KR20220034120A

KR20220034120A - 바이오계면활성제 및 다른 대사산물의 생산 향상을 위한 믹소박테리아 및 슈도모나스의 공배양

Info

Publication number: KR20220034120A
Application number: KR1020227001698A
Authority: KR
Inventors: 션 파머; 켄 알리벡; 야지에 첸
Original assignee: 로커스 아이피 컴퍼니 엘엘씨
Priority date: 2019-06-17
Filing date: 2020-06-15
Publication date: 2022-03-17
Also published as: EP3983552A1; EP3983552A4; CO2021017405A2; WO2020257109A1; CA3144302A1; US20220243241A1; PE20220011A1; MX2021016144A; CL2021003395A1; BR112021025673A2; AU2020296837A1; JP2022536968A

Abstract

믹소코커스 크산투스 및 슈도모나스 클로로라피스를 공동 배양하는 단계를 포함하는, 미생물 바이오계면활성제의 향상된 생산을 위한 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 바이오계면활성제는 람노지질 또는 람노지질-유사 당지질이다. 특정 구현예에서, 테르펜 및/또는 테르페노이드를 포함하는 유기 탄화수소와 같은 다른 미생물 성장 부산물이 생성된다. 해당 방법에 따라 생산된 미생물 기반 제품뿐만 아니라, 예를 들어 농업, 석유 및 가스 회수, 및 건강 관리의 용도로도 제공된다.

Description

바이오계면활성제 및 다른 대사산물의 생산 향상을 위한 믹소박테리아 및 슈도모나스의 공배양

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2019년 6월 17일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/862,180호에 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 본 명세서에 참조로서 포함된다.

박테리아, 효모 및 진균과 같은 미생물의 배양은 매우 다양한 유용한 바이오-제제의 생산에 중요하다. 미생물은 예를 들어 식품 산업, 의약품, 농업, 오일 및 가스 회수, 채굴, 환경적 복원 및 폐기물 관리에서 중요한 역할을 하지만, 미생물-기반 산물의 상업화를 제한하는 요소 중 하나는 번식 밀도 당 비용이다. 이는 미생물 및 미생물의 성장 부산물을 대규모로 생산하는 것이 특히 비용이 많이 들고 실행 불가능하기 때문이다.

미생물 계면활성제, 즉 바이오계면활성제의 관심은, 특히, 구조적 다양성, 환경 친화성, 선택성, 극단적인 조건하에서의 성능 및 다양한 산업에서의 잠재적인 "친환경" 응용으로 인해 최근 수년 동안 꾸준히 증가하고 있다.

바이오계면활성제는 미생물에 의해 생성된 구조적으로 다양한 표면-활성 물질 그룹이다. 모든 바이오계면활성제는 극성(친수성) 모이어티 및 비극성(소수성)기의 두 부분으로 구성된 양친매성 물질이다. 이러한 양친매성 구조로 인해, 바이오계면활성제는, 예를 들어 소수성 수-불용성 물질의 표면적을 증가시키고, 이러한 물질의 수분 생체이용률을 증가시키고, 박테리아 세포 표면의 특성을 변화시킬 수 있다.

바이오계면활성제는 또한 물과 오일 사이의 계면 장력을 감소시킬 수 있고, 따라서 포획된 액체를 이동하는데 요구되는 정역학적 압력을 낮춤으로써 모세관 효과를 극복할 수 있다. 계면에 축적됨으로써, 바이오계면활성제는 계면 장력을 감소시켜 용액에서 응집된 미셀 구조의 형성을 유도할 수 있다. 미셀 형성은 예를 들어 이동하는 수상에서 오일을 이동시키는 물리적 메커니즘을 제공하고 강력한 유화 및 해유화(demulsifying) 특성을 가질 수 있다. 기공을 형성하고 생물학적 막을 불안정하게 만드는 바이오계면활성제의 능력은 또한 예를 들어 해충을 방제하고, 다양한 표면에 대한 미생물 부착을 억제하고/하거나 바이오필름 형성을 방지하기 위한 항균제, 항진균제 및 용혈제로서의 사용을 허용한다. 또한, 바이오계면활성제는 생분해성이고 독성이 낮으며 재생 가능한 자원을 사용하여 경제적으로 생산할 수 있다.

낮은 독성 및 생분해성의 특성과 조합된 바이오 계면활성제는 다양한 환경 및 산업에 유용할 수 있다. 대부분의 바이오계면활성제-생산 유기체는 성장 배지에서 탄화수소 공급원의 존재에 대한 반응으로 바이오계면활성제를 생산한다. 미네랄과 pH의 농도와 같은 기타 배지 구성요소도 바이오계면활성제 생산에 상당히 영향을 미칠 수 있다.

미생물 바이오계면활성제는 예를 들어, 스타메렐라 종(Starmerella spp.)(예: S. bombicola), 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.)(예: P. aeruginosa, P. putida, P. florescens, P. fragi, P. syringae); 플라보박테리움 종(Flavobacterium spp.); 바실러스 종(Bacillus spp.)(예: B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. pumillus, B. cereus, B. licheniformis); 위커하모미세스 종(Wickerhamomyces spp.)(예: W. anomalus), 칸디다 종(Candida spp.)(예: C. albicans, C. rugosa, C, iropicalis, C. lipolytica, C. torulopsis), 사카로미세스(Saccharomyce)(예: S. cerevisiae); 슈도지마 종(Pseudozyma spp.)(예: P. aphidis), 로도코커스 종(Rhodococcus spp.)(예: R. erythropolis); 우스틸라고 종(Ustilago spp.)(예: U. maydis); 아르트로박터 종(Arthrobacter spp.); 캄필로박터 종(Campylobacter spp.); 코르니박테리움 종(Cornybacterium spp.); 및 기타를 포함하는 박테리아, 진균 및 효모와 같은 다양한 미생물에 의해 제조된다.

저분자량 당지질, 지질펩티드, 플라보지질 및 인지질을 포함하는 여러 유형의 바이오계면활성제와 지질단백질, 지질다당류-단백질 복합체 및 다당류-단백질-지방산 복합체와 같은 고분자량 중합체가 있다. 지방산의 탄화수소 사슬은 바이오계면활성제 분자의 공통 친유성 모이어티로서 작용하지만, 친수성 부분은 예를 들어 에스테르, 알코올, 카르복실레이트, 아미노산, 펩티드 및/또는 탄수화물에 의해 형성될 수 있다.

바이오계면활성제의 한 가지 중요한 유형은 람노지질(RLP)이다. RLP는 람노스 모이어티 및 3-(하이드록시알카노일옥시)알칸산 지방산 테일을 포함하는 당지질이다. 2개의 주요 부류의 람노지질, 즉 모노-람노지질 및 디-람노지질이 존재하며, 각각 1개 또는 2개의 람노오스 그룹을 갖는다. 지방산 테일의 분지 길이와 정도는 RLP 분자마다 다를 수 있다.

가장 통상적으로, RLP는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 박테리아를 사용하여 생산되지만, 녹농균은 사람, 특히 면역 체계가 손상된 사람에게 치명적일 수 있는 기회감염 병원체이다. 따라서, 녹농균의 병원성 특성은 부분적으로 RLP의 적용을 제한하는데, 이는 부분적으로 RLP를 사용하는 사람들에게 가하는 위험 때문이다.

다양한 산업에서 유용할 수 있는 부가적인 미생물 성장 부산물은 예를 들어,바이오폴리머, 산, 효소, 항생제, 항바이러스, 항진균제 및 용매를 포함한다. 그러나, 미생물-기반 산물의 상용화에 있어서 한 가지 제한 요소는 효과적인 미생물 산물을 배양하기 위한 안전하고 대규모 작업을 개발하는 데 어려움이 있다는 것이다.

미생물을 성장시키고 성장 부산물을 생산하기 위한 미생물 배양의 두 가지 원리: 침지(액체 발효); 및 표면 배양(고체 상태 발효(SSF))이 존재한다. SSF는 미강, 버개스(baggasse) 및 종이 펄프와 같은 고체 기질을 미생물 배양에 이용한다. 이러한 방법에 대한 하나의 장점은 영양소-풍부 폐기물이 기질로서 용이하게 재활용될 수 있다는 것이다. 또한, 기질은 매우 천천히 그리고 꾸준히 활용되기 때문에 동일한 기질을 장기간 발효 기간 동안 사용할 수 있다.

침지 발효는 당밀 및 영양액과 같은 자유 유동성 액체 기질을 이용한다. 생리활성 화합물은 성장 미생물에 의해 유동 액체 내로 분비될 수 있다.

미생물 및 이들의 성장 부산물은 석유, 농업 및 화장품을 비롯한 다양한 산업에서 매우 유익한 역할을 할 가능성이 있다. 그러나, 이러한 응용 분야에 필요한 람노지질 및 RLP 유사 물질과 같은 미생물-기반 산물을 대량으로 생산하기 위해서는 보다 안전하고 효율적인 방법이 필요하다.

본 발명은 미생물 바이오계면활성제 및 다른 유용한 미생물 대사물질을 생산하는 개선된 방법을 제공한다. 유리하게는, 본 발명의 방법 및 미생물-기반 산물은 환경 친화적이고, 작동 친화적이고 비용 효율적이다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 믹소박테리움(myxobacterium) 및 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.) 박테리아를 공배양하는 단계를 포함하는 하나 이상의 미생물 성장 부산물의 제조 방법을 제공한다. 유리하게는, 특정 구현예에서, 본 방법을 사용할 때 달성된 하나 이상의 성장 부산물의 총 세포 바이오매스 및/또는 총 생산량은 개별 미생물의 순수한 배양물이 배양될 때보다 더 크다.

특정 구현예에서, 상기 믹소박테리움은 M. 크산투스(M. xanthus)이고 슈도모나스(Pseudomonas)는 P. 클로로라피스(P. chlororaphis)이다. 바람직한 구현예에서, 슈도모나스(pseudomonas)는 예를 들어 P. 클로로라피스 균주 111(UCM 13-111) 또는 P. 클로로라피스 균주 306(UCM B-306)과 같이 인간에게 병원성이 아닌 균주이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 슈도모나스(pseudomonas) 균주가 이용될 수 있다.

일 구현예에서, 미생물은 소규모에서 대규모에 이르는 배양 공정을 이용하여 공배양된다. 이러한 배양 공정은 침지형 배양/발효, 고체 상태 발효(SSF), 하이브리드, 이들의 변형 및/또는 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예들에서, 배양 공정은 유가식(fed-batch) 공정이다.

