KR20220036130A - Method of controlling demethylation of stem cell dna - Google Patents
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Abstract
본 발명은 DNA의 손상 없이 줄기 세포 DNA의 탈메틸화를 제어할 수 있는 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법은 (a) 기준 줄기 세포와 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포를 준비하는 단계; (b) 상기 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포 각각에 테라헤르츠파를 조사하는 단계; (c) 상기 기준 줄기 세포의 DNA의 메틸화 레벨에 대한 상기 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포의 DNA의 제1 메틸화 레벨 내지 제N 메틸화 레벨을 각각 검출하는 단계; 및 (d) 상기 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포 중 제M 메틸화 레벨을 가지는 제M 샘플 줄기 세포에 조사된 테라헤르츠파의 제M 조사 시간, 제M 조사 빈도 및 제M 출력으로 제M 주파수 대역의 테라헤르츠파를 하나 이상의 대상 줄기 세포에 조사하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다(M, N은 자연수, 1≤M≤N).The present invention relates to a method for controlling demethylation of stem cell DNA that can control demethylation of stem cell DNA without damaging the DNA. The method for controlling demethylation of stem cell DNA according to the present invention includes the steps of (a) preparing reference stem cells and first to Nth sample stem cells; (b) irradiating terahertz waves to each of the first to N-th sample stem cells; (c) detecting the first to Nth methylation levels of the DNA of the first to Nth sample stem cells with respect to the methylation level of the DNA of the reference stem cell, respectively; and (d) the M irradiation time, the M irradiation frequency, and the M output of the terahertz wave irradiated to the M sample stem cells having the M methylation level among the first to N sample stem cells. It is characterized by comprising the step of irradiating terahertz waves in the M frequency band to one or more target stem cells (M, N are natural numbers, 1≤M≤N).
Description
본 발명은 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법에 관한 것으로, 특히 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for controlling demethylation of stem cell DNA, and particularly to a method for controlling demethylation of stem cell DNA.
줄기 세포는 자기갱신(self-renewal)을 할 수 있으면서 다양한 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖추고 있어 줄기 세포를 퇴행성 질환의 치료에 이용하기 위한 연구가 활발히 진행 중이다. 줄기 세포를 이용한 치료 요법은 초반엔 큰 기대를 모았으나, 손상된 조직의 재생이 기대한 만큼 충분하지 못하거나 그 효과가 지속되지 못하는 문제점이 보고되는 상황이다. 이는 이식된 성체 줄기 세포가 생체 내에서 생존하는 비율과 원하는 세포로 분화되는 능력이 낮기 때문이다.Stem cells have the ability to self-renew and differentiate into various cells, so research is actively underway to use stem cells to treat degenerative diseases. Treatment using stem cells initially raised great expectations, but problems have been reported in which the regeneration of damaged tissue is not sufficient as expected or the effect is not sustained. This is because transplanted adult stem cells have a low survival rate in vivo and a low ability to differentiate into desired cells.
줄기 세포의 분화에서 후생유전학적 변화(epigenetic modification)가 중요한 인자로 인식되고 있다. 대표적인 후생유전학적 변화인 DNA 메틸화(methylation)는 DNA의 cytosine이 메틸화된 cytosine(5-mC)로 치환되는 현상으로 유전자의 염기서열 자체는 변화하지 않으면서 유전자의 활성을 제어할 수 있는 조절자 역할을 한다. 특히 전역적 DNA 메틸화 농도는 유전자 활성을 조절하여 배아의 발생, 줄기 세포의 분화에서 어떤 세포로 분화할 것인지 어느 단계까지 분화할 것인지를 결정하는데 영향을 미친다. 따라서 줄기 세포의 DNA 메틸화를 분화 과정에서 동역학적으로 능동 탈메틸화를 통해 적절히 조절한다면 줄기 세포의 활성을 조절하고 원하는 계열의 세포로 분화하도록 조절할 수 있다.Epigenetic modification is recognized as an important factor in stem cell differentiation. DNA methylation, a representative epigenetic change, is a phenomenon in which cytosine in DNA is replaced with methylated cytosine (5-mC), and serves as a regulator that can control gene activity without changing the gene base sequence itself. Do it. In particular, global DNA methylation concentration regulates gene activity and influences the development of embryos and the differentiation of stem cells into which cells to differentiate and at what stage of differentiation. Therefore, if the DNA methylation of stem cells is appropriately regulated through active demethylation dynamically during the differentiation process, the activity of the stem cells can be controlled and differentiated into cells of the desired lineage.
DNA 메틸화가 줄기세포 분화에서 중요한 역할을 하지만, 이를 조절하는 방법은 별로 많지 않다. DNA 메틸화에 관여하는 효소와 결합하는 뉴클레오타이드 유사체를 이용하여 이 효소의 기능을 억제하는 것이 가장 널리 이용되는 방법이다.Although DNA methylation plays an important role in stem cell differentiation, there are not many ways to control it. The most widely used method is to inhibit the function of the enzyme involved in DNA methylation using a nucleotide analog that binds to the enzyme.
FDA 승인을 받은 다코젠의 데시타빈(Decitaine, 5-Aza-2'-deoxycytidine)이 뉴클레오타이드 유사체가 가장 널리 알려져 있다. 데시타빈은 탈메틸화를 이용한 일부 암의 치료에 사용된다.Dacogen's Decitaine (5-Aza-2'-deoxycytidine), which has been approved by the FDA, is the most widely known nucleotide analog. Decitabine is used to treat some cancers using demethylation.
