KR20220038602A - Methods and systems for identifying microorganisms - Google Patents
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Abstract
본 발명은 진동 프로파일을 평가함으로써 시료 내 미생물을 동정하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 상기 방법은 공지 스펙트럼의 데이터베이스를 준비하는 단계, 공지 스펙트럼으로부터 사전 계산된 모델을 도출하는 단계를 포함하며, 상기 사전 계산된 모델은 미생물의 계층적으로 정리된 분류 그룹과 연관된 것이다. 미생물을 동정하기 위해, 미생물의 미지 시료의 스펙트럼은 복수의 하위 단계에서 상기 사전 계산된 모델과 비교된다.The present invention relates to a method and system for identifying microorganisms in a sample by evaluating the vibrational profile. The method comprises the steps of preparing a database of known spectra, deriving a pre-computed model from the known spectrum, the pre-computed model being associated with a hierarchically organized taxonomic group of microorganisms. To identify the microorganism, the spectrum of the unknown sample of the microorganism is compared to the pre-calculated model in a plurality of sub-steps.
Description
본 발명은, 종래의 방법에 비해 극히 짧은 시간 내에 미생물 성장에 관한 표지를 동정 및 수득하기 위한, 예를 들어 스펙트럼 프로파일의 다변량 분석법 또는 대안적으로 신경망과 같은 통계학적 기법을 사용한, 의학 분야, 임상학 분야, 수의학 분야, 농업 식품 분야, 및 환경 분야에서 활용 가능한 미생물의 동정 방법에 관한 것이다.The present invention relates to the medical field, clinical science, using, for example, multivariate analysis of spectral profiles or alternatively statistical techniques such as neural networks, for identifying and obtaining markers of microbial growth in an extremely short time compared to conventional methods. It relates to a method for identifying microorganisms that can be used in fields, veterinary medicine, agricultural food fields, and environmental fields.
특히, 본 발명은 미지 시료의 진동 스펙트럼의 스펙트럼 프로파일을 분석하고 데이터베이스 내에 사전에 수집 및 저장된 시료의 스펙트럼의 스펙트럼 프로파일과 비교함으로써 미생물을 동정하기 위한 분석 기구를 제공한다.In particular, the present invention provides an analysis instrument for identifying microorganisms by analyzing the spectral profile of a vibration spectrum of an unknown sample and comparing it with the spectral profile of a spectrum of a sample previously collected and stored in a database.
미생물을 동정하기 위해 진동 분광학적 기술을 사용하는 것은 공지되어 있다.It is known to use vibrational spectroscopy techniques to identify microorganisms.
예를 들어, 푸리에 변환 적외선 분광법 (FTIR)은 분석 시료의 화학적 조성 정보를 얻을 수 있는 비파괴적인 분석 기술이다. 1990년대 초부터 FTIR은 생물 시료의 분석에 사용되어 왔다 (Diem M. et al., The Analyst [27 Aug 2004, 129 (10): 880-885]).For example, Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) is a non-destructive analytical technique that can obtain information on the chemical composition of an analyte sample. Since the early 1990s, FTIR has been used for the analysis of biological samples (Diem M. et al., The Analyst [27 Aug 2004, 129 (10): 880-885]).
이와 동시에, FTIR 기술로 미확인 미생물을 동정하고 분류할 수 있음이 보고되었다 (Helm D. et al., Journal of General Microbiology (1991, 137, 69-79) and Marley L. et al., Vibrational Spectroscopy 26,2, 2001, 151-159).At the same time, it has been reported that FTIR technology can identify and classify unidentified microorganisms (Helm D. et al., Journal of General Microbiology (1991, 137, 69-79) and Marley L. et al., Vibrational Spectroscopy 26 , 2, 2001, 151-159).
미생물의 여러 종(species), 아종(subspecies), 또는 하위분류(sub-classifications)는 단백질, 지질, 핵산, 및 다당류 측면에서의 정확한 생화학적 조성에 따라 특정되며, 이러한 정보는 고유 진동 스펙트럼에 반영되어 있다고 알려져 있다 (ed. Griffiths and Chalmers, 2001 Handbook of Vibrational Spectroscopy, John Wiley & sons, New York, Volume 5).Different species, subspecies, or sub-classifications of microorganisms are characterized by their exact biochemical composition in terms of proteins, lipids, nucleic acids, and polysaccharides, and this information is reflected in the natural vibration spectrum. (ed. Griffiths and Chalmers, 2001 Handbook of Vibrational Spectroscopy, John Wiley & sons, New York, Volume 5).
미생물학 분야에서 FTIR 기술에 의해 제시된 잠재적인 활용법은 다음을 포함한다: Potential applications presented by FTIR technology in the field of microbiology include:
(i) 인간 또는 수의학 분야에서, 예를 들어 임상실험실에서의 병원체 동정;(i) identification of pathogens in human or veterinary medicine, for example in clinical laboratories;
(ii) 역학 조사, 연구 주제, 병원체 스크리닝, 위생 점검, 감염 체인의 해명, 통제 요법, 및 재발 감염의 감지;(ii) epidemiological investigations, research subjects, pathogen screening, sanitation checks, elucidation of infection chains, control therapy, and detection of recurrent infections;
(iii) 환경으로부터의 미생물의 특징화 및 스크리닝;(iii) characterization and screening of microorganisms from the environment;
(iv) 생명공학적 처리의 모니터링;(iv) monitoring of biotechnological treatments;
(v) 식품 산업 또는 약학 산업에서 미생물 품질 관리;(v) microbial quality control in the food industry or pharmaceutical industry;
(vi) 수확한 균주의 유지관리.(vi) Maintenance of harvested strains.
미지 시료의 스펙트럼을 데이터베이스에 저장된 공지 미생물 종의 스펙트럼과 비교 분석하는 기술에 기반한 미생물의 동정 방법이 공지되어 있다.A method for identifying microorganisms based on a technique of comparing and analyzing a spectrum of an unknown sample with a spectrum of a known microorganism species stored in a database is known.
이러한 유형의 공지의 동정 방법에 대한 예는, US5660998A, CN103217398A, US6379920B1, WO2006002537A1, US9551654B2, US20170167973A1, WO2017/210783A1, Sousa et al., European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases (2014) 33: 1345-1353, Whittaker et al., Journal of Microbiological Methods 55 (2003) 709-716, Wang et al., International Journal of Food Microbiology 167 (2013) 293-302 에 보고되어 있다.Examples of known methods of identification of this type are US5660998A, CN103217398A, US6379920B1, WO2006002537A1, US9551654B2, US20170167973A1, WO2017/210783A1, Sousa et al., European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases (2014) 33: 1345-1353, It is reported in Whittaker et al., Journal of Microbiological Methods 55 (2003) 709-716, Wang et al., International Journal of Food Microbiology 167 (2013) 293-302.
다른 방법은 본 출원인의 특허 출원 PCT/IT2019/050025 에 기재되어 있다.Another method is described in the applicant's patent application PCT/IT2019/050025.
그러나, 상기 공지의 방법 중 다수는 스펙트럼을 투과, 반사, 또는 이미징(imaging) 모드에서 수행하여 획득한다.However, many of these known methods acquire spectra by performing in transmission, reflection, or imaging mode.
예를 들어, 투과 또는 반사 획득 모드는 US5660998 및 US6379920 에 보고되어 있는 한편, 이미징 모드는 WO2006002537A1, US9551654B2, US20170167973A1 에서 채용되어 있다.For example, transmission or reflection acquisition modes are reported in US5660998 and US6379920, while imaging modes are employed in WO2006002537A1, US9551654B2, US20170167973A1.
이들 방법은, 얻어진 신호가 시료의 두께와 시료의 모폴로지에 직접적으로 의존한다는 사실과 관련된 단점을 가지며, 이러한 단점은 너무 두껍고 포화 신호를 생성하거나 또는 비균질적이고 산란으로 인한 왜곡 신호를 생성할 수 있다는 것이다.These methods have disadvantages related to the fact that the obtained signal is directly dependent on the thickness of the sample and the morphology of the sample, which is that it may be too thick and produce a saturated signal, or it may be inhomogeneous and produce a distorted signal due to scattering. .
다중 픽셀과 같은 이미징 접근 방식을 기반으로 하는 방법은 단일 포인트 검출기에 비해, 픽셀당 얻을 수 있는 신호/노이즈 비가 더 낮기 때문에 개별 스펙트럼의 해상도에 제한이 있을 수 있다는 것도 알려져 있다.It is also known that methods based on imaging approaches such as multi-pixel may have limitations in the resolution of individual spectra due to the lower achievable signal/noise ratio per pixel compared to single-point detectors.
현재 기술의 다른 단점은 종종, 스펙트럼이 미생물의 독특한 신호를 덮어버리는 물(water) 또는 다른 오염 물질의 존재로 인한 신호를 나타낼 수 있다는 것이다.Another disadvantage of the current technology is that the spectrum can often reveal signals due to the presence of water or other contaminants that overshadow the unique signal of the microorganism.
일부의 경우, 예를 들어 CN103217398A와 같은 경우에는, 건조 과정을 채용하지만, WO 2017/210783A1 에 보고된 바와 같이, 이러한 과정은 미생물을 손상시키고 비가역적인 영향을 미칠 수 있으며, 이러한 손상은 미생물의 스펙트럼을 변형시킬 수 있다.In some cases, for example CN103217398A, a drying process is employed, but as reported in WO 2017/210783A1, this process can damage microorganisms and have an irreversible effect, such damage can affect the spectrum of microorganisms. can be transformed.
일부 경우, 예를 들어 WO 2017/210783 A1 와 같은 경우에는, 스펙트럼에 존재하는 수분 성분을 제거하기 위해 다중 획득에 의존할 수 있다. 그러나, 이러한 해법은 스펙트럼 비교를 위한 분석 절차가 더 복잡하고 분석 시간이 더 오래 걸린다는 단점이 있다.In some cases, for example WO 2017/210783 A1, one can rely on multiple acquisitions to remove the moisture component present in the spectrum. However, this solution has the disadvantage that the analysis procedure for spectrum comparison is more complicated and the analysis time is longer.
현재 기술의 또다른 단점은 종종, 참조용 데이터베이스가 한정된 수의 미생물 종만을 포함하므로 가능성 있는 광범위한 종을 다루지 못한다는 것이다.Another disadvantage of the current technology is that it often does not cover a wide range of possible species, as reference databases contain only a limited number of microbial species.
예를 들어, CN103217398A 에 보고된 데이터 베이스 및 관련 동정 방법은 박테리아 13종을 참조한다.For example, the database and related identification methods reported in CN103217398A refer to 13 bacterial species.
게다가, 참조용 데이터베이스의 크기가 커짐에 따라 미생물 종의 배양 및 성장 절차에 관한 일련의 문제, 스펙트럼 획득 절차에 관한 일련의 문제 및 비교 분석 절차에 관한 일련의 문제가 발생한다.Moreover, as the size of the reference database grows, a set of problems arises with respect to procedures for culturing and growing microbial species, a set of problems with respect to spectral acquisition procedures, and a set of problems with procedures for comparative analysis.
예를 들어, 미지 시료의 스펙트럼은 데이터베이스에 포함된 많은 수의 스펙트럼과 비교되어야 하므로, 데이터베이스의 크기가 커질수록 미지 시료에 대한 분석 시간도 늘어난다.For example, since the spectrum of an unknown sample has to be compared with a large number of spectra included in the database, the analysis time for the unknown sample increases as the size of the database increases.
또한, 동일한 종의 미생물이라도 스펙트럼 특성에 큰 변동이 있을 수 있고, 이는 데이터베이스에 포함된 스펙트럼과 비교하기가 곤란하게 한다.In addition, even microorganisms of the same species may have large variations in spectral properties, which makes it difficult to compare with spectra included in databases.
