KR20220050669A - 효소 기반 금나노 클러스터로 구성된 나노입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

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KR20220050669A
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Abstract

본 발명은 효소 기반 금나노 클러스터로 구성된 나노입자 및 이의 제조방법에 대한 것으로, 본 발명은 단백질-금나노클러스터와 효소-금나노클러스터가 뭉쳐 형성되어, 안정성 및 센싱의 민감도를 향상시킬 수 있는 나노입자 및 이의 제조방법에 대한 것이다.

Description

효소 기반 금나노 클러스터로 구성된 나노입자 및 이의 제조방법{Nanoparicles comprising enzyme-based gold nanocluster and Preparation method thereof}
본 발명은 효소 기반 금나노 클러스터로 구성된 나노입자 및 이의 제조방법에 대한 것으로, 본 발명은 단백질-금나노클러스터와 효소-금나노클러스터가 뭉쳐 형성되어, 안정성 및 센싱의 민감도를 향상시킬 수 있는 나노입자 및 이의 제조방법에 대한 것이다.
인체 내에 존재하는 생리활성물질을 센서를 이용하여 측정하고자 하는 기술이 최근 각광받고 있다. 센서를 이용하여 측정하고자 하는 대표적인 생리활성물질로 과산화수소와 글루코오스를 들 수 있는데, 상기 과산화수소는 인체 내에서 세포 성장, 세포 사멸 등 생리학적 과정에서 중요한 역할을 수행하나, 인체 내에서 과산화수소가 고농도로 존재하는 경우, 세포 손상, 암 등의 원인이 되기도 하며, 혈액 내 글루코오스는 우리 몸에서 중요한 역할을 하나 혈당이 높거나 낮을 경우 신체에 영향을 주어 당뇨병 등의 질병을 일으킬 수 있다. 이에 따라, 하기 특허문헌 기재된 바와 같은 과산화수소 측정용 센서, 글루코오스 측정용 센서가 개발되고 있다.
<특허문헌>
1. 특허 제10-1823114호(2018. 01. 23. 등록) "과산화수소 검출 센서 및 이를 이용한 과산화수소 검출 방법"
2. 특허 제10-1450385호(2014. 10. 06. 등록) "글루코오스 농도 측정용 바이오센서 및 그 제조방법"
하지만, 종래의 과산화수소 측정용 센서, 글루코오스 측정용 센서 등은 센싱의 민감도가 낮은 문제가 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로,
본 발명은 단백질-금나노클러스터와, 과산화효소-금나노클러스터가 뭉쳐 형성되어, 높은 민감도 및 향상된 안정성을 가지는 과산화수소 측정용 나노입자 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 단백질-금나노클러스터, 과산화효소-금나노클러스터 및 글루코오스산화효소-금나노클러스터가 뭉쳐 형성되어, 높은 민감도 및 향상된 안정성을 가지는 글루코오스 측정용 나노입자 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발병은 앞서 본 목적을 달성하기 위하여 다음과 같은 구성을 가진 실시예에 의해 구현된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자는 단백질-금나노클러스터와, 상기 단백질-금나노클러스터에 결합된 효소-금나노클러스터를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자에 있어서 상기 효소-금나노클러스터는 과산화효소-금나노클러스터를 포함하며, 상기 단백질-금나노클러스터는 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 단백질을 포함하고, 상기 과산화효소-금나노클러스터는 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 과산화효소를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자는 상기 단백질-금나노클러스터와 상기 과산화효소-금나노클러스터가 서로 뭉쳐 형성되며, 구형의 형태를 가지고, 과산화수소와 반응 시 형광 세기가 변화하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자에 있어서 상기 단백질은 알부민이 사용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자에 있어서 상기 효소-금나노클러스터는 과산화효소-금나노클러스터 및 글루코오스산화효소-금나노클러스터를 포함하며, 상기 단백질-금나노클러스터는 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 단백질을 포함하고, 상기 과산화효소-금나노클러스터는 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 과산화효소를 포함하며, 상기 글루코오스산화효소-금나노클러스터는 금나노클러스터와 상기 금나노클러스터를 에워싸는 글루코오스 산화효소를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자는 상기 단백질-금나노클러스터, 상기 과산화효소-금나노클러스터 및 상기 글루코오스산화효소-금나노클러스터가 서로 뭉쳐 형성되며, 구형의 형태를 가지고, 글루코오스 측정을 위해 