TET(Ten-Eleven Translocation) 탈메틸화 5-mC 산화 효소를 활용한 방법은 줄기세포 분화조절의 효율을 크게 높여준다고 보고되고 있어 이를 이용한 연구도 활발하게 진행되고 있다. 그러나 이러한 화학적 방법은 화학 물질의 독성에 의해 사용에 제한이 있으며 줄기세포 분화 과정에 적용하기 힘들다는 단점이 있어 줄기세포 분화 제어를 통한 세포 치료제 연구에 활용될 매개로서 적합하지 않다.It has been reported that the method using TET (Ten-Eleven Translocation) demethylation 5-mC oxidase greatly increases the efficiency of stem cell differentiation control, and research using this method is also actively being conducted. However, these chemical methods have limitations in use due to the toxicity of chemical substances and have the disadvantage of being difficult to apply to the stem cell differentiation process, so they are not suitable as a medium to be used in cell therapy research through stem cell differentiation control.
데시타빈과 TET를 비교하면 아래의 표 1과 같다.A comparison between decitabine and TET is shown in Table 1 below.
인간 유전체는 약 2800만개의 CpG(Cytosine-phoshate-Guanine) 사이트(site)를 가지고 있다. 체세포에서는 60-80%의 CpG가 메틸화되어 있으며, 이렇게 메틸화된 CpG는 유전자 침묵을 통해 유전자 발현이 조절되며 딸세포로 안정적으로 유전된다.The human genome has approximately 28 million CpG (Cytosine-phoshate-Guanine) sites. In somatic cells, 60-80% of CpGs are methylated, and these methylated CpGs regulate gene expression through gene silencing and are stably inherited to daughter cells.
현재 유전자 치료 목적으로 인위적으로 메틸화를 조절하는 수동 탈메틸화 약물 기작의 경우 이러한 메틸화 정보가 딸세포로 전달되는 것을 막아 딸세포의 탈메틸화를 유도하고 있다.Currently, in the case of passive demethylation drug mechanisms that artificially control methylation for gene therapy purposes, this methylation information is prevented from being transmitted to daughter cells, thereby inducing demethylation of daughter cells.
능동 탈메틸화의 경우 DNA 유전을 수반하지 않고 직접적으로 DNA에서 탈메틸화가 이루어지는 것을 의미한다. 능동 탈메틸화는 배아 발생 과정에서 유전자 활성 조절을 위해 효소를 통해 이루어지는 것으로 알려져 있어 줄기 세포의 분화 과정에 깊이 연관이 되어 있다.In the case of active demethylation, it means that demethylation occurs directly in DNA without involving DNA inheritance. Active demethylation is known to occur through enzymes to regulate gene activity during embryonic development, and is therefore deeply involved in the differentiation process of stem cells.
효소를 이용한 생화학적인 반응을 이용해 능동 탈메틸화를 배아 분과 과정에서 적용하려는 연구가 다수 수행되고 있지만, 재현성이 낮고 DNA의 손상을 발생시키는 문제가 있다.Many studies have been conducted to apply active demethylation in the embryonic division process using biochemical reactions using enzymes, but there are problems with low reproducibility and DNA damage.
따라서 줄기 세포의 분화를 보다 정밀하게 제어하는 기술의 개발을 통해 줄기 세포 치료의 효율을 극대화 하는 세포치료제의 개발이 필요하다.Therefore, it is necessary to develop cell therapy products that maximize the efficiency of stem cell treatment through the development of technology to more precisely control the differentiation of stem cells.
본 발명은 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.The purpose of the present invention is to provide a method for controlling demethylation of stem cell DNA.
본 발명에 따른 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법은 (a) 기준 줄기 세포와 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포를 준비하는 단계; (b) 상기 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포 각각에 테라헤르츠파를 조사하는 단계; (c) 상기 기준 줄기 세포의 DNA의 메틸화 레벨에 대한 상기 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포의 DNA의 제1 메틸화 레벨 내지 제N 메틸화 레벨을 각각 검출하는 단계; 및 (d) 상기 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포 중 제M 메틸화 레벨을 가지는 제M 샘플 줄기 세포에 조사된 테라헤르츠파의 제M 조사 시간, 제M 조사 빈도 및 제M 출력으로 제M 주파수 대역의 테라헤르츠파를 하나 이상의 대상 줄기 세포에 조사하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다(M, N은 자연수, 1≤M≤N).The method for controlling demethylation of stem cell DNA according to the present invention includes the steps of (a) preparing reference stem cells and first to Nth sample stem cells; (b) irradiating terahertz waves to each of the first to N-th sample stem cells; (c) detecting the first to Nth methylation levels of the DNA of the first to Nth sample stem cells with respect to the methylation level of the DNA of the reference stem cell, respectively; and (d) the M irradiation time, the M irradiation frequency, and the M output of the terahertz wave irradiated to the M sample stem cells having the M methylation level among the first to N sample stem cells. It is characterized by comprising the step of irradiating terahertz waves in the M frequency band to one or more target stem cells (M, N are natural numbers, 1≤M≤N).
상기 (b) 단계는 상기 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포에 각각 제1 조사 시간 내지 제N 조사 시간, 제1 조사 빈도 내지 제N 조사 빈도 및 제1 출력 내지 제N 출력으로 제1 주파수 대역 내지 제N 주파수 대역의 테라헤르츠파를 조사하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.The step (b) is performed by applying a first irradiation time to the N-th irradiation time, a first irradiation frequency to a N-th irradiation frequency, and a first to N-th output to the first to N-th sample stem cells, respectively. It is preferable to include the step of irradiating terahertz waves in the frequency band to the Nth frequency band.