이러한 변동성은 각 종에 상이한 균주가 존재하기 때문이거나 또는 배양 배지의 화학적 조성 및/또는 성장 조건의 가능한 변동으로 인해 동일한 종의 상이한 배양물 사이에 차이가 발생하기 때문일 수 있다. This variability may be due to the presence of different strains in each species or due to differences occurring between different cultures of the same species due to possible variations in the chemical composition and/or growth conditions of the culture medium.
따라서 많은 수의 미생물 분류 (예를 들어 분류학적 범주 또는 표현형 그룹 또는 유전형 그룹)에 대해 작동할 수 있고 변동성이 큰 참조용 데이터베이스를 사용하여 작동할 수 있는, 신규한 미생물 동정 방법을 개발할 필요가 있다.Therefore, there is a need to develop novel methods of identification of microorganisms that can work for large numbers of microbial classifications (eg taxonomic categories or phenotypic groups or genotypic groups) and can work with highly variability reference databases. .
따라서, 본 발명의 일 목적은 미지 미생물의 시료가 상기와 같이 하나 이상의 카테고리 및/또는 그룹에 속하는지 여부를 결정할 수 있는 동정 방법을 제안하는 것이다.Accordingly, one object of the present invention is to propose an identification method capable of determining whether a sample of an unknown microorganism belongs to one or more categories and/or groups as described above.
본 발명의 또다른 목적은 생물학적 유체 및/또는 복합 매트릭스의 존재 또는 부재 하의 상이한 환경 조건에서, 또는 상이한 배지 상의 상이한 배양 조건에서 성장했을 수 있는, 미생물의 동일한 종, 아종, 또는 하위분류의 상이한 균주를 구별할 수 있는 미생물 동정 방법을 제안하는 것이다.Another object of the present invention is that different strains of the same species, subspecies, or subclass of microorganisms may have grown in different environmental conditions, in the presence or absence of biological fluids and/or complex matrices, or in different culture conditions on different media. To propose a method for identifying microorganisms that can distinguish
본 발명의 또다른 목적은 심지어는 대용량 데이터베이스의 경우에서도 개별 분석 각각마다 짧은 시간이 소요되며 높은 연산력을 필요로 하지 않는, 정확한 미생물 동정 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an accurate microorganism identification method that takes a short time for each individual analysis and does not require high computational power, even in the case of a large database.
본 발명의 또다른 목적은 모든 상이한 분석 단계 및 기기 구성요소를 통합하여 간단한 방식으로 미생물을 동정하는 방법을 구현할 수 있는 장치를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an apparatus capable of implementing a method for identifying microorganisms in a simple manner by integrating all the different assay steps and instrument components.
본 발명의 또다른 목적은 원격 데이터 처리 및 그에 따른 결과 달성을 위해 연속적 또는 부분적 인터넷 연결을 필요로 하지 않는 장치 및 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an apparatus and method that does not require a continuous or partial Internet connection for remote data processing and thus achieving results.
본 출원인은 현재 기술의 단점을 극복하고 전술한 목적 및 기타 목적과 이점을 얻기 위해 본 발명을 도출하고, 시험하고, 구체화하였다.The applicant has devised, tested and embodied the present invention in order to overcome the shortcomings of the present technology and obtain the above and other objects and advantages.
본 발명은 독립 청구항에 설명되고 특징화되어 있다. 종속 청구항은 본 발명의 추가적 특징이나 주요 발명 아이디어에 대한 변형례를 기재한다.The invention is described and characterized in the independent claims. The dependent claims set forth additional features of the invention or modifications to the main inventive idea.
본 발명은 미생물의 동정 방법, 특히, 미지 시료의 진동 스펙트럼을, 데이터베이스 내에 사전 저장된 공지 시료의 참조 진동 스펙트럼으로부터 생성된 미리 계산한 모델과 비교하는 단계를 포함하는, 미지 시료에 존재하는 미생물의 동정 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for identifying microorganisms, in particular, for the identification of microorganisms present in an unknown sample, comprising the step of comparing the vibrational spectrum of the unknown sample with a pre-calculated model generated from a reference vibrational spectrum of a known sample previously stored in a database. it's about how
본 발명에 따른 미생물의 동정 방법은 다음의 단계를 포함한다:The method for identification of microorganisms according to the present invention comprises the following steps:
- 공지 미생물 시료의 참조용 스펙트럼 데이터베이스를 준비하는 단계;- preparing a spectral database for reference of known microbial samples;
- 더 넓은 카테고리 및/또는 분류 그룹에서부터 더 좁은 카테고리 및/또는 분류 그룹까지 계층적으로 정리된 미생물의 카테고리 및/또는 분류 그룹과 연관된 복수의 사전 계산된 모델을 생성하고, 여기서 상기 사전 계산된 모델 각각은 미생물의 카테고리 및/또는 분류 그룹과 연관된 스펙트럼 특징의 식별을 포함하는, 하나 이상의 단계; - generating a plurality of pre-computed models associated with categories and/or taxonomic groups of microorganisms arranged hierarchically from broader categories and/or taxonomic groups to narrower categories and/or taxonomic groups, wherein said pre-computed models one or more steps, each comprising identification of a spectral feature associated with a category and/or taxonomic group of microorganisms;
- 미지 시료를 샘플링하는 하나의 단계;- one step of sampling the unknown sample;
- 미지 시료의 스펙트럼을 획득하는 하나 이상의 단계;- one or more steps of acquiring a spectrum of an unknown sample;
- 미지 시료의 스펙트럼을 처리하는 하나 이상의 단계;- one or more steps of processing the spectrum of the unknown sample;
- 하나 이상의 분석 단계로서, 상기 단계 각각은 미지 시료의 스펙트럼을 상기 사전 계산된 모델과 비교하는 복수의 하위 단계를 연속적으로 수행하도록 제공되며, 상기 하위 단계 각각은 다변량 분석 방법을 이용하여, 미지 시료의 스펙트럼을 점진적으로 더 좁은 카테고리 및/또는 분류 그룹의 사전 계산된 모델과 비교하여, 미지 시료가 미생물의 상기 카테고리 및/또는 분류 그룹에 소속함을 보여주는 점수를 적어도 제공하기 위한 것인 단계;- one or more analysis steps, each of said steps being provided for sequentially performing a plurality of sub-steps of comparing the spectrum of the unknown sample to said pre-calculated model, each of said sub-steps using a multivariate analysis method, the unknown sample comparing the spectrum of the to a pre-computed model of progressively narrower categories and/or taxonomic groups to at least provide a score showing that the unknown sample belongs to said category and/or taxonomic group of microorganisms;
- 하나 이상의 컨트롤 단계로서, 신뢰성 파라미터가 사전 결정된 승인 값보다 더 낮은 경우 미지 시료의 새로운 스펙트럼 획득 단계를 요청하거나 또는 실패한 동정 또는 성공적인 동정을 포함할 수 있는 최종 결과를 제공하는 단계.- one or more control steps, requesting a new spectral acquisition step of an unknown sample if the reliability parameter is lower than a predetermined acceptance value or providing a final result which may include a failed or successful identification.
일 구현예에 따르면, 공지된 미생물 시료와 연관된 참조용 스펙트럼의 데이터베이스를 준비하는 단계는 각 공지된 시료에 대해 다음을 제공한다:According to one embodiment, the step of preparing a database of spectra for reference associated with a known microbial sample provides for each known sample:
- 공지의 시료, 가능하게는, 생물학적 유체 및/또는 복합 매트릭스의 존재 또는 부재 하의 고체 또는 액체 배지에서 성장하여 얻어진 공지의 시료를 샘플링하는 단계;- sampling a known sample, possibly a known sample obtained by growing on a solid or liquid medium in the presence or absence of a biological fluid and/or a complex matrix;
- 공지의 시료의 스펙트럼을 획득하는 하나 이상의 단계;- at least one step of acquiring a spectrum of a known sample;
- 공지의 시료의 스펙트럼을 처리하는 하나 이상의 단계.- one or more steps of processing the spectrum of a known sample.
미지의 시료 및/또는 공지의 시료는, 본 방법의 제1 구현예에 따르면, 임의 적합한 배지, 예를 들어 고체 또는 액체 배지, 가능하게는 생물학적 유체 및/또는 복합 매트릭스의 존재 또는 부재 하의 임의 적합한 배지를 사용하여 성장시켜 얻은 시료일 수 있다.The unknown sample and/or the known sample, according to a first embodiment of the method, can be in any suitable medium, for example a solid or liquid medium, possibly in the presence or absence of a biological fluid and/or a complex matrix. It may be a sample obtained by growing using a medium.
다른 구현예에 따르면, 미지 시료 및/또는 공지 시료는 성장 단계를 거치지 않고 천연 시료에서 직접 얻을 수 있다.According to another embodiment, the unknown sample and/or the known sample may be directly obtained from a natural sample without undergoing a growth stage.
일 구현예에 따르면, 데이터베이스 준비 단계는 데이터베이스를 생성하기 위해 오직 한번만 수행될 수 있으며, 그 후 후속하는 미지 시료의 각 분석에 사용될 수 있다.According to one embodiment, the database preparation step may be performed only once to generate the database, which may then be used for each subsequent analysis of the unknown sample.
또한, 일 구현예에 따르면, 데이터 베이스 준비 단계는, 미생물의 새로운 카테고리 및/또는 분류 그룹을 포함시켜 본 방법의 적용 범위를 확장하고자 할 때마다 수행되는, 데이터베이스의 업데이트를 가리킬 수 있다.Further, according to one embodiment, the database preparation step may refer to updating the database, which is performed whenever it is desired to expand the scope of application of the present method to include a new category and/or classification group of microorganisms.
이와 유사하게, 사전 계산된 모델은, 일단 생성되면, 미지 시료의 후속적인 모든 분석에 사용될 수 있거나 또는 미생물의 새로운 카테고리 및/또는 분류 그룹을 추가하고자 할 때마다 업데이트될 수 있다.Similarly, pre-computed models, once created, can be used for any subsequent analysis of an unknown sample or updated whenever new categories and/or taxonomic groups of microorganisms are desired to be added.
본 발명에 따르면, 상기 스펙트럼은 직접적 방식 또는 간접적 방식으로 적외선 흡수를 검출할 수 있는 장치, 예를 들어 진동 분광계를 이용하여 획득될 수 있다.According to the invention, the spectrum can be obtained using a device capable of detecting infrared absorption in a direct or indirect manner, for example a vibrational spectrometer.
일 구현예에 따르면, 본 발명은 시료가 부재할 때와 시료가 존재할 때 모두에서 연속적인 신호 획득 모드를 사용하며, 상기 연속적인 모드는, 각각, 기구의 세정 작업과, 스펙트럼의 획득을 준비하는 스펙트럼 파라미터 (예를 들어 신호 강도, 신호 대 노이즈 비, 스펙트럼 모양, 최적 건조 수준)의 객관적인 평가를 지원할 수 있다.According to one embodiment, the present invention uses a continuous signal acquisition mode both in the absence of the sample and in the presence of the sample, wherein the continuous mode comprises, respectively, cleaning the instrument and preparing the spectrum for acquisition. It can support objective evaluation of spectral parameters (eg signal intensity, signal-to-noise ratio, spectral shape, optimal drying level).
유익하게는, 본 발명에 따르면, 전술한 스펙트럼 파라미터의 모니터링이 제공되며, 이는 얻어진 스펙트럼의 품질을 표준화하여, 공정이 작업자에 의한 주관적인 평가에 독립적이도록 하여준다.Advantageously, according to the invention, monitoring of the spectral parameters described above is provided, which standardizes the quality of the obtained spectra, making the process independent of subjective evaluation by the operator.