일 구현예에서, 공배양은 침지 발효를 사용하여 수행된다. 일 구현예에서, SSF 및 침지 발효의 하이브리드(hybrid)가 사용되는데, 여기서 미립자 고정 담체는 액체 배양 배지에 현탁되어 세포 부착 및 바이오필름 형성을 위한 부위로서 작용한다. 이는 특히, 고체 표면 상에 향상된 성장을 나타낼 수 있는 믹소박테리아의 성장에 유용하다.

액체 성장 배지는 예를 들어 탄소, 질소, 단백질, 비타민 및/또는 미네랄의 공급원을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 영양 배지는 고농도의 하나 이상의 특정 미생물 성장 부산물의 생산을 위해 맞춤화된다. 일 구현예에서, 액체 영양 배지는 예를 들어 카놀라유와 같은 거품 방지제를 포함한다.

일부 구현예에서, 미립자 고정 담체는 액체 배양 배지가 제1 및/또는 제2 미생물로 접종되기 전, 그와 동시에, 또는 그 후에 액체 배양 배지에 현탁된다.

일 구현예에서, 고정 담체(anchoring carrier)는 박테리아 부착 및 성장을 위한 핵형성 부위의 역할을 하기에 적합한 임의의 살균된 재료일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 재료는 직경이 약 0.1 ㎛ 내지 약 5 mm 인 복수의 개별 미세 입자, 예를 들어 곡물을 포함한다. 박테리아는 입자에 부착되어 그 위에 축적되어, 박테리아-담체 덩어리를 생성한다.

고정 담체는 불활성일 수 있거나, 또는 추가적인 영양소 및/또는 미생물 접종제를 운반 및/또는 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 고정 담체는 다공성일 수 있다. 고정 담체는 합성 물질 및/또는 천연 유래 물질을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 고정 담체는, 예를 들어, 유리, 중합체(예: 폴리락트산(PLA)), 한천 또는 젤라틴으로 만들어진 볼을 포함한다. 일 구현예에서, 고정 담체는, 예를 들어, 잘게 썬 스폰지(chopped sponge)또는 수세미(loofa) 조각들일 수 있다. 일 구현예에서, 고정 담체는 종자, 너트, 콩 또는 심지어 바나나(bananas)와 같은 잘게 썬 과일 조각과 같은 식품을 포함할 수도 있다.

바람직한 구현예에서, 고정 담체는 셀룰로오스 및/또는 옥수수 분의 미세 그레인을 포함한다.

유리하게는, 고정 담체의 사용은 예를 들어 박테리아가 부착되고 축적될 수 있는 증가된 표면적으로 인하여 박테리아 바이오매스의 증가된 생산을 제공한다. 또한, 박테리아 바이오매스의 축적은 바이오계면활성제 및 기타 대사산물과 같은 유익한 성장 부산물의 생산을 증가시킬 수 있다.

일 구현예에서, 박테리아는 고정 담체 상에서 바이오필름 형태로 성장한다. 일 구현예에서, 일부 박테리아는 액체 배양 배지에서 플랑크톤 형태로 성장하고, 일부 박테리아는 고정 담체 상에서 성장한다.

일부 구현예에서, 배양 방법은 유가식(fed-batch) 배양을 이용한다. 발효 반응기는 예를 들어 카놀라유(또는 다른 소포제 용액), 탄소 공급원(예: 글리세롤), pH 조절제, 및/또는 필요에 따라 다른 추가적인 영양 공급원과 함께 공급될 수 있다. 발효 반응기의 "공급(feeding)"은, 예를 들어, 24시간, 48시간, 또는 여러 번, 예를 들어, 24시간 내지 48시간 마다 발생할 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 제1 및 제2 미생물은 원하는 효과, 예를 들어 원하는 양의 세포 바이오매스 또는 원하는 양의 하나 이상의 미생물 성장 부산물을 생성하기에 충분한 시간 기간 동안 발효 시스템에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 발효는 20℃ 내지 30℃의 온도에서 24시간 내지 5일 이상 동안 일어난다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 미생물 성장 부산물을 생성하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 성장 부산물은 하나 이상의 바이오계면활성제를 포함한다.

본 발명에 따른 바이오계면활성제는, 예를 들어 당지질, 지질펩티드, 플라보지질, 인지질, 고분자량 중합체, 지방산 에스테르, 지방산 에테르, 지질단백질, 리포폴리사카라이드-단백질 복합체, 및/또는 다당류-단백질-지방산 복합체를 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 방법은 당지질 바이오계면활성제, 예를 들어 람노지질(RLP), 트레할로스 지질, 만노실에리트리톨 지질(MEL), 셀로비오스 지질 및/또는 소포로지질(SLP)을 생산하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 5 g/L 내지 30 g/L의 당지질을 생성하는데 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 당지질은 람노지질 및/또는 RLP-유사 당지질이다.

특정 구현예에서, 예를 들어, 다른 당지질 및/또는 플라보지질과 같은 하나 이상의 유형의 바이오계면활성제가 공배양 중에 생성된다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 성장 부산물은 또한 다른 대사산물, 예를 들어 효소, 바이오폴리머, 산, 용매, 가스, 단백질, 펩티드, 아미노산, 알콜, 호르몬, 지질, 탄수화물, 항생제, 안료, 및 기타 생리활성 화합물을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 다른 대사물은 예를 들어 카로티노이드와 같은 테르펜 및/또는 테르페노이드이다.

유리하게는, 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 개별 미생물의 순수한 배양물이 배양될 때보다 더 높은 농도에서 바이오계면활성제, 테르펜 및/또는 테르페노이드 및/또는 다른 성장 부산물의 생성을 초래할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명은 본 방법에 따라 생성된 미생물-기반 산물 뿐만 아니라, 예를 들어 개선된 오일 생산, 생물학적 정화(bioremediation) 및 채굴(mining); 폐기물 처분 및 처리; 식물 건강 및 생산성 증진; 및 토양 건강 개화 및/또는 회복 등에서의 그의 용도를 제공한다.

미생물-기반 산물은 제1 및/또는 제2 미생물 및/또는 이들의 성장 부산물 뿐만 아니라 잔류 성장 배지, 미립자 고정 담체 및/또는 영양소를 포함하는, 본 방법에 따라 생성된 전체 배양물을 포함할 수 있다.

미생물은 살아있는, 생존할 수 있거나 또는 비활성 형태일 수 있다. 이들은 바이오필름, 영양 세포, 포자 및/또는 이들의 조합의 형태일 수 있다. 특정 구현예에서, 미생물이 존재하지 않으며, 여기서 상기 조성물은 미생물 성장 부산물, 예를 들어, 배양물로부터 추출되고 선택적으로 정제된 바이오계면활성제를 포함한다.

본 발명은 미생물 및 이들의 성장 부산물을 생산하는 방법을 제공한다. 유리하게는, 본 발명의 미생물-기반 산물 및 방법은 환경 친화적이고, 작동 친화적이고 비용 효율적이다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 미생물 성장 부산물의 향상된 생산을 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 믹소박테리움 및 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.)의 균주를 공배양하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 성장 부산물은 람노지질(rhamnolipids)및/또는 플라보지질과 같은 바이오계면활성제를 포함한다.

성장 부산물은 또한 다른 대사산물, 예를 들어 효소, 바이오폴리머, 산, 용매, 가스, 단백질, 펩티드, 아미노산, 알코올, 호르몬, 지질, 탄수화물, 항생제 및 기타 유기 및/또는 생리활성 화합물을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 다른 대사물은 예를 들어 카로티노이드와 같은 테르펜 및/또는 테르페노이드이다.

유리하게는, 특정 구현예에서, 본 방법에 따라 달성된 하나 이상의 성장 부산물의 총 세포 바이오매스 및/또는 총 생산량은 개별 미생물의 순수한 배양물이 자체적으로 배양되는 경우보다 더 클 수 있다.

선택된 용어 정의

본원에 사용된 "바이오필름"은 박테리아와 같은 미생물의 복합 응집체이며, 상기 세포는 세포 외 다당류 매트릭스를 사용하여 서로 부착되거나 및/또는 표면에 부착된다. 바이오필름 내의 세포는 동일한 유기체의 플랑크톤 세포와 생리학적으로 구별되며, 단일 세포는 액체 배지에서 뜨거나 유영할 수 있다.

본원에 사용된 "공배양(co-cultivation)"은 단일 발효 시스템에서의 1종 이상의 미생물 배양을 의미한다. 일부 예에서, 미생물은 적대적으로 또는 공생적으로 상호작용하여, 원하는 효과, 예를 들어 원하는 양의 세포 바이오매스 성장 또는 원하는 양의 대사산물 생성을 초래한다. 일 구현예에서, 이러한 적대적 또는 공생적 관계는 향상된 효과를 초래할 수 있으며, 예를 들어, 미생물 중 하나만 단독으로 배양함으로써 얻어지는 것과 비교할 때 원하는 효과가 확대될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 하나의 미생물, 예를 들어, 믹소코커스 종(Myxococcus sp.)은 다른 미생물, 예를 들어 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.)에 의한 바이오계면활성제 또는 기타 대사산물의 생산을 위한 자극제로서 작용할 수 있다.

본원에 사용된 "증진시키는 것(enhancing)"은 개선 및/또는 증가하는 것을 의미한다.

본원에 사용된 "발효"는 제어된 조건하에서 세포의 배양 또는 성장을 의미한다. 상기 성장은 호기성 또는 혐기성일 수 있다.

본원에 사용된 "분리(isolated)" 또는 "정제된(purified)" 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 단백질, 소분자(예를 들어, 하기에 기술된 것), 또는 다른 화합물은 세포 물질, 유전자 또는 유전자 서열, 및/또는 자연에서 관련되는 아미노산 또는 아미노산 서열과 같은 다른 화합물이 실질적으로 없다. 정제되거나 또는 분리된 균주는 그것이 자연에 존재하고/거나 그것이 재배되었던 환경에서 제거된다. 따라서, 분리된 균주는 예를 들어, 생물학적으로 순수한 배양물, 또는 포자(또는 균주의 다른 형태)로서 존재할 수 있다.