사용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자와 TMB 용액을 혼합한 혼합용액에 글루코오스를 첨가하면, 글루코오스 존재 및 그 양에 따라 혼합용액의 색상이 변화하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 글루코오스 측정용 센서는 금속 전극과, 링커에 의해 상기 금속 전극에 결합된 글루코오스 측정용 나노입자를 포함하며, 상기 글루코오스 측정용 나노입자는 제5항의 나노입자가 사용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자의 제조방법은 단백질-금나노클러스터와, 효소-금나노클러스터를 섞어 혼합용액을 준비하는 혼합용액준비단계와, 탈용매화를 통해 단백질-금나노클러스터와 효소-금나노클러스터가 뭉쳐 입자가 형성되도록 에탄올을 포함하는 탈용매화 용액을 혼합용액에 첨가하여 반응시키는 탈용매화단계와, 상기 탈용매화단계에서 형성된 입자를 가교시켜 견고한 형태를 가지도록 탈용매화단계 후 추가적으로 가교제를 첨가하는 가교단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자의 제조방법에 있어서 상기 혼합용액준비단계에서는 단백질-금나노클러스터와, 과산화효소-금나노클러스터가 혼합되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자의 제조방법에 있어서 상기 혼합용액준비단계에서는 단백질-금나노클러스터와, 과산화효소-금나노클러스터와, 글루코오스산화효소-금나노클러스가 혼합되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 앞서 본 실시예에 의해 다음과 같은 효과를 얻을 수 있다.
본 발명은 과산화수소 측정용 나노입자가 단백질-금나노클러스터와, 과산화효소-금나노클러스터가 뭉쳐 형성되어, 안정성을 향상시키면서도 높은 민감도로 과산화수소를 센싱할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 글루코오스 측정용 나노입자가 단백질-금나노클러스터, 과산화효소-금나노클러스터 및 글루코오스산화효소-금나노클러스터가 뭉쳐 형성되어, 안정성을 향상시키면서도 높은 민감도로 글루코오스를 센싱할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 과산화수소 측정용 나노입자의 제조과정을 설명하기 위한 참고도.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 과산화수소 측정용 나노입자의 형광 변화를 설명하기 위한 참고도.
도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따른 글루코오스 측정용 나노입자의 제조과정을 설명하기 위한 참고도.
도 4는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 센서 및 이를 이용한 전기화학적 실험 방법을 설명하기 위한 참고도.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 과산화수소 측정용 나노입자의 TEM 이미지.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 과산화수소 측정용 나노입자의 DLS 분석 결과를 나타내는 그래프.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 과산화수소 측정용 나노입자를 일광 및 자외선에서 촬영한 결과를 나타내는 이미지.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 과산화수소 측정용 나노입자의 흡수 파장과 방출 파장을 나타내는 그래프.
도 9는은 본 발명의 다른 실시예에 따른 글루코오스 측정용 나노입자의 TEM 이미지.
도 10은 본 발명의 다른 실시예에 따른 글루코오스 측정용 나노입자의 DLS 분석 결과를 나타내는 그래프.
도 11은 본 발명의 다른 실시예에 따른 글루코오스 측정용 나노입자를 자외선에서 촬영한 결과를 나타내는 이미지.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 과산화수소 측정용 나노입자가 과산화수소와 반응하여 형광세기가 변화함을 확인하기 위한 그래프.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 과산화수소 측정용 나노입자가 과산화수소와 반응하여 형광세기가 변화함을 확인하기 위한, 과산화수소 측정용 나노입자를 자외선에서 촬영한 결과를 나타내는 이미지.
도 14 및 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 과산화수소 측정용 나노입자가 과산화수소와 반응하여 형광세기가 변화함을 확인하기 위한, 과산화수소 농도에 따른 형광 세기 감소율을 나타내는 그래프.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 과산화수소 측정용 나노입자의 선택적 과산화수소 검출 결과를 나타내는 촬영 이미지.
도 17 및 18은 본 발명의 다른 실시예에 따른 글루코오스 측정용 나노입자와 TMB 용액을 이용하여 글루코오스를 측정할 수 있음을 확인하기 위한 혼합용액을 촬영한 결과를 나타내는 이미지.
도 19는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 센서의 SEM 이미지.
