KR20220057286A - Composition, kit and method for screening FAK inhibitor - Google Patents
Composition, kit and method for screening FAK inhibitor Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220057286A KR20220057286A KR1020200142383A KR20200142383A KR20220057286A KR 20220057286 A KR20220057286 A KR 20220057286A KR 1020200142383 A KR1020200142383 A KR 1020200142383A KR 20200142383 A KR20200142383 A KR 20200142383A KR 20220057286 A KR20220057286 A KR 20220057286A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cell line
- fak
- cancer
- cancer cell
- aspartic acid
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
- G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6806—Determination of free amino acids
- G01N33/6812—Assays for specific amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
- G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
본 명세서는 FAK 활성 억제제를 스크리닝하기 위한 조성물, 키트 및 방법을 개시한다.Disclosed herein are compositions, kits and methods for screening inhibitors of FAK activity.
표적치료제(target therapy)란 정상세포에는 거의 영향을 주지 않으면서 특정 질환과 관련된 세포의 성장, 분화, 증식을 유지하기 위해 필요한 단백질 경로의 특정 부위를 차단하여 특정 질환에 대한 치료 효과를 보이는 치료제로, 항암 치료제 분야에서 활발히 개발되어오고 있다. 신규 표적 항암제 개발에 있어서 주요한 후보 단백질로는 초점성 유착 인산화 효소(focal adhesion kinase, FAK)가 있다. 상기 FAK는 단백질 티로시나제 인산화 효소 2(protein tyrosine kinase 2, PTK2)로도 하며, 인체내에서 PTK2 유전자에 의해 인코딩된다. FAK는 초점접착-관련된 단백질 인산화효소로, 암의 성장과 전이 과정에서 주요한 역할을 하여, FAK를 억제할 수 있다면 암세포의 이동성이 감소되어 전이를 막을 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한 많은 연구에서 FAK의 비정상적 STAT3 활성화가 유방암 내에서 연결되어 있다는 연구가 보고되었다(Nana et al, 2019). Target therapy is a therapeutic agent that shows a therapeutic effect on a specific disease by blocking a specific site of a protein pathway necessary to maintain the growth, differentiation, and proliferation of cells related to a specific disease with little effect on normal cells. , has been actively developed in the field of anticancer drugs. A major candidate protein in the development of novel targeted anticancer drugs is focal adhesion kinase (FAK). The FAK is also referred to as protein tyrosine kinase 2 (PTK2), and is encoded by the PTK2 gene in the human body. FAK is known to be a focal adhesion-related protein kinase and plays a major role in cancer growth and metastasis. In addition, many studies have reported that aberrant STAT3 activation of FAK is linked in breast cancer (Nana et al, 2019).
신약개발 시 약물의 약효를 평가하기 위한 전 임상 연구는 주로 생체 외의 세포 실험과 동물실험을 이용하여 진행되고 있다. 세포를 이용한 약효 평가는 약물 후보 물질을 세포에 처리하여 세포의 성상학적 관찰, 염색, PCR(Polymerase Chain Reaction), 단백질 분석 등을 관찰하여 약효를 평가하는 것으로 동물 모델보다 간편하고 신속하며, 비용이 저렴하며 동물 윤리에 저촉되지 않는 등 많은 이점을 가지고 있다. 대사체학(metabolomics) 기법은 세포과정 중 발생하는 소분자 대사체 전체(metabolome)에 대하여 종합적인 연구가 가능한 학문이다. 이는 전체적인 세포 상태, 체계와 관련된 대사 상태 및 거시적 생화학적 사건 관측과 약효와 관련된 바이오마커 도출을 가능하게 한다(Yeung, 2018). 따라서 대사체학을 신약 개발 스크리닝에 도입하여 약물이 세포 내에서 적용하여 변하는 대사체들을 스크리닝 함으로써 후보 물질에 대한 정량 및 정성 평가를 동시에 대량 신속처리(High-throughput) 방식으로 평가할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 현재의 체학(omics)을 기반으로 한 바이오마커 시장은 유전체, 단백질체, 대사체를 모두 포함하지만 주로 유전체에 집중되어 있다. 그러나, 이 중 생체의 표현 형질에 가까운 물질로서 실질적인 약효를 확인할 수 있는 대사체를 이용한 신약 개발 스크리닝 시스템의 개발이 필요하다.Preclinical research to evaluate drug efficacy in developing new drugs is mainly conducted using in vitro cell tests and animal tests. Evaluating drug efficacy using cells is to evaluate drug efficacy by treating drug candidates to cells and observing cell astrology, staining, PCR (Polymerase Chain Reaction), protein analysis, etc. It has many advantages, such as being inexpensive and not violating animal ethics. Metabolomics is a study that enables comprehensive research on the entire small molecule metabolome that occurs during cellular processes. This makes it possible to observe the overall cellular state, system-related metabolic state and macroscopic biochemical events, and to derive biomarkers related to drug efficacy (Yeung, 2018). Therefore, by introducing metabolomics into new drug development screening and screening metabolites that change by applying drugs in cells, it has the advantage of being able to evaluate quantitative and qualitative evaluations of candidate substances in a high-throughput method at the same time. . The current biomarker market based on omics includes genomes, proteomic bodies, and metabolites, but is mainly focused on genomes. However, among them, it is necessary to develop a new drug development screening system using a metabolite that can confirm actual drug efficacy as a substance close to the phenotype of the living body.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 FAK 활성 억제제를 스크리닝하기 위한 대사체 바이오마커, 이를 포함하는 조성물, 키트를 제공하는 것이다. An object of the present invention is to provide a metabolite biomarker for screening FAK activity inhibitors, a composition comprising the same, and a kit.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 대사체를 사용한 FAK 활성 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a method for screening an inhibitor of FAK activity using a metabolite.
본 발명의 일 실시예는 n-아세틸-l-아스파르트산(n-acetyl-l-aspartic acid), 숙신산(succinic acid), L-아스파르트산(L-aspartic acid) 및 시트르산(citric acid) 중 하나 이상의 대사체를 검출하는 물질을 유효성분으로 포함하는 FAK (focal adhesion kinase) 활성 억제제의 스크리닝용 조성물을 제공한다.One embodiment of the present invention is one of n-acetyl-l-aspartic acid, succinic acid, L-aspartic acid and citric acid Provided is a composition for screening a FAK (focal adhesion kinase) activity inhibitor comprising a substance that detects abnormal metabolites as an active ingredient.
본 발명의 다른 일 실시예는, n-아세틸-l-아스파르트산(n-acetyl-l-aspartic acid), 숙신산(succinic acid), L-아스파르트산(L-aspartic acid) 및 시트르산(citric acid) 중 하나 이상의 대사체의 레벨(level) 측정부를 포함하는 FAK(focal adhesion kinase) 활성 억제제의 스크리닝 키트를 제공한다.Another embodiment of the present invention, n-acetyl-l-aspartic acid, succinic acid, L-aspartic acid and citric acid It provides a screening kit for inhibitors of focal adhesion kinase (FAK) activity comprising a level measurement unit of one or more metabolites.
본 발명의 다른 일 실시예는, FAK 과발현 세포주 및 암 세포주 중 하나 이상의 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계; 후보 물질을 처리한 상기 세포주 내 n-아세틸-l-아스파르트산(n-acetyl-l-aspartic acid), 숙신산(succinic acid), L-아스파르트산(L-aspartic acid) 및 시트르산(citric acid) 중 하나 이상의 대사체의 레벨(level)을 측정하는 단계; 및 측정한 n-아세틸-l-아스파르트산, 숙신산, L-아스파르트산 및 시트르산 중 하나 이상의 대사체의 레벨을 후보 물질 처리 전의 레벨과 비교하는 단계를 포함하는, FAK (focal adhesion kinase) 활성 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.Another embodiment of the present invention comprises the steps of: treating a candidate substance to one or more of the FAK-overexpressing cell line and the cancer cell line; Among n-acetyl-l-aspartic acid, succinic acid, L-aspartic acid and citric acid in the cell line treated with the candidate substance measuring the level of one or more metabolites; and comparing the measured level of one or more metabolites of n-acetyl-l-aspartic acid, succinic acid, L-aspartic acid and citric acid with the level before treatment with a candidate substance. A screening method is provided.
본 발명의 일 실시예들은 FAK 억제 효과를 스크리닝할 수 있는 대사체 바이오마커를 제공할 수 있다. 상기 대사체 바이오마커를 포함하는 스크리닝용 조성물, 키트 또는 스크리닝 방법을 사용하면 표적 항암제 개발에 있어 기존 유전체, 단백질체 등을 사용한 생체 외(in vitro) 스크리닝 방법보다 효율적으로 신약 기능을 예측할 수 있으며, 동물윤리법에 저촉되지 않고, 동시 정량/정성법으로 간편하고 신속하게 대량으로 분석할 수 있어, 신약 스크리닝 및 연구 개발에 유용하다. Embodiments of the present invention may provide a metabolite biomarker capable of screening the FAK inhibitory effect. When the screening composition, kit or screening method containing the metabolite biomarker is used, it is possible to predict the function of a new drug more efficiently than the in vitro screening method using the existing genome or protein body in the development of a target anticancer drug, and It does not conflict with the ethical law, and it is useful for new drug screening and R&D because it can be easily and quickly analyzed in large quantities using simultaneous quantitative/qualitative methods.
