KR20220017381A - dCas9/gRNA 복합체 기반의 표적 RNA 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 dCas9/gRNA 복합체 기반의 표적 RNA 검출 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 표적 RNA의 검출 방법은 별도의 유전자 분리 및 증폭 단계 없이 육안으로 표적 RNA를 검출할 수 있으며, 특히, 우수한 표적 특이성 및 신속성을 통하여 빠르고 정확하게 표적 RNA를 검출할 수 있어 다양한 병원균 및/또는 바이러스들에 대한 검출에 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

Description

dCas9/gRNA 복합체 기반의 표적 RNA 검출 방법{TARGET RNA DETECTING METHOD BASED ON dCas9/gRNA COMPLEX}
본 발명은 dCas9/gRNA 복합체 기반의 표적 RNA 검출 방법에 관한 것이다.
천연 상태 그대로 검출하기 어려운 핵산을 표지하여 검출하는 방법은 분자생물학이나 세포생물학의 다양한 분야에 응용되어 왔다. 특이적인 혼성화 반응 (specific hybridization reaction)을 이용하는 서던 블로팅(Southern blotting), 노던 블로팅 (Northern blotting), 인시츄 혼성화 (in situ hybridization), 핵산 마이크로어레이 (microarray)에서 신호를 검출하기 위해 표지 물질이 부착된 핵산이 널리 사용되어 왔다. 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)에서 표지된 단량체 (표지된 dNTP) 또는 표지된 프라이머를 사용하여 DNA를 증폭함과 동시에 DNA를 표지하는 방법이 알려져 있다. 이렇게 표지된 DNA를 마이크로어레이로 검출할 수 있다.
PCR과 동시에 핵산을 표지하는 방법은 표지를 위한 별도의 단계가 필요하지 않은 장점이 있는 반면, 형광 염료 등으로 표지된 단량체를 사용하는 경우 표지되지 않은 단량체를 사용하는 경우보다 PCR의 효율이 떨어지는 단점이 있다. 또한, RNA는 PCR 방법으로 증폭할 수 없기 때문에 PCR로 표지하는 방법으로 RNA를 검출하려면 역전사(reverse transcription)를 통해 cDNA를 제조하는 단계가 필요하고, 특히 마이크로 RNA (microRNA, miRNA)와 같이 길이가 짧은 경우 cDNA 제조가 번거로운 문제가 있다. 이에, 보다 향상된 민감도와 특이도를 갖는 핵산 검출 기술의 개발이 절실한 실정이다.
앞서 설명된 방법들의 경우, 많은 양의 검출 핵산을 보유한 경우에 타겟이 되는 핵산을 검출하기에 용이한 방법들이다, 현재도 많이 사용하고 있음에도 불구하고, 적은 양의 타겟 핵산이 존재할 시에는 이를 검출하기가 매우 어려운 실정이며(민감도가 낮음), 다른 저해제들로 인해서 특정 타겟만을 검출하지 못하고, 비특정 타겟을 잘못 검출하는 경우(특이도가 낮음)가 빈번하다.
또한, 병원균이나 바이러스 등의 감염으로 인한 질병에 초기 대처 및 질병의 진행, 확산을 막기 위해서는 병원균 및 바이러스 등의 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단하는 것이 필요하다. 감염 후 증상이 나타나기 전인 잠복기 때 이를 진단할 수 있다면 전염병의 확산을 효과적으로 예방하여 큰 피해를 막을 수 있다. 즉, 바이러스의 감염으로 인한 질병의 확산을 초기에 대처하고, 단일 염기서열의 변형으로 인한 약물 내성 바이러스 감염에 대하여 적절한 치료를 진행하기 위하여서는, 해당 바이러스에 대한 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단하는 것이 필요하다.
CRISPR/Cas 시스템은 박테리아의 면역체계로써, 외부에서 유입된 DNA/RNA를 인지, 절단함으로써 외부로부터의 감염을 막는 역할을 한다. 특히, CRISPR/Cas 시스템이 염기서열 특이적인 인지와 절단이 가능하다는 것이 밝혀진 이후, 새로운 유전자 편집 기술로 주목받고 있는 동시에, 표적 유전자를 검출, 진단하는 기술에까지 다양하게 응용되고 있으나, 아직까지 CRISPR/Cas 시스템을 이용하여 표적 유전자를 육안으로 검출하는 기술이 부재하고, 바이러스 유전자를 분리하여 증폭 과정 없이 CRISPR/Cas 기반의 유전자 검출시스템에 바로 적용하는 연구가 이루어진 바가 없다.
이에 따라, PCR이 필수적으로 수반되어야 하거나 유전자만을 분리하여 분석하는 기존의 유전자 진단법과는 달리, 별도의 유전자 분리 단계 및 PCR 과정을 수행하지 않고도 높은 감도로 표적 유전자의 검출이 가능한, CRISPR/Cas 기반의 기술에 대한 개발이 필요한 실정이다.
대한민국 공개특허공보 제10-2013-0094498호
상술한 상황 하에서, 본 발명자들은 신속하면서도 정확한 유전자 검출 방법을 개발하기 위해 예의 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 표적 RNA를 검출함에 있어서, 불활성화된 Cas9(dCas9) 및 표적 RNA에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA로 이루어진 dCas9/gRNA 복합체와 PAMmer를 사용하는 경우, 유전자 증폭 과정을 필수적으로 포함하는 기존의 분자진단 방법의 복잡한 절차를 간소화함과 동시에, 감도가 낮은 면역진단의 단점을 극복할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명의 표적 RNA 특이적 검출 방법을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 PAMmer를 도입한 dCas9/gRNA 시스템을 기반으로 하는 표적 RNA의 검출 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 PAMmer를 도입한 dCas9/gRNA 시스템을 기반으로 하는 표적 RNA 검출용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산 서열", "뉴클레오타이드 서열" 및 "폴리뉴클레오타이드 서열"은, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드, 및 이의 단편 또는 일부, 및 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 의미하고, 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 표적 RNA의 검출 방법을 제공한다:
(a) 불활성화된 Cas9(dCas9)과 표적 RNA에 상보적인 gRNA(guide RNA)로 이루어진 dCas9/gRNA 복합체를, 대상으로부터 분리된 생물학적 시료 및 PAMmer와 반응시키는 단계로서,
상기 PAMmer는, 표적 RNA에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3'-제1 혼성화 부위(hybridization portion), PAM (protospacer-adjacent motif) 서열, 및 표적 RNA에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5'-제2 혼성화 부위를 포함하며, 상기 3'-말단에 검출가능한 시그날을 간접 생성하는 표지 리간드가 결합된 올리고뉴클레오타이드이고; 및
(b) 검출가능한 시그날을 인지하는 항-리간드를 상기 (a) 단계의 반응물에 처리하는 단계.
본 발명의 표적 RNA를 검출하는 방법은, PAMmer의 존재하에서, 불활성화된 Cas9(dCas9) 및 표적 RNA에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA로 이루어진 dCas9/gRNA 복합체와, 표적 유전자(RNA)를 포함하는 시료를 반응시키는 단계를 포함한다.
보다 구체적으로, 상기 PAMmer는, 하기 3 부위로 구분된다:
(i) 표적 RNA에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3'-제1 혼성화 부위(hybridization portion), (ii) PAM (protospacer-adjacent motif) 서열, 및 (iii) 표적 RNA에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5'-제2 혼성화 부위.
상기 3'-제1 혼성화 부위는 표적 RNA에 특이적으로 결합하며, 3'-말단에 검출가능한 시그날을 간접 생성하는 표지 리간드가 결합된 부위이고;
상기 5'-제2 혼성화 부위는 표적 RNA에 특이적으로 결합하며, 상기 상기 5'-제2 혼성화 부위의 표적 RNA에 혼성화된 서열은, 이의 상응되는 위치에 존재하는 gRNA의 서열과 동일한 서열을 갖는다.
상기 단계는 표적 유전자를 포함하는 1 종 이상의 유전자가 포함된 시료와 상기 PAMmer 및 dCas9/gRNA 복합체를 반응시키는 단계이며, 상기 반응을 통해 표적 유전자와 PAMmer 및 dCas9/gRNA 복합체가 결합된 결합물, 반응하지 않은 표적 유전자 이외의 유전자 및 반응하지 않은 복합체를 포함하는 반응물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 불활성화된 Cas9(dCas9) 및 표적 RNA에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA로 이루어진 복합체는 표적 RNA의 검출 방법을 수행하기 전 형성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 단계 수행시 dCas9과 가이드 RNA가 순차적으로 또는 함께 시료와 반응하여 형성될 수 있다.