도 20은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 센서의 AFM 이미지.
도 21 내지 22는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 센서의 CV 측정 결과를 나타내는 그래프.
도 23은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 센서의 글루코오스 농도에 따른 환원 피크 전류 값의 선형화 결과를 나타내는 그래프.
도 24 및 25는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 센서의 amperometric i-t 측정결과를 나타내는 그래프.
도 26은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 센서의 선택적 글루코오스 검출결과를 나타내는 그래프.
도 27은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 센서의 실제 샘플에서 글루코오스 검출 결과를 나타내는 그래프.
이하에서는 본 발명에 따른 효소 기반 금나노 클러스터로 구성된 나노입자 및 이의 제조방법을 첨부된 도면을 참조하여 설명한다. 특별한 정의가 없는 한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 정의에 따른다. 또한, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대해 상세한 설명은 생략한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예는 효소 기반 금나노 클러스터로 구성된 나노입자에 대한 것으로, 상기 나노입자는 단백질-금나노클러스터와, 상기 단백질-금나노클러스터에 결합된 효소-금나노클러스터를 포함한다. 종래 금나노클러스터는 일반적인 금 나노입자와 달리 수 십개의 금 원자들이 뭉쳐 대략 2nm 이하의 크기로 형성되는 물질인데, 불연속적인 에너지 준위를 가지는 분자와 같은 성질을 가져 형광을 띄게 된다. 다만, 상기 금나노클러스터는 불안정한 성질을 가지므로, 본 발명에서는 단백질(효소 포함)을 이용하여 금나노클러스터를 안정화시킨, 단백질-금나노클러스터, 효소-금나노클러스터를 제조하고 이를 이용하여 상기 나노입자를 제조하게 된다. 효소를 이용하여 금나노클러스터를 안정화시킨 효소-금나노클러스터는 효소의 성질, 형광적인 성질 및 전도성을 모두 가지게 되며, 효소가 아니라 알부민과 같은 일반 단백질을 이용하여 금나노클러스터를 안정화시킨 단백질-금나노클러스터 역시 효소와 같은 촉매의 성질을 가지고 형광적인 성질 및 전도성을 가지게 된다.
상기 단백질-금나노클러스터는 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 단백질을 포함한다. 상기 단백질은 효소가 아닌 일반 단백질이 사용될 수 있으며, 예컨대 응집성을 가져 자기 결합체를 형성할 수 있는 단백질, 시스테인, 티로신 등의 잔기를 포함하는 단백질 등이 사용될 수 있으며, 구체적으로 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 오브알부민(ovalbumin) 등의 알부민, 리소자임 등이 사용될 수 있다. 상기 단백질-금나노클러스터는 종래의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 예컨대 단백질 용액 및 금 이온을 함유한 용액을 혼합하고, 상기 단백질 내로 침투한 금 이온(Au3+)을 환원시키기 위해 알카리 수용액을 추가로 혼합하고 반응시켜 형성할 수 있다. 위의 과정에서 금 이온과 단백질에 존재하는 잔기의 결합에 의해 단백질 내에 복수 개의 금 이온이 위치하게 되며, Au3+가 Au1+로 환원되며, 알카리 수용액에 의해 일부 Au1+이 Au0로 환원되어 금나노클러스터를 단백질이 에워싸는 형태의 단백질-금나노클러스터가 형성되게 된다.
