KR20220040773A - 반월상 연골 지지체 및 이의 제조방법 - Google Patents

반월상 연골 지지체 및 이의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20220040773A
KR20220040773A KR1020200123906A KR20200123906A KR20220040773A KR 20220040773 A KR20220040773 A KR 20220040773A KR 1020200123906 A KR1020200123906 A KR 1020200123906A KR 20200123906 A KR20200123906 A KR 20200123906A KR 20220040773 A KR20220040773 A KR 20220040773A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
support
layer
cells
meniscus
tissue regeneration
Prior art date
Application number
KR1020200123906A
Other languages
English (en)
Inventor
노인섭
노건수
하오 응유엔 트란
고피나탄 자나르타난
Original Assignee
서울과학기술대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울과학기술대학교 산학협력단 filed Critical 서울과학기술대학교 산학협력단
Priority to KR1020200123906A priority Critical patent/KR20220040773A/ko
Publication of KR20220040773A publication Critical patent/KR20220040773A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A61F2/30—Joints
    • A61F2/30756—Cartilage endoprostheses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A61F2/30—Joints
    • A61F2/38—Joints for elbows or knees
    • A61F2/3872—Meniscus for implantation between the natural bone surfaces
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3843—Connective tissue
    • A61L27/3852—Cartilage, e.g. meniscus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/58—Materials at least partially resorbable by the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A61F2/30—Joints
    • A61F2/30756—Cartilage endoprostheses
    • A61F2002/30762—Means for culturing cartilage
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A61F2/30—Joints
    • A61F2/30756—Cartilage endoprostheses
    • A61F2002/30766—Scaffolds for cartilage ingrowth and regeneration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/06—Materials or treatment for tissue regeneration for cartilage reconstruction, e.g. meniscus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

전기방사 지지체층 및 3D 프린팅 지지체층이 적층되어 이루어지는 조직재생용 지지체로서, 상기 전기방사 지지체층은 상기 조직재생용 지지체의 상단, 또는 하단 중 어느 하나 이상의 일면을 이루고, 상기 조직재생용 지지체는 적어도 하나의 세포 배양층을 포함하는, 조직 재생용 지지체, 이의 제조방법 및 상기 조직재생용 지지체를 포함하는 생분해성 의료기기에 관한 것이다.

Description

반월상 연골 지지체 및 이의 제조방법{A biodegradable meniscus scaffold and its manufacturing method}
본 발명은 전기방사 지지체층 및 3D 프린팅 지지체층을 포함하는 조직재생용 지지체, 이의 제조방법 및 상기 지지체를 포함하는 생분해성 의료기기에 관한 것이다.
생체조직공학은 손상 되었거나 기능을 상실한 조직 및 장기를 복원, 재생 또는 대체하여 정상적인 기능을 유도하기 위하여 생체재료 지지체에 세포를 배양하여 체내에 이식함으로써 조직의 수복과 재생을 추구하는 기술이다.
반월상 연골은 쐐기 형태의 반달모양으로 대퇴골과 경골 사이에 관절 연골과 함께 있다. 반월상 연골은 슬관절의 하중과 스트레스를 분산, 외부 충격을 흡수시킬 뿐만 아니라, 관절 액을 원활하게 분산시키는 윤활작용 등 슬관절의 기능을 유지하는데 있어서 매우 중요한 역할을 하는 구조물 중 하나이다.
이러한 반월상 연골의 손상은 연골 자체의 퇴행성 변화, 교통사고 및 다양한 스포츠 활동 등에 의해 발생하며, 슬관절 손상 중 가장 빈도가 높다. 반월상 연골은 외곽부의 2/3정도만이 혈관이 존재하는 부위로 치유에 있어서 제한성을 갖는다. 반월상 연골이 손상되면 혈관이 존재하는 외곽부의 red zone의 경우 자발적인 재생이 가능하기 때문에 봉합법(suturing)이, 혈관이 존재하지 않아 재생이 이루어지지 않는 내곽부의 화이트 존(white zone)의 경우 절제법(menisectomy)이 수행 된다. 또한 동종이 식법도 수행된다. 그러나 이들은 퇴행성 관절염을 유발하는 등의 근본적인 치료가 될 수 없으며, 동종이식법의 경우 감염 및 면역 거부의 우려가 있고 공급의 제한이 있다.
현재 인공 반월상 연골은 인체 하중을 반복적으로 받는 특성을 고려하여 콜라겐을 고밀도로 제조하여 손상된 반월상연골의 부분적으로 대체하여 사용하고 있으나, 인체하중에 대하여 탄성을 제공하지 못하고 있으며 또한 환자의 조직을 재생하지 못하고 있다.
최근에는, 반월상 연골 형태의 천연 또는 합성 고분자 지지체를 이식하는 연구되고 있다. 조직공학에 사용되는 생체재료 지지체를 이용하여 만든 인공 조직을 체내에 이식하게 되면 체내 이식 초기에는 지지체로 인해 이식된 조직 세포들이 신체 내에서 사멸하지 않고 본래의 기능을 유지하는 기반을 제공하고 시간이 경과함에 따라서 생분해성 고분자는 점차 소멸하고 신체 내부에 충분히 적응한 이식 세포만으로 구성된 자연조직과 동일한 형태와 기능을 지닌 조직을 형성할 수 있게 되어야 된다.
생체조직 지지체로는 생분해성의 천연 및 합성 고분자가 사용되는데 천연고분자로는 알지네이트, 단백질, 콜라겐(젤라틴), 피브린, 알부민, 글루텐, 엘라스틴, 히루아루론산, 셀룰로오스, 전분, 키토산 등이 있고, 합성고분자로는 폴리글리콜라이드(PGA), 폴리락타이드(PLA), 폴리다이옥사논(polydioxane) 그리고 그들의 공중합체, 폴리포스파젠, 폴리안하이드라이드 등이 사용되고 있다.
이러한 생분해성 고분자를 사용하여 조직세포의 담체를 제작하여 세포와 함께 체내에 이식하게 되면, 세포가 신체 조직에 적응하여 조직을 형성하는 도중에 생분해성 고분자는 차차 분해되어 사라지므로 재수술을 통해 고분 자를 제거하는 불편을 덜 수 있으며 이물질 삽입에 의한 만성적인 면역반응 또한 감소하는 효과를 기대할 수 있 게 된다. 또한 생분해성 고분자는 생체내에서 이물반응을 일으키지 않아야 하며, 전혀 무해한 물질로 분해되어 야 함은 물론 적절한 가공 특성 및 강도를 지녀야 한다.
