KR20220034504A - 셀루메티닙을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 셀루메티닙을 유효성분으로 포함하는 Rip3의 발현증가 또는 활성증가에 의해 진행되는 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에서는 RIP3가 퇴행성 관절염의 발병과 진행에 중요한 인자로 작용할 수 있음을 최초로 규명하고, RIP3의 활성 억제제로 셀루메티닙을 새로이 동정하였다. 셀루메티닙은 이미 신경섬유종증 1형 종양 치료제로 FDA 승인을 받은 안전성이 입증된 물질로, 퇴행성 관절염 치료제로 사용하는 경우 신속한 상용화가 가능할 것이다.
Description
본 발명은 셀루메티닙을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 셀루메티닙을 유효성분으로 포함하는 Rip3의 발현증가 또는 활성증가에 의해 진행되는 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
퇴행성 관절염 (osteoarthritis, OA)은 주로 연골 형성 (cartilage ECM synthesis) 억제 및 연골조직 파괴(cartilage destruction) 촉진으로 오는 퇴행성관절 질환이다. 노화와 관련된 많은 병인학적 위험 인자들과 병리생리학적 과정들이 퇴행성 관절염의 진행에 기여한다. 관절 불안정성과 손상을 포함한 기계적 스트레스 및 퇴행성 관절염에 걸리기 쉽게 하는 노화 관련 인자들이 잠재적인 퇴행성 관절염 야기 기작들이다. 이러한 인자들은 다양한 이화 및 동화 인자들을 생산하는 독특한 세포 타입인 연골세포 내 생화학적 경로들의 활성화로 인해 Mmp(Matrix metalloproteinase)에 의한 ECM (extracellular matrix)의 분해, 그리고 연골세포의 탈분화(dedifferentiation) 및 아팝토시스 (apoptosis)를 통한 ECM 합성의 중단을 초래한다 (pelletier JP et al, Arthritis Rheum, 44:1237-47, 2001). 특히, 관절을 이루고 있는 연골 조직은 한번 손상되게 되면 정상적으로 생체 내에서 재생이 되지 않는다. 이러한 관절의 연골조직이 손상될 경우 심한 통증과 함께 일상 활동에 제한을 받게 되며, 만성화될 경우 치명적인 퇴행성 관절염을 유발하게 되어 정상적인 생활이나 직업적인 활동을 방해하게 된다.
이처럼, 관절 연골의 파괴를 특징으로 하는 퇴행성 관절염은 기계적 스트레스로 인한 동화 및 이화 인자 불균형에 의해 발생하고, 이러한 인자들이 연골 세포의 생화학적 경로를 변경하고 세포 외 기질 (ECM)을 생성하는 능력을 감소시키며 이화 작용 기질 분해 효소를 통해 ECM 분자를 분해하여 염증 반응을 유발하게 된다. 많은 자료에서 연골 세포의 사멸(chondrocyte death)이 퇴행성 관절염 병인과 관련되어 있음을 시사하고 있다 (Ryu JH, et al. Cell Death Differ 2012;19(3):440-50; Thomas CM, F et al. Osteoarthritis Cartilage 2007;15(1):27-34.) 아폽토시스(apoptosis)는 type II 콜라겐 또는 기타 ECM 구성 요소를 방출하지 않고 탈분화된 연골세포(dedifferentiated chondrocyte)를 제거하는 것으로 고려되는 반면, 네크롭토시스(necroptosis)는 세포막을 파열시킴으로써 주변 조직에 해로운 영향을 미치는 비교적 최근 알려진 병태 생리학적 세포 사멸 형태이다. 네크롭토시스 세포는 강력한 염증 반응을 유발하는 손상 관련 분자 패턴을 방출하고, 아폽토시스에 비해 더 면역원성이 있으며, 염증 반응과 ECM 분해를 촉진한다.
네크롭토시스는 주로 수용체 상호 작용 단백질 키나제 1 (RIP1), RIP3 및 혼합 계통 키나제 도메인 유사 단백질 (mixed lineage kinase domain-like protein , MLKL)에 의해 매개된다. RIP1-RIP3 복합체의 조립 및 활성화는 두 단백질의 키나제 활성에 따라 달라진다. RIP3 활성화는 MLKL의 인산화를 유도하고 이를 세포막으로 이동시켜 파괴한다. 세포 사멸(cell death), 염증, 종양 형성 및 신진 대사에서 RIP3의 복잡한 역할은 조직 손상 매개체와 질병 진행 및 중증도의 순환 마커와 함께 광범위하게 연구되어 왔다. RIP1 및 RIP3 억제는 신장, 뇌 및 심장 허혈성 재관류 손상; 췌장염; 및 아세트 아미노펜 유도 간염 모델을 포함한 수많은 병리학적 마우스 모델의 결과를 개선하는 것으로 보고되었다. 또한 RIP3는 기질인 MLKL과 독립적으로 그리고 의존적으로 작용할 수 있으며, 이는 RIP3 및 MLKL이 조직 특이적 효과를 발휘할 수 있음을 시사한다.
지금까지 관절염 치료제는 개발되어 있지 않고, 일반적으로 관절염증 완화 목적으로 NSAID (non-steroidal anti-inflammatory drugs) 약물을 사용하고 있다. 하지만, NSAID 계열 약물은 관절 염증만을 일시적으로 완화시키는 효과가 주된 목적이기 때문에 연골 형성 촉진 및 연골조직 파괴 억제를 필요로 하는 비염증성 관절염인 퇴행성 관절염에는 NSAID 계열의 약물 사용은 적합하지 않은 치료 방법이다 (Pritchard MH et al., Annals of the Rheumatic Diseases, 37:493-503, 1978). 이러한 비스테로이드성 항염증 약물(NSAIDs)은 염증성 관절염인 류마티스 관절염 치료제로서 염증 기전을 차단하기 위해서는 적합하나, 오히려 연골 손상을 가속화시키거나 심혈관, 위장관, 신장, 간 등에 부작용을 일으킬 수 있다.
또한, 현재 연골형성을 위해 개발된 자기유래 연골세포 이식술은 환자의 정상부위에서 이미 생성되어 있는 연골과 연골하골 부분을 함께 채취하여, 손상된 연골부위에 적당한 구멍을 파고 이식하여 초자연골을 생성하는 방법으로 일부 환자에게서 성공을 거두었지만, 연골 조직 파괴 부분이 적고 자가이식이 가능한 환자만을 대상으로 시행할 수 있어 보편적인 방법이 될 수 없다 (Peterson L et al, J Bone Joint Surg Am 85-A Suppl:17-24, 2003)
최근에는 RIP3가 MLKL과 무관하게 TLRTRIF-RIP3-IL-1β축을 통해 관절염 발병을 촉진한다고 제안한 바 있고, (Lawlor KE, et al. Nat Commun 2015;6:6282), 또 다른 연구에서는 p55TNFR-IKK2-RIP3 축이 활막 섬유아세포 관절 유발성 및 세포 사멸 반응을 조율한다는 것을 발견한 바 있으나 (Armaka M, et al. Nat Commun 2018;9(1):618), 이는 모두 류마티스 관절염 모델에 기초한 연구로, 연골에서 RIP3의 생리적 및 병리학적 역할은 아직 다루어지지 않았으며 RIP3 매개의 신호조절이 조절이 퇴행성 관절염 발병에 관여하는지 여부에 대한 연구는 전혀 이루어지지 않았다.
한편, 셀루메티닙은 신경섬유종증 1형 신경계 종양 치료제로 FDA 승인받은 항암제로, 셀루메티닙을 관절염 치료에 이용될 수 있다는 연구는 진행된 바 없고, 일부 특허문헌에서 셀루메티닙을 다양한 질환의 치료에 보조 치료제로 함께 사용할 수 있음을 단순 나열하고 있으나, 셀루메티닙의 관절염 치료에 관한 어떠한 기술적 효과도 증명하지 못하고 있다 (US 10478506, US 2017/0349572)
본 발명에서는 RIP3가 퇴행성 관절염 병인에 어떻게 관여하는지에 대한 기본 분자 메커니즘을 인간 퇴행성 관절염 연골 샘플과 내측 반월상 연골 (destabilization of the medial meniscus, DMM) 수술 유도 퇴행성 관절염 마우스 모델을 이용하여 연구하였다. 또한, 본 발명에서는 RIP3 넉아웃 마우스를 사용하여 RIP3가 퇴행성관절염 관여인자들의 신호전달계를 활성화시킴으로써 퇴행성 관절염 진행을 촉진시킴을 추가로 확인하였으며, 연결맵 (connectivity map, CMap) 접근방식으로 신규한 RIP3 저해제를 동정하고, 이들 저해제가 퇴행성 관절염 치료제로 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
Pelletier JP et al, Arthritis Rheum, 44:1237-47, 2001
Ryu JH, et al. Cell Death Differ 2012;19(3):440-50.
Thomas CM, F et al. Osteoarthritis Cartilage 2007;15(1):27-34.
Pritchard MH et al., Annals of the Rheumatic Diseases, 37:493-503, 1978
Peterson L et al, J Bone Joint Surg Am 85-A Suppl:17-24, 2003
Lawlor KE, et al. Nat Commun 2015;6:6282
Armaka M, et al. Nat Commun 2018;9(1):618
본 발명은 퇴행성 관절염 치료를 위한 셀루메티니의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 (I)의 구조를 가지는 셀루메티닙을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다:
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 RIP3의 발현증가 및/또는 활성증가에 의해 진행되는 퇴행성 관절염 치료를 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:
(a) 퇴행성 관절염을 가지는 객체의 손상된 조직으로부터 수득된 샘플로부터 RIP3 발현양 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
(b) 상기 RIP3 발현양 또는 활성이 정상 객체 또는 동일 객체의 비손상 조직 샘플로부터 측정된 RIP3 발현양 또는 활성 정도에 비해 증가된 경우, 셀루메티닙을 퇴행성 관절염 치료 물질로 선정하는 단계.
본 발명은 또한, 하기 화학식 (I)의 구조를 가지는 셀루메티닙을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다:
본 발명에서는 RIP3가 퇴행성 관절염의 발병과 진행에 중요한 인자로 작용할 수 있음을 최초로 규명하고, RIP3의 활성 억제제로 셀루메티닙을 동정하였다. 셀루메티닙은 이미 신경섬유종증 1형 치료제로 FDA 승인을 받은 안전성이 입증된 물질로, 퇴행성 관절염 치료제로 사용하는 경우 신속한 상용화가 가능할 것이다.