본 발명에서 용어 "생물학적 시료"는 임의의 RNA 및/또는 표적 RNA를 포함하는 임의의 시료를 의미한다. 상기 생물학적 시료는 대상으로부터 수득한 임의의 조직 또는 체액일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 대상의 가래, 혈액, 혈청, 혈장, 혈구(예를 들어, 백혈구), 조직, 생검 샘플, 도말 샘플, 세척 샘플, 면봉 샘플, 세포 함유 체액, 유동 핵산, 소변, 복막액 및 흉수, 뇌 척수액, 대변, 누액 또는 이로부터의 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 생물학적 시료는 조직학적 목적 하에 취해진 조직 절편, 즉 동결또는 고정 절편 또는 그의 미세해부 세포 또는 세포외 부분을 또한 포함할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 대상에게 위해를 끼치지 않는 방법으로 얻어질 수 있다.
본 발명에서 용어 "가이드 RNA"는 표적 RNA에 특이적으로 결합하는 서열을 포함하는 RNA로서, 본 발명 상기 가이드 RNA는 Cas9 단백질과 복합체를 형성할 수 있다. 상기 가이드 RNA는 crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)로 구성될 수 있다.
crRNA는 표적 RNA와 결합할 수 있다.
tracrRNA는 crRNA와 결합하여 dCas9 단백질의 구조를 변화시키는 역할을 할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 상기 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA의 역할을 유지하면서 하나의 가닥으로 연결된 sgRNA(단일 사슬 가이드 RNA)일 수 있다.
이러한 가이드 RNA는 표적 RNA의 서열을 기준으로 할 때 이의 3'-말단 쪽에서 상보적 서열을 가지며, PAMmer는 표적 RNA의 서열을 기준으로 할 때 이의 5'-말단 쪽에서 상보적 서열을 가지는 것이 바람직하다.
guide RNA(gRNA)는, PAMmer(PAM 서열 및 표적 RNA에 상보적 서열을 포함하며, 3'-말단에 검출가능한 시그날을 간접적으로 생성할 수 있는 표지 리간드가 결합된 염기서열)와 5 내지 20 뉴클레오타이드 길이, 보다 바람직하게 6 내지 10 뉴클레오타이드 길이만큼 표적 RNA에 대해 각각 상보적으로 결합하는 동일한 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 일 구현예에 따르면, biotin-PAMmer는 표적 유전자에 상보적인 염기서열로 구성되나, PAM (5'-NGG-3') 미스매치(mismatch) 영역이 존재할 수 있다. PAM 영역으로부터 3' → 5'방향으로 8 bp 가 연장되었으며, 이 확장된 부위는 gRNA의 표적 유전자 결합 부위와 겹치도록 구성된다. 동시에, 3' 말단에는 비오틴(biotin)이 결합된 형태로 제작되었다.
본 발명에서 용어 "특이적 결합"은 혼성화와 혼용되어 사용될 수 있다.
가이드 RNA가 표적 RNA에 특이적으로 결합하는 것은 표적 RNA와 상보적인 서열의 가이드 RNA가 표적 유전자의 단일 가닥의 표적 서열과 혼성화하여 이중가닥 분자(혼성체)를 형성하는 것을 의미할 수 있다.
상기 가이드 RNA의 표적 RNA와 상보적인 서열은 표적 RNA의 일부분과 혼성화될 수 있고, 상기 상보적인 서열은 표적 RNA의 일부분과 90% 이상, 구체적으로는 95% 이상, 보다 구체적으로는 100% 상보적인 서열일 수 있다.
본 발명에서 용어, "Cas 단백질"은 CRISPR/Cas 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)와 복합체를 형성하여 활성화된 엔도뉴클레아제 또는 nickase를 형성한다. 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스피요젠스 (Streptococcus pyogens) 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "불활성화된 Cas9"은 뉴클레아제의 기능이 불활성화된 Cas9 뉴클레아제 단백질로서, dCas9(catalytically deficient Cas9)으로도 명명될 수 있다. 불활성화된 Cas9 단백질의 제조는 뉴클레아제의 활성을 불활성화시키는 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity (Martin Jinek et al, Science 17 Aug 2012: Vol. 337, Issue 6096, pp. 816-821) 등의 알려진 문헌으로부터 dCas9에 관한 정보를 참조할 수 있다. 위 문헌은 본 문헌에 참조 문헌으로 통합된다.
상기 Cas9 단백질 및 이의 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank 와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다.
PAM (protospacer-adjacent motif) 서열은 Cas9 단백질이 정확하게 표적 RNA의 염기 서열에 달라붙어(binding) 잘라내는 과정에서 꼭 필요한 2~6개의 짧은 염기서열이다. PAM이 표적 RNA 옆에 존재해야 Cas9이 원활히 기능을 할 수 있다. PAM은 두 개의 구아닌(GG)이 연이어진 'NGG' 형식을 갖춰야 한다. 즉 TGG, AGG, GGG, CGG처럼 GG가 필수적으로 들어가야 하며, 이에 따라 NGG 또는 NGGNG이고, 이 때 N은 임의의 뉴클레오티드로 정의되는 것일 수 있다.
PAM의 존재로 특정 부위에서만 Cas9 단백질이 발현하게 되며, Cas9단백질은 PAM 염기서열 3번째 염기쌍과 4번째 염기쌍 사이 공간을 절단한다.
이러한 PAM 서열의 경우, PAM 포함 염기 서열의 5'-말단을 기준으로 가이드 RNA와 표적 RNA에 대해 겹치는 서열 뒤에 위치할 수 있다. 즉, 5'-말단으로부터 약 5 내지 12 bp, 보다 바람직하게 6 내지 10 bp 만큼 뒤에 위 PAM 서열이 위치할 수 있다.
이러한 PAM 포함 염기 서열의 PAM 위치 서열 뒤에 표적 RNA에 상보적인 서열이 다시 존재하고 3'-말단에 검출가능한 시그날을 간접적으로 생성할 수 있는 표지 리간드가 결합된 형태로 염기 서열을 제공한다. 즉, PAM 포함 염기 서열에서 PAM 서열은 표적 RNA에 상보적 서열 사이에 존재한다.
용어 "검출가능한 시그날"은 인간 눈에 의해 또는 검출 시스템의 수단에 의해 직접 감지될 수 있는 시그날을 말한다. 당해 시그날의 특성은 사용된 표지의 특성에 따라 변한다. 상기 시그날은 특히 착색된, 발광성, 형광성, 인광성, 방사활성 또는 자기 시그날일 수 있다. 바람직하게는 상기 시그날은 착색된 시그날이다.
본 명세서에서 표지를 언급하면서 사용되는 용어 "간접"은 상기 표지가 기질 또는 결합 파트너와 같은 다른 화합물과 상호작용 후에만 검출가능한 시그날을 생성할 수 있음을 의미한다. 검출가능한 시그날을 간접적으로 생성할 수 있는 표지는, 예를 들면, 리간드/항-리간드 쌍의 제1 구성원 또는 기질의 존재 하에서 검출가능한 시그날을 생산하는 효소일 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서 고려되는 리간드/항-리간드 쌍의 예는 다음 쌍들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 비오틴/아비딘 또는 아비딘 유사체, 항원/항체, 특히 비오틴/항-비오틴 항체 또는 디곡시게닌/항-디곡시게닌 항체, 분자/수용체 또는 당/렉틴.
또한, 예를 들어, 3'-말단에 결합되는 표지 리간드는 구체적으로, 비오틴, 디곡시게닌, 압타머 (aptamer), 펩타이드(peptide), 형광 화합물 (fluorescent compound), 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide), 폴리사카라이드 (polysaccharides)로부터 선택되는 어느 하나 이상 일 수 있다.
바람직하게, 이러한 PAM 서열 뒤에 표적 RNA에 상보적인 서열이 존재하고, 3'-말단에 비오틴-결합된 형태로 염기 서열을 제공한다.