특정 구현예에서, 정제된 화합물은 관심 화합물의 60 중량% 이상이다. 바람직하게는, 제제는 관심 화합물을 약 75 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 90 중량% 이상, 가장 바람직하게는 99 중량% 이상이다. 예를 들어, 정제된 화합물은 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99%, 또는 100%(w/w)의 원하는 화합물을 포함한다. 순도는 임의의 적절한 표준 방법, 예를 들면, 컬럼 크로마토그래피, 박막 크로마토그래피, 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)분석에 의해 측정된다.

본원에 사용된 "미생물-기반 조성물"은 미생물 또는 다른 세포 배양물의 성장 결과로서 생성된 성분을 포함하는 조성물을 의미한다. 따라서, 미생물-기반 조성물은 미생물 자체 및/또는 미생물 성장의 부산물을 포함할 수 있다.

미생물은 영양 상태 또는 포자 형태, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 미생물은 플랑크톤 형태 또는 바이오필름 형태(biofilm form)또는 이들의 혼합물일 수 있다. 성장 산물은 예를 들어 대사산물(예: 바이오계면활성제), 세포막 성분, 발현된 단백질 및/또는 다른 세포 성분일 수 있다. 미생물은 손상되거나 용해되지 않을 수 있다. 세포 또는 포자는, 예를 들어, 조성물의 밀리리터 당 1 x 10⁴, 1 x 10⁵, 1 x 10⁶, 1 x 10⁷, 1 x 10⁸, 1 x 10⁹, 1 x 10¹⁰, 1 x 10¹¹ 또는 1 x 10¹² 이상의 농도로 존재하거나 존재하지 않을 수 있다.

본원에 사용된 "미생물-기반 산물"은 바람직한 결과를 달성하기 위해 실제에 적용될 산물이다. 상기 미생물-기반 산물은 상기 배양 공정으로부터 수확되는 미생물-기반 조성물일 수 있다. 대안적으로, 미생물-기반 산물은 첨가된 추가 성분들을 포함할 수 있다. 이러한 추가 성분들은, 예를 들어, 안정화제, 완충제, 담체(예: 물 또는 염 용액), 추가 미생물 성장을 지원하기 위해 첨가된 영양소, 비영양소 성장 촉진제 및/또는 이들이 적용되는 환경에서 미생물 및/또는 조성물의 추적을 용이하게 하는 제제를 포함한다. 미생물-기반 산물은 또한 미생물-기반 조성물의 혼합물을 포함할 수 있다. 미생물-기반 산물은 또한 여과, 원심분리, 용해, 건조, 정제 등과 같은 일부 방식으로 처리된 미생물-기반 조성물의 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 "감소하다(reduces)"는 적어도 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100% 의 음(-)의 변경을 의미한다.

본원에 사용된 "계면활성제"는 두 가지 액체 사이, 액체와 기체 사이, 또는 액체와 고체 사이의 표면 장력(또는 계면 장력)을 낮추는 화합물을 의미한다. "바이오계면활성제"는 살아있는 세포(living cell)에 의해 생성되는 표면 활성 물질이다.

"구비하는(including)" 또는 "함유하는(containing)"과 동의어인 이행적인 용어 "포함하는(comprising)"은 포괄적(inclusive)이거나 개방형(open-ended)이며 추가의 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 대조적으로, 이행구 "구성된(consisting of)"은 청구범위에 명시되지 않은 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"이라는 이행구는 청구된 발명의 "기본적이고 새로운 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는" 특정 재료 또는 단계에 대한 청구 범위를 제한한다. 용어 "포함하는(comprising)"의 사용은 인용된 구성요소(들)로 본질적으로 이루어지거나 본질적으로 이루어질 수 있는 다른 구현예를 고려한다.

구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다. 구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않은 한, 본 명세서에 사용된 용어 "a", "and" 및 "the"는 단수 또는 복수로 이해된다.

구체적으로 언급되지 않거나 문맥상 명백하지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "약(about)"은 예를 들어 평균의 2개 표준 편차 내에서 당업계의 정상 허용 범위 내로 이해된다. 약(About)은 상술한 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 이내로 이해될 수 있다.

여기에서 변수의 정의에 있는 화학 그룹 목록의 인용은 그 변수를 임의의 단일 그룹 또는 나열된 그룹의 조합으로 정의하는 것을 포함한다. 여기에서 변수 또는 양태에 대한 구현예의 언급은 임의의 단일 구현예로서 또는 임의의 다른 구현예 또는 이의 부분과 조합하여 그 구현예를 포함한다.

본원에 제공된 임의의 조성물 또는 방법은 본원에 제공된 임의의 다른 조성물 및 방법 중 하나 이상과 조합될 수 있다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다. 여기에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전체가 참고로 여기에 포함된다.

공배양 방법

본 발명은 바이오매스(예: 살아있는 또는 비활성 세포 물질), 세포외 대사산물 및/또는 세포내 성분의 생산을 위한 물질 및 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 발효 반응기에서 2종 이상의 상이한 미생물을 공배양하는 것을 포함하는, 하나 이상의 미생물 성장 부산물을 생산하기 위한 개선된 방법을 제공한다.

유리하게는, 본 발명의 공배양 방법을 사용할 때 달성되는 하나 이상의 성장 부산물의 총 세포 바이오매스 및/또는 총 생산량은 개별 미생물의 배양물이 개별적으로 배양되는 경우에 비해 더 클 수 있다.

보다 구체적으로, 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 미생물 성장 부산물의 향상된 생산을 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 이상의 성장 부산물의 성장 및 생성에 유리한 조건 하에 침지된 발효 반응기에서 제1 미생물 및 제2 미생물을 공배양하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 미생물은 믹소박테리움 이고, 제2 미생물은 슈도모나스(Pseudomonas)의 균주이다.

미생물은 소규모에서 대규모에 이르는 배양 시스템을 이용하여 공배양된다. 이러한 배양 시스템은 침지형 배양/발효, 고체 상태 발효(SSF), 및 하이브리드, 이들의 변형 및/또는 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

특정 바람직한 구현예에서, 미생물을 공배양하고/하거나 미생물 성장 부산물을 생산하기 위한 방법은 액체 영양 배지를 포함하는 발효 시스템에 제1 미생물을 접종하는 단계 및 발효 시스템에 제2 미생물을 접종하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 미생물은 믹소코커스 종(Myxococcus spp.) 박테리아이고, 제2 미생물은 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.)의 균주이다. 더욱 바람직하게는, 일 구현예에서, 믹소코커스는 M 크산투스(M. xanthus)이고, 슈도모나스(Pseudomonas)는 P. 클로라피스(P. chlorophis)의 균주이다. 바람직하게는, 상기 균주는 인간 및/또는 동물에 대해 병원성이 아니다.

일 구현예에서, P. 클로라피스(P. chlorophis)의 균주는 P. 클로로라피스 아종(P. chlororaphis subsp.) 아우레오파시엔스(aureofaciens) 균주 306(Ukrainian Collection of Microorganisms (UCM) deposit number UCM B-306 (IMV B-7096), no. 2687)이다.

일 구현예에서, P. 클로라피스(P.chlorophis)의 균주는 P. 클로로라피스 아종(P. chlororaphis subsp.) 아우레오파시엔스(aureofaciens) 균주 111(UCM deposit number UCM B-l 11 (IMV B-7097), no. 21 16)이다.

특정 구현예에서, 공배양 방법은 침지 발효를 이용한다. 특정 구현예에서는, 고체 상태 발효 및 침지 발효의 하이브리드(hybrid)가 사용되는데, 여기서 미립자 고정 담체는 세포 부착 및/또는 바이오필름 형성을 위한 부위로서 작용하도록 액체 배양 배지에 현탁된다. 이는 특히, 고체 표면 또는 다른 담체 상에서 향상된 성장을 나타낼 수 있는 믹소박테리아의 성장에 특히 유용하다.

본 발명에 따라 사용되는 미생물 성장 용기는 산업적 사용을 위한 임의의 발효기 또는 배양 반응기일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 용기는 기능성 제어/센서를 가질 수 있거나, 또는 기능적 제어/센서들에 연결되어 pH, 산소, 압력, 온도, 교반기 샤프트 전력, 습도, 점도 및/또는 미생물 밀도 및/또는 대사산물 농도 등과 같은, 공배양 공정에서 중요한 인자들을 측정할 수 있다.

추가적인 구현예에서, 용기는 또한 용기 내의 미생물의 성장(예: 세포 수 및 성장 상의 측정)을 모니터링할 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 CFU 계수 및/또는 순도 측정을 수행하기 위해 발효 전반에 걸쳐 임의의 지점에서 샘플이 채취될 수 있다. 일 구현예에서, 발효 시작시에 샘플링이 수행되고, 발효 전반에 걸쳐 하루에 여러 번(예: 하루에 2 회) 수행된다.

일부 구현예에서, 배양 방법은 유가식(fed-batch) 배양을 이용한다. 발효 반응기는 예를 들어 카놀라유(또는 다른 소포(anti-foam)/탈포(de-forming) 용액), 탄소 공급원(예: 글리세롤), pH 조절제, 및/또는 필요에 따라 다른 추가적인 영양 공급원과 함께 공급될 수 있다.

일 구현예에서, 발효 반응기는 공급 용기에 연결된다. 공급 용기는 바람직하게는 액체 영양 배지 및/또는 공급(예: 이송 또는 보충)을 위한 다른 물질을 발효 반응기에 보유한다. 발효 반응기의 "공급(Feeding)"은 배양 전체에 걸쳐 연속적으로 또는 지정된 시간 지점에서 일어날 수 있다.

특정 구현예에서, 지정된 공급 시점은 배양 개시 후 약 12 시간, 24 시간, 36 시간, 48 시간 또는 52 시간이다. 특정 구현예에서, 영양 배지 및/또는 다른 공급 물질이 반응기 내에 공급되는 다수의 시점, 예를 들어, 배양 전반에 걸쳐 6시간마다, 12시간마다, 24시간마다, 36시간마다, 또는 48시간마다 등의 시점이 있다.

일 구현예에서, 발효 반응기는 거품 수집 용기에 연결된다. 영양 배지 및/또는 영양물(feed)에 소포/탈포 용액을 사용함에도 불구하고, 일부 양의 거품이 발효 공정에 의해 여전히 자연적으로 생성된다. 일부 구현예에서, 거품은 반응기로부터 자동 및/또는 수동으로 추출되고 거품 수집 용기 내에 수집된다. 일부 구현예에서, 수집된 거품은 추출되고 선택적으로 정제될 수 있는 바이오계면활성제와 같은 미생물 성장 부산물을 포함한다.