도 1은 연골세포에서 MLKL 발현이 검출되지 않음음을 나타낸다. (A) 조직 RIP1, RIP3 및 MLKL 발현 패턴을 보여주는 단백질 아틀라스 데이터 (Protein Atlas에서 수정됨). (B) 다양한 조직 샘플에서 네크롭토시스 조절 인자의 발현 수준. 단백질 추출물은 웨스턴 블롯팅으로 분석함 (상단 패널). 웨스턴 블로팅의 정량화 (하단 패널). (C) 도 2A의 웨스턴 블로팅 결과의 정량화 (n = 3). (D) 연골 세포를 M2 버퍼, Laemmli SDS 버퍼 (L), RIPA 버퍼 (R) 또는 초음파 처리와 함께 RIPA 버퍼 (R+So)에 용해하였다. 용 물은 웨스턴 블로팅으로 분석하였다. Vimentin은 불용성 단백질 검출에 대한 양성 대조군으로 사용되었다 (n = 3). (E) 연골 세포를 MG132, CQ 또는 10mg/mL의 E64d + 10mg/mL 펩스타틴 A로 6 시간 동안 처리하고 세포 용해물을 웨스턴 블로팅으로 분석하였다. NIK 및 LC3II는 각각 프로테아좀 및 리소좀 의존적 분해를 차단한 대조군이다 (n = 3). (F) 도 2B의 웨스턴 블로팅 결과의 정량화 (n = 3). (G) MEF 및 연골 세포를 TSZ (TNF + zVAD + SMAC 모방체)로 지정된 시간 동안 처리하고 세포 용해물을 웨스턴 블롯팅 (n = 3)으로 분석함. (H) MEF 및 연골 세포를 TSZ (TNF + zVAD + SMAC 모방체)로 처리하고 세포 용해물을 웨스턴 블 롯팅으로 분석함 (왼쪽 패널) (n = 3). MEF와 연골 세포를 지정된 시간 동안 TSZ로 처리하고 MTT 분석 또는 위상차 현미경으로 세포 독성을 분석함 (중간). TNF로 유도된 세포 사멸을 LDH 분석법으로 분석함 (오른쪽). 값은 평균 ± SEM으로 표시함. two-tailed t-test을 사용하여 통계 분석을 수행함.
도 2는 연골 세포에서 RIP3의 비-정규적(non-canonical) 역할이 퇴행성 관절염 병인과 관련이 있음을 보여준다. (A) 연골 세포에서 네크롭토시스 발현 수준을 나타냄. (A) 연골 세포에서 괴사 조절제의 발현 수준. 야생형 및 MLKL 녹아웃 MEF, 골수 유래 단핵구 (BMDM), 대식세포, 연골 조직 및 일차 마우스 관절 연골 세포에서 추출한 단백질을 웨스턴 블로팅으로 분석함 (n = 3). (B) MEF 및 연골 세포를 TSZ (TNF + zVAD + SMAC 모방체)로 처리하고 세포 용해물을 웨스턴 블로팅으로 분석함 (n = 3). (C) Alcian blue, Safranin O 및 RIP3, p-MLKL 및 MLKL 면역 염색 (n = 5)으로 염색된 비손상 및 손상된 인간 연골. 스케일 바 : 100 μm. (D) qPCR에 의해 측정된 비손상 및 손상된 인간 퇴행성 관절염 연골에서의 RIP3 발현 (n = 5). 값은 평균 ± SEM으로 표시됨. two-tailed t-tests을 사용하여 통계 분석을 수행함. (E) 표시된 MOI에서 Ad-C (대조군) 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포에서 RIP3, p-RIP3, MLKL 및 p-MLKL의 웨스턴 블로팅 분석 (n = 3). (F) 대조군과 비교하여 처리된 세포에서의 RIP3 관련 유전자(표 3에 나열됨)의 GSEA 분석.
도 3은 상승된 RIP3 발현이 연골 세포에서 퇴행성 관절염 병인 관련 유전자 발현 패턴과 상관 관계가 있음을 보여준다. (A) 표시된 각 단백질의 상대적 발현 수준은 도 2C에 나타난 인간 비손상 및 손상된 연골의 면역 조직 화학으로부터 결정되었다(n = 5). (B) 도 2E의 웨스턴 블로팅 결과의 정량화 (n = 3). (C) Ad-Rip3- 및 Ad-C- 감염된 RIP1-/-MEF 및 Flag-RIP3 형질 감염된 MEF에서 네크롭토시스 조절 인자의 웨스턴 블로팅 분석 (n = 3). (D) Ad-C 또는 Ad-Rip3에 감염된 연골 세포에서 RIP3 및 p-RIP3의 웨스턴 블로팅 (왼쪽) 및 유전자 발현 (오른쪽) 분석. Ad-Rip3 및 Ad-C-감염된 연골 세포 사이에서 차등 발현된 (differentially expressed) 유전자 (DEG)는 폴드 변화(Fold change, FC)> 3을 사용하여 선택되었음. 상위 10 개의 상향 조정된 DEG (Up-DEG) 및 상위 10 개의 퇴행성 관절염 관련 Up-DEG는 RIP3 과발현으로 나열함 (중간). Functional annotation은 Up-DEG에서 상당히 강화되었다. MSigDB (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb)에서 hallmark gene annotation을 사용하여 hypergeometric tests를 수행하고 -log10 (q-value)으로 정의된 농축 점수를 산출하였다. Ad-C 또는 Ad-Rip3 (오른쪽)에 감염된 연골 세포에서 Mmp3의 RT-PCR 분석. (E) Up-DEG에서 상당히 풍부한 functional terms. Functional annotation은 MSigDB의 큐레이트된 유전자 세트 (C2)에서 얻음. 값은 평균 ± SEM으로 표시됨. two-tailed t-test을 사용하여 통계 분석을 수행함.
도 4는 RIP3 발현의 변화(modulation)가 퇴행성 관절염과 상관관계가 있음을 보여주는 것이다. 표시된 MOI 에서 Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포(n = 5)에서 RIP3, MMP3, MMP13 및 COX2의 (A) RT-PCR (왼쪽) 및 qPCR (오른쪽), (B) 웨스턴 블로팅 분석 결과. (C) Ad-Rip3에 감염된 연골 세포(n = 5)에서 Adamts4, Adamts5, aggrecan 및 Col2a1의 qPCR 분석. (D) 연골 세포 (n = 5)에서 Ad-Rip3 감염에 의한 아그레카나제 (왼쪽) 및 콜라게나제 (오른쪽) 활성. (E) Safranin-O 염색, OARSI 등급, 골극 형성 및 연골하 골판 두께로 평가된 Ad-C 및 Ad-Rip3가 관절 내로 주입된 마우스 무릎 관절의 연골 파괴 및 퇴행성 관절염 발달 (n = 9). (F) Ad-C- 또는 Ad-Rip3 주입된 연골에서 RIP3, MMP3, MMP13, COX2, MLKL 및 p-MLKL 면역 염색. 통계 분석은one-way ANOVA with Bonferroni's test (A, C 및 D), nonparametric Mann-Whitney U tests (E, OARSI 등급, 골조직 형성)와 two-tailed t-tests(E, 연골 하골판)로 수행함. 스케일 바 : 100 μm
도 5는 상승된 RIP3 발현이 연골 세포 세포 사멸을 유도하지 않음을 보여준다. 표시된 MOI에서 Ad-C 또는 Ad-Rip3으로 감염된 연골 세포(n = 5)에서 표시된 단백질 또는 전사체 수준에 대한 (A) 도 2B의 웨스턴 블라팅 결과의 상대적 발현양 (B) 및 RT-PCR 분석. 표시된 단백질의 상대적 발현 수준은 (C) 도 4F에서 Ad-C 또는 Ad-Rip3 주사 연골에서 면역 조직 화학 또는 (D) 도 6B 에서 DMM 작동 WT 또는 Rip3 KO 마우스의 연골 (n = 9)로부터 결정됨. (E) 표시된 MOI에서 Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포에서 LDH 분석 또는 위상차 현미경으로 세포 세포 독성을 분석함. 대조군 MEF는 표시된 시간 동안 TSZ로 처리하고 LDH 분석 또는 위상차 현미경으로 세포 세포 독성을 분석함. (F) 아폽토시스 유도 조건, TC (TNF 30 ng/mL + 시클로헥시미드, CHX 1 mg/mL) 하에서 표시된 MOI에서 Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포의 아폽토시스 관련 단백질 패턴 분석. 연골 세포는 또한 RIP3 과발현없이 TC로 처리되었고, 세포 용해물은 웨스턴 블로팅으로 분석되었음. (G) 연골 세포 및 RIP3 과발현 연골 세포에서 TNF- 유도된 다운스트림 신호. 세포를 지정된 시간 동안 TNF로 처리하고 웨스턴 블로팅으로 세포 용해물을 분석함. 값은 평균±SEM으로 표시되고 one-way ANOVA with Bonferroni's test (A 및 D) 또는 a two-tailed t-test(C)로 평가됨
도 6은 Rip3 녹아웃 마우스에서 감소된 퇴행성 관절염 병인을 나타낸다. (A 및 B) WT 및 Rip3 녹아웃 마우스에 수술 DMM (n = 9)을 적용하였다. 연골 파괴는 Safranin-O 염색, OARSI 등급, 골극 형성, 연골하 골판 두께 (A) 및 RIP3, MMP3, MMP13, COX2, MLKL 및 p-MLKL 면역 조직 화학 염색 (B)에 의해 평가되었다. 값은 표시된 수의 독립된 실험의 표준 ± 표준편차로 표현된다. 통계 분석은 one-way ANOVA with Bonferroni's test (A), a non-parametric Mann-Whitney U test (A, OARSI 등급 지정, 골극 형성), 또는 two-tailed t-test (A, 연골하 골판 두께)로 수행됨. 스케일 바 : 100 μm.
도 7은 RIP3 과발현은 음성 조절 인자(regulator)인 TRIM24를 통해 유전자 발현 패턴을 변경함을 보여준다. 마이크로어레이 데이터에 기반한 업스트림 조절 인자를 예측하기 위하여 Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software (QIAGEN, https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuitypathway-analysis)로 전사체 조절 인자를 분석하였다. 분석된 데이터는 활성화 Z-스코어 > 1 또는 < -1로 필터링되었으며, 분석된 샘플에서 조절 인자가 발현될 필요는 없었다. (B) MEF 및 (C) 연골 세포는 표시된 MOI의 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염시켰다. 세포 용 해물은 웨스턴 블로팅 (왼쪽) (n = 3) 및 qPCR (오른쪽) (n = 4)에 의해 분석되었다. (D) Ad-C 또는 Ad-Rip3으로 감염된 연골 세포 (n = 3)에서 RIP3, p-RIP3 및 TRIM24의 웨스턴 블롯 분석(왼쪽). Ad-C 또는 Ad-Rip3으로 감염된 연골 세포 (n = 4)에서 Rip3 및 Trim24의 qPCR 분석(오른쪽). 값은 평균±표준편차로 표현함. two-tailed t-test를 사용하여 통계 분석을 수행함.
