KR20220015451A - 흉선 재생과 t 세포의 재구성을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

흉선 재생과 t 세포의 재구성을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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폴 윌리암 피네건
다니엘 조지프 놀란
카롤리나 쿠차로바
마이클 다니엘 긴즈버그
케니스 엔. 윌스
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Abstract

본 발명은 아데노바이러스 E4ORF1 및/또는 BMP4를 발현하도록 조작된 비-흉선 내피 세포 (ntEC) 및 이러한 조작된 ntEC를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 이러한 ntEC를 요법에, 예를 들어 필요한 개체에서 흉선 재생 (예, T 세포 재구성 포함)을 강화하는데 이용하는 방법을 제공한다. 이러한 개체는, 예를 들어 노화, 감염(예, HIV 감염), 방사선 요법을 이용한 치료, 화학요법을 이용한 치료 또는 장기/조직 이식을 위한 준비로 골수파괴 컨디셔닝의 결과로서, 흉선 손상, 흉선 기능성 결함, T 세포 생산 부족이 존재하거나 및/또는 면역약화된 개체를 포함한다.

Description

흉선 재생과 T 세포의 재구성을 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2019년 5월 28일자 미국 가출원 번호 62/853,452에 대해 우선권 혜택을 주장한다.
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흉선은 골수에서 이동하는 조혈 선조 세포로부터 T 세포의 발생을 지원한다. Legrand et al. (2007);"Human thymus regeneration and T cell reconstitution;" Seminars in Immunology; Vol. 19; No. 5; pp 280-288. 흉선의 활성은 노화에 따라 점차적으로 쇠퇴해, T 세포 생산이 저하되고 면역 기능은 약화된다. Id. 또한, 흉선은 손상에 매우 민감하며, 쉽게 손상되어, 화학요법, 방사선 노출, 장기 이식 (예, 골수 이식) 전에 실시되는 컨디셔닝 용법 및 감염 (예, HIV 감염)에 대한 반응을 비롯한 다양한 상황에서 T 세포 생산 고갈 및 면역결핍으로 이어진다. Id. 흉선 조직의 재생은 T 세포 구획을 보충하여 - 면역 기능을 복구할 수 있다. Id. 흉선은 일부 고유한 재생 능력을 가지고 있지만, 이러한 흉선 재생 정도와 속도는 흔히 충분치 않아, 환자는 중증 면역-약화되어 잠재적인 생명을 위협하는 감염에 취약해진다. 이와 같이, 당해 기술 분야에서는 흉선 재생과 T 세포 재구성을 모두 강화할 수 있는 조성물 및 방법이 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요구들을 다룬다.
본 발명은, 부분적으로는, 살아있는 개체에 아데노바이러스 E4ORF1 폴리펩타이드 또는 아데노바이러스 E4ORF1 폴리펩타이드와 BMP4를 발현하도록 조작된 비-흉선 내피 세포 ("ntEC")를 투여함으로써, 흉선 재생을 생체내에서 유도할 수 있다는 놀라운 발견 사실을 기반으로 한다. 본 발명의 실시예 부분에 기술된 바와 같이, E4ORF1 단독 또는 E4ORF1을 BMP4와 함께 발현하는 조작된 ntEC를 살아있는 개체에 투여하면, 흉선 재생과 T 세포 재구성이 강화된다. 이러한 효과는, 기존에 발표된 연구들에서, 내피 세포의 투여가 흉선 재생을 강화할 수 있지만, 이러한 효과는 흉선 내피 세포를 사용한 경우에만 달성될 수 있는 것으로 입증되었다는 점에서, 특히 놀라운 일이다. Wertheimer et al., (2018); "Production of BMP4 by endothelial cells is crucial for endogenous thymic regeneration;" Sci. Immunol. 3, 2736을 참조한다. 이러한 선행 연구들에서, 흉선 재생은 비-흉선 내피 세포를 이용한 경우에는 관찰되지 않았다. Id. E4ORF1 단독 또는 BMP4 및 E4ORF1 둘다를 발현하는 조작된 ntEC를 이용해 생체내에서 흉선 재생과 T 세포 재구성을 유도할 수 있다는 발견은, 몇가지 중요한 실질적인 의미를 가지는데, 한가지는 환자의 흉선에서 내피 세포를 수득 및 배양하기 위해 복잡하고 침습적인 절차를 수행해야 하는 필요성을 없애준다. 대신, 흉선 재생과 T 세포 재구성 프로토콜에 사용하기 위한 내피 세포는 훨씬 더 접근하기 쉬운 소스, 예를 들어, 지방세포 조직, 피부 조직 또는 탯줄 조직으로부터 수득할 수 있어, 흉선 재생에서 내피 세포 요법의 이용가능성이 크게 단순해진다.
이에, 본 발명은 다양한 새로운 조성물 및 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 BMP4를 발현하는 조작된 ntEC 집단 (즉, BMP4+ ntEC)을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 아데노바이러스 E4ORF1 폴리펩타이드를 발현하는 조작된 ntEC 집단 (즉, E4ORF1+ ntEC)을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 BMP4 및 아데노바이러스 E4ORF1 폴리펩타이드를 발현하는 조작된 ntEC 집단 (즉, MP4+E4ORF1+ ntEC)을 제공한다. 일부 구현예에서, 이들 조작된 ntEC 집단은 단리된 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 조작된 ntEC 집단은 실질적으로 순수한 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 조작된 ntEC 집단은 시험관내에, 예를 들어 세포 배양물에 존재한다. 일부 구현예에서, 조작된 ntEC 집단은 생체외 존재한다. 일부 구현예에서, 조작된 ntEC 집단은 생체내 존재한다. 일부 구현예에서, 조작된 ntEC 집단은 살아있는 개체에 투여하기 적합한 치료학적 조성물과 같은 조성물에 존재한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명은 조작된 ntEC 집단, 및 살아있는 개체에 투여하기 적합한 생리 식염수를 포함하는 치료학적 조성물을 제공한다. 마찬가지로, 일부 구현예에서, 본 발명은 조작된 ntEC 집단 및 생체적합한 매트릭스 액체 물질 (예, Matrigel) 또는 생체적합한 매트릭스 고체 물질과 같은 생체적합한 매트릭스 물질을 포함하는 치료학적 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 ntEC, 및/또는 이들 조작된 ntEC를 포함하는 조성물은, 흉선 조직 중량, 흉선 기능 또는 T 세포 집단에 결함이 존재하는 개체 또는 면역약화 개체와 같은 살아있는 개체에서 흉선 재생 및/또는 T 세포 재구성을 강화하는 방법 등의, 다양한 치료학적 용도로 이용할 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 개체는 나이 든 개체이거나, 바이러스 감염 (예, HIV 감염) 개체이거나, 방사선 (예, 방사선 요법)에 노출된 개체이거나, 화학요법으로 치료받은 개체이거나, 또는 예를 들어, 골수 또는 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)과 같은 장기 이식을 준비하는 경우에 골수파괴성 컨디셔닝제로 처치받은 개체이다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명은 E4ORF1 또는 E4ORF1과 BMP4 둘다를 발현하도록 조작된 ntEC 또는 이러한 ntEC를 포함하는 치료학적 조성물을 필요한 개체에 유효량으로 투여하여 개체에서 흉선 재생 및/또는 T 세포 재구성을 자극하는 것을 포함하는, 개체에서 흉선 재생 및/또는 T 세포 재구성을 강화하는 방법을 제공한다.
내피 세포 (EC)는 임의의 비-흉선 소스로부터 유래할 수 있다. 적절한 EC (ntEC) 소스에 대한 예로는, 비-제한적으로, 지방세포 조직 (즉, 지방세포 EC), 피부 조직 (즉, 피부 EC), 심장 조직 (즉, 심장 EC), 신장 조직 (즉, 신장 EC), 폐 조직 (즉, 폐 EC), 간 조직 (즉, 간 EC), 골수 조직 (즉, 골수 EC), 제대정맥 (즉, 제대정맥 EC - 또는 "UVEC") 등이 있다.
일부 구현예에서, ntEC는 성체 EC이다. 일부 구현예에서, ntEC는 소아 EC (juvenile EC)이다. 일부 구현예에서, ntEC는 태아 EC이다. 일부 구현예에서, ntEC는 배아 EC이다. 일부 구현예에서, ntEC는 분화된 EC이다. 일부 구현예에서, ntEC는 내피 선조 세포로부터 유래한다. 일부 구현예에서, ntEC는 줄기 세포로부터 유래한다. 일부 구현예에서, ntEC는 일차 조직 배양물로부터 유래한다. 일부 구현예에서, ntEC는 내피 세포주의 EC로부터 유래한다. ntEC를 본원에 기술된 바와 같은 치료 방법에 이용할 경우에, 일부 구현예에서, ntEC는 세포를 투여받게 될 개체에 대해 자가의 것이며, 다른 구현예에서 ntEC는 세포를 투여받게 될 개체에 대해 동종이계의 것이다.
일부 구현예에서, ntEC는 언급된 분자 또는 분자들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 BMP4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 아데노바이러스 E4ORF1 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함한다. BMP4 및 E4ORF1 둘다 이용하는 구현예에서, BMP4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 E4ORF1 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 동일한 핵산 분자 또는 서로 다른 재조합 핵산 분자에 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, BMP4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 E4ORF1 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 이종의 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 플라스미드 벡터이다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 발현 벡터이다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 바이러스 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, E4ORF1 및/또는 BMP4 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 ntEC에서 일시적으로 발현된다. 일부 구현예에서, BMP4 및/또는 E4ORF1 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 ntEC에서 안정적으로 발현되다. 일부 구현예에서, E4ORF1 및/또는 BMP4 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 ntEC 게놈에 통합된다.
E4ORF1 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 이용하는 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 아데노바이러스 게놈이 아니다. E4ORF1 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 이용하는 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 자연 생성 아데노바이러스 게놈이 아니다. E4ORF1 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 이용하는 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 아데노바이러스 벡터가 아니다.
본 발명의 이러한 구현예들과 기타 구현예들은 본원의 다른 부분에서 추가로 기술된다. 아울러, 당해 기술 분야의 당업자에게 자명한 바와 같이, 본원에 기술된 다양한 구현예들에 대한 일부 수정 및 조합도 본 발명의 범위에 속한다.
