KR20220025983A - Crosslinked hydrogel of hyaluronic acid derivative for sustained drug release - Google Patents

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Abstract

The present invention provides a hydrogel composition comprising a hyaluronic acid-dopamine conjugate and a positive ion of a pharmaceutically usable salt, and an in situ-forming subcutaneous injection containing the same. The positive ion-enhanced hyaluronic acid hydrogel composition, and the in situ-forming subcutaneous injection containing the same of the present invention can be injected into the subcutaneous tissue with minimal invasiveness without skin excision and suturing in the fields of medicine, pharmaceuticals, and skin procedures, and thus can be usefully used as a formulation capable of improving patient compliance by reducing the administration frequency by sustained release of a drug.

Description

히알루론산 유도체의 교차결합에 의한 약물 서방출성 하이드로겔{Crosslinked hydrogel of hyaluronic acid derivative for sustained drug release}Crosslinked hydrogel of hyaluronic acid derivative for sustained drug release

본 발명은 히알루론산 유도체의 교차결합에 의한 약물 서방출성 하이드로겔에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 히알루론산-도파민 접합체 및 약학적으로 사용가능한 염의 양이온을 포함하는 하이드로겔 조성물, 및 이를 포함하는 인시튜(in situ) 형성 피하주사용 주사제에 관한 것이다.The present invention relates to a sustained-release hydrogel of a drug by crosslinking of a hyaluronic acid derivative, and more particularly, a hydrogel composition comprising a cation of a hyaluronic acid-dopamine conjugate and a pharmaceutically usable salt, and in situ comprising the same ( in situ ) It relates to an injection for forming subcutaneous injection.

주로 친수성 폴리머를 기본으로 하는 하이드로겔은 3차원(3D) 구조를 가지며 내부 구조에 상당한 양의 물을 유지한다. 일반적으로 하이드로겔은 임상 적용에서의 생체적합성, 제조 과정에서의 유연성, 물리화학적 및 기계적 특성의 조절 가능성을 나타내어, 생의학적 용도로 광범위하게 적용될 수 있다. 졸 상의 하이드로겔 조성물이 겔 상으로 전이되면 점성 고체로서의 특성을 나타내고, 이는 체내로의 보다 용이한 투여에 방해가 될 수 있다. 이에 따라, 침습성을 최소화하기 위하여 주입가능한 하이드로겔이 광범위하게 개발되고 있다. 또한, 겔 및 유효성분의 전구체 혼합물은 주사기 바늘을 통과해야 하며 체내에서 겔화되어야 한다. 인시튜(in situ) 겔 형성의 경우, 물리적 요인(즉, pH, 온도 및 이온 농도) 및/또는 화학 반응(즉, 마이클 첨가반응[Michael addition] 및 쉬프 염기 형성 반응[Schiff's base formation])을 이용할 수 있다. 겔은 주사된 후, 최소 침습적으로 주사 부위 공간에 자발적으로 맞추어질 수 있으며, 이에 따라 통증 감소 및 조직의 빠른 회복으로 연결될 수 있다. 주사용 하이드로겔의 물리화학적 및 기계적 특성으로 인해, 다양한 유형의 유효성분(즉, 소분자 화합물, 핵산, 펩타이드 및 단백질)이 하이드로겔 구조에 포함될 수 있고, 서방출성 또는 맞춤형 약물 방출이 프로그래밍될 수 있다. 또한, 다수의 거대분자(즉, 천연 중합체, 합성 중합체, 핵산, 펩티드 및 단백질)가 도입되어 바람직한 하이드로겔 구조가 제조되고, 제조된 물질의 물리화학적 및 유동학적 특성이 조절된다는 연구 결과가 보고되고 있다.Hydrogels based primarily on hydrophilic polymers have a three-dimensional (3D) structure and retain a significant amount of water in their internal structure. In general, hydrogels exhibit biocompatibility in clinical applications, flexibility in the manufacturing process, and control of physicochemical and mechanical properties, and thus can be widely applied for biomedical applications. When the sol phase hydrogel composition is transferred to the gel phase, it exhibits properties as a viscous solid, which may interfere with easier administration into the body. Accordingly, injectable hydrogels have been extensively developed to minimize invasiveness. In addition, the precursor mixture of the gel and the active ingredient must pass through a syringe needle and gel in the body. For in situ gel formation, physical factors (i.e. pH, temperature and ionic concentration) and/or chemical reactions (i.e. Michael addition and Schiff's base formation) Available. After the gel is injected, it can spontaneously fit into the injection site space minimally invasively, which can lead to pain reduction and rapid tissue recovery. Due to the physicochemical and mechanical properties of injectable hydrogels, various types of active ingredients (i.e., small molecule compounds, nucleic acids, peptides and proteins) can be included in the hydrogel structure, and sustained or customized drug release can be programmed. . In addition, research results have been reported that a number of macromolecules (i.e., natural polymers, synthetic polymers, nucleic acids, peptides, and proteins) are introduced to produce desirable hydrogel structures, and the physicochemical and rheological properties of the prepared materials are controlled. there is.

그 중에서도 히알루론산(hyaluronic acid, HA)은 생체적합성과 생분해성으로 인해 하이드로겔 기제로 널리 연구되어 왔다. HA는 반복되는 이당류인 β-1,4-D-글루쿠론산-β-1,3-N-아세틸-D-글루코사민(β-1,4-D-glucuronic acid-β-1,3-N-acetyl-D-glucosamine)으로 구성된 다당류이며, 연골조직의 세포 외 기질(ECM) 성분이다. 체내 히알루로니다제(hyaluronidase, HAase)에 의해 분해될 수 있으므로, 피부 필러, 상처 드레싱 및 붕대, 약물 전달 및 조직 공학에 활용되고 있다. 비변형 HA의 분산시 낮은 점탄성 관련 문제를 극복하기 위하여, HA 기반 하이드로겔의 물리화학적 및 유동학적 특성을 개선하기 위한 다양한 화학적 변형 및 물리적 가교 접근법이 시도되었다. HA는 카르복실산 기(글루쿠론산 내), 히드록실 기 및 N-아세틸 기(탈아미드화 이후)와 같은 대표적인 작용기를 가지고 있다. 이들 작용기는 화학적으로 변형된 HA 유도체를 만들기 위하여 아미드화, 에스테르화, 산화, 에테르 형성, 헤미아세탈 형성 및 카바메이트 형성에 참여할 수 있다. 비변형 HA 자체는 몇몇 가교제(예: 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르[1,4-butanediol diglycidyl ether], 디비닐설폰[divinylsulfone] 및 글루타르알데히드[glutaraldehyde])와 직접 가교 결합될 수 있고, 이들의 상업적 제품(예: Synvisc®, Restylane®, Juvederm®, Teosyal® 및 Glytone®)은 이미 관절 주사와 피부 필러용으로 사용되고 있다. 한편, 기능화된 HA 유도체는 화학적 가교 결합(클릭 화학[click chemistry] 포함), 인시튜(in situ) 가교, 효소 가교, 광 가교 및 물리적 가교를 통해 목적하는 HA 하이드로겔 시스템으로 제조될 수 있다.Among them, hyaluronic acid (HA) has been widely studied as a hydrogel base due to its biocompatibility and biodegradability. HA is a repeating disaccharide, β-1,4- D -glucuronic acid-β-1,3- N -acetyl- D -glucosamine (β-1,4- D -glucuronic acid-β-1,3- N It is a polysaccharide composed of -acetyl- D -glucosamine) and is a component of the extracellular matrix (ECM) of cartilage tissue. Since it can be degraded by hyaluronidase (HAase) in the body, it is used in dermal fillers, wound dressings and bandages, drug delivery, and tissue engineering. In order to overcome the problem of low viscoelasticity in the dispersion of unmodified HA, various chemical modification and physical crosslinking approaches have been attempted to improve the physicochemical and rheological properties of HA-based hydrogels. HA has representative functional groups such as carboxylic acid groups (in glucuronic acid), hydroxyl groups and N -acetyl groups (after deamidation). These functional groups can participate in amidation, esterification, oxidation, ether formation, hemiacetal formation and carbamate formation to produce chemically modified HA derivatives. Unmodified HA itself can be directly cross-linked with some cross-linking agents, such as 1,4-butanediol diglycidyl ether [1,4-butanediol diglycidyl ether], divinylsulfone [divinylsulfone] and glutaraldehyde [glutaraldehyde] and their commercial products (eg Synvisc ® , Restylane ® , Juvederm ® , Teosyal ® and Glytone ® ) are already used for joint injections and dermal fillers. On the other hand, functionalized HA derivatives can be prepared into a desired HA hydrogel system through chemical cross-linking (including click chemistry), in situ cross-linking, enzymatic cross-linking, light cross-linking and physical cross-linking.

HA 폴리머에 도입되는 다수의 잔기들 중에서, 카테콜 기는 금속 이온과의 배위, 카테콜 기 자체의 공유결합 및 다른 기능성 잔기와의 화학적 가교와 관련하여 연구되었다. 본 발명의 발명자들은 이전 연구[S.Y. Lee, J.H. Park, M. Yang, M.J. Baek, M.H. Kim, J. Lee, A. Khademhosseini, D.D. Kim, H.J. Cho, Ferrous sulfate-directed dual-cross-linked hyaluronic acid hydrogels with long-term delivery of donepezil, Int. J. Pharm. 582 (2020) 119309]에서, HA-도파민(HA-dopa)과의 반응에 FeCl3 대신 FeSO4를 사용하여 단일 주사기를 사용한 인시튜 겔 형성 시스템에 적합하게 겔화 시간을 지연시켰다. 철염(iron salt)은 몇몇 중요한 생물학적 역할이 있지만 철염 가교 HA-dopa 하이드로겔 네트워크의 경우에는 중금속인 철염의 과용 및 해독을 항상 고려해야 한다.Among the many residues introduced into HA polymers, catechol groups have been studied with respect to coordination with metal ions, covalent bonding of catechol groups themselves and chemical crosslinking with other functional moieties. The inventors of the present invention have previously studied [SY Lee, JH Park, M. Yang, MJ Baek, MH Kim, J. Lee, A. Khademhosseini, DD Kim, HJ Cho, Ferrous sulfate-directed dual-cross-linked hyaluronic acid hydrogels with long-term delivery of donepezil, Int. J. Pharm. 582 (2020) 119309], using FeSO 4 instead of FeCl 3 in the reaction with HA-dopamine (HA-dopa) to delay the gelation time suitable for an in situ gel forming system using a single syringe. Although iron salts have several important biological roles, in the case of iron salt cross-linked HA-dopa hydrogel networks, overuse and detoxification of iron salts, a heavy metal, should always be considered.

대한민국 특허공개 제10-2013-0046283호(2013.05.07.)Korean Patent Publication No. 10-2013-0046283 (2013.05.07.)

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 히알루론산 유도체의 하이드로겔 시스템에서 하이드로겔의 네트워크 구조를 강화하면서도 철염 사용시의 부작용을 해결할 수 있는 겔 형성 시스템을 제공하는 것이다.The technical problem to be achieved by the present invention is to provide a gel-forming system that can solve the side effects of using iron salt while strengthening the network structure of the hydrogel in the hydrogel system of the hyaluronic acid derivative.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The technical problems to be achieved by the present invention are not limited to the technical problems mentioned above, and other technical problems not mentioned can be clearly understood by those of ordinary skill in the art to which the present invention belongs from the description below. There will be.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면에 따라, 히알루론산-도파민 접합체 및 약학적으로 사용가능한 염의 양이온을 포함하고, pH 7 ~ 11인 하이드로겔 조성물이 제공된다.In order to achieve the above technical object, according to an aspect of the present invention, a hydrogel composition comprising a cation of a hyaluronic acid-dopamine conjugate and a pharmaceutically usable salt, and having a pH of 7 to 11 is provided.

일 구현예에서, 상기 히알루론산-도파민 접합체는 평균 분자량이 10 ~ 3000 kDa인 히알루론산을 포함할 수 있다.In one embodiment, the hyaluronic acid-dopamine conjugate may include hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa.

일 구현예에서, 상기 히알루론산-도파민 접합체는 접합체 총 중량에 대하여 도파민이 1 ~ 40 중량%로 포함될 수 있다.In one embodiment, the hyaluronic acid-dopamine conjugate may contain 1 to 40% by weight of dopamine based on the total weight of the conjugate.

일 구현예에서, 상기 히알루론산-도파민 접합체는 하이드로겔 조성물 중 최종 농도 1 ~ 100 mg/mL로 포함될 수 있다.In one embodiment, the hyaluronic acid-dopamine conjugate may be included in a final concentration of 1 to 100 mg/mL in the hydrogel composition.

일 구현예에서, 상기 약학적으로 사용가능한 염의 양이온은 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 바륨 이온, 알루미늄 이온 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종의 양이온일 수 있다.In one embodiment, the cation of the pharmaceutically usable salt may be one cation selected from the group consisting of sodium ion, potassium ion, calcium ion, magnesium ion, barium ion, aluminum ion, and mixtures thereof.

일 구현예에서, 상기 약학적으로 사용가능한 염의 양이온은 수산화나트륨(NaOH), 제1인산칼륨(KH2PO4), 제2인산칼륨(K2HPO4), 염화칼륨(KCl), 제1인산나트륨(NaH2PO4), 제2인산나트륨(Na2HPO4), 염화나트륨(NaCl) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종의 염의 양이온일 수 있다.In one embodiment, the cation of the pharmaceutically usable salt is sodium hydroxide (NaOH), potassium monophosphate (KH 2 PO 4 ), potassium diphosphate (K 2 HPO 4 ), potassium chloride (KCl), monophosphate It may be a cation of one salt selected from the group consisting of sodium (NaH 2 PO 4 ), dibasic sodium phosphate (Na 2 HPO 4 ), sodium chloride (NaCl), and mixtures thereof.