하지만, 종래 생분해성 합성 고분자를 사용한 생체조직공학 지지체들은 지지체의 강도와 탄성이 낮아 원하는 생체조직 의 지지체로 사용하기에 한계가 있었으며, 또한 인체의 하중을 받으면서 동시에 생분해와 함께 환자의 손상된 조직을 재생하지 못하는 문제점이 있다. 특히 생분해성 지지체를 사용하여 반월상연골을 재생하는 과정에서는 주변 조직으로부터 지지체의 내부까지 조직을 재생해야 함에도 불구하고, 지지체 내부로의 조직재생을 유도하지 못하는 문제점을 갖고 있다.
따라서, 상기 생분해성 합성 고분자의 물성 한계를 극복하고, 반월상연골 지지체의 내부까지 연골조직을 재생할 필요할 수 있는 생분해성 지지체의 개발이 필요하다. 이러한 문제점들을 풀기 위해서 반월상연골의 3차원 형태와 모습에 따라 반월상연골 프레임(frame)을 제조하고, 다른 한편으로는 3D 프린팅 및/혹은 나노섬유기술을 적용하여 반월상연골의 3차원 형태에 따라 박막의 지지체 (=층으로 된 지지체 박막)를 제조한 다음에, 각 층별로 세포 배양을 진행하여 반월상연골 프레임에 적층하여 세포가 함유된 반월상연골 지지체를 제조할 수 있다. 이러한 세포가 포함된 박막 층으로 구성된 반월상연골 지지체는 환자 하중을 견딜 수 있는 기계적 물성이나 구조적 안정성이 유지되면서, 지지체층의 내부에 존재하는 세포로부터의 조직재생을 유도할 수 있는 기술이 될 수 있으며, 동시에 지지체 모든 부분으로부터의 반월상연골의 조직재생을 유도할 수 있는 조직공학 지지체를 개발하여 환자조직과 같은 반월상연골 조직공학기술에 적용할 필요가 있다. 박막은 반월상연골의 단면을 모사할 수 있는 나노크기와 마이크로 크기로 복합된 형태로 제조하는 기술이 필요하며, 이는 3D 프린팅기술과 전기방사기술이 적합할 수 있으며, 전기방사기술은 패턴을 제조할 수 있는 기술을 적용하면, 인체조직을 모방하는데 유용하다.
한국등록특허 제1617434호, “생분해성 생체고분자를 이용한 다층구조의 연골지지체 제조방법” (등록일: 2016.04.26)
본 발명의 목적은 전기방사 지지체층 및 3D 프린팅 지지체층이 적층되어 이루어지는 조직재생용 지지체로서, 상기 전기방사 지지체층은 상기 조직재생용 지지체의 상단, 또는 하단 중 어느 하나 이상의 일면을 이루고, 상기 조직재생용 지지체는 적어도 하나의 세포 배양층을 포함하는, 조직 재생용 지지체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 전기방사 지지체층을 제조하는 단계, (b) 3D 프린팅 지지체층을 제조하는 단계 및 (c) 상기 제조된 전기방사 지지체층 및 3D 프린팅 지지체층을 각각 1 이상 적층시키는 단계를 포함하는 조직재생용 지지체 제조방법으로, 상기 (c)단계는, 적어도 하나의 세포 배양층을 로딩하는 단계를 포함하는, 조직재생용 지지체 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 조직재생용 지지체를 포함하는 생분해성 의료기기를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 전기방사 지지체층 및 3D 프린팅 지지체층이 적층되어 이루어지는 조직재생용 지지체로서, 상기 전기방사 지지체층은 상기 조직재생용 지지체의 상단, 또는 하단 중 어느 하나 이상의 일면을 이루고, 상기 조직재생용 지지체는 적어도 하나의 세포 배양층을 포함하는, 조직 재생용 지지체가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 지지체는 반월상일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 지지체는, 폴리카프롤락톤(Polycaprolactone, PCL), 폴리글리콜라이드(Polyglycolic acid, PGA), 폴리락타이드(Polylactic acid, PLA) 폴리카프롤락톤(Polycaprolactone, PCL), 폴리(락타이드-글라이콜라이드)(Poly(lactic-co-glycolic) acid, PLGA) 및 폴리다이옥사논(polydioxane) 중 적어도 어느 하나 이상의 생분해성 고분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, (a) 전기방사 지지체층을 제조하는 단계, (b) 3D 프린팅 지지체층을 제조하는 단계 및 (c) 상기 제조된 전기방사 지지체층 및 3D 프린팅 지지체층을 각각 1 이상 적층시키는 단계를 포함하는 조직재생용 지지체 제조방법으로, 상기 (c)단계는, 적어도 하나의 세포 배양층을 로딩하는 단계를 포함하는, 조직재생용 지지체 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 전술한 조직재생용 지지체를 포함하는, 생분해성 의료기기가 제공된다.
본 발명을 이용하면 조직재생용 지지체는 동일 층에 각기 다른 세포 혹은 줄기세포를 로딩하거나, 층의 일부에만 세포를 로딩하고 추후 다른 종의 세포를 로딩하거나 로딩되지 않도록 조절할 수 있다. 즉, 자가, 동종 또는 이종의 세포를 로딩시킬 수 있고, 지지체 내부에서 세포들의 부착, 증식, 조직재생 등이 지지체 내부에서 진행될 수 있으며, 층상의 지지체 구조에 따라 생체 하중을 분산시킬 수 있어 조직재생 효과 및 기계적 안정성이 향상되는 특징이 있다.
특히, 생분해성 고분자로 폴리카프롤락톤을 사용하거나, 폴리카프롤락톤에 세포부착성 고분자가 결합된 물질을 이용하게 되면 세포부착성이 향상되고, 생분해성, 조직재생성, 탄성, 기계적 강도 등이 조절될 수 있다.
3D 프린팅 박막 층과 전기방사 박막층을 교대로 적층함으로써, 생분해, 층간 특성, 조직재생성, 기계적 강도 등의 조절이 용이하고, 각 층에 세포를 접종 및 배양할 때 줄기세포 및 분화된 세포를 사용할 수 있으며, 줄기세포는 적절한 환경을 제공함으로써 특정 조직의 재생을 유도할 수 있다.
아울러, 나노섬유가 방사된 패턴 지지체를 바닥 또는 상단에 위치시킴으로써 세포를 로딩하고, 소정의 각도로 나노섬유가 패턴되어 있어 로딩된 세포가 밑으로 빠져나가지 않을 수 있으므로 조직재생시 효과적이다. 또한, 본 발명의 조직재생용 지지체는 생분해성 의료기기에 적용할 수 있으며, 플랫폼 기술 적용이 가능하다.