도 1. 동일 탯줄로부터 유래한 세포주 4종에 대한 시험관내 증폭 분석. 첫째날, 표면적 25 cm2의 소형 플라스크에 각 세포주 500,000주를 접종한다. 모든 세포주는 증폭시 혈청 존재 하에 배양한다. E4ORF1+ HUVEC 및 BMP4+ E4ORF1+ HUVEC는 플라스크 4개, 즉 표면적 225 cm2 (4xT225)를 15일 이내에 채우는 반면, HUVEC 및 BMP4+ HUVEC는 16일째에 T225 플라스크 단 1개 (1xT225)만 채운다.
도 2A-C. BMP4+ E4ORF1+ ntEC는 흉선 재생을 자극한다. 실시예 2에 기술된 실험의 결과들. 각 그래프는 다음과 같은 처리군에서 살아있는 흉선 세포 (도 2. A), 살아있는 수질 상피 세포 (mTEC)(도 2B), 및 회복된 살아있는 피질 상피 세포 (cTEC)(도 2C)의 수를 도시한다: (1) NoRad, No EC, (2) Rad. No EC, (3) Rad, Mu 흉선 EC, (4) Rad Mu BMEC, 및 (5) Rad. Mu BMEC/BMP4. y축은 각 동물 개체의 흉선으로부터 단리된 총 세포 수를 나타낸다. 처리군 간의 유의한 차이는 *로 표시하며, 여기서 *는 P-값 <0.05, **는 P-값 <0.01, ***는 P-값 < 0.001을 의미한다. Mu = 뮤라인 (즉, 마우스). BMEC는 골수 내피 세포이다. Mu BMEC/BMP4 세포는 E4ORF1 및 BMP4 둘다 발현한다.
도 3A-F. BMP4+ E4ORF1+ ntEC는 흉선 재생을 자극한다. 실시예 2에 기술된 실험들의 결과. 그래프는 각 동물 개체의 흉선으로부터 단리한 지정된 유형의 세포의 수를 도시한다. 도 3A - CD45- EpCam+ 세포 수에 의해 측정한 전체 흉선 상피의 양. 도 3B - CD45- EpCam+ Ki67+ 세포의 수에 의해 측정한 활발하게 증식하는 흉선 상피 세포의 양. 도 3C - EpCam+ α6 인테그린+ Sca1+ 세포의 수에 의해 측정한 흉선 상피 선조 세포 (TEPC)의 양. 도 3D - EpCam+ α6 인테그린+ Sca1+ Ki67+ 세포의 수에 의해 측정한 활발하게 증식하는 TPEC의 양. 도 3E - CD45- K5+ K8+ 세포의 수에 의해 측정한 흉선 상피 선조 세포 (TEPC)의 양. 도 3F - CD45- K5+ K8+ Ki67+ 세포의 수에 의해 측정한 활발하게 증식하는 TPEC의 양. 각 경우에 처리군 2개에서 수득한 데이터를 나타낸다. EC 대조군 ("650 cGy No EC") 및 BMP4+ E4ORF1+ 인간 제대정맥 내피 세포 (HUVEC) ("650 cGy 500K AB245 세포") 처리군은 없다. 대조군과 처리군 간의 유의한 차이는 P 값으로 표시한다.
도 4. 이식 후 3주 경과시 총 흉선 세포 충실도 (total thymic cellularity). 치사 선량 (100 cGy)의 전신 조사 및 세포 이식 후 3주차 (3W) 총 흉선 세포 충실도. 구제 뮤라인 골수 (골수-단독)와 BMP4+ E4ORF1+ HUVEC (E4/BMP4)의 공동-주입은 non-BMP4 발현 모 세포인 E4ORF1+ HUVEC (E4)와 비교해 흉선 세포를 회복하는데 세포 수 측면에서 더 높은 효과를 제공하는 경향을 나타낸다. 군 간의 통계학적 유의성은 골수-단독 군을 다른 방사선 조사 군, 즉 인간 세포로 처리된 군과 비교할 경우 크루스칼 왈리스 일원식 ANOVA 및 Dunn의 다중 비교 검정으로 검정한다.
도 5. 흉선에서 도너 CD45+ 세포의 수. 도면에서 데이터에 대한 추가적인 설명은 실시예 5를 참조한다.
도 6A-B. 흉선에서 CD3+ 세포의 회복. 도면에서 데이터에 대한 추가적인 설명은 실시예 5를 참조한다.
도 7A-B. CD4 또는 CD8을 발현하는 T 림프구의 회복. 도면에서 데이터에 대한 추가적인 설명은 실시예 5를 참조한다.
도 8A-B. 전체 CD3+ 세포에 대한 CD4+ 및 CD8+ 세포의 상대적인 기여. 도면에서 데이터에 대한 추가적인 설명은 실시예 5를 참조한다.
도 9. T-림프구 성숙화 - 개략적인 도시. 도면에서 정보에 대한 추가적인 설명은 실시예 5를 참조한다.
도 10 A -B. 1000 cGY TBI 처리 후 3주차에 살아있는 CD3+ 도너 이중 양성 (DP) T-세포의 수 (도 10A) 및 % (도 10B). 도면에서 데이터에 대한 추가적인 설명은 실시예 5를 참조한다.
도 11 A -B. 1000 cGY TBI 처리 후 3주차에 살아있는 이중 음성 (DN) 도너 CD45+ 세포의 수 (도 11A) 및 % (도 11B). 도면에서 데이터에 대한 추가적인 설명은 실시예 5를 참조한다.
도 12 A -D. 회복 중인 흉선에서 DN 아집단 세포의 수. 도 12A - DN1 세포. 도 12B - DN2 세포. 도 12C - DN3 세포. 도 12D - DN4 세포. 도면에서 데이터에 대한 추가적인 설명은 실시예 5를 참조한다.
도 13 A -D. DN CD3 세포에서 DN 아집단의 분포. 도 13A - DN1 세포. 도 13B - DN2 세포. 도 13C - DN3 세포. 도 13D - DN4 세포. 도면에서 데이터에 대한 추가적인 설명은 실시예 5를 참조한다.
도 14. 1000 cGY TBI 처리 후 3주차에 살아있는 CD45 음성/ EpCam+ 세포의 수. 도면에서 데이터에 대한 추가적인 설명은 실시예 5를 참조한다.
도 15. EpCAM+/Sca1+ 세포의 회복. 도면에서 데이터에 대한 추가적인 설명은 실시예 5를 참조한다.
도 16. EpCAM+/Sca1+/α6+ 세포의 회복. 도면에서 데이터에 대한 추가적인 설명은 실시예 5를 참조한다.
도 17. EpCAM+ 피질 TEC (cTEC\)의 회복. 도면에서 데이터에 대한 추가적인 설명은 실시예 5를 참조한다.
도 18. 증식 중인 (Ki67+) cTEC의 회복. 도면에서 데이터에 대한 추가적인 설명은 실시예 5를 참조한다.
도 19. 수질 TEC (mTEC)의 회복. 도면에서 데이터에 대한 추가적인 설명은 실시예 5를 참조한다.
도 20. 중식 중인 mTEC의 회복. 도면에서 데이터에 대한 추가적인 설명은 실시예 5를 참조한다.
도 21. BMP4+ E4ORF1+ ntEC는 전신 방사선 조사 및 골수 이식 후 생존성을 강화한다. 생존율 (y축)은 지정된 처리군에서 일수 (x축)에 따른 도표로 작성된다. 전신 치사 선량의 방사선 조사 후 5주차의 동물 생존성을 도시한다. 동물에 구제 뮤라인 골수 (BM) 200,000 또는 500,000개를 단독으로 BMP4+ E4ORF1+ HUVEC와 함께 투여한다.
본원의 "발명의 내용", "도면", "도면의 간단한 설명", "실시예" 및 "청구 범위" 섹션은 본 발명의 주요 구현예들 중 일부를 기술한다. 이러한 "구체적인 내용" 섹션은 본 발명의 조성물 및 방법에 관한 일부 부가적인 설명을 제공하며, 이는 본원의 다른 모든 섹션과 연계하여 읽히는 것으로 의도된다. 아울러, 당해 기술 분야의 당업자들에게 명백한 바와 같이, 본 특허 명세서 전반에 걸쳐 기술된 여러가지 실시예들은 다양한 다른 방식으로 조합될 수 있으며, 그렇게 의도된다. 본원에 기술된 특정 실시예들의 이러한 조합은 본 발명의 범위에 속한다.
일부 정의들과 약어들이 아래에 제공된다. 그외 용어 또는 표현도 본원의 도처에서 정의되거나 또는 이것이 사용되는 문맥에서 자명한 의미를 가질 수 있다. 본원에서 달리 정의되지 않거나 또는 일부 다른 의미가 본원의 문맥에서의 사용으로부터 명확하지 않은 한, 모든 기술 용어 및 과학 용어들과 본원에 사용된 약어들은 본 발명과 관련있는 기술 분야의 당업자들이 통상적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다. 예를 들어, The Dictionary of Cell and Molecular Biology (5th ed. J.M. Lackie ed., 2013), the Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (2d ed. R. Cammack et al. eds., 2008), 및 The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology (2d ed. P-S. Juo, 2002)는 본원에 사용된 일부 용어들에 대한 일반적인 정의를 당업자에게 제공할 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형식 ("a," "an," 및 "the")은 문맥상 명확하게 그렇지 않은 것으로 기술되지 않은 한 복수의 언급을 포함한다. 용어 부정 관사 및 "하나 이상의" 및 "적어도 하나"와 같은 용어는 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
아울러, "및/또는"은 각 명시된 특징 또는 구성성분들 각각을 다른 것과 함께 또는 단독으로 구체적으로 기술하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, "A 및/또는 B"에서와 같은 표현에 사용되는 용어 "및/또는"은 A와 B, A 또는 B, A (단독) 및 B (단독)를 포괄하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"에서와 같은 표현에 사용되는 용어 "및/또는"은 A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 B; A 또는 C; B 또는 C; A 및 B; A 및 C; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독)을 포괄하는 것으로 의도된다.
단위, 접두사 및 기호는 국제 단위 (SI)에서 허가된 형태로 사용된다. 수치 범위는 범위를 한정하는 수치를 포함하며, 본원에 제공되는 임의의 개별 값은 본원에 제공된 다른 개별 수치를 포함하는 범위에 대한 엔드포인트로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 8, 9 및 10과 같은 수치 세트는 1-10의 수치 범위를 기술한 것이다.