상기 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포는 각각 중간엽 줄기 세포를 포함할 수 있다.The first to N sample stem cells may each include mesenchymal stem cells.
상기 하나 이상의 대상 줄기 세포는 각각 중간엽 줄기 세포를 포함할 수 있다.The one or more target stem cells may each include mesenchymal stem cells.
본 발명에 따른 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법에는 다음과 같은 장점이 있다.The method for controlling demethylation of stem cell DNA according to the present invention has the following advantages.
(1) 본 발명에 따른 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법은 DNA 및 세포의 손상없이 능동적 탈메틸화를 유도할 수 있다는 장점이 있다. 즉, 줄기 세포에 테라헤르츠파를 조사하더라도 AP 사이트(site)가 거의 증가하지 않아 줄기 세포의 DNA에 손상이 발생하지 않아 줄기 세포의 DNA의 손상없이 능동적 탈메틸화를 유도할 수 있다.(1) The method for controlling demethylation of stem cell DNA according to the present invention has the advantage of being able to induce active demethylation without damaging DNA and cells. In other words, even if terahertz waves are irradiated to stem cells, the AP site does not increase at all, so no damage occurs to the DNA of the stem cell, and active demethylation can be induced without damaging the DNA of the stem cell.
(2) 본 발명에 따른 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법은 조사되는 테라헤르츠파의 파라미터에 따라 원하는 메틸화 레벨을 가지는 줄기 세포를 얻을 수 있으므로 재현성이 높다는 장점이 있다.(2) The method for controlling demethylation of stem cell DNA according to the present invention has the advantage of high reproducibility because stem cells with a desired methylation level can be obtained depending on the parameters of the terahertz wave being irradiated.
(3) 줄기 세포 DNA의 메틸화 레벨에 따라, 유전자의 발현량이 변화하므로, 줄기 세포의 분화를 원하는 방향으로 제어할 수 있다는 장점이 있다.(3) Since the expression level of genes changes depending on the methylation level of stem cell DNA, there is an advantage that differentiation of stem cells can be controlled in a desired direction.
도 1은 본 발명에 따른 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법을 도시한 흐름도.
도 2는 본 발명에 따른 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법의 (b) 단계를 도시한 개략도.
도 3은 본 발명에 따른 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법에서 샘플 줄기 세포에 조사되는 테라헤르츠파의 출력에 따른 메틸화 레벨을 도시한 도면.
도 4는 본 발명에 따른 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법에서 기준 줄기 세포와 샘플 줄기 세포의 메틸화 레벨을 도시한 도면.
도 5는 테라헤르츠파가 조사되지 않은 기준 줄기 세포를 기준으로 본 발명에 따른 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법에 따라 테라헤르츠파가 조사된 샘플 줄기 세포의 유전자 발현을 표시한 그래프이다.1 is a flow chart showing a method for controlling demethylation of stem cell DNA according to the present invention.
Figure 2 is a schematic diagram showing step (b) of the method for controlling demethylation of stem cell DNA according to the present invention.
Figure 3 is a diagram showing the methylation level according to the output of terahertz waves irradiated to sample stem cells in the method for controlling demethylation of stem cell DNA according to the present invention.
Figure 4 is a diagram showing the methylation levels of reference stem cells and sample stem cells in the method for controlling demethylation of stem cell DNA according to the present invention.
Figure 5 is a graph showing gene expression of sample stem cells irradiated with terahertz waves according to the method for controlling demethylation of stem cell DNA according to the present invention, based on reference stem cells not irradiated with terahertz waves.
이하에서는, 첨부된 도면을 참조하여, 본 발명에 따른 에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, with reference to the attached drawings, according to the present invention will be described in detail.
먼저, 본 발명에 따른 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법은 테라헤르츠파 조사 장치, 메틸화 레벨 검출 장치 등에서 수행된다.First, the method for controlling demethylation of stem cell DNA according to the present invention is performed using a terahertz wave irradiation device, a methylation level detection device, etc.
도 1은 본 발명에 따른 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법을 도시한 흐름도이다.Figure 1 is a flowchart showing a method for controlling demethylation of stem cell DNA according to the present invention.
도 1을 참조하면, 기준 줄기 세포와 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포를 준비한다(S100)(N은 1 이상의 자연수). 기준 줄기 세포와 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포는 실질적으로 동일한 줄기 세포이다. 기준 줄기 세포는 메틸화 정도(또는 메틸화 레벨)의 기준이 줄기 세포이다. 따라서, 기준 줄기 세포는 테라헤라츠파에 노출되지 않는다. 반면에, 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포는 테라헤라츠파에 대한 노출에 의해 변화하는 메틸화 정도를 검출하기 위한 줄기 세포이다.Referring to Figure 1, reference stem cells and first to N sample stem cells are prepared (S100) (N is a natural number of 1 or more). The reference stem cell and the first sample stem cell to the Nth sample stem cell are substantially the same stem cells. A reference stem cell is a stem cell that has a standard methylation degree (or methylation level). Therefore, the reference stem cells are not exposed to terahertz waves. On the other hand, the first to N sample stem cells are stem cells for detecting the degree of methylation that changes due to exposure to terahertz waves.