일 구현예에서, 액체 영양 배지는 탄소 공급원을 포함한다. 탄소 공급원 캠은 글루코스, 수크로스, 락토오스, 프럭토스, 트레할로스, 만노오스, 만니톨 및/또는 말토스와 같은 탄수화물; 아세트산, 푸마르산, 시트르산, 프로피온산, 말산, 말론산, 및/또는 피루브산 같은 유기산; 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜타놀, 헥산올, 이소부탄올, 및/또는 글리세롤과 같은 알코올류; 대두유, 미강유, 올리브유, 참기름, 카놀라유 및/또는 아마인유와 같은 유지류; 분말 당밀 등을 포함하며, 이들 탄소원은 독립적으로 또는 2 종 이상의 조합으로 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 액체 영양 배지는 질소 공급원을 포함한다. 질소 공급원은 예를 들어, 질산칼륨, 질산암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄, 암모니아, 요소 및/또는 염화암모늄일 수 있다. 이러한 질소 공급원은 독립적으로 또는 둘 이상의 조합으로 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 하나 이상의 무기 염이 또한 액체 영양 배지에 포함될 수 있다. 무기염은, 예를 들어, 인산이수소칼륨, 인산일칼륨, 인산수소이칼륨, 인산수소이나트륨, 염화칼륨, 황산마그네슘, 염화마그네슘, 황산철(제1철), 염화철, 황산망간, 염화망간, 황산아연, 염화납, 황산구리, 염화칼슘, 탄산칼슘, 질산칼슘, 황산마그네슘, 인산나트륨, 염화나트륨 및/또는 탄산나트륨을 포함할 수 있다. 이러한 무기염은 독립적으로 또는 둘 이상의 조합으로 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 미생물에 대한 성장 인자 및 미량 영양소가 배지에 포함된다. 이는 특히 모든 비타민을 생산할 수 없는 미생물을 성장시키는 경우에 특히 바람직하다. 철, 아연, 구리, 망간, 몰리브덴 및/또는 코발트와 같은 미량 원소를 포함하는 무기 영양소가 또한 배지에 포함될 수 있다. 또한, 비타민류, 필수 아미노산, 단백질 및 미량원소의 공급원은 예를 들어, 펩톤, 효모 추출물, 감자 추출물, 쇠고기 추출물, 대두 추출물, 바나나 껍질 추출물 등, 또는 정제된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질의 생합성에 유용한 것들과 같은 아미노산도 포함될 수 있다.

미립자 고정 담체는 박테리아 부착 및 성장을 위한 핵형성 부위의 역할을 하기에 적합한 임의의 재료일 수 있다. 일부 구현예에서, 재료는 직경이 약 0.1 ㎛ 내지 약 5 mm, 4 mm, 3 mm, 2 mm, 1 mm 또는 0.5 mm인 복수의 개별적인 조각, 입자 및/또는 그레인을 포함한다. 박테리아는 그 위에 부착되고 그 위에 축적되어 박테리아-담체 덩어리(masses)를 생성한다.

일 구현예에서, 고정 담체는 알긴산 나트륨 비드를 포함한다. 상기 비드는 예를 들어 1% 내지 5%, 또는 2% 내지 3% 의 무균 알긴산 나트륨 및 선택적으로 영양소 및/또는 박테리아 접종제를 포함하는 용액을 살균 1% 내지 7%, 또는 2% 내지 5% 염화칼슘 용액에 연속적으로 첨가함으로써 형성할 수 있다.

일 구현예에서, 고정 담체는, 예를 들어, 유리, 중합체(예: 폴리락트산(PLA)), 한천 또는 젤라틴으로 만들어진 볼을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 고정 담체는, 예를 들어, 잘게 자른 스폰지(chopped sponge)또는 수세미(loofa)의 조각들일 수 있다. 일 구현예에서, 고정 담체는 식료품, 예를 들어, 종자, 견과류, 콩 또는 심지어 바나나(bananas)와 같은 잘게 썬 과일을 포함할 수도 있다.

바람직한 구현예에서, 고정 담체는 셀룰로오스 및/또는 옥수수 분의 미세 그레인을 포함한다. 일 구현예에서, 미세 그레인(fine grain)의 사용은 보다 큰 입자(예: 5 mm 초과)에 비해 바람직하고, 이는 공정의 스케일링 업을 용이하게 하기 때문이다.

유리하게는, 고정 담체의 사용은 예를 들어 박테리아가 부착되고 축적될 수 있는 증가된 표면적에 기인하여 박테리아 바이오매스의 증가된 생산을 제공한다. 또한, 바이오계면활성제와 같은 유용한 성장 부산물의 생산에 있어서 박테리아 바이오매스의 축적이 증가될 수 있다.

일 구현예에서, 박테리아는 고정 담체 상의 바이오필름 형태로 성장한다. 일 구현예에서, 일부 박테리아는 플랑크톤 형태로 액체 배양 배지에서 성장하며, 일부 박테리아는 고정 담체 상에서 성장한다.

일부 구현예에서, 액체 배양 배지는 고정 담체의 현탁 전에 또는 그와 동시에 미생물로 접종된다. 일부 구현예에서, 고정 담체는 액체 배양 배지에 현탁되기 전에 제1 및/또는 제2 미생물로 미리 접종된다.

공배양 방법은 성장 배양물에 산소화(oxygenation)를 추가로 제공할 수 있다. 일 구현예는 공기의 느린 움직임을 이용하여 저산소 함유 공기를 제거하고 산소화된 공기를 도입한다. 산소화된 공기는 액체의 기계적 교반을 위한 임펠러 및 액체로의 산소 용해를 위해 액체에 기포를 공급하기 위한 공기 스파저를 포함하는 메커니즘을 통해 매일 보충된 주변 공기일 수 있다. 특정 구현예에서, 용존 산소(DO) 수준은 공기 포화의 약 25% 내지 약 75%, 약 30% 내지 약 70%, 약 35% 내지 약 65%, 약 40% 내지 약 60%, 또는 약 50% 로 유지된다. 공기 유동은, 예를 들어, 약 0.5 v/m 내지 약 2.0 v/m, 또는 약 1.0 v/m 내지 약 1.5 vvm 으로 공급될 수 있다.

일부 구현예에서, 공배양 방법은 오염으로부터 보호하기 위해 공배양 공정 전 및/또는 공정 동안 액체 배지에 산 및/또는 항균제를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 접종 전에, 액체 배양 배지의 성분을 임의로 살균시킬 수 있다. 사용되는 경우, 고정 담체는 또한 바람직하게는, 예를 들어, 오토클레이브 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 살균된다. 또한, 배지의 제조에 사용되는 물은 오염을 방지하기 위해 여과될 수 있다.

일 구현예에서, 액체 영양 배지의 살균은 액체 배양 배지의 성분들을 약 85℃ 내지 100℃의 온도에서 물에 위치시킴으로써 달성될 수 있다. 일 구현예에서, 살균은 1:3(w/v)의 비율로 1% 내지 3%의 과산화수소에 성분들을 용해시킴으로써 달성될 수 있다.

일 구현예에서, 공배양에 사용되는 장비는 살균 상태이다. 반응기/용기와 같은 배양 장치는 살균 유닛, 예를 들어 오토클레이브(autoclave)로부터 분리될 수 있지만 이에 연결되어 있다. 배양 장치는 또한 접종을 시작하기 전에 현장에서 살균하는 살균 유닛을 가질 수 있다. 공기는 당해 기술분야에서 공지된 방법에 의해 살균될 수 있다. 예를 들어, 주변 공기는 용기에 유입되기 전에 적어도 하나의 필터를 통과할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 배지는 저온살균(pasterized)되거나, 선택적으로 열이 전혀 가해지지 않을 수 있으며, 여기서 pH 및/또는 낮은 수분 활성의 사용은 원하지 않는 미생물 성장을 제어하는데 이용될 수 있다.

혼합물의 pH는 관심 미생물에 적합해야 한다. 일부 구현예에서, pH는 약 2.0 내지 약 11.0, 약 3.0 내지 약 10.0, 약 4.0 내지 약 9.0, 약 5.0 내지 약 8.0, 또는 약 6.0 내지 약 7.0 이다. 일 구현예에서, pH는 약 6.8이다. 완충제와 탄산염 및 포스페이트와 같은 pH 조절제는 pH를 바람직한 값 근처로 안정화시키는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 염기성 용액(예: 15% 내지 25%, 또는 20% NaOH 용액)은 액체 영양 배지에 포함되고/되거나 배양 시에 반응기에 공급되어 배양물의 pH 를 자동으로 유지 및/또는 조절한다. 금속 이온이 고농도로 존재하는 경우, 액체 배지 중에서 킬레이트제의 사용이 필요할 수 있다.

일 구현예에서, 미생물의 공배양 방법은 약 5℃ 내지 약 100℃ , 약 15℃ 내지 약 60℃, 약 20℃ 내지 약 45℃, 또는 약 24℃ 내지 약 30℃에서 수행된다. 일 구현예에서, 공배양은 일정한 온도에서 연속적으로 수행될 수 있다. 다른 구현예에서, 공배양은 온도 변화에 영향을 받을 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 제1 및 제2 미생물은 원하는 효과, 예를 들어 원하는 양의 세포 바이오매스 또는 원하는 양의 하나 이상의 미생물 성장 부산물을 생성하기에 충분한 시간 기간 동안 발효 시스템에서 배양될 수 있다. 바이오매스 함량은, 예를 들어 5 g/L 내지 180 g/L 이상, 또는 10 g/L 내지 150 g/L 일 수 있다.

일부 구현예에서, 발효는 24시간 내지 1주, 약 4일 내지 6일, 또는 약 5일 동안 일어난다. 미생물에 의해 생성된 미생물 성장 부산물(들)은 미생물에 보유되거나 성장 배지로 분비될 수 있다. 특정 구현예에서, 성장 부산물은 배양물의 상부에서 거품 층(foam layer)형태로 제조된다.

또 다른 구현예에서, 미생물 성장 부산물을 생산하는 방법은 관심 미생물 성장 부산물을 추출, 농축 및/또는 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 대안적으로, 미생물 성장 부산물은, 정제가 수행되지 않는, 미정제 형태로 이용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 성장 배지는 미생물 성장 부산물의 활성을 안정화시키는 화합물을 함유할 수 있다.