구현예들이 "포함하는"이라는 표현을 사용해 기술된 경우, "로 구성되는" 및/또는 "로 필수적으로 구성되는"과 같은 용어로 기술된 다른 비슷한 구현예들도 포함한다.
본원에서, "약" 및 "대략"이라는 용어들은 수치 값에 대해 사용되는 경우 언급된 값에서 ± 10%를 의미한다.
본원에서, 용어 "동종이계"는 동일 종으로부터 유래되거나, 기원하거나 또는 속하는, 유전적으로 관련성이 있거나 또는 유전적으로 관련성은 없지만 유전자 측면에서 비슷한 구성원인 것을 의미한다. 동종이계 ntEC를 개체에 투여하는 것을 수반하는 구현예에서, 동종이계 세포는 세포를 투여받게 될 개체 (즉, 수용자)와 동일한 종의 도너로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 동종이계 세포는 세포를 투여받게 될 개체 (즉, 수용자)와 동일한 MHC/HLA 타입을 가진 도너로부터 수득하며, 즉, 세포 도너와 세포 수용자는 MHC-매칭되거나 또는 HLA-매칭된다. 일부 구현예에서, 세포 (예, ntEC)는 (a) 도너로부터 수득하고, (b) 유지 및/또는 배양 및/또는 증폭 및/또는 생체외 유전자 변형된 다음 (c) 도너와 동일한 종의 개체에 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, ntEC는 도너로부터 수득하여 BMP4+ 및/또는 E4ORF1+를 부여하도록 생체외 유전자 변형된 다음 도너와 동일한 종의 수용자 개체에 투여된다. 마찬가지로, 일부 구현예에서, ntEC를 도너로부터 수득하고, BMP4+ 및/또는 E4ORF1+를 부여하도록 생체외 유전자 조작된 다음 도너와 MHC/HLA 타입이 동일한 동일한 종의 수용자 개체에 투여된다.
본원에서, 용어 "자가"는 동일한 개체로부터 유래하거나 또는 기원하는 것을 의미한다. 개체에 자가 ntEC의 투여를 수반하는 구현예에서, 자가 ntEC는 ntEC를 투여받게 될 개체로부터 수득된다 (즉, ntEC의 도너와 수용자는 동일 개체이다). 일부 구현예에서, 세포 (예, ntEC)는 (a) 개체로부터 수득하고, (b) 유지 및/또는 배양 및/또는 증폭 및/또는 생체외 유전자 변형 후 (c)동일 개체에 투여된다. 예를 들어, 일부 이러한 구현예에서, ntEC는 개체로부터 수득하여 BMP4+ 및/또는 E4ORF1+를 부여하도록 생체외 유전자 변형한 다음 동일 개체에 투여된다.
본원에서, 약어 "BMP4"는 문맥에서의 사용으로부터 명확해지는 바와 같이 골 형태형성 단백질 4 또는 그 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
본원에서, 약어 "EC(들)"는 내피 세포(들)를 지칭한다. 본원에서, 약어 "ntEC(들)"는 비-흉선 내피 세포(들)를 지칭한다.
본원에서, 약어 "E4ORF1"은 문맥에서의 사용으로부터 명확해지는 바와 같이아데노바이러스 게놈의 초기 4 (E4) 영역의 오픈 리딩 프래임 (ORF), 또는 이 ORF에 의해 코딩되는 폴리펩타이드/단백질을 지칭한다.
본원에서, 용어 "배양"은 다양한 종류의 배지 상에서 또는 배지 중에서의 세포 증폭을 의미한다. "공-배양"은 다양한 종류의 배지 상에서 또는 배지 중에서 2종 이상의 상이한 유형의 세포를 증폭시키는 것을 의미한다.
본원에서, 용어 "유효량"은 예를 들어 치료 결과를 측정하기 위해 본 발명의 실시예 부분에 기술된 한가지 이상의 방법을 이용하여 분석되는 바와 같이, 언급된 치료 결과를 검출가능한 수준으로 달성하기에 충분한, ntEC의 양 또는 ntEC를 포함하는 치료학적 조성물의 양을 의미한다. 치료 결과는 아래에서 추가로 기술된다 ("치료" 정의 참조 - 다양한 매개변수/치료 결과들이 언급됨). 임의의 개별 사례에서 적절한 "유효량"은, 예를 들어 용량 증가 실험과 같이 당해 기술 분야에 공지된 표준 기법을 이용해 실험적으로 결정할 수 있으며, 계획된 투여 경로, 원하는 투여 빈도 등과 같은 인자들을 고려해 결정할 수 있다. 아울러, "유효량"은 본 명세서의 실시예 부분에 기술된 것과 같은 분석으로 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 유효량은 약 5 x 106 ntEC/개체 체중 kg이다. 일부 구현예에서, 유효량은 약 1 x 106 내지 약 50 x 106 ntEC/개체 체중 kg이다. 일부 구현예에서, 유효량은 약 5 x 106 내지 약 25 x 106 ntEC/개체 체중 kg이다. 일부 구현예에서, 유효량은 약 5 x 106 ntEC/개체 체중 kg이다. 일부 구현예에서, 유효량은 약 10 x 106 ntEC/개체 체중 kg이다. 일부 구현예에서, 유효량은 약 15 x 106 ntEC/개체 체중 kg이다. 일부 구현예에서, 유효량은 약 20 x 106 ntEC/개체 체중 kg이다. 일부 구현예에서, 유효량은 약 25 x 106 ntEC/개체 체중 kg이다. 일부 구현예에서, 유효량은 약 30 x 106 ntEC/개체 체중 kg이다. 일부 구현예에서, 유효량은 약 35 x 106 ntEC/개체 체중 kg이다. 일부 구현예에서, 유효량은 약 40 x 106 ntEC/개체 체중 kg이다. 일부 구현예에서, 유효량은 약 45 x 106 ntEC/개체 체중 kg이다. 일부 구현예에서, 유효량은 약 50 x 106 ntEC/개체 체중 kg이다.
용어 "조작된"은 비-흉선 내피 세포(ntEC)와 관련하여 사용되는 경우, 언급된 표현형 (예, E4ORF1 발현, BMP4 발현 또는 E4ORF1 및 BMP4 발현)을 달성하거나 또는 언급된 핵산 분자 또는 폴리펩타이드를 발현하도록 사람에 의해 조작된 ntEC 세포를 지칭한다. 용어 "조작된 세포"는 자연 생성 세포를 포함하는 것으로 의도하지 않지만, 대신 예를 들어, 재조합 핵산 분자를 포함하는 세포 또는 인위적으로(예를 들어, 유전자 변형에 의해) 변형된 세포를 포괄하는 것으로 의도되며, 예를 들어 따라서 세포가 발현하지 않을 폴리펩타이드를 발현하거나, 또는 비-조작된 내피 세포에서 관찰되는 수준보다 실질적으로 높은 수준으로 폴리펩타이드를 발현하게 된다 (예, BMP4를 과다 발현한다).
용어 "유전자 변형" 및/또는 "유전자 변형된" 및/또는 "유전자-변형된"은 세포의 게놈 또는 세포의 유전 물질의 내용물 또는 뉴클레오티드 서열에 대한 임의의 부가, 결손, 변형 또는 파괴를 의미한다. 일부 구현예에서, 본원에 언급된 내피 세포는, E4ORF1을 코딩하는 핵산 분자 및/또는 BMP4를 코딩하는 핵산 분자를 제공하도록 유전자 변형될 뿐 아니라, 또한 원하는 바에 따라 하나 이상의 다른 유전자 변형을 포함할 수도 있다. 용어 "유전자 변형" 및 이와 관련한 상기한 용어들은 일시적인 유전자 변형과 안정적인 유전자 변형을 모두 포괄하며, 비-제한적으로 형질도입 (핵산의 수용자로의 생체내 또는 시험관내 바이러스 매개 전달), 형질감염 (단리된 핵산의 세포로의 흡수), 리포좀 매개 전달 및 기타 당해 기술 분야에 잘 알려진 기타 유전자 전달 수단 등의 다양한 여러가지 유전자 전달 비히클 및 방법의 사용을 포괄한다.
본원에서, 용어 "단리된"은 통상적인 상태에서 이와 조합된 하나 이상의 다른 세포 집단, 산물, 화합물 또는 조성물로부터 분리된 세포의 집단을 지칭하거나, 및/또는 살아있는 개체의 신체에 있지 않은 세포 집단을 지칭한다.
본원에서, 용어 "재조합"은 분자생물학 및 유전자 조작 (예, 분자 클로닝) 방법을 사용하여 인간에 의해 (기계 사용을 포함함) 단리, 구축 및/또는 설계되고, 자연계에 존재하지 않거나 또는 자연계에 존재하지 않는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 자연 상태에서 조합되지 않는 뉴클레오티드 서열과 조합되어 제공되거나, 또는 자연계에서 일반적으로 조합된 뉴클레오티드 서열 없이 제공되는. 핵산 분자를 지칭한다. 따라서, 재조합 핵산 분자는 자연계에 존재하는 핵산 분자, 예를 들어, 유기체의 게놈에 있는 핵산 분자와는 구별되어야 한다. 예를 들어, 해당 게놈 DNA 서열에서 발견될 수 있는 임의적으로 개입된 (intervening) 인트론 서열이 없는, mRNA 서열의 "cDNA" 카피 또는 상보적인 DNA를 포함하는 핵산 분자는 재조합 핵산 분자로 간주될 것이다. 추가적인 예로, 재조합 E4ORF1 핵산 분자는 자연 생성된 아데노바이러스 게놈에서 통상적으로 조합되지 않은 프로모터 및/또는 다른 유전자 요소에 작동가능하게 연결된 E4ORF1 코딩 서열을 포함할 수도 있다.
용어 "개체"는 인간 등의 포유류 및 인간을 제외한 영장류 뿐만 아니라 토끼, 랫, 마우스, 고양이, 개, 말, 소 양, 염소, 돼지의 기타 포유류 종을 포괄한다. 일부 구현예에서, 개체는 포유류 개체이다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다. 일부 구현예에서, 개체는 인간을 제외한 영장류이다.