도 1은 본 발명의 일 구현예로서 FAK 활성 억제제 PF-573228을 유방암(MCF-7) 세포주에 처리한 후 12시간 경과시 세포 생존율 분석한 결과를 도시한 것이다.(***: P≤0.001, **: P≤0.01, *: p≤0.05)
도 2는 본 발명의 일 구현예로서 FAK 활성 억제제 PF-573228을 유방암(MCF-7) 세포주에 처리한 후 24시간 경과시 세포 생존율 분석한 결과를 도시한 것이다.(***: P≤0.001, **: P≤0.01, *: p≤0.05)
도 3은 본 발명의 일 구현예로서 FAK 활성 억제제 PF-573228을 유방암(MCF-7) 세포주에 처리한 후 48시간 경과시 세포 생존율 분석한 결과를 도시한 것이다.(***: P≤0.001, **: P≤0.01, *: p≤0.05)
도 4는 본 발명의 일 구현예로서 FAK 활성 억제제 PF-562271을 유방암(MCF-7) 세포주에 처리한 후 12시간 경과시 세포 생존율 분석한 결과를 도시한 것이다.(***: P≤0.001, **: P≤0.01, *: p≤0.05)
도 5는 본 발명의 일 구현예로서 FAK 활성 억제제 PF-562271을 유방암(MCF-7) 세포주에 처리한 후 24시간 경과시 세포 생존율 분석한 결과를 도시한 것이다.(***: P≤0.001, **: P≤0.01, *: p≤0.05)
도 6은 본 발명의 일 구현예로서 FAK 활성 억제제 PF-562271을 유방암(MCF-7) 세포주에 처리한 후 48시간 경과시 세포 생존율 분석한 결과를 도시한 것이다.(***: P≤0.001, **: P≤0.01, *: p≤0.05)
도 7은 본 발명의 일 구현예로서 FAK 활성 억제제 PF-573228를 처리한 유방암(MCF-7) 세포주의 대사체 변화를 초고성능 액체크로마토그래피 질량분석기(ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry, UHPLC-MS)를 이용하여 positive mode에서 분석한 결과를 도시한 것이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예로서 FAK 활성 억제제 PF-562271를 처리한 유방암(MCF-7) 세포주의 대사체 변화를 초고성능 액체크로마토그래피 질량분석기(ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry, UHPLC-MS)를 이용하여 positive mode에서 분석한 결과를 도시한 것이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예로서 상기 도 7 및 8의 결과 값 중 12시간 경과시의 값을 PLS-DA(Partial Least Squares Discriminant Analysis) 통계처리한 결과를 도시한 것이다.
도 10은 본 발명의 일 구현예로서 상기 도 7 및 8의 결과 값 중 24시간 경과시의 값을 PLS-DA(Partial Least Squares Discriminant Analysis) 통계처리한 결과를 도시한 것이다.
도 11은 본 발명의 일 구현예로서 상기 도 7 및 8의 결과 값 중 48시간 경과시의 값을 PLS-DA(Partial Least Squares Discriminant Analysis) 통계처리한 결과를 도시한 것이다.
도 12는 본 발명의 일 구현예로서 상기 도 9의 통계처리 결과값을 보정한 데이터에 대하여 t검증을 수행한 결과 FAK 활성 억제제 처리시 유의하게 변화한 대사체들을 히트맵(heatmap)으로 도시한 것이다.
도 13은 본 발명의 일 구현예로서 상기 도 9의 통계처리 결과값을 보정한 데이터에 대하여 t검증을 수행한 결과 FAK 활성 억제제 처리시 유의하게 변화한 대사체인 L-아스파르트산(L-Aspartic acid)의 변화량을 상자 수염 그림으로 도시한 것이다.(***: P≤0.001, **: P≤0.01, *: p≤0.05)
도 14는 본 발명의 일 구현예로서 상기 도 9의 통계처리 결과값을 보정한 데이터에 대하여 t검증을 수항한 결과 FAK 활성 억제제 처리시 유의하게 변화한 대사체인 N-아세틸-L-아스파르트산(N-Acetyl-L-aspartic acid)의 변화량을 상자 수염 그림으로 도시한 것이다.(***: P≤0.001, **: P≤0.01, *: p≤0.05)
도 15는 본 발명의 일 구현예로서 상기 도 9의 통계처리 결과값을 보정한 데이터에 대하여 t검증을 수항한 결과 FAK 활성 억제제 처리시 유의하게 변화한 대사체인 숙신산(Succinic acid)의 변화량을 상자 수염 그림으로 도시한 것이다.(***: P≤0.001, **: P≤0.01, *: p≤0.05)
도 16은 본 발명의 일 구현예로서 상기 도 9의 통계처리 결과값을 보정한 데이터에 대하여 t검증을 수항한 결과 FAK 활성 억제제 처리시 유의하게 변화한 대사체인 시트르산(Citric acid)의 변화량을 상자 수염 그림으로 도시한 것이다.(***: P≤0.001, **: P≤0.01, *: p≤0.05)
도 17은 본 발명의 일 구현예들에 따른 대사체들을 MetaboAnalyst 프로그램 대사경로 분석한 결과 도출된 공통 경로인 알라닌, 아스파르테이트 및 글루타메이트 대사경로(alanine, aspartate and glutamate metabolic pathway) 및 시트르산 회로(citric acid cycle; TCA cycle)를 도시한 것이다.1 shows the results of cell viability analysis at 12 hours after treatment with a breast cancer (MCF-7) cell line with the FAK activity inhibitor PF-573228 as an embodiment of the present invention. (***: P≤0.001 , **: P≤0.01, *: p≤0.05)
Figure 2 shows the results of analysis of cell viability 24 hours after treatment with the FAK activity inhibitor PF-573228 in a breast cancer (MCF-7) cell line as an embodiment of the present invention. (***: P≤0.001 , **: P≤0.01, *: p≤0.05)
Figure 3 shows the results of analysis of cell viability 48 hours after treatment of the FAK activity inhibitor PF-573228 in a breast cancer (MCF-7) cell line as an embodiment of the present invention. (***: P≤0.001 , **: P≤0.01, *: p≤0.05)
4 shows the results of cell viability analysis at 12 hours after treatment with the FAK activity inhibitor PF-562271 in a breast cancer (MCF-7) cell line as an embodiment of the present invention. (***: P≤0.001 , **: P≤0.01, *: p≤0.05)
5 shows the results of analysis of cell viability 24 hours after treatment with the FAK activity inhibitor PF-562271 in a breast cancer (MCF-7) cell line as an embodiment of the present invention. (***: P≤0.001 , **: P≤0.01, *: p≤0.05)
6 shows the results of cell viability analysis after 48 hours of treatment with a breast cancer (MCF-7) cell line with the FAK activity inhibitor PF-562271 as an embodiment of the present invention. (***: P≤0.001 , **: P≤0.01, *: p≤0.05)
7 is a metabolite change of a breast cancer (MCF-7) cell line treated with the FAK activity inhibitor PF-573228 as an embodiment of the present invention by ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry (UHPLC); -MS) shows the results of analysis in positive mode.
8 is a metabolite change of a breast cancer (MCF-7) cell line treated with the FAK activity inhibitor PF-562271 as an embodiment of the present invention by ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry (UHPLC); -MS) shows the results of analysis in positive mode.
FIG. 9 is a view showing the results of PLS-DA (Partial Least Squares Discriminant Analysis) statistical processing of the 12-hour elapsed values among the result values of FIGS. 7 and 8 as an embodiment of the present invention.
FIG. 10 shows the results of PLS-DA (Partial Least Squares Discriminant Analysis) statistical processing of the values after 24 hours among the result values of FIGS. 7 and 8 as an embodiment of the present invention.
11 is a view showing the results of PLS-DA (Partial Least Squares Discriminant Analysis) statistical processing of the values after 48 hours among the result values of FIGS. 7 and 8 as an embodiment of the present invention.
12 is a heatmap showing metabolites significantly changed during FAK activity inhibitor treatment as a result of performing t-verification on the data corrected for the statistical processing result of FIG. 9 as an embodiment of the present invention. will be.
13 is a metabolite of L-aspartic acid (L-Aspartic acid), which is a metabolite significantly changed during FAK activity inhibitor treatment as a result of performing t-verification on the data corrected for the statistical processing result of FIG. 9 as an embodiment of the present invention. ) is shown as a box and whisker plot. (***: P≤0.001, **: P≤0.01, *: p≤0.05)
14 is a metabolite of N-acetyl-L-aspartic acid (N-acetyl-L-aspartic acid ( The change amount of N-Acetyl-L-aspartic acid) is shown as a box and whisker figure. (***: P≤0.001, **: P≤0.01, *: p≤0.05)
15 is a box showing the amount of change in succinic acid, a metabolite that is significantly changed when FAK activity inhibitor treatment is performed as a result of t-testing on the data corrected for the statistical processing result of FIG. 9 as an embodiment of the present invention It is shown as a mustache figure. (***: P≤0.001, **: P≤0.01, *: p≤0.05)
16 is a box showing the amount of change in citric acid, a metabolite that is significantly changed during FAK activity inhibitor treatment, as a result of performing t-test for the data corrected for the statistical processing result of FIG. 9 as an embodiment of the present invention. It is shown as a mustache figure. (***: P≤0.001, **: P≤0.01, *: p≤0.05)
17 is a diagram showing alanine, aspartate and glutamate metabolic pathways, which are common pathways derived as a result of analyzing the MetaboAnalyst program metabolic pathway of metabolites according to embodiments of the present invention, and citric acid cycle acid cycle (TCA cycle) is shown.
이하, 본 발명의 실시예들을 보다 상세하게 설명하고자 한다. Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail.