상기 방법은 회분식(batch), 준연속(quasi-continuous), 연속 공정(continuous process), 또는 유가식(fed-batch)공정으로 수행될 수 있다.

일 구현예에서, 모든 거품, 영양 배지, 세포 및/또는 박테리아-담체 덩어리는 공배양 완료시(예: 원하는 세포 밀도, 또는 대사체의 양을 달성하기 위해) 제거된다. 나머지 세포 덩어리는 재활용 및/또는 가수분해되어, 세포 내에 존재하는 임의의 잔류 화합물(leftover compound)을 얻을 수 있다. 이러한 회분식 절차에서, 제1 회차의 수확(harvesting)시 완전히 새로운 회차(batch)가 개시된다.

일 구현예에서, 공정은 유가식(fed-batch)공정이며, 여기서 특정 영양 공급원 및/또는 기타 물질이 영양 배지를 보충하고/하거나 공정의 효율을 증가시키기 위하여 특정 시점에 반응기에 공급된다. 전체 회차(batch)는 배양 사이클 말미에 수확되고, 제1 회차(batch)의 수확시 완전히 새로운 회차(batch)가 개시된다.

일 구현예에서, 상기 공정은 연속 또는 준-연속 공정이며, 관심 산물이 배양물, 예를 들어 공배양 시 형성되는 거품 및/또는 액체 영양 배지로부터 수집된다. 바람직한 구현예에서, 거품 및/또는 배지는 선택적인 pH 측정기를 갖는 수집 용기 내에 위치된다. 살아있는 세포를 갖는 바이오매스 및/또는 접종된 고정 담체는 접종제로서 발효 반응기에 남아 있고, 영양 배지는 예를 들어, 공급 탱크로부터 신선한 영양 배지로 보충되어, 미생물 성장 및 대사산물의 생산을 계속한다.

일 구현예에서, 거품은 1시간 내지 24시간마다, 격일로 또는 2일 내지 7일마다 일정한 기준으로 추출될 수 있다. 다른 구현예에서, 거품은 특정 부피에 도달하면 추출될 수 있다. 제거되는 조성물은 무세포 거품 또는 배양액(broth)일 수 있고/있거나 일부 세포를 포함할 수 있다.

배양 시스템으로부터 수집된 거품 및/또는 배양액은 미생물 성장 부산물을 추출하기 위해 세척 및/또는 원심분리에 의해 처리될 수 있다. 선택적으로, 성장 부산물을 저장, 정제 및/또는 미정제 형태로 직접 사용할 수 있다.

일 구현예에서, 사용되는 경우, 고정 담체의 일부 또는 전부를 배양물로부터 수확하고, 예를 들어, 낮은 농도(예: 1 내지 2%)의 에탄올을 사용하여 세척할 수 있다. 그 후, 생성된 액체를 원심분리하여 성장 부산물 및 세포 덩어리를 분리한다.

유리하게는, 본 발명의 공배양 방법을 사용할 때 달성된 하나 이상의 성장 부산물의 총 세포 바이오매스 및/또는 총 생산량은 개별 미생물의 순수한 배양물이 자체적으로 배양되는 경우에 비해 더 클 수 있다.

특정 구현예에서, 본 방법에 따라 달성되는 총 세포 바이오매스는 제1 및 제2 미생물이 개별적으로 배양될 때보다 적어도 0.01%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 그 이상 더 클 수 있다.

특정 구현예에서, 본 방법에 따라 생성된 성장 부산물의 총 농도는 제1 및 제2 미생물이 개별적으로 배양될 때보다 적어도 0.01%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 그 이상 더 클 수 있다.

미생물

본 발명의 시스템 및 방법에 따라 성장된 미생물은, 예를 들어, 박테리아, 효모 및/또는 진균을 포함할 수 있다. 이들 미생물은 천연 또는 유전자 변형된 미생물일 수 있다. 예를 들어, 미생물은 특정 유전자로 형질 전환되어 특정 특성을 나타낼 수 있다. 미생물은 또한 원하는 균주의 돌연변이체일 수 있다.본원에 사용된 "돌연변이체(mutant)"는 참조 미생물의 균주, 유전자 변이체 또는 하위 유형을 의미하며, 여기서 돌연변이체는 참조 미생물에 비해 하나 이상의 유전자 변형(예: 점 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 결실, 복제, 프레임 시프트 돌연변이 또는 반복 확장)을 갖는다. 돌연변이체를 만드는 절차는 미생물학 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, UV 돌연변이 유발 및 니트로소구아니딘이 이 목적을 위하여 광범위하게 사용된다.

바람직한 구현예에서, 미생물은 그람-양성 및 그람-음성 박테리아를 포함하는 박테리아이다. 특정 구현예에서, 제1 미생물은 믹소박테리아(myxobacteria)로부터 선택된다. 믹소박테리아(myxobacteria)는 집단으로 또는 떼로 사는 포식성 박테리아이다. 이러한 떼는 복합 바이오필름과 자실체(fruiting body) 구조를 형성할 수 있고, 이는 점액포자(myxopospores)를 함유하는 단순 또는 분지형 집합체이다. 포식하는 동안 박테리아는 효소, 항생제 및 기타 2차 대사산물을 포함한 포식성 분자를 분비하며, 여기에는 예를 들어 바이오계면활성제가 포함될 수 있다.

믹소박테리아는, 예를 들어 믹소코커스 종(Myxococcus spp.), 스티그마텔라 아우란티아카(Stigmatella aurantiaca), 소란기움 셀룰로섬(Sorangium cellulosum), 미니시스티스 로세아(Minicystis rosea) 및 콘드로마이세스 크로카투스(Chondromyces crocatus)를 포함한다.

바람직한 구현예에서, 믹소박테리아는 예를 들어, M. xanthus, M. fulvus, M. flavescens, M. macrosporus, M. stipitatus, M. virescens, M. coralloides, 및 M. disciformis로부터 선택된 믹소코커스 종(Myxococcus spp.) 박테리아이다. 더 바람직하게는, 믹소코커스는 M. xanthus 이다.

특정 구현예에서, 제2 미생물은 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.) 박테리아 로부터 선택된다. 바람직하게는, 슈도모나스(Pseudomonas)는 인간 또는 동물에 대해 병원성이 없는 균주이다.

슈도모나스 속(Pseudomonas genus)은 일반적으로 호기성 조건에서 성장하는 그람 음성균(Gram-negative bacteria)을 포함한다. 일부는 사람(예: P. aeruginosa) 또는 식물(예: P. putida)에 대해 병원성이지만, 다른 것은 식물(예: P. fluorescens)에서의 성장을 촉진할 수 있다. 대부분의 슈도모나스는 바이오필름을 형성하여, 특히 항생제에 대해 내성을 가지며, 감염 경우에 치료하기가 어렵다. 그러나, 많은 슈도모나스 종은, 예를 들어, 바이오계면활성제를 포함하는 유용한 성장 부산물을 생성할 수 있다.

일 구현예에서, P. 클로라피스(P. chlorophis)의 균주는 P. 클로라피스 아종 (P. chlororaphis subsp.) 아우레오파시엔스(aureofaciens) "균주 306"(Ukrainian Collection of Microorganisms (UCM) deposit number UCM B-306 (IMV B-7096), no. 2687)이다. 일 구현예에서, P. 클로라피스(P. chlorophis)의 균주는 P. 클로라피스 아종(P. chlororaphis subsp.) 아우레오파시엔스(aureofaciens) "균주 111" (UCM deposit number UCM B-l 1 1 (IMV B-7097), no. 21 16)이다.

특정 구현예에서, 제1 및 제2 미생물 이외에 하나 이상의 추가의 미생물이 포함된다. 일부 구현예에서, 추가의 미생물(들)은 제2 미생물로서 사용되는 것 이외의 슈도모나스 균주이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 균주 306 및 균주 111은 둘 다 제1 미생물과 공배양된다.

바람직한 구현예에서, M. 크산투스(M. xanthus) 및 P. 클로라피스(P. chlorophis)의 균주는 본 발명의 방법에 따라 공배양된다. 유리하게는, 일부 구현예에서, 이들 2 개의 균주의 공배양으로부터 세포 바이오매스는 개별 미생물의 순수한 배양물이 배양되는 경우보다 더 크다. 또한, 일부 구현예에서, 공배양에서 바이오계면활성제 및/또는 다른 대사산물의 생산은 개별 미생물의 순수한 배양물이 사용될 때보다 더 크다.

특정 구현예에서, 성장 부산물 및/또는 대사산물의 이러한 향상된 생산은 공배양에 의해 발생되는데, 여기서 경쟁 미생물의 존재가 예를 들어 방어 분자 및/또는 자가-성장 촉진제의 향상된 생산을 유도한다. 특정 구현예에서, 이들은 바이오계면활성제 및/또는 테르펜/테르페노이드(terpene/terpenoids)이다.

미생물 성장 부산물

본 발명의 방법 및 시스템은 하나 이상의 유용한 미생물 성장 부산물을 포함하는 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 성장 부산물은 하나 이상의 바이오계면활성제이다. 본 발명에 따른 바이오계면활성제는, 예를 들어 당지질, 지질펩티드, 플라보지질, 인지질, 지방산 에스테르, 지방산 에테르, 지질단백질, 지질다당류-단백질 복합체, 및/또는 다당류-단백질-지방산 복합체를 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 바이오계면활성제는 람노지질(RLP) 또는 유사한 당지질 바이오계면활성제이다. 람노지질은 글리코실 헤드 그룹(즉, 람노스)모이어티, 및 3-(하이드록시알카노일옥시)알칸산(BAA) 지방산 테일, 예컨대 3-하이드록시데칸산을 포함한다. 2가지 주요 부류의 람노지질, 즉 모노- 및 디-람노지질이 존재하며, 이는 각각 1개 또는 2 개의 람노스 모이어티를 포함한다. HAA모이어티는 예를 들어 성장 배지 및 환경 조건에 따라 길이 및 분지의 정도에 따라 변할 수 있다.