3'-말단의 염기서열의 경우 표적 RNA와 상보적인 서열의 마지막에 비오틴이 결합할 수도 있고, 상보적인 서열이 끝난 후 추가의 염기 서열을 1 내지 10 bp로 더 포함한 후 비오틴이 연결될 수 있다.
PAM (protospacer-adjacent motif) 서열을 포함하고 표적 RNA에 상보적 서열을 포함하는 3'-말단에 표지 인자로 비오틴-결합된 염기서열은 dCas9/gRNA 복합체로 인하여, 절단되고 검출 가능한 3'-말단에 표지 인자를 제공한다.
Cas9은 ssDNA에 결합하는 PAM-presenting oligonucleotide (PAMmer)를 함께 제공함으로써 ssDNA도 절단할 수 있다. 비슷한 방식으로 PAMmer를 사용하여 Cas9이 ssRNA를 자르도록 조작할 수도 있다. DNA는 건드리지 않고 RNA만을 자르기 위해서는, PAMmer가 DNA의 PAM을 포함하지 않는 RNA 부분을 타겟팅하도록 해야 한다. 이처럼 RNA를 타겟팅하는 Cas9을 RCas9으로 부르며, gRNA 및 타겟에 상보적인 PAMmer를 디자인하기만 하면 되는 간편함을 가지고 있다.
용어 "PAMmer"는 가이드 뉴클레오타이드 서열-프로그램 가능한 RNA 결합 단백질과 상호작용할 수 있는 PAM 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 적절한 PAMmer 서열에 대한 상세한 설명은, 예를 들어, 문헌[O'Connell et al., Nature, 2014, 516:263-266]에 기재되어 있다.
본 발명의 PAMmer는 PAM 염기서열을 포함하지 않는 단일 가닥의 타겟(표적) RNA를 dCas9/gRNA 복합체에 의해 인지될 수 있도록 하기 위해, PAM 서열을 포함하는 동시에, 검출가능한 시그널을 발생시키기 위해 표지 리간드를 포함하도록 제작한 짧은 올리고뉴클레오타이드이다.
PAM 서열은 약 2개 내지 약 10개의 뉴클레오타이드를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프를 의미한다. PAM 서열은 그들이 결합하고 당해 기술분야에 공지된 가이드 뉴클레오타이드 서열-프로그램 가능한 RNA 결합 단백질에 특이적이다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) PAM은 서열 5'-NGG-3'을 보유하며, 이때 "N"은 2개의 구아닌("G") 뉴클레오염기를 동반하는 임의의 뉴클레오염기이다.
본 발명의 표적 RNA의 검출 방법은 (b) 검출가능한 시그날을 인지하는 항-리간드를 상기 (a) 단계의 반응물에 처리하는 단계;를 포함하는 표적 RNA의 검출 방법을 제공한다.
구체적으로, (b) 아비딘 또는 아비딘 유사체를 상기 (a) 단계의 반응물에 처리하는 단계;를 포함하는 표적 RNA의 검출 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, (b) 아비딘 또는 아비딘 유사체의 호스래디쉬 과산화수소 컨쥬게이트 및 호스래디쉬 과산화수소 기질을 상기 (a) 단계의 반응물에 처리하는 단계;를 포함하는 표적 RNA의 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 검출가능한 시그날을 인지하는 항-리간드를 상기 (a) 단계의 반응물에 처리하는 단계는 위 (a)단계에 따라, 3'-말단에 검출가능한 시그날을 간접적으로 생성할 수 있는 표지 리간드를 인지할 수 있는 항-리간드 물질을 처리하는 것이다.
이러한 3'-말단에 검출가능한 시그날을 간접적으로 생성할 수 있는 표지 리간드를 인지할 수 있는 항-리간드 물질은 예를 들어, 아비딘 또는 아비딘 유사체, 항체 (예를 들어, 항-비오틴 항체, 항-디곡시게닌 항체), 수용체, 렉틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
위 리간드/항-리간드 쌍을 기반으로 하여 기질의 존재 하에서 검출가능한 시그날을 생산하는 효소 및 이의 기질을 통해 발색 등이 이루어질 수 있다.
예를 들어, 상기 효소는 호스래디쉬 과산화수소 (horseradish peroxidase), 알칼린 포스파타제 또는 β-갈락토시다제이다. 항-리간드 물질은 위 효소와 컨쥬게이트된 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 아비딘 또는 아비딘 유사체의 호스래디쉬 과산화수소 컨쥬게이트 등이 있다.
상기 효소에 대한 기질은 예를 들어, 호스래디쉬 과산화수소 (horseradish peroxidase)에 대하여 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), 2,2' -azino-di-[3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid] (ABTS), o-phenylenediamine dihydrochloride (OPD), 3,3'-diaminobenzidine (DAB), Luminol 등이 사용될 수 있으며, 알칼린 포스파타제에 대하여 p-Nitrophenyl Phosphate, Disodium Salt (PNPP) 등이 사용될 수 있으며, β-갈락토시다제에 대하여 Chlorophenol red-B-D galactopyrano (CPRG), O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG), 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside (X-Gal) 등이 사용될 수 있다.
상기와 같은 리간드/항-리간드를 통한 검출가능한 시그널의 생성은 세포의 용해물로부터 유전자 및/또는 RNA 분리하는 단계를 거치지 않으면서도 높은 감도로 표적 RNA를 특이적으로 검출할 수 있도록 정보를 제공한다.
바람직하게, 아비딘 또는 아비딘 유사체를 처리하여 항-리간드를 제공하고, 이에 검출가능한 시그날을 생산하는 효소 및 기질을 처리하는 것일 수 있다. 예를 들어, 아비딘 또는 아비딘 유사체에 반응 가능한 호스래디쉬 과산화수소가 처리되고 이에 적용 가능한 기질, 예를 들어 3,3',5,5'- 테트라메틸벤지딘 (TMB), 2,2' -아지노-디-[3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산] (ABTS), o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드 (OPD), 3,3'-디아미노벤즈이딘 (DAB), 루미놀 등이 사용될 수 있으며, 알칼린 포스파타제에 대하여 p-Nitrophenyl Phosphate, Disodium Salt (PNPP) 등을 처리하는 것일 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 표적 RNA를 검출함에 있어서, 및 PAM (protospacer-adjacent motif) 서열을 포함하고 표적 RNA에 상보적 서열을 포함하는 3'-말단에 비오틴-결합된 염기서열은 아비딘 또는 아비딘 유사체의 호스래디쉬 과산화수소 컨쥬게이트를 처리하고, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)를 통해 발색 정보 및/또는 형광 발색 변화 정보를 제공할 수 있다. 여기서 아비딘 유사체는 예를 들어 아비딘 유사체는 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 또는 캡타비딘(captavidin)일 수 있다.
이에 따라, 세포의 용해물로부터 유전자 및/또는 RNA 분리하는 단계를 거치지 않으면서도 높은 감도로 표적 RNA를 특이적으로 검출할 수 있다.
이에 본 발명의 검출 방법은 (c) (b) 단계의 반응물의 형광 발색 변화를 육안으로 확인하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 검출할 수 있는 한, 검출 목적 대상의 종류는 제한되지 않으나, 위와 같은 정보 제공은 바람직하게, 바이러스, 병원균 등에 이용될 수 있다.
예를 들어, 빠른 진단을 필요하는 바이러스로 바이러스는 DNA 바이러스, RNA 바이러스, 또는 레트로바이러스가 있을 수 있다. 특히, 바람직하게는 RNA 바이러스이다. 즉, 상기 표적 RNA는 바이러스 유래 RNA일 수 있다.
구체적으로 RNA 바이러스의 예는 코로나바이러스과 바이러스, 피코르나바이러스과 바이러스, 칼리시바이러스과 바이러스, 플라비바이러스과 바이러스, 토가바이러스과 바이러스, 보르나바이러스과, 필로바이러스과, 파라믹소 바이러스과, 뉴모바이러스과, 랩도바이러스과, 아레나바이러스과, 부니아바이러스과, 오르쏘믹소바이러스과, 또는 델타바이러스 중 하나 이상 (또는 이의 임의의 조합) 을 포함한다. 특정 예시적 실시형태에서, 바이러스는 코로나바이러스, SARS, 폴리오바이러스, 리노바이러스, A 형 간염 바이러스, 노르워크 바이러스, 황열병 바이러스, 웨스트나일 바이러스, C 형 간염 바이러스, 뎅기열 바이러스, 지카 바이러스, 루벨라 바이러스, 로스리버 바이러스, 신드비스 바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 보르나병 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 니파 바이러스, 헨드라 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 공수병 바이러스, 라싸 바이러스, 한타바이러스, 크림-콩고 출혈열 바이러스, 인플루엔자, 또는 D 형 간염 바이러스이다.