일 구현예에서, 상기 약학적으로 사용가능한 염의 양이온은 하이드로겔 조성물 중 최종 농도 10 ~ 1000 mM일 수 있다.In one embodiment, the cation of the pharmaceutically usable salt may have a final concentration of 10 to 1000 mM in the hydrogel composition.

일 구현예에서, 상기 하이드로겔 조성물은 난용성 약물을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 난용성 약물은 도네페질, 암포테리신 B, 커큐민, 플로레틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 덱사메타손, 부데소나이드, 시클로스포린, 타크로리무스, 라파마이신, 페노피브레이트, 프레드니솔론, 이트라코나졸, 인슐린(중성 pH), 인도메타신 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종일 수 있다.In one embodiment, the hydrogel composition may further include a poorly soluble drug, wherein the poorly soluble drug is donepezil, amphotericin B, curcumin, floretin, paclitaxel, docetaxel, dexamethasone, budesonide, cyclo It may be one selected from the group consisting of sporin, tacrolimus, rapamycin, fenofibrate, prednisolone, itraconazole, insulin (neutral pH), indomethacin, and mixtures thereof.

일 구현예에서, 상기 난용성 약물은 마이크로스피어(microsphere)에 캡슐화될 수 있으며, 상기 마이크로스피어는 평균 부피 밀도-연관 직경이 1 ~ 100 μm일 수 있다.In one embodiment, the poorly soluble drug may be encapsulated in microspheres, and the microspheres may have an average bulk density-associated diameter of 1 to 100 μm.

본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 하이드로겔 조성물을 포함하는 인시튜(in situ) 형성 피하주사용 주사제가 제공된다.According to another aspect of the present invention, in situ ( in situ ) forming subcutaneous injection containing the hydrogel composition is provided.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 히알루론산-도파민 접합체 및 약학적으로 사용가능한 염을 혼합하는 단계를 포함하는 하이드로겔 조성물의 제조방법이 제공된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for preparing a hydrogel composition comprising mixing a hyaluronic acid-dopamine conjugate and a pharmaceutically usable salt.

일 구현예에서, 상기 히알루론산-도파민 접합체는 히알루론산 및 도파민을 EDC-NHS 커플링을 이용하여 아미드 결합 반응시키는 단계에 의해 제조되는 것일 수 있다.In one embodiment, the hyaluronic acid-dopamine conjugate may be prepared by subjecting hyaluronic acid and dopamine to an amide bond reaction using EDC-NHS coupling.

본 발명에 의해, 히알루론산-도파민 접합체 및 약학적으로 사용가능한 염의 양이온을 포함하는 하이드로겔 조성물이 특정 pH 범위 환경에서 졸-겔 전이 특성을 나타내고, 전단 연화 거동, 신장성에 의한 자가치유능, 및 약물의 서방출 특성을 나타내므로, 철염 등의 중금속 이온 관련 전신 독성의 위험이 해결된, 인시튜(in situ) 형성 약물 서방출 제제(피하주사 제형 등)로 개발될 수 있다는 것이 밝혀졌다.According to the present invention, a hydrogel composition comprising a cation of a hyaluronic acid-dopamine conjugate and a pharmaceutically usable salt exhibits sol-gel transition properties in a specific pH range environment, shear softening behavior, self-healing ability by extensibility, and It has been found that since the drug exhibits sustained-release properties, it can be developed as an in situ -forming drug sustained-release formulation (subcutaneous injection formulation, etc.) in which the risk of systemic toxicity related to heavy metal ions such as iron salts is resolved.

따라서, 본 발명의 양이온-강화 히알루론산 하이드로겔 조성물, 및 이를 포함하는 인시튜(in situ) 형성 피하주사용 주사제는 의약, 제약, 피부 시술 분야에서 피부 절제 및 봉합없이 최소 침습성으로 피하조직에 주사될 수 있으며, 약물 서방출에 의한 투여 빈도의 감소로 환자 순응도를 향상시킬 수 있는 제형으로서 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the cation-enhanced hyaluronic acid hydrogel composition of the present invention, and an in situ -forming subcutaneous injection containing the same, are injected into the subcutaneous tissue with minimal invasiveness without skin excision and suturing in the fields of medicine, pharmaceuticals, and skin procedures. and can be usefully used as a formulation that can improve patient compliance by reducing the administration frequency by sustained release of the drug.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.It should be understood that the effects of the present invention are not limited to the above-described effects, and include all effects that can be inferred from the configuration of the invention described in the detailed description or claims of the present invention.

도 1은 본 발명에서 개발된 인산칼륨 가교 하이드로겔 네트워크의 개략도이다.
도 2는 HA-dopa 접합체의 합성 및 검증 결과로서, (a) HA-dopa 유도체의 합성 과정을 나타낸 화학식, (b) HA-dopa의 1H-NMR 스펙트럼[1.8-2.0 ppm(시프트 1) 및 6.6-6.9 ppm(시프트 2-4)에서의 화학적 이동은 각각 HA 및 dopa를 의미함], (c) dopa/HA의 중량비 및 dopa/HA의 적분비로 얻어진 선형회귀분석 추세선, (d) HA, HA-dopa 및 dopa의 UV-Vis 흡수 스펙트럼이다.
도 3a ~ 3f는 최적화된 하이드로겔 시스템의 물리화학적 특성으로서, (3a) HA-dopa(without pH adjustment), HA-dopa/K4, HA-dopa/K20, HA-dopa/K100 및 HA-dopa/K200의 졸-겔(Sol-gel) 전이를 반전 시험으로 조사한 결과, (3b) HA-dopa/K100(without pH adjustment), HA-dopa/NaH2PO4100, HA-dopa/KCl100 및 HA-dopa의 졸-겔 전이 특성을 반전 시험으로 시험한 결과, (3c) HA-dopa, HA-dopa/K4, HA-dopa/K20, HA-dopa/K100 및 HA-dopa/K200의 UV-Vis 흡광도 데이터, (3d) DPZ MS의 입자 특성으로서 입자 크기 분포(i) 및 SEM 이미지(ii)가 나타나 있으며[SEM 이미지에서 스케일 바의 길이는 100 μm임], (3e) 동결건조된 HA-dopa/DPZ MS 및 HA-dopa/DPZ MS/K100 표본의 SEM 이미지, (3f) HA-dopa/DPZ MS/K100 및 HA-dopa/DPZ MS/K100+HAase 군의 DPZ 방출 프로파일 결과[각 점은 평균±SD(n=3)를 나타냄]이다.
도 4a ~ 4d는 설계된 하이드로겔 네트워크의 유동학적 특성으로서, (4a) HA-dopa/DPZ MS/K100의 반전 시험에 의한 인큐베이션 시간-의존적 졸-겔 전이 특성, (4b) HA-dopa/DPZ MS/K100의 주사기 바늘 이용 주사가능성 시험 결과, (4c) HA-dopa/DPZ MS/K100의 신장성 시험 결과로서, 2개의 가교된 겔 단편(메틸렌 블루 존재 및 비존재 하)을 부착하고 이들의 신장성을 시험한 결과, (4d) HA-dopa, HA-dopa/DPZ MS, HA-dopa/K100 및 HA-dopa/DPZ MS/K100 표본의 변형률 및 진동수 변화 시험 결과[G' 및 G" 데이터를 변형률 및 진동수에 따라 표시함]이다.
도 5a ~ 5d는 최적화된 하이드로겔 시스템의 마우스에서 피하주사 후의 생분해 데이터로서, (5a) ICG, HA-dopa/DPZ MS/ICG, HA-dopa/K100/ICG 및 HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG 주사 군의 전신 스캔 NIRF 이미지[NIRF 신호는 336 시간 동안 모니터링함], (5b) 각 군에서 주사된 겔의 형광 강도 프로파일[각 점은 평균±SD(n=3)를 나타냄, * p<0.05], (5c) 투여 후 14 일에 주사 부위를 절단한 후 ICG, HA-dopa/DPZ MS/ICG, HA-dopa/K100/ICG 및 HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG-주사된 군의 남아 있는 겔 부분의 사진 및 중량 값의 그래프[각 점은 평균±SD(n=3)를 나타냄, * p<0.05], (5d) 투여 후 14 일에 HA-dopa/DPZ MS/ICG, HA-dopa/K100/ICG 및 HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG 군의 생체 외 NIRF 이미지 및 강도 값의 그래프[각 점은 평균±SD(n=3)를 나타냄, * p<0.05]이다. 1 is a schematic diagram of a potassium phosphate crosslinked hydrogel network developed in the present invention.
2 is a result of the synthesis and verification of the HA-dopa conjugate, (a) the chemical formula showing the synthesis process of the HA-dopa derivative, (b) 1 H-NMR spectrum of HA-dopa [1.8-2.0 ppm (shift 1) and Chemical shifts at 6.6-6.9 ppm (shift 2-4) mean HA and dopa, respectively], (c) linear regression trend line obtained with the weight ratio of dopa/HA and the integral ratio of dopa/HA, (d) HA, UV-Vis absorption spectra of HA-dopa and dopa.
Figures 3a to 3f are physicochemical properties of the optimized hydrogel system, ( 3a ) HA-dopa (without pH adjustment), HA-dopa / K4, HA-dopa / K20, HA-dopa / K100 and HA-dopa / As a result of investigating the sol-gel transition of K200 by inversion test, ( 3b ) HA-dopa/K100 (without pH adjustment), HA-dopa/NaH 2 PO 4 100, HA-dopa/KCl100 and HA- As a result of testing the sol-gel transition properties of dopa by inversion test, ( 3c ) UV-Vis absorbance of HA-dopa, HA-dopa/K4, HA-dopa/K20, HA-dopa/K100 and HA-dopa/K200 Data, ( 3d ) Particle size distribution (i) and SEM image (ii) as particle characteristics of DPZ MS [the length of scale bar in SEM image is 100 μm], ( 3e ) Lyophilized HA-dopa/ SEM images of DPZ MS and HA-dopa/DPZ MS/K100 specimens, ( 3f ) DPZ release profile results of HA-dopa/DPZ MS/K100 and HA-dopa/DPZ MS/K100+HAase groups [each point is the mean ± SD (n=3)].
Figures 4a to 4d are rheological properties of the designed hydrogel network, ( 4a ) incubation time-dependent sol-gel transition properties by inversion test of HA-dopa/DPZ MS/K100, ( 4b ) HA-dopa/DPZ MS Injectability test result using syringe needle of /K100, ( 4c ) As a result of extensibility test of HA-dopa/DPZ MS/K100, two crosslinked gel fragments (with and without methylene blue) were attached and their elongation As a result of the test for sex, ( 4d ) the strain and frequency change test results of HA-dopa, HA-dopa/DPZ MS, HA-dopa/K100 and HA-dopa/DPZ MS/K100 samples [G' and G" data Displayed according to strain and frequency].
5a to 5d are biodegradation data after subcutaneous injection in mice of the optimized hydrogel system, ( 5a ) ICG, HA-dopa/DPZ MS/ICG, HA-dopa/K100/ICG and HA-dopa/DPZ MS/K100 Whole body scan NIRF image of /ICG injection group [NIRF signal monitored for 336 h], ( 5b ) Fluorescence intensity profile of injected gel in each group [each dot represents mean±SD (n=3), *p <0.05], ( 5c ) ICG, HA-dopa/DPZ MS/ICG, HA-dopa/K100/ICG and HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG-injected after excision of the injection site 14 days after administration Photographs of the remaining gel fractions of the group and graphs of weight values [each dot represents mean±SD (n=3), * p<0.05], ( 5d ) HA-dopa/DPZ MS/ICG 14 days after administration , graphs of in vitro NIRF images and intensity values of HA-dopa/K100/ICG and HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG groups [each dot represents mean±SD (n=3), *p<0.05] am.

본 발명은 히알루론산-도파민 접합체 및 약학적으로 사용가능한 염의 양이온을 포함하고, pH 7 ~ 11인 하이드로겔 조성물을 제공한다.The present invention provides a hydrogel composition comprising a cation of a hyaluronic acid-dopamine conjugate and a pharmaceutically usable salt, and having a pH of 7 to 11.