일부 구현예에서, 바이오계면활성제는 람노지질(RLP) 또는 유사한 당지질 바이오계면활성제이다. 람노지질은 글리코실 헤드 그룹(즉, 람노스)모이어티, 및 3-(하이드록시알카노일옥시)알칸산(BAA) 지방산 테일, 예컨대 3-하이드록시데칸산을 포함한다. 2가지 주요 부류의 람노지질, 즉 모노- 및 디-람노지질이 존재하며, 이는 각각 1개 또는 2 개의 람노스 모이어티를 포함한다. HAA모이어티는 예를 들어 성장 배지 및 환경 조건에 따라 길이 및 분지의 정도에 따라 변할 수 있다.

(1)

상기 식에서, m 은 2, 1 또는 0 이고,

n 은 1 또는 0 이고,

R¹ 과 R²는 서로 독립적으로 2개 내지 24개, 바람직하게는 5개 내지 13개의 탄소 원자를 갖는 상이한 유기 작용기이고, 특히 불포화, 분지형 또는 비분지형 알킬 작용기이고,

상기 알킬 작용기는 8개 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 선형 포화 알킬 작용기이거나, 노닐 또는 데실 작용기 또는 이들의 혼합물이다.

이들 화합물의 염이 본 발명에 따라 포함되기도 한다. 본 발명에서, 용어 "디-람노지질"은 n이 1인 상기 식의 화합물 또는 그의 염을 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, "모노-람노지질"은 본 발명에서 상기 일반식의 화합물 또는 그의 염을 의미하는 것으로 이해되고, 여기서 n은 0이다.

특정 구현예에서, 상기 방법은 약 0.1 g/L 내지 약 30 g/L, 약 1 g/L 내지 약 25 g/L, 또는 약 5 g/L 내지 약 25 g/L 의 RLP 및/또는 RLP-유사 당지질을 생성하는데 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 미생물은 또한 다른 당지질(예: 소포로지질, 트레할로스 지질, 셀로비오스 지질 및/또는 만노실에리트리톨 지질) 및/또는 플라보지질과 같은 하나 이상의 추가적인 유형의 바이오계면활성제를 생성할 수 있다. 플라보지질은 일반적으로 플라보박테리움 속(genus Flavobacterium)의 박테리아에 의해 제조된다. 친수성 모이어티는 시트르산 및 2 개의 카다베린 분자를 포함한다. 상기 소수성 모이어티는 6 내지 10 개의 탄소를 갖는 2 개의 분지쇄 아실기로 구성된다.

특정 구현예에서, 상기 방법은 약 0.1 g/L 내지 약 30 g/L, 약 1 g/L 내지 약 25 g/L, 또는 약 5 g/L 내지 약 25 g/L의 하나 이상의 다른 유형의 바이오계면활성제, 예를 들어, 플라보지질을 생성하는데 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 미생물 성장 부산물은 다른 대사산물을 포함한다. 본원에 사용된 "대사산물(metabolite)"은 대사에 의해 생성된 모든 물질(예: 성장 부산물), 또는 특정 대사 과정에 참여하는 데 필요한 물질, 예를 들어 효소, 효소 억제제, 생체고분자, 산, 용매, 가스, 단백질, 펩티드, 아미노산, 알코올, 안료, 폴리케타이드, 페로몬, 호르몬, 지질, 전위독소(ectotoxins), 내독소(endotoxins), 외독소(exotoxins), 탄수화물, 항생제, 항진균제, 항바이러스제 및/또는 기타 유기 및/또는 생리활성 화합물을 지칭할 수 있다. 상기 방법에 의해 생성된 대사산물 함량은, 예를 들면, 적어도 0.1%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 일 수 있다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 성장 부산물은 테르펜 및/또는 테르페노이드와 같은 유기 화합물을 포함한다. 테르펜 및 테르페노이드(이소프레노이드)는 일반적으로 식물 및 몇몇 곤충에 의해 생성되는 탄화수소 화합물이다. 침엽수 및 캐니버스와 같은 테르펜/테르페노이드-생성 식물의 성장률 때문에 테르펜 및 테르페노이드의 대량 생산 또한 매우 느리고 비경제적일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 배양된 미생물은 테르펜 및/또는 테르페노이드를 생성한다.

테르펜(terpenes)의 종류는, 예를 들면, 헤미테르펜, 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 디테르펜, 세스터테르펜, 트리테르펜, 세스쿼터펜, 테트라테르펜, 폴리테르펜 및/또는 노리소프레노이드를 포함할 수 있다. 테르페노이드(terpenoids)는 변형된 테르펜(modified terpenes)이다. 테르페노이드의 종류는, 예를 들면, 헤미테르페노이드, 모노테르페노이드, 세스퀴테르페노이드, 디테르페노이드, 세스터테르페노이드, 트리테르페노이드, 테트라테르페노이드 및/또는 폴리테르페노이드를 포함할 수 있다. 테르펜 및/또는 테르페노이드의 구체적이고 비제한적인 예는 카로틴, 카로티노이드, 미르센, 리모넨, 리날로올, 피넨, 카리오필렌, 비사보롤, 시트랄, 멘톨, 캠퍼, 살비노린 A, 칸나비노이드, 징코라이드, 바이로베라이드, 및 커큐미노이드를 포함한다. 일 구현예에서, 유기 화합물은 카로티노이드이다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 성장 부산물은, 예를 들어 산화환원효소, 전이효소, 가수분해효소, 리아제, 이성질화효소 및/또는 리가제 등의 효소를 포함한다. 본 발명에 따른 효소의 특정 유형 및/또는 서브클래스는 또한, 이에 제한되지는 않지만, 질소분해효소, 프로테아제, 아밀라아제, 글리코시다아제, 셀룰라아제, 글루코시다아제, 글루카나아제, 갈락토시다아제, 모아노시다아제, 수크라아제, 덱스트라나아제, 가수분해효소, 메틸전이효소, 포스포릴라아제, 탈수소효소(예: 포도당 탈수소효소, 알코올 탈수소효소), 옥시게나아제(예: 알칸 옥시게나아제, 메탄 모노옥시게나아제, 디옥시게나아제), 하이드록실라제(예: 알칸 하이드록실라제), 에스테라제, 리파제, 리그니나제, 만나나제, 옥시다제, 락카제, 티로시나제, 시토크롬 P450 효소, 퍼옥시다제(예: 클로로퍼옥시다제 및 기타 할로페록시다제) 및 락타제를 포함한다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 성장 부산물은 항생제 화합물, 예를 들어, 아미노글리코시드, 아미카로시클리신, 바시트라신, 바실라엔, 바실리신, 바실리소신, 코랄로피로닌 A, 디피시딘, 에트낭지엔 그라미시딘, b-락탐, 리케니포르민, 마크로락틴수블란신, 옥시디피시딘, 플란타졸리신, 리포스타틴, 스펙티노마이신, 서브틸린, 티로시딘 및/또는 쯔비터미신 A를 포함한다. 일부 구현예에서, 항생제는 일종의 바이오계면활성제일 수도 있다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 성장 부산물은 항진균성 화합물, 예를 들어, 펜지신, 서팩틴, 할리안지신, 마이코바실린, 마이코서브틸린 및/또는 바실로마이신을 포함한다. 일부 구현예에서, 항진균제는 일종의 바이오계면활성제일 수도 있다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 성장 부산물은 예를 들어, 부탄올, 에탄올, 아세테이트, 에틸 아세테이트, 락테이트, 아세토인, 벤조산, 2, 3-부탄디올, 베타-글루칸, 인돌-3-아세트산(IAA), 로바스타틴, 아우라친, 카노사민, 레세오플라빈, 테르펜테신, 펜탈레노락톤, 투린지엔신(b-외독소), 폴리케타이드(PK), 테르펜, 테르페노이드, 페닐-프로파노이드, 알칼로이드, 사이드로리보솜과 같은 기타 생리활성 화합물뿐 아니라 리보솜 및 비-리보솜 합성 펩티드를 포함한다.

미생물-기반 산물

본 발명은 미생물-기반 산물 뿐만 아니라, 예를 들어, 농업, 향상된 오일 회수, 생물학적 정화(bioremediation), 의약품, 및 화장품을 비롯한 다양한 용도에 있어서의 이들의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 하나의 미생물-기반 산물은 단순히 미생물, 미생물에 의해 생성된 미생물 성장 부산물, 임의의 잔류 영양소 및/또는 잔류 미립자 고정 담체를 포함하는 발효 배지이다. 미생물-기반 산물은 추출 및/또는 정제 없이, 또는 추출 및/또는 정제 없이 사용될 수 있다.

미생물은 활성 또는 비활성 형태, 또는 영양 세포, 바이오필름, 포자 또는 이들의 조합의 형태일 수 있다. 미생물-기반 산물은 추가적인 안정화, 보존 및 저장 없이 사용될 수 있다. 유리하게는, 이들 미생물-기반 산물의 직접적인 사용은 미생물의 높은 생존율을 보존하고, 이물질 및 바람직하지 않은 미생물로부터의 오염 가능성을 감소시키고, 미생물 성장 부산물의 활성을 유지한다.

일 구현예에서, 제1 및 제2 미생물은 공배양 후에 서로 분리된다. 일 구현예에서, 산물은 제1 및 제2 미생물 및/또는 이들 성장 부산물의 혼합물(blend)를 포함한다.

일 구현예에서, 조성물은 살아있는 미생물을 포함하지 않는다. 일 구현예에서, 조성물은 살아있는 것이든 비활성인 것이든 미생물을 전혀 포함하지 않는다.

일 구현예에서, 조성물은 이를 생성한 미생물로부터 분리된 하나 이상의 미생물 성장 부산물을 포함한다. 성장 부산물은 정제 또는 미정제 형태일 수 있다.

미생물 성장으로 인한 미생물, 영양 배지 및/또는 거품은 발효기 및/또는 수집 용기에서 제거될 수 있고, 예를 들어 즉시 사용을 위해 배관을 통해 이송될 수 있다.

다른 구현예에서, 조성물(미생물, 거품 및/또는 배양액(broth))은, 예를 들어 의도된 용도, 고려되는 적용 방법, 발효 탱크의 크기 및 미생물 성장 설비로부터 사용 위치로의 임의의 운송 모드를 고려하여 적절한 크기의 용기에 배치될 수 있다. 따라서, 미생물-기반 조성물이 배치되는 용기는, 예를 들어 1 갤런 내지 1, 000 갤런 또는 그 이상일 수 있다. 특정 구현예에서, 용기는 2 갤런, 5 갤런, 25 갤런 또는 그 이상이다.