본문에 개시되어 있는 본 발명의 실시예들은 단지 설명을 위한 목적으로 예시된 것으로서, 본 발명의 실시예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본문에 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 실시예들은 본 발명을 특정한 개시 형태로 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다. The embodiments of the present invention disclosed in the text are illustrated for the purpose of explanation only, and the embodiments of the present invention may be embodied in various forms and should not be construed as being limited to the embodiments described in the text. . The present invention can make various changes and can have various forms, and the embodiments are not intended to limit the present invention to a specific disclosed form, and all changes, equivalents or substitutes included in the spirit and scope of the present invention should be understood as including
단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것으로, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 배제되지 않는다.The singular expression includes the plural expression unless the context clearly dictates otherwise. In the present application, terms such as "comprise" or "have" are intended to designate that a feature, number, step, operation, component, part, or a combination thereof described in the specification exists, and one or more other features The possibility of the presence or addition of numbers, steps, acts, components, parts, or combinations thereof is not excluded.
본 발명의 일 실시예는 n-아세틸-l-아스파르트산(n-acetyl-l-aspartic acid), 숙신산(succinic acid), L-아스파르트산(L-aspartic acid) 및 시트르산(citric acid) 중 하나 이상의 대사체를 검출하는 물질을 유효성분으로 포함하는 FAK(focal adhesion kinase) 활성 억제제의 스크리닝용 조성물을 제공한다.One embodiment of the present invention is one of n-acetyl-l-aspartic acid, succinic acid, L-aspartic acid and citric acid Provided is a composition for screening a FAK (focal adhesion kinase) activity inhibitor comprising a substance that detects abnormal metabolites as an active ingredient.
본 발명의 다른 일 실시예는 n-아세틸-l-아스파르트산(n-acetyl-l-aspartic acid), 숙신산(succinic acid), L-아스파르트산(L-aspartic acid) 및 시트르산(citric acid) 중 하나 이상의 대사체의 레벨(level) 측정부를 포함하는 FAK(focal adhesion kinase) 활성 억제제의 스크리닝 키트를 제공한다.Another embodiment of the present invention is n-acetyl-l-aspartic acid, succinic acid, L-aspartic acid, and citric acid. It provides a screening kit for inhibitors of focal adhesion kinase (FAK) activity comprising a level measurement unit of one or more metabolites.
본 명세서에서, 상기 '스크리닝'은 특정한 물질 또는 성분을 선별 및/또는 검출하는 것을 의미하며, 그 방법과 대상에 제한되지 않는다. In the present specification, the 'screening' means selecting and/or detecting a specific substance or component, and the method and subject are not limited thereto.
일 실시예에서 상기 '대사체를 검출하는 물질'은 n-아세틸-l-아스파르트산, 숙신산, L-아스파르트산 및 시트르산 중 적어도 어느 하나를 포함하는 대사체를 검출할 수 있는 물질이라면 제한되지 않고 모두 포함되며, 예를 들어 항체, ELISA 키트 내 효소 등을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는 시트르산을 이용한 시트르산 검정 키트(Citric Acid Assay Kit; Megazyme사, #K-CITR), 숙시네이트 비색 검정 키트(Succinate Colorimetric Assay Kit; Merck사, #MAK184) 및 아스파르테이트 검정 키트(Aspartate Assay Kit; Abcam사, #ab102512) 등일 수 있다. In one embodiment, the 'substance detecting a metabolite' is not limited as long as it is a substance capable of detecting a metabolite including at least one of n-acetyl-1-aspartic acid, succinic acid, L-aspartic acid, and citric acid. All are included, and may include, for example, an antibody, an enzyme in an ELISA kit, and the like. More specifically, a citric acid assay kit (Citric Acid Assay Kit; Megazyme, #K-CITR) using citric acid, a succinate colorimetric assay kit (Merck, #MAK184) and an aspartate assay kit (Aspartate) Assay Kit; Abcam, #ab102512) and the like.
일 실시예에서 상기 '대사체의 레벨'은 시료내 포함되는 대사체의 농도, 질량 등의 객관적인 수치 또는 상대적 수치를 모두 포함하는 의미이며, 그 수치의 종류에 제한되지 않는다. 일 실시예에서 상기 '대사체의 레벨 측정부'는 본 발명의 일 실시예들에 따른 스크리닝용 조성물을 포함하는 것일 수 있다.In one embodiment, the 'metabolite level' includes all objective or relative values such as the concentration and mass of the metabolite contained in the sample, and is not limited to the type of the value. In one embodiment, the 'metabolite level measurement unit' may include the composition for screening according to embodiments of the present invention.
일 실시예에서 상기 조성물은 FAK 과발현 세포주 및 암 세포주 중 하나 이상을 유효성분으로 더 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 키트는 FAK 과발현 세포주 및 암 세포주 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다. In one embodiment, the composition may further include one or more of a FAK-overexpressing cell line and a cancer cell line as an active ingredient. In one embodiment, the kit may further include one or more of a FAK-overexpressing cell line and a cancer cell line.
종래에는 특정 질병에 대한 효능을 갖는 물질을 스크리닝하기 위하여 특정 질병인자가 과발현되어 있는 세포주에서 실험하는 것이 일반적이었으나, 질병의 종류가 변할 때마다 과발현 세포주를 제조하거나 구매해야 하므로, 구입에 드는 고가의 비용뿐만 아니라 특정 질병이 과발현된 세포주에 대한 검증과 구입의 어려움이 항상 존재하였다. 그러나 본 발명의 일 실시예는 FAK 활성 억제제를 스크리닝하는데 있어 FAK 과발현 세포주뿐만 아니라 본 기술분야의 실험에서 보편적으로 쓰이며 배양 조건이 까다롭지 않은 세포주인 암세포주를 포함할 수 있어, 상기와 같은 어려움을 해결하였다.Conventionally, in order to screen a substance having efficacy against a specific disease, it is common to test on a cell line in which a specific disease factor is overexpressed. In addition to cost, there has always been a difficulty in verifying and purchasing a cell line overexpressing a specific disease. However, an embodiment of the present invention may include not only FAK-overexpressing cell lines in screening for inhibitors of FAK activity, but also cancer cell lines, which are commonly used in experiments in the art and are not difficult to culture conditions, so as to overcome the above difficulties. Solved.
일 실시예로서, 상기 암 세포주는 유방암 세포주, 난소암 세포주, 췌장암 세포주, 폐암 세포주 및 대장암 세포주 중 하나 이상을 포함할 수 있으나 암의 종류에 제한되지 않는다. 또한 상기 암 세포주는 FAK 과발현 여부에 제한되지 않는다. 구체적으로, 일 실시예로서, 상기 유방암종 세포주는 유방상피내암 세포주(유방암상피세포주)일 수 있고, 구체적으로는 MCF-7 세포주, MDA-MB-231 세포주, SK-BR-3 세포주 등을 예로 들 수 있다. 본 발명에서 사용한 MCF-7 세포주는 기탁번호 KCTC 13643BP로 기탁하였다.As an embodiment, the cancer cell line may include one or more of a breast cancer cell line, an ovarian cancer cell line, a pancreatic cancer cell line, a lung cancer cell line, and a colorectal cancer cell line, but the type of cancer is not limited. In addition, the cancer cell line is not limited to overexpression of FAK. Specifically, as an embodiment, the breast carcinoma cell line may be a breast carcinoma cell line (breast cancer epithelial cell line), specifically, MCF-7 cell line, MDA-MB-231 cell line, SK-BR-3 cell line, etc. can be heard The MCF-7 cell line used in the present invention was deposited with accession number KCTC 13643BP.
일 실시예로서, 상기 '과발현'은 FAK의 발현 레벨이 각 조직의 정상 세포와 비교하여 1.1 배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상, 1.5배 이상, 1.6배 이상, 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 2.0배 이상, 2.5배 이상, 3배 이상, 3.5배 이상, 4배 이상, 4.5배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 25배 이상, 30배 이상, 35배 이상, 40배 이상, 45배 이상, 50배 이상 더 높은 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In one embodiment, the 'overexpression' indicates that the expression level of FAK is 1.1 times or more, 1.2 times or more, 1.3 times or more, 1.4 times or more, 1.5 times or more, 1.6 times or more, 1.7 times or more compared to normal cells of each tissue. , 1.8 times or more, 1.9 times or more, 2.0 times or more, 2.5 times or more, 3 times or more, 3.5 times or more, 4 times or more, 4.5 times or more, 5 times or more, 10 times or more, 15 times or more, 20 times or more, 25 It may mean more than twice, more than 30 times, more than 35 times, more than 40 times, more than 45 times, more than 50 times, but is not limited thereto.