본 발명의 하이드로겔 조성물에서 네트워크를 형성하는 메커니즘은 도 1에 나타나 있다. 히알루론산-도파민 접합체의 카테콜 기와 약학적으로 사용가능한 염의 양이온은 특정 pH 범위 환경에서 배위를 형성하고, 이에 따른 히알루론산-도파민 접합체의 카테콜 기의 공유 결합이 유도됨으로써 하이드로겔 가교 네트워크를 형성하게 된다. 상기 가교 네트워크에는 히알루론산-도파민 접합체의 카테콜 기들 사이의 수소 결합 및 양이온-π 상호 작용과 같은 상호작용도 기여할 것이다. 이에 따라, 본 발명에서 설계된 하이드로겔 구조는 졸-겔 전이 현상을 나타낸다. 또한, 본 발명에서 설계된 하이드로겔 구조는 겔 형성 후에 외부 압력이 적용되면 전단 연화 거동(shear thinning behavior)을 나타내며, 이는 피하주사에 적합한 물질 특성이다. 즉, 본 발명의 하이드로겔 조성물은 주사기 바늘을 통해 용이하게 주입될 수 있고, 피하주사된 후에는 주사 부위에서 가교된 겔 상태로 존재하게 되어, 하이드로겔에 도입된 약물이 서방출되도록 한다.The mechanism of forming a network in the hydrogel composition of the present invention is shown in FIG. 1 . The catechol group of the hyaluronic acid-dopamine conjugate and the cation of the pharmaceutically usable salt form a coordination in a specific pH range environment, thereby induced covalent bonding of the catechol group of the hyaluronic acid-dopamine conjugate to form a hydrogel cross-linked network. will do Interactions such as hydrogen bonding and cation-π interactions between the catechol groups of the hyaluronic acid-dopamine conjugate will also contribute to the cross-linking network. Accordingly, the hydrogel structure designed in the present invention exhibits a sol-gel transition phenomenon. In addition, the hydrogel structure designed in the present invention exhibits shear thinning behavior when external pressure is applied after gel formation, which is a material property suitable for subcutaneous injection. That is, the hydrogel composition of the present invention can be easily injected through a syringe needle, and after subcutaneous injection, it exists in a cross-linked gel state at the injection site, so that the drug introduced into the hydrogel is released slowly.

본 발명의 하이드로겔 조성물에 포함되는 히알루론산-도파민 접합체에 있어서, 이에 포함되는 히알루론산은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 히알루론산을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 평균 분자량이 10 ~ 3000 kDa, 더욱 바람직하게는 저분자량 등급인 100 ~ 1000 kDa인 히알루론산일 수 있다.In the hyaluronic acid-dopamine conjugate included in the hydrogel composition of the present invention, as the hyaluronic acid included therein, hyaluronic acid commonly used in the technical field to which the present invention belongs may be used, and preferably, the average molecular weight is 10 to 3000 It may be hyaluronic acid with a kDa, more preferably a low molecular weight grade of 100 to 1000 kDa.

일 구현예에서, 상기 히알루론산-도파민 접합체는 접합체 총 중량에 대하여 도파민이 1 ~ 40 중량%, 바람직하게는 5 ~ 15 중량%로 포함될 수 있다.In one embodiment, the hyaluronic acid-dopamine conjugate may contain 1 to 40% by weight of dopamine, preferably 5 to 15% by weight, based on the total weight of the conjugate.

일 구현예에서, 상기 히알루론산-도파민 접합체는 하이드로겔 조성물 중에서 졸-겔 전이를 나타내는 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 하이드로겔 조성물 중 최종 농도 1 ~ 100 mg/mL, 바람직하게는 5 ~ 50 mg/mL로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In one embodiment, the hyaluronic acid-dopamine conjugate may be included in a concentration showing sol-gel transition in the hydrogel composition, for example, the final concentration in the hydrogel composition is 1 ~ 100 mg / mL, preferably 5 ~ It may be included at 50 mg/mL, but is not limited thereto.

본 명세서에서, "약학적으로 사용가능한 염"이라 함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 의약품에 사용가능한 염으로서, 바람직하게는 피하주사 등의 인체에 적용되는 제형에 사용가능한 염이다. 예를 들어, 나트륨염, 칼륨염 등과 같은 알칼리 금속염; 칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등과 같은 알칼리 토금속염; 알루미늄염 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 약학적으로 사용가능한 염의 구체적인 예로서는 수산화나트륨(NaOH), 제1인산칼륨(KH2PO4), 제2인산칼륨(K2HPO4), 염화칼륨(KCl), 제1인산나트륨(NaH2PO4), 제2인산나트륨(Na2HPO4), 염화나트륨(NaCl) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종의 염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 약학적으로 사용가능한 염의 양이온은 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 바륨 이온, 알루미늄 이온 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종의 양이온이다.In the present specification, the term "pharmaceutically usable salt" refers to a salt that can be used in pharmaceuticals in the art to which the present invention belongs, preferably a salt that can be used in formulations applied to the human body, such as subcutaneous injection. alkali metal salts such as, for example, sodium salts, potassium salts and the like; alkaline earth metal salts such as calcium salts, magnesium salts and barium salts; It may include, but is not limited to, an aluminum salt. Specific examples of the pharmaceutically usable salt include sodium hydroxide (NaOH), potassium phosphate monobasic (KH 2 PO 4 ), potassium phosphate dibasic (K 2 HPO 4 ), potassium chloride (KCl), sodium phosphate monobasic (NaH 2 PO). 4 ), sodium phosphate dibasic (Na 2 HPO 4 ), sodium chloride (NaCl), and one salt selected from the group consisting of mixtures thereof may be included, but is not limited thereto. The cation of the pharmaceutically usable salt is one kind of cation selected from the group consisting of sodium ion, potassium ion, calcium ion, magnesium ion, barium ion, aluminum ion, and mixtures thereof.

일 구현예에서, 상기 약학적으로 사용가능한 염은 하이드로겔 조성물 중에서 졸-겔 전이를 나타내는 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 하이드로겔 조성물 중 최종 농도 10 mM 이상의 약학적으로 사용 가능한 농도로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 하이드로겔 조성물 중 최종 농도 10 ~ 1000 mM, 더욱 바람직하게는 100 ~ 300 mM일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In one embodiment, the pharmaceutically usable salt may be included in a concentration exhibiting sol-gel transition in the hydrogel composition, for example, to be used at a pharmaceutically usable concentration of 10 mM or more in the hydrogel composition. can Preferably, the final concentration in the hydrogel composition may be 10 ~ 1000 mM, more preferably 100 ~ 300 mM, but is not limited thereto.

일 구현예에서, 상기 하이드로겔 조성물은 난용성 약물을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 난용성 약물은 수용해도가 비교적 낮은 약물을 의미하며, 예를 들어, 도네페질, 암포테리신 B, 커큐민, 플로레틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 덱사메타손, 부데소나이드, 시클로스포린, 타크로리무스, 라파마이신, 페노피브레이트, 프레드니솔론, 이트라코나졸, 인슐린(중성 pH), 인도메타신 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In one embodiment, the hydrogel composition may further include a poorly soluble drug, and the poorly soluble drug means a drug having relatively low water solubility, for example, donepezil, amphotericin B, curcumin, It may be one selected from the group consisting of floretin, paclitaxel, docetaxel, dexamethasone, budesonide, cyclosporine, tacrolimus, rapamycin, fenofibrate, prednisolone, itraconazole, insulin (neutral pH), indomethacin, and mixtures thereof. , but not limited thereto.

일 구현예에서, 상기 난용성 약물은 마이크로스피어(microsphere)에 캡슐화될 수 있다. 상기 마이크로스피어는 통상적으로 사용되는 유화 및 용매 증발 방법을 이용하여 제조될 수 있으며, 요약하면 하기와 같다. 폴리(락틱-코-글리콜산)[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]과 난용성 약물을 유기용매에 용해시킨 후 폴리비닐알코올 수용액에 첨가하여 균질화시킴으로써 에멀젼을 얻는다. 이 때 사용되는 PLGA는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 PLGA일 수 있으며, 바람직하게는 락트산:글리콜산(10:90 ~ 90:10), 더욱 바람직하게는 락트산:글리콜산(40:60 ~ 60:40)으로 구성된 PLGA일 수 있으며, 평균 분자량 10 ~ 100 kDa일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 얻어진 에멀젼을 교반하여 유기상을 증발시킨 다음, 적절한 분리 방법(예를 들어, 원심분리 등)을 이용하여 마이크로스피어를 분리한다.In one embodiment, the poorly soluble drug may be encapsulated in microspheres. The microspheres can be prepared using commonly used emulsification and solvent evaporation methods, which are summarized as follows. After dissolving poly(lactic-co-glycolic acid) [poly( lactic-co-glycolic acid), PLGA] and a poorly soluble drug in an organic solvent, it is added to an aqueous polyvinyl alcohol solution and homogenized to obtain an emulsion. The PLGA used at this time may be PLGA commonly used in the art to which the present invention belongs, preferably lactic acid: glycolic acid (10:90 to 90:10), more preferably lactic acid: glycolic acid (40: 60 to 60:40), and may have an average molecular weight of 10 to 100 kDa, but is not limited thereto. The resulting emulsion is stirred to evaporate the organic phase, and then the microspheres are separated using an appropriate separation method (eg, centrifugation, etc.).

상기와 같은 방법으로 제조된 마이크로스피어는 평균 부피 밀도-연관 직경이 1 ~ 100 μm, 바람직하게는 5 ~ 30 μm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The microspheres prepared by the above method may have an average bulk density-associated diameter of 1 to 100 μm, preferably 5 to 30 μm, but is not limited thereto.

본 발명은 또한, 상기 하이드로겔 조성물을 포함하는 인시튜(in situ) 형성 피하주사용 주사제를 제공한다. 본 발명의 하이드로겔 조성물은 상기 설명한 바와 같은 졸-겔 전이 특성, 전단 연화 거동, 신장성에 의한 자가치유능, 및 약물의 서방출 특성을 나타내므로, 약물의 피하주사 제형에 사용될 수 있으며, 약물 특성에 따라 히알루론산-도파민 접합체 및 약학적으로 사용가능한 염을 적절히 조절하여 설계할 수 있다.The present invention also provides in situ ( in situ ) forming subcutaneous injection containing the hydrogel composition. The hydrogel composition of the present invention exhibits the above-described sol-gel transition properties, shear softening behavior, self-healing ability by extensibility, and sustained-release properties of the drug, so it can be used for subcutaneous injection formulations of drugs, and drug properties Accordingly, it can be designed by appropriately adjusting the hyaluronic acid-dopamine conjugate and the pharmaceutically usable salt.

본 발명은 또한, 히알루론산-도파민 접합체 및 약학적으로 사용가능한 염을 혼합하는 단계를 포함하는 하이드로겔 조성물의 제조방법을 제공한다. 상기 제조방법의 일 실시예에서는, 상기 히알루론산-도파민 접합체를 물에 분산시켜 분산액을 제조한 후, 약학적으로 사용가능한 염의 용액을 상기 분산액에 첨가하여 제조할 수 있다. 이 때, 히알루론산-도파민 접합체 분산액에 난용성 약물을 추가로 첨가하여 난용성 약물이 도입된 하이드로겔 조성물을 제조할 수 있다. 상기 난용성 약물은 마이크로스피어에 캡슐화된 형태로 첨가될 수 있다. 난용성 약물 및 마이크로스피어는 상기에서 설명한 바와 같다.The present invention also provides a method for preparing a hydrogel composition comprising mixing a hyaluronic acid-dopamine conjugate and a pharmaceutically usable salt. In one embodiment of the preparation method, the hyaluronic acid-dopamine conjugate is dispersed in water to prepare a dispersion, and then a solution of a pharmaceutically usable salt may be added to the dispersion to prepare it. At this time, by further adding a poorly soluble drug to the hyaluronic acid-dopamine conjugate dispersion, a hydrogel composition into which the poorly soluble drug is introduced can be prepared. The poorly soluble drug may be added in an encapsulated form in microspheres. Poorly soluble drugs and microspheres are as described above.

상기 히알루론산-도파민 접합체는 히알루론산 및 도파민을 EDC-NHS 커플링을 이용하여 아미드 결합 반응시키는 단계에 의해 제조될 수 있다. 제조 과정을 요약하면, 히알루론산을 물에 분산시킨 후, EDC 및 NHS의 유기용매 용액과 상기 히알루론산 분산액을 혼합하여 히알루론산의 카르복실산 기를 활성화시킨다. 상기 혼합액의 pH를 산성화한 다음, 도파민 용액을 첨가하여 반응시킴으로써 히알루론산-도파민 접합체를 얻을 수 있다(도 2a).The hyaluronic acid-dopamine conjugate may be prepared by subjecting hyaluronic acid and dopamine to an amide bond reaction using EDC-NHS coupling. To summarize the manufacturing process, after hyaluronic acid is dispersed in water, the organic solvent solution of EDC and NHS and the hyaluronic acid dispersion are mixed to activate the carboxylic acid group of hyaluronic acid. A hyaluronic acid-dopamine conjugate can be obtained by acidifying the pH of the mixed solution and then reacting by adding a dopamine solution (FIG. 2a).

상기 약학적으로 사용가능한 염은 상기에서 설명한 바와 같다.The pharmaceutically usable salt is as described above.

