 FLI1 존재비로 이어진다. 섬유아세포 특이적 Fli1 전사체 존재비는 섬유아세포 특이적 Fsp1-Cre:R26RtdTomato 이식 리포터 마우스에서 loxP 측접된 Fli1 shRNA 발현 카세트의 렌티바이러스 입자 주입에 의해 뮤린 피부에서 감소되었고, 상처 가장자리 피부 섬유아세포에서의 Fli1 넉다운은 상처 관류를 현저히 지연시키며 상처 봉합을 손상시켰다. FLI1의 섬유아세포 표적화된 넉다운의 조건 하에서, miR-200b의 억제는 VF 세포 상태 전환을 가져오지 못하였다.
대조적으로, 피부 상처가 섬유아세포 계통 추적 Fsp1-Cre:R26RtdTomato 마우스에서 발생하고 LNA 항-miR-200b로 형질감염되는 경우, 상처 가장자리 조직은 VF 특징을 나타내는 섬유아세포 계통 표시 세포의 현저한 존재비를 나타내었다. 따라서, 상처 후 발생하는 miR-200b 억제 및 상처 가장자리에서 FLI1의 증가된 발현은 생리학적 반응이며 VF 상태 변화를 겪는 상처 가장자리 피부 섬유아세포에 국소화될 수 있다.
miR-200b 억제의 치료적 중요성을 시험하기 위해, 본 발명자들은 C57BL6 마우스의 허혈성 뒷다리를 연구하였다. miR-200b의 조직 나노형질감염(TNT) 기반 ASO 억제는 허혈성 뒷다리에서 관류 및 대사를 구제하였다. 마이크로 CT 이미징은 miR-200b 억제 후 피부 미세혈관의 발아(sprouting)를 밝혀내었다. 흥미롭게도, 손상 부위에서의 혈관형성 세포는 주로 섬유아세포로부터 유래되었으며 각질세포 및 대 식세포와 같은 다른 비내피 국소 세포로부터 유래되지 않았다. 피부 섬유아세포에서 miR-200b의 중요성을 구체적으로 시험하기 위해 miR-200b-429fl/fl-Col1a2CreER WT 및 타목시펜(TAM) 처리된 마우스에서 허혈성 뒷다리 연구를 또한 수행하였다. 섬유아세포에서 miR-200b의 타목시펜 처리된 조건부 넉아웃은 허혈성 다리에서 관류를 향상시켰고, CD31을 발현하는 VF의 증가된 존재비와 관련되었다.
피부 상처 치유에서 확인된 miR-200b 및 Fli1 축이 당뇨병 대상체에 존재하는지 여부를 평가하기 위해, 본 발명자들은 인간 환자에서 상처 가장자리 조직을 조사하였고 비당뇨병 대상체와 비교하여 당뇨병 대상체에서 지속적으로 상승된 miR 200b 존재비와 감소된 FLI1 전사체를 관찰하였다. 상처 부위에서 지속적으로 상승된 miR-200b가 VF 상태의 유도 및 관련된 상처 치유를 변경한다는 가설을 시험하기 위해, 스트렙토조토신 투여를 사용하여 섬유아세포 특이적 리포터 Fsp1-Cre:R26RtdTomato 마우스를 당뇨병이 있도록 만들었다. 이러한 당뇨병 마우스에서, 섬유아세포의 VF 상태로의 손상 유도되고 miR-200b 의존적인 생리학적 전환이 손상되었다.
유형 II 당뇨병의 또 다른 확립된 뮤린 모델인 db/db 마우스에서, 피부 상처는 인간 당뇨병 대상체와 유사하게 상처 가장자리에서 miR-200b 발현을 억제하지 못하였다. db/db 마우스의 상처 가장자리에서 ASO 의존적 강제 miR-200b 억제는 FLI1의 존재비를 증가시킨 후 상처 가장자리 조직에서 VF 세포 상태 변화로의 섬유아세포의 존재비를 증가시켰고, 유의하게 향상된 상처 관류 및 치유와 관련되었다.
따라서, 본 발명자들은 혈관신생촉진 VF 기능적 상태에서의 획득으로 섬유아세포의 세포 상태 변화를 유발하는 상처 치유 동안 피부 섬유아세포 Fli1 발현을 조절하는 miR-200b의 생리적인 역할을 확인하였다. 이 경로는 당뇨병 인간 및 뮤린 대상체에서 파괴되지만, 당뇨병 마우스에서 ASO의 TNT 전달의 사용을 통해 치유되어 손상된 피부에서 비정상적인 지속적으로 높은 miR-200b 수준을 FLI1의 발현이 상향 조절되고, VF 상태가 유도되며, 상처 관류 및 치유가 회복되는 지점까지 낮춘다.