도 8은 TRIM24 하향 조절이 퇴행성 관절염 관련 유전자 발현을 유도하는 것을 보여준다. (A) 도 7B, (B) 도 7C, (C) 도 7D에 따른 웨스턴 블로팅 결과의 정량화 (n=3). (D) 표시된 MOI에서 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA에 감염된 MEF에서 TRIM24, RIP3 및 COX2의 웨스턴 블로팅 분석 (n = 3) (왼쪽). 3 회의 독립적인 실험을 기반으로 평균±표준편차로 나타낸 웨스턴 블로팅 결과의 정량화 (중간). Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염된 MEF에서 Mmp3, Mmp13 및 Cox2의 qPCR 분석 (n = 4) (오른쪽). (E) 표시된 MOI의 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염된 연골 세포 (n = 5)의 도 9B의 웨스턴 블로팅으로부터 표시된 단백질의 상대적 발현 수준은 결정되었음. (F) 표시된 MOI에서 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염된 연골 세포에서 위상차 현미경 (왼쪽)으로 세포 세포 독성을 분석함.. Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염된 연골 세포에서 Rip3, Mmp3, Cox2 및 Trim24의 qPCR 분석 (오른쪽) (n = 9). 값은 평균±표준편차로 표현되었고, 통계 분석은 two- tailed t-test (A-D) 또는 one-way ANOVA with Bonferroni's test (E)로 수행하였다.
도 9는 TRIM24가 RIP3 발현의 업스트림 조절 인자임을 보여준다. 표시된 MOI의 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염된 연골 세포(n = 5)에서 TRIM24, RIP3, MMP3 및 COX2의 (A) RT-PCR (왼쪽), qPCR (오른쪽) 및 (B) 웨스턴 블롯 분석. Safranin-O 로 염색된 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA를 관절 내 주사한 WT 마우스의 무릎 관절 연골 (n = 9)에서, (C) 연골 파괴, 골조직 형성 및 연골하 골 두께를 스코어링으로 평가하고, (D) Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA가 주입 된 연골에서의 TRIM24, RIP3, MMP3, MMP13 및 COX2을 면역 염색함. (E) 표시된 단백질의 상대적 발현 수준은 DMM 수술 후 2 주마다 연골의 면역 조직 화학으로부터 결정되었음 (n = 9). 값은 평균으로 표현되었으며, 데이터는 one-way ANOVA with Bonferroni's test (A), non-parametric Mann-Whitney U test (C; OARSI 등급, 골극 형성) 또는 two-tailed t-test (C; 연골 하 골판 두께)을 사용하여 분석하였음. 스케일 바 : 100 μm.
도 10은 TRIM24와 RIP3의 발현이 DMM에 의해 유도된 퇴행성 관절염 모델에서 역 상관 관계가 있음을 보여준다. (A) 도 9D에 따른 표시된 MOI에서 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염된 연골 세포 (n = 9)의 면역 조직 화학으로부터 표시된 단백질의 상대적 발현 수준이 결정되었다. (B 및 C) WT 마우스는 연골 파괴를 유도하기 위해 DMM 수술을 받았다 (n = 5). (B) 퇴행성 관절염 증상은 OARSI 점수를 사용하고 골조직 및 연골하 골 형성을 평가하여 점수를 매겼다. (C) 도 9E에 따른 DMM 수술 연골의 면역 조직 화학으로부터 표시된 단백질의 상대적 발현 수준이 결정되었다. 값은 표준±표준편차로 표현되었으며, 데이터는 two-tailed t-test (A) 또는 one-way ANOVA with Bonferroni's test (B 및 C)를 사용하여 분석되었다.
도 11은 AZ-628이 RIP3 키나제 활성을 약화시키고 RIP3 매개 퇴행성 관절염 병인을 감소시킴을 보여준다. (A) CMap 접근법을 사용한 인 실리코 약물 스크리닝의 개략도 및 상위 10 개 예측 화합물. (B) AutoDock Vina를 사용한 AZ-628, 네라티닙 및 셀루메티닙의 RIP3에 대한 결합 친화도 분석. (C) 표시된 용량의 AZ-628, 셀루메티닙 또는 네라티닙의 존재/부재에서 Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포에서 RT-PCR (상단) 및 웨스턴 블로팅 (하단)에 의해 결정된 MMP3, MMP13 및 COX2 발현 (n=5). (D) AZ-628에 의한 RIP3 키나제 활성의 억제. 연골 세포는 아데노 바이러스 Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염되었고 GSK'872, AZ-628 및 HS-1371로 처리되었음. 세포 용해물은 웨스턴 블로팅 (n = 3)에 의해 분석됨. (E) (C)와 동일한 조건에서 Mmp3의 qPCR 분석 (n = 9). (F) LDH 방출 분석을 사용하여 평가된 세포 독성 (n = 6). (G) RIP3 매개 퇴행성 관절염 및 AZ-628의 억제 효과의 다이어그램. 값은 평균 ± SEM으로 표시되며, two-tailed t-tests를 사용하여 통계 분석을 수행함.
도 12는 RIP3 키나제 활성을 조절하기 위한 새로운 억제제 선별을 나타낸다. (A) PubChem로부터 억제제 분자의 3D 구조. (B) LDH 분석에 의해 검출된 연골 세포 생존력에 대한 AZ-628, 셀루메티닙 및 네라티닙의 효과 (n = 5). (C 및 D) 표시된 용량의 AZ-628, 셀루메티닙 및 네라티닙의 존재 또는 부재하에 Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포(n = 5)에서 표시된 단백질의 상대적 발현 수준을 (C) qPCR 및 (D) 도 11C의 웨스턴 블로팅 결과 확인함. 데이터는 one-way ANOVA with Bonferroni's test를 사용하여 분석하였다.
도 13은 AZ-628이 RIP3 매개 퇴행성 관절염 병인의 강력한 억제제로 작용함을 보여준다. (A) RIP3을 사용한 14 개 화합물의 결합 친화성 분석. (B) RIP3 및 소분자에 대한 컴퓨팅 도킹 모델. (C) 도 11D의 웨스턴 블로팅의 정량화 결과 (n = 3). (D) Ad-C 또는 Ad-Rip3 에 감염된 연골 세포에서 Rip3, Cox2 및 Mmp3 발현의 qPCR 분석 (n = 9). (E) Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포에서 웨스턴 블 롯팅 (왼쪽) 및 위상차 현미경 (오른쪽)에 의해 평가된 세포 독성. (F) RIP3 키나제 도메인에 결합하는 AZ-628 또는 포스페이트의 다이어그램. 값은 평균±표준편차로 표현되고, 통계 분석은 two-tailed t-test로 수행하였음.
도 2는 연골 세포에서 RIP3의 비-정규적(non-canonical) 역할이 퇴행성 관절염 병인과 관련이 있음을 보여준다. (A) 연골 세포에서 네크롭토시스 발현 수준을 나타냄. (A) 연골 세포에서 괴사 조절제의 발현 수준. 야생형 및 MLKL 녹아웃 MEF, 골수 유래 단핵구 (BMDM), 대식세포, 연골 조직 및 일차 마우스 관절 연골 세포에서 추출한 단백질을 웨스턴 블로팅으로 분석함 (n = 3). (B) MEF 및 연골 세포를 TSZ (TNF + zVAD + SMAC 모방체)로 처리하고 세포 용해물을 웨스턴 블로팅으로 분석함 (n = 3). (C) Alcian blue, Safranin O 및 RIP3, p-MLKL 및 MLKL 면역 염색 (n = 5)으로 염색된 비손상 및 손상된 인간 연골. 스케일 바 : 100 μm. (D) qPCR에 의해 측정된 비손상 및 손상된 인간 퇴행성 관절염 연골에서의 RIP3 발현 (n = 5). 값은 평균 ± SEM으로 표시됨. two-tailed t-tests을 사용하여 통계 분석을 수행함. (E) 표시된 MOI에서 Ad-C (대조군) 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포에서 RIP3, p-RIP3, MLKL 및 p-MLKL의 웨스턴 블로팅 분석 (n = 3). (F) 대조군과 비교하여 처리된 세포에서의 RIP3 관련 유전자(표 3에 나열됨)의 GSEA 분석.
도 3은 상승된 RIP3 발현이 연골 세포에서 퇴행성 관절염 병인 관련 유전자 발현 패턴과 상관 관계가 있음을 보여준다. (A) 표시된 각 단백질의 상대적 발현 수준은 도 2C에 나타난 인간 비손상 및 손상된 연골의 면역 조직 화학으로부터 결정되었다(n = 5). (B) 도 2E의 웨스턴 블로팅 결과의 정량화 (n = 3). (C) Ad-Rip3- 및 Ad-C- 감염된 RIP1-/-MEF 및 Flag-RIP3 형질 감염된 MEF에서 네크롭토시스 조절 인자의 웨스턴 블로팅 분석 (n = 3). (D) Ad-C 또는 Ad-Rip3에 감염된 연골 세포에서 RIP3 및 p-RIP3의 웨스턴 블로팅 (왼쪽) 및 유전자 발현 (오른쪽) 분석. Ad-Rip3 및 Ad-C-감염된 연골 세포 사이에서 차등 발현된 (differentially expressed) 유전자 (DEG)는 폴드 변화(Fold change, FC)> 3을 사용하여 선택되었음. 상위 10 개의 상향 조정된 DEG (Up-DEG) 및 상위 10 개의 퇴행성 관절염 관련 Up-DEG는 RIP3 과발현으로 나열함 (중간). Functional annotation은 Up-DEG에서 상당히 강화되었다. MSigDB (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb)에서 hallmark gene annotation을 사용하여 hypergeometric tests를 수행하고 -log10 (q-value)으로 정의된 농축 점수를 산출하였다. Ad-C 또는 Ad-Rip3 (오른쪽)에 감염된 연골 세포에서 Mmp3의 RT-PCR 분석. (E) Up-DEG에서 상당히 풍부한 functional terms. Functional annotation은 MSigDB의 큐레이트된 유전자 세트 (C2)에서 얻음. 값은 평균 ± SEM으로 표시됨. two-tailed t-test을 사용하여 통계 분석을 수행함.