본 발명의 바람직한 구현예에서는 히알루론산-도파민 접합체의 하이드로겔 네트워크를 가교시키기 위하여 기존에 사용하던 철염 대신 생리적으로 사용가능한 약학적 염 중 하나인 제1인산칼륨(KH2PO4)을 도입하였다. 이는 히알루론산-도파민 접합체의 겔 구조를 가교시키는데 KH2PO4를 사용하는 최초 시도이다. KH2PO4는 완충액 제조에 널리 사용되는 인산염 중 하나이며 일반적으로 안전한(GRAS) 물질로 인식되고 있다. KH2PO4에 의해 가교된 점탄성적으로 비유동적인 히알루론산-도파민 접합체 하이드로겔은 약물 서방출 프로파일 및 임상 활용상 충분한 안전성을 제공할 것이다. 또한, 상기 하이드로겔 시스템에 도입된 약물로서 알츠하이머성 치매 치료제인 도네페질 염산염(donepezil hydrochloride)은 원래 수용성이 높은 물질이나, 본 제형에서는 서방출을 위해 염이 결합되어 있지 않은 도네페질(donepezil, DPZ)을 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 마이크로스피어(microsphere, MS)에 봉입하였고, 이를 KH2PO4로 교차결합시킨 HA-dopa 하이드로겔에 도입하여 제조하였다. 제조된 DPZ MS 함입 HA-dopa/KH2PO4 하이드로겔은 단일 주사기를 사용한 피하주사용 인시튜 겔 형성 시스템으로 사용될 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, potassium monobasic phosphate (KH 2 PO 4 ), one of physiologically usable pharmaceutical salts, was introduced instead of the previously used iron salt to cross-link the hydrogel network of the hyaluronic acid-dopamine conjugate. This is the first attempt to use KH 2 PO 4 to crosslink the gel structure of the hyaluronic acid-dopamine conjugate. KH 2 PO 4 is one of the widely used phosphates for buffer preparation and is generally recognized as a safe (GRAS) material. The viscoelastically non-flowing hyaluronic acid-dopamine conjugate hydrogel cross-linked by KH 2 PO 4 will provide sufficient safety for drug sustained-release profile and clinical application. In addition, as a drug introduced into the hydrogel system, donepezil hydrochloride, a treatment for Alzheimer's dementia, is a material with high water solubility, but in this formulation, donepezil (DPZ), which is not bound to a salt for sustained release ) was encapsulated in poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres (MS), and it was prepared by introducing it into a HA-dopa hydrogel crosslinked with KH 2 PO 4 . The prepared DPZ MS-impregnated HA-dopa/KH 2 PO 4 hydrogel can be used as an in situ gel-forming system for subcutaneous injection using a single syringe.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, the following examples are intended to illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.

<< 실시예Example >>

1. 물질 및 실험방법1. Substances and test methods

1.1. 물질1.1. matter

3-히드록시티라민 히드로클로라이드(3-Hydroxytyramine hydrochloride, 도파민) 및 인도시아닌 그린(indocyanine green, ICG)은 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (일본 도쿄)에서 구입하였다. 히알루론산(hyaluronic acid [HA], 초저분자량 등급; 평균 MW: ~ 500 kDa)은 Bioland Co., Ltd. (한국, 천안)에서 얻었다. PLGA(락트산:글리콜산 = 50:50, Mn: 45~55 kDa)는 PolySciTech(미국 인디애나주 웨스트 라파예트 소재의 Akina, Inc.)로부터 입수하였다. 수산화나트륨(NaOH), 제1인산칼륨(KH2PO4) 및 염화칼륨(KCl)은 Daejung Chemicals & Metals Co. Ltd. (한국 시흥)에서 구입하였다. 중수(D2O), 히알루로니다제(HAase[소 고환 유래, 400 ~ 1000 units/mg 고체]), N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC), 폴리비닐 알코올(PVA; MW: 67 kDa), 제1인산나트륨(NaH2PO4) 및 트윈 80은 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich, 미국 미주리 주 세인트루이스)에서 구입하였다. DPZ은 종근당제약(Chong Kun Dang Pharmaceutical Corporation, 서울)에 의해 제공되었다. 다른 모든 시약은 분석 등급이었으며 상업적으로 구입가능하였다.3-Hydroxytyramine hydrochloride (dopamine) and indocyanine green (ICG) are manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tokyo, Japan). Hyaluronic acid (hyaluronic acid [HA], ultra-low molecular weight grade; average MW: ~ 500 kDa) is manufactured by Bioland Co., Ltd. (Cheonan, Korea). PLGA (lactic acid:glycolic acid = 50:50, Mn: 45-55 kDa) was obtained from PolySciTech (Akina, Inc., West Lafayette, Indiana). Sodium hydroxide (NaOH), potassium monobasic (KH 2 PO 4 ) and potassium chloride (KCl) are manufactured by Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. Ltd. It was purchased from (Siheung, Korea). Heavy water (D 2 O), hyaluronidase (HAase [from bovine testis, 400 to 1000 units/mg solids]), N -hydroxysuccinimide (NHS), N- (3-dimethylamino ) Propyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride (N- ( 3- dimethylaminopropyl )-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC), polyvinyl alcohol (PVA; MW: 67 kDa), monobasic sodium phosphate (NaH 2 PO 4 ) and Tween 80 were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). DPZ was provided by Chong Kun Dang Pharmaceutical Corporation (Seoul). All other reagents were analytical grade and commercially available.

1.2. HA-dopa의 합성 및 확인1.2. Synthesis and identification of HA-dopa

HA-dopa는 EDC 및 NHS에 의해 촉매화된 아미드 결합을 통해 합성하였다. HA(96 mg)를 증류수(DW) 10 mL에 투명하게 분산시켰다. EDC(61.3 mg) 및 NHS(36.8 mg)를 포함하는 디메틸설폭사이드(DMSO, 10 mL)를 HA 분산액과 혼합하여 HA의 카르복실산 기를 활성화시켰다. 1N HCl을 첨가하여 pH를 5로 조절하고, 도파(dopa, 49.3 mg)를 포함하는 DMSO(5 mL)를 상기 혼합물에 첨가하였다. 이를 실온에서 1 일 동안 교반하고 투석 백으로 옮겼다(분자량 컷오프(MWCO): 7 kDa). 미반응 물질을 제거하기 위하여 합성된 중합체의 투석 과정에서 DW를 3 일 동안 사용하였다. 최종 결과물을 이후 사용하기 위하여 동결건조시켰다.HA-dopa was synthesized via amide linkages catalyzed by EDC and NHS. HA (96 mg) was transparently dispersed in 10 mL of distilled water (DW). Dimethylsulfoxide (DMSO, 10 mL) containing EDC (61.3 mg) and NHS (36.8 mg) was mixed with the HA dispersion to activate the carboxylic acid groups of the HA. 1N HCl was added to adjust the pH to 5, and DMSO (5 mL) containing dopa (49.3 mg) was added to the mixture. It was stirred at room temperature for 1 day and transferred to a dialysis bag (molecular weight cutoff (MWCO): 7 kDa). DW was used for 3 days during dialysis of the synthesized polymer to remove unreacted substances. The final product was lyophilized for later use.

HA-dopa 접합체의 합성 여부를 확인하기 위하여, 양성자 핵자기 공명(1H-NMR) 분광법을 사용하였다. HA-dopa에서 dopa 함량을 측정하기 위하여, 상이한 중량비의 dopa 대 HA를 갖는 혼합물 샘플을 제조하고 이들의 통합 값(integration value)을 1H-NMR 분광법(JNM-ECA-600, JEOL Ltd., 일본 아키시마)으로 얻었다. HA-dopa 중합체에서의 dopa 함량은 이들 표준 샘플에 기반하여 작성된 선형회귀분석 추세선에 의해 계산하였다.To confirm whether the HA-dopa conjugate was synthesized, proton nuclear magnetic resonance ( 1 H-NMR) spectroscopy was used. To determine the dopa content in HA-dopa, mixture samples with different weight ratios of dopa to HA were prepared and their integration values were measured by 1 H-NMR spectroscopy (JNM-ECA-600, JEOL Ltd., Japan). from Akishima). The dopa content in the HA-dopa polymer was calculated by a linear regression trend line created based on these standard samples.

HA-dopa의 합성은 자외선-가시광선(UV-Vis) 영역에서 분광학적 분석으로 검증하였다. HA(800 μg/mL), HA-dopa(800 μg/mL) 및 dopa(DW 중 2, 10, 40, 80 및 120 μg/mL)의 흡광도 데이터(250 ~ 400 nm 범위)를 UV-Vis 분광계(Libra S80 이중-빔 분광광도계, Biochrom Ltd., Cambridge, UK)로 측정하였다. 선형회귀분석 추세선은 280 nm에서의 흡광도 데이터로부터 얻었으며, HA-dopa의 dopa 함량은 해당 표준 곡선으로부터 계산하였다.The synthesis of HA-dopa was verified by spectroscopic analysis in the ultraviolet-visible (UV-Vis) region. Absorbance data (ranging from 250 to 400 nm) of HA (800 μg/mL), HA-dopa (800 μg/mL) and dopa (2, 10, 40, 80, and 120 μg/mL in DW) were analyzed using a UV-Vis spectrometer. (Libra S80 dual-beam spectrophotometer, Biochrom Ltd., Cambridge, UK). The linear regression analysis trend line was obtained from the absorbance data at 280 nm, and the dopa content of HA-dopa was calculated from the corresponding standard curve.

1.3. 가교 하이드로겔 시스템의 제조 및 물리화학적 특성 평가1.3. Preparation of cross-linked hydrogel systems and evaluation of physicochemical properties

HA-dopa 기반 겔 구조의 겔화 거동에 대한 KH2PO4 농도의 영향을 육안 검사로 평가하였다[S.Y. Lee, et al., Int. J. Pharm. 582 (2020) 119309]. DW에 분산된 HA-dopa 분산액(겔 조성물에서 최종 농도 15 mg/mL)과 상이한 농도의 KH2PO4 용액(겔 전구체에서 최종 농도 4, 20, 100 및 200 mM, pH 8)을 혼합하였다. 이들의 졸-겔 전이 특성은 실온에서 24 시간 동안 인큐베이션한 후 반전 방법으로 시험하였다.The effect of KH 2 PO 4 concentration on the gelation behavior of the HA-dopa-based gel structure was evaluated by visual inspection [SY Lee, et al., Int. J. Pharm. 582 (2020) 119309]. The HA-dopa dispersion dispersed in DW (final concentration 15 mg/mL in the gel composition) and KH 2 PO 4 solutions of different concentrations (final concentrations 4, 20, 100 and 200 mM, pH 8 in the gel precursor) were mixed. Their sol-gel transition properties were tested by inversion method after incubation at room temperature for 24 hours.

설계된 하이드로겔의 겔화 특성에 대한 이온 및 pH의 영향은 반전 시험으로 조사하였다[S.Y. Lee, et al., Int. J. Pharm. 582 (2020) 119309]. HA-dopa(15 mg/mL) + 100 mM KH2PO4(pH 조절 없음), HA-dopa(15 mg/mL) + 100 mM NaH2PO4(pH 8), HA-dopa(15 mg/mL) + 100 mM KCl(pH 8) 및 HA-dopa + DW(pH 8) 군을 각각 제조하고 pH 값을 측정하였다. 실온에서 24 시간 동안 인큐베이션한 후, 이들의 겔화 특성을 반전 시험으로 평가하였다.The effect of ions and pH on the gelling properties of the designed hydrogel was investigated by inversion test [SY Lee, et al., Int. J. Pharm. 582 (2020) 119309]. HA-dopa (15 mg/mL) + 100 mM KH 2 PO 4 (no pH adjustment), HA-dopa (15 mg/mL) + 100 mM NaH 2 PO 4 (pH 8), HA-dopa (15 mg/mL) mL) + 100 mM KCl (pH 8) and HA-dopa + DW (pH 8) groups were prepared, respectively, and pH values were measured. After incubation at room temperature for 24 hours, their gelation properties were evaluated by inversion test.

겔 구조에 대한 KH2PO4 농도의 영향을 UV-Vis 분광법으로 추가 분석하였다. HA-dopa(0 mM KH2PO4(pH 8)), HA-dopa/K4(4 mM KH2PO4(pH 8)), HA-dopa/K20(20 mM KH2PO4(pH 8)), HA-dopa/K100(100 mM KH2PO4(pH 8)) 및 HA-dopa/K200(200 mM KH2PO4(pH 8)) 검체는 전술한 바와 같이 제조하였고, 이들의 흡광도 데이터는 250 ~ 700 nm 파장 범위에서 모니터링하였다(Libra S80 이중-빔 분광광도계, Biochrom Ltd., 케임브리지, 영국).The effect of KH 2 PO 4 concentration on the gel structure was further analyzed by UV-Vis spectroscopy. HA-dopa (0 mM KH 2 PO 4 (pH 8)), HA-dopa/K4 (4 mM KH 2 PO 4 (pH 8)), HA-dopa/K20 (20 mM KH 2 PO 4 (pH 8)) ), HA-dopa/K100 (100 mM KH 2 PO 4 (pH 8)) and HA-dopa/K200 (200 mM KH 2 PO 4 (pH 8)) samples were prepared as described above, and their absorbance data was monitored in the 250-700 nm wavelength range (Libra S80 dual-beam spectrophotometer, Biochrom Ltd., Cambridge, UK).

DPZ MS는 변형된 유화 및 용매 증발 방법으로 보고된 바에 따라 제조하였다[S.Y. Lee, et al., Int. J. Pharm. 582 (2020) 119309; J.W. Choi, J.H. Park, H.R. Cho, J.W. Chung, D.D. Kim, H.C. Kim, H.J. Cho, Sorafenib and 2,3,5-triiodobenzoic acid-loaded imageable microspheres for transarterial embolization of a liver tumor, Sci. Rep. 7 (2017) 554]. PLGA(50 mg) 및 DPZ(5 mg)을 디클로로메탄(1.5 mL)에 용해시키고 DW(15 mL) 중 PVA 0.5 %(w/v)에 첨가하였다. 상기 혼합물을 고속균질화기(ULTRA-TURRAX® T25 basic, IKA, 미국 노스캐롤라이나 주 윌밍턴)로 9,000 rpm에서 5 초 동안 즉시 처리하였다. 얻어진 에멀젼을 30분 동안 교반하여 유기상을 증발시켜 제거하였다. 16,100 g에서 5분 동안 원심분리하여 MS 펠렛을 수득하고 동결건조를 위하여 DW에 분산시켰다.DPZ MS was prepared as reported by a modified emulsification and solvent evaporation method [SY Lee, et al., Int. J. Pharm. 582 (2020) 119309; JW Choi, JH Park, HR Cho, JW Chung, DD Kim, HC Kim, HJ Cho, Sorafenib and 2,3,5-triiodobenzoic acid-loaded imageable microspheres for transarterial embolization of a liver tumor, Sci. Rep. 7 (2017) 554]. PLGA (50 mg) and DPZ (5 mg) were dissolved in dichloromethane (1.5 mL) and added to PVA 0.5% (w/v) in DW (15 mL). The mixture was immediately treated with a high-speed homogenizer (ULTRA-TURRAX ® T25 basic, IKA, Wilmington, NC, USA) at 9,000 rpm for 5 seconds. The resulting emulsion was stirred for 30 minutes and the organic phase was removed by evaporation. MS pellets were obtained by centrifugation at 16,100 g for 5 min and dispersed in DW for lyophilization.