보다 바람직하게, SARS-CoV2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, COVID-19) 또는 인플루엔자 바이러스일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 검출 방법은 단일 염기 변이에 대해서도 우수한 민감도 및 정확도를 나타내어, 바이러스 변이에 대한 검출 또한 우수하다. 이에 한정되는 것은 아니나, 예를 들어, 메르스 바이러스 I529T 및/또는 D510G 변이, 폴리오 바이러스 VP1-101 및/또는 VP1-102 변이, 인간면역결핍바이러스 (HIV) V106A, V179D, 및/또는 Y181C 변이, 지카 바이러스 S139N 변이, 중증급성호흡기증후군 (SARS) D614G 변이, 인플루엔자바이러스 H275Y 변이 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은
(a) dCas9과 표적 RNA에 상보적인 guide RNA(gRNA)를 포함하는 기판 표면에 고정화된 dCas9/gRNA 복합체;
(b) 표적 RNA에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3'-제1 혼성화 부위(hybridization portion), PAM (protospacer-adjacent motif) 서열, 및 표적 RNA에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5'-제2 혼성화 부위를 포함하며, 3'-말단에 비오틴-결합된 PAMmer;
(c) 검출가능한 시그날을 인지하는 항-리간드를 포함하는 표적 RNA 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 표적 RNA 검출용 키트는 표적 RNA의 검출 방법은 별도의 유전자 분리 및 증폭 단계 없이 실시간 및 육안으로 표적 RNA를 검출할 수 있고, 특히 단일 돌연변이 표적 RNA 또한 우수한 민감도와 정확도를 기초로 검출할 수 있다는 점에서 신속하고 정확한 진단 정보를 제공할 수 있다.
이에 따라, 본 발명에 따른 표적 RNA 검출용 키트는 (a) dCas9과 표적 RNA에 상보적인 guide RNA(gRNA)를 포함하는 기판 표면에 고정화된 dCas9/gRNA 복합체;를 가진다.
본 발명에서 상기 고정화는 dCas9/gRNA 복합체를 고상 지지체인 기판 표면에 처리하고 인큐베이션함으로써, dCas9/gRNA 복합체가 표면에 코팅되는 것을 의미하나, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 이에 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 임의의 고정화 방법을 이용하여 추가적으로 고정화할 수 있다.
본 발명에 따르면, dCas9/gRNA 복합체가 기판 표면에 고정되어 있다. 이러한 고정된 dCas9/gRNA 복합체는 PAM (protospacer-adjacent motif) 서열을 포함하고 표적 RNA에 상보적 서열을 포함하는 3'-말단에 검출가능한 시그날을 간접적으로 생성할 수 있는 표지 리간드가 결합된 염기서열과 반응을 쉽게 일어나게 하고, 빠르게 표적 RNA에 의해 생성되는 차후 검출 가능한 표지 리간드를 제공한다.
본 발명에 따른 표적 RNA 검출용 키트는 (b) PAM (protospacer-adjacent motif) 서열을 포함하고 표적 RNA에 상보적 서열을 포함하는 3'-말단에 검출가능한 시그날을 간접적으로 생성할 수 있는 표지 리간드가 결합된 염기서열; 을 가진다.
위 염기서열이 기판 표면에 고정화된 dCas9/gRNA 복합체에 처리되면, 표적 RNA의 유무에 따라 상이한 반응 결과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 표적 RNA 검출용 키트는 (c) 검출가능한 시그날을 인지하는 항-리간드를 가진다.
상기 항-리간드는 검출 가능한 시그널을 제공하는 표지 리간드에 반응하여 착색된, 발광성, 형광성, 인광성, 방사활성 또는 자기 시그날 등의 정보를 제공하고, 이에 따라 표적 RNA에 대한 유무 정보를 제공한다.
본 발명은 (a) dCas9과 표적 RNA에 상보적인 guide RNA(gRNA)를 포함하는 기판 표면에 고정화된 dCas9/gRNA 복합체;
(b) PAM (protospacer-adjacent motif) 서열을 포함하고 표적 RNA에 상보적 서열을 포함하는 3'-말단에 비오틴-결합된 결합된 염기서열;
(c) 아비딘 또는 아비딘 유사체의 호스래디쉬 과산화수소 컨쥬게이트; 및
(d) 호스래디쉬 과산화수소 기질을 포함하는 표적 RNA 검출용 키트를 제공한다.
앞서 검출 방법에서 언급된 내용은 본 키트에서도 적절히 변형되어 적용 가능하다.
또한, 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작된다.
또한 상기 키트는 사용 지침(instruction) 및 기타 검출에 필요한 도구 또는 장비를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 PAMmer 도입에 따른 dCas9/gRNA 복합체 기반 시스템에 의해, 종래 PCR 과정을 수행하지 않고도, 높은 감도로, 표적 유전자의 육안 검출이 달성된다. 따라서, 본 발명은 보다 개선된 정확성 및 편의성을 가지고, 효과적으로 복수의 타겟 서열을 동시 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 단일 염기 단위로도 정교하게 타겟 서열을 검출할 수 있다.
본 발명의 PAMmer를 도입한 dCas9/gRNA 복합체 기반 육안 검출 시스템에 의한 표적 RNA의 검출 방법은 별도의 유전자 분리 및 증폭 단계 없이 육안으로 표적 RNA를 검출할 수 있으며, 특히, 우수한 표적 특이성 및 신속성을 통하여 빠르고 정확하게 표적 RNA를 검출할 수 있어 다양한 병원균 및/또는 바이러스들에 대한 검출에 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
도 1a는 표적 RNA와 biotin-PAMmer 및 gRNA의 염기서열 구조를 나타내며, 도 1b는 표적 RNA와 biotin-PAMmer가 dCas9/gRNA 복합체와 반응 시 표적 RNA/biotin-PAMmer의 이동상의 변화를 확인한 전기 영동 결과를 나타낸다.
도 2는 dCas9/gRNA 복합체의 표면 고정화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3a는 표적 RNA인 SARS-CoV-2 N1과 biotin-PAMmer, 및 gRNA의 염기서열 구조를 나타내며, 도 3b는 dCas9/gRNA 복합체와 biotin-PAMmer를 이용해 SARS-CoV-2 N1 유전자를 육안으로 정량 검출한 결과를 나타내며, 도 3c는 표적 RNA인 pH1N1 H1과 biotin-PAMmer, 및 gRNA의 염기서열 구조를 나타내며, 도 3d는 dCas9/gRNA 복합체와 biotin-PAMmer를 이용해, pH1N1 H1 유전자를 육안으로 정량 검출한 결과를 나타낸다.
도 4a는 dCas9/gRNA 복합체와 biotin-PAMmer를 이용한 SARS-CoV-2 및 pH1N1 H1유전자의 선택적 검출 결과를 나타내며, 도 4b는 dCas9/gRNA 복합체와 biotin-PAMmer를 이용한 인플루엔자 바이러스 아형 (H1, H3, H5) 유전자를 선택적으로 검출한 결과를 나타낸다.
도 5는 dCas9/gRNA 복합체 기반의 약물 내성 인플루엔자 바이러스 유전자의 검출 결과로서, 도 5a 및 5b는 서열정보를 나타내며, 도 5c 및 5d는 약물 내성 인플루엔자 바이러스의 검출 결과 확인을 나타낸다.
도 6는 바이러스 배양액으로부터 별도의 유전자 분리 및 증폭 과정 없이 SARS-CoV-2 및 pH1N1 유전자를 선택적으로 검출한 결과로서, 도 6a는 관련 모식도를 나타내며, 도 6b는 실험 결과를 나타낸다.
도 7는 음성 비인두 흡입물 및 객담 샘플에 각각 SARS-CoV-2, pH1N 및 약물 내성 pH1N1을 처리 후, 별도의 유전자 분리 및 증폭 과정 없이, 처리한 바이러스를 검출해낸 결과로서, 도 7a는 실험 모식도를 나타내며, 도 7b 내지 7d는 검출 결과를 나타낸다.