현재 피부에서 생리학적으로 발생하는 것으로 알려져 있고 단일 ASO의 피부 TNT 전달에 의해 국소적으로 증대되어 당뇨병에서 무뎌진 경로를 구제할 수 있는, 섬유아세포에서의 행동 상태 변화를 유도하는 이러한 실험예는 재생 요법을 고려하기 위한 새로운 패러다임을 제시한다.
대체 단백질, 세포 또는 복합 조직의 주입 또는 이식의 접근법을 고려하기보다는, 알려진 후성유전학적 경로를 증가시키는 국소 접근법의 사용이 시험가능한 대안일 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Sen, Chandan Singh, Kanhaiya Roy, Sashwati Yoder, Mervin Tabasum, Saba Abou-Hashem,, Ahmed <120> VASCULOGENIC FIBROBLASTS <130> 83677-322025 <150> 62/903,130 <151> 2019-09-20 <150> 62/906,140 <151> 2019-09-26 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 catcattacc aggcatatt 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 caucauuacc aggcauauu 19

Claims (12)

  1. 원래의 섬유아세포에 비해 하나 이상의 혈관형성 특성을 나타내도록 인간 피부 섬유아세포를 재프로그래밍하는 방법으로서, 재프로그래밍된 세포는 섬유아세포 특이적 단백질-1(Fsp-1)을 발현하면서 적어도 다음의 특성:
    내피 세포(EC) 유사 형태학적 형상의 변화;
    세포 표면 혈관 내피 성장 인자 수용체-2(VEGFR2) 발현의 상향조절;
    혈소판 내피 세포 부착 분자 1(CD31)의 상향조절된 발현;
    내피 산화질소 합성효소(eNOS)의 상향조절;
    카드헤린 5(CDH5)의 상향조절, 및
    아세틸화된 저밀도 지질단백질(Ac-LDL)의 향상된 흡수
    를 나타내고;
    상기 방법은 상기 세포에서 기능성 miR-200b의 농도를 감소시키는 단계를 포함하는 것인 인간 피부 섬유아세포를 재프로그래밍하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, miR-200b 농도는 세포를 간섭 RNA로 형질감염시킴으로써 감소되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-miR-200b 올리고뉴클레오타이드가 인간 피부 섬유아세포의 시토졸 내로 전달되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 항-miR-200b 올리고뉴클레오타이드가 생체내에서 인간 피부 섬유아세포의 시토졸 내로 전달되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 전달이 조직 나노형질감염을 통한 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성되는 혈관형성 섬유아세포로서, 혈관형성 섬유아세포는
    섬유아세포 특이적 단백질-1(Fsp-1), 및
    혈관 내피 성장 인자 수용체-2(VEGFR2) 발현, 혈소판 내피 세포 부착 분자 1(CD31), 내피 산화질소 합성효소(eNOS) 및 카드헤린 5(CDH5)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질
    을 발현하는 것인 혈관형성 섬유아세포.
  7. 환자의 조직에서 신생혈관형성을 자극하는 방법으로서, 상기 방법은 생체내에서 피부 섬유아세포를 혈관형성이 되도록 재프로그래밍하는 단계를 포함하며, 상기 방법은
    상기 피부 섬유아세포를 항-miRNA-200b 올리고뉴클레오타이드와, 상기 항-miRNA-200b 올리고뉴클레오타이드의 세포 흡수를 향상시키는 조건 하에서 접촉시키는 단계
    를 포함하는 것인 환자의 조직에서 신생혈관형성을 자극하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 항-miR-200b 올리고뉴클레오타이드가 인간 피부 섬유아세포의 시토졸 내로 전달되는 것인 방법.
  9. 혈관형성 섬유아세포로서, 상기 섬유아세포는
    섬유아세포 특이적 단백질-1(Fsp-1), 및
    혈관 내피 성장 인자 수용체-2(VEGFR2) 발현, 혈소판 내피 세포 부착 분자 1(CD31), 내피 산화질소 합성효소(eNOS) 및 카드헤린 5(CDH5)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질
    을 발현하는 것인 혈관형성 섬유아세포.
  10. 제9항에 있어서, miRNA-200b를 표적화하는 간섭 RNA를 추가로 포함하는 혈관형성 섬유아세포.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 혈관형성 섬유아세포는 또한 내피 세포(EC) 유사 형태학적 형상을 나타내고 천연 피부 섬유아세포에 비해 아세틸화된 저밀도 지질단백질(Ac-LDL)의 향상된 흡수를 갖는 것인 혈관형성 섬유아세포.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관형성 섬유아세포는 상기 혈관 내피 성장 인자 수용체-2(VEGFR2) 발현, 혈소판 내피 세포 부착 분자 1(CD31), 내피 산화질소 합성효소(eNOS) 및 카드헤린 5(CDH5)의 각각을 발현하는 것인 혈관형성 섬유아세포.
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