DPZ MS의 입자 크기 및 분포를 레이저 회절 입자 크기 분석기(Mastersizer 3000, Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK)로 평가하였다. 제조된 DPZ MS의 형태는 전계-방출 주사 전자 현미경(FE-SEM; SUPRA 55VP, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.The particle size and distribution of the DPZ MS was evaluated with a laser diffraction particle size analyzer (Mastersizer 3000, Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK). The morphology of the prepared DPZ MS was observed with a field-emission scanning electron microscope (FE-SEM; SUPRA 55VP, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany).

DPZ MS에서의 약물 캡슐화율 수치는 UV-Vis 검출기(1260 VWD), 자동 샘플러(1260 Vialsampler) 및 펌프(1260 Quat Pump VL)로 구성된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템(1260 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)으로 분석하였다. 제1인산칼륨(potassium phosphate monobasic, 10 mM) 및 아세토니트릴(65:35, v/v)을 이동상 제조에 사용하였다. 역상 C18 컬럼(Kinetex, 250 mm×4.6 mm, 5 μm; Phenomenex, Torrance, CA, USA)을 채택하고 유속을 1 mL/분으로 고정시켰다. 주입 부피는 20 μL였고 측정 파장은 268 nm로 설정하였다.Drug encapsulation rate figures in DPZ MS were obtained from a high performance liquid chromatography (HPLC) system (1260 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Potassium phosphate monobasic (10 mM) and acetonitrile (65:35, v/v) were used to prepare the mobile phase. A reversed-phase C18 column (Kinetex, 250 mm × 4.6 mm, 5 μm; Phenomenex, Torrance, CA, USA) was adopted and the flow rate was fixed at 1 mL/min. The injection volume was 20 μL and the measurement wavelength was set to 268 nm.

HA-dopa/DPZ MS/K100 하이드로겔 시스템을 블렌딩 방법에 의해 제조하였다. HA-dopa(15 mg/mL), DPZ MS(DPZ 최종 농도 1 mg/mL) 및 KH2PO4(100 mM의 최종 농도, pH 8)를 DW에 분산 또는 용해시켰다. DW에 HA-dopa를 완전히 분산시킨 후, DPZ MS 현탁액 및 KH2PO4 용액을 그 분산액에 첨가하였다.The HA-dopa/DPZ MS/K100 hydrogel system was prepared by the blending method. HA-dopa (15 mg/mL), DPZ MS (DPZ final concentration 1 mg/mL) and KH 2 PO 4 (100 mM final concentration, pH 8) were dispersed or dissolved in DW. After HA-dopa was completely dispersed in DW, DPZ MS suspension and KH 2 PO 4 solution were added to the dispersion.

HA-dopa/DPZ MS 및 HA-dopa/DPZ MS/K100의 단면 형태는 FE-SEM(SUPRA 55VP, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 관찰하였다. 겔 전구체를 24 시간 동안 경화시키고 FE-SEM 영상화를 위하여 동결건조시켰다.The cross-sectional morphologies of HA-dopa/DPZ MS and HA-dopa/DPZ MS/K100 were observed using FE-SEM (SUPRA 55VP, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany). The gel precursors were cured for 24 h and lyophilized for FE-SEM imaging.

개발된 가교 하이드로겔 시스템으로부터의 DPZ 방출 패턴은 HAase의 존재 또는 비존재 하에서 측정하였다[S.Y. Lee, et al., Int. J. Pharm. 582 (2020) 119309; W.W. Lwin, N. Puyathorn, S. Senarat, J. Mahadiek, T. Phaechamud, Emerging role of polyethylene glycol on doxycycline hyclateincorporated Eudragit RS in situ forming gel for periodontitis treatment, J. Pharm. Investig. 50 (2020) 8194]. DPZ(0.6 mg)를 함유하는 HA-dopa/DPZ MS/K100 하이드로겔(0.6 mL)을 Midi-GeBAflex 튜브(MWCO: 3.5 kDa; Gene Bio-Application Ltd., Kfar Hanagide, Israel)에 첨가하고, 상기 투석 튜브를 0.3 % 트윈 80(30 mL)을 포함하는 PBS(pH 7.4)로 옮겼다. 약물 방출 프로파일에 대한 HAase의 영향을 측정하기 위하여, HAase(1 mg/mL)-로딩 HA-dopa/DPZ MS/K100 하이드로겔도 제조하였다. 약물 방출 시험용 샘플을 진탕 인큐베이터에서 37 ℃, 50 rpm으로 인큐베이션하였다. 방출 시험 개시 후 4, 24, 48, 72, 144, 168, 216, 288, 360, 504 및 672 시간에 각 샘플의 방출액 일정량(200 μL)을 취하고 동일한 부피의 새로운 방출 매질(medium)을 첨가하였다. 상기 설명한 HPLC 방법으로 취한 방출액의 약물 농도를 정량분석하였다.The DPZ release pattern from the developed cross-linked hydrogel system was measured in the presence or absence of HAase [S.Y. Lee, et al., Int. J. Pharm. 582 (2020) 119309; W.W. Lwin, N. Puyathorn, S. Senarat, J. Mahadiek, T. Phaechamud, Emerging role of polyethylene glycol on doxycycline hyclateincorporated Eudragit RS in situ forming gel for periodontitis treatment, J. Pharm. Investig. 50 (2020) 8194]. HA-dopa/DPZ MS/K100 hydrogel (0.6 mL) containing DPZ (0.6 mg) was added to a Midi-GeBAflex tube (MWCO: 3.5 kDa; Gene Bio-Application Ltd., Kfar Hanagide, Israel), and the The dialysis tube was transferred to PBS (pH 7.4) containing 0.3% Tween 80 (30 mL). To measure the effect of HAase on the drug release profile, HAase (1 mg/mL)-loaded HA-dopa/DPZ MS/K100 hydrogels were also prepared. Samples for drug release testing were incubated at 37° C. and 50 rpm in a shaking incubator. At 4, 24, 48, 72, 144, 168, 216, 288, 360, 504 and 672 hours after the start of the release test, a certain amount (200 μL) of the release solution of each sample was taken and an equal volume of fresh release medium was added. did The drug concentration of the release solution taken by the HPLC method described above was quantitatively analyzed.

1.4. 제조된 하이드로겔 구조의 유동학적 특성1.4. Rheological properties of the prepared hydrogel structure

HA-dopa/DPZ MS/K100 하이드로겔의 겔화 시간은 반전 시험으로 측정하였다. 겔 전구체[HA-dopa(15 mg/mL), DPZ MS(DPZ 최종 농도 1 mg/mL) 및 KH2PO4(최종 농도 100 mM, pH 8)]를 제조하고, 0, 10, 30, 60, 120, 240 및 360 분 동안 인큐베이션한 이후에 반전시켜 유동성을 시험하였다.The gelation time of the HA-dopa/DPZ MS/K100 hydrogel was measured by an inversion test. The gel precursors [HA-dopa (15 mg/mL), DPZ MS (DPZ final concentration 1 mg/mL) and KH 2 PO 4 (final concentration 100 mM, pH 8)] were prepared, 0, 10, 30, 60 , 120, 240 and 360 min incubation followed by inversion to test fluidity.

설계된 HA-dopa/DPZ MS/K100 하이드로겔의 단일 주사기 시스템을 통한 주사가능성을 평가하였다. 겔 전구체[HA-dopa(15 mg/mL), DPZ MS(DPZ 최종 농도 1 mg/mL) 및 KH2PO4(최종 농도 100 mM, pH 8)]를 6 시간 인큐베이션한 후 이들의 주사가능성을 확인하기 위하여 주사기 바늘을 통해 밀어내었다.The injectability of the designed HA-dopa/DPZ MS/K100 hydrogel through a single syringe system was evaluated. After incubation of the gel precursors [HA-dopa (15 mg/mL), DPZ MS (DPZ final concentration 1 mg/mL) and KH 2 PO 4 (final concentration 100 mM, pH 8)] for 6 h, their injectability was evaluated. It was pushed through the syringe needle to confirm.

HA-dopa/DPZ MS/K100 하이드로겔의 자가치유능을 신장성 시험으로 조사하였다[S.Y. Lee, et al., Int. J. Pharm. 582 (2020) 119309]. 메틸렌 블루(0.2 mg/mL)의 존재 또는 비존재 하에서 HA-dopa(15 mg/mL), DPZ MS(DPZ 최종 농도 1 mg/mL) 및 KH2PO4(최종 농도 100 mM, pH 8)로 구성된 하이드로겔 단편을 준비하였다. 설계된 하이드로겔의 신장성을 부착 1 시간 후에 시험하였다.The self-healing ability of HA-dopa/DPZ MS/K100 hydrogel was investigated by extensibility test [SY Lee, et al., Int. J. Pharm. 582 (2020) 119309]. HA-dopa (15 mg/mL), DPZ MS (DPZ final concentration 1 mg/mL) and KH 2 PO 4 (final concentration 100 mM, pH 8) in the presence or absence of methylene blue (0.2 mg/mL) The constructed hydrogel fragment was prepared. The extensibility of the designed hydrogel was tested 1 hour after adhesion.

HA-dopa, HA-dopa/DPZ MS, HA-dopa/K100 및 HA-dopa/DPZ MS/K100 군의 유동학적 특성을 레오미터(rheometer, Advanced Rheometric Expansion System; Rheometric Scientific, Inc., Piscataway, NJ, 미국)를 사용하여 평가하였다[S.Y. Lee, et al., Int. J. Pharm. 582 (2020) 119309]. 동적 변형률 변화 시험(dynamic strain sweep) 프로파일은 50 rad/s 진동수 및 25 ℃ 온도에서 측정하였고, G' 및 G" 값은 1 ~ 400 % 변형 범위에서 측정하였다. 동적 진동수 변화 시험에서는, 변형률을 25 ℃에서 10 %로 설정하고 G' 및 G" 값을 1 ~ 100 rad/s의 진동수 범위에서 측정하였다.The rheological properties of the HA-dopa, HA-dopa/DPZ MS, HA-dopa/K100 and HA-dopa/DPZ MS/K100 groups were analyzed using a rheometer (Advanced Rheometric Expansion System; Rheometric Scientific, Inc., Piscataway, NJ). , USA) was evaluated using [SY Lee, et al., Int. J. Pharm. 582 (2020) 119309]. The dynamic strain sweep profile was measured at a frequency of 50 rad/s and a temperature of 25 °C, and the G' and G" values were measured in the range of 1 to 400 % strain. In the dynamic frequency change test, the strain was measured at 25 It was set to 10% at ℃ and the G' and G" values were measured in the frequency range of 1 to 100 rad/s.

1.5. 생체 내 생분해 시험1.5. In vivo biodegradation test

설계된 하이드로겔 시스템의 생분해성 패턴은 실시간 광학 영상화에 의해 관찰되었다. 근적외선 형광(near-infrared fluorescence, NIRF) 영상화를 위하여, 본 연구에서는 NIRF 염료로서 ICG를 하이드로겔 구조에 포함시켰다. ICG를 0.5 mg/mL로 하이드로겔의 전구체 혼합물에 첨가하였고, 하이드로겔 시스템의 다른 제조 프로토콜은 상기 설명된 바와 동일하였다.The biodegradability pattern of the designed hydrogel system was observed by real-time optical imaging. For near-infrared fluorescence (NIRF) imaging, ICG as a NIRF dye was incorporated into the hydrogel structure in this study. ICG was added to the precursor mixture of the hydrogel at 0.5 mg/mL, and the other preparation protocol of the hydrogel system was the same as described above.

제조된 하이드로겔의 생분해성은 ICR(Institute of Cancer Research) 마우스(수컷, 5 주령, 오리엔트 바이오, 성남, 한국)에 피하주사된 ICG 용액 또는 ICG-로딩 겔 구조의 NIRF 신호를 모니터링함으로써 평가하였다. 동물 실험 프로토콜은 강원대학교 동물 관리 및 사용위원회에서 승인받았다. 상기 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 NIH(National Institutes of Health) 가이드에 따라 수행하였다(NIH Publications No. 8023, 1978 년 개정). ICG 용량은 2.5 mg/kg으로 설정하고, 각 용액 또는 겔을 마우스 등쪽에 피하주사하였다. 주사 후 0, 2, 6, 24, 48, 72, 144, 168, 240 및 336 시간 후의 NIRF 신호를, 엔플루란(enflurane) 흡입에 의한 마취 유도 후 FOBI(NeoScience Co., Ltd., 대한민국 수원)로 전신 스캔하였다. 각 시점에서 형광 강도의 평균값을 얻었다. 14 일째에, 겔 주사 부위 주위의 피부를 절제하여 남아 있는 겔의 무게를 측정하였다. 또한, 절제된 겔 조직으로부터의 생체 외(ex vivo) NIRF 신호를 FOBI(NeoScience Co., Ltd.)로 검출하여 정량분석하였다.The biodegradability of the prepared hydrogel was evaluated by monitoring the NIRF signal of the ICG solution or ICG-loading gel structure subcutaneously injected into ICR (Institute of Cancer Research) mice (male, 5 weeks old, Orient Bio, Seongnam, Korea). The animal testing protocol was approved by the Animal Care and Use Committee of Kangwon National University. The animal experiments were performed according to the National Institutes of Health (NIH) guide for the care and use of laboratory animals (NIH Publications No. 8023, revised 1978). The ICG dose was set at 2.5 mg/kg, and each solution or gel was subcutaneously injected into the back of the mouse. NIRF signals 0, 2, 6, 24, 48, 72, 144, 168, 240, and 336 hours after injection, FOBI (NeoScience Co., Ltd., Suwon, Korea) after induction of anesthesia by enflurane inhalation ) was scanned throughout the body. The average value of the fluorescence intensity at each time point was obtained. On day 14, the skin around the gel injection site was excised and the remaining gel was weighed. In addition, the ex vivo NIRF signal from the excised gel tissue was detected and quantitatively analyzed by FOBI (NeoScience Co., Ltd.).