도 8은 COVID-19 양성 확진 환자의 비인두 흡입물 및 객담 샘플에서, 별도의 유전자 분리 및 증폭 과정 없이, 바이러스를 검출해 낸 결과를 보여준다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. biotin-PAMmer의 도입을 통한 dCas9/gRNA의 표적 특이성
본 발명자들은 본 발명의 biotin-PAMmer 도입을 통한 dCas9/gRNA 시스템에 의한 타겟-특이 검출 효과를 입증하고자, 타겟(표적) RNA 및 biotin-PAMmer의 존재하에서 dCas9/gRNA 복합체의 표적 특이성을 확인하였다.
간략하게는 다음과 같다: 먼저, 100 nM의 gRNA와 1 μM의 dCas9 단백질을 상온에서 10분간 반응하여 dCas9/gRNA 복합체를 형성하였다.
또한, PAMmer는 PAM 염기서열을 포함하지 않는 단일 가닥의 타겟(표적) RNA를 dCas9/gRNA 복합체에 의해 인지될 수 있도록 하기 위해, PAM 서열을 포함하는 동시에, 검출가능한 시그널을 발생시키기 위해 표지 리간드를 포함하도록 제작한 짧은 올리고뉴클레오타이드이다.
본 발명의 PAMmer는, 가이드 뉴클레오타이드 서열-프로그램 가능한 RNA 결합 단백질과 상호작용할 수 있는 PAM 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드로서,
표적 유전자(RNA)에 상보적인 염기서열 부위(3'-제1 혼성화 부위 및 5'-제2 혼성화 부위) 및 PAM 서열을 포함하며;
상기 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단(3'-제1 혼성화 부위)에 검출가능한 시그널을 간접 발생시키는 표지 리간드를 포함하고;
상기 5'-제2 혼성화 부위는 상기 PAM 서열로부터 5'-말단 방향으로 8 bp가 연장된 부위로서, 이 연장 부위는 gRNA의 표적 유전자 결합(혼성화) 부위와 일치(서열이 동일)하도록 설계된 것을 특징으로 한다.
본 실시예에서는, 비오틴이 결합된 형태의 biotin-PAMmer을 이용하였다.
상기 dCas9/gRNA 복합체를 농도별(10, 50, 100, 250 nM)로 희석하고, 여기에 1 μM의 표적 RNA 유전자, 1 μM의 biotin-PAMmer 및 1X 반응 버퍼를 혼합하여, 1 시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 상기 반응물을 8%의 native PAGE 젤을 사용하여 전기영동한 후, biotin-PAMmer 및 표적 RNA의 이동상 변화(mobility shift)를 확인하였다. 반응에 사용된 gRNA, biotin-PAMmer, 표적 RNA의 염기서열 구조는 도 1a과 같다.
그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 타겟 RNA 및 biotin-PAMmer의 존재하는 조건에서, dCas9/gRNA 복합체를 처리하지 않은 경우, biotin-PAMmer와 표적 RNA의 이동상에 변화가 없는 반면, dCas9/gRNA 복합체를 처리한 경우에는 복합체의 농도가 증가함에 따라 이동상에 변화, 즉, biotin-PAMmer와 표적 RNA의 양이 증가하는 것을 확인하였다.
이를 통해 dCas9/gRNA 복합체는, biotin-PAMmer 및 표적 RNA에 특이적으로 결합한다는 것을 확인하였다.
실시예 2. dCas9/gRNA 복합체의 고상에서의 고정화
본 발명자들은 고상에서 dCas9/gRNA 복합체를 고정화시켰을 때 본 발명의 biotin-PAMmer를 도입한 dCas9/gRNA 시스템이 작동할 수 있는 지 확인하기 위하여, dCas9/gRNA 복합체를 고상 기질의 표면에 고정화시켰다.
간략하게는 다음과 같다: 600 nM의 gRNA와 1 μM의 dCas9을 상온에서 10분간 반응하여 dCas9/gRNA 복합체를 형성한 후, 1X PBS 용액을 이용하여 10배 희석시킨 dCas9/gRNA 복합체를 96웰 플레이트에 처리하여 상온에서 2시간 반응하였다.
이후, 1X PBS, 0.05 % tween 20으로 구성된 세척 버퍼를 이용하여 표면을 세척하였다. 다음으로, 0.1 mg/mL의 BSA(bovine serum albumin)를 표면에 처리하여 40 분간 상온에서 반응하고, 세척 버퍼로 표면을 세척하였다. 이후, 5% 탈지 분유에 희석된 Cas9 모노클로날 항체(monoclonal antibody)를 표면에 처리하고 1 시간 동안 반응하였다. 세척 버퍼를 이용하여 표면을 세척한 후, 5% 탈지 분유에 희석된 HRP-conjugated anti-mouse IgG secondary antibody를 표면에 처리하고 1 시간 동안 반응하였다. 표면을 세척하고, TMB 용액 및 2.5 M 황산 용액을 순차적으로 처리하여 색 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, dCas9/gRNA 복합체가 처리되지 않은 표면과 비교하여, dCas9/gRNA 복합체가 처리된 경우에만 색 변화가 발생하는 것을 확인하였고, 이를 통해 dCas9/gRNA 복합체가 성공적으로 표면에 코팅된 것을 알 수 있었다.
즉, 이는, 통상적으로 당업계에 공지된 고체 표면 고정화를 위한 전용 버퍼의 사용 및/또는 특정 고정화 조건 하에서 실시되지 않더라도, 희석된 dCas9/gRNA 복합체를 96 웰 플레이트와 같은 고상 지지체에 처리한 후, 상온에서 인큐베이션하는 것만으로도 고상 지지체 상에 적용하여 검출가능함을 입증한다.
실시예 3. 표적 RNA의 육안 검출
본 발명자들은 상기 실시예 2에서 고체 표면-고정화된 dCas9/gRNA 복합체에, 표적 RNA와 biotin-PAMmer를 반응시킨 후, streptavidin-HRP 및 TMB 처리에 의해 육안으로 표적 RNA를 검출할 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, 600 nM의 gRNA와 1 μM의 dCas9을 상온에서 10분간 반응하여 dCas9/gRNA 복합체를 형성한 후, 1X PBS 용액을 이용하여 10배 희석시킨 dCas9/gRNA 복합체를 96well plate에 처리하여 상온에서 2시간 반응하였다. 이후, 1X PBS, 0.05 % tween 20으로 구성된 세척 버퍼를 이용하여 표면을 세척하였다. 다음으로, 0.1 mg/mL의 bovine serum albumin (BSA)를 표면에 처리하여 40분간 상온에서 반응하고, 세척 버퍼로 표면을 세척하였다. 이후, 농도별로 준비된 표적 RNA (0 ~ 100 nM)를 1 μM의 biotin-PAMmer 및 1X 반응 버퍼와 혼합하여 표면에서 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 표면 세척 후, 20 μg/mL의 streptavidin-HRP와 30분간 상온에서 반응하였다. 표면을 세척하고, TMB 용액 및 2.5 M 황산 용액을 순차적으로 처리하여 색 변화를 확인하였고, 마이크로플레이트 기계로 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 450 nm에서 관찰하였다.
이때, 반응에 사용된 gRNA, biotin-PAMmer, 표적 RNA의 염기서열 구조는 도 3a 및 3c에 나타내었다.
그 결과, 도 3b 및 도 3d에 나타낸 바와 같이, 표적 RNA의 농도가 증가함에 따라(0 ~ 100 nM), 측정된 흡광도가 증가하는 것을 확인하였다.
이는, 본 발명의 표면-고정화된 dCas/gRNA 복합체와 biotin-PAMmer, streptavidin-HRP 및 TMB 반응을 사용하는 경우, 표적 RNA의 육안 검출이 가능함을 입증한다.
실시예 4. 표적 RNA의 특이적 검출
본 발명자들은 dCas9/gRNA 기반의 표적 RNA 육안 검출 기술을 이용하여 다중 유전자의 동시 검출이 가능한지를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3에서 전술한 바와 같이, 각기 다른 유전자를 표적하는 dCas9/gRNA 복합체를 형성하여, 96 well plate의 각기 다른 표면에 고정화하고 BSA를 처리하였다. 이후, 여러 종류의 유전자가 혼합된 샘플을, 각기 다른 유전자를 표적하는 dCas9/gRNA 복합체가 고정된 표면에 동시에 처리하였다. 그후, 상기 실시예 3에서와 같이 biotin-PAMmer 및 streptavidin-HRP 처리 과정을 통하여 육안 검출 반응을 진행하였다. 이때, biotin-PAMmer는 표적 RNA 별로 다른 염기서열을 갖도록 설계하였으며, 각각 표적하는 유전자가 같은 dCas9/gRNA 복합체가 고정된 표면에 처리되었다.