따라서, 상기 모드에 의해 획득된 스펙트럼은 실질적으로 동일한 강도 수준과 건조 수준을 갖는 시료를 가리키므로 더욱 서로를 비교할 수 있게 된다.Thus, the spectra obtained by the above modes point to samples having substantially the same intensity level and dryness level, making it more comparable to each other.
일 구현예에 따르면, 본 발명은 분류 그룹의 가장 현저한 식별 스펙트럼 특징을 자동으로 식별하는 알고리즘을 사용하는 것을 제공한다.According to one embodiment, the present invention provides for using an algorithm to automatically identify the most prominent discriminating spectral features of a classification group.
상기 특징은 분석 단계에 필요한 시간을 현저히 줄여줌으로써 시간을 단축하고 동정 정확도를 높일 수 있다.The above feature significantly reduces the time required for the analysis step, thereby shortening the time and increasing the identification accuracy.
유익하게는, 당업계에서의 방법들에 대하여, 계층적으로 정리된 미생물의 분류 그룹과 연관된 복수의 사전 계산된 모델을 순차적으로 사용하는 것은 미지 시료의 동정에 필수적인 계산력을 줄여주며, 이에 따라, 데이터 처리를 위한 분산 또는 원격 컴퓨팅 시스템을 사용하였을 때 필수적인 인터넷 연결을 필요로 하지 않는다.Advantageously, for methods in the art, sequential use of a plurality of pre-computed models associated with a hierarchically organized taxonomic group of microorganisms reduces the computational power necessary for the identification of unknown samples, and thus, It does not require an essential Internet connection when using distributed or remote computing systems for data processing.
이러한 특징은 데이터베이스의 크기를 증가시켜, 상이한 미생물의 많은 종, 아종, 분류 또는 하위 분류, 동일한 종, 아종 또는 아과의 상이한 균주, 가능하게는 생물학적 유체 및/또는 복합 매트릭스의 존재 하에, 가능하게는 상이한 배지 상의 상이한 배양 조건 또는 상이한 환경 조건에서 성장한 것들을 동정할 수 있게 하여준다.This feature increases the size of the database, possibly in the presence of many species, subspecies, classifications or subclasses of different microorganisms, different strains of the same species, subspecies or subfamily, possibly in biological fluids and/or complex matrices. It makes it possible to identify those grown under different culture conditions or different environmental conditions on different media.
또한, 본 발명은 전술한 미생물을 동정하는 방법을 수행하기 위한 장치에 관한 것으로서, 상기 장치는 방사선의 광원, 검출기, 분석될 시료가 위치하는 구획된 획득 지대, 및 처리 시스템과 데이터 디스플레이 시스템이 설치되고 상기 검출 장치와 커플링되는 고정형 또는 휴대형의 전자 장치를 포함하는, 진동 프로파일을 검출하기 위한 장치를 포함하는 것일 수 있다.In addition, the present invention relates to an apparatus for performing the above-described method for identifying microorganisms, wherein the apparatus is provided with a light source of radiation, a detector, a partitioned acquisition zone in which a sample to be analyzed is located, and a processing system and a data display system and a device for detecting a vibration profile, including a stationary or portable electronic device coupled with the detection device.
일 구현예에 따르면, 더 넓은 분류 그룹에서부터 더 좁은 분류 그룹까지 계층적으로 정리된 미생물의 분류 그룹과 연관된 사전 계산된 모델이 상기 전자 장치에 저장되고, 상기 사전 계산된 모델 각각은 미생물의 카테고리 및/또는 분류 그룹과 연관된 동정 스펙트럼 특징을 포함한다.According to an embodiment, a pre-calculated model associated with a taxonomic group of microorganisms hierarchically arranged from a broader taxonomic group to a narrower taxonomic group is stored in the electronic device, and each of the pre-calculated models includes a category of the microorganism and and/or include identification spectral features associated with the classification group.
본 발명의 상기 및 기타의 양태, 특징, 및 이점은 이하의 상세한 설명, 도면, 및 첨부된 특허청구범위를 참조하면 이해될 것이다. 상세한 설명과 통합된 부분인 도면은 본 발명의 일부 구현예들을 보여주며, 상세한 설명과 더불어 본 발명의 주요 내용을 기재하기 위해 제시된 것이다.
본 발명은 다음의 도면을 통해 보다 잘 설명된다:
- 도 1은 본 발명의 방법에 가능한 장비의 개략도이고;
- 도 2 는 본 발명의 방법의 일 구현예에 따른 단계를 예시하여 나타낸 블록 다이어그램이고;
- 도 3a와 3b는 FTIR-ATR 기술을 사용하여 수집한 실험 데이터를 보여주고, 도 3a는 수집된 미가공 데이터(raw data)를 보여주며 여기서 각 종은 다른 색으로 나타나 있는 한편, 도 3b는 변환된 데이터를 보여주고;
- 도 4a와 4b는 각각, E 단계에서 얻은 미지 시료의 분류를 위한 하위 단계의 그래픽 표현 및 동정 신뢰성을 위해 단계 F 에서 생성된 점수를 할당하는 대응 표를 보여준다.
- 도 5 는 "속(Genus)" 카테고리에 따른 미생물의 분류를 평가하는데 사용되고 본원에 기재된 구현예에 따른 방법을 데이터베이스의 스펙트럼과 교차 검증을 통해 얻은 혼돈 매트릭스(confusion matrix)이다.
이해를 돕기 위해, 가능한 동일한 참조 번호를 사용하여 도면에서 동일한 공통 요소를 표시하였다. 일 구현예의 요소 및 특징은 추가로 설명하지 않더라도 편리하게 다른 구현예에 통합될 수 있음을 이해해야 한다.These and other aspects, features, and advantages of the present invention will be understood by reference to the following detailed description, drawings, and appended claims. The drawings, which are an integral part of the detailed description, show some embodiments of the present invention, and together with the detailed description, are presented to explain the subject matter of the present invention.
The present invention is better illustrated with reference to the following drawings:
1 is a schematic diagram of a possible equipment for the method of the invention;
- Figure 2 is a block diagram illustrating the steps according to an embodiment of the method of the invention;
- Figures 3a and 3b show the experimental data collected using the FTIR-ATR technique, Figure 3a shows the raw data collected, where each species is shown in a different color, while Figure 3b shows the transformation show the data;
- Figures 4a and 4b show, respectively, a graphical representation of a sub-step for the classification of an unknown sample obtained in step E and a correspondence table assigning the score generated in step F for identification reliability.
- Figure 5 is a confusion matrix obtained through cross-validation with a spectrum of a database used to evaluate the classification of microorganisms according to the "Genus" category and the method according to the embodiment described herein.
For ease of understanding, the same common elements have been denoted in the drawings by the same reference numerals whenever possible. It should be understood that elements and features of one implementation may be conveniently incorporated into another implementation without further description.
이하 본 발명의 여러가지 구현예를 상세히 설명한다. 첨부의 도면에는 하나 이상의 예가 도시되어 있다. 각 예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되는 것으로서 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 일 구현예의 일부로서 도시 또는 기재되는 특징은 다른 구현예에 적용되거나 또는 관련되어서 또다른 구현예가 될 수 있다. 본 발명은 그러한 개질 및 변형을 모두 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.Hereinafter, various embodiments of the present invention will be described in detail. One or more examples are shown in the accompanying drawings. Each example is provided to illustrate the present invention and should not be construed as limiting the present invention. For example, a feature shown or described as part of one implementation may be applied to or related to another implementation, resulting in another implementation. It should be understood that the present invention includes all such modifications and variations.
본 구현예를 기재하기 전에, 본 상세한 설명은 도면을 이용하는 이하의 상세한 설명에 기재되어 있는 구성 요소의 구체적 구조나 배치로 한정되어서는 안된다. 본 상세한 설명은 다른 구현예를 제공할 수 있고 다양한 다른 방식으로 수득되거나 수행될 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 표현과 용어는 단순히 설명을 목적으로 하는 것일 뿐, 이를 한정적인 것으로 이해하여서는 안된다.Before describing the present embodiment, this detailed description should not be limited to the specific structure or arrangement of the components described in the following detailed description using the drawings. This detailed description is capable of providing other embodiments and of being obtained or carried out in various other ways. In addition, the expressions and terms used herein are merely for the purpose of description and should not be construed as limiting.
특별히 다르게 정의하지 않는 한, 본 명세서에 기재된 모든 기술적 용어와 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다.Unless specifically defined otherwise, all technical and scientific terms described herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs.
본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명을 검증하기 위한 테스트에서 또는 실제로 사용될 수 있지만, 방법 및 재료는 예시를 이용하여 아래에 기술된다. 상충하는 경우 정의를 포함하는 본 출원이 우선한다. 재료, 방법 및 예는 순전히 예시이며 제한적인 방식으로 이해되어서는 안 된다.Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in practice or in testing to verify the present invention, the methods and materials are described below by way of example. In case of conflict, the present application, including definitions, will control. The materials, methods, and examples are purely illustrative and should not be construed in a limiting manner.
본원에서 시료란 분석 목적을 위한 미생물과 같은 미생물 유기체를 포함하는 모든 물질의 최소량을 의미한다.As used herein, a sample means the minimum amount of any material comprising a microbial organism, such as a microorganism, for analytical purposes.
때로는, 필요하다면, 미생물의 조성이 각각 미지이거나 또는 공지인 경우, 미지 시료 또는 공지 시료로 기술할 것이다.Sometimes, if necessary, when the composition of the microorganism is unknown or known, respectively, it will be described as an unknown sample or a known sample.
일 구현예에 따르면, 미생물은 의학, 임상, 수의학, 농업 및 식품, 환경적 관심이 될 수 있다.According to one embodiment, the microorganism may be of medical, clinical, veterinary, agricultural and food, environmental interest.
도 1은 본 발명에 따라 미생물을 동정하기 위한 장비 10을 개략적으로 나타낸다.1 schematically shows a
일 구현예에 따르면, 적외선 흡수를 직접적으로 또는 간접적으로 검출하기 위해, 상기 장비는 예를 들어 다음과 같은 장치를 사용한다:According to one embodiment, in order to detect infrared absorption directly or indirectly, the equipment uses, for example, the following device:
- 적외선 IR 분광광도계, 가능하게는 푸리에 변환 적외선에서 작동하는 것,- Infrared IR spectrophotometer, possibly working in Fourier transform infrared,
- 라만 분광계,- raman spectrometer,
- 광열 분광계,- photothermal spectrometer,
- 광음향 분광계- photoacoustic spectrometer
- 상기 열거한 기구 중 하나와 신호 상승을 위한 것이 아닌 공명 기술이 커플링된 것, 예컨대 공명 라만, 표면 증강, 표면 증강 라만 분광법 (SERS), 표면 증강 적외선 흡수 (SEIRA), 공명 표면 증강 적외선 흡수 (resonant SEIRA), 팁-강화 라만 분광법 (TERS).- one of the instruments enumerated above coupled with a resonance technique not for signal enhancement, such as resonance Raman, surface enhancement, surface enhanced Raman spectroscopy (SERS), surface enhanced infrared absorption (SEIRA), resonant surface enhanced infrared absorption ( resonant SEIRA), tip-enhanced Raman spectroscopy (TERS).
본 발명의 적용 가능성은 사실상 미지 시료의 진동 프로프일을 획득하는데 사용되는 기술 유형으로 제한되지 않으며, 본원에 설명된 방법 및 장치는 모든 유형의 진동 스펙트럼과 연관하여 사용될 수 있다.The applicability of the present invention is in fact not limited to the type of technology used to obtain the vibrational profile of an unknown sample, and the methods and apparatus described herein can be used in connection with any type of vibrational spectrum.