여기서, 기준 줄기 세포, 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포는 각각 중간엽 줄기 세포인 것이 바람직하다.Here, it is preferable that the reference stem cell and the first to N sample stem cells are mesenchymal stem cells.
다음에는, 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포 각각에 테라헤르츠파를 조사한다(S200).Next, terahertz waves are irradiated to each of the first to N sample stem cells (S200).
S200 단계에 대해 도 2를 참조하여 상세히 설명한다.Step S200 will be described in detail with reference to FIG. 2.
도 2는 본 발명에 따른 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법의 (b) 단계를 도시한 개략도이다.Figure 2 is a schematic diagram showing step (b) of the method for controlling demethylation of stem cell DNA according to the present invention.
도 2를 참조하면, 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포에 각각 제1 조사 시간 내지 제N 조사 시간, 제1 조사 빈도 내지 제N 조사 빈도 및 제1 출력 내지 제N 출력으로 제1 주파수 대역 내지 제N 주파수 대역의 테라헤르츠파를 조사한다.Referring to FIG. 2, a first frequency is applied to the first to Nth sample stem cells, respectively, from the first irradiation time to the Nth irradiation time, from the first irradiation frequency to the Nth irradiation frequency, and from the first output to the Nth output, respectively. Terahertz waves in the band to the Nth frequency band are investigated.
구체적으로는, 제1 샘플 줄기 세포에는 제1 파라미터(제1 조사 시간, 제1 조사 빈도, 제1 출력 및 제1 주파수 대역)의 테라헤르츠파를 조사하고, 제2 샘플 줄기 세포에는 제2 파라미터(제2 조사 시간, 제2 조사 빈도, 제2 출력 및 제2 주파수 대역)의 테라헤르츠파를 조사한다. 마찬가지로, 제N 샘플 줄기 세포에는 제N 파라미터(제N 조사 시간, 제N 조사 빈도, 제N 출력 및 제N 주파수 대역)의 테라헤르츠파를 조사한다.Specifically, the first sample stem cells are irradiated with terahertz waves of first parameters (first irradiation time, first irradiation frequency, first output, and first frequency band), and the second sample stem cells are irradiated with second parameters. Terahertz waves of (second irradiation time, second irradiation frequency, second output, and second frequency band) are irradiated. Similarly, the N-th sample stem cells are irradiated with terahertz waves with the N-th parameters (N-th irradiation time, N-th irradiation frequency, N-th power, and N-th frequency band).
즉, 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포 중 어느 하나를 제M 샘플 줄기 세포라 하면(M은 1≤M≤N을 만족하는 자연수), 제M 샘플 줄기 세포에 제M 조사 시간 및 제M 조사 빈도로 제M 출력의 제M 주파수 대역의 테라헤르츠파를 조사한다.That is, if any one of the first sample stem cell to the Nth sample stem cell is called the M sample stem cell (M is a natural number satisfying 1≤M≤N), the M irradiation time and the M Terahertz waves in the M frequency band of the M output are irradiated at the irradiation frequency.
여기서, 테라헤르츠파의 조사 시간, 조사 빈도, 출력 및 주파수 대역은 필요에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 특정 값에 한정되지 않는다.Here, the irradiation time, irradiation frequency, output, and frequency band of the terahertz wave can be appropriately selected as needed and are not limited to specific values.
다음에는, 기준 줄기 세포의 DNA의 메틸화 레벨에 대한 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포의 DNA의 제1 메틸화 레벨 내지 제N 메틸화 레벨을 각각 검출한다(S300).Next, the first to Nth methylation levels of the DNA of the first to Nth sample stem cells are detected relative to the methylation levels of the DNA of the reference stem cell (S300).
이하에서는, S300 단계에 대하여 상세히 설명한다.Below, step S300 will be described in detail.
줄기 세포가 테라헤르츠파에 노출되면, 줄기 세포의 DNA의 메틸화 레벨에 변화가 발생한다. 구체적으로는, 테라헤르츠파의 조사 시간, 조사 빈도, 출력 및 주파수 대역에 따라 줄기 세포의 DNA의 메틸화 레벨이 각기 다르게 변화한다.When stem cells are exposed to terahertz waves, changes occur in the methylation level of the stem cell's DNA. Specifically, the methylation level of DNA in stem cells changes differently depending on the terahertz wave irradiation time, irradiation frequency, output, and frequency band.
도 3은 본 발명에 따른 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법에서 샘플 줄기 세포에 조사되는 테라헤르츠파의 출력에 따른 메틸화 레벨을 도시한 도면이다.Figure 3 is a diagram showing the methylation level according to the output of terahertz waves irradiated to sample stem cells in the method for controlling demethylation of stem cell DNA according to the present invention.
도 3을 참조하면, 줄기 세포에 조사되는 테라헤르츠파의 출력에 따라 각 줄기 세포의 메틸화 레벨에 변화가 발생한다. 구체적으로는, 조사되는 테라헤르츠파의 출력이 클수록 메틸화 레벨이 낮다(즉, 탈메틸화가 많이 발생한다). 예를 들어, 도 3에 도시된 바와 같이, 테라헤르츠파가 조사되지 않은 기준 줄기 세포의 메틸화 레벨을 1.0이라 하면, 서로 다른 출력의 테라헤르츠파에 노출된 4개의 샘플 줄기 세포는 조사된 테라헤르츠파의 출력이 증가할수록 메틸화 레벨이 감소한다.Referring to Figure 3, changes occur in the methylation level of each stem cell depending on the output of the terahertz wave irradiated to the stem cell. Specifically, the greater the output of the irradiated terahertz wave, the lower the methylation level (i.e., the more demethylation occurs). For example, as shown in Figure 3, if the methylation level of the reference stem cell that was not irradiated with terahertz waves is 1.0, the four sample stem cells exposed to terahertz waves of different outputs were irradiated with terahertz waves. As the power of the wave increases, the methylation level decreases.