상기 효소-금나노클러스터는 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 효소를 포함한다. 상기 효소는 다양한 효소가 사용될 수 있으며, 상기 효소 역시 단백질임으로 일반 단백질 용액 대신에 효소 용액을 사용하는 것을 제외하고 다른 조건을 단백질-금나노클러스터 제조방법과 동일하게 하여 효소-금나노클러스터를 제조할 수 있다. 상기 효소-금나노클러스터는 한 종류 또는 다른 종류의 복수 개의 효소-금나노클러스터가 사용될 수 있는데, 도 1 및 2에 도시된 바와 같이 과산화효소-금나노클러스터를 사용한 경우, 단백질-금나노클러스터와, 과산화효소-금나노클러스터가 서로 뭉쳐 형성된 과산화수소 측정용 나노입자는 구형을 형태를 가지며, 과산화수소가 존재하지 않을 시에는 형광이 발현되나 과산화수소와 반응 시에는 형광의 세기가 줄어들어 과산화수소를 측정하기 위한 형광센서에 이용될 수 있다. 또한, 도 3 및 4에 도시된 바와 같이, 과산화효소-금나노클러스터 및 글루코오스산화효소-금나노클러스를 사용한 경우, 단백질-금나노클러스터, 과산화효소-금나노클러스터 및 글루코오스산화효소-금나노클러스터가 서로 뭉쳐 형성된 글루코오스 측정용 나노입자는 구형을 형태를 가지며, 상기 나노입자를 전극에 결합시켜 전기화학적 센서를 구성하는 경우, 글루코오스 존재 및 양에 따라 변화하는 전기적 신호를 얻을 수 있어, 글루코오스를 측정하기 위한 전기화학적 센서에 이용될 수 있다. 또한, 글루코오스 측정용 나노입자와, 글루코오스 및 TMB 용액을 혼합하면, 글루코오스 측정용 나노입자는 글루코오스를 과산화수소와, 글루콘산(gluconic acid)으로 전환시키고, 상기 과산화수소는 상기 글루코오스 측정용 나노입자에 의해 물로 환원되고 동시에 TMB는 산화되므로 푸른 색으로 색상이 변하게 된다. 즉, 글루코오스의 농도가 높을수록, 글루코오스 측정용 나노입자, 글루코오스 및 TMB의 혼합용액의 색상이 더욱 푸르게 된다.
본 발명의 다른 실시예는 도 4에 도시된 바와 같이 금속 전극과, 링커에 의해 상기 금속 전극에 결합된 글루코오스 측정용 나노입자를 포함하는 글루코오스 측정용 센서에 대한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시예는 효소 기반 금나노 클러스터로 구성된 나노입자의 제조방법에 대한 것으로, 상기 나노입자의 제조방법은 주형으로 사용되는 단백질-금나노클러스터와, 효소-금나노클러스터를 섞어 혼합용액을 준비하는 혼합용액준비단계와, 탈용매화를 통해 단백질-금나노클러스터와 효소-금나노클러스터가 뭉쳐 입자가 형성되도록 에탄올을 포함하는 탈용매화 용액을 혼합용액에 첨가하여 반응시키는 탈용매화단계와, 상기 탈용매화단계에서 형성된 입자를 가교시켜 견고한 형태를 가지도록 탈용매화단계 후 추가적으로 가교제를 첨가하는 가교단계 등을 포함한다.
상기 혼합용액준비단계는 주형으로 사용되는 단백질-금나노클러스터와, 효소-금나노클러스터를 섞어 혼합용액을 준비하는 단계로, 상기 효소-금나노클러스터는 한 종류 또는 다른 종류의 복수 개의 효소-금나노클러스터가 사용될 수 있는데, 도 1에 도시된 바와 같이 과산화효소-금나노클러스터를 사용하는 경우, 상기 제조방법을 통해 과산화수소 측정용 나노입자를 제조할 수 있고, 도 3에 도시된 바와 같이, 과산화효소-금나노클러스터 및 글루코오스산화효소-금나노클러스를 사용하는 경우, 글루코오스 측정용 나노입자를 제조할 수 있다.
상기 탈용매화단계는 탈용매화를 통해 단백질-금나노클러스터와 효소-금나노클러스터가 뭉쳐 입자가 형성되도록 에탄올을 포함하는 탈용매화 용액을 혼합용액에 첨가하여 반응시키는 단계로, 에탄올을 포함하는 탈용매화 용액을 혼합용액에 첨가하여 탈용매화를 통해 단백질 및 효소가 일정한 모양과 크기로 뭉치도록 하여, 단백질-금나노클러스터와 효소-금나노클러스터가 뭉쳐 입자가 형성되도록 한다. 상기 탈용매화 용액은 에탄올 이외에 아세토니트릴을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 탈용매화 용액은 혼합용액에 한꺼번에 혼합되는 것이 아니라 한 방울씩 첨가되는 것이 바람직하다.