이하, 본 실시예에 이용된 서열 정보를 하기 표 1에 나타내었다.
gRNA 서열 (5' → 3')
SARS-CoV-2 N1(서열번호 1) mA*mA*mA* CGU AAU GCG GGG UGC AUG UUU UAG AGC UAG AAA UAG CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAA AAA GUG GCA CCG AGU CGG UGC mU*mU*mU* U
SARS-CoV-2 N2(서열번호 2) mU*mG*mG* GGG CAA AUU GUG CAA UUG UUU UAG AGC UAG AAA UAG CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAA AAA GUG GCA CCG AGU CGG UGC mU*mU*mU* U
SARS-CoV-2 N3(서열번호 3) mG*mG*mG* UGC CAA UGU GAU CUU UUG UUU UAG AGC UAG AAA UAG CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAA AAA GUG GCA CCG AGU CGG UGC mU*mU*mU* U
pH1N1 H1(서열번호 4) mC*mC*mA* GCA UUU CUU UCC AUU GCG UUU UAG AGC UAG AAA UAG CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAA AAA GUG GCA CCG AGU CGG UGC mU*mU*mU* U
pH1N1 WT N1(서열번호 5) mC*mC*mU* CUU AGU GAU AAU UAG GGG UUU UAG AGC UAG AAA UAG CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAA AAA GUG GCA CCG AGU CGG UGC mU*mU*mU* U
pH1N1/H275Y N1(서열번호 6) mC*mC*mU* CUU AGU AAU AAU UAG GGG UUU UAG AGC UAG AAA UAG CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAA AAA GUG GCA CCG AGU CGG UGC mU*mU*mU* U
IFV H3(서열번호 7) mC*mU*mU* CCA UUU GGA GUG AUG CAG UUU UAG AGC UAG AAA UAG CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAA AAA GUG GCA CCG AGU CGG UGC mU*mU*mU* U
IFV H5(서열번호 8) mC*mA*mA* CCA UCU ACC AUU CCC UGG UUU UAG AGC UAG AAA UAG CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAA AAA GUG GCA CCG AGU CGG UGC mU*mU*mU* U
Target 서열 (5' → 3')
SARS-CoV-2 N1(서열번호 9) GAC CCC AAA AUC AGC GAA AUG CAC CCC GCA UUA CGU UUG G
SARS-CoV-2 N2(서열번호 10) UUA CAA ACA UUG GCC GCA AAU UGC ACA AUU UGC CCC CA
SARS-CoV-2 N3(서열번호 11) GGG AGC CUU GAA UAC ACC AAA AGA UCA CAU UGG CAC CC
pH1N1 H1(서열번호 12) GGU ACC GAG AUA UGC AUU CGC AAU GGA AAG AAA UGC UGG AUC UG
pH1N1 WT N1(서열번호 13) AUC AGU CGA AAU GAA UGC CCC UAA UUA UCA CUA UGA GGA AUG CUC CUG
pH1N1/H275Y N1(서열번호 14) AUC AGU CGA AAU GAA UGC CCC UAA UUA UUA CUA UGA GGA AUG CUC CUG
IFV H3(서열번호 15) UUG GCA AGU GCA AGU CUG AAU GCA UCA CUC CAA AUG GAA GCA UU
IFV H5(서열번호 16) GGU UUU AUA GAG GGA GGA UGG CAG GGA AUG GUA GAU GGU UGG UAU G
SARS(서열번호 17) AAC AUG CUU AGG AUA AUG GCC UCU CUU GUU CUU GCU CGC A
Biotin-PAMmer Sequence (5' → 3')
SARS-CoV-2 N1(서열번호 18) GGG TGC ATC GGG CTG ATT TTG GGG TC - Biotin
SARS-CoV-2 N2(서열번호 19) GTG CAA TTC GGG GCC AAT GTT TGT AA - Biotin
SARS-CoV-2 N3(서열번호 20) GAT CTT TTC GGG TAT TCA AGG CTC CC - Biotin
pH1N1 H1(서열번호 21) rUrCrC rATrU GrCC rGGrU GrCA rUArU CrUC rGGrU ArCC rArAC rUT - Biotin
pH1N1 WT N1 및 pH1N1/H275Y N1(서열번호 22) rAArU rUArG GrGC GrGrU rUCA rUrUT CGA CrUG AT - Biotin
IFV H3(서열번호 23) rGrUG rATrG CrArC GrGrA GrAC TrUrG rCAC rUTG rCrCA - Biotin
IFV H5(서열번호 24) rArUT rCCrC TrGrC GrGrU CrCT CrCrC rUCT rATA rArAA - Biotin
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 표적 RNA가 각각의 dCas9/gRNA 복합체에 의하여 매우 선택적으로 검출될 수 있다는 것을 확인할 수 있었고, 표적 RNA의 염기서열에 따라 매우 특이적인 육안 검출이 가능함을 보여주었다.
구체적으로, 도 4a는 SARS-CoV-2 N1 (CoV-2 N1), SARS-CoV-2 N2 (CoV-2 N2), SARS-CoV-2 N3 (CoV-2 N3), pH1N1 H1 (H1)에 대한 결과를 나타낸다. 해당 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 표적 RNA를 육안으로 명확히 검출할 수 있었으며, 이를 통해 코로나 바이러스의 검출이 가능함을 확인하였다.
또한, 도 4b는 pH1N1 H1 (H1), IFV H3(H3), IFV H5(H5)에 대한 결과를 나타낸다. 해당 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 표적 RNA를 육안으로 명확히 검출할 수 있었으며, 이를 통해 인플루엔자 바이러스의 검출이 가능함을 확인하였다.
즉, 본 발명의 dCas9/gRNA 기반의 표적 RNA 육안 검출 방법을 통하여 다중 표적 RNA에 대한 동시 검출이 가능함을 입증하였다.
실시예 5: 단일 염기서열 차이를 갖는 유전자의 검출
신종플루 바이러스의 치료제인 Oseltamivir에 대해 내성을 보이는 약물 내성 바이러스 중, H275Y N1 돌연변이형(mutant type)은 약물에 감수성이 있는 바이러스(wild type)와 비교하여, 단일 염기서열의 차이를 보이는 것으로 알려져 있다. 적절한 치료를 위해서는 약물 내성 바이러스 감염 여부에 대한 빠른 진단이 요구된다.
이에, 본 발명자는 본 발명의 dCas9/gRNA 기반의 표적 RNA 육안 검출 기술을 이용하여 단일 염기서열의 차이를 갖는 유전자를 구별할 수 있는지를 확인하기 위하여, 돌연변이형인 pH1N1/H275Y N1와 야생형인 pH1N1 WT N1을 대상으로, 실험을 실시하였다.
구체적으로, 도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같이, 표적 RNA인 pH1N1/H275Y RNA 상에서 야생형(wild type) 바이러스와 비교하여 염기서열의 차이(예컨대, 단일 염기 변이)가 있는 부분을, gRNA가 결합하는 gRNA 결합 영역으로 선택하고, 상기 gRNA 상의 차이나는 염기서열 위치에서 5'-말단 방향으로 5 bp가 이격된 위치에 하나의 염기서열 미스매치(mismatch)를 갖도록 gRNA를 제작하였다.
이후, 상기 실시예 3에서 전술한 바와 같이 dCas9/gRNA 복합체를 형성하여 고상 표면에 고정하고, biotin-PAMmer 및 streptavidin-HRP, TMB 처리를 통하여 육안 검출을 실시하였다.
그 결과, 도 5c 및 도 5d에 나타낸 바와 같이, 인플루엔자 바이러스의 H275Y 돌연변이형의 유전자에 상보적인 gRNA로 구성된 dCas9/gRNA가 고정된 표면에서는, H275Y N1 돌연변이형의 유전자가 처리된 경우 색 변화가 관찰되었다.