1.6. 데이터 분석1.6. data analysis

얻어진 실험 데이터의 통계 분석은 양측 t-검정 및 분산 분석으로 수행하였다. 본 연구에서 각 실험은 최소 3회 반복하였고, 데이터는 평균±표준편차(SD)로 표시하였다.Statistical analysis of the obtained experimental data was performed by two-tailed t -test and analysis of variance. In this study, each experiment was repeated at least 3 times, and the data were expressed as mean ± standard deviation (SD).

2. 결과 및 토론2. Results and Discussion

2.1. HA-dopa의 합성 및 확인2.1. Synthesis and identification of HA-dopa

본 연구에서는 DPZ의 서방출을 위하여 KH2PO4-유도 가교 HA-dopa 하이드로겔을 제조하였다(도 1). K+ 이온 및 HA-dopa의 카테콜 기 사이의 배위와 pH 조절에 의한 HA-dopa에서의 카테콜 기의 공유 결합이 본 연구에서 사용된 주요한 겔 가교 메커니즘이다. 카테콜 기들 사이의 수소 결합 및 양이온-π 상호 작용과 같은 또 다른 상호작용의 힘도 본 발명에서 설계된 하이드로겔 구조의 졸-겔 전이에 기여할 수 있을 것이다. 피하주사에 적용될 때 방출 제어를 위하여 DPZ을 PLGA MS에 캡슐화하였다. 이에 더하여, 피하주사를 통한 장시간 약물전달을 위하여 DPZ MS를 가교 하이드로겔 네트워크에 도입시켰다.In this study, KH 2 PO 4 -induced crosslinking HA-dopa hydrogel was prepared for sustained release of DPZ (FIG. 1). Coordination between the K + ion and the catechol group in HA-dopa and the covalent bond of the catechol group in HA-dopa by pH control are the main gel crosslinking mechanisms used in this study. Another interaction force, such as hydrogen bonding and cation-π interaction between catechol groups, may also contribute to the sol-gel transition of the hydrogel structure designed in the present invention. DPZ was encapsulated in PLGA MS for release control when applied subcutaneously. In addition, DPZ MS was introduced into the cross-linked hydrogel network for long-term drug delivery through subcutaneous injection.

HA-dopa는 보고된 바에 따라 HA의 카르복실산 기와 dopa의 아민 기 사이의 EDC/NHS-커플링된 아미드 결합 반응으로 합성하였다(도 2a) [S.Y. Lee, et al., Int. J. Pharm. 582 (2020) 119309; S.Y. Lee, J.H. Park, S.H. Ko, J.S. Shim, D.D. Kim, H.J. Cho, Mussel-inspired hyaluronic acid derivative nanostructures for improved tumor targeting and penetration, ACS Appl. Mater. Interfaces 9 (2017) 22308-22320]. HA-dopa의 합성은 1H-NMR 및 UV-Vis 흡광도 분석으로 확인하였다(도 2b ~ 2d). 본 연구에서도 HA-dopa의 1H-NMR 스펙트럼에서 dopa 기에 대한 양성자 피크(피크 2 ~ 4, 6.6 ~ 6.9 ppm)가 관찰되었다(도 2b). HA-dopa 중 dopa의 함량을 결정하기 위하여, dopa 대 HA의 중량비가 상이한 다수의 표준 샘플로부터 얻어진 회귀선을 얻고, 합성된 HA-dopa 접합체에서의 dopa 함량을 얻어진 표준 곡선으로부터 계산하였다(도 2c). 1H-NMR 분석에 의해 분석된 합성 HA-dopa에서의 dopa의 평균 함량은 9.3 %였다. 이러한 값은 UV-Vis 분광 분석으로 측정된 280 nm에서의 흡광도 값으로부터도 계산되었다(도 2d). UV-Vis 분석에 의해 측정된 HA-dopa의 평균 dopa 함량은 8.5 %였으며, 1H-NMR 분석으로부터 계산된 값과 비교하여 유의적인 차이는 없었다. 이와 같이 얻어진 모든 데이터는 본 연구에서 HA-dopa가 적절히 합성되었음을 시사한다.HA-dopa was synthesized as reported by EDC/NHS-coupled amide bond reaction between the carboxylic acid group of HA and the amine group of dopa (Fig. 2a) [SY Lee, et al., Int. J. Pharm. 582 (2020) 119309; SY Lee, JH Park, SH Ko, JS Shim, DD Kim, HJ Cho, Mussel-inspired hyaluronic acid derivative nanostructures for improved tumor targeting and penetration, ACS Appl. Mater. Interfaces 9 (2017) 22308-22320]. The synthesis of HA-dopa was confirmed by 1 H-NMR and UV-Vis absorbance analysis ( FIGS. 2b to 2d ). Also in this study, proton peaks (peaks 2 to 4, 6.6 to 6.9 ppm) for the dopa group were observed in the 1 H-NMR spectrum of HA-dopa (Fig. 2b). In order to determine the dopa content in HA-dopa, a regression line obtained from a number of standard samples having different weight ratios of dopa to HA was obtained, and the dopa content in the synthesized HA-dopa conjugate was calculated from the obtained standard curve (Fig. 2c). . The average content of dopa in the synthetic HA-dopa analyzed by 1 H-NMR analysis was 9.3%. These values were also calculated from the absorbance values at 280 nm measured by UV-Vis spectroscopic analysis (Fig. 2d). The average dopa content of HA-dopa measured by UV-Vis analysis was 8.5%, and there was no significant difference compared with the value calculated from 1 H-NMR analysis. All the data thus obtained suggest that HA-dopa was properly synthesized in this study.

2.2. 가교 하이드로겔 시스템의 제조 및 겔 구조의 물리화학적 특성2.2. Preparation of cross-linked hydrogel systems and physicochemical characterization of gel structures

겔화 메커니즘 및 설계된 KH2PO4-유도 가교 하이드로겔의 물리화학적 특성을 조사하였다(도 3a ~ 3f). dopa 기는 금속 양이온과 배위할 수 있으며 하이드로겔 구조의 가교를 형성할 수 있다고 보고되었다[C.E. Schante, G. Zuber, C. Herlin, T.F. Vandamme, Chemical modifications of hyaluronic acid for the synthesis of derivatives for a broad range of biomedical applications, Carbohydr. Polym. 85 (2011) 469-489; N. Patil, C. Jerome, C. Detrembleur, Recent advances in the synthesis of catechol-derived (bio)polymersfor applications in energy storage and environment, Prog. Polym. Sci. 82 (2018) 34-91]. 본 발명의 발명자들의 이전 연구에서는 황산철(FeSO4)에서 유래한 철 이온이 HA 폴리머에 부착된 dopa 기와 성공적으로 배위결합한다는 것을 보고한 바 있다. 본 연구에서는 생리적 완충 염을 이용한 HA-dopa의 가교가 시도되었다. HA-dopa 분산액에 포함되는 물질로서 KH2PO4(인산칼륨 염 중 하나임)가 선택되었다(도 3a). KH2PO4 농도-의존적 겔화 특성을 반전 시험으로 확인하였다(도 3a). 20 mM 이하의 KH2PO4 농도 범위에서는 반전 시험 결과 겔화 특성이 나타나지 않았다. 점탄성 증가의 특성은 100 및 200 mM KH2PO4 농도 군에서 뚜렷이 나타났으며, 이에 따라 KH2PO4의 독성 가능성을 최소화하기 위하여 최종 KH2PO4 농도는 100 mM로 정하였다. 동등한 몰 농도(molar concentration)의 NaH2PO4 또는 KCl을 첨가하여 겔화 거동을 조사하였다(도 3b). pH 값이 4.9인 HA-dopa/K100(pH 조절 없음)에서 졸-겔 전이는 나타나지 않았다. 그러나, HA-dopa 분산액에 100 mM KH2PO4(pH 8)를 첨가하면 점탄성 특성이 유의하게 상승하였고 해당 제제의 최종 pH 값은 7.3으로 상승하였다. 설계된 하이드로겔의 겔화 거동에 대한 양이온 및 음이온 유형의 영향을 확인하기 위하여 NaH2PO4 또는 KCl을 첨가하여 시험하였다. NaH2PO4(pH 8) 또는 KCl(pH 8)의 첨가에 의해서도 점탄성 특성의 증가가 유도되었고, 이들의 pH 값은 7.6 또는 5.5였다. 양이온(K+)의 존재뿐만 아니라 pH(7 내지 8)의 조절이 하이드로겔 구조의 가교를 제공하는 것으로 추정되었다. 최종 pH 값이 6.0인 DW(pH 조절됨) 중 HA-dopa는 겔 경화 특성을 나타내지 않았다. 이들 데이터로부터, pH 증가 및 양이온의 첨가(약학적 염 형태)가 하이드로겔 구조의 가교를 유도할 수 있음을 시사한다.The gelation mechanism and physicochemical properties of the designed KH 2 PO 4 -induced crosslinking hydrogel were investigated ( FIGS. 3a to 3f ). It has been reported that the dopa group can coordinate with metal cations and can form crosslinks of hydrogel structures [CE Schante, G. Zuber, C. Herlin, TF Vandamme, Chemical modifications of hyaluronic acid for the synthesis of derivatives for a broad range. of biomedical applications, Carbohydr. Polym. 85 (2011) 469-489; N. Patil, C. Jerome, C. Detrembleur, Recent advances in the synthesis of catechol-derived (bio)polymers for applications in energy storage and environment, Prog. Polym. Sci. 82 (2018) 34-91]. Previous studies of the present inventors have reported that iron ions derived from iron sulfate (FeSO 4 ) successfully coordinate with the dopa group attached to the HA polymer. In this study, crosslinking of HA-dopa using physiological buffer salts was attempted. As a material to be included in the HA-dopa dispersion, KH 2 PO 4 (one of the potassium phosphate salts) was selected ( FIG. 3A ). KH 2 PO 4 concentration-dependent gelation properties were confirmed by inversion test (Fig. 3a). In the KH 2 PO 4 concentration range of 20 mM or less, the gelation characteristic was not observed as a result of the inversion test. The characteristic of increasing viscoelasticity was clearly shown in the 100 and 200 mM KH 2 PO 4 concentration groups. Accordingly, in order to minimize the possibility of toxicity of KH 2 PO 4 , the final KH 2 PO 4 concentration was set to 100 mM. The gelation behavior was investigated by adding NaH 2 PO 4 or KCl at an equivalent molar concentration ( FIG. 3b ). There was no sol-gel transition in HA-dopa/K100 (no pH adjustment) with a pH value of 4.9. However, when 100 mM KH 2 PO 4 (pH 8) was added to the HA-dopa dispersion, the viscoelastic properties were significantly increased and the final pH value of the formulation was raised to 7.3. In order to confirm the effect of the cation and anion types on the gelation behavior of the designed hydrogel, NaH 2 PO 4 or KCl was added and tested. An increase in the viscoelastic properties was also induced by the addition of NaH 2 PO 4 (pH 8) or KCl (pH 8), and their pH values were 7.6 or 5.5. It was hypothesized that the presence of cations (K + ) as well as the control of pH (7-8) provided crosslinking of the hydrogel structure. HA-dopa in DW (pH adjusted) with a final pH value of 6.0 did not show gel curing properties. These data suggest that pH increase and addition of cations (in the form of pharmaceutical salts) can induce crosslinking of the hydrogel structure.

KH2PO4 농도 의존적 겔화 특성을 UV-Vis 분석으로 조사하였다(도 3c). 폴리도파민(polydopamine) 형성과 K+-dopa 배위로 인해 KH2PO4의 고농도 범위에서 파장 300 ~ 700 nm의 흡광도가 더 높게 관찰되었다. 반전 시험 데이터(도 3a)에서 알 수 있는 바와 같이, HA-dopa/K100 및 HA-dopa/K200의 흡광 스펙트럼은 유사한 것으로 보였다. 과량의 사용을 피하기 위하여 100 mM KH2PO4를 최종 제형으로 선택하였다.KH 2 PO 4 concentration-dependent gelation properties were investigated by UV-Vis analysis (Fig. 3c). Due to polydopamine formation and K + -dopa coordination, higher absorbance at a wavelength of 300 to 700 nm was observed in the high concentration range of KH 2 PO 4 . As can be seen from the inversion test data (Fig. 3a), the absorption spectra of HA-dopa/K100 and HA-dopa/K200 appeared to be similar. 100 mM KH 2 PO 4 was chosen as the final formulation to avoid overuse.