마찬가지로, 조사된 테라헤르츠파의 조사 시간, 조사 빈도 및 주파수 대역에 따라 샘플 줄기 세포는 각각의 메틸화 레벨을 가진다.Likewise, sample stem cells have respective methylation levels depending on the irradiation time, irradiation frequency, and frequency band of the irradiated terahertz waves.
S300 단계에서는, 기준 줄기 세포의 DNA의 메틸화 레벨을 기준으로 조사된 테라헤르츠파의 조사 시간, 조사 빈도, 출력 및 주파수 대역의 차이에 따른 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포의 DNA의 제1 메틸화 레벨 내지 제N 메틸화 레벨을 각각 검출한다.In step S300, the DNA of the first to N sample stem cells is irradiated according to the difference in the irradiation time, irradiation frequency, output, and frequency band of the terahertz wave irradiated based on the methylation level of the DNA of the reference stem cell. The 1st methylation level to the Nth methylation level are respectively detected.
도 4는 본 발명에 따른 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법에서 기준 줄기 세포와 샘플 줄기 세포의 메틸화 레벨을 도시한 도면이다.Figure 4 is a diagram showing the methylation levels of reference stem cells and sample stem cells in the method for controlling demethylation of stem cell DNA according to the present invention.
도 4에 도시된 바와 같이, 테라헤르츠파에 노출된 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포의 DNA는 조사된 테라헤르츠파의 파라미터에 따라 각각 제1 메틸화 레벨 내지 제N 메틸화 레벨을 가진다.As shown in FIG. 4, the DNA of the first to Nth sample stem cells exposed to terahertz waves has a first to Nth methylation level, respectively, depending on the parameters of the irradiated terahertz waves.
다음에는, 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포 중 제M 메틸화 레벨을 가지는 제M 샘플 줄기 세포에 조사된 테라헤르츠파의 제M 조사 시간, 제M 조사 빈도 및 제M 출력으로 제M 주파수 대역의 테라헤르츠파를 하나 이상의 대상 줄기 세포에 조사한다(S400). 여기서, 하나 이상의 대상 줄기 세포는 각각 중간엽 줄기 세포를 포함할 수 있다.Next, the M irradiation time, the M irradiation frequency, and the M output of the terahertz wave irradiated to the M sample stem cells having the M methylation level among the first to N sample stem cells are the M frequency. Terahertz waves in the band are irradiated to one or more target stem cells (S400). Here, the one or more target stem cells may each include mesenchymal stem cells.
다음에는, 하나 이상의 대상 줄기 세포의 DNA의 유전자 발현량에 따라 하나 이상의 대상 줄기 세포를 분화시킨다(S500).Next, one or more target stem cells are differentiated according to the gene expression level of the DNA of the one or more target stem cells (S500).
줄기 세포는 그 DNA의 탈메틸화 레벨에 따라 각 유전자의 발현량이 상이하다. 또한, 줄기 세포는 각 유전자의 발현량에 따라 다르게 분화한다. 소정의 탈메틸화 레벨을 가지는 샘플 줄기 세포가 뼈 조직으로 분화하면, 즉, 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포 중 어느 하나인 제M 샘플 줄기 세포가 제M 메틸화 레벨을 가지며, 제M 샘플 줄기 세포의 DNA의 유전자 중 특정 유전자의 발현량에 따라 제M 샘플 줄기 세포가 뼈 조직으로 분화한다면, 하나 이상의 대상 줄기 세포에 제M 샘플 줄기 세포에 조사된 테라헤르츠파의 파라미터, 즉 제M 조사 시간, 제M 조사 빈도 및 제M 출력으로 제M 주파수 대역의 테라헤르츠파를 조사하면, 뼈 조직으로 분화하는 줄기 세포를 제조할 수 있다.Stem cells have different expression levels of each gene depending on the demethylation level of their DNA. Additionally, stem cells differentiate differently depending on the expression level of each gene. When the sample stem cell with a predetermined demethylation level differentiates into bone tissue, that is, the M sample stem cell, which is any one of the first sample stem cell to the N sample stem cell, has the M methylation level, and the M sample If the first M sample stem cells differentiate into bone tissue according to the expression level of a specific gene among the DNA genes of the stem cells, the parameters of the terahertz wave irradiated to the first M sample stem cells to one or more target stem cells, that is, the third M irradiation By irradiating terahertz waves in the M frequency band with time, M irradiation frequency, and M output, stem cells that differentiate into bone tissue can be produced.
마찬가지로, 테라헤르츠파의 파라미터에 따라 연골 조직, 근육 조직, 골수 조직 등으로 분화하는 대상 줄기 세포를 제조할 수 있다.Likewise, target stem cells that differentiate into cartilage tissue, muscle tissue, bone marrow tissue, etc. can be produced depending on the parameters of the terahertz wave.
이하에서는, 샘플 줄기 세포의 DNA의 유전자의 발현량에 대해 상세히 설명한다.Below, the expression levels of DNA genes in sample stem cells will be described in detail.