예를 들어, 상기 장비는 ATR (Attenuated Total Reflectance, 감쇠 전반사율)과 같은 시료의 진동 스펙트럼의 임의 획득 모드를 사용할 수 있는 FTIR 유형의 진동 분광법용 분광 광도계, 이에, FTIR-ATR 분광광도계를 포함한다 (도 1).For example, the instrument comprises a spectrophotometer for vibrational spectroscopy of the FTIR type, such as an FTIR-ATR spectrophotometer, capable of using any mode of acquisition of the vibrational spectrum of a sample, such as Attenuated Total Reflectance (ATR). (Fig. 1).
분광광도계는 처리 시스템 및 데이터 디스플레이 시스템과 커플링될 수 있다.The spectrophotometer may be coupled with a processing system and a data display system.
처리 시스템 및 데이터 디스플레이 시스템은, 예를 들어 단일 처리 및 디스플레이 시스템으로 통합될 수 있고/있거나 예를 들어 스크린이 장착된 개인용 컴퓨터 또는 휴대폰 또는 태블릿과 같은 휴대용 장치와 같은 전자 장치 15에 포함될 수 있다.The processing system and data display system may, for example, be integrated into a single processing and display system and/or may be included in an
일 구현예에 따르면, 처리 시스템은 전자 장치 15에 의해 판독 가능한 매체에 기억될 수 있고 장비 10에 의해 각 경우에 실행될 수 있는 명령을 포함하는 컴퓨터 프로그램을 포함한다.According to one embodiment, the processing system comprises a computer program comprising instructions which can be stored on a medium readable by the
이하, 설명의 단순화를 위해, 장치 10을 관리하고 데이터를 처리 및 디스플레이할 수 있는 소프트웨어 및 하드웨어 시스템의 세트를 나타내기 위해 전자 장치 15를 참조할 것이다.Hereinafter, for simplicity of description, reference will be made to
그 자체로 주요 구성요소로 알려진 분광 광도계는 적어도 방사선 17의 광원 13 및 검출기 14를 포함한다.The spectrophotometer, known per se as the main component, comprises at least a
단순성을 위해, 모노크로메이터(mono-chromator), 초퍼(chopper), 간섭계(interferometer)와 같은 분광광도계의 다른 구성요소는 도 1에 나타내지 않았다.For simplicity, other components of the spectrophotometer, such as a mono-chromator, chopper, and interferometer, are not shown in FIG. 1 .
광원 13은 시료에 존재하는 분자를 여기(excite)시키는데 적합한 임의 유형의 방사선 17을 방출할 수 있으며, 예를 들어 IR, FTIR 또는 FTIR-ATR 분광광도계의 경우 이는 적외선 17의 광원일 수 있다.The
일 구현예에 따르면, 광원 13은 Globar 유형의 흑체 광원 또는 Quantum Cascade Laser (QCL) 또는 적외선 영역에서 방출하는 일반 레이저일 수 있다.According to an embodiment, the
일 구현예에 따르면, 예를 들어, 분광광도계가 라만 기술을 기반으로 하는 경우, 광원 13은 채용된 특정 유형의 라만 기술에 기반하여, 가능하면 적외선 영역 이상과 관련된 주파수를 갖는, 단색광의 레이저 광원 13 일 수 있다.According to one embodiment, for example, where the spectrophotometer is based on Raman technology, the
일 구현예에 따르면, 광원 13에 의해 방출된 방사선 17, 즉 입사 방사선 17a는, 가능하게는 반사 요소 16에 의해, 획득 지대 18에 위치한 시료를 향할 수 있다.According to an embodiment, the
ATR 모드가 사용되는 구현예에 따르면, 입사 방사선 17a는 내부 반사 요소에 영향을 미치도록 반사 요소 16에 의해 지향될 수 있다.According to an embodiment in which the ATR mode is used, the
일 구현예에 따르면, 내부 반사 요소는 예를 들어 결정(crystal) 12 일 수 있다.According to one embodiment, the internally reflective element may be, for example, a
일 구현예에 따르면, 결정 12는 높은 굴절률을 갖는 결정 12일 수 있다.According to an embodiment, the
일 구현예에 따르면, 결정 12는 다이아몬드, ZnSe, 규소 또는 게르마늄의 결정 12 일 수 있다.According to one embodiment, the
유익하게는, 결정 12가 다이아몬드 결정 12일 경우, 비교 측정에 사용되는 ZnSe, 규소 또는 게르마늄보다 내구성이 뛰어나고 투명도 범위가 더 크다는 이점이 있다.Advantageously, when the
결정 12 내부의 방사선 17의 반사는 결정 12의 표면에 소멸장(evanescent field)을 생성하고 여기에서 획득 지대 18이 구획될 수 있다.Reflection of the
상기 소멸장은 경우에 따라 시료 내부에서 수 마이크론까지 도달할 수 있는 깊이 범위로 침투할 수 있다.In some cases, the evanescent field may penetrate into a depth range that can reach up to several microns inside the sample.
특히, 이 깊이 범위는 입사각과 입사 방사선 17a의 파장 뿐만 아니라 결정 12에 사용되는 재료의 굴절률의 함수이므로, 모든 분석 시료에 대해 실질적으로 상수(constant)로 간주될 수 있다.In particular, since this depth range is a function of the angle of incidence and the wavelength of the
이러한 이유로, 유익하게는, ATR 모드를 사용하면 시료를 통과하는 방사선의 광학 경로와 상관없이 스펙트럼을 획득할 수 있으므로 시료의 두께와 상관없이 투과 또는 반사를 사용하는 접근 방식에 비해 더 높은 재현성을 보장한다.For this reason, advantageously, the ATR mode allows the acquisition of a spectrum independent of the optical path of the radiation passing through the sample, thus ensuring higher reproducibility compared to approaches using either transmission or reflection, regardless of the thickness of the sample. do.
또한, 이 모드를 사용하면 스펙트럼 품질에 부정적인 영향을 줄 수 있는 산란 및/또는 신호 포화의 현상을 제한하거나 방지할 수 있다.In addition, using this mode limits or avoids the phenomenon of scattering and/or signal saturation that can negatively affect spectral quality.
따라서, 이 모드는 측정의 더 큰 재현성과 시료의 더 간단한 준비를 보장한다.Therefore, this mode ensures greater reproducibility of measurements and simpler preparation of samples.
시료와의 상호작용 후, 출구에서 방사선 17, 즉, 나가는 방사선 17b 는 반사 요소 16에 의해 검출기 14를 향해 지향한다.After interaction with the sample, the
일 구현예에 따르면, 상기 검출기 14 는 DLaTGS (Deuterated L-alanine doped triglycine sulphate, 중수소화 L-알라닌 도핑된 트리글리신 설페이트)일 수 있다.According to one embodiment, the
대안적 구현예에 따르면, 상기 검출기 14 는 DTGS 검출기일 수 있다. 대안적 구현예에 따르면, 상기 검출기 14 는 단일 또는 어레이로 배치된 MCT (Mercury Cadmium Telluride, 수은-카드뮴-텔루라이드) 검출기일 수 있다.According to an alternative embodiment, the
대안적 구현예에 따르면, 상기 검출기 14는 CCD 검출기일 수 있다.According to an alternative embodiment, the
대안적 구현예에 따르면, 상기 검출기 14는 단일 또는 어레이로 배치된 볼로미터(bolometer) 또는 마이크로볼로미터일 수 있다.According to an alternative embodiment, the
예를 들어, 상기 검출기 14 는, 나오는 방사선 17b 에 포함된 광학 정보를 전기 신호로 변환하여 전자 장치 15로 전송한다.For example, the
일 구현예에서, 상기 장비는 NIR (근 적외선) 및/또는 MIR (중적외선) 및/또는 FIR (원적외선) 구역에 있는 스펙트럼을 획득하기 위해 배치된다.In one embodiment, the instrument is arranged to acquire a spectrum in the NIR (near infrared) and/or MIR (mid infrared) and/or FIR (far infrared) regions.
일 구현예에서, 장비 10은 연속 획득 모드에서 작동할 수 있으며, 즉, 획득 영역 18 에서 각 경우에 획득되는 것을 실시간으로 전자 장치 15의 화면에 디스플레이한다.In one implementation, the
또한, 본 발명은 도 2에 개략적으로 나타낸 바와 같이, 진동 프로파일을 평가함으로써 시료 내 미생물을 동정하는 방법으로서 하기의 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:The present invention also relates to a method for identifying microorganisms in a sample by evaluating a vibrational profile, as schematically shown in FIG. 2 , comprising the steps of:
- 하기를 포함하여 공지 미생물의 공지 시료의 참조용 스펙트럼의 데이터베이스를 준비하는 단계 A:Step A of preparing a database of spectra for reference of a known sample of a known microorganism, comprising:
- 공지 시료를 샘플링하는 하나 이상의 단계 A1; - at least one step A1 of sampling a known sample;
- 공지 시료의 스펙트럼을 획득하는 하나 이상의 단계 A2; - at least one step A2 of acquiring a spectrum of a known sample;
- 스펙트럼 구역을 적어도 식별하여 각 카테고리 및/또는 분류 그룹을 식별하는 스펙트럼 특징의 존재를 평가하기 위해 공지 시료의 스펙트럼을 처리, 가능하게는 자동화 처리하는 하나 이상의 단계 A3; - at least one step A3 of processing, possibly automating, the spectrum of the known sample to at least identify spectral regions to assess the presence of spectral features identifying each category and/or classification group;
- 더 넓은 카테고리 및/또는 분류 그룹에서 더 좁은 카테고리 및/또는 분류 그룹까지 계층적으로 정리된 미생물의 카테고리 및/또는 분류 그룹과 연관된 복수의 사전 계산된 모델을 생성하고, 상기 사전 계산된 모델 각각은 미생물의 카테고리 및/또는 분류 그룹과 연관된 스펙트럼 특징의 식별을 포함하는, 하나 이상의 단계 A4; - generating a plurality of pre-computed models associated with categories and/or taxonomic groups of microorganisms arranged hierarchically from broader categories and/or taxonomic groups to narrower categories and/or taxonomic groups, each of said pre-computed models one or more steps A4 comprising identification of spectral features associated with a category and/or taxonomic group of microorganisms;
- 미지 시료를 샘플링하는 단계 B;- step B of sampling the unknown sample;
- 미지 시료의 스펙트럼을 획득하는 하나 이상의 단계 C;- at least one step C of acquiring a spectrum of an unknown sample;
- 상기 A3 단계에서 정의된 것을 기초로 하여 미지 시료의 스펙트럼을 처리하는 하나 이상의 단계 D; - at least one step D of processing the spectrum of the unknown sample based on that defined in step A3 above;
- 하나 이상의 분석 단계로서, 상기 단계 각각은 미지 시료의 스펙트럼을 상기 사전 계산된 모델과 비교하는 복수의 하위 단계를 연속적으로 수행하도록 제공되며, 상기 하위 단계 각각은 다변량 분석 방법에 의해 미지 시료의 스펙트럼을 점진적으로 더 좁은 카테고리 및/또는 분류 그룹의 사전 계산된 모델과 비교하여, 미지 시료가 미생물의 상기 카테고리 및/또는 분류 그룹에 소속함을 보여주는 점수를 적어도 제공하기 위한 것인 단계 E;- one or more analysis steps, each of said steps being provided for sequentially performing a plurality of substeps of comparing the spectrum of the unknown sample to the pre-calculated model, each of the substeps being a spectrum of the unknown sample by a multivariate analysis method comparing to a pre-computed model of progressively narrower categories and/or taxonomic groups to at least provide a score showing that the unknown sample belongs to said category and/or taxonomic group of microorganisms;
- 하나 이상의 컨트롤 단계로서, 신뢰성 파라미터가 사전 결정된 승인 값보다 더 낮은 경우 미지 시료의 새로운 스펙트럼 획득 단계 C를 요청하거나 또는 실패한 동정 J 또는 성공적인 동정 G, H, I를 포함할 수 있는 최종 결과를 제공하는 단계 F.- as one or more control steps, requesting a new spectral acquisition step C of an unknown sample if the reliability parameter is lower than a predetermined acceptance value or providing a final result that may include a failed identification J or a successful identification G, H, I Step F.