도 4는 RIP3 발현의 변화(modulation)가 퇴행성 관절염과 상관관계가 있음을 보여주는 것이다. 표시된 MOI 에서 Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포(n = 5)에서 RIP3, MMP3, MMP13 및 COX2의 (A) RT-PCR (왼쪽) 및 qPCR (오른쪽), (B) 웨스턴 블로팅 분석 결과. (C) Ad-Rip3에 감염된 연골 세포(n = 5)에서 Adamts4, Adamts5, aggrecan 및 Col2a1의 qPCR 분석. (D) 연골 세포 (n = 5)에서 Ad-Rip3 감염에 의한 아그레카나제 (왼쪽) 및 콜라게나제 (오른쪽) 활성. (E) Safranin-O 염색, OARSI 등급, 골극 형성 및 연골하 골판 두께로 평가된 Ad-C 및 Ad-Rip3가 관절 내로 주입된 마우스 무릎 관절의 연골 파괴 및 퇴행성 관절염 발달 (n = 9). (F) Ad-C- 또는 Ad-Rip3 주입된 연골에서 RIP3, MMP3, MMP13, COX2, MLKL 및 p-MLKL 면역 염색. 통계 분석은one-way ANOVA with Bonferroni's test (A, C 및 D), nonparametric Mann-Whitney U tests (E, OARSI 등급, 골조직 형성)와 two-tailed t-tests(E, 연골 하골판)로 수행함. 스케일 바 : 100 μm
도 5는 상승된 RIP3 발현이 연골 세포 세포 사멸을 유도하지 않음을 보여준다. 표시된 MOI에서 Ad-C 또는 Ad-Rip3으로 감염된 연골 세포(n = 5)에서 표시된 단백질 또는 전사체 수준에 대한 (A) 도 2B의 웨스턴 블라팅 결과의 상대적 발현양 (B) 및 RT-PCR 분석. 표시된 단백질의 상대적 발현 수준은 (C) 도 4F에서 Ad-C 또는 Ad-Rip3 주사 연골에서 면역 조직 화학 또는 (D) 도 6B 에서 DMM 작동 WT 또는 Rip3 KO 마우스의 연골 (n = 9)로부터 결정됨. (E) 표시된 MOI에서 Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포에서 LDH 분석 또는 위상차 현미경으로 세포 세포 독성을 분석함. 대조군 MEF는 표시된 시간 동안 TSZ로 처리하고 LDH 분석 또는 위상차 현미경으로 세포 세포 독성을 분석함. (F) 아폽토시스 유도 조건, TC (TNF 30 ng/mL + 시클로헥시미드, CHX 1 mg/mL) 하에서 표시된 MOI에서 Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포의 아폽토시스 관련 단백질 패턴 분석. 연골 세포는 또한 RIP3 과발현없이 TC로 처리되었고, 세포 용해물은 웨스턴 블로팅으로 분석되었음. (G) 연골 세포 및 RIP3 과발현 연골 세포에서 TNF- 유도된 다운스트림 신호. 세포를 지정된 시간 동안 TNF로 처리하고 웨스턴 블로팅으로 세포 용해물을 분석함. 값은 평균±SEM으로 표시되고 one-way ANOVA with Bonferroni's test (A 및 D) 또는 a two-tailed t-test(C)로 평가됨
도 6은 Rip3 녹아웃 마우스에서 감소된 퇴행성 관절염 병인을 나타낸다. (A 및 B) WT 및 Rip3 녹아웃 마우스에 수술 DMM (n = 9)을 적용하였다. 연골 파괴는 Safranin-O 염색, OARSI 등급, 골극 형성, 연골하 골판 두께 (A) 및 RIP3, MMP3, MMP13, COX2, MLKL 및 p-MLKL 면역 조직 화학 염색 (B)에 의해 평가되었다. 값은 표시된 수의 독립된 실험의 표준 ± 표준편차로 표현된다. 통계 분석은 one-way ANOVA with Bonferroni's test (A), a non-parametric Mann-Whitney U test (A, OARSI 등급 지정, 골극 형성), 또는 two-tailed t-test (A, 연골하 골판 두께)로 수행됨. 스케일 바 : 100 μm.
도 7은 RIP3 과발현은 음성 조절 인자(regulator)인 TRIM24를 통해 유전자 발현 패턴을 변경함을 보여준다. 마이크로어레이 데이터에 기반한 업스트림 조절 인자를 예측하기 위하여 Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software (QIAGEN, https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuitypathway-analysis)로 전사체 조절 인자를 분석하였다. 분석된 데이터는 활성화 Z-스코어 > 1 또는 < -1로 필터링되었으며, 분석된 샘플에서 조절 인자가 발현될 필요는 없었다. (B) MEF 및 (C) 연골 세포는 표시된 MOI의 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염시켰다. 세포 용 해물은 웨스턴 블로팅 (왼쪽) (n = 3) 및 qPCR (오른쪽) (n = 4)에 의해 분석되었다. (D) Ad-C 또는 Ad-Rip3으로 감염된 연골 세포 (n = 3)에서 RIP3, p-RIP3 및 TRIM24의 웨스턴 블롯 분석(왼쪽). Ad-C 또는 Ad-Rip3으로 감염된 연골 세포 (n = 4)에서 Rip3 및 Trim24의 qPCR 분석(오른쪽). 값은 평균±표준편차로 표현함. two-tailed t-test를 사용하여 통계 분석을 수행함.
도 8은 TRIM24 하향 조절이 퇴행성 관절염 관련 유전자 발현을 유도하는 것을 보여준다. (A) 도 7B, (B) 도 7C, (C) 도 7D에 따른 웨스턴 블로팅 결과의 정량화 (n=3). (D) 표시된 MOI에서 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA에 감염된 MEF에서 TRIM24, RIP3 및 COX2의 웨스턴 블로팅 분석 (n = 3) (왼쪽). 3 회의 독립적인 실험을 기반으로 평균±표준편차로 나타낸 웨스턴 블로팅 결과의 정량화 (중간). Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염된 MEF에서 Mmp3, Mmp13 및 Cox2의 qPCR 분석 (n = 4) (오른쪽). (E) 표시된 MOI의 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염된 연골 세포 (n = 5)의 도 9B의 웨스턴 블로팅으로부터 표시된 단백질의 상대적 발현 수준은 결정되었음. (F) 표시된 MOI에서 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염된 연골 세포에서 위상차 현미경 (왼쪽)으로 세포 세포 독성을 분석함.. Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염된 연골 세포에서 Rip3, Mmp3, Cox2 및 Trim24의 qPCR 분석 (오른쪽) (n = 9). 값은 평균±표준편차로 표현되었고, 통계 분석은 two- tailed t-test (A-D) 또는 one-way ANOVA with Bonferroni's test (E)로 수행하였다.
도 9는 TRIM24가 RIP3 발현의 업스트림 조절 인자임을 보여준다. 표시된 MOI의 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염된 연골 세포(n = 5)에서 TRIM24, RIP3, MMP3 및 COX2의 (A) RT-PCR (왼쪽), qPCR (오른쪽) 및 (B) 웨스턴 블롯 분석. Safranin-O 로 염색된 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA를 관절 내 주사한 WT 마우스의 무릎 관절 연골 (n = 9)에서, (C) 연골 파괴, 골조직 형성 및 연골하 골 두께를 스코어링으로 평가하고, (D) Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA가 주입 된 연골에서의 TRIM24, RIP3, MMP3, MMP13 및 COX2을 면역 염색함. (E) 표시된 단백질의 상대적 발현 수준은 DMM 수술 후 2 주마다 연골의 면역 조직 화학으로부터 결정되었음 (n = 9). 값은 평균으로 표현되었으며, 데이터는 one-way ANOVA with Bonferroni's test (A), non-parametric Mann-Whitney U test (C; OARSI 등급, 골극 형성) 또는 two-tailed t-test (C; 연골 하 골판 두께)을 사용하여 분석하였음. 스케일 바 : 100 μm.
도 10은 TRIM24와 RIP3의 발현이 DMM에 의해 유도된 퇴행성 관절염 모델에서 역 상관 관계가 있음을 보여준다. (A) 도 9D에 따른 표시된 MOI에서 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염된 연골 세포 (n = 9)의 면역 조직 화학으로부터 표시된 단백질의 상대적 발현 수준이 결정되었다. (B 및 C) WT 마우스는 연골 파괴를 유도하기 위해 DMM 수술을 받았다 (n = 5). (B) 퇴행성 관절염 증상은 OARSI 점수를 사용하고 골조직 및 연골하 골 형성을 평가하여 점수를 매겼다. (C) 도 9E에 따른 DMM 수술 연골의 면역 조직 화학으로부터 표시된 단백질의 상대적 발현 수준이 결정되었다. 값은 표준±표준편차로 표현되었으며, 데이터는 two-tailed t-test (A) 또는 one-way ANOVA with Bonferroni's test (B 및 C)를 사용하여 분석되었다.
도 11은 AZ-628이 RIP3 키나제 활성을 약화시키고 RIP3 매개 퇴행성 관절염 병인을 감소시킴을 보여준다. (A) CMap 접근법을 사용한 인 실리코 약물 스크리닝의 개략도 및 상위 10 개 예측 화합물. (B) AutoDock Vina를 사용한 AZ-628, 네라티닙 및 셀루메티닙의 RIP3에 대한 결합 친화도 분석. (C) 표시된 용량의 AZ-628, 셀루메티닙 또는 네라티닙의 존재/부재에서 Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포에서 RT-PCR (상단) 및 웨스턴 블로팅 (하단)에 의해 결정된 MMP3, MMP13 및 COX2 발현 (n=5). (D) AZ-628에 의한 RIP3 키나제 활성의 억제. 연골 세포는 아데노 바이러스 Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염되었고 GSK'872, AZ-628 및 HS-1371로 처리되었음. 세포 용해물은 웨스턴 블로팅 (n = 3)에 의해 분석됨. (E) (C)와 동일한 조건에서 Mmp3의 qPCR 분석 (n = 9). (F) LDH 방출 분석을 사용하여 평가된 세포 독성 (n = 6). (G) RIP3 매개 퇴행성 관절염 및 AZ-628의 억제 효과의 다이어그램. 값은 평균 ± SEM으로 표시되며, two-tailed t-tests를 사용하여 통계 분석을 수행함.
도 12는 RIP3 키나제 활성을 조절하기 위한 새로운 억제제 선별을 나타낸다. (A) PubChem로부터 억제제 분자의 3D 구조. (B) LDH 분석에 의해 검출된 연골 세포 생존력에 대한 AZ-628, 셀루메티닙 및 네라티닙의 효과 (n = 5). (C 및 D) 표시된 용량의 AZ-628, 셀루메티닙 및 네라티닙의 존재 또는 부재하에 Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포(n = 5)에서 표시된 단백질의 상대적 발현 수준을 (C) qPCR 및 (D) 도 11C의 웨스턴 블로팅 결과 확인함. 데이터는 one-way ANOVA with Bonferroni's test를 사용하여 분석하였다.