반면, 표적 RNA와 단일 염기서열의 차이를 갖는 야생형의 유전자가 처리된 경우에는 색 변화가 관찰되지 않았다.
이는, 본 발명의 dCas9/gRNA 기반의 표적 RNA 육안 검출 기술을 통하여, 단일 염기서열 차이를 갖는 유전자를 구별할 수 있음을 제시한다.
실시예 6. 바이러스 배양액에서의 바이러스 검출
본 발명자들은, SARS-CoV-2 및 신종 인플루엔자 바이러스를 배양한 배양액에서, 별도의 키트를 통한 유전자 추출 및 증폭 과정 없이, 본 발명의 dCas9/gRNA 기반의 표적 RNA 육안 검출 기술을 이용하여, 표적 바이러스 RNA를 선택적으로 검출하고자 하였다(도 6a).
보다 상세하게, 103 PFU/mL 농도의 SARS-CoV-2, 104 PFU/mL 농도의 신종플루 바이러스(pH1N1) 및 상기 두 종류의 바이러스를 혼합한 샘플 (SARS-CoV-2 및 신종플루)을 준비한 후, 각 샘플을 TCEP/EDTA (최종 농도 100 mM/1 mM) 용액으로 처리하였다. 이후, 50℃에서 5분, 64℃에서 5분 순차적으로 열처리하여 샘플로 사용하였다. 다음으로 상기 실시예 3에서 전술한 바와 같이, SARS-CoV-2와 신종플루 바이러스의 유전자를 표적으로 하는 dCas9/gRNA 복합체를 고상 표면에 고정화 하고, biotin-PAMmer 및 streptavidin-HRP, TMB 처리를 통하여 육안 검출을 실시하였다.
그 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 바이러스를 처리하지 않은 조건에서는 색 변화가 관찰되지 않았으나, SARS-CoV-2 바이러스 용액이 단독 처리된 경우에는 SARS-CoV-2 유전자 (CoV-2 N1, N2, 및 N3)에 대해 상보적인 dCas9/gRNA 복합체가 고정된 표면에서만 색 변화가 관찰되었다.
또한, 신종플루 바이러스 용액이 단독 처리된 경우에는 신종플루 유전자 (H1)에 대해 상보적인 dCas9/gRNA 복합체가 고정된 표면에서만 색 변화가 관찰되었다.
또한, 두 바이러스를 혼합 처리한 조건에서는 SARS-CoV-2 및 H1에 상보적인 dCas9/gRNA 복합체가 고정된 표면 모두에서 색 변화가 관찰되는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해, 별도의 유전자 분리 및 증폭 과정 없이도, dCas9/gRNA 기반의 표적 RNA 육안 검출 기술을 통하여, 바이러스 배양액에서의 바이러스 유전자가 매우 선택적으로 검출 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예 7. 비인두 흡입물 및 객담에서의 표적 RNA 검출 확인
SARS-CoV-2 및 신종플루 바이러스와 같이 호흡기 질환을 일으키는 바이러스들은 주로 비인두 흡입물 또는 객담에서, 바이러스 RNA 분리 키트에 의하여 추출되어, RT-PCR 방법에 의해 검출되고 있다.
이에, 본 발명자들은 키트를 통한 별도의 유전자 추출 과정없이, 본 발명의 dCas9/gRNA 기반의 표적 RNA 육안 검출 기술을 이용하여, 비인두 흡입물(nasopharyngeal aspirates) 또는 객담(nasopharyngeal sputum)에서 바이러스 RNA를 검출하고자 하였다(도 7a).
구체적으로, SARS-CoV-2 (103 PFU/mL) 및 신종플루 (104 PFU/mL), H275Y 약물 내성 신종플루 (104 PFU/mL) 바이러스를 비인두 흡입물 또는 객담에 처리하였다. 이후, 바이러스 처리된 비인두 흡입물 및 객담을 TCEP/EDTA (최종 농도 100 mM/1 mM) 용액으로 처리하고, 50℃에서 5분, 64℃에서 5분 순차적으로 열처리하여 샘플로 사용하였다. 상기 실시예 3에서 전술한 바와 같이, SARS-CoV-2. 신종플루 바이러스(pH1N1) 및 H275Y 약물 내성 신종플루(pH1N1/H275Y)의 유전자를 표적으로 하는 dCas9/gRNA 복합체를 표면에 고정화하고, biotin-PAMmer 및 streptavidin-HRP, TMB 처리를 통하여 육안 검출을 실시하였다.
그 결과, 도 7b 내지 도 7c에 나타낸 바와 같이, 바이러스를 처리하지 않은 음성 비인두 흡입물 및 객담 검체 조건에서는 색 변화가 관찰되지 않았으나, 바이러스가 처리된 양성 검체 샘플은 각기 상보적인 dCas9/gRNA 복합체가 고정된 표면에서 선택적으로 색 변화가 관찰되는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해, 비인두 흡입물 및 객담 검체에서 별도의 유전자 분리 및 증폭 과정 없이도, dCas9/gRNA 기반의 표적 RNA 육안 검출 기술을 통하여, 표적 RNA 검출이 가능함을 확인할 수 있었다.
구체적으로, 도 7b 및 도 7c를 통해서 SARS-Cov-2 유무의 확인이 가능함을 확인하였고, 도 7d를 통해서 인플루엔자 바이러스뿐만 아니라 단일 변이를 가지는 변이체에 대한 확인도 가능함을 확인하였다.
실시예 8. COVID-19 양성 확진 환자의 비인두 흡입물 및 객담에서의 표적 RNA 검출 확인
본 발명자들은, 종래 키트를 통한 별도의 유전자 추출 과정없이, 본 발명의 dCas9/gRNA 기반의 표적 RNA 육안 검출 기술을 이용하여, 임상에서 실제 COVID-19를 검출할 수 있음을 입증하기 위하여, 양성 확진 환자의 비인두 흡입물 및 객담을 이용하여 표적 RNA 검출을 확인하였다.
간략하게는, COVID-19 양성 확진 환자 및 음성 환자의 비인두 흡입물 및 객담을 각각 TCEP/EDTA (최종 농도 100 mM/1 mM) 용액으로 처리하고, 50℃에서 5분, 64℃에서 5분 순차적으로 열처리하여 샘플로 사용하였다. 상기 실시예 3에서 전술한 바와 같이, SARS-CoV-2의 유전자를 표적으로 하는 dCas9/gRNA 복합체를 표면에 고정화 하고, biotin-PAMmer 및 streptavidin-HRP, TMB 처리를 통하여 육안 검출을 실시하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 음성 환자의 비인두 흡입물 및 객담 검체 조건에서는 색 변화가 관찰되지 않았으나, 양성 확진 환자의 검체 샘플은 각기 상보적인 dCas9/gRNA 복합체가 고정된 표면에서 선택적으로 색 변화가 관찰되는 것을 확인하였다.
이를 통해, 비인두 흡입물 및 객담 검체에서 별도의 유전자 분리 및 증폭 과정 없이도, 본 발명의 dCas9/gRNA 기반의 표적 RNA 육안 검출 기술을 통하여, COVID-19 감염 진단이 가능함을 확인할 수 있었다.