그러나 본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 반월상 연골 지지체 제조과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2 는 3D 프린팅 하여 제조한 반월상연골 층 지지체 및 섬유 밀도가 상이한 패턴구조를 가진 전기방사 나노섬유매트를 광학 촬영한 사진을 도시한 것이다. 나노섬유 매트의 패턴을 전기방사에 의해 제조되었으며, 패턴 사이의 기공 사이는 나노섬유를 제조하여 기공의 일부를 일정 두께를 형성하도록 제조하였다.
도 3은 전기방사를 이용하여 기공크기와 두께 등이 다르도록 제조한 3가지 타입으로 제조한 나노패턴 섬유메쉬(a, b, c) 및 3D 프린팅으로 제조된 반월상 연골 지지체 프레임(d)의 현미경 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 반월상 연골 지지체(스캐폴드)의 MC3T3 세포 증식의 광학 밀도를 측정한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 시험 관내 MC3T3 세포 배양 후 반월상연골 스캐 폴드의 H & E 염색 결과를 관찰한 것이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 이용한 용어는 단지 설명을 목적으로 이용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 이용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 이용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 전기방사 지지체층 및 3D 프린팅 지지체층이 적층되어 이루어지는 조직재생용 지지체로서, 상기 전기방사 지지체층은 상기 조직재생용 지지체의 상단, 또는 하단 중 어느 하나 이상의 일면을 이루고, 상기 조직재생용 지지체는 적어도 하나의 세포 배양층을 포함하는, 조직 재생용 지지체가 제공된다. 이 때, 상기 전기방사 지지체층 또는 상기 3D 프린팅 지지체층의 각 모서리는 단일선상에 위치하지 않도록 적층될 수 있으며, 상기 지지체층 중 적어도 하나가 적층된 후 상기 세포 배양층이 적층된 구조를 포함할 수 있으며, 지지체층 및 세포배양층이 교차로 적층된 구조일 수도 있다. 구체적으로는, 생분해성 고분자 지지체층 위에 세포부착성 단백질을 코팅한 다음 세포가 접종된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 지지체는 각 생분해성 고분자에 세포부착성 고분자 또는 세포부착성 도메인을 더 포함하는 생분해성-세포부착성 고분자를 포함할 수 있고, 상기 생분해성-세포부착성 고분자를 포함하는 지지체는 세포부착성 및 조직재생성이 향상된 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 조직재생용 지지체는 반월상 지지체일 수 있으며, 반월상 연골 지지체로서 이식 용도로 사용되는 것일 수 있다.
예를 들어, 전기방사 지지체층은 콜라겐, 젤라틴, 실크 피브로인일 수 있고, 일정한 배향을 갖는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 예로, 전기방사 지지체층은 단백질과 다당류로 이루어진 망상 구조를 갖는 세포외 기질의 성분일 수 있고, 구체적으로는 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 구조체(structural component); 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌 및 테나신 등의 접착성 단백질; 황산콘드로이틴(chondroitin sulfate)이나 황산헤파란 (heparan sulfate) 그리고 주단백질로부터 생성되는 프로테오글리칸; 및 다당류로만 이루어진 히알루론산 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 전기방사 지지체층은 각 층에 방사형으로 나노섬유를 추가로 포함하는 전기방사 나노섬유 지지체층일 수 있다. 전기방사 나노섬유 지지체층은 하중을 받더라도 지지체에 적용되는 하중이 분산되는 효과가 있으므로 지지체의 안정성을 도모할 수 있다. 프린팅물의 구조는 마름모, 격자, 벌집 등 다양하게 조절할 수 있으며, 각 층은 마이크로 두께와 스트럿(strut) 간격을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 전기방사 지지체층은 각 스트럿 사이에 나노섬유들이 존재하는 패턴이 형성된 구조일 수 있다. 소정의 각도로 패턴된 나노섬유로 인해 세포를 로딩시에도 밑으로 세포가 빠지지 않을 수 있다. 이 때, 소정의 각도는 30도 내지 90도 일 수 있다. 상기 나노섬유는 전기방사 지지체층 층 또는 3D 프린팅 지지체층 층을 프레임에 넣어 적층시에 프린팅 층들이 서로 붙지 않도록 완충 역할을 하고, 조직 재생시에 계면층으로 작용할 수 있다. 또한, 3D프린팅 지지체층에 세포 접종 시, 세포가 아래쪽으로 빠져나가지 않도록 조직재생용 지지체의 상면 또는 하면의 일면에 전기방사 지지체층을 배치하고, 구체적으로는 가장 낮은 지지체층에 무작위(랜덤)로 전기방사 지지체층을 배치함이 바람직하다.
일 측에 따르면, 상기 지지체는, 생분해성 고분자를 포함할 수 있다. 구체적으로는, 각 생분해성 고분자에 세포부착성 고분자 또는 세포부착성 도메인을 더 포함하는 생분해성-세포부착성 고분자를 포함할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 지지체는, 폴리카프롤락톤(Polycaprolactone, PCL), 폴리글리콜라이드(Polyglycolic acid, PGA), 폴리락타이드(Polylactic acid, PLA) 폴리카프롤락톤(Polycaprolactone, PCL), 폴리(락타이드-글라이콜라이드)(Poly(lactic-co-glycolic) acid, PLGA) 및 폴리다이옥사논(polydioxane)중 적어도 어느 하나 이상의 생분해성 고분자를 포함할 수 있다. 구체적으로는, 상기 3D 프린팅 지지체층이 생분해성 고분자를 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 생분해성 고분자는 폴리카프롤락톤일 수 있다. 특히, 폴리카프롤락톤은 탄성, 생분해성, 기계적 강도를 제공할 수 있는 생체재료이므로 3D 프린팅된 폴리카프롤락톤 층에 세포를 접종 및 세포 배양에 적합하다.