도 13은 AZ-628이 RIP3 매개 퇴행성 관절염 병인의 강력한 억제제로 작용함을 보여준다. (A) RIP3을 사용한 14 개 화합물의 결합 친화성 분석. (B) RIP3 및 소분자에 대한 컴퓨팅 도킹 모델. (C) 도 11D의 웨스턴 블로팅의 정량화 결과 (n = 3). (D) Ad-C 또는 Ad-Rip3 에 감염된 연골 세포에서 Rip3, Cox2 및 Mmp3 발현의 qPCR 분석 (n = 9). (E) Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포에서 웨스턴 블 롯팅 (왼쪽) 및 위상차 현미경 (오른쪽)에 의해 평가된 세포 독성. (F) RIP3 키나제 도메인에 결합하는 AZ-628 또는 포스페이트의 다이어그램. 값은 평균±표준편차로 표현되고, 통계 분석은 two-tailed t-test로 수행하였음.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
관절염은 크게 비 염증성 관절염과 염증성 관절염으로 나눌 수 있는데, 비염증성 관절염으로는 골 관절염 (퇴행성 관절염, osteoarthritis, OA)을 들 수 있고, 염증성 관절염으로는 류마티스 관절염을 대표적으로 들 수 있다.
퇴행성 관절염은 일명 골관절염이라고도 불리며, 발병원인은 아직 분명하지 않지만, 유전, 외상, 비만, 노화, 대사이상 등과 같은 다양한 유발인자들이 이에 관여한다고 알려져 있다. 이러한 인자들에 의해 연골세포에서 공격인자와 방어인자 간의 균형이 깨지게 되고, 연골조직 파괴 촉진 및 연골 마모가 심화되면서 골관절염에 특징적인 병리학적 변화로 인해 환자는 통증을 느끼게 되고, 관절운동에 제한이 생긴다고 보고되어 있다.
반면, 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis, RA)의 경우, 연골세포 및 연골조직 파괴로 인해 유발되는 퇴행성 관절염과는 달리, 자가면역반응에 의한 질환의 진행이 중요한 원인 인자로 알려져 있다. 류마티스 관절염은 활막 세포의 염증과 증식을 특징으로 하는, 만성 자가면역 질환 (autoimmune diseases)으로서, 퇴행성 관절염과 달리 관절 주위 뼈의 골다공증 및 골미란 등이 발생한다. 류마티스 관절염은 활막 (synovial membrane)의 염증이 관절막 (joint capsule)과 인대 (ligament), 건 (tendon)으로 퍼지고, 뼈로 침범하여 진행되게 된다. 따라서, 퇴행성 관절염과 류미티스 관절염은 그 발명 원인 및 진행단계가 전혀 상이하며, 이에 대한 치료 방법도 상이하다.
지금까지 알려진 류마티스관절염 치료제로는 염증 기전을 차단하기 위해 적당한 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAIDs), 페니실라민, 스테로이드성 호르몬, TNF 억제제, 인터류킨 억제제, JAK 억제제, 항-CD 관련 억제제 등이 이에 해당한다 (Pritchard MH et al, Ann Rheum Dis, 37:493-503, 1978; 2014 Frost & Sullivan report: Product and pipeline analysis of the global rheumatoid arthritis therapeutics market). 관절 통증 및 염증 완화 목적으로 NSAID 약물 및 스테로이드성 호르몬이 퇴행성관절염 환자에 사용되고 있지만, 이는 질병 자체를 치료하기 보다는 증상만을 완화시키므로 실질적인 퇴행성 관절염 치료제로서의 역할은 될 수 없다 (Abramson SB et al, Osteoarthritis Cartilage, 7:380-1, 1999) 뿐만 아니라, 연골세포 및 연골조직 파괴에 의해 주로 발생하는 퇴행성 관절염은 그 발병 원인과 현상이 염증성 관절염인, 류마티스 관절염과는 엄연히 다르기 때문에, 퇴행성 관절염 치료방법 역시 류마티스 관절염 치료방법과는 다를 수밖에 없다.
이러한 결과를 바탕으로 비교해 보면, 퇴행성 관절염과 류마티스 관절염의 경우, 전혀 다른 질병 원인이 존재하며, 또한 현재 개발되고 있는 치료제 역시 퇴행성 관절염의 경우, 연골 재생을 중심으로, 류마티스 관절염의 경우, 염증 억제를 기본으로 진행되고 있음을 확인할 수 있다. 따라서, 퇴행성 관절염 치료를 위한 표적 인자와 염증성 류마티스 관절염 치료를 위한 표적 인자는 서로 다르게 적용되어야 한다.
본 발명의 용어 "퇴행성 관절염 (osteoarthritis, OA) 및 "골 관절염"은 혼용하여 사용되며, 동일한 의미로 이해되어야 할 것이다.
본 발명에서는 퇴행성 관절염이 유발된 환자에서 RIP3 발현이 증가되어 있음을 최초로 확인하였고, RIP3에 결합하는 신규한 억제제로 셀루메티닙을 새로이 동정하였으며, 셀루메티닙을 처리하였을 때 퇴행성 관절염에서 발현이 증가되어 연골 파괴를 유도하는 Mmp3, Mmp13 및 Cox2의 발현을 억제할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일관점에서 화학식 (I)의 구조를 가지는 셀루메티닙을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다:
화학식 (I).
본 발명에 있어서, 상기 퇴행성 관절염은 RIP3의 발현증가 및/또는 활성증가에 의해 진행되는 퇴행성 관절염인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 골관절염을 유발하는 유전자인 mmp3, mmp13 및/또는 cox2의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 (i) 연골 파괴 감소, (ii) 골극 형성 촉진 및 (iii) 연골하 골판 두께 감소의 방지로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 효과를 발휘하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. "제약상(약학적으로) 허용되는 담체"는 제제를 제제화하거나 또는 안정화시키는 것을 돕기 위해서 활성 성분에 추가될 수 있는 물질이고, 환자에게 유의한 해로운 독성 효과를 야기하지 않는다.
상기 담체는 환자를 자극하지 않고 본 발명에 따른 셀루메티닙의 기능을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 다른 담체는 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (E W Martin)]에 기재되어 있다.
제약상 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액제 또는 분산액제를 즉각 투여용(extemporaneous)으로 제조하기 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 조성물은 바람직하게는 비경구 주사용으로 제제화된다. 조성물은 용액제, 마이크로 에멀젼제, 리포좀제, 또는 높은 약물 농도에 적합한 기타 주문된 구조물로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이것들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 일부 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시킬 수 있다. 멸균 주사가능한 용액제는 필요한 양의 셀루메티닙을 필요에 따라 상기 기재된 성분들 중 1 종 또는 이것들의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에 멸균 마이크로여과를 수행하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액제는 활성 화합물을 기본적인 분산 매질 및 상기 기재된 것들로부터의 기타 필요한 성분을 함유하는 멸균 비히클로 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사가능한 용액제를 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 일부 제조 방법은 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 이것의 미리 멸균-여과시킨 용액으로부터 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.
또한, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 고통받는 환자의 중증도에 따라 달라질 수 있는 투여량 및 빈도로 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 조성물은 필요에 따라 볼루스로서 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 관절노화에 따른 연골조직 파괴를 억제하고 연골형성을 촉진시켜, 퇴행성 관절염을 치료할 수 있다.
현재까지 알려진 퇴행성 관절염 치료법으로는 인공관절치환술, 연골성형술, 연골이식술, 자기유래연골세포 이식술 등이 있으나, 인공관절치환술은 관절 절개가 필요하므로 환자의 고통 및 부담이 있고, 시술 과정이 복잡하고 까다롭다. 뿐만 아니라, 자가이식이 가능한 환자만을 대상으로 시행하기 때문에 치료의 제한적인 부분이 많이 존재한다 (Peterson L et al, J Bone Joint Surg Am, 85:17-24, 2003) 자가 유래 연골세포 이식술은 환자의 정상부위에서 채취한 연골조직으로부터 연골세포를 얻어, 체외에서 필요한 수 만큼 배양하고 증식한 후, 손상된 연골 부분을 채우는 방법이다. 하지만, 이 역시 공여 조직이 제한되어 있고, 이식용 조직을 채취하기 위한 수술을 필요로 하기 때문에 시술 과정이 복잡하고 까다롭다 (Yoon et al, Jorunal of Rheumatic Diseases, 19, 2012) 이밖에 자가유래 골수, 근육, 지방 등의 조직으로부터 중간엽 줄기세포를 얻고, 체외에서 분화시켜 관절 연골손상 부위에 주입하는 방법이 있다. 하지만, 중간엽 줄기세포를 TGF-b를 바탕으로 연골세포 분화시 중간엽 줄기세포가 비대연골세포로 분화될 위험이 있으며, BMP로 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화 시켰을 경우에는, 골증식체로 분화될 위험이 존재한다 (1 Park et al, J of Korean Orthopaedic Research Society, 18:2, 2015; Mamidi MK et al, Osteoarthritis Cartilage, 24:1307-16, 2016) 또한, 현재까지 개발된 퇴행성 관절염 의약품이나 건강식품류 대부분이 실질적으로 퇴행성관절염 치료에 중요한 연골세포 활성 및 연골 재생 효과보단, 진통완화 및 항염증 효과에만 치중하는 경향을 보이고 있다.
따라서, 종래의 퇴행성관절염 치료 의약품이나 건강식품류가 가지고 있는 부작용, 연골재생 효과 저하 및 안전성 확보 등의 문제점을 해결할 수 있으며, 이미 신경섬유종증 1형 종양 치료제로 FDA 승인 받은 셀루메티닙은 퇴행성 관절염 예방, 치료 또는 개선을 위한 원료로 유용하게 사용될 것으로 기대할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서 화학식 (I)의 구조를 가지는 셀루메티닙을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
상기 건강 기능식품은, 식품조성물로써 기능성 식품, 영양보조제, 건강식품, 식품 첨가제 등의 다양한 형태를 포함하는 것이며, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태, 예컨대, 앞서 언급한 셀루메티닙을 차, 쥬스, 드링크의 형태로 제조하거나, 과립화, 캡슐화, 분말화 하거나, 음료, 과실 및 가공식품, 어유, 육류 및 그 가공식품, 빵류, 면류, 조미료 등 각종 식품에 첨가하여 제조함으로써 제공될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 RIP3의 발현증가 및/또는 활성증가에 의해 진행되는 퇴행성 관절염 치료를 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다:
(a) 퇴행성 관절염을 가지는 객체의 손상된 조직으로부터 수득된 샘플로부터 RIP3 발현양 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
(b) 상기 RIP3 발현양 또는 활성이 정상 객체 또는 동일 객체의 비손상 조직 샘플로부터 측정된 RIP3 발현양 또는 활성 정도에 비해 증가된 경우, 셀루메티닙을 퇴행성 관절염 치료 물질로 선정하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 샘플은 연골 조직 또는 연골 조직으로부터 분리된 체액 샘플인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, RIP3는 정상 조직에서 발현되지 않거나 그 발현양이 미미하나 퇴행성 관절염이 발병되었거나 진행되는 조직에서 연골이 파괴됨에 따라 발현되거나 그 발현양이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 RIP3는 정상 조직에서 그 활성이 없거나 매우 약하나 퇴행성 관절염이 발병되었거나 진행되는 조직에서 연골이 파괴됨에 따라 그 활성이 확인되거나 그 활성이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명에 있어서 RIP3 발현양 또는 활성이 증가함에 따라 퇴행성 관절염의 진행 단계를 파악할 수 있을 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 RIP3 발현양 또는 활성은 정상 객체 또는 비손상 조직에 비해 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상 또는 50% 이상 증가된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 발현양 측정을 위해서는 당업계에 의해 공지된 방법은 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 유전자 발현량 변화를 PCR에 의해 검출하거나, 단백질 발현량 변화를 항원-항체 반응, 예컨대 EILSA 반응, 또는 압타머를 이용하여 검출할 수 있을 것이다.