일 구현예에 따르면, 단계 A1, A2, A3 은 데이터베이스에 새로운 공지의 시료를 삽입하고자 할 때마다 반복될 수 있다.According to one embodiment, steps A1, A2, and A3 may be repeated whenever a new known sample is to be inserted into the database.
일 구현예에 따르면, 샘플링 단계 B, A1 에서, 시료는 미생물을 위한 영양 물질을 첨가하는 예비적 절차를 거칠 수 있다.According to one embodiment, in the sampling steps B and A1, the sample may be subjected to a preliminary procedure of adding a nutrient substance for microorganisms.
일 구현예에 따르면, 시료는 고체 배양 배지 상에서 성장할 수 있다.According to one embodiment, the sample may be grown on a solid culture medium.
일 구현예에 따르면, 시료는 페트리 디시(Petri dish) 상에서 성장할 수 있다.According to one embodiment, the sample may be grown on a Petri dish.
일 구현예에 따르면, 시료는 액체 배양 배지 상에서 성장할 수 있고, 그 후 원심분리되어 농축 펠릿으로 얻어질 수 있다.According to one embodiment, the sample may be grown on a liquid culture medium and then centrifuged to obtain a concentrated pellet.
일 구현예에 따르면, 시료는 액체 배양 배지, 또는 액체 성장 액(broth)에서 성장할 수 있고 그 후 여과될 수 있다.According to one embodiment, the sample may be grown in a liquid culture medium, or liquid growth broth and then filtered.
일 구현예에 따르면, 시료는 액체 배양 배지 또는 액체 성장 액에서 성장할 수 있거나 또는 존재하는 미생물의 농도를 높이기 위한 농축 또는 농후화(enrichment) 절차에 가해질 수 있다.According to one embodiment, the sample may be grown in a liquid culture medium or liquid growth broth or may be subjected to a concentration or enrichment procedure to increase the concentration of microorganisms present.
다른 구현예에 따르면, 분석될 시료는 성장 단계를 경험하지 않은 천연 시료에서 직접 얻어질 수 있다.According to another embodiment, the sample to be analyzed may be obtained directly from a natural sample that has not undergone a growth phase.
일 구현예에 따르면, 시료는 가능하게는, 인간, 동물, 환경, 농업 및 식품 기원의 생물학적 유체 및/또는 복합 매트릭스를 포함할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 스펙트럼 획득 단계 C, A2 는, 시료와 접촉하는 장치 표면, 예를 들어 도 1의 획득 지대 18의 표면을 세정하는 예비 단계를 제공할 수 있다.According to one embodiment, the sample may comprise a biological fluid and/or a composite matrix, possibly of human, animal, environmental, agricultural and food origin. According to one embodiment, the spectrum acquisition steps C, A2 may provide a preliminary step of cleaning the device surface in contact with the sample, for example, the surface of the
일 구현예에 따르면, 배경 스펙트럼을 획득하여, 예를 들어 연속 획득 모드를 통해 배경 스펙트럼을 획득하여, 예를 들어 획득 지대 18에 침착된 불순물과 연관된 흡수 밴드가 사라지는 것을 관찰함으로써, 그러한 세정 효과를 확인할 수 있다.According to one embodiment, such a cleaning effect can be obtained by acquiring a background spectrum, for example through a continuous acquisition mode, for example by observing the disappearance of absorption bands associated with impurities deposited in
또한, 일 구현예에 따르면, 스펙트럼 획득 단계 C, A2는 시료의 분석물이 취해져서, 가능하게는 분광 광도계의 결정 12 에 위치하는, 획득 지대 18에 놓는 것을 제공한다.Further, according to one embodiment, the spectral acquisition steps C, A2 provide that an analyte of the sample is taken and placed in an
일 구현예에 따르면, 분석물은, 예를 들어 일회용 막대에 의해 제거 및 놓임으로써, 고체 형태로 획득 지대 18에 놓인다.According to one embodiment, the analyte is placed on the
일 구현예에 따르면, 분석물은, 예를 들어 동역학적 프레스를 사용함으로써, 획득 지대 18에 대해 가압될 수 있다.According to one embodiment, the analyte may be pressed against the
일 구현예에 따르면, 시료의 건조 수준 및 스펙트럼 획득에 필요한 스펙트럼 파라미터 (예를 들어 신호 강도, 신호 대 노이즈 비, 스펙트럼 모양)는 분광학적으로 모니터링된다.According to one embodiment, the level of dryness of the sample and the spectral parameters necessary for spectral acquisition (eg signal intensity, signal-to-noise ratio, spectral shape) are monitored spectroscopically.
일 구현예에 따르면, 연속 획득 모드에서 장비를 떠나는 수분 함량을 평가하고 각각의 파수 범위에서 물의 스펙트럼 특성과 관련된 흡수 밴드의 감소를 가능한 완전한 소멸까지 모니터링하는 것이 가능하다.According to one embodiment, it is possible to evaluate the moisture content leaving the instrument in the continuous acquisition mode and to monitor the reduction of the absorption band related to the spectral properties of water in each wavenumber range, up to possible complete disappearance.
본 발명에 따르면, 시료의 스펙트럼은 건조 및 스펙트럼 파라미터의 사전 결정된 표준 수준에 도달할 때 획득된다.According to the invention, the spectrum of the sample is obtained upon reaching predetermined standard levels of drying and spectral parameters.
유익하게는, 이 특징은 스펙트럼이 미생물의 독특한 신호를 덮거나 간섭하는 물의 존재로 인한 신호를 가질 수 있는 현재 기술의 문제점을 극복하거나 적어도 제한할 수 있게 한다.Advantageously, this feature makes it possible to overcome or at least limit the problems of the current technology that the spectrum may have a signal due to the presence of water interfering or covering the unique signal of the microorganism.
또한, 스펙트럼 획득 단계 C, A2는 시료에서 취한 분석물의 스펙트럼이 기록되는 것을 제공한다.In addition, the spectrum acquisition steps C, A2 provide that the spectrum of the analyte taken from the sample is recorded.
일 구현예에 따르면, 스펙트럼 기록은 사전 결정된 수의 순차 스펙트럼을 획득하도록 제공하며, 그 다음으로, 신호 대 노이즈 비를 개선하기 위해 평균을 낸다.According to one embodiment, spectral recording provides to acquire a predetermined number of sequential spectra, which are then averaged to improve the signal-to-noise ratio.
일 구현예에 따르면, 각 분석물에 대해 8 내지 512, 바람직하게는 각 분석물에 대해 32 내지 256, 더욱 바람직하게는 각 분석물에 대해 64 내지 128의 범위에 포함된 다수의 스펙트럼을 획득하고 평균화할 수 있다.According to one embodiment, a plurality of spectra are obtained, comprised in the range of 8 to 512 for each analyte, preferably 32 to 256 for each analyte, more preferably 64 to 128 for each analyte, can be averaged.
스펙트럼을 처리하는 단계 D, A3, 또는 스펙트럼의 평균은 다음을 제공할 수 있다:Step D, A3 of processing the spectrum, or averaging the spectrum may provide:
- 각 카테고리 및/또는 분류 그룹을 식별하는 스펙트럼 특징의 존재를 평가하기 위해 스펙트럼 구역을 식별, 가능하게는 자동화된 식별하는 것;- identification, possibly automated identification, of spectral regions to assess the presence of spectral features identifying each category and/or classification group;
- 스펙트럼 프로파일의 선형 및/또는 비선형 보간 및/또는 피팅 알고리즘을 사용하는 것;- using linear and/or non-linear interpolation and/or fitting algorithms of spectral profiles;
- 스펙트럼 프로파일의 1차 및/또는 2차 도함수를 계산하는 것;- calculating the first and/or second derivative of the spectral profile;
- 전체 스펙트럼 범위에 걸쳐 벡터 정규화 알고리즘을 사용하여 도함수를 정규화하는 것. 예를 들어, 도 3a는 상이한 시료에 대해 수집될 수 있는 스펙트럼을 도시하는 한편, 도 3b는 처리된 스펙트럼을 도시한다.- Normalizing the derivatives using a vector normalization algorithm over the entire spectral range. For example, FIG. 3A shows a spectrum that may be collected for a different sample, while FIG. 3B shows a processed spectrum.
몇가지 공지 시료에 대해 단계 A1, A2, A3 를 반복함으로써 공지 미생물의 참조용 스펙트럼의 데이터베이스를 준비할 수 있다.A database of spectra for reference of known microorganisms can be prepared by repeating steps A1, A2, and A3 for several known samples.
그러나, 본 방법의 일 구현예에 따르면, 데이터베이스는 다른 방법을 사용하여 얻은 공지 미생물의 스펙트럼을 포함할 수 있다.However, according to one embodiment of the method, the database may include spectra of known microorganisms obtained using other methods.
일 구현예에 따르면, 데이터베이스는 공지 미생물의 상이한 분류 그룹에 속하는 단일 미생물(monomicrobial) 배양과 관련된 스펙트럼을 포함한다.According to one embodiment, the database includes spectra related to monomicrobial cultures belonging to different taxonomic groups of known microorganisms.
일 구현예에 따르면, 데이터베이스는 각 카테고리 및/또는 분류 그룹에 대해 공지 미생물의 상이한 균주와 관련된 스펙트럼을 포함한다.According to one embodiment, the database comprises, for each category and/or taxonomy group, spectra associated with different strains of known microorganisms.
일 구현예에 따르면, 데이터베이스는 배양 배지, 예를 들어 한천(Agar), CNA 한천, CLED 한천, 혈액 한천, 색생성(Chromogenic) 한천, 사부로(Sabouraud) 한천에서 성장한 시료에 관한 스펙트럼을 포함한다.According to one embodiment, the database comprises spectra related to samples grown on a culture medium, for example, agar, CNA agar, CLED agar, blood agar, Chromogenic agar, Sabouraud agar.
일 구현예에 따르면, 데이터베이스는 액체 성장 액에서 성장한 시료와 관련된 스펙트럼을 포함하며, 그 후, 원심분리, 여과, 또는 농후화(enriched)되어 펠릿 또는 농축 시료를 얻는다.According to one embodiment, the database comprises spectra associated with a sample grown in a liquid growth broth, which is then centrifuged, filtered, or enriched to obtain a pellet or concentrated sample.
일 구현예에 따르면, 데이터베이스는 성장 단계 없이 임의 물질 또는 재료로부터 직접적으로 얻은 시료, 즉, 천연 시료에서 얻은 시료에 관한 스펙트럼을 포함한다.According to one embodiment, the database comprises spectra relating to a sample obtained directly from any substance or material without a growth step, ie a sample obtained from a natural sample.
유익하게는, 액체 액에서의 성장 및 후속하는 펠릿화 또는 여과 또는 농후화로부터 얻어진 스펙트럼의 측정은 생물학적 유체, 예를 들어 체액 및/또는 복합 매트릭스의 존재 하에 직접적으로 스펙트럼을 식별하도록 하여준다.Advantageously, measurement of spectra obtained from growth in a liquid fluid and subsequent pelleting or filtration or thickening allows to identify spectra directly in the presence of biological fluids, such as body fluids and/or complex matrices.