이 때, 세포는 생체 유래로 배양가능한 것이면 크게 제한되지는 않으나, 생체 내 조직 재생 효과를 가지는 세포임이 바람직하다. 예를 들어, 줄기세포, 섬유아세포, 반월상 연골세포 등일 수 있고, 연골 유래의 중간엽 줄기세포임이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 반월상 연골의 가장 바깥 부분에는 혈관 세포를 로딩하거나 사용하지 않을 수도 있다. 또한, 복수의 층에는 동종의 세포가 로딩될 수 있고, 이종의 세포가 로딩될 수 있으며, 각 층별로 서로 상이한 세포가 로딩될 수 있다. 가령, 조직재생용 지지체 각 층에 세포를 로딩할 때, 다른 부분이 볼록하므로 다른 세포를 추후 로딩하거나 혹은 세포가 로딩되지 않도록 조절할 수 있는 프레임을 이용함으로써 동일 층에도 다른 세포를 로딩할 수 있다. 이 때, 세포는 예를 들어 줄기세포, 섬유아세포, 반월상 연골세포 등일 수 있고, 연골유래의 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 반월상 연골의 가장 바깥 부분에는 혈관 세포를 로딩하거나 사용하지 않을 수도 있다. 또한, 복수의 층에는 동종의 세포가 로딩될 수 있고, 이종의 세포가 로딩될 수 있으며, 각 층별로 서로 상이한 세포가 로딩될 수 있다. 가령, 지지체 각 층에 세포를 로딩할 때, 다른 부분이 볼록하므로 다른 세포를 추후 로딩하거나 혹은 세포가 로딩되지 않도록 조절할 수 있는 프레임을 이용함으로써 동일 층에도 다른 세포를 로딩할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 조직재생용 지지체 제조방법은 3D 프린팅기술을 사용하여 복원하고자 하는 조직 혹은 장기의 형상을 구현하는 생분해성 프레임을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 생분해성 프레임은 기공을 가질 수 있으며, 프레임의 기공 혹은 박막 층에 실을 연결하여 반월상연골 주변 골에 연결하여 이식되는 지지체가 압축하중을 받는 동안 그 위치를 유지할 수 있도록 디자인 할 수 있다. 실은 또한 생분해 실이 바람직하며, 생분해성 봉합사가 사용될 수 있다.
본 발명의 조직재생용 지지체는 전기방사된 나노섬유를 포함하는 전기방사 지지체층 및 3D 프린팅 지지체층이 적층된 구조를 포함하고, 상기 적층된 구조는 세포부착성 고분자-생분해성 고분자로 구성된 하이브리드 고분자로 이루어짐으로써 신체 하중이 지지체 표면에 적용되면 지지체 내부에 로딩된 세포에 의해 세포부착성 향상 및 조직재생촉진이 유도될 수 있다. 또한, 본 발명의 지지체는 상기 하이브리드 고분자를 이용하여 지지체 층을 제조하여 프레임에 적층하여 반월상연골 지지체를 제조함으로써, 폴리카플록락톤(PCL) 단일 생분해성 고분자를 이용하여 적층한 경우와 다르게 세포부착성을 제공할 수 있고, 또한 생분해 속도가 다르게 디자인할 수 있다. 따라서 PCL과 같이 생분해 속도가 늦은 단일 생분해성 고분자 지지체 층과 세포부착성이 향상되고, PCL 고분자의 비율이 낮은 하이브리드 고분자를 이용하여 제조되는 하이브리드 고분자 지지체 층을 복합하여 반월상연골 프레임에 적용하여 반월상연골 지지체를 제조함으로써, 지지체 각 층의 생분해 속도조절 및 지지체의 기계적 물성 유지의 균형을 맞출 수 있는 특징이 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, (a) 전기방사 지지체층을 제조하는 단계; (b) 3D 프린팅 지지체층을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 제조된 전기방사 지지체층 및 3D 프린팅 지지체층을 각각 1 이상 적층시키는 단계를 포함하는 조직재생용 지지체 제조방법으로, 상기 (c)단계는, 적어도 하나의 세포 배양층을 로딩하는 단계를 포함하는, 조직재생용 지지체 제조방법이 제공된다. 이 때, 세포는 전술한 세포와 동일한 것일 수 있고, 생체 유래로 배양가능한 것이면 크게 제한되지는 않으나, 생체 내 조직 재생 효과를 가지는 세포임이 바람직하다. 구체적으로, 상기 (c)단계는 생분해성 고분자 지지체층 위에 세포부착성 단백질을 코팅한 뒤 세포를 접종하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이와 같은 단계의 수행으로, 본 발명의 조직재생용 지지체의 세포부착성 및 조직재생성을 향상시킬 수 있다.
예를 들면, 프레임 내부에 지지체층을 로딩하고, 로딩된 지지체층 위로 세포배양층을 로딩하고 세포를 배양시키는 과정이 반복적으로 수행될 수 있다. 이 경우, 반복적으로 로딩되는 세포배양층은 각각 상이한 종류의 세포를 포함할 수 있으며, 적어도 하나의 세포배양층에는 적어도 1종의 세포가 배양됨이 바람직하다. 일 경우로, 연골 세포를 재생시키기 위한 연골 재생용 지지체를 제조하는 경우라면, 연골조직을 재생시키는 효과를 갖는 세포를 세포배양층 내에 접종한 뒤 적층시키는 것이 바람직하다.
반월상 연골 지지체를 제조하는 경우, 반월상 연골은 높이와 동일 층의 위치에 따라 서로 다른 세포와 조직을 포함하고 있으므로, 3D 프린팅 지지체층 및 전기방사 지지체층으로 구분하여 제조하는 것이 바람직하다. 이 때, 위층과 아래층 각각은 서로 연결되어야 하므로, 전기방사 지지체층은 나노크기의 두께임이 바람직하다. 반월상 연골 지지체가 대상체에 적용되는 경우, 보행하면서 지지체에 불규칙적이고 반복적인 하중이 적용되어 지지체가 생분해되기 시작한다. 이 때, 생분해 기간이 비교적 긴 생분해성 고분자를 지지체층에 사용하고, 생분해성 고분자를 포함하는 3D 프린팅 지지체층에 세포 배양층을 포함시켜 세포가 비교적 긴 시간동안 조직재생이 가능하다.