본원에서, 세포 집단과 관련하여 "실질적으로 순수한"이라는 표현은, 전체 세포 집단을 구성하는 세포들 중 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 더 바람직하게는 적어도 약 85%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%에서, (예, 하나 이상의 특정 세포 마커, 형태적 특징 또는 기능적 특징의 발현에 의해 결정되는 바와 같이) 특정 타입의 세포들로 된 집단을 의미한다. 즉, "실질적으로 순수한 세포 집단"은 특정 타입 또는 타입들이 아닌 세포를 약 50% 미만, 바람직하게는 약 25% 미만, 더 바람직하게는 약 15% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만으로 포함하는 세포 집단을 지칭한다.
본원에서, 흉선, 흉선 세포 또는 흉선에 영향을 미치는 상태와 관련하여, 용어 "치료하는" 및 "재생하는" (및 이의 문법상의 변형어)뿐 아니라 관련 방법 용어 (예, "치료 방법" 및 "재생 방법")는, 지정된 매개변수, 또는 살아있는 개체에 본 발명의 조작된 ntEC를 투여하는 경우에 증가 또는 가속화 (즉, 강화)되는 것으로 각각 입증된 다음과 같은 매개변수 (a) - (t) 중 하나 이상을 검출가능한 수준까지의 증가 또는 가속화를 의미하거나, 또는 증가 또는 가속화 (총체적으로 "강화")하는 방법을 의미한다: (a) 전체 흉선 세포의 증식 수 (CD45+ 흉선세포 및 CD45- 흉선 기질 세포, (b) 흉선 중량, (c) 자기-제한성 및/또는 자기-관용성 및/또는 면역적격 및/또는 나이브 T 세포의 결과, (d) 흉선 기능 (예, T 세포와 같은 림프구 세포에 대한 지원), (e) T 세포 선조 세포, 미성숙 T 세포 또는 성숙 T 세포의 증식 수, (f) CD45+ 세포의 증식 수, (g) CD3+ 세포의 증식 수, (h) CD3+ CD4+ 세포의 증식 수, (i) CD3+ CD8+ 세포의 증식 수, (j) CD3+ CD4+ CD8+ (이중 양성 또는 "DP" 세포)의 증식 수, (k) CD4- CD8- 세포 (이중-음성 "DN" 세포, 예를 들어 DN1, DN2, DN3 및/또는 DN4 세포)의 증식 수, (l) 흉선 기질 세포의 증식 수, (m) 흉선 상피 세포의 증식 수, (n) 흉선 CD45- EpCAM+ 세포의 증식 수, (o) 흉선 CD45- EpCAM+ Sca1+ 세포 (TEPC)의 증식 수, (p) 흉선 CD45- EpCAM+　 세포 (cTEC)의 증식 수, (q) 흉선 CD45- EpCAM+ Ki67+ (증식성 cTEC 세포)의 증식 수, (r) 흉선 CD45- EpCAM+　세포 (수질 흉선 상피 세포 (mTEC)의 증식 수, (s) 흉선 CD45- EpCAM+ Ki67+ (증식성 mTEC 세포)의 증식 수, 및 (t) 표 A (아래 참조)에 열거된 한가지 이상의 세포 타입의 증식 수.　 특정 구현예에서, 이들 매개변수/치료학적 결과들 중 한가지 이상이 영구적으로 또는 일시적으로 증가 또는 가속화 (총체적으로 "강화")된다면, 그 개체는 성공적으로 치료된 것이거나, 또는 흉선 또는 지정된 흉선 세포 타입 또는 타입들의 성공적인 "재생" 또는 "회복"이 달성된 것이다. 일부 구현예에서, 이러한 매개변수/치료 결과의 강화 (증가 또는 가속화)에 대한 검출 및/또는 강화에 대한 양적 확인/수준 측면에서의 확인은 적절한 베이스라인 또는 적절한 대조군과 비교해, 예를 들어 치료 방법을 개시하기 전 매개변수의 수준과 비교해 또는 방법을 수행하기 전 비슷한 대조군 개체에서의 매개변수의 수준과 비교해, 또는 ntEC의 부재 하에 (예를 들어, ntEC가 아닌 전달 비히클을 이용하여) 수행할 경우의 매개변수의 수준과 비교해, 또는 비-조작된 ntEC (예, BMP4를 발현하지 않는 ntEC 및/또는 E4ORF1을 발현하지 않는 ntEC)의 부재 하에 방법을 수행할 경우 매개변수의 수준과 비교해, 평가한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 매개변수/치료 결과에 대한 강화 (증가 또는 가속화) 정도는 임의의 검출가능한 양일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 매개변수/치료 결과에 대한 강화 (증가 또는 가속화) 정도는 통계학적으로 유의한 양일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 매개변수에 대한 강화 (증가 또는 가속화) 정도는 적절한 베이스라인 또는 적절한 대조군과 비교해 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 매개변수에 대한 강화 (증가 또는 가속화) 정도는, 매개변수/치료 결과가 개체에서 "정상적인" 수준, 즉 건강한 개체에서 예상되는 수준 또는 어떠한 질병이 없는 개체에서 예상되는 수준, 또는 화학요법, 방사선 요법, 이식 전 컨디셔닝 요법 또는 골수파괴성 컨디셔닝 요법으로 치료하기 전 또는 질병에 걸리기 전 개체가 가지는 수준인 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 매개변수에 대한 강화 (증가 또는 가속화) 정도는 매개변수가 "정상" 수준보다 더 높은 수준인 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 매개변수에 대한 강화 (증가 또는 가속화) 정도는 매개변수가 "정상" 수준의 약 50%, 또는 더 바람직하게는 약 60%, 또는 더 바람직하게는 약 70%, 또는 더 바람직하게는 약 80%, 또는 더 바람직하게는 약 90%인 것일 수 있다. 본 발명의 각 구현예에서, 흉선 재생을 강화하는 방법, 흉선 재생을 높이는 대응 방법 및 흉선 재생을 가속화하는 대응 방법 역시 고려됨에 유념하여야 한다. 마찬가지로, 본 발명의 각각의 구현예에서, 흉선 재생을 강화하는 방법, 전술한 구체적인 매개변수/치료 결과 (예, a-s 매개변수) 중 임의의 하나 이상을 강화하는 방법도 고려됨에 유념하여야 한다.
본원에서 용어 "흉선 세포"는, 비-제한적으로, 아래 표 A에 열거된 것 등의 본래 흉선의 일부를 구성하거나 또는 흉선에 위치하는 세포를 지칭한다. 흉선 세포의 일반적인 범위에, 적어도 일정 시간 동안, 예를 들어, 흉선 내부에서 발생하는 T 세포 성숙화 및 T 세포 교육 공정의 일부로서, 흉선 내부에 상주하는 흉선 기질 세포 및 조혈 기원의 세포 (예, T 세포 선조 세포, 미성숙 T 세포 및 성숙 T 세포) 둘다 포함된다. (상기에서 정의되는) 용어 "흉선 재생"은 흉선 기질 세포의 재생과 조혈 기원 세포의 재생을 모두 포괄하며, 용어 "T 세포 재구성"을 포괄한다. 흉선 재생 공정의 일부로서 발생하는 조혈 기원 세포에 대한 작용은 흉선 내부에 상주하는 조혈 기원 세포에 대한 분석을 기반으로 및/또는 순환계에서 이러한 세포를 분석함으로써 관찰할 수 있으며, 예를 들어, 본 발명의 조작된 ntEC를 투여한 후 흉선으로부터 T 세포 생산 강화는 순환계에서 이러한 세포를 분석함으로써 검출할 수 있다.
표 A
흉선 세포 세포 마커 프로파일 세포 타입
조혈 계통 세포 CD45+ T 세포 선조세포 및 T 세포 (성숙 및 미성숙 세포)
CD45+ CD3+ T 세포 (성숙)
CD45+ CD3+ CD4+ CD4+ T 세포 (성숙)
CD45+ CD3+ CD8+ CD8+ T 세포 (성숙)
CD45+ CD3+ CD4+ CD8+ 이중-양성 T 세포 (DP) (성숙)
CD45+ CD4- CD8- 이중-음성 T 세포 (DN) (미성숙)
CD45+ CD4- CD8- CD44+ CD25- 이중-음성 타입 1 세포 (DN1) (미성숙)
CD45+ CD4- CD8- CD44+ CD25+ 이중-음성 타입 2 세포 (DN2) (미성숙)
CD45+ CD4- CD8- CD44- CD25+ 이중-음성 타입 2 세포 (DN3) (미성숙)
CD45+ CD4- CD8- CD44- CD25- 이중-음성 타입 세포 (DN4) (미성숙)
상피 세포 CD45-EpCAM+ Sca1+ (α6+ 또는 α6-) 흉선 상피 선조 세포 (TEPC)
CD45-EpCAM+ Sca1+ (α6+ 또는 α6-) Ki67+ 증식성 흉선 상피 선조 세포 (TEPC)
CD45-EpCAM+ 흉선 상피 세포 (TEC)
CD45-EpCAM+ Ki67+ 증식성 흉선 상피 세포 (TEC)
CD45- EpCam+ K5+ K8+ 흉선 상피 선조 세포 (TEPC)
CD45-EpCAM+ MHCII+Ly51+UEA1lo 피질 흉선 상피 세포 (cTEC)
CD45-EpCAM+ Ki67+ MHCII+Ly51+UEA1lo 증식성 피질 흉선 상피 세포 (cTEC)
CD45-EpCAM+MHCII+Ly51loUEA1+ 수질 흉선 상피 세포 (mTEC)
CD45-EpCAM+ Ki67+ MHCII+Ly51loUEA1+ 증식성 수질 흉선 상피 세포 (mTEC)
핵산 분자 및 폴리펩타이드
본원에 기술된 본 발명에 대한 몇가지 구예들은 E4ORF1+, BMP4+, 및/또는E4ORF1+ BMP4+의 조작된 내피 세포 (ntEC), 즉, E4ORF1 폴리펩타이드, BMP4 폴리펩타이드, 또는 E4ORF1 폴리펩타이드와 BMP4 폴리펩타이드 둘다를 발현하는 세포를 수반한다. 이들 폴리펩타이드는 본원에서 총괄하여 "본 발명의 폴리펩타이드"로 지칭된다.
"본 발명의 폴리펩타이드"는 핵산 분자에 의해 코딩된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 아데노바이러스 E4ORF1 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자, BMP4 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자, 및/또는 아데노바이러스 E4ORF1 폴리펩타이드 및 BMP4 폴리펩타이드 둘다를 코딩하는 핵산 분자를 수반한다. 이러한 핵산 분자는 본원에서 총괄하여 "본 발명의 핵산 분자"로 지칭된다.