상기 가교단계는 상기 탈용매화단계에서 형성된 입자를 가교시켜 견고한 형태를 가지도록 탈용매화단계 후 추가적으로 가교제를 첨가하는 단계로, 탈용매화 용액 첨가후 혼합용액이 색이 불투명하게 바뀌면 가교제가 첨가되어 뭉친 단백질 및 효소들 간의 아민기가 가교되도록 하여, 상기 탈용매화단계에서 형성된 입자가 견고한 형태를 가지도록 한다. 상기 가교제는, 예컨대 글루타르알데하히드가 사용될 수 있다. 상기 가교단계를 수행한 내용물을 원심분리를 진행하여 불순물을 제거하여 나노입자를 수득할 수 있게 된다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 단백질-금나노클러스터의 제조
1. 알부민-금나노클러스터의 제조
소혈청알부민(bovine serum albumin)를 3차 증류수에 녹여 BSA 용액(100mg/mL)을 준비하고, 3차 증류수에 녹인 HAuCl4 용액(10mM) 0.5mL를 상기 BSA 용액 0.5mL에 섞은 후, BSA 내부로 침투하여 Au3+로된 금 이온을 Au0로 환원시키기 위해 수산화나트륨(1M) 10ul를 추가로 넣고, 24시간 동안 37℃에서 900RPM으로 섞어주며 반응시켜, 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 단백질(알부민)을 포함하는 알부민-금나노클러스터(BSA-AuNC)를 제조하였다.
2. 과산화효소-금나노클러스터의 제조
BSA 대신에 홍당무과산화효소(HRP)를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 1의 1과 동일하게 하여, 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 단백질(과산화효소)은 포함하는 과산화효소-금나노클러스터(HRP-AuNC)를 제조하였다.
3. 글루코오스산화효소-금나노클러스터의 제조
BSA 대신에 글루코오스 산화효소(GOx)를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 1의 1과 동일하게 하여, 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 단백질(글루코오스산화효소)을 포함하는 글루코오스산화효소-금나노클러스터(GOx-AuNC)를 제조하였다.
<실시예 2> 센싱용 나노입자의 제조
1. 하기에서는 실시예 1에서 제조된 BSA-AuNC, HRP-AuNC 및 GOx-AuNC를 이용하여 센싱용 나노입자를 제조하였다.
2. BSA-AuNC 100uL와 HRP-AuNC 10uL를 섞어 혼합 용액을 준비하고(14℃ 온도로 고정), 상기 혼합 용액의 탈용매화(desolvation)를 발생시켜 단백질이 일정한 모양과 크기로 뭉치도록 하기 위해 Acetonitrile과 Ethanol을 4 대 1의 비율로 섞은 용액 300uL를 상기 혼합 용액에 천천히 섞고, 상기 혼합 용액의 색이 불투명하게 바뀌면 뭉친 단백질간의 Amine기의 Cross-linking이 이루어지도록 하기 위해 1% Glutaraldehyde 40ul를 넣어 12시간 동안 900RPM 조건으로 반응시킨다. 이후, 원심 분리를 통해 입자화되지 않은 단백질을 제거하여 BSA-AuNC와 HRP-AuNC가 뭉쳐서 형성된 과산화수소 측정용 나노입자(HPNP)를 얻었다.
3. BSA-AuNC와 HRP-AuNC 대신에 BSA-AuNC 50uL, HRP-AuNC 10uL 및 GOx-AuNC 50uL를 섞어 혼합 용액을 준비하고, Acetonitrile과 Ethanol을 4 대 1의 비율로 섞은 용액 200uL를 사용한 것을 제외하고는, 다른 조건을 실시예 2의 2와 동일하게 하여, BSA-AuNC, HRP-AuNC 및 GOx-AuNC가 뭉쳐서 형성된 글루코오스 측정용 나노입자(GNP)를 얻었다.
<실시예 3> 센싱용 나노입자의 특성 확인
1. 실시예 2의 2에서 제조된 과산화수소 측정용 나노입자를 TEM으로 확인하여 그 결과를 도 5에 나타내었고, 상기 과산화수소 측정용 나노입자에 대해 DLS 분석을 실시하여 그 결과를 도 6에 나타내었고, 상기 과산화수소 측정용 나노입자를 일광 및 자외선에서 촬영하여 그 결과를 도 7에 나타내었으며(도 7에서 왼쪽 사진이 일광에서 나노입자를 촬영한 것이고, 오른쪽 사진이 자외선에서 나노입자를 촬영한 것임), 상기 과산화수소 측정용 나노입자의 흡수 파장과 방출 파장을 확인하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.