이 때, 상기 (c) 단계는, 상기 전기방사 지지체층 및 상기 3D 프린팅 지지체층의 각 모서리는 단일선상에 위치하지 않도록 적층시켜 복수의 층상구조를 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 조직재생용 지지체 제조방법은, 상기 제조된 전기방사 지지체층 및 3D 프린팅 지지체층에 세포를 접종하여 배양하는 단계, 세포배양된 박막 층을 각각 1 이상 적층시키는 단계, 적층된 지지체를 세포배양 혹은 생체에 이식하는 단계를 포함할 수 있다. 이 때, 손상된 생체조직을 효과적으로 재생하기 위해서는, 지지체 각 층별로 접종된 세포는 해당 층에만 존재하도록 제작되는 것이 바람직하다. 이 때, 세포는 예를 들어 줄기세포, 섬유아세포, 반월상 연골세포 등일 수 있고, 연골 유래의 중간엽 줄기세포임이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 반월상 연골의 가장 바깥 부분에는 혈관 세포를 로딩하거나 사용하지 않을 수도 있다. 또한, 복수의 층에는 동종의 세포가 로딩될 수 있고, 이종의 세포가 로딩될 수 있으며, 각 층별로 서로 상이한 세포가 로딩될 수 있다. 가령, 지지체 각 층에 세포를 로딩할 때, 다른 부분이 볼록하므로 다른 세포를 추후 로딩하거나 혹은 세포가 로딩되지 않도록 조절할 수 있는 프레임을 이용함으로써 동일 층에도 다른 세포를 로딩할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 조직재생용 지지체 제조방법은 지지체 프레임을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로는, 3D 프린팅 기술을 사용하여 복원하고자 하는 조직 혹은 장기의 형상을 구현하는 생분해성 프레임을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 생분해성 프레임 제조를 통해 프레임의 내부에 층상 구조의 전기방사 지지체층 및 3D 프린팅 지지체층을 적층시켜 조직재생용 지지체를 제조할 수 있다. 상기 생분해성 프레임은 기공을 가질 수 있으며, 프레임의 기공 혹은 박막 층에 실을 연결하여 반월상연골 주변 골에 연결하여 이식되는 지지체가 압축하중을 받는 동안 그 위치를 유지할 수 있도록 디자인 할 수 있다. 이 때, 상기 실은 생분해 실임이 바람직하며, 생분해성 봉합사가 사용될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 전기방사 지지체층은 콜라겐, 젤라틴, 실크 피브로인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 예로, 전기방사 지지체층은 단백질과 다당류로 이루어진 망상 구조를 갖는 세포외 기질의 성분일 수 있고, 구체적으로는 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 구조체(structural component); 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌 및 테나신 등의 접착성 단백질; 황산콘드로이틴(chondroitin sulfate)이나 황산헤파란 (heparan sulfate) 그리고 주단백질로부터 생성되는 프로테오글리칸; 및 다당류로만 이루어진 히알루론산 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 전기방사 지지체층은 각 층에 방사형으로 나노섬유를 추가로 포함하는 전기방사 나노섬유 지지체층일 수 있다. 상기 전기방사 나노섬유 지지체층은 하중을 받더라도 지지체에 적용되는 하중이 분산되는 효과가 있으므로 지지체의 안정성을 도모할 수 있다. 프린팅물의 구조는 마름모, 격자, 벌집 등 다양하게 조절할 수 있으며, 각 층은 마이크로 두께와 스트럿(strut) 간격을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 전기방사 지지체층은 각 스트럿 사이에 나노섬유들이 존재하는 패턴이 형성된 구조일 수 있다. 소정의 각도로 패턴된 나노섬유로 인해 세포를 로딩시에도 밑으로 세포가 빠지지 않을 수 있다. 이 때, 소정의 각도는 15도, 30도 내지 90도 일 수 있다. 상기 나노섬유는 전기방사 지지체층 또는 3D 프린팅 지지체층을 프레임에 넣어 적층시에 프린팅 층들이 서로 붙지 않도록 완충 역할을 하고, 조직 재생시에 계면층으로 작용할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 지지체는, 폴리카프롤락톤(Polycaprolactone, PCL), 폴리글리콜라이드(Polyglycolic acid, PGA), 폴리락타이드(Polylactic acid, PLA) 폴리카프롤락톤(Polycaprolactone, PCL), 폴리(락타이드-글라이콜라이드)(Poly(lactic-co-glycolic) acid, PLGA) 및 폴리다이옥사논(polydioxane) 중 적어도 어느 하나 이상의 생분해성 고분자를 포함할 수 있다. 구체적으로는, 상기 3D 프린팅 지지체층이 생분해성 고분자를 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 생분해성 고분자는 폴리카프롤락톤일 수 있다. 특히, 폴리카프롤락톤은 탄성, 생분해성, 기계적 강도를 제공할 수 있는 생체재료이므로 3D 프린팅된 폴리카프롤락톤 층에 세포를 접종 및 세포 배양에 적합하다.
상기 3D 프린팅 지지체층은 기공이 있어 세포를 접종시 아래쪽으로 떨어질 수 있으므로, 이를 해결하기 위해 나노크기의 기공과 두께를 갖도록 전기방사된 나노섬유 지지체층을 조직재생용 지지체의 상단 또는 하단의 일면에 배치함으로써 세포가 지지체 바깥쪽으로 빠져나가는 것을 방지할 수 있다. 이 때, 지지체의 상단 또는 하단의 일면에 배치되는 전기방사 지지체층은 무작위(랜덤)로 전기방사된 나노섬유일 수 있다.
복수의 3D 프린팅 지지체층 사이에 전기방사 지지체층을 배치하여 적층시, 층별로 접종된 세포가 아래 층으로 이동되는 것을 막기 위해 각 층마다 각도를 다르게 적층하는 것이 바람직하다. 이 때, 3D 프린팅 지지체층 사이에 배치되는 전기방사 나노섬유 지지체층은 전술한 지지체의 상면 또는 하면의 일면에 배치되는 지지체층과는 달리 소정의 각도, 두께 및 기공 등을 포함하는 패턴을 갖는 것이 바람직하다. 구체적으로, 상기 소정의 각도는 15도 내지 90도임이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 측에 따르면, 상기 3D 프린팅 지지체층은 생분해성 고분자를 포함할 수 있다. 일 측에 따르면, 상기 생분해성 고분자는 탄성과 생분해성을 조절할 수 있는 고분자를 선택할 수 있으며, 예를 들면 폴리카프롤락톤(Polycaprolactone, PCL), 폴리카프롤락톤, 폴리락타이드, 폴리(락타이드-글라이콜라이드), 폴리글라이콜라이드 등과 같은 고분자 일 수 있다. 또는, 상기 3D 프린팅 지지체층은 폴리카프롤락톤에 세포부착성 고분자가 결합된 구성을 포함할 수도 있다. 특히, 폴리카프롤락톤은 탄성, 생분해성, 기계적 강도를 제공할 수 있는 생체재료이므로 3D 프린팅된 폴리카프롤락톤 층에 세포를 접종 및 세포 배양에 적합하다.
또한, 3D 프린팅하여 특정 장기의 형상를 모방하는 지지체를 제조하여 지지체 내부로 조직 재생을 유도하기 위해서는, 지지체 내부에 세포를 포함시켜 함께 3D 프린팅 할 수 있다. 이 경우, 100도 가량의 고온에서 프린팅하게 되어 세포들이 사멸할 수 있으므로, 세포가 함유된 지지체층을 미리 제작해둔 조직재생용 지지체 프레임에 적층시켜 제조하는 것이 보다 바람직하다.