성장 용기로부터의 미생물-기반 조성물을 수확할 때, 수확된 산물을 용기 내에 배치 및/또는 배관 연결(또는 사용하기 위해 운송할 때)하므로 추가적인 요소가 첨가될 수 있다. 첨가제는, 예를 들어 완충제, 담체, 동일하거나 상이한 설비 에서 생산된 기타 미생물 기반 조성물, 점도 조절제, 방부제, 미생물 성장을 위한 영양소, 추적제, 살충제 및 의도된 용도에 특정한 기타 성분일 수 있다.

유리하게는, 본 발명에 따르면, 미생물-기반 산물은 미생물이 성장한 배양액(broth)을 포함할 수 있다. 산물은, 예를 들어, 중량 기준으로 적어도 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100% 배양액일 수 있다. 중량 기준으로 산물 내의 바이오매스 양은, 예를 들어, 사이에 있는 모든 백분율을 포함하여, 예를 들어, 0% 내지 100%, 10% 내지 90%, 20% 내지 80%, 또는 30% 내지 70% 일 수 있다.

선택적으로, 산물은 사용 전에 저장될 수 있다. 저장 시간은 짧은 것이 바람직하다. 따라서, 저장 시간은 60일, 45일, 30일, 20일, 15일, 10일, 7일, 5일, 3일, 2일, 1일, 또는 12시간 미만일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 산물은 예를 들어, 20℃, 15℃, 10℃, 5℃, 또는 4℃ 또는 그 이하의 온도로 저장된다. 세포가 존재하고 포자 형태로 존재하는 경우, 상기 산물은 일 구현예에서, 조기 발아를 방지하기 위해 15℃ 이하의 온도에서 저장 및 운송된다.

사용 방법

본 발명의 미생물-기반 산물은 다양한 목적으로 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 조성물은 농업(agriculture)에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 생성된 조성물이 해충 및/또는 질병의 확산을 치료 및/또는 예방하기 위해 식물 및/또는 그의 환경에 적용되는 방법이 제공된다. 또한, 본 발명의 조성물은 토양 내 수분 분산 및 흡수를 향상시킬 뿐만 아니라 식물 뿌리를 통해 토양으로부터 영양분 흡수를 향상시키고, 식물 건강을 촉진하고, 수확량을 증가시키고, 토양 통기를 관리하는 데 유용할 수 있다.

일 구현예에서, 본 조성물은 오일 및 가스 산업의 맥락에서 매우 유리할 수 있다. 유정, 유정 천공, 지반 형성 또는 오일 및/또는 가스 회수에 사용되는 장비에 적용될 때, 본 발명에 따라 생성된 조성물은 원유 회수의 향상; 오일 점도 감소; 로드, 튜브, 라이너 및 펌프에서 파라핀 제거 및 분산; 장비 부식 방지; 오일 샌드 및 스트리퍼 웰(stripper well)에서의 오일 회수; 파쇄 유체로서의 파쇄 (fracking) 작업의 향상; 원유(crude oil)에서의 H₂S 농도의 감소; 및 탱크, 유동 라인 및 파이프라인의 청소를 위한 방법에 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명에 따라 생성된 조성물은 오일의 하나 이상의 특성을 개선하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물을 오일에 적용하거나 오일-함유 형성에 적용하여 오일의 점도를 감소시키고, 오일을 신유에서 단유로 전환하고/하거나 중질 원유에서 경질 분획으로 오일을 업그레이드하는 방법이 제공된다.

일 구현예에서, 본 발명에 따라 생성된 조성물은 산업 장비를 세정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물이 유정 로드, 튜빙 및/또는 케이싱과 같은 오일 생산 장비에 적용되어, 장비로부터의 중질 탄화수소, 파라핀, 아스팔텐, 스케일 및 기타 오염물을 제거하는 방법이 제공된다. 상기 조성물은 또한 다른 산업, 예를 들어 식품 가공 및 제조, 농업, 제지 및 기타 산업, 즉 지방, 오일 및 그리스가 축적되어 장비를 오염 및/또는 더럽히는 산업에서 사용되는 장비에 적용될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명에 따라 생성된 조성물은 동물 건강을 증진시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 동물 사료 또는 물에 적용될 수 있거나, 사료 또는 물과 혼합하여, 가축 및 수산 양식에서의 질병 확산을 방지하는데 사용될 수 있고, 항생제의 대량 사용에 대한 필요성을 감소시키고, 메탄, 이산화탄소 및/또는 아산화질소 방출을 감소시킬 뿐만 아니라, 보충 단백질 및 다른 영양소를 제공할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명에 따라 생성된 조성물은 식품의 부패를 방지하고, 식품의 소비 수명을 연장시키고/시키거나 식품 매개 질환을 예방하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 조성물은 신선한 농산물, 구운 식품, 육류, 및 수확 후 곡물 등의 식품에 적용되어 바람직하지 않은 미생물 성장을 방지하는 방법이 제공된다.

본 발명의 조성물에 대한 다른 용도는 생물 비료, 바이오살충제, 생물 용출, 토양 및 물의 생물학적 정화, 약학적 보조제(경구로 섭취한 약물의 생체이용률을 증가시키기 위함), 화장품, 원치 않는 미생물 성장 제어 및 기타 여러 가지를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

미생물-기반 산물의 현지 생산

본 발명의 바람직한 구현예에서, 미생물 성장 설비는 신선한 고밀도 미생물 및/또는 미생물 성장 부산물을 원하는 규모로 생산한다. 미생물 성장 설비는 적용 장소 또는 그 근처에 위치할 수 있다. 상기 설비는 회번식(batch), 준연속(quasi-continuous) 또는 연속(continuous) 배양으로 고밀도 미생물-기반 조성물을 생산한다.

분산된 미생물 성장 설비는 미생물-기반 산물이 사용될 위치에 위치될 수 있다. 예를 들어, 미생물 성장 설비는 사용 위치로부터 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 15, 10, 5, 3, 또는 1 마일 미만에 있을 수 있다.

본 발명의 미생물 성장 설비는 미생물 자체, 미생물 대사산물, 및/또는 미생물이 성장되는 배양액의 다른 성분을 포함하는 신선한 미생물-기반 조성물을 생산한다. 원하는 경우, 조성물은 고밀도의 영양 세포 또는 번식체, 또는 영양 세포 및 번식체의 혼합물을 가질 수 있다.

미생물-기반 산물이 종래의 미생물 생산의 미생물 안정화, 보존, 저장 및 운반 공정에 의존하지 않고 국부적으로 생성되므로, 훨씬 더 높은 밀도의 박테리아 세포 및/또는 번식체가 생성될 수 있어, 현지 적용에서 사용하기 위한 미생물-기반 산물의 보다 작은 부피를 필요로 하거나, 또는 필요한 효능을 달성하기 위해 필요한 경우 훨씬 더 높은 밀도의 미생물 적용을 가능하게 한다. 이는 규모가 축소된 생물 반응기(예: 더 작은 발효 탱크 및 시작 물질, 영양소, pH 조절제의 더 적은 공급)를 허용하여, 시스템이 효율적인 것이 되게 한다. 미생물-기반 산물의 현장 생산은 또한 산물에 성장 배양액이 포함되는 것이 용이해지게 한다. 배양액은 발효 중에 생성된, 특히 현지 사용에 잘 맞추어진 제제를 함유할 수 있다.

유리하게는, 상기 조성물은 특정 위치에서 사용하도록 맞춤화될 수 있다. 미생물 성장 설비는 미생물-기반 산물을 맞춤 제작하여 목적지 지역과의 시너지를 개선하고 자연적으로 발생하는 지역 미생물 및 대사 부산물의 힘을 활용하여 오일 생산을 개선할 수 있는 능력을 통해 제조 다양성을 제공한다. 현지 미생물은, 예를 들어, 내염성 및 고온에서 성장할 수 있는 능력에 기초하여 식별될 수 있다.

유리하게는, 이들 미생물 성장 시설은, 업스트림 처리 지연, 공급망 병목 현상, 부적절한 보관, 및 예를 들어, 생존 가능한 높은 세포-계수 산물 및 관련 배양액 및 세포가 원래 성장되는 관련 배양액 및 대사물을 적시에 납품 및 적용하는 것을 방해하는 기타 비상사태로 인해 제품 품질 문제에 시달리는 널리 흩어져 있는 산업 규모의 생산자들에 의존하는 당면 문제에 대한 해결책을 제공한다.

본 발명의 미생물-기반 산물은 발효 성장 배지에 존재하는 대사산물 및 영양소로부터 세포가 분리된 전통적인 산물에 비해 특히 유리하다. 운송 시간의 단축으로 현지 수요에 의해 요구되는 만큼의 시간 및 양으로 신선한 일괄 처리 미생물 및/또는 이들의 대사산물을 생산 및 전달할 수 있게 된다.

예를 들어, 발효 24 시간 이내의 현지 생산 및 배송은 순수한 높은 세포 밀도 조성물과 실질적으로 더 낮은 선적 비용을 가져온다. 보다 효과적이고 강력한 미생물 접종제의 개발이 급속하게 발전할 것이라는 전망을 감안할 때 미생물-기반 산물을 신속하게 제공할 수 있는 이러한 능력으로부터 소비자들은 큰 이익을 얻게 될 것이다.

실시예

본 발명 및 그의 많은 이점들에 대한 더 큰 이해는 예시로서 제공된 하기 실시예로부터 얻을 수 있다. 하기 실시예는 본 발명의 방법, 응용, 구현예 및 변형예의 일부를 예시한다. 이들은 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본 발명과 관련하여 수많은 변경 및 수정이 이루어질 수 있다.

실시예 1 - 바이오계면활성제 및 탄화수소 생산을 위한 M. XANTHUS 및 균주 111의 공배양

슈도모나스 클로라피스 "균주 111"을 적어도 48시간 동안 소규모 반응기에서 성장시켜 3.0% 내지 5% 접종물을 생성한다. 믹소코커스 크산투스(Myxococcus xanthus)를 적어도 4 일 동안 소규모 반응기에서 성장시켜 0.6% 내지 1.0% 접종물을 생성한다. M. 크산투스 접종물은 순도를 테스트하기 위해 3일 후에 슬라이드 스트리킹(slide streaking)을 이용하여 샘플링 및 테스트할 수 있다.