본 발명의 폴리펩타이드 및 본 발명의 핵산 분자는 본원에서 특정되거나 본 기술분야에 공지된 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있거나, 또는 이러한 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 변이체, 유도체, 돌연변이 또는 단편인 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있되, 이러한 변이체, 유도체, 돌연변이 또는 단편은 본원에 기술된 하나 이상의 기능적 특성(이에 한정되는 것은 아니나, ntEC에서 발현 및 흉선 및/또는 T 세포 재구성이 필요한 개체에 투여하였을 때 흉선 재생 및/또는 T 세포 재구성을 유도하는 능력)을 가진 폴리펩타이드를 포함하거나 또는 이를 코딩한다.
BMP4 폴리펩타이드를 수반하는 이러한 구현예들에서, BMP4 폴리펩타이드는 인간, 인간을 제외한 영장류, 토끼, 랫, 마우스, 염소 또는 돼지 BMP4 폴리펩타이드와 같은 임의의 포유류 BMP4 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 인간 BMP4 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 이러한 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, Genbank 데이터베이스와 같이 널리 공지된 공개 데이터베이스에서 이용가능하다. 예를 들어, 인간 BMP4에 대해 적합한 인간 아미노산 서열은 등재 번호 NP_001193.2 GI:157276593 NP_570911.2 GI:157276595, NP_570912.2 GI:157276597, NP_001334841.1 GI:1122781626, NP_001334842.1 GI:1122781519, NP_001334843.1 GI:1122780734, NP_001334844.1 GI:1122781552, NP_001334845.1 GI:1122780682 및 NP_001334846.1 GI:1122781077을 가진 서열을 포함한다. 본 발명의 실시예에서 기술된 실험에서, 사용된 인간 BMP4 폴리펩타이드는 하기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다: ATGATTCCTGGTAACCGAATGCTGATGGTCGTTTTATTATGCCAAGTCCTGCTAGGAGGCGCGAGCCATGCTAGTTTGATACCTGAGACGGGGAAGAAAAAAGTCGCCGAGATTCAGGGCCACGCGGGAGGACGCCGCTCAGGGCAGAGCCATGAGCTCCTGCGGGACTTCGAGGCGACACTTCTGCAGATGTTTGGGCTGCGCCGCCGCCCGCAGCCTAGCAAGAGTGCCGTCATTCCGGACTACATGCGGGATCTTTACCGGCTTCAGTCTGGGGAGGAGGAGGAAGAGCAGATCCACAGCACTGGTCTTGAGTATCCTGAGCGCCCGGCCAGCCGGGCCAACACCGTGAGGAGCTTCCACCACGAAGAACATCTGGAGAACATCCCAGGGACCAGTGAAAACTCTGCTTTTCGTTTCCTCTTTAACCTCAGCAGCATCCCTGAGAACGAGGTGATCTCCTCTGCAGAGCTTCGGCTCTTCCGGGAGCAGGTGGACCAGGGCCCTGATTGGGAAAGGGGCTTCCACCGTATAAACATTTATGAGGTTATGAAGCCCCCAGCAGAAGTGGTGCCTGGGCACCTCATCACACGACTACTGGACACGAGACTGGTCCACCACAATGTGACACGGTGGGAAACTTTTGATGTGAGCCCTGCGGTCCTTCGCTGGACCCGGGAGAAGCAGCCAAACTATGGGCTAGCCATTGAGGTGACTCACCTCCATCAGACTCGGACCCACCAGGGCCAGCATGTCAGGATTAGCCGATCGTTACCTCAAGGGAGTGGGAATTGGGCCCAGCTCCGGCCCCTCCTGGTCACCTTTGGCCATGATGGCCGGGGCCATGCCTTGACCCGACGCCGGAGGGCCAAGCGTAGCCCTAAGCATCACTCACAGCGGGCCAGGAAGAAGAATAAGAACTGCCGGCGCCACTCGCTCTATGTGGACTTCAGCGATGTGGGCTGGAATGACTGGATTGTGGCCCCACCAGGCTACCAGGCCTTCTACTGCCATGGGGACTGCCCCTTTCCACTGGCTGACCACCTCAACTCAACCAACCATGCCATTGTGCAGACCCTGGTCAATTCTGTCAATTCCAGTATCCCCAAAGCCTGTTGTGTGCCCACTGAACTGAGTGCCATCTCCATGCTGTACCTGGATGAGTATGATAAGGTGGTACTGAAAAATTATCAGGAGATGGTAGTAGAGGGATGTGGGTGCCGCTGA. (서열번호 1).
이 뉴클레오티드 서열은 다음과 같은 BMP4 아미노산을 코딩한다: MIPGNRMLMVVLLCQVLLGGASHASLIPETGKKKVAEIQGHAGGRRSGQSHELLRDFEATLLQMFGLRRRPQPSKSAVIPDYMRDLYRLQSGEEEEEQIHSTGLEYPERPASRANTVRSFHHEEHLENIPGTSENSAFRFLFNLSSIPENEVISSAELRLFREQVDQGPDWERGFHRINIYEVMKPPAEVVPGHLITRLLDTRLVHHNVTRWETFDVSPAVLRWTREKQPNYGLAIEVTHLHQTRTHQGQHVRISRSLPQGSGNWAQLRPLLVTFGHDGRGHALTRRRRAKRSPKHHSQRARKKNKNCRRHSLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYQAFYCHGDCPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSSIPKACCVPTELSAISMLYLDEYDKVVLKNYQEMVVEGCGCR (서열번호 2).
아데노바이러스 E4ORF1 폴리펩타이드를 수반하는 구현예들에서, 사용되는 폴리펩타이드 서열은 인간 아데노바이러스 타입 2, 3, 5, 7, 9, 11, 12, 14, 34, 35, 46, 50 또는 52와 같이 임의의 적절한 아데노바이러스 타입 또는 균주로부터 유래할 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 사용되는 폴리펩타이드 서열은 인간 아데노바이러스 타입 5로부터 유래한다. 이러한 아데노바이러스 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 이러한 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, Genbank 데이터베이스와 같이 잘 공지된 공개적으로 이용가능한 데이터베이스에서 입수가능하다. 예를 들어, 적절한 서열은 다음을 포함한다: 인간 아데노바이러스 9 (Genbank 등재 번호 CAI05991), 인간 아데노바이러스 7 (Genbank 등재 번호 AAR89977), 인간 아데노바이러스 46 (Genbank 등재 번호 AAX70946), 인간 아데노바이러스 52 (Genbank 등재 번호 ABK35065), 인간 아데노바이러스 34 (Genbank 등재 번호 AAW33508), 인간 아데노바이러스 14 (Genbank 등재 번호 AAW33146), 인간 아데노바이러스 50 (Genbank 등재 번호 AAW33554), 인간 아데노바이러스 2 (Genbank 등재 번호 AP.sub.--000196), 인간 아데노바이러스 12 (Genbank 등재 번호 AP.sub.--000141), 인간 아데노바이러스 35 (Genbank 등재 번호 AP.sub.--000607), 인간 아데노바이러스 7 (Genbank 등재 번호 AP.sub.--000570), 인간 아데노바이러스 1 (Genbank 등재 번호 AP.sub.--000533), 인간 아데노바이러스 11 (Genbank 등재 번호 AP.sub.--000474), 인간 아데노바이러스 3 (Genbank 등재 번호 ABB 17792), 및 인간 아데노바이러스 타입 5 (Genbank 등재 번호 D12587).
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 및 핵산 분자는 본원에 구체적으로 언급되거나 또는 당해 기술 분야에 공지된 것 (예를 들어, Genbank 데이터베이스와 같은 공개 서열 데이터베이스)과 동일한 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 및 핵산 분자는 이러한 서열의 변이체, 유도체, 돌연변이, 또는 단편, 예를 들어, 이러한 서열과 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 변이체, 유도체, 돌연변이 또는 단편인 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체, 유도체, 돌연변이 또는 단편은 공지된 서열에 대해 85%, 또는 약 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가진다. 일부 구현예에서, 공지된 뉴클레오타이드 서열에 대한 변이체, 유도체, 돌연변이 또는 단편은 공지된 뉴클레오타이드에 대해 뉴클레오티드 약 50개, 또는 약 45개, 또는 약 40개, 또는 약 35개, 또는 약 30개, 또는 약 28개, 26개, 24개, 22개, 20개, 18개, 16개, 14개, 12개, 10개, 9개, 8개, 7, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 뉴클레오타이드 길이 차이를 가진다. 일부 구현예에서, 공지된 아미노산 서열에 대한 변이체, 유도체, 돌연변이 또는 단편은 공지된 아미노산에 대해 약 50개, 또는 약 45개, 또는 약 40개, 또는 약 35개, 또는 약 30개, 또는 약 28개, 26개, 24개, 22개, 20개, 18개 16개, 14개, 12개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 가진다.
E4ORF1 핵산 또는 아미노산 서열이 사용되는 구현예의 경우, 일부 구현예에서, 이들 서열은 아데노바이러스 E4ORF1 영역으로부터 유래되는 다른 서열 없이, 예를 들어, 전체 E4ORF1 영역의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형태가 아니거나 또는 E4ORF1 영역에 의해 코딩되는 다른 폴리펩타이드와 함께 사용되지 않는다. 그러나, 일부 다른 구현예에서는, 이들 서열은 E4ORF2, E4ORF3, E4ORF4 또는 E4ORF5 서열, 또는 이들의 변이체, 돌연변이 또는 단편 등의, E4ORF1 영역으로부터 유래되는 하나 이상의 다른 핵산 또는 아미노산 서열과 함께 사용될 수도 있다. 예를 들어, E4ORF1 서열은 다른 서열, 유전자 또는 코딩 영역 (예, 프로모터, 마커 유전자, 항생제 내성 유전자 등)을 포함하는 구조체 (예, 바이러스 벡터) 형태로 사용될 수 있지만, 특정 구현예에서, E4ORF1 전체 영역을 포함하지 않거나 또는 E4ORF1 전체 영역으로부터 유래되는 다른 ORF, 예를 들어, E4ORF2, E4ORF3, E4ORF4 및/또는 E4ORF5를 포함하지 않는 구조체 형태로 E4ORF1 서열이 사용된다.