조직재생용 지지체가 반월상 연골 지지체로 제조되어 생체 내 이식 용도로 이용되는 경우, 환자가 이동하는 동안 하중을 받게되어 지지체가 이식된 위치에서 벗어날 수 있고, 지나친 하중을 받게 되어 조직재생에 효과가 낮아질 수 있으므로, 지지체 프레임에 전기방사된 나노섬유 지지체층을 연결하여 주변 골조직에 고정시킬 수 있도록 제조됨이 바람직하다. 이 때, 고정수단으로는 생체 적합성을 갖는 의료용 실을 이용함이 바람직하고, 구체적으로는 생분해성 봉합사임이 가장 바람직하다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 전술한 조직재생용 지지체를 포함하는 생분해성 의료기기가 제공된다. 구체적으로는 상기 의료기기는 생체 표면에 일부가 접촉하거나, 생체 내 이식이 가능한 것임이 바람직하고, 접촉 또는 이식된 주변의 조직 또는 세포의 재생을 유도하는 용도로 사용되는 것일 수 있다. 바람직하게 상기 생분해성 의료기기는, 조직 이식용 구조물, 생체모사 조직 등일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 반월상 연골 지지체 및 프레임 제조
반월상 연골 지지체(스캐폴드)는 폴리카프롤락톤(Polycaprolactone, PCL)을 이용하여 생분해성 PCL 프린팅 3층, PCL 반월상연골 프레임 및 3 층의 전기방사 나노섬유 패턴화 필름으로 구성되었으며, 제조 개략도는 도 1에 도시한 바와 같다. 반월상연골 프레임의 바닥층은 랜덤하게 전기방사 하여 제조한 나노섬유 지지체를 적용하였으며, 2층부터는 필요에 따라 전기방사층과 3D 프린팅 층을 프레임 내부에 혼합하여 적층함으로써, 적층 반월상연골 지지체를 제조하였다. 지지체층의 적층은 하나의 층을 프레임에 넣은 후에 중간엽 줄기세포를 접종하여 1 층이 완성되도록 하였으며, 이후에 다시 다른 하나의 층 지지체를 추가하고, 줄기세포 접종과정을 추가하였으며, 이러한 적층과 세포접종을 진행함으로써 세포가 접종된 반월상 연골지지체를 제조하였고, 이러한 세포접종된 반월상연골 지지체를 2주간 in vitro 세포배양을 진행하여 각 층에서의 층 지지체의 분해와 세포증식, 조직재생을 유도하였다. 3D 프린팅 반월상연골 지지체층 및 프레임 제조는 본 연구자 그룹에서 개발하여 논문으로 발표한 5축으로 구성된 로터리 3D 프린터 시스템을 이용하여 제작되었다(참고, Lee, J., Kim, K.E., Bang, S. et al. A desktop multi-material 3D bio-printing system with open-source hardware and software. Int. J. Precis. Eng. Manuf. 18, 605-612 (2017).
실시예 1-1. 3D 프린팅 기술을 이용한 반월상 연골 지지체층의 제조
반월상 연골 지지체(스캐폴드)는 3층의 폴리카프롤락톤(Polycaprolactone, PCL) 고분자를 고온에서 용융하여 90도씨로 고분자를 용융시키면서 3D 프린팅 층을 제조하였다, PCL 프린팅 층의 각 높이는 200 ㎛로 제조되었으며, 압력 450kPa, 속도 300mm / min 및 온도 80 ° C를 갖는 세부적인 처리 매개변수를 사용하여 정밀한 구조 반월상연골 지지체(스캐폴드)를 얻도록 설정했다. 하기 표 1의 프린팅 레이어 및 프레임 치수 조건에 따라 프린팅 하였다.
구분 스트럿 두께(μm) 길이(μm) 높이(μm)
3D 프린팅 층(layer) 174 ± 9.331 160 ± 11.24 200 ± 5.13
3D 프린팅 프레임 174 ± 9.331 160 ± 11.24 800 ± 25.98
실시예 1-2. 3D 프린팅 기술을 이용한 반월상 연골 지지체 프레임의 제조
프린터의 주사기 외부에 온도를 조절할 수 있는 공압식 3D 프린팅 시스템을 이용하여 반월상연골 프레임을 제조하였다. PCL 고분자 파우더를 주사기에 넣은 다음에, 주사기 외부에 온도를 조절할 수 있는 금속홀더를 이용하여 온도를 80도씨 고온으로 올려서 PCL 고분자용액을 제조하였더. 용융된 PCL 용액을 포함하는 주사기에 공압을 적용하여 용액을 주사기 바늘을 통하여 압출시켜 이동식 스테이지 위에 놓인 플라스틱 판에 3D 프린팅하여 PCL 반월상연골 프레임은 제조하였다.
실시예 1-3. 전기방사 기술을 이용한 반월상 연골 지지체층의 제조
전기방사 나노섬유 패턴화 필름을 제조하기 위해, 1,1,1,3,3,3- 헥사플루오로-2- 프로판 용매에 12 % (w / v)의 PCL 을 용해하여 사용하였고, 전기방사 나노섬유 패턴화 필름의 두께를 다양하게 제조하였다. 40μm에서 60μm까지 표면상의 전기방사 나노섬유 패턴화 필름은 격자형 배향으로 고유한 반월상구조를 모방하고, 보다 우수한 세포부착 및 증식을 제공하도록 디자인하여 제조하였다. 패턴이 없는 연골지지체층은 PCL 용액 및 PCL-젤라틴 혼합용액을 사용하여 일반 전기방사 방법대로 랜덤하게 전기방사하여 반월상연골 지지체층을 제조하였다.