2. 실시예 2의 3에서 제조된 글루코오스 측정용 나노입자를 TEM으로 확인하여 그 결과를 도 9에 나타내었고, 상기 글루코오스 측정용 나노입자에 대해 DLS 분석을 실시하여 그 결과를 도 10에 나타내었고, 상기 글루코오스 측정용 나노입자를 자외선에서 촬영하여 그 결과를 도 11에 나타내었다. 상기 복합효소입자(CENP)는 BSA-AuNC, HRP-AuNC 및 GOx-AuNC 대신에 BSA, HRP 및 GOx를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 2의 3과 동일하여 하여 형성하였다.
3. 도 5 및 6을 보면 과산화수소 측정용 나노입자는 구형의 형태를 가지며 나노 사이즈를 가짐을 알 수 있고, 도 7을 보면 과산화수소 측정용 나노입자는 형광 특성을 가지며, 도 8을 보면 과산화수소 측정용 나노입자는 흡수 파장의 피크가 248nm이며 방출 파장의 피크가 720nm임을 알 수 있다.
4. 도 9 및 10을 보면 글루코오스 측정용 나노입자는 구형의 형태를 가지며 나노 사이즈를 가짐을 알 수 있고, 도 11을 보면 글루코오스 측정용 나노입자는 형광 특성을 가지나, BSA, HRP 및 GOx를 포함하는 복합효소입자는 형광 특성을 가지지 않음을 알 수 있다.
<실시예 4> 과산화수소 측정용 나노입자를 이용한 과산화수소 측정
1. 과산화효소입자(ENP), HPNP, 100mM의 과산화수소가 혼합된 HPNP에 대하여, 흡수 파장 248nm 및 방출 파장 720nm으로 하여 형광 세기를 측정하여 도 12에 나타내었고, HPNP, 100mM의 과산화수소가 혼합된 HPNP를 자외선 하에서 사진 촬영하여 그 결과를 도 13에 나타내었고(도 13에서 A가 HPNP를 촬영한 것이고, 오른쪽 사진이 100mM의 과산화수소가 혼합된 HPNP를 촬영한 것임), BSA-AuNC, HRP-AuNC 및 HPNP 각각에 대하여 혼합되는 과산화수소의 농도를 달리하여, 흡수 파장 248nm 및 방출 파장 720nm으로 하여 형광 세기를 측정하고 형광 세기 감소율을 계산하여 그 결과를 도 14 및 15에 나타내었다. 상기 과산화효소입자(ENP)는 BSA-AuNC, HRP-AuNC 및 GOx-AuNC 대신에 BSA 및 HRP를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 2의 3과 동일하게 하여 형성하였다.
2. 도 12 및 13을 보면, 과산화효소입자는 형광 세기가 0에 가까워 형광 성질을 가지는 입자가 아님을 알 수 있고, HPNP는 형광 세기가 8000 정도인데 100mM의 과산화수소를 첨가하면 형광의 세기가 3000 정도로 낮아지는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 14 및 15를 보면, BSA-AuNC의 검출 한계가 10μM이고, HRP-AuNC의 검출 한계가 1μM인데 반해, HPNP의 검출 한계는 10nM임을 알 수 있고, HPNP가 BSA-AuNC와 HRP-AuNC에 비해서 과산화수소의 저농도에서 감소율이 크다는 것을 알 수 있다.
<실시예 5> 과산화수소 측정용 나노입자의 선택성 확인
1. 과산화수소 측정용 나노입자에 ZnCl2, KCl, MgCl2, gulcose, GSH(glutathione), Vc(ascorbic acid), H2O2를 혼합하고, 자외선 하에서 사진 촬영하여 그 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16에서 Blank는 HPNP에 다른 용액들과 농도를 동일하게 하기 위해 같은 양의 3차 증류수를 혼합한 경우를 의미한다.
2. 도 16을 보면, Blank의 형광과 비교해볼 때, Zn2+, K+, Mg2+, glucose, glutathione(GSH), ascorbic acid(Vc)은 형광 변화가 없는데, 과산화수소는 형광이 변화하여, 상기 과산화수소 측정용 나노입자는 과산화수소에 대하여 선택성을 가짐을 알 수 있다.