본 발명의 핵산 분자는 원하는 용도에 따라 다양한 다른 핵산 서열, 유전자 또는 코딩 영역, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 항생제 내성 유전자, 리포터 유전자 또는 발현 태그 (예, GFP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열) 또는 바람직할 수 있는 임의의 기타 뉴클레오티드 서열 또는 유전자를 포함하는 구조체 또는 벡터에 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 단독으로 또는 융합 단백질의 일부로서 발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 발현을 허용하기 위한 하나 이상의 프로모터의 통제 하에 배치될 수 있다. 원하는 세포 타입에서 핵산 서열의 발현을 구동시킬 수 있는 임의의 프로모터가 사용될 수 있다. 적합한 프로모터의 예로는, 비-제한적으로, CMV, SV40, RSV, HIV-Ltr 및 MML 프로모터 등이 있다. 또한, 프로모터는 아데노바이러스 게놈 유래 프로모터 또는 이의 변이체일 수 있다. 예를 들어, E4ORF1이 사용되는 경우, 프로모터는 아데노바이러스에서 천연적으로 E4ORF1의 발현을 구동하는 프로모터일 수 있다. 그러나, E4ORF1가 사용되는 다른 구현예들에서, 프로모터는 아데노바이러스 게놈에서 천연적으로 E4ORF1의 발현을 구동하는 것이 아니다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 유도성 프로모터의 통제 하에 배치되어, 핵산 서열의 발현을 필요에 따라 진행하거나 (turn on) 또는 중단 (turn off) 할 수 있다. 임의의 적절한 유도성 발현 시스템이, 예를 들어, 테트라사이클린 유도성 발현 시스템 또는 호르몬 유도성 발현 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산 분자는 이것이 필요한 동안에는 발현되고, 원하는 결과가 달성되었을 때, 예를 들어 내피 세포의 충분한 생장 또는 증식이 이루어졌을 때에는, 중단할 수 있다. 발현을 진행 또는 중단하는 능력은 생체내 이용시 특히 유용할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드, 합성 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는, 세포내에서 안정적인 변형된 합성 RNA와 같은 RNA를 포함하며, 이를 이용해 세포내에서 직접 단백질의 발현/생산을 지시할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 DNA를 포함할 수 있다. DNA가 사용되는 구현예에서, DNA 서열은 세포내에서 발현을 허용 (및/또는 촉진, 강화 또는 규제)하기 위해 하나 이상의 적절한 프로모터 및/또는 조절 인자와 작동가능하게 연결될 수 있으며, 하나 이상의 적절한 벡터 또는 구조체 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 동일한 핵산 구조체 형태로 내피 세포에 도입되거나, 또는 개별 핵산 구조체로 도입될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는, 비-제한적으로, 형질감염 기법 및 바이러스-매개 형질도입 기법 등의 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적절한 시스템을 이용해 내피 세포에 도입할 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 형질감염 방법으로는, 비-제한적으로, 리포좀-매개 형질감염, 폴리브렌-매개 형질감염, DEAE 덱스트란-매개 형질감염, 전기천공법, 인산칼슘 석출법, 미세주입법 및 미세입자 총 (micro-particle bombardment) 등이 있다. 사용될 수 있는 바이러스-매개 형질도입 방법으로는, 비-제한적으로, 렌티바이러스-매개 형질도입, 아데노바이러스-매개 형질도입, 레트로바이러스-매개 형질도입, 아데노-부속 바이러스-매개 형질도입 및 헤르페스 바이러스-매개 형질도입 등이 있다.
또한, 본 발명은, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터 등의 벡터를 제공한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명은 BMP4 및/또는 E4ORF1 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 이러한 일부 구현예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 이러한 구현예에서, 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, BMP4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 E4ORF1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 동일한 구조체 또는 벡터에 제공되며, 개별 프로모터들의 통제 하에 배치되거나 또는 개별 프로모터의 통제 하에 예를 들어 BMP4와 E40RF1 서열 사이에 내부 리보좀 도입 부위 서열 (IRES)과 함께 배치될 수 있다.
일부 구현예에서, 펩타이드 모방체가 사용될 수 있다. 펩타이드 모방체는 폴리펩타이드를 모방하도록 설계된 소형 단백질-유사 체인이다. 이 분자는 본 발명의 임의의 폴리펩타이드 (예, BMP4 또는 E4ORF1 폴리펩타이드)를 모방하도록 설계될 수 있다. 펩타이드 모방체를 구축하기 위해 펩타이드 변형하거나 또는 펩타이드 모방체를 설계하는 다양한 여러가지 방법들은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 이를 이용해 본 발명의 폴리펩타이드들 중 하나에 대한 펩타이드 모방체를 제조할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 및 핵산 분자의 취급, 조작 및 발현은 분자 생물학 및 세포 생물학의 통례적인 기법들을 이용해 수행할 수 있다. 이러한 기법들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 일 예로 Sambrook, Fritsch and Maniatis eds., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1989); the series Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.)의 교시 내용, 또는 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열의 취급, 조작 및 발현에 사용하기에 적합한 기법 안내에 대한 임의의 다른 표준 문서의 교시 내용을 참조할 수 있다. E4ORF1 서열의 취급 또는 발현과 관련된 부가적인 측면들은 미국 특허 8,465,732에 언급되어 있으며, 이들 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
내피 세포
본원에 기술된 비-흉선 내피 세포 (ntEC)는 당해 기술 분야에 공지된 혈관 내피 세포의 임의의 적절한 비-흉선 소스로부터 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, ntEC는 흉선 내피 세포에 특이적인 하나 이상의 마커 (또는 마커 프로파일)를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 내피 세포는 1차 내피 세포이다. 일부 구현예에서, 내피 세포는 포유류 세포, 예를 들어 인간 또는 인간을 제외한 영장류 세포, 또는 토끼, 랫, 마우스, 염소, 돼지 또는 기타 포유류 세포이다. 일부 구현예에서, 내피 세포는 일차 인간 내피 세포이다. 일부 구현예에서, 내피 세포는 제대정맥 내피 세포 (UVEC), 예를 들어 인간 제대정맥 내피 세포 (HUVEC)이다. 일부 구현예에서, 내피 세포는 지방세포 EC이다. 일부 구현예에서, 내피 세포는 피부 EC이다. 일부 구현예에서, 내피 세포는 심장 EC이다. 일부 구현예에서, 내피 세포는 신장 EC이다. 일부 구현예에서, 내피 세포는 폐 EC이다. 일부 구현예에서, 내피 세포는 간 EC이다. 일부 구현예에서, 내피 세포는 골수 EC이다. 사용될 수 있는 또 다른 적절한 내피 세포로는 미국 특허 8,465,732에서 E4ORF1-발현에 적합한 것으로 기존에 개시된 것이 있으며, 상기 특허의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 구현예에서, 내피 세포는 특정 언급된 분자 (예, BMP4 및/또는 E4ORF1)의 발현과 더불어 이와는 별개로 하나 이상의 유전자 변형을 포함하도록 유전자-변형된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 내피 세포는 또한 ETV2를 발현하도록 조작될 수 있다. 실제, ntEC가 BMP4 및/또는 E4ORF1을 발현하는 본원 전체에 기술된 각각의 구현예에서, ntEC는 또한 ETV2를 발현할 수 있다. 아울러, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 ntEC는 내피 세포에 영향을 미치는 질환 또는 장애에 관여하는 것으로 알려지거나 또는 관여하는 것으로 의심되는 유전자의 수정된 버전, 또는 내피 세포에 제공되거나 또는 조작된 내피 세포를 이용해 투여 또는 전달하는 것이 바람직할 수 있는, 치료학적으로 유용한 유전자와 같은 임의의 다른 유전자를 포함할 수 있다.
세포 집단 & 조성물
본 발명의 내피 세포는 내피 세포 집단 또는 내피 세포 집단을 포함하는 조성물로 존재하거나 또는 이러한 형태로 제공될 수 있다.
예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명은 조작된 BMP4+E4ORF1+ 비-흉선 내피 세포 (ntEC)의 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 조작된 ntEC 집단은 시험관내 또는 생체외이다. 일부 구현예에서, 이러한 조작된 ntEC 집단은 생체내이다. 일부 구현예에서, 이러한 조작된 ntEC 집단은 단리된 집단이다. 일부 구현예에서, 이러한 집단은 실질적으로 순수한 ntEC 세포 집단이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 전체 세포 집단을 구성하는 세포의 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 더 바람직하게는 적어도 약 85%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%는 본 발명의 조작된 ntEC일 것이다. 일부 구현예에서, 조작된 ntEC 집단에서 ntEC는 제대정맥 내피 세포 (UVEC), 지방세포 내피 세포, 피부 내피 세포, 폐 내피 세포, 심장 내피 세포, 신장 내피 세포 또는 골수 내피 세포이다. 일부 구현예에서, ntEC는 인간 제대정맥 내피 세포 (HUVEC)이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 전술한 또는 본원의 도처에 기술된 ntEC 집단을 포함하는 다양한 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 집단은 생리 식염수, 세포 현탁 매질, 세포 배양 배지 등과 같은 담체 용액을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물은 본원에 기술된 ntEC 집단과 생리식염수와 같이 개체에 투여하기 적합한 용액을 포함하는 치료학적 조성물이다. 그외 치료학적으로 허용가능한 물질이 필요에 따라 포함될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면 의도한 용도에 따라 치료학적 조성물에 포함될 적절한 물질을 쉽게 선택할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물 및 치료학적 조성물은 본원에 기술된 ntEC 집단 및 생체적합한 매트릭스 물질 (예, 실온 또는 체온에서 액체 또는 고체인 생체적합한 매트릭스 물질)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 조성물은 부가적인 세포 타입, 예를 들어, ntEC의 존재 하에 (예를 들어, "피더" 세포로서 ntEC를 이용해) 유지, 배양 또는 증폭시킬 수 있거나 또는 ntEC와 함께 개체에 투여할 수 있는 부가적인 세포 타입을 포함할 수 있다. 이러한 부가적인 세포 유형에 대한 예로는, 비-제한적으로, 줄기 세포 또는 선조 세포, 예를 들어 흉선 줄기 세포 또는 선조 세포, 조혈 세포, 조혈 줄기 세포 (HSC), 조혈 선조 세포 (HPC) 및 조혈 줄기 및 선조 세포 (HSPC)를 포함한다. 본 발명의 내피 세포와 함께 제공되거나 또는 이용할 수 있는 세포에 대한 다른 예들은 미국 특허 8,465,732에 기술되어 있으며, 그 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
치료 방법 및 기타 활용
일부 구현예에서, 본 발명은 다양한 치료학적 방법, 예를 들어 본 발명의 조작된 ntEC (또는 이러한 조작된 ntEC를 포함하는 조성물)를 유효량으로 개체에 투여함으로써 필요한 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명은 흉선 재생이 필요한 개체에 조작된 비-흉선 내피 세포 (ntEC)를 포함하는 치료학적 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함하며, 이러한 조작된 ntEC가 E4ORF1+ 또는 BMP4+E4ORF1+이고, 이로써 개체에서 흉선 재생이 강화되는, 흉선 재생을 강화하는 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 골수파괴성 컨디셔닝을 시술받은 개체에 조작된 비-흉선 내피 세포 (ntEC)를 포함하는 치료학적 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함하고, 조작된 ntEC가 BMP4+E4ORF1+인, 개체에서 골수파괴성 컨디셔닝 시술 후 생존성을 높이는 방법을 제공한다. 마찬가지로, 다른 구현예에서, 본 발명은 조작된 비-흉선 내피 세포 (ntEC)를 포함하는 치료학적 조성물을 유효량으로 골수파괴성 컨디셔닝 및 후속적인 조혈 세포 이식 (HCT)(예, 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)) 시술된 개체에 투여하는 것을 포함하며, 조작된 ntEC가 BMP4+E4ORF1+인, 골수파괴성 컨디셔닝 처리 및 후속적인 조혈 세포 이식 (HCT) (예, 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)) 후 생존성을 높이는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 생존성은 조작된 ntEC 비-시술 및 동일한 골수파괴성 컨디셔닝 (및/또는 HCT) 시술 개체에서와 비교해 높아진다.