패턴형 전기방사 반월상연골 지지체의 최적의 다공성 크기를 조절하기 위해서, 도 3에 도시된 바와 같이 기공크기가 상이한 3가지 타입의 금속 메쉬를 이용하여 제조한 전기방사 지지체를 제조하여 사용하였고, 또한 3D프린팅 기술을 이용하여 반월상연골 지지체 층 및 프레임을 사용하였다. 도 3의 (a) 내지 (c)는 각각 400 μm, 200μm, 100 μm의 기공크기를 갖는 생분해성 지지체 메쉬를 도시한 것이고, (d)는 표 2의 조건을 갖는 3D 프린팅 지지체층 프레임을 도시한 것이다. 구체적으로는 하기 표21의 격자 패턴을 가진 생분해성 지지체 층을 치수 범위에서 전기방사 하여 제조하였다. 이때 전기방사 바늘 끝과 메쉬 사이의 거리는 12cm로 고정되었고, 전체 제조공정은 10kV의 전압을 적용하여 반월상 연골 모양의 나노섬유 매트를 제조하였다.(도 2)
도 2의 (a) 내지 (d)는 각각 3D 프린팅 지지체 층이고, 도 2의 우측에 배역된 (a1) 내지 (d2)의 8장의 사진은 각각 섬유 밀도가 다른 반월상 연골 모양 나노섬유 매트의 광학사진을 촬영한 것으로, (a1), (a2) 는 25분, (b1), (b2)는 20분, (c1), (c2)는 15분, (d1), (d2)는 10분(5mm=스케일 바)동안 방사한 섬유 매트를 현미경으로 관찰한 것이다. 도 2를 살펴보면, 전기방사시간에 따라 섬유 정렬 및 밀도가 향상되는 것을 확인할 수 있으며, 섬유 밀도의 증가는 기공 크기의 현저한 감소를 가져와 세포 부착 및 증식을 방해할 수 있다.
샘플 구분 스트럿 두께(μm) 길이(μm) 높이(μm)
타입 1(Type 1) 136 ± 2.331 129 ± 11.24 62 ± 5.13
타입 2(Type 2) 62 ± 8.621 45 ± 3.04 52 ± 7.13
타입 3(Type 3) 45 ± 3.755 59 ± 2.99 48 ± 4.17
실시예 1-4. 지지체층의 적층에 의한 반월상 연골 지지체 제조
실시예에 따라서 제조한 전기방사 지지체층 샘플과 3D 프린팅 지지체층 샘플을 번갈아 가면서 반월상연골 프레임에 적층하여 반월상연골 지지체를 완성하였다. 먼저, 반월상연골 프레임의 내부에 가장 낮은 첫번째 층은 랜덤하게 PCL 고분자를 전기방사하여 제조한 전기방사 층 샘플을 놓은 다음에, 3D 프린팅 층과 전기 방사 필름을 층별로 조합하여 적층하여 반월상연골 지지체를 완성하였다.
실시예 1-5. 지지체층의 적층에 의한 반월상 연골 지지체의 멸균처리
완성된 반월상연골 지지체를 조직공학용 지지체로 적용하기 위하여 에탄올 (70 %)에 3 시간 동안 침지시킨 후, 추가로 클린벤치 내에서 12 시간 동안 UV 조사함으로써 멸균된 반월상 연골 지지체(스캐폴드)를 제조하였다. 또한 PCL 지지체층 이외에도 필요에 따라서PCL-젤라틴 혼합용액을 이용하여 전기방사하여 연골 지지체층 샘플을 제조하였고, 이들을 사용하여 반월상연골 지지체를 완성하는데 적용하였다.
실시예 2. 반월상 연골 지지체(스캐폴드)의 물성 확인
실시예 2-1. 세포생존성 분석
실시예 1로 제조된 반월상연골 프레임 내부에 층 상 지지체 샘플을 하나씩 넣어 반월상연골 지지체를 완성하였다. 이때 각 층의 지지체 표면마다 1층부터 5 x 104 세포/mL 농도로 배양된 중간엽 줄기세포를 접종하였다. 반월상연골 프레임 안에 적층 된 6개 층 각각에 줄기세포를 상기 농도로 접종한 다음에 반월상연골 지지체에서의 세포의 증식속도를 14일 동안 2-3일마다 측정(CCK-8) 하였으며, 14일 최종일에는 세포의 생사 및 사멸 분석은 생세포 및 사멸 분석키트(live & dead assay kit)를 사용하여 세포생존성을 형광현미경으로 관찰하였다. 또한 H&E와 MT 염색을 진행하여 세포에 의하여 조직재생 여부를 현미경으로 관찰하였다.
염색체는 살아있는 세포의 세포질 내부를 관찰하기 위해서 녹색형광 칼세인 아세톡시메틸(Calcein acetoxymethyl)을 사용하였고, 반면에 죽은 세포는 세포막을 관통함으로써 세포 사멸을 나타내는 적색 형광 ethD-1(ethidium homodimer-1) 염색을 관찰함으로써 세포생존성을 평가하였다. 분석을 위해 염색용액을 충분히 처리했으며(24웰 디쉬에서 웰당 1 ml), 세포를 PBS로 세척하고 염색 용액에서 30분동안 암실의 실온에서 인큐베이션 하였다.
실시예 2-2. 세포 부착성 및 증식성 확인
세포 부착성 및 증식성 확인은 공급업체의 프로토콜(Invitrogen, USA)에 따라 수행되었다. 먼저, α-MEM과 CCK-8 용액(Dojindo Molecular Technologies)의 9:1 혼합물을 제조하고, 사용된 배지는 제거한 후 1㎖ 혼합용액을 각 웰에 첨가하고 2 시간 동안 배양하였다. 이 후, 빈 플레이트로 배양된 용액을 옮기고, 1 ml의 10 % FBS 배지를 웰에 첨가하고 10 분 동안 인큐베이션 하였다. 이어서, 100 ㎕의 용액을 96 웰 플레이트에 취하고 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정 하였다.
실시예 2-3. 조직학적 분석
실시예 1로 제조된 반월상연골 지지체(스캐폴드)에서 ECM, 콜라겐 및 2 가지 세포 유형의 (2주간)핵 형성을 관찰하기 위해 3색 염색 프로토콜(Masson 's Trichrome, MT)에 의한 염색을 수행하였다.
실시예 3. 반월상 연골 모양의 전기방사 나노섬유 지지체층(나노섬유 메트) 표면에서의 세포 거동 확인
세포거동을 비교하기 위한 in vitro 시험관 내 분석을 위해 다음의 조건을 반월상 연골 패턴화 된 나노섬유 매트에 적용하였다.