상이한 배양 배지에서 성장하여 얻은 효과를 또한 포함하는, 데이터베이스에 포함된 스펙트럼의 이러한 불균질성과 가변성은 미생물을 동정하는 일반적인 분석을 수행할 수 있게 하여준다.This heterogeneity and variability of the spectra contained in the database, which also includes the effects obtained by growing in different culture media, makes it possible to perform general analyzes to identify microorganisms.
각 스펙트럼의 다중 획득이 사용되는 구현예에서, 반복되는 개별 스펙트럼 및/또는 반복에 대해 계산된 평균 스펙트럼을 데이터베이스에 삽입하는 것이 가능하다.In embodiments where multiple acquisitions of each spectrum are used, it is possible to insert individual spectra repeated and/or average spectra calculated for the iterations into the database.
단계 A4 는 데이터베이스에 포함된 스펙트럼에서 시작하여 사전 계산된 모델, 즉, 계층적으로 정리된 미생물의 분류 그룹과 연관된 식별 스펙트럼 특징을 포함하는 참조용 라이브러리를 생성하는 것을 제공한다.Step A4 provides, starting from the spectra contained in the database, to create a pre-computed model, ie, a library for reference containing identifying spectral features associated with hierarchically organized taxonomic groups of microorganisms.
일 구현예에 따르면, 상기 사전 계산된 모델은 장비 10의 전자 장치 15에 저장될 수 있다.According to an embodiment, the pre-calculated model may be stored in the
일 구현예에 따르면, 식별 스펙트럼 특징은 예를 들어, 모양, 크기, 피이크의 강도와 면적, 상이한 피이크들의 강도 사이 또는 면적 사이의 상관관계와 비, 피이크의 최대 주파수 값을 포함할 수 있다.According to one embodiment, the discriminating spectral characteristic may include, for example, the shape, size, intensity and area of a peak, a correlation and ratio between intensities or areas of different peaks, and a maximum frequency value of the peak.
일 구현예에 따르면, 식별 스펙트럼 특징은 예를 들어 도 3a 및 도 3b 에 나타낸, 950 과 1280 cm-1사이의 스펙트럼 지대 (핵산, 탄수화물 및 다당류와 관련된 것), 1280 과 1480 cm-1 사이의 스펙트럼 지대 (전분, 예를 들어 단백질 전분, 메틸(methyl) 및 메틸렌(methylene), 예를 들어 지질의 것과 관련된 것), 1700 과 1800 cm-1 사이의 스펙트럼 지대 (카르보닐 기, 예를 들어 지질의 것과 관련된 것), 2800 과 3000 cm-1 사이의 스펙트럼 지대 (지방족 쇄, 예를 들어 지질의 것과 관련된 것)에서의 스펙트럼 프로파일을 포함할 수 있다.According to one embodiment, the discriminating spectral characteristic is a spectral zone between 950 and 1280 cm -1 (related to nucleic acids, carbohydrates and polysaccharides), between 1280 and 1480 cm -1 , as shown for example in FIGS. 3A and 3B . spectral zone (starch, eg protein starch, methyl and methylene, eg related to that of lipids), spectral zone between 1700 and 1800 cm -1 (carbonyl groups, eg lipids) ), and spectral profiles in the spectral region between 2800 and 3000 cm -1 (associated with those of aliphatic chains, eg, lipids).
일 구현예에 따르면, 분류 그룹은 예를 들어, 도메인(domain), 계(kingdom), 문(phylum), 류(class), 목(order), 과(family), 족(tribe), 속(genus), 종(species), 아종(subspecies)과 같은 분류 카테고리를 포함할 수 있다.According to one embodiment, a taxonomy group is, for example, a domain, a kingdom, a phylum, a class, an order, a family, a tribe, a genus ( genus), species, and subspecies.
일 구현예에 따르면, 분류 그룹은 예를 들어 원핵생물, 진핵생물, 고세균류, 그람 양성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 효모, 사상성 진균일 수 있다.According to one embodiment, the taxonomic group can be, for example, prokaryotes, eukaryotes, archaea, gram-positive bacteria, gram-negative bacteria, yeast, filamentous fungi.
다른 구현예에 따르면, 분류 그룹은 예를 들어 분류 카테고리 및/또는 표현형 그룹 및/또는 유전자형 그룹일 수 있다.According to another embodiment, a taxonomy group may be, for example, a classification category and/or a phenotype group and/or a genotype group.
일 구현예에 따르면, 상기 분류 그룹은, 더 넓은 분류 그룹이 더 좁은 분류 그룹 세트를 포함하도록, 예를 들어 미생물의 한 속이 다른 종들을 포함할 수 있고 미생물의 한 종이 여러 아종을 포함할 수 있도록, 더 넓은 분류 그룹에서부터 더 좁은 분류 그룹에까지 계층적으로 정리될 수 있다.According to one embodiment, the taxonomic groups are grouped so that a wider taxonomic group includes a narrower set of taxonomic groups, eg, a genus of microorganisms can include different species and a single species of microorganisms can include several subspecies. , can be hierarchically organized from a wider classification group to a narrower classification group.
일 구현예에 따르면, 사전 계산된 모델은 각 카테고리 및/또는 분류 그룹과 관련된 식별 스펙트럼 특징의 리스트를 포함할 수 있다.According to one implementation, the pre-computed model may include a list of identifying spectral features associated with each category and/or classification group.
그 후, 단계 A4 에서, 데이터베이스에 포함된 스펙트럼은 미생물의 분류 그룹에 공통인 식별 스펙트럼 특징을 식별하기 위해 비교된다.Then, in step A4, the spectra contained in the database are compared to identify identifying spectral features common to taxonomic groups of microorganisms.
일 구현예에 따르면, 자동 인식 시스템이 제공되어 분류 그룹과 연관된 식별 스펙트럼 특징을 식별할 수 있다.According to one implementation, an automatic recognition system may be provided to identify an identifying spectral feature associated with a classification group.
일 구현예에 따르면, 분류 그룹과 연관된 식별 스펙트럼 특징은 후술하는 통계적 분석 기술 및/또는 신경망 및/또는 인공 학습에 기반한 접근법을 이용하여 식별될 수 있다.According to one implementation, the discriminating spectral features associated with a classification group may be identified using statistical analysis techniques described below and/or approaches based on neural networks and/or artificial learning.
일 구현예에 따르면, 분류 그룹을 기반으로 하여, 사전 계산된 임의 수의 모델을 생성할 수 있다.According to one implementation, based on the classification group, it is possible to generate any number of pre-computed models.
이러한 방식으로, 분석 단계 E 에서 미지 시료의 스펙트럼을 모델과 비교할 때마다, 이러한 비교는, 전체 스펙트럼 범위 및/또는 모든 스펙트럼 특징 보다는, 오직 스펙트럼 간격 및/또는 가장 관심있는 스펙트럼 특징에 관해서만 수행될 수 있다.In this way, whenever in the analysis step E the spectrum of an unknown sample is compared with the model, such comparison will be performed only with respect to spectral intervals and/or spectral features of most interest, rather than the entire spectral range and/or all spectral features. can
예를 들어, 만약 전체 스펙트럼 범위에 걸쳐 1cm-1의 해상도로 획득한 미지 시료의 스펙트럼을 예를 들어 동일한 해상도로 획득한 18000개의 참조 스펙트럼을 포함하는 데이터베이스와 비교하고 싶다면, 현재 기술을 사용하여 이 비교를 수행하려면 6,500만개의 포인트를 평가하는 것이 필요할 것이다.For example, if you want to compare the spectrum of an unknown sample acquired with a resolution of 1 cm −1 over the entire spectral range with a database containing, for example, 18000 reference spectra acquired with the same resolution, you can use the current technique to It would be necessary to evaluate 65 million points to perform a comparison.
본 출원인은, 본 발명에 따라 사전 계산된 모델을 사용함으로써, 이러한 비교를 위해 현재 기술의 방법보다 20배 내지 80배 더 적은 포인트의 평가 수를 필요로 할 수 있다는 것을 발견하였다.Applicants have discovered that, by using a pre-computed model according to the present invention, the number of evaluations of 20 to 80 times fewer points may be required for this comparison than the methods of the present technology.
따라서 미리 계산된 모델을 사용하면 필요한 컴퓨팅 성능을 상관 방식으로 줄일 수 있으므로 대규모 데이터베이스가 있는 경우에도 원격 데이터 분석 및/또는 분산 컴퓨팅이 필요하지 않다.Thus, the use of precomputed models can reduce the required computing power in a correlational way, eliminating the need for remote data analysis and/or distributed computing, even with large databases.
따라서, 이러한 특징은 많은 수의 분류 그룹을 포함하도록 데이터베이스의 크기를 상당히 증가시킬 수 있게 하여 본 발명의 방법의 예측 및 동정 능력을 개선하고 확장한다.Thus, this feature allows to significantly increase the size of the database to include a large number of taxonomy groups, thereby improving and extending the predictive and identification capabilities of the method of the present invention.
또한, 이 특징을 통해 고해상도에서도 스펙트럼을 사용하여 작업할 수 있어 분석법의 정확도와 정밀도가 개선된다.This feature also allows you to work with spectra even at high resolution, improving the accuracy and precision of your methods.
더욱이, 예를 들어, 리스트가 있으면 모든 스펙트럼에 대한 전체 파장 범위에서 최소 제곱 방법 및/또는 가능한 평균 제곱 폐기(average square discards) 계산을 사용하는 것이 불필요하게 될 수 있다.Moreover, for example, having a list may make it unnecessary to use least squares methods and/or possible average square discards calculations over the entire wavelength range for all spectra.
일 구현예에 따르면, 분석 단계 E 는 미지 시료의 스펙트럼이 사전 계산된 모델과 비교되는, 복수의 비교 하위 단계를 연속적으로 제공한다.According to one embodiment, the analysis step E sequentially provides a plurality of comparison substeps, wherein the spectrum of the unknown sample is compared with a pre-computed model.
특히, 각 하위 단계는 미지 시료의 스펙트럼을 점진적으로 더 작은 분류 그룹의 사전 계산된 모델과 비교하고, 미생물의 미생물 분류 그룹에 대한 미지 시료의 소속을 나타내는 적어도 일부 점수를 제공한다.In particular, each sub-step compares the spectrum of the unknown sample to a pre-computed model of progressively smaller taxonomic groups, and provides at least some score indicative of the affiliation of the unknown sample to the microbial taxonomic group of microorganisms.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 다변량 분석의 통계적 및/또는 화학계측적 방법이 비교에 사용될 수 있으며, 예를 들어 주성분 분석 (Principal Components Analysis, PCA), 또는 선형 판별식 분석 (LDA), 선형 판별식 부분 최소-자승(Linear discriminant partial least-squares, LDPLS), 이차 판별 분석 (Quadratic Discriminant Analysis, QD), 계층적 클러스터 분석 (Hierarchical Cluster Analysis, HCA), 랜덤 포레스트(Random Forest), 또는 이들과 다른 기술의 임의 조합 등등이 있다.According to an embodiment of the present invention, statistical and/or chemometric methods of multivariate analysis may be used for comparison, for example, Principal Components Analysis (PCA), or linear discriminant analysis (LDA), linear Linear discriminant partial least-squares (LDPLS), Quadratic Discriminant Analysis (QD), Hierarchical Cluster Analysis (HCA), Random Forest, or with them any combination of different techniques, and so on.
일 구현예에 따르면, 신경망에 기반한 접근법을 구현하는 방법, 기술, 또는 알고리즘이 상기 비교를 위해 사용될 수 있다.According to one embodiment, a method, technique, or algorithm implementing an approach based on a neural network may be used for the comparison.