도 5는 테라헤르츠파가 조사되지 않은 기준 줄기 세포를 기준으로 본 발명에 따른 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법에 따라 테라헤르츠파가 조사된 샘플 줄기 세포의 유전자 발현을 표시한 그래프이다.Figure 5 is a graph showing gene expression of sample stem cells irradiated with terahertz waves according to the method for controlling demethylation of stem cell DNA according to the present invention, based on reference stem cells not irradiated with terahertz waves.
먼저, 도 5에서 "Fold Change"는 테라헤르츠파가 조사되지 않은 기준 줄기 세포를 기준으로 테라헤르츠파가 조사된 샘플 줄기 세포의 유전자 발현량을 의미한다. 예를 들어, 그래프의 Fold Change 값이 5이면 해당 유전자의 발현량이 기준 줄기 세포에 비해 5배인 것을 의미한다.First, in FIG. 5, “Fold Change” refers to the gene expression level of sample stem cells irradiated with terahertz waves based on reference stem cells not irradiated with terahertz waves. For example, if the Fold Change value in the graph is 5, it means that the expression level of the corresponding gene is 5 times that of the reference stem cell.
도 5에서, ITGB8(Integrin beta 8)은 integrin beta family member의 하나로써, integrin 복합체는 세포-세포 및 세포-세포 외 matrix 상호작용을 매개하며, 인간 기도 상피 세포 증식에 있어 중요한 역할을 하는 유전자이다.In Figure 5, ITGB8 (Integrin beta 8) is one of the integrin beta family members. The integrin complex mediates cell-cell and cell-extracellular matrix interactions, and is a gene that plays an important role in human airway epithelial cell proliferation. .
TNFRSF11B(Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11b)는 TNFRSF11B는 osteoprotegerin이라는 단백질을 만드는데 있어 방향을 제시하는 유전자이다. osteoprotegerin는 파골 세포라 불리는 특수 세포의 조절에 관여하며, 골이 재생되는 동안 뼈 조직을 분해한다.TNFRSF11B (Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11b) is a gene that provides direction for producing a protein called osteoprotegerin. Osteoprotegerin is involved in the regulation of special cells called osteoclasts, which break down bone tissue during bone regeneration.
EDN1(Endothelin 1)은 주로 내피세포에 의해 분비되는 혈관 수축제 및 혈관 세포의 섬유증을 유발하고 활성 산소종의 생성을 자극. Mesenchymal stem cell의 생존, 신생혈관조절 그리고 MSC의 이동에 연관된 유전자이다.EDN1 (Endothelin 1) is a vasoconstrictor mainly secreted by endothelial cells, causes fibrosis of vascular cells, and stimulates the production of reactive oxygen species. It is a gene involved in mesenchymal stem cell survival, angiogenesis regulation, and MSC migration.
도 5를 참조하면, ITGB8, TNFRSF11B 및 EDN1의 발현량은 음의 값이다. 예를 들어, ITGB8은 약 -6.5이다. 이는 테라헤르츠파가 조사된 샘플 줄기 세포의 ITGB8 유전자의 발현량이 테라헤르츠파가 조사되지 않은 기준 줄기 세포의 ITGB8 유전자의 발현량 대비 6.5배 감소한 것을 의미한다. 마찬가지로, TNFRSF11B 및 EDN1 유전자의 발현량이 테라헤르츠파가 조사되지 않은 기준 줄기 세포의 TNFRSF11B 및 EDN1 유전자의 발현량 대비 해당 배수만큼 감소한 것을 의미한다.Referring to Figure 5, the expression levels of ITGB8, TNFRSF11B, and EDN1 are negative values. For example, ITGB8 is approximately -6.5. This means that the expression level of the ITGB8 gene in the sample stem cells irradiated with terahertz waves decreased by 6.5 times compared to the expression level of the ITGB8 gene in the reference stem cells that were not irradiated with terahertz waves. Likewise, it means that the expression level of the TNFRSF11B and EDN1 genes was reduced by the corresponding fold compared to the expression level of the TNFRSF11B and EDN1 genes in the reference stem cells that were not irradiated with terahertz waves.
도 5에서, JUNB(AP-1)는 사이토카인, 성장인자, 스트레스 박테리아 및 바이러스 감염을 포함한 다양한 자극에 반응하여 유전자 발현을 조절하는 전사 인자이다. 또한, JUNB는 분화, 증식 및 세포 사멸을 포함하여 여러 세포 과정을 제어하며Osteocalcin을 포함한 조골세포 관련 유전자 조절에 관여한다.5, JUNB (AP-1) is a transcription factor that regulates gene expression in response to various stimuli, including cytokines, growth factors, stress bacteria, and viral infections. Additionally, JUNB controls several cellular processes, including differentiation, proliferation, and apoptosis, and is involved in the regulation of osteoblast-related genes, including osteocalcin.
NFATC2(Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 2)는 면역 반응 동안 유전자 전사를 유도하는데 중요한 역할하는 유전자이다. 특히 NFATC2는 T cell에서 사이토카인 유전자의 발현을 유도한다.NFATC2 (Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 2) is a gene that plays an important role in inducing gene transcription during immune responses. In particular, NFATC2 induces the expression of cytokine genes in T cells.