본 발명에 있어서, 정상 객체에서는 RIP3 발현이 확인되지 않거나 미미한 정도에 불과하나, 퇴행성 관절염에서는 RIP3 발현양이 확인되거나 미미한 정도가 현저히 증가하는 것으로, 해당 발현양 증가는 당업자가 용이하게 식별 가능한 정도일 것이다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명 할 것이다.
실시예 1. 실험방법
1-1. 인간 퇴행성 관절염 샘플 및 실험 퇴행성 관절염 마우스 모델의 제작
인간 연골 샘플은 무릎 관절 전체 치환술(total knee arthroplasty)을 받은 63 ~ 80 세의 개인에게서 얻었다 (표 1). 모든 환자는 서면 동의서를 제출하였고, 샘플 수집은 가톨릭대학교의 IRB에 의해 승인되었다(UC14CNSI0150).
수컷 C57BL/6 및 Rip3-/-마우스 (C57BL/6; Dr. VM Dixit, Genentech, San Francisco, USA)는 아주 대학교 실험실 동물 연구 센터에서 모든 동물 절차를 승인한 Institutional Animal Care and Use Committee의 가이드라인에 따라 유지하였다.
실험 퇴행성 관절염 모델을 생산하기 위해, 12 주령 수컷 마우스를 수술 DMM에 적용하고 수술 후 10 주에 희생시켰다. 암컷 마우스는 퇴행성 관절염 병인에 대한 여성 호르몬의 영향 때문에 사용에서 배제하였다. 관절 내 주사를 위한 아데노바이러스는 Vector Biolabs (Malvern, USA)에서 구입하였다 : Ad-C (1060), Ad-Rip3 (ADV-270614) 및 Ad-shRNA Trim24 (shADV-274975). 야생형 마우스에 아데노바이러스 (1 x 109 PFUs/10 μL)를 매주 2 회 무릎 관절에 주사하고 첫 번째 아데노 바이러스 주사 후 3 주 후에 희생시켰다.
1-2. 일차 마우스 관절 연골 세포의 분리 및 세포 배양
마우스 관절 연골세포는 출생 후 5일 째 ICR 마우스의 연골에서 분리하고, 단백질 분해 효소와 콜라게나제로 효소적으로 분해한 후, 10 % FBS, 100 units/mL의 페니실린 및 100ug/mL의 스트렙토마이신이 보충된 DMEM (Capricorn science GmbH; Hessen, Germany)에서 유지시켰다. 3일째, 세포 (4.25 x 105 세포/웰)를 아데노 바이러스로 감염시키거나 재조합 단백질로 처리하였다. Mlkl+/+ 및 Mlkl-/- MEF는 10 % FBS 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 유지시켰다.
1-3. 시약
항체는 Enzo Biochem (New York, USA; RIP3), BD-Transduction Laboratories (Breda, Netherlands; RIP1), Santa Cruz Biotechnology (Dallas, USA; GAPDH, Actin, IκBα, Vimentin), Cell Signaling Technology (Danvers, USA; p-ERK, p-JNK, PARP, Caspase3, p-RIPK1, NIK), Abcam (Cambridge, UK; p-MLKL, p-RIP3), MLKL, TRIM24, COX2, MMP3, MMP13), 및 Sigma-Aldrich (St Louis, USA; LC3B, Vinculin)로부터 구입하였다. TNF-α 및 zVAD는 R&D Systems (Minneapolis, USA)에서 구입하였다. Cycloheximide, Pepstatin A 및 MG132는 Calbiochem (San Diego, USA)에서 구입하였다. Chloroquine diphosphate (CQ) 및 AZ-628은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. GSK'872는 Selleckchem (Houston, USA)에서 구입하였다. Selumetinib은 Abcam에서 구입하였다. Neratinib은 MedChemExpress (Princeton, USA)에서 구입했습니다. HS-1371은 자체 제작하였다 (Park HH, Park SY, Mah S, et al. HS-1371, a novel kinase inhibitor of RIP3-mediated necroptosis. Exp Mol Med 2018;50(9):125).
1-4. 세포 생존력 분석
세포 생존력은 젖산 탈수소 효소 (LDH) 비색 분석 키트 (BioVision (Milpitas, CA, USA))를 사용하여 평가되었다. 연골 세포를 96 웰 디쉬 (1.5 x 104 세포/웰)에 분주하고 24 시간 (5 % CO2, 37℃동안 배양하고 다양한 농도의 AZ-628, 셀루메티닙 및 네라티닙으로 24 시간 동안 처리하였다. 495 nm에서 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 상청액을 분석하였다. 미처리 (100 % 생존) 및 Triton X-100 처리 (0 % 생존) 샘플을 정규화에 사용하였다. 생존율은 다음과 같이 계산하였다:
1-5. 웨스턴 블로팅
세포를 M2 완충액에 용해하고, 마우스 조직은 50mM Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl, 50mM NaF, 1 % Tween 20, 0.2 % NP-40 및 프로테아제 저해제로 구성된 용해 완충액에 용해하였다. 동일한 양의 세포 추출물을 SDS-PAGE (6 % 스태킹 겔 및 10 % 러닝 겔)로 분리하고 면역 블롯팅으로 분석했하였다.
1-6. 역전사(RT)-PCR 및 qPCR
총 RNA는 TRIzol 시약 (Molecular Research Center (Molecular Research Center (Cincinnati, OH, USA))을 사용하여 관절 연골 세포에서 추출하고 ImProm-II ™Reverse Transcriptase (Promega (Madison, WI, USA))를 사용하여 상보적 DNA (cDNA)로 역전사하였으며 표 2에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR 또는 qPCR로 증폭하였다. qPCR은 SYBR premix Ex Taq (TaKaRa Bio, Kusatsu, Shiga, Japan)를 사용하여 수행하였으며, 결과는 Gapdh로 정규화되고 대조군과 비교한 폴드-변화로 표현하였다.
1-7. 콜라게나제 및 아그레카나제 활성 분석
연골 세포를 6-웰 디쉬 (2 x 105 세포/웰)에 분주하고 Ad-C 또는 Ad-Rip3 아데노바이러스(Ad-C (1060), Ad-Rip3 (ADV-270614), Vector Biolabs (Malvern, USA)) 로 감염시켰다. 세포를 FBS 없는 DMEM에서 36 시간 동안 배양 하였다. 배양 배지를 수집하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 Viva®Spin Columns (Sartorius Stedim Biotech, Gottingen, Germany)을 사용하여 동일한 부피를 농축하였다. 농축된 샘플은 EnzCheck ™Gelatinase/Collagenase Assay kits (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 사용하여 총 콜라게나제 활성에 대해 분석하였다. 콜라게나제 활성은 Ex/Em = 485/530 nm에서 SYNERGY H1 마이크로 플레이트 리더 (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 형광 신호로 측정하였다. 아그레카나제 활성은 Aggrecanase Activity Assay Kit (Abnova, Taipei, Taiwan)를 사용하여 분석하였다. 아그레카나제 수준은 제조업체의 프로토콜에 따라 430 nm에서 흡광도를 측정하여 농축된 상청액에서 정량화되었다.
1-8. 조직학 및 면역 조직 화학
인간 퇴행성 관절염 연골과 마우스 무릎 관절을 4 % 파라포름알데히드에 고정하고 파라핀에 포매하였다. 마우스 무릎 관절은 0.5 M EDTA (pH 7.4)에서 2 주 동안 석회화하였다. 파라핀 포매 샘플은 Safranin-O 또는 Alcian blue 또는 면역 염색으로 염색하였다. 연골 파괴는 실험 그룹핑에 대해 알지 못하는 세 명의 관찰자에 의해 실험 퇴행성 관절염 마우스 모델에서 평가되었으며 OARSI (국제 퇴행성 관절염 연구 학회) 등급 시스템 (등급 0-6)에 따라 점수가 매겨졌다. OARSI 점수는 각 마우스에 대한 평균 최대 점수로 제시되었다. 대표적인 Safranin-O 염색 이미지는 각 섹션의 최고 고도 병변(advanced lesions)에서 선택되었으며 이전에 설명한대로 골극 성숙도(osteophyte maturity)를 정량화하였다. 연골하 골 경화증(Subchondral bone sclerosis)은 연골하 골판 두께를 측정하여 결정하였다. MMP3, MMP13 및 MLKL (Abcam), COX2 및 TRIM24 (Proteintech) 및 RIP3 (Enzo Biochem) 항체를 사용하여 인간 및 마우스 연골 절편에서 면역 조직 화학 염색을 수행하였다.
1-9. 마이크로어레이 분석
마우스 관절 연골 세포를 Ad-Rip3 또는 Ad-C (MOI, 800)로 36 시간 동안 감염시켰다. 총 RNA는 TRIzol 시약 (Molecular Research Center)을 사용하여 분리하고 제조업체의 프로토콜에 따라 Affymetrix Mouse GeneChip 2.0 ST Array (Macrogen, Seoul, Korea)로 분석했습니다. 마이크로어레이 데이터는 접근 코드 GSE154669로 유전자 발현 옴니버스에 저장되었다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE154669) (Rip3 용).