일 실시예로서, 상기 FAK 활성 억제제는 암 치료제일 수 있다. 상기 암 치료제는 예를 들어 유방암, 난소암, 췌장암, 대장암, 폐암 및 파킨슨병 중 하나 이상에 대한 치료제를 포함할 수 있다. 일 예시로서, FAK와 유방암과의 연관성은 "Frank Aboubakar Nana et al., Role of Focal Adhesion Kinase in Small-Cell Lung Cancer and Its Potential as a Therapeutic Target, Cancers (basel), 2019", "Rigiracciolo et al., Focal adhesion kinase (FAK) activation by estrogens involves GPER in triple-negative breast cancer cells, Journal of Experimental & Clinical Cancer Research (2019) 38:58" 및 "Napoleon Navarro-Tito et al., Arachidonic acid promotes FAK activation and migration in MDA-MB-231 breast cancer cells, Experimental cell research, 314(2008), 3340-3355"에 보고되었다. 일 예시로서, FAK와 난소암과의 연관성은 "Anil K. Sood et al., Biological Significance of Focal Adhesion Kinase in Ovarian Cancer , American Journal of Pathology, Vol. 165, No. 4, October 2004"에 보고되었다. 일 예시로서, FAK와 췌장암과의 연관성은 "Rajani Kanteti et al., Focal adhesion kinase a potential therapeutic target for pancreatic cancer and malignant pleural mesothelioma, CANCER BIOLOGY & THERAPY, 2018, VOL. 19, NO. 4, 316-327"에 보고되었다. 일 예시로서, FAK와 대장암과의 연관성은 "Keun-Yeong Jeong., Inhibiting focal adhesion kinase: A potential target for enhancing therapeutic efficacy in colorectal cancer therapy, World J Gastrointest Oncol 2018 October 15; 10(10): 290-292"에 보고되었다. 일 예시로서, FAK와 폐암과의 연관성은 "Frank Aboubakar Nana et al., Increased Expression and Activation of FAK in Small-Cell Lung Cancer Compared to Non-Small-Cell Lung Cancer, Cancers 2019, 11, 1526"에 보고되었다. 일 예시로서, FAK와 파킨슨병과의 연관성은 "Insup Choi et al., LRRK2 G2019S mutation attenuates microglial motility by inhibiting focal adhesion kinase, NATURE COMMUNICATIONS, 2015"에서 보고되었다. 상기 문헌들은 그 전체가 본 명세서에 참조로 통합된다.In one embodiment, the FAK activity inhibitor may be a cancer therapeutic agent. The cancer therapeutic agent may include, for example, a therapeutic agent for one or more of breast cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer, lung cancer, and Parkinson's disease. As an example, the association between FAK and breast cancer is "Frank Aboubakar Nana et al ., Role of Focal Adhesion Kinase in Small-Cell Lung Cancer and Its Potential as a Therapeutic Target, Cancers (basel), 2019", "Rigiracciolo et al . ., Focal adhesion kinase (FAK) activation by estrogens involves GPER in triple-negative breast cancer cells, Journal of Experimental & Clinical Cancer Research (2019) 38:58” and “Napoleon Navarro-Tito et al ., Arachidonic acid promotes FAK activation and migration in MDA-MB-231 breast cancer cells, Experimental cell research, 314 (2008), 3340-3355". As an example, the association between FAK and ovarian cancer was reported in "Anil K. Sood et al. , Biological Significance of Focal Adhesion Kinase in Ovarian Cancer, American Journal of Pathology, Vol. 165, No. 4, October 2004" . As an example, the association between FAK and pancreatic cancer is "Rajani Kanteti et al., Focal adhesion kinase a potential therapeutic target for pancreatic cancer and malignant pleural mesothelioma, CANCER BIOLOGY & THERAPY, 2018, VOL. 19, NO. 4, 316- 327" was reported. As an example, the association between FAK and colorectal cancer is “Keun-Yeong Jeong., Inhibiting focal adhesion kinase: A potential target for enhancing therapeutic efficacy in colorectal cancer therapy, World J Gastrointest Oncol 2018 October 15; 10(10): 290 -292". As an example, the association between FAK and lung cancer is reported in "Frank Aboubakar Nana et al ., Increased Expression and Activation of FAK in Small-Cell Lung Cancer Compared to Non-Small-Cell Lung Cancer,
일 실시예로서 상기 FAK 활성 억제제는 PF-573228, PF-562271, NVP-226, Y15 (1,2,4,5-benzenetetraamine tetrahydrochloride), PND-1186, VS-6063, VS-4718, GSK2256098, 디펙티닙(defactinib) 등을 포함할 수 있으나, FAK 활성을 저해할 수 있는 것이라면 이에 제한되지 않고 모두 포함될 수 있다. In one embodiment, the FAK activity inhibitor is PF-573228, PF-562271, NVP-226, Y15 (1,2,4,5-benzenetetraamine tetrahydrochloride), PND-1186, VS-6063, VS-4718, GSK2256098, DEPEC It may include tinib (defactinib) and the like, but is not limited thereto, as long as it can inhibit FAK activity, and all may be included.
일 실시예에서 상기 n-아세틸-l-아스파르트산, 숙신산, L-아스파르트산 및 시트르산은 모두 알라닌, 아스파르테이트 및 글루타메이트 대사경로(alanine, aspartate and glutamate metabolic pathway) 및 시트르산 회로(citric acid cycle; TCA cycle)의 대사 경로에 공통적으로 관여한다. 도 18은 상기 두 대사 경로에 관하여 도시한 것이다. 일 실시예로서, 상기 FAK 활성 억제제에 의해 FAK 활성이 억제되면 n-아세틸-l-아스파르트산, 숙신산 및 L-아스파르트산의 세포내에서 레벨은 감소하며, 시트르산의 세포내 레벨은 증가한다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따르면 이들의 공통적인 대사경로를 참고하여 전임상 생체외(in vitro) 세포 실험에서 FAK 활성 억제제의 효능을 스크리닝할 수 있다. In one embodiment, the n-acetyl-l-aspartic acid, succinic acid, L-aspartic acid and citric acid are all selected from the alanine, aspartate and glutamate metabolic pathways and the citric acid cycle; It is commonly involved in metabolic pathways of the TCA cycle). 18 shows the two metabolic pathways. In one embodiment, when the FAK activity is inhibited by the FAK activity inhibitor, the intracellular levels of n-acetyl-l-aspartic acid, succinic acid and L-aspartic acid decrease, and the intracellular level of citric acid increases. Therefore, according to an embodiment of the present invention, the efficacy of FAK activity inhibitors can be screened in preclinical in vitro cell experiments with reference to their common metabolic pathways.
본 발명의 상기 키트는, 일 실시예로서 상기 대사체 레벨 측정부에서 측정된 대사체들의 레벨을 분석하는 다변량 분석(multivariate analysis) 시스템을 더 포함할 수 있다. 일 실시예로서 상기 다변량 분석 시스템은 FAK 활성 억제에 효과가 있는 후보 물질에 의하여 대상이 되는 세포주에서 특이적으로 변화하는 4종 이상의 대사체들 중 둘 이상의 체내 레벨 변화를 동시에 분석하는 통계적 시스템을 의미한다.The kit of the present invention, as an embodiment, may further include a multivariate analysis system for analyzing the levels of metabolites measured by the metabolite level measurement unit. As an embodiment, the multivariate analysis system refers to a statistical system that simultaneously analyzes changes in the body level of two or more of four or more metabolites that are specifically changed in a target cell line by a candidate substance effective in inhibiting FAK activity do.
일 실시예에서, 상기 키트는 FAK 활성 억제제를 스크리닝할 수 있는 방법, 또는 스크리닝 대상이 되는 대사체에 대한 설명을 포함하는 지시서를 더 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 지시서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있으며, 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함하는 안내서 등을 더 포함할 수 있다.In one embodiment, the kit may further include instructions including a method for screening a FAK activity inhibitor or a metabolite to be screened. For example, the instruction may include a brochure in the form of a pamphlet or leaflet, a label attached to the kit, and instructions on the surface of a package including the kit. It may further include a guide and the like.
본 발명의 일 실시예는 FAK 활성 억제제의 스크리닝 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은, FAK 과발현 세포주 및 암 세포주 중 하나 이상의 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계; 후보 물질을 처리한 상기 세포주 내 n-아세틸-l-아스파르트산, 숙신산, L-아스파르트산 및 시트르산 중 하나 이상의 대사체의 레벨(level)을 측정하는 단계; 및 측정한 n-아세틸-l-아스파르트산, 숙신산, L-아스파르트산 및 시트르산 중 하나 이상의 대사체의 레벨을 후보 물질 처리 전의 레벨과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.One embodiment of the present invention may provide a method for screening an inhibitor of FAK activity, the method comprising: treating a candidate substance to one or more of a FAK-overexpressing cell line and a cancer cell line; measuring the level of one or more metabolites of n-acetyl-1-aspartic acid, succinic acid, L-aspartic acid and citric acid in the cell line treated with the candidate substance; and comparing the measured level of one or more metabolites of n-acetyl-1-aspartic acid, succinic acid, L-aspartic acid and citric acid with the level before treatment with the candidate substance.
일 실시예로서, 상기 후보 물질 처리 전 후의 대사체의 레벨 변화값에 대하여 t-검증을 수행한 후 p값이 0.15 이하, 0.14 이하, 0.13 이하, 0.12 이하, 0.11 이하, 0.1 이하, 0.09 이하, 0.08 이하, 0.07 이하, 0.06 이하, 0.05 이하, 0.04 이하, 0.03 이하, 0.02, 0.01 이하의 값을 나타낼 때 그 물질을 유의적인 변화를 나타내는 대사체로 분류할 수 있다. 보다 구체적으로는 0.05 이하의 값을 나타낼 때 그 물질을 유의적인 변화를 나타내는 것으로 분류할 수 있다.As an embodiment, after performing t-verification on the level change value of the metabolite before and after treatment with the candidate substance, the p value is 0.15 or less, 0.14 or less, 0.13 or less, 0.12 or less, 0.11 or less, 0.1 or less, 0.09 or less, When the values are 0.08 or less, 0.07 or less, 0.06 or less, 0.05 or less, 0.04 or less, 0.03 or less, 0.02 or 0.01 or less, the substance can be classified as a metabolite showing a significant change. More specifically, when it shows a value of 0.05 or less, the substance can be classified as showing a significant change.