일 구현예에 따르면, 인공 학습 (머신 러닝)에 기반한 접근법을 구현하는 방법, 기술 또는 알고리즘이 상기 비교를 위해 사용될 수 있다.According to one embodiment, a method, technique or algorithm implementing an approach based on artificial learning (machine learning) may be used for the comparison.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비교는 스펙트럼 및 모델의 제1 및/또는 제2의 도함수(derivatives)를 비교하는 것을 제공할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, said comparison may provide for comparing first and/or second derivatives of a spectrum and a model.
일 구현예에 따르면, 통계적 가중치를 사용하여 스펙트럼의 다른 구역에 다른 방식으로 가중하기 위해 통계적 가중치를 사용하는 것이 가능하다.According to one embodiment, it is possible to use statistical weights to weight different regions of the spectrum in different ways using statistical weights.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 스펙트럼과 모델 사이의 비교는 예를 들어 최소 제곱에 기반한 방법을 사용하여 스펙트럼과 모델 사이의 거리 정의를 통해 수행될 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the comparison between the spectrum and the model may be performed through definition of the distance between the spectrum and the model using, for example, a least squares based method.
일 구현예에 따르면, 거리는 통계적 및/또는 화학측정학적 분석을 수행하기 위해 미터법으로(metric) 사용될 수 있다. According to one embodiment, distance may be used as a metric to perform statistical and/or chemometric analysis.
일 구현예에 따르면, 스펙트럼 사이의 변동량(variance)은 PCA 및/또는 LDA 분석을 위해 사용될 수 있다.According to one embodiment, the variance between spectra can be used for PCA and/or LDA analysis.
일 구현예에 따르면, PCA 수행 및 후속하여 LDA 를 이용한 주요 구성요소의 선형 판별식의 분석을 제공하는 결합된 통계 방법을 사용할 수 있다.According to one embodiment, a combined statistical method may be used that provides for performing PCA and subsequently analyzing the linear discriminant of the principal components using LDA.
일 구현예에 따르면, PCA 결과가 후속 LDA 분석 대상이 될 때, PCA 에 의해 얻은 클러스터의 분리가 강조되어 서로 매우 유사한 스펙트럼 특징을 가진 종도 동정할 수 있다.According to one embodiment, when PCA results are subjected to subsequent LDA analysis, the separation of clusters obtained by PCA is emphasized, so that species with spectral characteristics very similar to each other can be identified.
일 구현예에 따르면, 상기 비교 하위 단계는 미지 시료가 속하는 더 넓은 카테고리 및/또는 분류 그룹을 식별하기 위해 먼저 미지 스펙트럼을 더 넓은 분류 그룹의 사전 계산된 모델과 비교하고; 이어서, 미지 시료가 속하는 점진적으로 더 좁은 분류 그룹을 동정하기 위해 상기 미지 스펙트럼을 점진적으로 더 작은 분류 그룹의 사전 계산된 모델과 비교할 수 있다.According to one embodiment, the comparison substep comprises first comparing the unknown spectrum with a pre-computed model of the broader classification group to identify a broader category and/or classification group to which the unknown sample belongs; The unknown spectrum can then be compared to a pre-computed model of progressively smaller taxonomic groups to identify progressively narrower taxonomic groups to which the unknown sample belongs.
유익하게는, 이 특징은 다른 공지의 방법과 관련하여, 스펙트럼 유형들 사이에 더 적은 수의 비교를 수행하게 하여준다.Advantageously, this feature allows to perform fewer comparisons between spectral types in relation to other known methods.
예를 들어, 데이터베이스에 45가지 다른 종과 관련된 45가지 유형의 스펙트럼이 포함된 경우, 현재 공지된 기술의 방법으로는 존재하는 모든 45가지 유형의 종과 비교하여 미지 시료를 동정하려고 할 것이다.For example, if a database contains 45 types of spectra related to 45 different species, the methods of the presently known technique will attempt to identify the unknown sample by comparing it to all 45 types of species present.
반면, 본 발명의 방법의 구현예에 따르면, 45가지 종은 유사한 특징으로 특징화된 더 넓은 분류의 매크로 그룹 (예를 들어 4)에 따라 분류될 수 있다.On the other hand, according to an embodiment of the method of the present invention, the 45 species can be classified according to a broader classification of macrogroups (eg 4) characterized by similar characteristics.
각 매크로 그룹은 예를 들어 3개의 더 작은 분류 그룹을 포함하고, 각각은 차례로 2개의 더 작은 분류 하위 그룹을 포함하며, 후자는 예를 들어 다른 종 또는 아종과 관련된다.Each macrogroup contains, for example, three smaller taxonomic groups, each in turn containing two smaller taxonomic subgroups, the latter relating to, for example, other species or subspecies.
이 경우, 3개의 하위 단계가 제공될 수 있으며, 첫번째 하위 단계에서 첫번째 분류 매크로 그룹이 미지 시료에 할당되고, 두번째 하위 단계에서 두번째 분류 그룹이 할당되고, 세번째 하위 단계에서 세번째 분류가 할당된다. In this case, three sub-steps may be provided, in the first sub-step the first classification macro group is assigned to the unknown sample, in the second sub-step the second classification group is assigned, and in the third sub-step the third classification is assigned.
유익하게는, 이 특징을 통해 스펙트럼을 유사한 매크로 그룹으로 나눌 수 있어 데이터 매트릭스를 단순화하고 첫번째 단계 후에 덜 복잡한 데이터 매트릭스로 작업할 수 있으며, 여기서 특히 유사한 종이나 아종을 나누는 특징을 더 쉽게 식별할 수 있다.Advantageously, this feature allows us to divide the spectrum into groups of similar macros, which simplifies the data matrix and allows us to work with less complex data matrices after the first step, where it is easier to identify features that specifically divide similar species or subspecies. there is.
따라서, 상기 특징은 시간 측면과, 공지 방법에 관련하여 컴퓨팅 리소스의 소비 측면의 모두에서, 보다 빠르고 더 효율적인 방법을 얻을 수 있게 한다.Thus, this feature makes it possible to obtain a faster and more efficient method, both in terms of time and in terms of consumption of computing resources in relation to known methods.
일 구현예에 따르면, 각 비교 하위 단계에서, 상기 다변량 분석 기술은 미지 스펙트럼이 비교되는 분류 그룹 각각에 소속하는지를 보여주는 점수를 제공한다.According to one embodiment, at each comparison substep, the multivariate analysis technique provides a score showing whether the unknown spectrum belongs to each of the classification groups being compared.
소속 점수는 전술한 다변량 분석 기술로부터 공지의 방식으로 얻을 수 있으며 가능하게는 정규화되고 백분율로 표현될 수 있다.The membership score can be obtained in a known manner from the multivariate analysis technique described above and possibly normalized and expressed as a percentage.
예를 들어, 일 구현예에 따르면, 소속 점수는 주요 구성요소들 사이의 선형 판별식과 연관될 수 있다.For example, according to one implementation, an affiliation score may be associated with a linear discriminant between key components.
일 구현예에 따르면, 컨트롤 단계 F 는 분석 단계 E 에서 수행된 동정의 신뢰성을 확인하기 위해 제공된다.According to one embodiment, the control step F is provided to confirm the reliability of the identification performed in the analysis step E.
상기 컨트롤은 예를 들어 각 하위 단계에서 예를 들어 70% 초과의 사전 결정된 승인 값보다 더 높은 소속 점수를 갖는 미지 시료가 속하는 하나 이상의 분류 그룹이 동정되었는지 확인함으로써 수행될 수 있다. Said control may be performed, for example, by verifying that at each sub-step one or more taxonomy groups to which the unknown sample belongs with an affiliation score higher than, for example, a predetermined acceptance value of greater than 70% have been identified.
이 경우, (도 2의 블록 G), 미지 시료는 더 좁은 분류 그룹으로 동정된다.In this case (block G in Fig. 2), the unknown sample is identified as a narrower classification group.
하나 이상의 비교 하위 단계에서, 소속 점수의 하나가 사전 결정된 승인 값 보다 더 낮은 경우, 상기 방법은 미지 시료로부터 취해진 두번째 분석물에 대해 두 번째 획득 단계 C, 두 번째 처리 단계 D, 및 두 번째 분석 단계 E 를 수행한다.In one or more comparison substeps, if one of the affiliation scores is lower than a predetermined acceptance value, the method includes a second acquisition step C, a second processing step D, and a second analysis step for a second analyte taken from the unknown sample. do E.
만약 두 개의 분석 단계 E 가 미지 시료를 동일한 분류 그룹 (도 2에서 블록 H)에 할당할 경우, 상기 미지 시료는 두 개의 분석 단계 E 에 할당된 가장 작은 분류 그룹으로 동정된다.If two analysis steps E assign an unknown sample to the same classification group (block H in FIG. 2 ), the unknown sample is identified as the smallest classification group assigned to the two analysis steps E. FIG.
혹은, 세번째 분석이 수행되고 세번째 획득 단계 C, 세번째 처리 단계 D, 및 세번째 분석 단계 E가 수행된다.Alternatively, a third analysis is performed and a third acquisition step C, a third processing step D, and a third analysis step E are performed.
세번째 분석 단계 E 가 이전 분석 단계 E 중 적어도 하나의 동일한 분류 그룹에 미지 시료를 할당할 경우(도 2의 블록 I), 미지 시료는 일치하는 결과와 함께 두 개의 분석 단계 E 에 의해 할당된 가장 작은 분류 그룹으로 동정된다.If the third analysis step E assigns an unknown sample to the same classification group in at least one of the previous analysis steps E (block I in Fig. identified as a taxonomy group.
혹은, 비(non)-동정 메시지가 제공된다 (도 2의 블록 J).Alternatively, a non-identifying message is provided (block J in FIG. 2 ).
일 구현예는 데이터를 수집하고 이를 데이터베이스에 대해 분석하는데 사용되는 컴퓨터 프로그램 또는 소프트웨어로서, 컴퓨터로 판독가능한 매체에 저장 가능하고, 일단 미생물의 분류 및 동정용 분석 장치가 실행되면 본 발명에 따른 방법의 수행을 결정하는 명령이 포함되는 컴퓨터 프로그램 또는 소프트웨어를 제공한다. One embodiment is a computer program or software used to collect data and analyze it against a database, which can be stored in a computer-readable medium, and once the analysis device for classification and identification of microorganisms is executed, the method according to the present invention Provided is a computer program or software containing instructions for determining performance.
실시예 1Example 1
도 4a는 본 발명에 따른 복수의 예측 모델을 적용함으로써 (단계 E) 관심 대상의 다양한 카테고리를 실질적으로 결정하기 위해 미지 스펙트럼에 대해 수행되는 프로세스 흐름을 개략적으로 도시한다. 미지 스펙트럼은 공지 스펙트럼의 데이터베이스에서 단계 A1, A2, A3, A4 에서 개발된 복수의 예측 모델과 비교된다. 각 모델은 예를 들어, 결정되는 카테고리에 대해 가능한 것들 중에서 특정 유형의 속성에 대한 PCA-LDA 분석을 기반으로 한다. 특히, 도 4a의 각 패널에 대해, 각 포인트는, 공지 시료의 데이터베이스에 존재하는 스펙트럼에 대해 PCA-LDA 계산으로 할당된 좌표에 해당하고 (단계 A4); 세트 A, B, C 내의 각 포인트는 결정되는 카테고리에 속하는 특정 유형을 반영한다. 모델 1 에서는 카테고리 1 에 제공되는 다양한 유형에 대한 소속이 결정되고, 공지 시료의 모든 스펙트럼이 소속 A, B, C 의 각 세트 내로 그룹화된다 (도 4a의 첫번째 패널). 따라서, 모델 1 의 경우, 세가지 다른 유형이 가능하며, 각각은 모델에 의해 구획된 공간의 특정 부분과 연관된다.Fig. 4a schematically shows a process flow performed on an unknown spectrum to substantially determine various categories of interest (step E) by applying a plurality of predictive models according to the present invention; The unknown spectrum is compared with a plurality of predictive models developed in steps A1, A2, A3, A4 in a database of known spectra. Each model is based, for example, on a PCA-LDA analysis of a particular type of attribute among the possible ones for the category being determined. Specifically, for each panel in Fig. 4a, each point corresponds to a coordinate assigned by the PCA-LDA calculation for a spectrum present in a database of known samples (step A4); Each point in sets A, B, C reflects a particular type belonging to the category being determined. In Model 1, the affiliations for the various types provided in Category 1 are determined, and all spectra of known samples are grouped into each set of affiliations A, B, and C (first panel in Fig. 4a). Thus, for model 1, three different types are possible, each associated with a specific part of the space demarcated by the model.