제조된 DPZ MS의 입자 특성을 입자 크기 분석 및 FE-SEM 촬영으로 조사하였다(도 3d). DPZ 자체의 수용해도가 낮은 편이므로 서방출형 목적으로 PLGA MS에 캡슐화하였다[S.Y. Lee, et al., Int. J. Pharm. 582 (2020) 119309]. 본 연구에서 제조된 DPZ MS의 평균 부피 밀도-연관 직경은 24 μm였다(도 3d). 이에 상응하는 DPZ MS의 직경 및 구형 형태도 FE-SEM 이미지로 관찰되었다(도 3d).Particle properties of the prepared DPZ MS were investigated by particle size analysis and FE-SEM imaging (FIG. 3d). Since the water solubility of DPZ itself is low, it was encapsulated in PLGA MS for the purpose of sustained release [S.Y. Lee, et al., Int. J. Pharm. 582 (2020) 119309]. The average bulk density-associated diameter of the DPZ MS prepared in this study was 24 μm (Fig. 3d). The corresponding diameter and spherical shape of the DPZ MS were also observed in the FE-SEM image (Fig. 3d).

동결건조된 DPZ MS-로딩 하이드로겔 구조는 FE-SEM 영상화에 의해 관찰되었다(도 3e). HA-dopa/DPZ MS 군은 DPZ MS가 부착된 벌집(honeycomb) 유사 구조를 나타냈으며, HA-dopa/DPZ MS/K100 군은 겔 가교로 인해 HA-dopa/DPZ MS 군보다 밀도가 높은 내부 단위 구조를 갖는 것으로 보였다.The lyophilized DPZ MS-loaded hydrogel structure was observed by FE-SEM imaging (Fig. 3e). The HA-dopa/DPZ MS group showed a honeycomb-like structure to which DPZ MS was attached, and the HA-dopa/DPZ MS/K100 group had a higher density of internal units than the HA-dopa/DPZ MS group due to gel crosslinking. appeared to have a structure.

또한, 설계된 하이드로겔 시스템으로부터의 DPZ 방출을 HAase의 존재 또는 비존재 하에서 조사하였다(도 3f). HAase는 가교된 하이드로겔에서 HA를 분해시킬 것으로 예상되며, 이의 존재는 DPZ MS와 방출 매질의 접촉 확률을 증가시킴으로써 DPZ의 방출 속도를 가속화할 수 있다. 도 3f에 도시된 바와 같이, HA-dopa/DPZ MS/K100 + HAase 군은 7 일째부터 HA-dopa/DPZ MS/K100 군보다 뚜렷이 높은 DPZ 방출 속도를 나타냈다. 설계된 하이드로겔 시스템의 약물 서방출 양상이 관찰 되었고, 이는 약물의 투여 빈도를 감소시켜 환자 순응도를 향상시킬 수 있다.In addition, DPZ release from the designed hydrogel system was investigated in the presence or absence of HAase (Fig. 3f). HAase is expected to degrade HA in cross-linked hydrogels, and its presence can accelerate the release rate of DPZ by increasing the probability of contact of DPZ MS with the release medium. As shown in FIG. 3f , the HA-dopa/DPZ MS/K100 + HAase group showed a significantly higher DPZ release rate than the HA-dopa/DPZ MS/K100 group from the 7th day. The sustained-release pattern of the designed hydrogel system was observed, which can improve patient compliance by reducing the frequency of drug administration.

2.3. 유동학적 특성2.3. rheological properties

설계된 하이드로겔 구조의 유동학적 특성은 반전 시험, 주사가능성, 신장성 및 점탄성 측정에 의해 조사되었다(도 4a ~ 4d). HA-dopa/DPZ MS/K100 군의 겔화 시간은 반전 시험으로 결정하였다(도 4a). 겔화 거동을 360분 동안 모니터링하였고, 반전 상태에서의 하이드로겔의 유지는 10분에서도 나타났다. 이러한 즉각적인 접착은 dopa의 히드록실 기 사이의 수소 결합, 양이온과 dopa의 히드록실 기 사이의 배위, 및 페놀 기의 π-π 상호 작용과 관련될 수 있다. HA-dopa/DPZ MS/K100 군의 색상은 인큐베이션 시간이 길어짐에 따라 밝은 갈색으로 변화하였고, 이는 HA 골격(backbone)에 이식된 dopa 기의 중합을 나타낸다. 설계된 하이드로겔 구조의 점탄성 특성이 상승하는 것이 이러한 경화 작용에 기인하는 것으로 추정된다.The rheological properties of the designed hydrogel structures were investigated by inversion tests, injectability, extensibility and viscoelasticity measurements (Figs. 4a to 4d). The gelation time of the HA-dopa/DPZ MS/K100 group was determined by an inversion test ( FIG. 4A ). The gelation behavior was monitored for 360 min, and retention of the hydrogel in the inverted state was observed even at 10 min. This immediate adhesion may be related to the hydrogen bonding between the hydroxyl groups of dopa, the coordination between the cation and the hydroxyl groups of dopa, and the π-π interactions of the phenol groups. The color of the HA-dopa/DPZ MS/K100 group changed to light brown as the incubation time increased, indicating polymerization of the dopa group grafted to the HA backbone. It is presumed that the increase in the viscoelastic properties of the designed hydrogel structure is due to this curing action.

제조된 HA-dopa/DPZ MS/K100 하이드로겔의 주사기 바늘을 통한 주사가능성을 6 시간 동안 인큐베이션한 후 시험하였다(도 4b). 도 4a에 나타난 바와 같이, HA-dopa/DPZ MS/K100 하이드로겔은 360분에 거의 완전한 겔 가교를 나타냈다. 이러한 상태에서, HA-dopa/DPZ MS/K100 하이드로겔은 주사기 바늘을 통과할 때 전단 연화 거동(shear thinning behavior)을 나타냈으며, 이는 피하주사에 적합한 특성일 수 있다. HA-dopa/DPZ MS/K100 하이드로겔의 전구체 혼합물은 주사기 바늘을 통해 용이하게 주입될 수 있고, 주사 부위에서 가교될 수 있을 것으로 예상된다. 설계된 인시튜(in situ) 형성 하이드로겔은 절제 및 봉합없이 최소 침습성으로 피하조직에 주사될 수 있다.The injectability of the prepared HA-dopa/DPZ MS/K100 hydrogel through a syringe needle was tested after incubation for 6 hours ( FIG. 4b ). As shown in Fig. 4a, the HA-dopa/DPZ MS/K100 hydrogel showed almost complete gel crosslinking at 360 min. In this state, the HA-dopa/DPZ MS/K100 hydrogel exhibited shear thinning behavior when passing through a syringe needle, which may be a suitable property for subcutaneous injection. It is expected that the precursor mixture of HA-dopa/DPZ MS/K100 hydrogel can be easily injected through a syringe needle and cross-linked at the injection site. The designed in situ forming hydrogel can be injected into the subcutaneous tissue with minimal invasiveness without excision and suturing.

HA-dopa/DPZ MS/K100 하이드로겔의 자가치유능은 신장성 측정으로 시험하였다(도 4c). 메틸렌 블루의 존재 또는 비존재 하에서 가교된 2 개의 하이드로겔 단편을 약하게 압축하여 부착시켰고, 여기에 인장 강도를 적용하여 신장 능력을 시험하였다. 상기 신장 능력 시험에서 부착된 2 개의 하이드로겔 단편이 신장성이 있음이 확인되었고, 이는 피하주사 후 자가치유능을 의미한다. 이러한 자가치유 과정은 설계된 하이드로겔 시스템의 분해 속도를 감소시켜 주사 부위에서의 잔존량이 증가되는 결과로 이어진다. 이러한 가교된 하이드로겔 구조의 생분해 속도 감소에 의해 약물의 서방출이 달성될 수 있다.The self-healing ability of the HA-dopa/DPZ MS/K100 hydrogel was tested by extensibility measurement ( FIG. 4c ). In the presence or absence of methylene blue, two crosslinked hydrogel fragments were attached by gentle compression, and tensile strength was applied thereto to test their elongation ability. In the stretching ability test, it was confirmed that the two hydrogel fragments attached to each other had extensibility, which means self-healing ability after subcutaneous injection. This self-healing process reduces the decomposition rate of the designed hydrogel system, leading to an increase in the residual amount at the injection site. Sustained release of the drug can be achieved by reducing the biodegradation rate of this cross-linked hydrogel structure.

HA-dopa, HA-dopa/DPZ MS, HA-dopa/K100 및 HA-dopa/DPZ MS/K100 검체의 저장 계수(G') 및 손실 계수(G")를 레오미터를 사용하여 측정하였다(도 4d). HA-dopa 및 HA-dopa/DPZ MS 군은 G'(탄성 거동을 나타냄) 값보다 높은 G"(점성 거동을 나타냄) 값과 진동수-의존 선형 증가 패턴을 나타냈으며, 이는 점성 액체의 전형적인 특성이다. 도 3a ~ 3f 및 도 4a ~ 4d에 나타난 바와 같이, HA-dopa/K100 및 HA-dopa/DPZ MS/K100 검체는 유동학 데이터에서 개선된 점탄성을 나타냈다. HA-dopa/K100 및 HA-dopa/DPZ MS/K100 군 모두에서 탄성 계수(G')가 점성 계수(G")보다 높았으며, 이는 점탄성 고체의 대표적인 특성을 반영한다. 결론적으로, 설계된 HA-dopa/DPZ MS/K100 하이드로겔은 인시튜 겔 형성에 적합한 겔화, 주사가능성, 신장성 및 점탄성을 보유한다고 볼 수 있다.The storage coefficient (G') and loss coefficient (G") of the HA-dopa, HA-dopa/DPZ MS, HA-dopa/K100 and HA-dopa/DPZ MS/K100 samples were measured using a rheometer (Fig. 4d). The HA-dopa and HA-dopa/DPZ MS groups showed higher G" (indicating viscous behavior) values and a frequency-dependent linear increase pattern than the G' (indicating elastic behavior) values, indicating that It is a typical characteristic. As shown in FIGS. 3a to 3f and 4a to 4d, the HA-dopa/K100 and HA-dopa/DPZ MS/K100 samples showed improved viscoelasticity in the rheological data. In both the HA-dopa/K100 and HA-dopa/DPZ MS/K100 groups, the elastic modulus (G') was higher than the viscous modulus (G"), reflecting the representative properties of viscoelastic solids. In conclusion, the designed HA- It can be seen that the dopa/DPZ MS/K100 hydrogel has gelation, injectability, extensibility and viscoelasticity suitable for in situ gel formation.