1-10. 인 실리코 결합 분석
사용된 리간드의 화학 구조 (도 10A)는 PubChem 데이터베이스 (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)에서 검색하였다. 분자 도킹 분석은 단백질-리간드 결합 친화도 및 위치를 결정하는데 널리 사용되는 AutoDock Vina (ver. 1.1.2)를 사용하여 수행되었다. 모든 도킹 분석은 단단한 수용체(rigid receptors)와 완전히 유연한 리간드(fully flexible ligands)로 수행되었다. 수용체 좌표 및 도킹 매개 변수는 AutoDock MGLTools (ver. 1.5.6)를 사용하여 준비하였다. 리간드 결합 친화도는 음의 Gibbs 자유 에너지 (Δkcal/mol)를 사용하여 평가하였다. 도킹 구조는 PyMOL (ver. 1.3; DeLanoScientific, San Carlos, CA, USA)을 사용하여 시각화되었다.
1-11. Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)
GSEA는 Java GSEA 소프트웨어 (ver. 4.0.3; Broad Institute, MIT)를 사용하여 수행되었다. 유전자는 발현에 따라 순위가 매겨졌다. RIP3 과발현 후 상향 조절되거나 하향 조절된 것들을 RIP3 관련 유전자 세트로 선택하였다.
1-12. 통계분석
모든 실험은 4 회 이상 독립적으로 수행되었다. Shapiro-Wilk normality test, Levene's homogeneity of variance test, 및 two-tailed independent t-test를 사용하여 두 개의 독립 그룹을 비교하였다. Shapiro-Wilk test, Levene's test, 및 one-way analysis of variance with Bonferroni's post-hoc test를 이용하여 다수의 비교를 수행하였다. non-parametric Mann-Whitney U tests를 이용하여 서수 등급 시스템(ordinal grading system)을 기반으로 한 데이터를 분석하였다. 0.05 미만의 P 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
실시예 2. RIP3 과발현에 의한 유전자 발현 양상 변화와 퇴행성 관절염과의 연관성
연골 퇴행(cartilage degeneration)에서 네크롭토시스(necroptosis)의 역할을 조사하기 위해 다양한 마우스 조직 샘플에서 RIP3 및 MLKL의 발현 패턴을 조사하였다. RIP3 발현은 조직마다 크게 다르지 않았으나, MLKL 발현은 연골과 (도 1A, 도 1B) 연골에서 우세한 세포 유형인 일차 마우스 관절 연골 세포(primary mouse articular chondrocytes)에서 극히 낮게 나타났다 (도 1C, 도 2A). 낮은 MLKL 발현은 프로테아좀 (MG132)이나 리소좀 (CQ, E64d/Pep A) 억제제가 MLKL 단백질 수준을 변화시키지 않은바, 단백질 불용성, 구성적 단백질 회전율 또는 단백질 안정성 때문은 아니라고 판단되었다 (도 1D, 도 1E). 네크롭토시스 자극(TNFα + zVAD + SMAC mimetic; TSZ)은 MLKL을 인산화하여 네크롭토시스를 유도하는 RIP3를 활성화 할 수 있다. TSZ 처리 후, MLKL 인산화는 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 에서 강하게 검출되었지만 연골 세포에서는 검출되지 않았다 (도 2B; 도 1F, 1G). 한편, TNF는 MLKL의 인산화의 결함으로 인해, 연골세포에서 네크롭토시스를 유도하지 못하였다 (도 1H).
연골에서 RIP3의 가능한 역할을 탐구하기 위하여 본 발명자들은 인간 퇴행성 관절염 비손상 및 손상된 연골 샘플에서 RIP3 발현을 조사하였다. 손상된 퇴행성 관절염 연골에서는 비손상된 샘플에 비해 RIP3 발현이 현저히 높게 나타났으나 (도 2C, 2D; 도 3A), MLKL 및 p-MLKL 발현은 다르지 않았고 검출할 수 없었다. 다음으로, 본 발명자들은 Ad-Rip3에 감염된 일차 마우스 관절 연골 세포에서 RIP3를 이소성으로 (ectopically) 발현시켰다. RIP3 과발현은 네크롭토시스를 유도할 수 있는 MLKL 인산화를 유발하지 않았다 (도 2E; 도 3B). 따라서 퇴행성 관절염 발병에서 RIP3 과발현은 전형적인 네크롭토시스 의존 기능(necroptosis-dependent functions)과 구별될 것이다. 상향 조절된 RIP3 발현은 MLKL 인산화를 통해 RIP1 독립적인 네크롭토시스를 유발하는 것으로 알려져 있는데, 이를 테스트하기 위해 RIP1이 결핍된 MEF(RIP1-deficient MEF)에서 RIP3을 과발현하여 RIP3 활성화가 다운스트림 이벤트를 트리거하기에 충분함을 보고자 하였다. 상향 조절된 RIP3 발현은 RIP1 인산화가 없는 상태에서 MLKL 인산화를 강화시켰으며, 이는 퇴행성 관절염 발달에서 RIP3의 역할이 네크롭토시스 독립적일 가능성이 낮음을 시사한다(도 3C).
다음으로, 본 발명자들은 Ad-Rip3에 감염된 연골 세포의 전사체 변화를 조사하기 위해 마이크로어레이를 사용하여 게놈 차원의 발현 프로파일링을 수행하였다. RIP3 과발현은 퇴행성 관절염 발병, 염증, MMP 활성화 및 ECM 분해에 핵심적인 역할을 하는 catabolic factors-matrix metalloproteinase 3 (Mmp3)의 발현을 증가 시켰다(도 3D). 기능 강화 분석 결과, RIP3 과발현으로 유도된 유전자(RIP3 overexpression-induced genes)는 TNFα 신호 전달 및 염증에 관여한다는 것으로 나타났다(도 3E).
RIP3 유도된 유전자 발현을 추가로 평가하기 위해 GSEA에 의해 퇴행성 관절염 연골에서 150 개의 상향 조절 및 71 개의 하향 조절된 유전자의 발현을 조사한 결과 (표 3), 퇴행성 관절염 시그니처 유전자가 RIP3 과발현 연골 세포에서 상향 조절되었음을 발견하였다 (도 2F).
실시예 3. RIP3에 의한 퇴행성 관절염 발병의 조절
MMP3, MMP13, ADAMTS4 및 ADAMTS5는 퇴행성 관절염 발병에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있고, Cox2는 주로 염증에 관여하며 콜라게나제(collagenas) 및 아그레카나제(aggrecanase) 활성화에 의해 연골 기질 분해를 유발한다. 본 발명자들은 상승된 RIP3 발현과 퇴행성 관절염 병인 사이의 연관성을 조사하고자, 관절 연골 세포에서 상향 조절된 이화 인자 (MMP3, MMP13, COX2 및 ADAMTS4) 및 하향 조절 된 동화 인자 (Col2a1 및 Aggrecan) 발현을 확인하였는데(도 4A-4C; 도 5A, 5B), 이들 유전자는 모두 퇴행성 관절염에서 연골을 파괴(disrupt)하는 것으로 잘 알려져 있다. MMP3와 MMP13은 콜라게나제 활성을 가지고 있고, Adamts4 및 Adamts5는 주로 각각 아그레카나제 1 및 2로 기능한다. 본 발명자들은 Ad-Rip3 감염에 의해 아그레카나제와 콜라게나제 활성이 상향 조절된다는 것을 확인하였다 (도 4D). 연골 세포에서 확인한 사항과 일관되게, Ad-Rip3은 Ad-C에 비해 WT 마우스에서 심각한 연골 파괴 및 퇴행성 관절염 증상을 유발했으며, 면역 조직 화학 염색은 Ad-Rip3이 연골에서 RIP3 과발현을 유발하고 MMP3, MMP13 및 COX2 발현을 증가시킴을 나타내었다 (도 4F, 도 5C). 이러한 효과를 확인하기 위하여, Rip3 결핍 마우스에서 인간 퇴행성 관절염 개발에 가장 적합한 DMM-유도된 퇴행성 관절염 모델을 확립하였다. 연골 파괴, 퇴행성 관절염 발현(manifestation), 이화 인자 발현은 WT 마우스에 비해 이들 마우스에서 현저하게 감소되었다 (도 6A, 6B; 도 5D). 인간 퇴행성 관절염 연골에서 RIP3 상향 조절과 일치하게, RIP3 결핍은 DMM 유발 마우스 모델에서 퇴행성 관절염을 약화(attenuate)시키는 것으로 밝혀졌으며, 이는 RIP3가 퇴행성 관절염 발병에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.
퇴행성 관절염과 상승된 RIP3 발현은 모두 세포 사멸과 밀접한 관련이 있기 때문에, 본 발명자들은 Ad-Rip3에 감염된 연골 세포에서 세포 독성을 관찰하여 RIP3 과발현이 퇴행성 관절염 발병을 가속화하는 세포 사멸 경로를 유발하는지 여부를 조사하였다. Ad-Rip3 유도된 RIP3 과발현은 TNF 매개 세포 사멸 유도된 PARP 및 카스파제 3 절단에도 불구하고 연골 세포 형태 또는 LDH 방출의 변화 (도 5E) 또는 PARP 절단을 유도하지 않았으며 (도 5F), 이로써 세포 사멸은 RIP3 매개 퇴행성 관절염 병인과 관련이 없음을 알 수 있었다. 그러나, RIP3 과발현은 TNF 매개 신호 전달을 유도하여 (도 5G), RIP3 상향 조절이 비표준(non-canonical) MLKL 독립적 기능을 통해 퇴행성 관절염 병인을 강화할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4. RIP3 매개 퇴행성 관절염 병인 신호의 음성 조절 인자로서의 TRIP24
연골 세포 분자 패턴에서 RIP3 매개된 변화의 기본 메커니즘을 이해하기 위하여 Ingenuity Pathway Analysis를 수행함으로써, 이러한 변화를 담당하는 업스트림 조절 인자를 예측하고자 하였다. 결과적으로, 본 발명자들은 367개의 상이하게 발현되는 (differentially expressed) 유전자 전사체를 확인하였다 (도 7A). 69개의 음성 업스트림 조절 인자 중, NF-κ를 통해 TNFα 신호를 조절하고 리간드 의존적 방식으로 레티노산 수용체 알파 (RARα)와 상호 작용하여 마우스에서 RARα 매개 전사를 약화시키는 중요한 전사 코어 조절 인자인 TRIM24가 선택되었다. 다른 조직 및 질병에서 TRIM24의 기능이 보고된 연구는 있지만, 연골 및 기타 관절 조직에서의 TRIM24 조절(modulation)은 아직 알려져 있지 않다. TRIM24가 RIP3 전사의 음성 업스트림 조절 인자인지 확인하기 위하여 Ad-Trim24 shRNA를 사용하여 일차 마우스 관절 연골 세포에서의 발현을 감소시켰다 (knock-down). TRIM24 하향 조절은 Rip3 mRNA 발현을 향상시켰지만 (도 7B, 7C; 도 8A, 8B), RIP3 과발현은 TRIM24 mRNA 또는 단백질 발현에 영향을 미치지 않았다 (도 7D; 도 8C), 이는 TRIM24가 RIP3 전사의 음성 업스트림 조절 인자(negative upstream regulator)임을 나타낸다.