일 실시예는 상기 대사체의 레벨을 후보 물질 처리 전의 레벨과 비교하는 단계 후, 상기 세포주에서 상기 n-아세틸-l-아스파르트산, 숙신산 및 L-아스파르트산 중 하나 이상의 대사체의 레벨이 후보물질 처리 전과 비교하여 감소하면 후보물질을 FAK 인산화 효소 억제제로 적합하다고 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 세포주에서 상기 n-아세틸-l-아스파르트산, 숙신산 및 L-아스파르트산 중 하나 이상의 대사체의 레벨이 후보물질 처리 전과 비교하여 감소되는 정도는 후보물질의 FAK 활성 억제 정도에 따라 달라지므로 통계적으로 유의하게 감소한 것이라면 그 감소 정도에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 세포주에서 상기 n-아세틸-l-아스파르트산, 숙신산 및 L-아스파르트산 중 하나 이상의 대사체의 레벨이 후보물질 처리 전과 비교하여 감소되는 정도는 20% 이상, 22% 이상, 24% 이상, 26 % 이상, 28% 이상, 30% 이상, 32% 이상, 34% 이상, 36% 이상, 38% 이상, 40% 이상, 42% 이상, 44% 이상, 46% 이상, 48% 이상 또는 50% 이상 감소하는 것일 수 있다. In one embodiment, after comparing the level of the metabolite with the level before treatment with the candidate substance, the level of one or more metabolites of n-acetyl-l-aspartic acid, succinic acid and L-aspartic acid in the cell line is determined by the candidate substance. The method may further include determining that the candidate material is suitable as a FAK kinase inhibitor if it decreases compared to before the treatment. Specifically, the degree to which the level of one or more metabolites of n-acetyl-l-aspartic acid, succinic acid and L-aspartic acid in the cell line is reduced compared to before treatment with the candidate substance depends on the degree of inhibition of FAK activity of the candidate substance. Therefore, if it is a statistically significant decrease, it is not limited to the extent of the decrease. For example, the degree to which the level of one or more metabolites of n-acetyl-l-aspartic acid, succinic acid and L-aspartic acid is reduced in the cell line compared to before treatment with a candidate substance is 20% or more, 22% or more, 24 % or more, 26% or more, 28% or more, 30% or more, 32% or more, 34% or more, 36% or more, 38% or more, 40% or more, 42% or more, 44% or more, 46% or more, 48% or more Or it may be reduced by 50% or more.
일 실시예는 상기 대사체의 레벨을 후보 물질 처리 전의 레벨과 비교하는 단계 후, 상기 세포주에서 상기 시트르산의 레벨이 후보물질 처리 전과 비교하여 증가하면, 후보물질을 FAK 인산화 효소 억제제로 적합하다고 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 시트르산의 레벨을 후보 물질 처리 전의 레벨과 비교하는 단계 후, 증가되는 정도는 후보물질의 FAK 활성 억제 정도에 따라 달라지므로 통계적으로 유의하게 증가한 것이라면 그 증가 정도에 제한되지 않는다. 예를 들어 상기 시트르산의 레벨을 후보 물질 처리 전의 레벨과 비교하여 증가되는 정도는 120% 이상, 130% 이상, 140% 이상, 150% 이상, 160% 이상, 170% 이상, 180% 이상, 190% 이상, 200% 이상, 210% 이상, 220% 이상, 230% 이상 증가하는 것일 수 있다.In one embodiment, after comparing the level of the metabolite with the level before treatment with the candidate substance, if the level of citric acid in the cell line increases compared to before treatment with the candidate substance, it is determined that the candidate is suitable as a FAK kinase inhibitor It may include further steps. Specifically, after the step of comparing the level of citric acid with the level before treatment with the candidate substance, the degree of increase depends on the degree of inhibition of FAK activity of the candidate substance, so if it is statistically significantly increased, the degree of increase is not limited. For example, the degree of increase in the level of citric acid compared to the level before the candidate material treatment is 120% or more, 130% or more, 140% or more, 150% or more, 160% or more, 170% or more, 180% or more, 190% or more. It may be an increase of more than, 200% or more, 210% or more, 220% or more, 230% or more.
일 실시예로서 상기 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계에서 후보물질의 처리농도는 세포주에 후보 물질을 처리시 상기 4종의 대사체들 중 하나 이상의 레벨이 변화하는 농도라면 이에 제한되지 않고 모두 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 처리 농도는 0.01μM 이상, 0.1μM 이상, 0.2 μM 이상, 0.3 μM 이상, 0.4 μM 이상, 0.5 μM 이상, 0.6 μM 이상, 0.7 μM 이상, 0.8 μM 이상, 0.9 μM 이상, 1 μM 이상, 1.1μM 이상, 1.2 μM 이상, 1.3 μM 이상, 1.4 μM 이상 또는 1.5 μM 이상일 수 있다. 예를 들어, 상기 처리 농도는 10 μM 이하, 9 μM 이하, 8 μM 이하, 7 μM 이하, 6 μM 이하, 5 μM 이하, 4 μM 이하, 3 μM 이하, 2 μM 이하 또는 1 μM 이하일 수 있다.As an embodiment, in the step of treating the candidate material in the cell line, the treatment concentration of the candidate material is not limited thereto, and may include any concentration at which the level of one or more of the four metabolites changes when the cell line is treated with the candidate material. there is. For example, the treatment concentration may be 0.01 μM or greater, 0.1 μM or greater, 0.2 μM or greater, 0.3 μM or greater, 0.4 μM or greater, 0.5 μM or greater, 0.6 μM or greater, 0.7 μM or greater, 0.8 μM or greater, 0.9 μM or greater, 1 μM or greater. or more, 1.1 μM or more, 1.2 μM or more, 1.3 μM or more, 1.4 μM or more, or 1.5 μM or more. For example, the treatment concentration may be 10 μM or less, 9 μM or less, 8 μM or less, 7 μM or less, 6 μM or less, 5 μM or less, 4 μM or less, 3 μM or less, 2 μM or less, or 1 μM or less.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다. 또한, 본 명세서에 기재된 '또는' 이라는 표현은, 별도의 언급이 없다면, '및'을 포함하는 개념으로 이해하여야 할 것이다.Overlapping contents are omitted in consideration of the complexity of the present specification, and terms not defined otherwise in the present specification have the meanings commonly used in the art to which the present invention pertains. In addition, the expression 'or' described in this specification should be understood as a concept including 'and', unless otherwise stated.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예들에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
[실시예 1] FAK 활성 억제제의 암 세포주에 대한 세포 성장 저해 효과 분석[Example 1] Analysis of the cell growth inhibitory effect of FAK activity inhibitors on cancer cell lines
본 발명의 일 실시예로서, 암 세포주가 FAK 활성 억제제의 스크리닝에 유용한 세포주인지 판단하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 FAK 활성 억제제로서 PF-573228 및 PF-562271가 세포주의 생존율 억제 효과를 보이는지 확인하기 위하여, 다음의 실험을 실시하였다.As an embodiment of the present invention, it is determined whether a cancer cell line is a useful cell line for screening FAK activity inhibitors, and whether PF-573228 and PF-562271 as FAK activity inhibitors according to an embodiment of the present invention show an inhibitory effect on cell line viability To confirm, the following experiment was performed.
본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방식에 따라 CCK-8 검사를 수행하여 암 세포주에 대한 PF-573228 및 PF-562271의 성장 저해율을 확인하였다. 암 세포주로는 2018.9.17일자로 기탁번호 KCTC13643BP로 기탁된 MCF-7 유방암 세포주를 사용하였으며, PF-573228 (#PZ0117) 및 PF-562271 (#PZ0387)는 Sigma aldrich사 에서 구입하였다. 상기 CCK-8 검사방법은 D. M. Kuhn, et al., J. Clin. Microbiol., 41, 506, 2003에 기재된 바에 따르며, 상기 문헌은 본 명세서에 그 전체가 참조로서 통합된다. The growth inhibition rate of PF-573228 and PF-562271 against cancer cell lines was confirmed by performing a CCK-8 test according to a method commonly used in the art of the present invention. As the cancer cell line, the MCF-7 breast cancer cell line deposited under the accession number KCTC13643BP on September 17, 2018 was used, and PF-573228 (#PZ0117) and PF-562271 (#PZ0387) were purchased from Sigma aldrich. The CCK-8 test method is described in DM Kuhn, et al ., J. Clin. Microbiol., 41, 506, 2003, which is incorporated herein by reference in its entirety.
상기 MCF-7 세포를 37℃ 온도의 5% 이산화탄소 세포배양기에서 10 %의 소태아혈청과 1 %의 항생제가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 96 웰플레이트의 각 웰에 세포수가 3.1 x 103 개가 되도록 배양하였다. 상기 세포의 성장이 안정화된 후, 대조군으로 총 배지의 0.01%가 되는 양의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 12, 24, 48시간 동안 배양하고, 이를 대조군으로 하였다. 그리고 실험군으로는 상기 동일하게 세포가 배양된 배지에 FAK 활성 억제제인 PF-573228 또는 PF-562271을 처리농도가 0.01, 0.1, 1, 2.5 또는 10 μM가 되도록 각각 첨가한 뒤, 12, 24, 48시간 동안 배양하였다. 이 후, 상기 각 배지에 CCK-8 시약을 처리하고 1시간 배양한 후, ELISA 기기를 이용하여 흡광도 470 nm에서 측정하였다.The MCF-7 cells were incubated in a 5% carbon dioxide cell incubator at 37°C using DMEM medium containing 10% fetal bovine serum and 1% antibiotics so that the number of cells was 3.1 x 10 3 in each well of a 96-well plate. cultured. After the growth of the cells was stabilized, DMSO (dimethyl sulfoxide) in an amount of 0.01% of the total medium was added as a control and incubated for 12, 24, 48 hours, which was used as a control. And as the experimental group, after adding the FAK activity inhibitor PF-573228 or PF-562271 to the same cell culture medium so that the treatment concentration was 0.01, 0.1, 1, 2.5 or 10 μM, respectively, 12, 24, 48 incubated for hours. After that, each medium was treated with CCK-8 reagent and cultured for 1 hour, and then absorbance was measured at 470 nm using an ELISA device.