<실시예 6> 클루코오스 측정용 나노입자를 이용한 글루코오스의 측정
1. 글루코오스 측정용 나노입자, PBS 및 TMB 용액을 혼합한 후, 농도를 달리하는 글루코오스를 첨가하여 반응시킨 후 디지털 카메라로 촬영하여 그 결과를 도 17 및 18에 나타내었다. 도 17의 (a)는 글루코오스가 혼합되지 않은 경우의 이미지이며, 도 17의 (b)는 2mM의 글루코오스가 혼합된 경우의 이미지이고, 도 18의 (a)는 글루코오스가 혼합되지 않은 경우의 이미지이며, 도 18의 (b)는 100uM의 글루코오스가 혼합된 경우의 이미지이다.
2. 도 17 및 18을 보면, 글루코오스가 추가로 혼합되는 경우 색상이 변화함을 알 수 있으며, 글루코오스가 첨가되는 양이 많을수록 더욱 푸른색을 뜀을 알 수 있다.
<실시예 7> 글루코오스 측정용 전기화학적 센서의 제조
1. 황산과 과산화수소를 7:3의 비율로 섞어 세척 용액을 준비하고, 금기판(1×1.5cm)을 세척 용액에 담궈 불순물을 제거하고, 70% 에탄올 및 3차수 순으로 세척하고 건조하였다.
2. 이후, chemical linker인 Cysteamine(7.7mg/ml in 100% EtOH) 200uL를 금기판에 도포하고, 반응하지 않은 링커를 제거하기 위해 2시간 뒤 에탄올을 이용하여 금기판을 세척하고, 1% glutaraldehyde 용액을 금기판 표면에 뿌린 후, 10분 뒤 3차수를 이용해 금기판을 세척 후, 실시예 2의 3에서 제조된 GNP 100uL를 금기판 위에 도포하고, 8시간 이상 반응 시킨 후, 3차수를 이용하여 금기판을 세척하여 금기판에 GNP가 고정된 글루코오스 측정용 센서 1을 준비하였다. 도 19는 GNP 고정 전(a) 및 후(b)의 금 기판의 주사전자현미경(SEM) 이미지이고, 도 20은 GNP 고정 전(a) 및 후(b)의 금 기판의 원자력현미경(AFM) 이미지인데, 도 19 및 20을 보면, 금기판 위에 나노입자가 잘 올라가 있음을 확인할 수 있다.
3. GNP 대신에 HRP-AuNC를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 7의 2과 동일하게 하여 HRP-AuNC가 고정된 센서 2를 제조하였다.
4. GNP 대신에 GOx-AuNC를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 7의 2과 동일하게 하여 GOx-AuNC가 고정된 센서 3을 제조하였다.
5. GNP 대신에 CENP를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 7의 2과 동일하게 하여 CENP가 고정된 센서 4를 제조하였다.
<실시예 8> 센서의 전기화학적 특성 확인
1. Cyclic voltammetry 측정
(1) 순환전압전류법(Cyclic voltammetry)을 통해 실시예 7에서 제조된 센서 1 내지 4의 전기화학적 특성을 분석하여 그 결과를 도 21 내지 23에 나타내었다. 상기 CV 실험에서는 CHI-660e 장치를 이용하였으며, PBS를 전해질로 하는 삼전극 시스템이 사용되었고, 센서 1 내지 4 각각이 워킹 전극으로, Ag/AgCl 전극을 레퍼런스 전극으로, 백금 전극을 카운터 전극으로 각각 사용하였다. 도 21은 글루코오스 1uM을 넣었을 때 센서 1 내지 3의 CV 그래프를 나타내며, 도 22는 글루코오스 1uM을 넣었을 때 센서 1 및 4의 CV 그래프를 나타내고, 도 23은 -0.55V에서 글루코오스 농도에 따른 환원 피크 전류 값의 선형화 결과를 나타내는 그래프이다.
(2) 도 21 내지 23을 보면, 센서 1을 사용하는 경우 클루코오스 센싱의 민감도를 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.