이후 본 발명자들은 MEF에서 TRIM24 넉-다운(knock-down)을 통한 RIP3 전사 조절이 퇴행성 관절염 관련 유전자 발현 패턴의 변화를 유도(elicit)하는지 여부를 조사하였다. Trim24 shRNA에 감염된 MEF는 Mmp3, Mmp13 및 Cox2 mRNA 발현뿐만 아니라 RIP3 및 COX2 단백질 발현을 증가시켰다(도 8D). 이와 유사하게 Ad-Trim24 shRNA에 감염된 연골 세포는 RIP3, MMP3, MMP13 및 COX2 발현을 증가시켜 (도 9A, 9B, 도 8E, 8F), RIP3가 TRIM24 매개 음성 조절의 분자 표적이 될 수 있음을 나타내었다. 마우스의 무릎 관절 조직에서 Ad-Trim24 shRNA 매개 TRIM24 녹다운은 연골 파괴, 골조직 형성(osteophyte formation), 연골하 골판 두께(subchondral bone plate thickness)(도 9C) 및 이화 인자 발현 (MMP3, MMP13 및 COX2)을 현저하게 증가시켰다 (도 9D, 도 10A). 퇴행성 관절염 질환의 발병 또는 진행에 대한 TRIM24-RIP3 축 (TRIM24-RIP3 axis)의 기여도를 명확히 하기 위해, 본 발명자들은 DMM 수술 후 마우스 퇴행성 관절염 연골 샘플에서 Trim24 및 RIP3의 시간에 따른 발현 프로파일을 조사하였다. 연골 파괴, 골조직 형성, 연골하 골경화증(subchondral bone sclerosis)과 같은 퇴행성 관절염 발현(manifestations)은 DMM 수술 후 4 ~ 6 주에 점진적으로 증가한 반면 (도 10B) Trim24는 퇴행성 관절염 발병 초기 단계에서 감소하고 RIP3 발현은 퇴행성 관절염 발병 시작(onset)에 따라 증가하였다 (도 10E, 도 9C). 따라서 TRIM24는 상승된 RIP3 발현을 음성 조절하여 퇴행성 관절염 발병을 가속화 하는 것임을 알 수 있었다.
실시예 5. CMap를 사용한 RIP3 발현과 관련된 약물의 식별
TRIM24는 전사적 공동조절 인자(transcriptional coregulator)로 신체 내에서 다양한 기능을 담당하기 때문에 TRIM24를 직접적인 약물 개발의 표적으로 삼는데에는 한계가 있다. 따라서 본 발명자들은 CMap 접근 방식으로 in silico 화합물 스크리닝을 통하여 RIP3를 억제함으로써 퇴행성 관절염 병인을 차단할 수 있는 약물을 확인하고자 하였다. 간략히 기술하자면, 본 발명자들은 CMap 데이터베이스에서 약 20,000 개의 소분자(small molecules)에 대한 약물 유도 전사체 데이터로부터 연골 세포에서 RIP3 과발현에 의해 상향 조절된 후 하향 조절되는 유전자의 우선순위를 정하여, RIP3 과발현에 대해 반대 발현 시그니처를 갖는 화합물을 검색하였다 (도 11A). 본 발명자들은 종래 퇴행성 관절염과 연관성이 알려져 있지 않은 후보 화합물 중 셀루메티닙, 네라티닙, 및 AZ-628을 동정하였다 (도 11A, 도 12A). 분자 도킹 분석에서 9 개의 화합물이 우수한 RIP3 결합 친화도 (결합 에너지 < -7.0kcal/mol)를 나타내고 5 개 화합물이 중간 정도의 RIP3 상호 작용 (결합 에너지> -7.0kcal/mol; 도 11B)을 나타내었다.
연골 세포에서 이들 화합물의 세포 독성 효과를 테스트 한 결과, AZ-628과 셀루메티닙은 2μM에서 독성을 나타내지 않았고, 네라티닙은 1μM에서 독성을 나타내지 않는 것으로 확인하였다 (도 12B). 한편, 이들 화합물이 RIP3 매개 퇴행성 관절염 병인을 억제하는지 조사해 본 결과, RIP3 과발현에 의한 MMP3, MMP13 및 COX2 발현을 용량 의존적 방식으로 감소시킴을 확인할 수 있었으며 (도 11C, 도 12C, 12D), 이들 화합물이 RIP3 활성을 억제하는 것도 확인하였다. AZ-628은 셀루메티닙 또는 네라티닙보다 더 높은 결합 친화성을 나타내며 RIP3 과발현 연골 세포에서 퇴행성 관절염 발병을 보다 효과적으로 억제하는바 (도 11C), 이에 대해 추가로 조사해 보았다. RIP3의 과발현은 자발적 자가-인산화를 초래하고 퇴행성 관절염 병인을 강화시킬 수 있다. 따라서, 퇴행성 관절염은 RIP3 키나제를 표적으로 하는 항암제, dabrafenib (DAB) 및 sorafenib을 사용하여 RIP3 키나제 활성을 억제함으로써 약화될 수 있을 것이다.
실시예 6. 퇴행성 관절염 병인에서 RIP3 키나제 저해에 따른 RIP3 활성 억제
종래 알려진 RIP3 키나제 억제제에는 유형 I (DAB 및 GSK'843), II (sorafenib, GSK'067 및 HS-1371), III 또는 분류되지 않은 (GSK'872, GSK'840) 키나제 결합 모드가 있으며, DAB 및 HS-1371은 RIP3 매개 염증성 질환의 치료 가능성을 보여준 바 있다. 이들의 RIP3 조절 능력을 조사하기 위해, DAB, GSK'872, HS-1371 및 AZ-628 의 시험관 내 결합 친화성을 조사하고((도 13A, 13B) RIP3 과발현 연골 세포에 미치는 영향을 조사하였다. 4 종류의 화합물 모두 RIP3 인산화를 거의 완전히 억제하였지만 (도 11D, 도 13C), Mmp3 및 Cox2 발현은 AZ-628 처리 된 연골 세포에서만 감소하였다 (도 11E, 도 13D). GSK'872 및 HS-1371은 AZ-628 보다 연골 세포에 더 큰 세포 독성 효과를 보였으며 (도 11F, 도 13E), 이는 이들의 결합이 RIP3의 구조적 변화를 유발하고 연골 세포 아폽토시스를 유도할 수 있음을 시사한다 (도 13E).
종합하면, 상기 데이터는 AZ-628이 RIP3 매개 퇴행성 관절염 병인을 차단할 수 있는 강력한 RIP3 키나제 억제제임을 시사한다. TRIM24-RIP3 축을 교란하는 경우 연골 세포에서 RIP3 매개 네크롭토시스에 따른 세포 사멸이 아닌 유전자 발현을 변화시킴으로써 퇴행성 관절염 발병을 가속화 한 반면, AZ-628에 의한 RIP3 키나제 활성 억제는 연골 세포 독성없이 퇴행성 관절염 관련 유전자 발현을 약화시켰다. 따라서, 연골 병리 생리학에 RIP3 키나제 활성이 연관되어 있음을 밝힌 상기 결과로부터, RIP3 발현 및 활성을 조절하는 물질을 효과 좋은 퇴행성 관절염 치료제로 활용할 수 있음을 알 수 있다 (도 11G, 도 13F).
실시예 7. 유전자 정보
본 발명에서 사용된 유전자 정보는 다음과 같다.
mouse RIPK3: UniGene ID Mm.46612
mouse Trim24 shRNA: UniGene ID Mm.41063
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION
<120> Composition for preventing or treating osteoarthritis comprising
Selumetinib
<130> P20-B223
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<223> Primer
<400> 24
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Claims (8)
- 화학식 (I)의 구조를 가지는 셀루메티닙을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염 치료 또는 예방용 조성물:
화학식 (I).
- 제1항에 있어서, 상기 퇴행성 관절염은 RIP3의 발현증가 및/또는 활성증가에 의해 진행되는 퇴행성 관절염인 것을 특징으로 하는 퇴행성 관절염 치료 또는 예방용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 퇴행성 관절염을 유발하는 유전자인 mmp3, mmp13, cox2의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 퇴행성 관절염 치료 또는 예방용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 (i) 연골 파괴 감소, (ii) 골극 형성 촉진 및 (iii) 연골하 골판 두께 감소의 방지로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 효과를 발휘하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 관절염 치료 또는 예방용 조성물.
- 다음 단계를 포함하는 RIP3의 발현증가 및/또는 활성증가에 의해 진행되는 퇴행성 관절염 치료를 위한 정보를 제공하는 방법:
(a) 퇴행성 관절염을 가지는 객체의 손상된 조직으로부터 수득된 샘플로부터 RIP3 발현양 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
(b) 상기 RIP3 발현양 또는 활성이 정상 객체 또는 동일 객체의 비손상 조직 샘플로부터 측정된 RIP3 발현양 또는 활성 정도에 비해 증가된 경우, 셀루메티닙을 퇴행성 관절염 치료 물질로 선정하는 단계. - 제5항에 있어서, 상기 샘플은 연골 조직 또는 연골 조직으로부터 분리된 체액인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 (b) 단계의 RIP3 발현양 또는 활성은 정상 객체 또는 비손상 조직에 비해 50% 이상 증가된 것을 특징으로 하는 방법.
- 화학식 (I)의 구조를 가지는 셀루메티닙을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품:
화학식 (I).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200116961A KR20220034504A (ko) | 2020-09-11 | 2020-09-11 | 셀루메티닙을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200116961A KR20220034504A (ko) | 2020-09-11 | 2020-09-11 | 셀루메티닙을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220034504A true KR20220034504A (ko) | 2022-03-18 |
Family
ID=80936586
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200116961A KR20220034504A (ko) | 2020-09-11 | 2020-09-11 | 셀루메티닙을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 조성물 |
Country Status (1)
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|---|---|
| KR (1) | KR20220034504A (ko) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170349572A1 (en) | 2012-12-21 | 2017-12-07 | Plexxikon Inc. | Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor |
| US10478506B2 (en) | 2014-04-17 | 2019-11-19 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Fucoidan nanogels and methods of their use and manufacture |
-
2020
- 2020-09-11 KR KR1020200116961A patent/KR20220034504A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170349572A1 (en) | 2012-12-21 | 2017-12-07 | Plexxikon Inc. | Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor |
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