발효 반응기는 2 개의 접종물로 접종된다. 본 발명의 일 구현예에 따른 영양배지는 다음 성분을 포함한다:

또한, 영양 배지는 셀룰로오스(1.0 내지 5.0 g/L) 및/또는 옥수수 분(1.0 내지 8.0 g/L)을 포함하는 미세 그레인 미립자 고정 담체를 포함한다.

20% NaOH를 포함하는 수성 염기 용액을 반응기에 공급하여 pH를 자동적으로 6.8 내지 7.0으로/또는 약 6.8 내지 7.0으로 유지한다. 이어서, 카놀라유 및/또는 식물성유(10 내지 30 ml/L)가 첨가되어 반응기에서의 거품 생성을 감소시키고 영양소의 추가적인 공급원으로서 작용한다. 거품을 줄이고/줄이거나 영양 배지를 보충하기 위해 필요에 따라 발효 전반에 걸쳐 카놀라유/식물성유를 보충할 수 있다.

온도는 약 24℃로 유지되고; DO는 약 50%로 유지되며; 공기 유량은 약 1 vvm 으로 유지된다.

배양은 약 5일 동안 수행된다. 발효기와 CFU 카운트 및/또는 순도를 위한 거품 수집 탱크에 대한 샘플링을 0 hr에서 수행하고, 이 후에는, 발효 전반에 걸쳐 하루에 2회 샘플링한다. 또한, 샘플링은 배양물의 수확 시점, 즉, 배양 5일 후에 할 수도 있다.

박테리아 배양물은 바이오계면활성제 및 카로티노이드(테사르페노이드)의 존재를 나타내는 오렌지색 내지 적색 안료를 포함하는 다른 미생물 성장 부산물을 포함한다.

발효 사이클이 완료된 후, 배양액을 반응기에서 수확한다. 미생물 성장 부산물을 포함하는 거품층이 발효 중에 생성될 수도 있다. 이 거품 층은 수집 용기 내에서 추출 및 수집된다. 거품 추출은 발효 전반 및/또는 발효 말미에 수행될 수 있다.

수확된 배양물 및 추출된 거품은 바이오계면활성제 및 유기 화합물을 정제하기 위하여 예를 들어, 에틸 아세테이트 추출 및/또는 회전 증발 정제를 이용하여 처리할 수 있다.

정제된 또는 미정제 형태의 성장 부산물은 예를 들어 바이오계면활성제의 존재를 확인하기 위해 분석될 수 있다. 균주 111의 성장 부산물을 표면 장력 감소 능력에 관련하여 측정하였고, 이는 바이오계면활성제의 존재를 나타낸다. 물에 첨가될 때, 표면 장력이 약 30 mN/m 로 감소되었다.

실시예 2 - 바이오계면활성제 생산을 위한 M. 크산투스 및 균주 306의 유가식 (FED-BATCH) 공배양

슈도모나스 클로라피스 균주 306을 적어도 48 시간 동안 소규모 반응기에서 성장시켜 3.0% 접종물을 생성한다. 믹소코커스 크산투스(Myxococcus xanthus)를 적어도 4 일 동안 배양 플라스크 (2L 작업 부피)에서 성장시켜 0.5% 접종물을 생성한다. M. 크산투스 접종물은 순도를 테스트하기 위해 3일 후에 슬라이드 스트리킹(slide streaking)을 이용하여 샘플링 및 테스트할 수 있다.

20% NaOH 를 포함하는 수성 염기 용액을 반응기에 공급하여 pH를 자동적으로 6.8 내지 7.0으로/또는 약 6.8 내지 7.0으로 유지한다. 이어서, 카놀라유 및/또는 식물성유(10 내지 30 ml/L)가 첨가되어 반응기에서의 거품 생성을 감소시키고 영양소의 추가적인 공급원으로서 작용한다.

배양은 약 5일 동안 수행된다. 온도는 약 24℃로 유지되고; DO는 약 50%로 유지되고; 공기 유량은 약 1 vvm 으로 유지된다.

배양 전반에 걸쳐 반응기에 추가적인 카놀라유(3%, 24시간마다 1회) 및 글리세롤(48시간 후 500 g/L)이 공급된다.

온도는 약 24℃로 유지되고; DO는 약 50%로 유지되고; 공기 유량은 약 1 vvm 으로 유지된다. 발효기와 CFU 카운트 및/또는 순도를 위한 거품 수집 탱크에 대한 샘플링을 0 hr에서 수행하고, 이 후에는, 발효 전반에 걸쳐 하루에 2 회 샘플링한다. 또한, 샘플링은 배양물의 수확 시점, 즉, 배양 5 일 후에 할 수도 있다.

발효 사이클이 완료된 후, 배양액을 반응기에서 수확한다. 미생물 성장 부산물을 포함하는 거품층이 발효 중에 생성될 수도 있다. 이 거품 층은 수집 용기 내에서 추출 및 수집된다.

수확된 배양물 및 추출된 거품은 바이오계면활성제를 정제하기 위하여 예를 들어, 에틸 아세테이트 추출 및/또는 회전 증발 정제를 이용하여 처리할 수 있다.

정제된 또는 미정제 형태의 성장 부산물은 예를 들어 바이오계면활성제의 존재를 확인하기 위해 분석될 수 있다. 균주 306의 성장 부산물을 표면 장력 감소 능력에 관련하여 측정하였고, 이는 바이오계면활성제의 존재를 나타낸다. 물에 첨가될 때, 표면 장력이 약 27 mN/m 로 감소되었다.

Claims

하나 이상의 미생물 성장 부산물의 생산을 향상시키는 방법으로서,
상기 방법은 발효 반응기에서 제1 미생물 및 제2 미생물을 공배양하는 단계를 포함하고,
상기 제1 미생물은 믹소박테리움(myxobacterium)이고, 제2 미생물은 슈도모나스(Pseudomonas)의 비병원성 균주이고,
상기 하나 이상의 미생물 성장 부산물의 농도는 상기 제1 및 제2 미생물이 개별적으로 배양되는 경우 달성될 것보다 더 큰 농도로 달성되는 것인 방법.
제1항에서,
상기 믹소박테리움은 믹소코커스 종(Myxococcus spp.) 박테리아인 것인 방법.
제2항에서,
상기 믹소코커스 종 박테리아는 M. 크산투스(M. xanthus)인 것인 방법.
제1항에서,
상기 슈도모나스(Pseudomonas)의 비병원성 균주는 P. 클로로라피스(P. chlororaphis)의 균주인 것인 방법.
제4항에서,
상기 균주는 P. 클로로라피스 아종(P. chlororaphis subsp.) 아우레오파시엔스(aureofaciens) 균주 306, 또는 P. 클로로라피스 아종(P. chlororaphis subsp.) 아우레오파시엔스(aureofaciens) 균주 111인 것인 방법.
제1항에서,
상기 믹소박테리움은 M. 크산투스(M. xanthus)이고, 상기 슈도모나스의 균주는 균주 306 또는 균주 111인 것인 방법.
제1항에서,
상기 슈도모나스 균주는 하나 이상의 성장 부산물을 생산하는 것인 방법.
제1항에서,
상기 하나 이상의 성장 부산물은 바이오계면활성제인 것인 방법.
제8항에서,
상기 바이오계면활성제는 람노지질(RLP)인 것인 방법.
제8항에서,
상기 바이오계면활성제는 플라보지질인 것인 방법.
제1항에서,
상기 하나 이상의 성장 부산물은 테르펜 및/또는 테르페노이드인 것인 방법.
제11항에서,
상기 테르페노이드는 카로티노이드인 것인 방법.
제1항에서,
상기 제1 및 제2 미생물을 공배양하는 단계는,
상기 발효 반응기에 상기 제1 미생물을 접종하고 상기 발효 반응기에 상기 제2 미생물을 접종하는 단계로서, 상기 발효 반응기는 액체 영양 배지를 포함하고;
상기 하나 이상의 미생물 성장 부산물의 성장 및 생산에 유리한 조건 하에 상기 반응기에서 상기 제1 및 제2 미생물을 배양하는 단계;
상기 반응기로부터 상기 하나 이상의 성장 부산물을 추출하는 단계; 및
선택적으로, 상기 하나 이상의 성장 부산물을 정제하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제13항에서,
상기 액체 영양 배지는 글루코스, 카제인 펩톤, 글리세롤, 효모 추출물, 인산일칼륨, 인산이나트륨, 질산암모늄, 황산마그네슘 7수화물, 황산 제1철 및 미량 금속을 포함하는 것인 방법.
제13항에서,
상기 액체 영양 배지 내에 미립자 고정 담체를 현탁시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제15항에서,
상기 미립자 고정 담체는 셀룰로오스 및/또는 옥수수 분의 그레인을 포함하는 것인 방법.
제15항에서,
상기 제1 및/또는 제2 미생물은 상기 미립자 고정 담체에 부착되고 그 위에 바이오필름 형태로 축적되어 복수의 박테리아-담체 덩어리를 형성하는 것인 방법.
제13항에서,
15% 내지 25%의 NaOH를 포함하는 염기 수용액을 상기 반응기에 첨가하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제13항에서,
48시간 배양 후에 500 g/L의 글리세롤을 상기 반응기에 공급하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제13항에서,
3% 카놀라유를 24시간 마다 상기 반응기에 공급하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제13항에서,
추가적인 액체 영양 배지를 상기 발효 반응기에 공급하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제1항에서,
상기 제1 미생물이 상기 제2 미생물에 의한 하나 이상의 성장 부산물의 향상된 생산을 자극하는 것인 방법.
제1항에서,
상기 성장 부산물은 상기 제1 미생물 또는 상기 제2 미생물이 개별적으로 배양된 경우보다 적어도 0.01% 내지 적어도 90% 더 큰 농도로 생성되는 것인 방법.
하나 이상의 미생물 및/또는 하나 이상의 미생물 성장 부산물을 포함하는 조성물로서,
상기 하나 이상의 미생물은 믹소코커스 크산투스(Myxococcus xanthus) 및 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis)를 포함하고,
상기 하나 이상의 미생물 성장 부산물은 바이오계면활성제, 테르펜 및/또는 테르페노이드를 포함하는 것인 조성물.
제24항에서,
상기 바이오계면활성제는 람노지질(rhamnolipids) 및/또는 플라보지질인 것인 조성물.
제24항에서,
상기 테르페노이드는 카로티노이드인 것인 조성물.
제24항에서,
상기 P. 클로로라피스는 균주 111 또는 균주 306인 것인 조성물.