ntEC 또는 ntEC를 포함하는 조성물의 적절한 유효량을 선택하는 수단은 상기에 기술되어 있다.
조작된 비-흉선 내피 세포 (ntEC)는 개체에 1회 (단일 투여) 또는 여러번 (다회 투여), 예를 들어, 2회, 3회 또는 4회 투여로 개체에 투여할 수 있다. 다회 투여가 채택되는 경우, 투여 일정은 임의의 적절한 일정일 수 있다. 일부 구현예에서, 다회 투여는 1일 간격, 2일 간격, 3일 간격, 4일 간격 또는 5일 간격이다. 예를 들어, 일 구현예에서, ntEC는 0일, 3일 및 5일에 투여된다. ntEC를 개체에 1차 투여하기 적절한 시기 (즉, 0일)는 개체의 구체적인 상황에 기초하여 의사가 선택할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 개체에 조혈 세포 이식 (HCT)을 제공하기 위한 준비로서 골수파괴성 컨디셔닝 처리와 함께 시술된다면, ntEC는 개체에 HCT를 투여한 (0일) 동일 일자에 개체에 1차 투여되거나, 또는 이후 다른 일자, 예를 들어 HCT 후 3일 및 5일에 다시 개체에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, ntEC의 유효량은 개체에 1회, 단일 투여로 투여된다. 일부 구현예에서, ntEC의 유효량은 개체에 여러 번, 즉 다중 투여로 투여되며, ntEC의 각 유효량이 개체에 전달된다. 일부 구현예에서, ntEC의 유효량은 다중 투여로 분할되며, 예를 들어 유효량의 1/2은 1차 투여시 임의 일자에, 나머지 1/2은 제2 투여시 다른 일자에 투여된다. 적절할 경우 이들 투여 일정의 여러가지 변형이 채택될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면 구체적인 상황에 따라 적절한 투여 일정을 선택할 수 있을 것이다.
일부 구현예에서, 흉선 재생은 CD45- 흉선 기질 세포 및 CD45+ T 세포로부터 하나 이상의 세포 타입의 회복을 포함한다. CD45- 흉선 기질 세포는, 비-제한적으로, 흉선 상피 선조세포 (TEPC), 피질 흉선 상피 세포 (cTEC) 및 수질 흉선 상피 세포 (mTEC)를 포함한다. CD45+ T 세포로는, 비-제한적으로, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 이중-양성 T 세포 (DP), 이중-음성 T 세포 (DN), 이중-음성 타입 1 (DN1) T 세포, 이중-음성 타입 2 (DN2) T 세포, 이중-음성 타입 3 (DN3) T 세포 및 이중-음성 타입 4 (DN4) T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 흉선 재생은 CD45- 흉선 기질 세포 및 CD45+ T 세포 둘다의 회복을 포함한다. 일부 구현예에서, 흉선 재생은 흉선 상피 선조세포 (TEPC), 피질 흉선 상피 세포 (cTEC) 및 수질 흉선 상피 세포 (mTEC)의 회복을 포함한다. 일부 구현예에서, 흉선 재생은 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 이중-양성 T 세포 (DP), 이중-음성 T 세포 (DN), 이중-음성 타입 1 (DN1) T 세포, 이중-음성 타입 2 (DN2) T 세포, 및 이중-음성 타입 4 (DN4) T 세포의 회복을 포함한다. 일부 구현예에서, 흉선 재생은 흉선 상피 선조세포 (TEPC), 피질 흉선 상피 세포 (cTEC), 및 수질 흉선 상피 세포 (mTEC), CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 이중-양성 T 세포 (DP), 이중-음성 T 세포 (DN), 이중-음성 타입 1 (DN1) T 세포, 이중-음성 타입 2 (DN2) T 세포, 및 이중-음성 타입 4 (DN4) T 세포의 재생을 포함한다.
일부 구현예에서, ntEC는 제대정맥 내피 세포 (UVEC), 지방세포 내피 세포, 피부 내피 세포, 폐 내피 세포, 심장 내피 세포, 신장 내피 세포 및 골수 내피 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구현예들 중 일부에서, 개체는 인간이다. 구현예들 중 일부에서, ntEC는 인간 제대정맥 내피 세포 (HUVEC)이다. 구현예들 중 일부에서, ntEC는 인간 골수 내피 세포이다. 구현예들 중 일부에서, ntEC는 인간 지방세포 내피 세포이다. 구현예들 중 일부에서, ntEC는 인간 피부 내피 세포이다.
일부 구현예에서, ntEC는 개체에 대해 자가이다. 일부 구현예에서, ntEC는 개체에 대해 동종이계이다. 일부 구현예에서, ntEC는 개체에 대해 MHC/HLA-일치한다.
일부 구현예에서, 개체는 화학요법, 방사선 요법, 이식 전 컨디셔닝 용법 또는 골수파괴성 컨디셔닝 용법으로 이미 시술받은 적 있는 개체이다. 골수파괴성 컨디셔닝 용법에 대한 예로는, 비-제한적으로, 개체에 방사선 조사 (예, 전신 방사선 조사) 및/또는 개체에 에토포시드 (etoposide) 및/또는 부설판 (busulfan)의 투여를 수반하는 용법을 포함한다.
일부 구현예에서, 개체는 조혈 세포 이식 (HCT), 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 또는 조혈 줄기 세포 및/또는 선조 세포 이식 (HSPCT)으로 시술받은 적 있는 개체이다.
일부 구현예에서, 개체는 면역결핍된 개체이다. 일부 구현예에서, 개체는 HIV 감염된 개체이다. 일부 구현예에서, 개체는 흉선 조직 무게, 흉선 기능 또는 T 세포 집단에 노화-관련 결핍성을 가진 개체이다.
일부 구현예에서, 방법은 조혈 세포 이식 (HCT) (예, 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 또는 조혈 줄기 및/또는 선조 세포 이식 (HSPCT)) 절차를 수행하는 맥락에서 조혈 세포 또는 조혈 줄기 세포 (HSC) 또는 조혈 줄기 세포 및 선조 세포 (HSPC)를 포함하는 치료학적 조성물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 구현예들 중 일부에서, 조작된 ntEC는 IV 주입에 의해 개체에 투여된다. 구현예들 중 일부에서, 조작된 ntEC 및 조혈 세포 (예, HSC)는 동시에 투여된다. 구현예들 중 일부에서, 조작된 ntEC 및 조혈 (예, HSC)는 개체에 동일한 주입 형태로 투여된다. 구현예들 중 일부에서, 조작된 ntEC는 수일 또는 수주의 코스 동안 다중 IV 주입으로서 개체에 투여된다.
본원에 제공된 치료 방법에 대한 일부 구현예에서, BMP4 단백질을 개체에 투여한다. 예를 들어, 일부 이러한 구현예에서, BMP4 단백질은 개체에 E4ORF1+ 또는 BMP4+E4ORF1+ ntEC를 함유한 조성물을 투여하기 전에 조성물에 첨가된다. 일부 구현예에서, BMP4 단백질을 포함하는 개별 조성물을 치료 방법의 일부로서 개체에 투여한다. 치료 방법에 대한 일부 구현예에서, BMP4를 개체에 투여하지 않는다.
일부 구현예에서, 흉선 내피 세포를 또한 개체에 투여한다 (즉, 비-흉선 EC (ntEC) 및 흉선 EC 둘다 투여한다). 일부 구현예에서, 흉선 내피 세포는 개체에 투여되지 않는다.
본원에 제공된 치료 방법에서, ntEC 또는 ntEC-함유 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 적절한 임의 수단을 이용하여, 예를 들어 주사 (예, 정맥내 (IV) 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 국소 주사)에 의해, 주입 (예, IV 주입, 피하 주입, 국소 주입)에 의해 또는 외과적 이식에 의해 개체에 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, ntEC 또는 ntEC-함유 조성물은 IV 주입에 의해 개체에 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 ntEC는 흉선에 직접 또는 흉선 주변으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 ntEC는 흉선내 주사 또는 흉선내 주입에 의해 개체에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 ntEC는 하갑상선 동맥으로 주사 또는 주입에 의해 개체에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 ntEC는 내흉동맥으로 주사 또는 주입에 의해 개체에 투여될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면 구체적인 상황에 따라 적절한 투여 경로를 선택할 수 있을 것이다.