각 미지 스펙트럼에 대해, 단계 E 에서는 모델이 구획한 공간에서 차지하는 공간 좌표를 예측하고, 동일 공간에서의 배치를 평가하여 해당 카테고리와 관련된 유형을 결정한다. 예를 들어, 도 4a의 첫번째 패널에서, 모델 1의 경우 이것의 좌표가 유형 A에 속하는 모델의 스펙트럼 좌표와 유사하므로 동일한 유형이 할당됨을 알 수 있다.For each unknown spectrum, step E predicts the spatial coordinates occupied by the model in the space partitioned by the model, and evaluates its placement in the same space to determine the type associated with that category. For example, in the first panel of Fig. 4a, it can be seen that in the case of model 1, its coordinates are similar to the spectral coordinates of a model belonging to type A, and therefore the same type is assigned.
가장 넓은 것에서 가장 좁은 것까지 모델을 계층적으로 세분화하면 복수의 모델의 적용을 제공하는 하위 단계들을 통해 해당 미생물 유형과 관련하여 점점 더 구체적인 정보를 얻을 수 있다 (도 4a의 두번째 패널과 세번째 패널).Hierarchically subdividing the model from the widest to the narrowest allows more and more specific information regarding that microbial type through substeps providing the application of multiple models (second and third panels in Fig. 4a). .
카테고리 1 에 대해 제공된 유형 내에서 특정 유형에 속하는 것은 미지 시료에 적용할 후속 모델을 결정한다는 점에 유의해야 한다.It should be noted that belonging to a particular type within the types provided for Category 1 determines the subsequent model to be applied to the unknown sample.
따라서, 미지 스펙트럼은 미지 시료를 연관시키는 점진적으로 보다 더 상세한 소속 카테고리를 식별하기 위해 점진적으로 더 좁은 분류 그룹의 사전 계산된 모델과 비교된다 (도 4a).Thus, the unknown spectrum is compared to a pre-computed model of progressively narrower classification groups to identify progressively more detailed affiliation categories that correlate unknown samples (Fig. 4a).
미지 시료의 분석 단계 E에 적용되는 각 모델에 대해, 연관된 유형에 속함을 보여주는 점수도 백분율 형식으로 계산된다. 이 값은 미지 스펙트럼에 대해 계산된 좌표가 동일 카테고리의 스펙트럼에 대한 모델에서 정의된 좌표와 얼마나 유사한지를 반영한다 (도 4b에서의 표).For each model applied to step E of analysis of the unknown sample, a score showing belonging to the associated type is also calculated in percentage form. This value reflects how similar the coordinates calculated for the unknown spectrum are to the coordinates defined in the model for the spectrum of the same category (table in Fig. 4b).
이어서, 단계 F 에서는 도 4b에 개략적으로 나타낸 바와 같이, 결과의 신뢰성을 평가하기 위해 프로세스의 다양한 하위 단계 동안에 결정된 각각의 유형과 연관된 소속 점수가 평가된다. 각 모델에 대해 승인 값은, 그 값 이상에서 결과가 신뢰성 있다고 간주될 수 있는 값으로 정의된다. 상기 비교로부터 소속 점수의 모든 값이 각 모델에 대해 사전에 설정된 값보다 더 높은 것이 드러난 경우, 그 결과가 제공되고 (단계 G), 그렇지 않으면 새로운 분석 단계가 요청된다.Then, in step F, the membership scores associated with each type determined during the various sub-steps of the process are evaluated to evaluate the reliability of the results, as schematically shown in FIG. 4B . For each model, the acceptance value is defined as a value above which the result can be considered reliable. If the comparison reveals that all values of the affiliation scores are higher than the preset values for each model, the results are provided (step G), otherwise a new analysis step is requested.
실시예 2Example 2
본 발명의 일 구현예에 따르면, 예를 들어 미생물의 속(Genus)와 같이 전술한 가능한 분류학적 특징 중 임의 하나를 동정하는데 사용될 수 있다. 도 5는 본 발명에 따른 데이터베이스의 스펙트럼을 사용하여 방법의 검증에서 얻은 혼돈 매트릭스(confusion matrix)를 보여주며, 실제 결과와 예측 결과 사이에 97.5% 에서 100% 까지의 대응 관계가 관찰될 수 있다.According to one embodiment of the present invention, it can be used to identify any one of the above-mentioned possible taxonomic characteristics, such as, for example, a genus of microorganisms. 5 shows a confusion matrix obtained in the validation of the method using the spectrum of the database according to the present invention, and a correspondence of 97.5% to 100% between the actual result and the predicted result can be observed.
본 발명의 분야 및 범위를 벗어나지 않으면서 지금까지 설명된 방법 및/또는 장치에 대한 수정 및/또는 부품 또는 단계의 추가가 이루어질 수 있음은 명백하다. 본 발명이 일부 구현예를 참조하여 설명되었지만, 당업자는 명시된 바와 같은 특징을 갖는 방법 및/또는 장치의 많은 다른 동등한 형태를 확실히 달성할 수 있을 것임이 분명하며, 특허청구범위에 명시된 특징을 가지며 그에 따라 정의된 보호범위 안에 모두 포함된다.It will be apparent that modifications and/or additions of parts or steps may be made to the methods and/or apparatuses heretofore described without departing from the spirit and scope of the invention. While the present invention has been described with reference to some embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that many other equivalent forms of methods and/or devices having the features as specified will be able to achieve without fail having the features specified in the claims. All are included within the scope of protection defined according to the
Claims (10)
- (A) 하기를 포함하여 공지 미생물의 공지 시료의 참조용 스펙트럼 데이터 베이스를 준비하는 단계 :
- (A1) 공지 시료를 샘플링하는 하나 이상의 단계;
- (A2) 공지 시료의 스펙트럼을 획득하는 하나 이상의 단계;
- (A3) 스펙트럼 구역을 적어도 식별하여 각 카테고리 및/또는 분류 그룹을 식별하는 스펙트럼 특징의 존재를 평가하기 위해 공지 시료의 스펙트럼을 처리, 가능하게는 자동화 처리하는 하나 이상의 단계;
- (A4) 더 넓은 카테고리 및/또는 분류 그룹에서부터 더 좁은 카테고리 및/또는 분류 그룹까지 계층적으로 정리된 미생물의 카테고리 및/또는 분류 그룹과 연관된 복수의 사전 계산된 모델을 생성하고, 상기 사전 계산된 모델 각각은 미생물의 카테고리 및/또는 분류 그룹과 연관된 스펙트럼 특징의 식별을 포함하는, 하나 이상의 단계;
- (B) 미지 시료를 샘플링하는 단계;
- (C) 미지 시료의 스펙트럼을 획득하는 하나 이상의 단계;
- (D) 상기 단계 (A3)에서 정의된 것을 기초로 하여 미지 시료의 스펙트럼을 처리하는 하나 이상의 단계;
- (E) 하나 이상의 분석 단계로서, 상기 단계 각각은 미지 시료의 스펙트럼을 상기 사전 계산된 모델과 비교하는 복수의 하위 단계를 연속적으로 수행하도록 제공되며, 상기 하위 단계 각각은 다변량 분석 방법에 의해 미지 시료의 스펙트럼을 점진적으로 더 좁은 카테고리 및/또는 분류 그룹의 사전 계산된 모델과 비교하여, 미지 시료가 미생물의 상기 카테고리 및/또는 분류 그룹에 소속함을 보여주는 점수를 적어도 제공하기 위한 것인 단계;
- (F) 하나 이상의 컨트롤 단계로서, 신뢰성 파라미터가 사전 결정된 승인 값보다 더 낮은 경우 미지 시료의 새로운 스펙트럼 획득 단계 (C)를 요청하거나 또는 실패한 동정(J) 또는 성공적인 동정(G, H, I)를 포함할 수 있는 최종 결과를 제공하는 단계.A method for identifying microorganisms in a sample by evaluating a vibrational profile, comprising the steps of:
- (A) preparing a spectral database for reference of a known sample of a known microorganism, including:
- (A1) one or more steps of sampling a known sample;
- (A2) at least one step of acquiring a spectrum of a known sample;
- (A3) one or more steps of processing, possibly automating, the spectrum of the known sample to at least identify spectral regions to assess the presence of spectral features identifying each category and/or classification group;
- (A4) generate a plurality of pre-computed models associated with categories and/or taxonomic groups of microorganisms organized hierarchically from broader categories and/or taxonomic groups to narrower categories and/or taxonomic groups, said pre-calculated one or more steps, each comprising identification of spectral features associated with a category and/or taxonomic group of microorganisms;
- (B) sampling the unknown sample;
- (C) at least one step of acquiring a spectrum of the unknown sample;
- (D) at least one step of processing the spectrum of the unknown sample based on that defined in step (A3) above;
- (E) one or more analysis steps, each of said steps being provided to sequentially perform a plurality of substeps of comparing a spectrum of an unknown sample to said pre-computed model, each of said substeps being determined by a multivariate analysis method comparing the spectrum of the sample to a pre-computed model of progressively narrower categories and/or taxonomic groups to at least provide a score showing that the unknown sample belongs to said category and/or taxonomic group of microorganisms;
- (F) one or more control steps, requesting a new spectral acquisition step (C) of an unknown sample or failing identification (J) or successful identification (G, H, I) if the reliability parameter is lower than a predetermined acceptance value; providing an end result that may include
상기 장치는 방사선(radiation)(17)의 광원(13), 검출기(14), 분석될 시료가 위치하는 구획된 획득 지대(18), 및 처리 시스템과 데이터 디스플레이 시스템이 설치되고 상기 검출 장치와 커플링되는 고정형 또는 휴대형의 전자 장치(15)를 포함하고,
상기 전자 장치(15)에는 더 넓은 분류 그룹에서부터 더 좁은 분류 그룹까지 계층적으로 정리된 미생물의 분류 그룹과 연관된 사전 계산된 모델이 저장되고, 상기 사전 계산된 모델 각각은 미생물의 분류 그룹과 연관된 스펙트럼 특징의 식별을 포함하며, 이에 따라, 결과를 얻는데 필수적인 계산 작업을 수행하기 위해 인터넷에 연결할 필요가 없는 것을 특징으로 하는, 장치.As an apparatus for performing the method for identifying microorganisms in a sample according to any one of claims 1 to 8,
The device is provided with a light source 13 of radiation 17 , a detector 14 , a partitioned acquisition zone 18 in which the sample to be analyzed is located, and a processing system and a data display system and coupled to the detection device. a fixed or portable electronic device (15) that is ringed;
The electronic device 15 stores a pre-calculated model associated with a classification group of microorganisms hierarchically arranged from a wider classification group to a narrower classification group, and each of the pre-calculated models is a spectrum associated with the classification group of the microorganism. A device comprising the identification of a feature, and thus eliminating the need to connect to the Internet to perform computational tasks necessary to obtain a result.
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