상기 결과들로부터 본 발명에 따른 표적 RNA의 검출 방법이 별도의 유전자 분리 및 증폭 단계 없이 육안으로 표적 RNA를 검출할 수 있으며, 특히, 우수한 표적 특이성 및 신속성을 통하여 빠르고 정확하게 표적 RNA를 검출할 수 있음을 확인하였다. 이에 따라, 다양한 병원균 및/또는 바이러스, 특히, 유행성이 높은 바이러스들에 대한 검출에 우수한 효과를 나타낼 수 있음을 입증하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology BioNano Health Guard Research Center <120> TARGET RNA DETECTING METHOD BASED ON dCas9/gRNA COMPLEX <130> KRIBB1-66/1-16PCT <150> KR 10-2020-0097531 <151> 2020-08-04 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 N1 (1-3, 97-99: 2'-O-methyl/ phosphorothioate modification) <400> 1 aaacguaaug cggggugcau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 N2 (1-3, 97-99: 2'-O-methyl/ phosphorothioate modification) <400> 2 ugggggcaaa uugugcaauu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 3 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 N3 (1-3, 97-99: 2'-O-methyl/ phosphorothioate modification) <400> 3 gggugccaau gugaucuuuu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 4 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pH1N1 H1 (1-3, 97-99: 2'-O-methyl/ phosphorothioate modification) <400> 4 ccagcauuuc uuuccauugc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 5 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pH1N1 WT N1 (1-3, 97-99: 2'-O-methyl/ phosphorothioate modification) <400> 5 ccucuuagug auaauuaggg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 6 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pH1N1/H275Y N1 (1-3, 97-99: 2'-O-methyl/ phosphorothioate modification) <400> 6 ccucuuagua auaauuaggg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 7 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFV H3 (1-3, 97-99: 2'-O-methyl/ phosphorothioate modification) <400> 7 cuuccauuug gagugaugca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 8 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFV H5 (1-3, 97-99: 2'-O-methyl/phosphorothioate modification) <400> 8 caaccaucua ccauucccug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 9 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 N1 <400> 9 gaccccaaaa ucagcgaaau gcaccccgca uuacguuugg 40 <210> 10 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 N2 <400> 10 uuacaaacau uggccgcaaa uugcacaauu ugccccca 38 <210> 11 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 N3 <400> 11 gggagccuug aauacaccaa aagaucacau uggcaccc 38 <210> 12 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pH1N1 H1 <400> 12 gguaccgaga uaugcauucg caauggaaag aaaugcugga ucug 44 <210> 13 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pH1N1 WT N1 <400> 13 aucagucgaa augaaugccc cuaauuauca cuaugaggaa ugcuccug 48 <210> 14 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pH1N1/H275Y N1 <400> 14 aucagucgaa augaaugccc cuaauuauua cuaugaggaa ugcuccug 48 <210> 15 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFV H3 <400> 15 uuggcaagug caagucugaa ugcaucacuc caaauggaag cauu 44 <210> 16 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFV H5 <400> 16 gguuuuauag agggaggaug gcagggaaug guagaugguu gguaug 46 <210> 17 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS <400> 17 aacaugcuua ggauaauggc cucucuuguu cuugcucgca 40 <210> 18 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 N1 <400> 18 gggtgcatcg ggctgatttt ggggtc 26 <210> 19 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 N2 <400> 19 gtgcaattcg gggccaatgt ttgtaa 26 <210> 20 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 N3 <400> 20 gatcttttcg ggtattcaag gctccc 26 <210> 21 <211> 32 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pH1N1 H1 <220> <223> chimeric <400> 21 uccatugccg gugcauaucu cgguaccaac ut 32 <210> 22 <211> 26 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pH1N1 WT N1 and pH1N1/H275Y N1 <220> <223> chimeric <400> 22 aauuagggcg guucauutcg acugat 26 <210> 23 <211> 27 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFV H3 <220> <223> chimeric <400> 23 gugatgcacg gagactugca cutgcca 27 <210> 24 <211> 27 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFV H5 <220> <223> chimeric <400> 24 autccctgcg gucctcccuc tataaaa 27

Claims (18)

  1. 다음 단계를 포함하는, 표적 RNA의 검출 방법:
    (a) 불활성화된 Cas9(dCas9)과 표적 RNA에 상보적인 gRNA(guide RNA)로 이루어진 dCas9/gRNA 복합체를, 대상으로부터 분리된 생물학적 시료 및 PAMmer와 반응시키는 단계로서,
    상기 PAMmer는,
    표적 RNA에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3'-제1 혼성화 부위(hybridization portion), PAM (protospacer-adjacent motif) 서열, 및 표적 RNA에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5'-제2 혼성화 부위를 포함하며,
    상기 3'-말단에 검출가능한 시그날을 간접 생성하는 표지 리간드가 결합된 올리고뉴클레오타이드이고; 및
    (b) 검출가능한 시그날을 인지하는 항-리간드를 상기 (a) 단계의 반응물에 처리하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 상기 3'-말단에 검출가능한 시그날을 간접적으로 생성할 수 있는 표지 리간드는, 비오틴, 디곡시게닌, 압타머 (aptamer), 펩타이드(peptide), 형광 화합물 (fluorescent compound), 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 및 폴리사카라이드 (polysaccharides)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는,
    표적 RNA의 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 상기 검출가능한 시그날을 인지하는 항-리간드는 아비딘 또는 아비딘 유사체, 항체, 수용체 및 렉틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는,
    표적 RNA의 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 상기 3'-말단에 검출가능한 시그날을 간접 생성하는 표지 리간드는 비오틴이고;
    상기 (b) 단계의 검출가능한 시그날을 인지하는 항-리간드는 아비딘 또는 아비딘 유사체인 것을 특징으로 하는,
    표적 RNA의 검출 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 gRNA는 단일 사슬 가이드 RNA인 것을 특징으로 하는,
    표적 RNA 검출 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 gRNA는, 상기 PAMmer의 5'-제2 혼성화 부위와 동일한 서열을 포함하며, 상기 서열은 5 내지 20 뉴클레오타이드 길이인 것을 특징으로 하는,
    표적 RNA의 검출 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 PAMmer의 5'-제2 혼성화 부위는, PAM 서열을 기준으로 3' → 5' 방향으로 5 내지 20 뉴클레오타이드 길이인 것을 특징으로 하는,
    표적 RNA 검출 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 상기 PAM 서열은 5'-NGG 또는 NGGNG이고, 상기 N은 임의의 뉴클레오티드로 정의되는 것을 특징으로 하는,
    표적 RNA 검출 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 dCas9/gRNA 복합체는 고정화된 것을 특징으로 하는,
    표적 RNA 검출 방법.
  10. 제4항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 아비딘 유사체는 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 또는 캡타비딘(captavidin)인 것을 특징으로 하는,
    표적 RNA 검출 방법.
  11. 제4항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 아비딘 또는 아비딘 유사체는 아비딘 또는 아비딘 유사체의 호스래디쉬 과산화수소 컨쥬게이트인 것을 특징으로 하는,
    표적 RNA 검출 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 (b) 단계에 호스래디쉬 과산화수소 기질은 3,3',5,5'- 테트라메틸벤지딘 (TMB), 2,2'-아지노-디-[3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산] (ABTS), o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드 (OPD), 3,3'-디아미노벤즈이딘 (DAB) 및 루미놀로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는,
    표적 RNA 검출 방법.
  13. 제4항에 있어서,
    상기 방법은 (c) (b) 단계의 반응물의 발색 변화를 육안으로 확인하는 단계;를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는,
    표적 RNA 검출 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 표적 RNA는 바이러스 유래 RNA인 것을 특징으로 하는,
    표적 RNA 검출 방법.
  15. 다음을 포함하는 표적 RNA 검출용 키트:
    (a) dCas9과 표적 RNA에 상보적인 guide RNA(gRNA)를 포함하는 기판 표면에 고정화된 dCas9/gRNA 복합체;
    (b) 표적 RNA에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3'-제1 혼성화 부위(hybridization portion), PAM (protospacer-adjacent motif) 서열, 및 표적 RNA에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5'-제2 혼성화 부위를 포함하며, 3'-말단에 검출가능한 시그날을 간접 생성하는 표지 리간드가 결합된 PAMmer; 및
    (c) 검출가능한 시그날을 인지하는 항-리간드.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 3'-말단에 검출가능한 시그날을 간접 생성하는 표지 리간드는 비오틴, 디곡시게닌, 압타머 (aptamer), 펩타이드(peptide), 형광 화합물 (fluorescent compound), 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 및 폴리사카라이드 (polysaccharides) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는,
    표적 RNA 검출용 키트.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 검출가능한 시그날을 인지하는 항-리간드는 아비딘 또는 아비딘 유사체, 항체, 수용체 및 렉틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는,
    표적 RNA 검출용 키트.
  18. 다음을 포함하는 표적 RNA 검출용 키트:
    (a) dCas9과 표적 RNA에 상보적인 guide RNA(gRNA)를 포함하는 기판 표면에 고정화된 dCas9/gRNA 복합체;
    (b) 표적 RNA에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3'-제1 혼성화 부위(hybridization portion), PAM (protospacer-adjacent motif) 서열, 및 표적 RNA에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5'-제2 혼성화 부위를 포함하며, 3'-말단에 비오틴-결합된 PAMmer;
    (c) 아비딘 또는 아비딘 유사체의 호스래디쉬 과산화수소 컨쥬게이트; 및
    (d) 호스래디쉬 과산화수소 기질.
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