측정 결과에 따른 세포 성장 그래프를 도 1 내지 6에 각각 나타내었다. FAK 활성 억제제인 PF-573228 및 PF-562271 모두 48시간이 지난 후 농도 의존적으로 유의하게 세포 생존율을 감소시킴을 확인하였다(student’s t-test, p value <0.05). 구체적으로, PF-573228을 각 0.01, 0.1, 1, 10 μM 처리 후 48시간 배양 시 대조군 대비 세포 성장을 각 61.61%, 37.30%로 억제하여 유의적인 세포 성장 저해능을 보였다. PF-562271 또한 각 0.01, 0.1, 1, 2.5 μM 처리 후 48시간 배양 시 대조군 대비 세포 성장을 각 53.43%, 31.71%로 억제하여 유의적인 세포 성장 저해능을 보였다. 세포에 처리하는 최대 농도는 각 약물의 용해도를 고려하여 결정하였다. 두 FAK 활성 억제제 모두 유의적인 (student’s t-test, p value <0.001) 시간 의존적 세포 성장 저해능을 보였으므로, MCF-7 세포, 즉 암 세포주가 FAK 활성 억제제 스크리닝을 위한 대상 세포주로 적합하다고 평가되었다. 또한, 상기 두 FAK 활성 억제제를 처리했을 시 분석에 이용할 세포 양이 충분하고 유의적으로 세포 사멸이 일어난 1 μM을 이하의 실험에서 대사체 바이오마커 도출을 위한 세포처리 분석 농도로 정하였다. Cell growth graphs according to the measurement results are shown in FIGS. 1 to 6 , respectively. It was confirmed that both PF-573228 and PF-562271, which are inhibitors of FAK activity, significantly decreased cell viability in a concentration-dependent manner after 48 hours (student's t-test, p value <0.05). Specifically, when PF-573228 was treated with 0.01, 0.1, 1, and 10 μM, respectively, when incubated for 48 hours, cell growth was inhibited by 61.61% and 37.30%, respectively, compared to the control, showing significant cell growth inhibitory ability. PF-562271 also showed significant cell growth inhibitory ability by inhibiting cell growth by 53.43% and 31.71%, respectively, compared to the control, when incubated for 48 hours after treatment with 0.01, 0.1, 1, and 2.5 μM, respectively. The maximum concentration to treat the cells was determined in consideration of the solubility of each drug. Since both inhibitors of FAK activity showed significant (student's t-test, p value <0.001) time-dependent cell growth inhibitory ability, it was evaluated that MCF-7 cells, ie, cancer cell lines, were suitable as target cell lines for FAK activity inhibitor screening. In addition, when the two FAK activity inhibitors were treated, 1 μM in which the amount of cells to be used for analysis was sufficient and significant cell death occurred was determined as the cell treatment assay concentration for deriving metabolite biomarkers in the following experiments.
[실시예 2] 암 세포주에서의 FAK 활성 억제제 스크리닝을 위한 대사체 분리 및 분석 [Example 2] Metabolite Isolation and Analysis for FAK Activity Inhibitor Screening in Cancer Cell Lines
MCF-7 세포주에 FAK 활성 억제제의 처리Treatment of FAK activity inhibitors in MCF-7 cell line
상기 실시예 1에서 사용된 것돠 동일한 MCF-7 유방암 세포를 37℃ 온도의 5% 이산화탄소 세포배양기에서 10 %의 소태아혈청과 1 %의 항생제가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 배양하였다. 세포의 성장이 안정화된 후, 대조군으로 총 배지의 0.01 %가 되는 양의 DMSO를 첨가하여 12시간 배양하였다. 실험군으로는 FAK 활성 억제제인 PF-573228과 PF-562,271를 총 배지의 0.01 %가 되도록 1 μM의 농도로 각각 처리하여 12, 24, 48시간 동안 배양하였다. 각 세포는 그룹 별 4개의 세포 디쉬에서 배양하여 각 군의 총 실험 수 n=4가 되도록 하였다. 약물을 배양한 뒤에는 배지를 제거하고 PBS(phosphate buffered saline)를 이용하여 세포를 2차례 세척해준 뒤에 셀 스크래퍼를 이용하여 세포를 배양 접시에서 획득하여 튜브에 담아 -80℃에서 보관하였다. MCF-7 breast cancer cells identical to those used in Example 1 were cultured using DMEM medium containing 10% fetal bovine serum and 1% antibiotic in a 5% carbon dioxide cell incubator at 37°C. After the cell growth was stabilized, DMSO was added in an amount of 0.01% of the total medium as a control and cultured for 12 hours. As the experimental group, FAK activity inhibitors PF-573228 and PF-562,271 were each treated at a concentration of 1 μM to 0.01% of the total medium, and cultured for 12, 24, and 48 hours. Each cell was cultured in 4 cell dishes for each group so that the total number of experiments in each group was n=4. After culturing the drug, the medium was removed and the cells were washed twice with PBS (phosphate buffered saline), and then the cells were obtained from a culture dish using a cell scraper, put in a tube, and stored at -80°C.
세포 내액 추출 및 DNA 정량Intracellular fluid extraction and DNA quantification
상기 FAK 활성 억제제를 처리한 실험군 시료와 대조군 시료의 질량분석을 위하여 내부 표준물질로 레저핀 2 μg/mL 이 들어있는 70 % 메탄올 용액을 120 μL씩 넣어준 뒤, 볼텍싱을 하여 추출물에 시료가 잘 섞이게 하였다. 그 후 각 시료와 용액의 혼합액을 액체 질소를 사용하여 얼렸다가, 상온의 물에 녹여준 뒤 30초간 음파처리하는 과정을 총 3번 반복 시행하여, 세포를 파괴하고 세포 내의 대사체를 추출하였다. 그리고 원심분리기에 14000 rpm에 10분 동안 원심 분리를 진행한 뒤에 상층액만 획득하여 분석을 진행했다. 획득한 각 추출물은 추후 세포량의 보정을 위하여 DNA 정량을 실시하였다. DNA정량은 신코 사의 분광광도계 Nano-MD를 사용하여 진행하였다. 각 추출물과 물을 1:3으로 혼합한 뒤 5 μL를 큐벳에 넣어주고 260 nm에서 정량하였다. For mass spectrometry of the FAK activity inhibitor-treated experimental group samples and control samples, 120 μL of 70% methanol solution containing 2 μg/mL of reserpine as an internal standard was added, followed by vortexing, and the sample was added to the extract. was mixed well. After that, the mixture of each sample and solution was frozen using liquid nitrogen, dissolved in room temperature water, and then sonicated for 30 seconds was repeated 3 times in total to destroy the cells and extract the metabolites in the cells. And after centrifugation in a centrifuge at 14000 rpm for 10 minutes, only the supernatant was obtained and analyzed. Each of the obtained extracts was subjected to DNA quantification for correction of the cell mass later. DNA quantification was performed using a spectrophotometer Nano-MD manufactured by Shinko. After mixing each extract and water in a ratio of 1:3, 5 μL was put into a cuvette and quantified at 260 nm.
질량분석기를 이용한 대사체 분석Metabolite analysis using mass spectrometry
상기에서 획득한 각 시료 추출물을 바이알에 담은 뒤 10 μL를 초고성능 액체크로마토그래피 질량분석기액체크로마토그래피질량분석기(한국과학기술연구원 분자인식연구센터 Thermo사의 Ultimate 300 UPHLC system-Orbitrap velos pro system mass spectrometry)에 주입하였다. 주입기의 온도는 4℃로 유지하였다. 초고성능 액체크로마토그래피의 용액 조건은 0.1 % 포름산을 넣은 물(이동상 A) 및 0.1 % 포름산을 넣은 메탄올(이동상 B)였다. 컬럼은 waters사의 ACQUITY*?* HSS T3 (2.1×100 mm, 1.7 μm)를 사용하고 컬럼의 온도는 40℃를 유지했다. 액체크로마토그래피 이동상의 구배는 0분을 시작으로 2분이 될 때까지 A 용액 99%으로 유지하고, 14분이 될 때까지 B 용액이 100%가 되도록 하고, 이 후 15분이 될 때까지 유지하였으며, 이 후 3분 동안은 처음 조건으로 맞춰주었다. 용액의 흐름은 0.4 mL로 유지했다. 질량분석기는 포지티브 모드(positive mode)와 네거티브 모드(negative mode) 분석 모두 진행되었다. 질량분석기의 소스 온도는 300℃, 용매 지연시간은 3분으로 하였다. 분석 도중에는 분석의 품질 관리를 위해 시퀀스에 QC(quality control) 샘플을 넣어 전체 분석법의 진행에 기기의 문제가 없음을 확인하였다. QC샘플은 대조군 및 실험군 시료 추출물을 모두 풀링한 것으로 사용했다. 분석 후 얻은 크로마토그램 결과를 도 7 (PF573228 처리군) 및 도 8(PF562271 처리군)에 나타내었다.After putting each sample extract obtained above in a vial, 10 μL of ultra-high performance liquid chromatography mass spectrometry liquid chromatography mass spectrometry (Korea Institute of Science and Technology Molecular Recognition Research Center Thermo's Ultimate 300 UPHLC system-Orbitrap velos pro system mass spectrometry) was injected into The temperature of the injector was maintained at 4°C. The solution conditions for ultra-high performance liquid chromatography were water containing 0.1% formic acid (mobile phase A) and methanol containing 0.1% formic acid (mobile phase B). Waters' ACQUITY *?* HSS T3 (2.1×100 mm, 1.7 μm) was used for the column, and the temperature of the column was maintained at 40°C. The gradient of the liquid chromatography mobile phase was maintained at 99% of solution A from 0 min until 2 min, and 100% of solution B until 14 min, and then maintained until 15 min. After 3 minutes, it was set to the first condition. The flow of the solution was maintained at 0.4 mL. In the mass spectrometer, both positive mode and negative mode analysis were performed. The source temperature of the mass spectrometer was set to 300°C, and the solvent delay time was set to 3 minutes. During analysis, quality control (QC) samples were put in the sequence for quality control of the analysis, and it was confirmed that there was no problem with the device in the progress of the entire analysis method. The QC sample was used as a pool of both control and experimental group sample extracts. The chromatogram results obtained after the analysis are shown in FIG. 7 (PF573228 treatment group) and FIG. 8 (PF562271 treatment group).