ITPR1(Inistol1,4,5-Trisphopsatahe Receptor Type1)은 소포체(Endoplasmic reticulum)라 불리는 세포구조로부터 주변 세포액(세포질)으로 칼슘이온을 방출, 세포 내 칼슘 이온의 농도를 적절히 조절함으로써 다양한 조직 및 기관의 발달과 기능에 중요한 역할을 하는 유전자이다.ITPR1 (Inistol1,4,5-Trisphopsatahe Receptor Type 1) releases calcium ions from a cellular structure called the endoplasmic reticulum into the surrounding cytoplasm and appropriately regulates the concentration of calcium ions within the cell, leading to the development of various tissues and organs. It is a gene that plays an important role in function.
ITGA2(Integrin alpha-)는 혈소판 및 다른 세포의 접착, 콜라겐의 조절 및 콜라게네이즈(collagenase) 유전자 발현 및 새로 합성된 세포 외 매트릭스를 조절하는 콜라겐 수용체로 세포 접착 및 연결에 관련된 유전자이다.ITGA2 (Integrin alpha-) is a collagen receptor that regulates the adhesion of platelets and other cells, regulation of collagen and collagenase gene expression, and newly synthesized extracellular matrix. It is a gene involved in cell adhesion and connection.
CXCL8(Interleukin-8)은 neutrophil chemotactic factor의 주요 인자로 알려져 있으며, 호중구(neutrophils) 뿐만 아니라 다른 과립구(granulocytes)에서 특정 화학 물질로 이동하는 성질을 유발하여 감염 부위로 이동 및 식균 작용(phagocytosis)을 유도하는 유전자이다. CXCL8은 또한 혈관 신생의 유발 인자이다. MSC로부터 유래한 CXCL8은 PI3K/AKT pathway를 통해 급성 골수성 백혈 세포의 생존과 증식을 유도한다.CXCL8 (Interleukin-8) is known to be a major neutrophil chemotactic factor, and causes neutrophils as well as other granulocytes to move to specific chemical substances, resulting in migration to the site of infection and phagocytosis. It is a gene that induces CXCL8 is also a trigger of angiogenesis. CXCL8 derived from MSC induces survival and proliferation of acute myeloid leukemia cells through the PI3K/AKT pathway.
DDIT4(DNA-damage-inducible transcript4)는 성장, 증식 및 자가 포식 (autophagy)과 같은 다양한 세포 기능을 조절하는 serine/threonine kinase의 음성 조전 인자로 작용한다. 또한 DDIT4는 DNA 손상과 에너지 스트레스에 의해 반응하여 발현되며, HIF-1a, mTOR의 신호 전달과 성체줄기세포의 운명(cell fate) 사이의 매개체 역할을 한다.DDIT4 (DNA-damage-inducible transcript4) acts as a negative regulator of serine/threonine kinase, which regulates various cellular functions such as growth, proliferation, and autophagy. Additionally, DDIT4 is expressed in response to DNA damage and energy stress, and serves as a mediator between HIF-1a and mTOR signaling and adult stem cell fate (cell fate).
IL1A(Interleukin 1 alpha)는 염증, 발열 및 패혈증 촉진에 관련된 유전자이다. IL1A는 주로 호중구(neutrophils), 상피세포 및 내피 세포뿐만 아니라 활성화된 대식세포(macrophage)에 의해 생성되며, 대사, 생리, 조혈 활동을 하며 면역반응 조절의 중심적인 역할을 한다.Interleukin 1 alpha (IL1A) is a gene involved in promoting inflammation, fever, and sepsis. IL1A is mainly produced by neutrophils, epithelial cells, and endothelial cells, as well as activated macrophages, and has metabolic, physiological, and hematopoietic activities and plays a central role in regulating immune responses.
BMP2(Bone morphogenetic protein2)는 TGF-beta signaling에 연관되어 뼈와 연골 발달에 관여하는 유전자이다. 또한, BMP2는 심장 세포 분화 및 상피에서 중간엽으로의 전이에 관여한다.BMP2 (Bone morphogenetic protein2) is a gene involved in bone and cartilage development through TGF-beta signaling. Additionally, BMP2 is involved in cardiac cell differentiation and epithelial-to-mesenchymal transition.
BMP6(Bone morphogenetic protein6)은 TGF-beta family의 구성원으로 세포증식, 분화, 매트릭스의 합성 및 apoptosis(세포사멸)의 주요 조절 인자로 기능하는 유전자이다. BMP6은 뼈와 연골의 발달, 성장 및 형성을 유발한다.BMP6 (Bone morphogenetic protein 6) is a member of the TGF-beta family and is a gene that functions as a major regulator of cell proliferation, differentiation, matrix synthesis, and apoptosis. BMP6 triggers the development, growth, and formation of bone and cartilage.
PTGS2(Prostaglandin-endoperoxide synthase2)는 Cox2라고도 알려져 있으며 염증의 강력한 매개자로서 혈관신생(angiogenesis) 및 종양 생성을 포함한 여러 병리 생리학적 과정을 유도하는 효소이다. 또한, PTGS2는 조골세포(Osteoblast)에서 저산소증(hypoxia)으로 인한 TNF-a 발현의 유도에도 관여한다고 알려져 있다Prostaglandin-endoperoxide synthase2 (PTGS2), also known as Cox2, is an enzyme that is a powerful mediator of inflammation and induces several pathophysiological processes, including angiogenesis and tumorigenesis. In addition, PTGS2 is known to be involved in the induction of TNF-a expression due to hypoxia in osteoblasts.