2.4. 생분해성2.4. biodegradable

설계된 하이드로겔 네트워크의 생체 내 분해 프로파일을, ICG를 하이드로겔 구조에 도입하여 NIRF 영상화로 확인하였다(도 5). 본 연구에서는 HA-dopa 중합체 분산액에 인산칼륨 염을 첨가하여 하이드로겔의 점탄성 특성을 향상시켰다. 점탄성의 증가와 주사 부위에서 하이드로겔의 잔존 비율이 연장되는 점 간의 관계를 실시간 광학 영상화로 조사하였다(도 5). ICG, HA-dopa/DPZ MS/ICG, HA-dopa/K100/ICG 및 HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG 군의 전신 스캔 NIRF 신호를 14 일 동안 모니터링하였다(도 5a). HA-dopa/K100/ICG 및 HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG 군에서는 투여 후 14 일까지도 NIRF 신호가 여전히 유지되었지만, 다른 군(ICG, HA-dopa/DPZ MS/ICG)의 NIRF 신호는 투여 초기(투여 후 1 ~ 2일)에 급격히 감소하였다. HA-dopa/K100/ICG와 HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG 군간에 14 일차 NIRF 신호에서 유의적인 차이는 없었다. HA-dopa/K100 하이드로겔로의 DPZ MS 도입은 생분해 속도 측면에서 유의적 변화를 발생시키지 않았다. HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG 군의 평균 형광 강도는 14 일차에 ICG 및 HA-dopa/DPZ MS/ICG 군보다 21.6 배 및 3.3 배 높았다(도 5b). 7 일차에도 HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG 군의 평균 형광 강도는 ICG 및 HA-dopa/DPZ MS/ICG 군보다 19.8 배 및 3.4 배 높았다(도 5b). 이러한 패턴은 생체 외(ex vivo) 데이터에서도 추가로 확인되었다(도 5c 및 5d). 남아 있는 겔 부분을 분리하여 무게를 측정하였다(도 5c). ICG 군의 경우, 용액의 특성 상 육안으로 관찰되는 겔 부분이 없어서 측정에서 제외하였다. 도 5c에 나타난 바에 따르면 HA-dopa/K100/ICG 및 HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG 군 간에는 남아있는 겔 무게의 유의적인 차이는 없었다. HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG 군의 무게는 HA-dopa/DPZ MS/ICG 군의 무게보다 3.4 배 높았으며, 이는 HA-dopa/DPZ MS/ICG 군 대비 HA-dopa /DPZ MS/K100/ICG 군의 14 일차 상대적 형광 강도 비율(3.3)과 매우 유사하다. 각 군의 생체 외(ex vivo) 형광 강도를 정량분석하였다(도 5d). 도 5b 및 5c에서 관찰된 것과 유사한 결과 양상이 도 5d에서도 나타나서, HA-dopa/DPZ MS/ICG 군 대비 HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG 군의 평균 형광 강도 비는 절제된 겔 부분의 검체에서 4.6이었다. 상기와 같은 생체 내 데이터 및 생체 외 데이터는 모두 KH2PO4-유도된 하이드로겔이 높은 점탄성으로 인해 교차결합되지 않은 하이드로겔보다 피하조직에서 더 오랜 시간 존재한다는 사실을 시사한다. 피하주사 후 HA-dopa/DPZ MS/K100 하이드로겔의 분해가 느리게 되면 투여 빈도가 감소되고 이는 환자 순응도 향상에 기여할 수 있다.The in vivo degradation profile of the designed hydrogel network was confirmed by NIRF imaging by introducing ICG into the hydrogel structure (FIG. 5). In this study, the viscoelastic properties of the hydrogel were improved by adding potassium phosphate salt to the HA-dopa polymer dispersion. The relationship between the increase in viscoelasticity and the extension of the residual ratio of the hydrogel at the injection site was investigated by real-time optical imaging (FIG. 5). Whole body scan NIRF signals of ICG, HA-dopa/DPZ MS/ICG, HA-dopa/K100/ICG and HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG groups were monitored for 14 days ( FIG. 5A ). In the HA-dopa/K100/ICG and HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG groups, the NIRF signal was still maintained up to 14 days after administration, but the NIRF signal in the other groups (ICG, HA-dopa/DPZ MS/ICG) was It decreased sharply at the initial stage of administration (1 to 2 days after administration). There was no significant difference in NIRF signal at day 14 between the HA-dopa/K100/ICG and HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG groups. Introduction of DPZ MS into the HA-dopa/K100 hydrogel did not cause a significant change in the biodegradation rate. The mean fluorescence intensity of the HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG group was 21.6 times and 3.3 times higher than that of the ICG and HA-dopa/DPZ MS/ICG groups on day 14 (FIG. 5b). Even on the 7th day, the average fluorescence intensity of the HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG group was 19.8 and 3.4 times higher than that of the ICG and HA-dopa/DPZ MS/ICG groups ( FIG. 5b ). This pattern was further confirmed in ex vivo data ( FIGS. 5c and 5d ). The remaining gel portion was separated and weighed (Fig. 5c). In the case of the ICG group, there was no gel part observed with the naked eye due to the nature of the solution, so it was excluded from the measurement. As shown in FIG. 5c , there was no significant difference in the remaining gel weight between the HA-dopa/K100/ICG and HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG groups. The weight of the HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG group was 3.4 times higher than that of the HA-dopa/DPZ MS/ICG group, which was higher than that of the HA-dopa/DPZ MS/ICG group. Very similar to the 14-day relative fluorescence intensity ratio (3.3) in the /ICG group. The ex vivo fluorescence intensity of each group was quantitatively analyzed (FIG. 5d). A result pattern similar to that observed in FIGS. 5B and 5C is also shown in FIG. 5D, so that the average fluorescence intensity ratio of the HA-dopa/DPZ MS/ICG group compared to the HA-dopa/DPZ MS/K100/ICG group is in the sample of the excised gel portion. It was 4.6. Both in vivo and ex vivo data as described above suggest that the KH 2 PO 4 -induced hydrogel exists for a longer time in the subcutaneous tissue than the non-crosslinked hydrogel due to its high viscoelasticity. If the degradation of the HA-dopa/DPZ MS/K100 hydrogel is slow after subcutaneous injection, the dosing frequency is reduced, which may contribute to improvement of patient compliance.

3. 결론3. Conclusion

본 발명에서는 DPZ의 서방출 전달을 위한 피하주사 제형으로 제1인산칼륨으로 결합시킨 HA-dopa 하이드로겔을 개발하였다. 중금속 이온을 사용하지 않고, HA 중합체에 결합된 dopa-기 간의 배위를 위하여 생리적 완충 염-가교 하이드로겔 제형을 개발하였다. 개발된 하이드로겔에서는 주사 후 중금속 이온 관련 전신 독성의 위험을 피할 수 있다. 가교 하이드로겔 구조가 피하조직에서 인시튜 겔을 형성하기에 적합한 겔화, 주사가능성, 신장성 및 점탄성 프로파일을 갖도록 KH2PO4 농도를 최적화하였다. 4 주 동안 약물이 지속적으로 방출되는 것이 관찰되었고, NIRF 영상 촬영으로 하이드로겔의 생분해 양상을 모니터링하였다. 이러한 데이터에 의해, 설계된 KH2PO4로 결합시킨 HA-dopa 하이드로겔 시스템은 생체 안전성이 우수한 약물 서방출 제제 중 하나라는 것이 확인되었다.In the present invention, a HA-dopa hydrogel bound with potassium monophosphate was developed as a subcutaneous injection formulation for sustained release delivery of DPZ. A physiologically buffered salt-crosslinking hydrogel formulation was developed for coordination between dopa-groups bound to HA polymers without the use of heavy metal ions. The developed hydrogel avoids the risk of heavy metal ion-related systemic toxicity after injection. The KH 2 PO 4 concentration was optimized so that the cross-linked hydrogel structure had a gelation, injectability, extensibility and viscoelastic profile suitable for forming a gel in situ in the subcutaneous tissue. Continuous drug release was observed for 4 weeks, and the biodegradation pattern of the hydrogel was monitored by NIRF imaging. Based on these data, it was confirmed that the designed HA-dopa hydrogel system coupled with KH 2 PO 4 is one of the sustained-release drug formulations with excellent biosafety.

4. 요약4. Summary

본 발명에서는 도네페질(donepezil, DPZ)의 피하주사 제형 중 하나로서 도파민(dopamine, dopa)으로 수식한 히알루론산(hyaluronic acid, HA)을 기본으로 하고 제1인산칼륨으로 결합시킨 하이드로겔을 제조하였다. KH2PO4의 도입 및 pH 조절로 양이온-카테콜(catechol) 배위 및 dopa 기능기의 공유 결합을 유도하였고, 이에 따라 하이드로겔의 점탄성 및 생분해성을 조절하였다. 하이드로겔에서 KH2PO4 농도를 최적화함으로써, 인시튜(in situ) 겔 형성을 위한 적절한 겔화 시간, 단일 주사기에 의한 주사가능성, 자가치유능 및 점탄성과 같은 기술적 특성을 달성하였다. DPZ을 폴리(락틱-코-글리콜산)[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA] 마이크로 스피어(microsphere, MS)에 봉입하고, 약물 서방출을 위하여 하이드로겔 구조에 함입시켰다. 설계된 KH2PO4로 결합시킨 HA-dopa/DPZ MS 하이드로겔 시스템의 생분해성을 광학 영상 촬영으로 평가한 결과, 14 일째에 가교된 HA-dopa 하이드로겔 군의 잔여 겔 중량이 가교되지 않은 HA-dopa 혼합물 군의 겔 중량보다 3.4 배 더 높았다(p<0.05). 이러한 결과 데이터에 따르면, 설계된 KH2PO4로 결합한 HA-dopa/DPZ MS 하이드로겔 구조는 서방출성 약물 전달용 피하주사 제형으로서 적절한 것으로 판단된다.In the present invention, as one of the subcutaneous injection formulations of donepezil (DPZ), a hydrogel was prepared based on hyaluronic acid (HA) modified with dopamine (dopa) and bound with potassium monophosphate. . The introduction and pH control of KH 2 PO 4 induced covalent bonding of cation-catechol coordination and dopa functional groups, thereby controlling the viscoelasticity and biodegradability of the hydrogel. By optimizing the KH 2 PO 4 concentration in the hydrogel, technical properties such as adequate gelation time for in situ gel formation, injectability by single syringe, self-healing ability and viscoelasticity were achieved. DPZ was encapsulated in poly(lactic-co-glycolic acid) [poly( lactic-co-glycolic acid), PLGA] microspheres (MS), and incorporated into the hydrogel structure for sustained release of the drug. As a result of evaluating the biodegradability of the HA-dopa/DPZ MS hydrogel system bound with the designed KH 2 PO 4 by optical imaging, on the 14th day, the residual gel weight of the cross-linked HA-dopa hydrogel group showed that the non-crosslinked HA- It was 3.4 times higher (p<0.05) than the gel weight of the dopa mixture group. According to these result data, the designed HA-dopa/DPZ MS hydrogel structure bound to KH 2 PO 4 is judged to be suitable as a subcutaneous injection formulation for sustained-release drug delivery.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.The above description of the present invention is for illustration, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive. For example, each component described as a single type may be implemented in a dispersed form, and likewise components described as distributed may be implemented in a combined form.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present invention is indicated by the following claims, and all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims and their equivalents should be construed as being included in the scope of the present invention.

Claims (14)

히알루론산-도파민 접합체 및 약학적으로 사용가능한 염의 양이온을 포함하고, pH 7 ~ 11인 하이드로겔 조성물.A hydrogel composition comprising a cation of a hyaluronic acid-dopamine conjugate and a pharmaceutically usable salt, and having a pH of 7 to 11. 제1항에 있어서, 상기 히알루론산-도파민 접합체가 평균 분자량이 10 ~ 3000 kDa인 히알루론산을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.The hydrogel composition according to claim 1, wherein the hyaluronic acid-dopamine conjugate comprises hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa. 제1항에 있어서, 상기 히알루론산-도파민 접합체가 접합체 총 중량에 대하여 도파민이 1 ~ 40 중량%로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.The hydrogel composition according to claim 1, wherein the hyaluronic acid-dopamine conjugate contains 1 to 40 wt% of dopamine based on the total weight of the conjugate. 제1항에 있어서, 상기 히알루론산-도파민 접합체가 하이드로겔 조성물 중 최종 농도 1 ~ 100 mg/mL로 포함되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.The hydrogel composition according to claim 1, wherein the hyaluronic acid-dopamine conjugate is included in a final concentration of 1 to 100 mg/mL in the hydrogel composition. 제1항에 있어서, 상기 약학적으로 사용가능한 염의 양이온이 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 바륨 이온, 알루미늄 이온 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종의 양이온인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.The cation of claim 1, wherein the cation of the pharmaceutically usable salt is one cation selected from the group consisting of sodium ion, potassium ion, calcium ion, magnesium ion, barium ion, aluminum ion, and mixtures thereof. A hydrogel composition. 제1항에 있어서, 상기 약학적으로 사용가능한 염의 양이온이 수산화나트륨(NaOH), 제1인산칼륨(KH2PO4), 제2인산칼륨(K2HPO4), 염화칼륨(KCl), 제1인산나트륨(NaH2PO4), 제2인산나트륨(Na2HPO4), 염화나트륨(NaCl) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종의 염의 양이온인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.According to claim 1, wherein the cation of the pharmaceutically usable salt is sodium hydroxide (NaOH), monobasic potassium phosphate (KH 2 PO 4 ), dibasic potassium phosphate (K 2 HPO 4 ), potassium chloride (KCl), the first Sodium phosphate (NaH 2 PO 4 ), sodium phosphate dibasic (Na 2 HPO 4 ), sodium chloride (NaCl), and a hydrogel composition, characterized in that the cation of one salt selected from the group consisting of mixtures thereof. 제1항에 있어서, 상기 약학적으로 사용가능한 염의 양이온이 하이드로겔 조성물 중 최종 농도 10 ~ 1000 mM인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.The hydrogel composition according to claim 1, wherein the cation of the pharmaceutically usable salt has a final concentration of 10 to 1000 mM in the hydrogel composition. 제1항에 있어서, 난용성 약물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.The hydrogel composition according to claim 1, further comprising a poorly soluble drug. 제8항에 있어서, 상기 난용성 약물이 도네페질, 암포테리신 B, 커큐민, 플로레틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 덱사메타손, 부데소나이드, 시클로스포린, 타크로리무스, 라파마이신, 페노피브레이트, 프레드니솔론, 이트라코나졸, 인슐린(중성 pH), 인도메타신 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.The method of claim 8, wherein the poorly soluble drug is donepezil, amphotericin B, curcumin, floretin, paclitaxel, docetaxel, dexamethasone, budesonide, cyclosporine, tacrolimus, rapamycin, fenofibrate, prednisolone, itraconazole, insulin ( Neutral pH), indomethacin, and a hydrogel composition, characterized in that one selected from the group consisting of mixtures thereof. 제8항에 있어서, 상기 난용성 약물이 마이크로스피어(microsphere)에 캡슐화된 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.The hydrogel composition according to claim 8, wherein the poorly soluble drug is encapsulated in microspheres. 제10항에 있어서, 상기 마이크로스피어가 평균 부피 밀도-연관 직경이 1 ~ 100 μm인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.The hydrogel composition according to claim 10, wherein the microspheres have an average bulk density-associated diameter of 1 to 100 μm. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 하이드로겔 조성물을 포함하는 인시튜(in situ) 형성 피하주사용 주사제.An in situ ( in situ ) forming subcutaneous injection comprising the hydrogel composition of any one of claims 1 to 11. 히알루론산-도파민 접합체 및 약학적으로 사용가능한 염을 혼합하는 단계를 포함하는 하이드로겔 조성물의 제조방법.A method for producing a hydrogel composition comprising mixing a hyaluronic acid-dopamine conjugate and a pharmaceutically usable salt. 제13항에 있어서, 상기 히알루론산-도파민 접합체가 히알루론산 및 도파민을 EDC-NHS 커플링을 이용하여 아미드 결합 반응시키는 단계에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물의 제조방법.The method of claim 13, wherein the hyaluronic acid-dopamine conjugate is prepared by an amide bond reaction between hyaluronic acid and dopamine using EDC-NHS coupling.
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