크로마토그램 데이터 분석 및 통계 처리Chromatogram data analysis and statistical processing
상기 도 7 및 도 8의 크로마토그램 데이터를 분석하기 위하여 PLS-DA분석(Partial least squares discriminant analysis)을 수행하였다. 구체적으로 상기 크로마토그램으부터 써모피셔사이언티티픽 사의 compound discovery 소프트웨어를 사용하여 보정과 피크 정렬을 한 엑셀 원본 데이터(raw data)를 추출하였다. 추출된 원본 데이터의 개수는 총 325개였다. 추출된 파일을 먼저 내부 표준물질로 나눠주고 세포의 DNA 정량을 이용하여 보정해준 뒤 SIMCA 소프트웨어를 이용하여 통계처리를 진행하였다. 그 결과는 도 9 내지 도 11에 나타내었다. Partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) was performed to analyze the chromatogram data of FIGS. 7 and 8 . Specifically, from the chromatogram, using the compound discovery software of Thermo Fisher Scientific Co., Ltd., the Excel raw data, which was corrected and peak aligned, was extracted. The total number of extracted original data was 325. The extracted files were first divided into internal standards, corrected using cell DNA quantification, and statistical processing was performed using SIMCA software. The results are shown in FIGS. 9 to 11 .
PLS-DA 분석결과 배양 시간별로 대조군과 각 실험군의 클러스터링(clustering)이 구분되어 나눠진 것을 알 수 있었다. PLS-DA plot에서는 각 그룹의 클러스터링 거리가 나눠질수록 대사체가 유의하게 변화하였음을 의미한다. 배양 시간 12, 24, 48시간 중 도 9인 12시간 배양시의 클러스터링이 가장 확연하게 나눠진 것을 볼 수 있었다. 그리고 대조군 대비 각 실험군의 대사체 변화 또한 12시간에서 유의적인 차이를 보였으나 24, 48시간에서는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 따라서 3종류의 시간 대비 그룹 중에서 약물 처리 후 변화가 가장 뚜렷하게 나타난 12시간 그룹을 약물 평가 모델로 선정하였다. 보정된 데이터는 t 검증을 하여 유의적으로 변한 데이터를 구분하였다. 통계처리 결과에 따라 p값이 0.05 이하인 물질들을 유의적인 것으로 나누었다. 유의적으로 구분된 물질들은 크로마토그램의 m/z 값을 토대로 HMDB (Human Metabolome Database), 매스뱅크(massbank), 메틀린(metlin)과 같은 데이터베이스를 토대로 정성이 진행됐다. 그 결과 도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, MCF-7 세포주에서 FAK 활성 억제제를 처리한 뒤 공통적으로 변화한 검출 물질은 총 4개로, n-아세틸-l-아스파르트산(n-acetyl-l-aspartic acid), 숙신산(succinic acid), L-아스파르트산(L-aspartic acid) 및 시트르산(citric acid)가 유의적으로 변화한 사실을 확인하였다. 상기 4종의 대사체는 모두 알라닌, 아스파르테이트 및 글루타메이트 대사경로(alanine, aspartate and glutamate metabolic pathway)에 관여하며, 상기 시트르산과 숙신산은 시트르산 회로(citric acid cycle; TCA cycle)의 대사 경로에 공통적으로 관여하는 대사체였다.As a result of the PLS-DA analysis, it was found that the control group and the clustering of each experimental group were divided by incubation time. In the PLS-DA plot, it means that the metabolites changed significantly as the clustering distance of each group was divided. It can be seen that clustering was most clearly divided during 12 hours of incubation, which is FIG. 9, among 12, 24, and 48 hours of incubation. In addition, the metabolite change of each experimental group compared to the control group also showed a significant difference at 12 hours, but no significant difference at 24 and 48 hours. Therefore, the 12-hour group, in which the change after drug treatment was most evident, was selected as the drug evaluation model among the three types of time comparison groups. The corrected data was t-tested to distinguish significantly changed data. Substances with a p value of 0.05 or less were classified as significant according to the results of statistical processing. Substances classified significantly were qualitatively analyzed based on databases such as HMDB (Human Metabolome Database), massbank, and metlin based on the m/z value of the chromatogram. As a result, as can be seen in FIG. 12 , there were a total of four detection substances that were commonly changed after treatment with the FAK activity inhibitor in the MCF-7 cell line, n-acetyl-l-aspartic acid (n-acetyl-l-aspartic acid). acid), succinic acid, L-aspartic acid, and citric acid were confirmed to be significantly changed. All four metabolites are involved in the alanine, aspartate and glutamate metabolic pathway, and the citric acid and succinic acid are common to the metabolic pathway of the citric acid cycle (TCA cycle). metabolites involved in
FAK 활성 억제제 PF-573228의 경우, 12시간 약물 처리 후 대조군 대비 n-아세틸-l-아스파르트산은 30.36%, 숙신산은 44.84%, L-아스파르트산은 33.26% 감소하는 경향을 보였으며 시트르산은 231.07% 증가하는 경향을 보였다. FAK 활성 억제제 PF-562271의 경우, 12시간 약물 처리 후 대조군 대비 n-아세틸-l-아스파르트산은 33.74%, 숙신산은 43.18%, L-아스파르트산은 41.77% 감소하였으며 시트르산은 108.44% 증가하는 양상을 보여주었다(도 13 내지 도 16 참조). 즉, 암 세포주에서 FAK 활성이 억제되면, 세포 내액에서 n-아세틸-l-아스파르트산, 숙신산, L-아스파르트산의 레벨이 감소하고 시트르산의 레벨이 증가하였다. 따라서, 상기 4종의 대사체들의 레벨 변화를 측정함으로써 FAK 활성 억제제를 스크리닝할 수 있음을 확인할 수 있다. In the case of the FAK activity inhibitor PF-573228, n-acetyl-l-aspartic acid decreased by 30.36%, succinic acid 44.84%, and L-aspartic acid 33.26% compared to the control group after 12 hours of drug treatment, and citric acid showed a tendency to decrease by 23.07%. showed a trend In the case of the FAK activity inhibitor PF-562271, n-acetyl-l-aspartic acid decreased by 33.74%, succinic acid by 43.18%, and L-aspartic acid by 41.77%, and citric acid increased by 108.44% compared to the control group after 12 hours of drug treatment (See FIGS. 13 to 16). That is, when FAK activity was inhibited in cancer cell lines, the levels of n-acetyl-1-aspartic acid, succinic acid, and L-aspartic acid decreased and the level of citric acid increased in the intracellular fluid. Therefore, it can be confirmed that the FAK activity inhibitor can be screened by measuring the level change of the four metabolites.
앞에서 설명된 본 발명의 실시예는 본 발명의 기술적 사상을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 보호범위는 청구범위에 기재된 사항에 의하여만 제한되고, 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상을 다양한 형태로 개량 변경하는 것이 가능하다. 따라서, 이러한 개량 및 변경은 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것인 한 본 발명의 보호범위에 속하게 될 것이다.The embodiments of the present invention described above should not be construed as limiting the technical spirit of the present invention. The protection scope of the present invention is limited only by the matters described in the claims, and it is possible for those of ordinary skill in the art to improve and change the technical idea of the present invention in various forms. Accordingly, such improvements and modifications will fall within the protection scope of the present invention as long as it is apparent to those of ordinary skill in the art.
Claims (17)
후보 물질을 처리한 상기 세포주 내 n-아세틸-l-아스파르트산(n-acetyl-l-aspartic acid), 숙신산(succinic acid), L-아스파르트산(L-aspartic acid) 및 시트르산(citric acid) 중 하나 이상의 대사체의 레벨(level)을 측정하는 단계; 및
측정한 n-아세틸-l-아스파르트산, 숙신산, L-아스파르트산 및 시트르산 중 하나 이상의 대사체의 레벨을 후보 물질 처리 전의 레벨과 비교하는 단계;
를 포함하는, FAK (focal adhesion kinase) 활성 억제제의 스크리닝 방법.treating one or more of a FAK-overexpressing cell line and a cancer cell line with a candidate substance;
Among n-acetyl-l-aspartic acid, succinic acid, L-aspartic acid and citric acid in the cell line treated with the candidate substance measuring the level of one or more metabolites; and
comparing the measured level of one or more metabolites of n-acetyl-1-aspartic acid, succinic acid, L-aspartic acid and citric acid with the level before treatment with a candidate substance;
A screening method of an inhibitor of FAK (focal adhesion kinase) activity, comprising a.