도 5를 참조하면, JUNB, NFATC2, ITPR1, ITGA2, CXCL8, DDIT4, IL1A, BMP2, BMP6 및 PTGS2의 발현량은 양의 값이다. 예를 들어, JUNB, CXCL8, PTGS2는 각각 약 5, 8, 41이다. Referring to Figure 5, the expression levels of JUNB, NFATC2, ITPR1, ITGA2, CXCL8, DDIT4, IL1A, BMP2, BMP6, and PTGS2 are positive values. For example, JUNB, CXCL8, and PTGS2 are approximately 5, 8, and 41, respectively.
이는 테라헤르츠파가 조사된 샘플 줄기 세포의 JUNB, CXCL8, PTGS2 유전자의 발현량이 테라헤르츠파가 조사되지 않은 기준 줄기 세포의 JUNB, CXCL8, PTGS2 유전자 대비 각각 5, 8, 41배 증가한 것을 의미한다. 마찬가지로, NFATC2, ITPR1, ITGA2, DDIT4, IL1A, BMP2 및 BMP6 유전자의 발현량이 테라헤르츠파가 조사되지 않은 기준 줄기 세포의 NFATC2, ITPR1, ITGA2, DDIT4, IL1A, BMP2 및 BMP6 유전자의 발현량 대비 해당 배수만큼 증가한 것을 의미한다.This means that the expression levels of the JUNB, CXCL8, and PTGS2 genes in the sample stem cells irradiated with terahertz waves increased by 5, 8, and 41 times, respectively, compared to the JUNB, CXCL8, and PTGS2 genes in the reference stem cells that were not irradiated with terahertz waves. Likewise, the expression levels of the NFATC2, ITPR1, ITGA2, DDIT4, IL1A, BMP2, and BMP6 genes were the corresponding folds compared to the expression levels of the NFATC2, ITPR1, ITGA2, DDIT4, IL1A, BMP2, and BMP6 genes in reference stem cells that were not irradiated with terahertz waves. It means that it has increased by as much as
이와 같이, 줄기 세포 DNA의 메틸화 레벨에 따라, 유전자의 발현량이 변화한다. 특히, 테라헤르츠파의 조사 시간, 조사 빈도 및 출력 등에 따라 줄기 세포 DNA의 메틸화 레벨을 제어할 수 있으며, 이에 따라, 유전자의 발현량도 제어할 수 있다. 유전자의 발현량은 줄기 세포의 분화를 결정하므로, 유전자의 발현량을 제어하여 줄기 세포의 분화를 원하는 방향으로 유도할 수 있다.In this way, the expression level of genes changes depending on the methylation level of stem cell DNA. In particular, the methylation level of stem cell DNA can be controlled according to the irradiation time, irradiation frequency, and output of terahertz waves, and accordingly, the expression level of genes can also be controlled. Since the expression level of a gene determines the differentiation of stem cells, the differentiation of stem cells can be induced in a desired direction by controlling the expression level of the gene.
Claims (4)
(b) 상기 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포 각각에 테라헤르츠파를 조사하는 단계;
(c) 상기 기준 줄기 세포의 DNA의 메틸화 레벨에 대한 상기 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포의 DNA의 제1 메틸화 레벨 내지 제N 메틸화 레벨을 각각 검출하는 단계; 및
(d) 상기 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포 중 제M 메틸화 레벨을 가지는 제M 샘플 줄기 세포에 조사된 테라헤르츠파의 제M 조사 시간, 제M 조사 빈도 및 제M 출력으로 제M 주파수 대역의 테라헤르츠파를 하나 이상의 대상 줄기 세포에 조사하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법(M, N은 자연수, 1≤M≤N).(a) preparing reference stem cells and first to N-th sample stem cells;
(b) irradiating terahertz waves to each of the first to N-th sample stem cells;
(c) detecting the first to Nth methylation levels of the DNA of the first to Nth sample stem cells with respect to the methylation level of the DNA of the reference stem cell, respectively; and
(d) The M irradiation time, the M irradiation frequency, and the M output of the terahertz wave irradiated to the M sample stem cells having the M methylation level among the first to N sample stem cells. A step of irradiating terahertz waves in the frequency band to one or more target stem cells.
A method for controlling demethylation of stem cell DNA, comprising: (M, N are natural numbers, 1≤M≤N).
상기 (b) 단계는 상기 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포에 각각 제1 조사 시간 내지 제N 조사 시간, 제1 조사 빈도 내지 제N 조사 빈도 및 제1 출력 내지 제N 출력으로 제1 주파수 대역 내지 제N 주파수 대역의 테라헤르츠파를 조사하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법.According to paragraph 1,
The step (b) is performed by applying a first irradiation time to the N-th irradiation time, a first irradiation frequency to a N-th irradiation frequency, and a first to N-th output to the first to N-th sample stem cells, respectively. Step of irradiating terahertz waves in the frequency band to the Nth frequency band
A method for controlling demethylation of stem cell DNA, comprising:
상기 제1 샘플 줄기 세포 내지 제N 샘플 줄기 세포는 각각 중간엽 줄기 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법.According to paragraph 1,
A method for controlling demethylation of stem cell DNA, wherein the first to N sample stem cells each include mesenchymal stem cells.
상기 하나 이상의 대상 줄기 세포는 각각 중간엽 줄기 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기 세포 DNA의 탈메틸화 제어 방법.According to paragraph 1,
A method for controlling demethylation of stem cell DNA, wherein the one or more target stem cells each include mesenchymal stem cells.
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