2. I-t curve Amperometry 측정
(1) 글루코오스의 농도별 실시간 반응을 확인하기 위해 I-t Amperometry법을 실시하였으며, 상기 실험에서는 PBS를 전해질로 하는 삼전극 시스템이 사용되었고, 센서 1이 워킹 전극으로, Ag/AgCl 전극이 레퍼런스 전극으로, 백금 전극이 카운터 전극으로 각각 사용되고, -0.55V의 potential, 0.1초의 sampling interval 및 5×106(A/V)의 sensitivity로 진행되었다. 각 시간별로 Glucose 최종농도가 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320nM이 되도록 준비된 글루코오스 용액을 10ul씩 넣고, amperometric i-t curve 데이터를 얻어 그 결과를 도 24 및 25에 나타내었다. 또한, 센서 1의 선택성을 확인하기 위해 5mL의 PBS를 챔버에 넣은 후 최종 농도가 100nM이 되도록 Glucose, Ascorbic acid(AA) 및 Uric acid(UA) 50ul를 순차적으로 넣고 amperometric i-t curve 데이터를 얻어 그 결과를 도 26에 나타내었다. 또한, 실제 샘플에서 센서 1의 글루코오스 측정 능력을 확인하기 위하여, serum 용액과, 최종 농도가 100nM이 되도록 glucose가 섞인 serum 용액을 번갈아 가며 50ul씩 넣고, amperometric i-t curve 데이터를 얻어 그 결과를 도 27에 나타내었다.
(2) 도 24 및 25를 보면 센서 1을 이용하여 극미량의 glucose의 측정이 가능함을 알 수 있고, 도 26를 보면 다른 물질과 함께 글루코오스가 존재하여도 글루코오스에만 선택적으로 amperometric 반응을 나타내는 것을 확인할 수 있고, 도 27을 보면 사람의 혈액 샘플에서 오직 글루코오스에만 amperometric 반응을 나타내는 것을 확인할 수 있어, 센서 1이 높은 민감도를 가지고 글루코오스를 선택적으로 센싱할 수 있음을 알 수 있다.
이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. 단백질-금나노클러스터와, 상기 단백질-금나노클러스터에 결합된 효소-금나노클러스터를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 효소-금나노클러스터는 과산화효소-금나노클러스터를 포함하며,
    상기 단백질-금나노클러스터는 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 단백질을 포함하고,
    상기 과산화효소-금나노클러스터는 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 과산화효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 나노입자는 상기 단백질-금나노클러스터와 상기 과산화효소-금나노클러스터가 서로 뭉쳐 형성되며, 구형의 형태를 가지고, 과산화수소와 반응 시 형광 세기가 변화하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 단백질은 알부민이 사용되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 효소-금나노클러스터는 과산화효소-금나노클러스터 및 글루코오스산화효소-금나노클러스터를 포함하며,
    상기 단백질-금나노클러스터는 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 단백질을 포함하고,
    상기 과산화효소-금나노클러스터는 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 과산화효소를 포함하며,
    상기 글루코오스산화효소-금나노클러스터는 금나노클러스터와 상기 금나노클러스터를 에워싸는 글루코오스 산화효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 나노입자는 상기 단백질-금나노클러스터, 상기 과산화효소-금나노클러스터 및 상기 글루코오스산화효소-금나노클러스터가 서로 뭉쳐 형성되며, 구형의 형태를 가지고, 글루코오스 측정을 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 나노입자와 TMB 용액을 혼합한 혼합용액에 글루코오스를 첨가하면, 글루코오스 존재 및 그 양에 따라 혼합용액의 색상이 변화하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  8. 금속 전극과, 링커에 의해 상기 금속 전극에 결합된 글루코오스 측정용 나노입자를 포함하며,
    상기 글루코오스 측정용 나노입자는 제6항의 나노입자가 사용되는 것을 특징으로 하는 글루코오스 측정용 센서.
  9. 단백질-금나노클러스터와, 효소-금나노클러스터를 섞어 혼합용액을 준비하는 혼합용액준비단계와, 탈용매화를 통해 단백질-금나노클러스터와 효소-금나노클러스터가 뭉쳐 입자가 형성되도록 에탄올을 포함하는 탈용매화 용액을 혼합용액에 첨가하여 반응시키는 탈용매화단계와, 상기 탈용매화단계에서 형성된 입자를 가교시켜 견고한 형태를 가지도록 탈용매화단계 후 추가적으로 가교제를 첨가하는 가교단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 혼합용액준비단계에서는 단백질-금나노클러스터와, 과산화효소-금나노클러스터가 혼합되는 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
  11. 제9항에 있어서
    상기 혼합용액준비단계에서는 단백질-금나노클러스터와, 과산화효소-금나노클러스터와, 글루코오스산화효소-금나노클러스가 혼합되는 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
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