상기 세포주에서 상기 n-아세틸-l-아스파르트산, 숙신산 및 L-아스파르트산 중 하나 이상의 대사체의 레벨이 후보물질 처리 전과 비교하여 감소; 및
상기 세포주에서 상기 시트르산의 레벨이 후보물질 처리 전과 비교하여 증가;
중 하나 이상을 만족하면, 후보물질을 FAK 인산화 효소 억제제로 적합하다고 판단하는 단계를 더 포함하는 스크리닝 방법.13. The method of claim 12, wherein after comparing the level of the metabolite with the level before treatment with the candidate substance,
a decrease in the level of one or more metabolites of n-acetyl-l-aspartic acid, succinic acid and L-aspartic acid in the cell line compared to before treatment with the candidate; and
an increase in the level of citric acid in the cell line compared to before treatment with a candidate substance;
If one or more of the above is satisfied, the screening method further comprising the step of determining that the candidate is suitable as a FAK kinase inhibitor.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200142383A KR102408538B1 (en) | 2020-10-29 | 2020-10-29 | Composition, kit and method for screening FAK inhibitor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200142383A KR102408538B1 (en) | 2020-10-29 | 2020-10-29 | Composition, kit and method for screening FAK inhibitor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220057286A true KR20220057286A (en) | 2022-05-09 |
| KR102408538B1 KR102408538B1 (en) | 2022-06-15 |
Family
ID=81582048
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200142383A KR102408538B1 (en) | 2020-10-29 | 2020-10-29 | Composition, kit and method for screening FAK inhibitor |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102408538B1 (en) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20050052663A (en) * | 2002-09-19 | 2005-06-03 | 화이자 프로덕츠 인크. | Inducible focal adhesion kinase cell assay |
| KR20160136078A (en) * | 2015-05-19 | 2016-11-29 | 한국과학기술연구원 | A method for screening of substances for treating gastric cancer using activities of neurotensin receptor |
| WO2019083333A1 (en) * | 2017-10-26 | 2019-05-02 | 서울대학교 산학협력단 | Method for diagnosing liver diseases and method for screening therapeutic agent for liver diseases using changes in expression of tm4sf5 protein |
| KR102007450B1 (en) * | 2018-05-31 | 2019-08-05 | 한국과학기술연구원 | Screening method for new therapeuric targets of drug discovery for colon cancer and prognostic biomarkers for colon cancer screened by using the same |
| KR20200049200A (en) * | 2018-10-31 | 2020-05-08 | 한국과학기술연구원 | Method, composition and kit for screening ALK or ROS-1 kinase inhibitor |
-
2020
- 2020-10-29 KR KR1020200142383A patent/KR102408538B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20050052663A (en) * | 2002-09-19 | 2005-06-03 | 화이자 프로덕츠 인크. | Inducible focal adhesion kinase cell assay |
| KR20160136078A (en) * | 2015-05-19 | 2016-11-29 | 한국과학기술연구원 | A method for screening of substances for treating gastric cancer using activities of neurotensin receptor |
| WO2019083333A1 (en) * | 2017-10-26 | 2019-05-02 | 서울대학교 산학협력단 | Method for diagnosing liver diseases and method for screening therapeutic agent for liver diseases using changes in expression of tm4sf5 protein |
| KR102007450B1 (en) * | 2018-05-31 | 2019-08-05 | 한국과학기술연구원 | Screening method for new therapeuric targets of drug discovery for colon cancer and prognostic biomarkers for colon cancer screened by using the same |
| KR20200049200A (en) * | 2018-10-31 | 2020-05-08 | 한국과학기술연구원 | Method, composition and kit for screening ALK or ROS-1 kinase inhibitor |
Non-Patent Citations (11)
| Title |
|---|
| Anil K. Sood et al., Biological Significance of Focal Adhesion Kinase in Ovarian Cancer , American Journal of Pathology, Vol. 165, No. 4, October 2004 |
| D. M. Kuhn, et al., J. Clin. Microbiol., 41, 506, 2003) |
| Frank Aboubakar Nana et al, Role of Focal Adhesion Kinase in Small-Cell Lung Cancer and Its Potential as a Therapeutic Target, Cancers (basel), 2019 |
| Frank Aboubakar Nana et al., Increased Expression and Activation of FAK in Small-Cell Lung Cancer Compared to Non-Small-Cell Lung Cancer, Cancers 2019, 11, 1526 |
| Insup Choi et al., LRRK2 G2019S mutation attenuates microglial motility by inhibiting focal adhesion kinase, NATURE COMMUNICATIONS, 2015 |
| Keun-Yeong Jeong., Inhibiting focal adhesion kinase: A potential target for enhancing therapeutic efficacy in colorectal cancer therapy, World J Gastrointest Oncol 2018 October 15; 10(10): 290-292 |
| Napoleon Navarro-Tito et al., Arachidonic acid promotes FAK activation and migration in MDA-MB-231 breast cancer cells, Experimental cell research, 314(2008), 3340-3355 |
| Peng-Cheng Lv et al, FAK inhibitors in Cancer, a patent review, Expert Opinion on Therapeutic Patents, 2018(비특허문헌 1) |
| Pollen K. Yeung, Metabolomics and Biomarkers for Drug Discovery, metabolites, 2018 |
| Rajani Kanteti et al., Focal adhesion kinase a potential therapeutic target for pancreatic cancer and malignant pleural mesothelioma, CANCER BIOLOGY & THERAPY, 2018, VOL. 19, NO. 4, 316-327 |
| Rigiracciolo et al. Focal adhesion kinase (FAK) activation by estrogens involves GPER in triple-negative breast cancer cells, Journal of Experimental & Clinical Cancer Research (2019) 38:58 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102408538B1 (en) | 2022-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ciavardelli et al. | Breast cancer stem cells rely on fermentative glycolysis and are sensitive to 2-deoxyglucose treatment | |
| Xu et al. | Quantitative proteomics study of breast cancer cell lines isolated from a single patient: discovery of TIMM17A as a marker for breast cancer | |
| Vogel et al. | Proteins and protein pattern differences between glioma cell lines and glioblastoma multiforme | |
| Li et al. | Myc-mediated SDHA acetylation triggers epigenetic regulation of gene expression and tumorigenesis | |
| Catenacci et al. | Absolute quantitation of Met using mass spectrometry for clinical application: assay precision, stability, and correlation with MET gene amplification in FFPE tumor tissue | |
| Heroux et al. | Comprehensive characterization of glioblastoma tumor tissues for biomarker identification using mass spectrometry-based label-free quantitative proteomics | |
| Dreishpoon et al. | FDX1 regulates cellular protein lipoylation through direct binding to LIAS | |
| Hao et al. | The novel cereblon modulator CC-885 inhibits mitophagy via selective degradation of BNIP3L | |
| Bartley et al. | Mammalian FMRP S499 is phosphorylated by CK2 and promotes secondary phosphorylation of FMRP | |
| Kozuka-Hata et al. | Phosphoproteome of human glioblastoma initiating cells reveals novel signaling regulators encoded by the transcriptome | |
| Zhu et al. | Identification of prothymosin alpha (PTMA) as a biomarker for esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) by label-free quantitative proteomics and Quantitative Dot Blot (QDB) | |
| CA2942605C (en) | Methods for identifying a biomarker indicative of a reduced drug response using a thermal shift assay | |
| Zhuang et al. | The novel function of tumor protein D54 in regulating pyruvate dehydrogenase and metformin cytotoxicity in breast cancer | |
| Xie et al. | EEF1D promotes glioma proliferation, migration, and invasion through EMT and PI3K/Akt pathway | |
| Tripathi et al. | SLC38A10 regulate glutamate homeostasis and modulate the AKT/TSC2/mTOR pathway in mouse primary cortex cells | |
| Gui et al. | Calponin 2 harnesses metabolic reprogramming to determine kidney fibrosis | |
| KR102408538B1 (en) | Composition, kit and method for screening FAK inhibitor | |
| Liu et al. | Cold shock domain containing E1 (CSDE1) protein is overexpressed and can be targeted to inhibit invasiveness in pancreatic cancer cells | |
| Klingelhuber et al. | A spatiotemporal proteomic map of human adipogenesis | |
| US11506654B2 (en) | Method, composition and kit for screening ALK or ROS-1 kinase inhibitor | |
| Arneson-Wissink et al. | Disrupted NOS2 metabolism drives myoblast response to wasting-associated cytokines | |
| Zhu et al. | Pancreatic ductal adenocarcinoma cells regulated the gemcitabine‐resistance function of CAFs by LINC00460 | |
| Bort et al. | Metabolic fingerprinting of chemotherapy-resistant prostate cancer stem cells. An untargeted metabolomic approach by liquid chromatography-mass spectrometry | |
| Xie et al. | Genomic and proteomic profiling of oxidative stress response in human diploid fibroblasts | |
| Serna et al. | Efficient monitoring of protein ubiquitylation levels using TUBE s‐based microarrays |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right |