도 4는 전술한 방법으로 제조된 반월상 연골 지지체(스캐폴드)의 시험관 내 MC3T3 세포배양을 도시한 것으로, 도 4의 (A)는 시간이 1, 7, 14일 증가함에 따른 세포 증식정도를 확인한 것이다. 도 4의 (A)를 보면, 대조군인 조직배양 플레이트와 반월상 연골 지지체(스캐폴드) 모두에서 세포 증식속도가 명백히 증가한 것을 확인할 수 있으며, 이는 MC3T3 세포가 본 발명의 지지체 표면에서 현저하게 성장했음을 의미한다. 특히 타입 3(Type 3) 샘플은 14일간 배양 후, MC3T3 증식이 점진적으로 증가했음을 알 수 있으며, 도 4의 (B)의 세포생존성 분석 결과 중 타입 3의 결과인 (a) 및 (d)를 비교한 사진에서도 확인할 수 있다. 이는 도 4의 (B) 중 타입 2에 대한 (b)와 (e), 타입 1에 대한 (c)와 (f)의 증가와 비교하더라도 월등이 높다는 것을 확인하였다. 즉, 타입 3 샘플이 세포 독성없이 세포 부착에 유리한 생물학적 환경을 제공한다는 것을 검증하였다.
실시예 4. 반월상 연골 모양의 나노섬유 매트 세포 이동성 확인
실시예3로 제조된 타입 1 내지 타입 3의 샘플을 H&E 염색함으로써 세포 침투 및 부착정도를 확인하였다.
도 5는 MC3T3 세포를 14일간 배양한 반월상 연골 지지체(스캐폴드)의 염색결과를 도시한 것으로, 염색 결과 역시 도 5(a)와 같이 타입 3의 샘플에서 세포의 분리 없이 전기방사 층 및 프린팅 층 모두에 세포가 확산되고 있다는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 도 5의 (b) 및 (c)에 도시된 바와 같이 타입 2 및 타입 1 샘플은 세포 침투 및 부착성이 제한적인 양상을 나타내는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 현상은, 전기방사된 섬유 내의 작은 기공률에 의한 것으로, 기공률을 제어하여 실험 기간동안 세포들 간의 이동성 및 부착성을 억제할 수 있음을 의미한다. 결과적으로, 타입3의 샘플이 세포 부착성이나 증식성 측면에서 가장 최적의 조건임을 확인하였다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (5)

  1. 전기방사 지지체층 및 3D 프린팅 지지체층이 적층되어 이루어지는 조직재생용 지지체로서,
    상기 전기방사 지지체층은 상기 조직재생용 지지체의 상단, 또는 하단 중 어느 하나 이상의 일면을 이루고,
    상기 조직재생용 지지체는 적어도 하나의 세포 배양층을 포함하는, 조직 재생용 지지체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 지지체는, 반월상인, 조직재생용 지지체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 지지체는, 폴리카프롤락톤(Polycaprolactone, PCL), 폴리글리콜라이드(Polyglycolic acid, PGA), 폴리락타이드(Polylactic acid, PLA) 폴리카프롤락톤(Polycaprolactone, PCL), 폴리(락타이드-글라이콜라이드)(Poly(lactic-co-glycolic) acid, PLGA) 및 폴리다이옥사논(polydioxane) 중 적어도 어느 하나 이상의 생분해성 고분자를 포함하는, 조직재생용 지지체.
  4. (a) 전기방사 지지체층을 제조하는 단계;
    (b) 3D 프린팅 지지체층을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 제조된 전기방사 지지체층 및 3D 프린팅 지지체층을 각각 1 이상 적층시키는 단계;
    를 포함하는 조직재생용 지지체 제조방법으로,
    상기 (c)단계는, 적어도 하나의 세포 배양층을 로딩하는 단계를 포함하는, 조직재생용 지지체 제조방법.
  5. 제1항의 조직재생용 지지체를 포함하는, 생분해성 의료기기.
KR1020200123906A 2020-09-24 2020-09-24 반월상 연골 지지체 및 이의 제조방법 KR20220040773A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200123906A KR20220040773A (ko) 2020-09-24 2020-09-24 반월상 연골 지지체 및 이의 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200123906A KR20220040773A (ko) 2020-09-24 2020-09-24 반월상 연골 지지체 및 이의 제조방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220040773A true KR20220040773A (ko) 2022-03-31

Family

ID=80935053

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200123906A KR20220040773A (ko) 2020-09-24 2020-09-24 반월상 연골 지지체 및 이의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20220040773A (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101617434B1 (ko) 2014-06-26 2016-05-02 주식회사 티이바이오스 생분해성 생체고분자를 이용한 다층구조의 연골지지체 제조방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101617434B1 (ko) 2014-06-26 2016-05-02 주식회사 티이바이오스 생분해성 생체고분자를 이용한 다층구조의 연골지지체 제조방법

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dias et al. Advances in electrospun skin substitutes
US11654214B2 (en) Ceramic-containing bioactive inks and printing methods for tissue engineering applications
He et al. A 3D‐printed PLCL scaffold coated with collagen type i and its biocompatibility
Yan et al. Implantable nerve guidance conduits: Material combinations, multi-functional strategies and advanced engineering innovations
Hasan et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts
Liu et al. Electrospun nanofibers for regenerative medicine
Ma et al. Rational design of nanofiber scaffolds for orthopedic tissue repair and regeneration
EP1835949B1 (en) Tissue engineering devices for the repair and regeneration of tissue
CN105979977B (zh) 支架
Wang et al. Synthetic scaffold morphology controls human dermal connective tissue formation
US7763272B2 (en) Support material for tissue engineering, for producing implants or implant materials, and an implant produced with the support material
Bian et al. The construction and performance of multi-level hierarchical hydroxyapatite (HA)/collagen composite implant based on biomimetic bone Haversian motif
US20060153815A1 (en) Tissue engineering devices for the repair and regeneration of tissue
Xing et al. Engineering complex anisotropic scaffolds beyond simply uniaxial alignment for tissue engineering
Mo et al. Electrospun nanofibers for tissue engineering
CN105477682A (zh) 一种组织工程半月板支架及制备方法
Shirwaiker et al. Scaffolding hydrogels for rapid prototyping based tissue engineering
Ladd et al. Electrospun nanofibers in tissue engineering
Namdari et al. Nanofibrous bioengineered heart valve—application in paediatric medicine
Sridhar et al. Improved regeneration potential of fibroblasts using ascorbic acid‐blended nanofibrous scaffolds
Sooriyaarachchi et al. Hybrid fabrication of biomimetic meniscus scaffold by 3D printing and parallel electrospinning
Forgacs et al. Biofabrication: micro-and nano-fabrication, printing, patterning and assemblies
George et al. Biopolymer-based scaffolds: Development and biomedical applications
Chen et al. Multiscale regeneration scaffold in vitro and in vivo
US9259445B2 (en) Integrated implant system (IIS) biocompatible, biodegradable and bioactive, comprising a biocompatible sterile porous polymeric matrix and a gel, integrating in situ the tridimensional matrix structure