일부 구현예에서, 흉선은 조작된 ntEC가 흉선에 기계적, 자기, 초음파 또는 기타 자극 방법을 통해 복귀되도록 더 허용적이게 만들 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 ntEC는 생체내 구축될 수 있으며, 예를 들어 치료학적 용도 또는 연구 목적으로 구축될 수 있다. 예를 들어, 일부 측면들에서, 본 발명은 개체에서 비-흉선 내피 세포가 핵산 분자로 형질감염 또는 형질전이되어 생체내 조작된 ntEC가 되도록, 개체에 BMP4를 코딩하는 핵산 분자 및/또는 E4ORF1을 코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, 적합한 벡터에, 및/또는 적절한 프로모터의 통제 하에)를 투여하는 것을 포함하는, 필요한 개체를 치료하는 방법과 같은, 다양한 치료학적 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 뉴클레오티드 분자는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적절한 수단을 이용해 개체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 분자 (예를 들어, 적절한 벡터에서)는 주사 또는 주입에 의해 원하는 위치에서 조직 또는 혈류에 투여될 수 있다. 핵산 분자는 1회 투여 또는 다중 투여로 투여될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면 원하는 용도에 따라 적절한 투약 용법과 적절한 투여 방법을 선택할 수 있을 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 ntEC는 사용 (예, 치료학적 사용)하기 전 이를 복제할 수 없도록 유사 분열 비활성화된다. 이는, 예를 들어, 미토마이신 C와 같은 화학제를 이용하거나 또는 조작된 내피 세포에 방사선 조사함으로써 달성할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 치료 방법은 개체에 ntEC 투여하기 전에 ntEC를 E4ORF1을 코딩하는 핵산 분자 및 선택적으로 BMP4를 코딩하는 핵산 분자로 형질전이 또는 형질감염함으로써 유전자 변형하는 초기 단계를 더 포함한다.
본원에 기술된 다양한 치료 방법들 중 임의 방법은 흉선 재생 (T 세포 재구성 자극 등)을 강화하거나 및/또는 상기 "치료" 정의 부분에 열거된 하나 이상의 매개변수 또는 치료 결과를 달성하기 위해 이용될 수 있다.
세포 배양 방법
세포 배양 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 임의의 적절한 세포 배양 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조작된 ntEC는, 예를 들어 미국 특허 8,465,732호에 기술된 바와 같이, 다른 내피 세포를 배양하는데 유용한 것으로 공지된 방법 또는 E4ORF1-발현 내피 세포를 배양하는데 유용한 것으로 공지된 방법을 이용해 배양될 수 있으며, 상기 미국 특허 문헌의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 내피 세포는 무혈청성 또는 외인성 성장인자의 부재 조건에서, 또는 혈청과 외인성 성장인자의 부재 조건에서 배양될 수 있다. 또한, 본 발명의 조작된 내피 세포는 냉동보존 (cryopreserved)될 수 있다. 세포 배양 및 세포 냉동보존에 대한 다양한 방법들이 Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition (2000) by R. Ian Freshney ("Freshney")에 기술된 방법과 같이 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
키트
본 발명은 또한 본 발명의 조작된 내피 세포를 생산하기 위한 및/또는 본원에 기술된 다양한 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 본원에 기술된 임의의 성분을 함유할 수 있으며, 비-제한적으로, 뉴클레오타이드 서열 (예를 들어, 벡터 내의), ntEC, 조작된 ntEC 집단, 대조군 비-조작된 ntEC, 샘플/표준물질 조작된 ntEC, 조작된 ntEC 또는 그 안에서 발현된 단백질 또는 핵산 분자를 검출하기 위한 수단 또는 조성물 (예, 핵산 프로브, 항체 등), 조작된 ntEC를 유지 또는 증폭시키는데 이용가능한 매질 또는 조성물, 조작된 ntEC에 의해 컨디셔닝화된 매질, 조작된 내피 세포를 개체에 투여하기 위한 수단 또는 조성물, 또는 이들의 임의 조합 등의, 본원에 기술된 임의의 구성성분을 함유할 수 있다. 이러한 모든 키트는 사용 설명서, 용기, 배양 용기 등을 포함할 수 있다. 라벨은 키트에 동봉될 수 있으며, 키트 내용물의 사용 설명 또는 기타 사용 정보를 제공해주는, 전자 또는 컴퓨터 판독가능한 형태 (예, 디스크, 광학 디스크, 메모리 칩 또는 테이프)일 수 있는 임의의 기술 또는 기록 매체 (recorded material)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 측면들은 아래 비-제한적인 실시예에서 추가로 설명될 수 있다.
실시예
실시예 1
조작된 비-흉선 내피 세포의 구축
비-흉선 내피 세포의 단리
비-흉선 내피 세포 (ntEC)는 탯줄 / 제대정맥, 지방세포 조직, 피부, 폐, 심장, 신장 또는 골수와 같은 원하는 조직 또는 임의의 다른 원하는 비-흉선 조직 소스로부터 단리된다. 내피 세포는 확립된 표준 프로토콜을 이용해 원하는 조직으로부터 단리된다. 탯줄에서 ntEC를 단리하는 예시적인 프로토콜은 아래에 제공된다. 다른 조직 소스로부터 내피 세포를 분리하는 비슷한 프로토콜들이 공지되어 있으며, 이용할 수 있다.
하기 내용은 임의의 원하는 종의 탯줄로부터 ntEC를 단리하는 예시적인 프로토콜이다. 이 프로토콜은 제대정맥 내피 세포 또는 "UVEC"의 집단을 구축하며, 인간 제대정맥으로부터 유래되는 경우, "HUVEC"로 지칭된다. 모든 단계들은 무균 기법 및 무균 물질을 사용해 수행된다.
탯줄은 내피 세포 단리하기 위한 처리시까지 2-8℃에서 둔다. UVEC는 콜라게나제로 효소 분해함으로써 탯줄의 제대정맥으로부터 단리된다. 예를 들어, 제대정맥은 생리 식염수 또는 살아있는 세포에 적합한 기타 용액 (예, 배양 배지)로 플러싱한 다음 생리 식염수 또는 살아있는 세포에 적합한 기타 용액 (예, 배양 배지) 중의 0.2% (w/v) 콜라게나제 용액을 충진하고 양 말단을 클림핑할 수 있다. 탯줄은 제대정맥으로부터 내피 세포를 해리시킬 수 있는 충분한 시간 동안 (예, 실온에서 약 30분) 적정 온도 (예, 실온 20-25℃)에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 시간은 인큐베이션이 이루어지는 온도에 따라 조직의 구체적인 특성에 따라 달라질 수 있다. 탈착된 세포는 정맥 외부로 씻어내고, 코니컬 튜브와 같은 적정 용기에 보관한다. 제대정맥은 생리식염수 또는 살아있는 세포에 적합한 기타 용액 (예, 배양 배지)로 다시 헹구고, 세척액을 또한 예를 들어 동일한 용기에 보관할 수 있다. 용기의 내용물을 원심분리하고, 상층액을 뽑아낸다. UVEC를 포함하는 세포 펠릿은 EC 배양 배지에 조심스럽게 재현탁한다. 사용될 수 있는 예시적인 배양 배지는 10% 소 태아 혈청, 20 ng/mL FGF-2, 10 U/mL 헤파린, 5 ㎍/mL 젠타미신, 10mM HEPES 및 1X 글루타맥스가 첨가된 M199 베이스 배지를 포함하는 EC 배양 배지이다. EC 배양 배지내 UVEC는 적절한 조직 배양 용기로 옮겨, 인큐베이터에 넣어 37 씨, 5% CO2에 둠으로써 시험관내 배양 공정을 개시한다. 당해 기술 분야의 당업자라면 UVEC 단리를 달성하기 위해 이러한 프로토콜에 변형을 행해질 수 있음을 알 것이다. 당해 기술 분야의 당업자라면 또한 다른 조직 소스로부터 ntEC를 단리하기 위해 이러한 프로토콜에 변형을 행할 수 있음을 알 것이다.
조작된 ntEC를 생산하기 위한 형질감염 또는 형질전이
적정 배양 시간 (예, 2일) 경과 후, 전술한 바와 같이 단리된 또는 임의의 다른 수단에 의해 단리 또는 수득된 ntEC를, 선별가능한 마커 및 원하는 코팅 서열(들)(예, E4ORF1 코딩 서열 (예, Ad5로부터) 또는 BMP4 코딩 서열)을 적절한 프로모터의 통제 하에 함유한 핵산 분자 (예, 발현 벡터, 바이러스 벡터 등의 형태)로 형질감염 또는 형질전이한다. 형질감염 또는 형질전이는 표준 형질감염 또는 형질전이 프로토콜을 이용해 수행한다. 제2 코딩 서열을 형질감염 또는 형질전이해야 한다면 (예, E4ORF1 코딩 서열 (예, Ad5로부터) 또는 BMP4 코딩 서열), 적정 시간 경과 후 (예, 다음날), ntEC를 선별가능한 마커 및 제2 코딩 서열을 적절한 프로모터의 통제 하에 함유한 제2 핵산 분자 (예, 발현 벡터, 바이러스 벡터, 등의 형태)로, 재차 표준 형질감염 또는 형질전이 프로토콜을 이용해 형질감염 또는 형질전이한다. 형질감염/형질전이를 2회 실시하는 경우, 형질감염/형질전이 순서는 원하는 바와 같을 수 있다 (예, E4ORF1 1차 또는 2차). 코딩 서열 2종을 동일한 핵산 분자 또는 분리된 핵산 분자들로 동시에 전달할 수 있다.
전형적으로, 형질감염 또는 형질전이 후, ntEC 세포는 적절한 선별 물질 또는 물질들이 함유된 적절한 선별 배지로 교체하기 전에 수일 (예, 3일)간 EC 배양 배지에서 유지된다. 예를 들어, 전달되는 핵산 분자가 주어진 항생제에 대해 내성을 부여하는 유전자를 함유한다면, 핵산 분자를 포함하지 않는 세포는 사멸하고 핵산 분자를 포함하는 세포는 생존하도록, 그 항생제는 적량으로 선별 배지에 제공된다.
전형적으로, ntEC는 또한 일정 기간 동안 혈청 고갈 배양 (E4ORF1 발현은 무혈청성 배양시 생존할 수 있는 능력을 ntEC에 부여함)을 거친다. 그런 후, ntEC는 적합한 EC 배양물에서 원하는 용도의 세포를 충분한 수로 생산하기에 충분한 시간 동안 표준 EC 배양 프로토콜을 이용해 증폭시킨다. 예를 들어, UVEC의 경우, 14-21일의 증폭기로 탯줄 하나로부터 E4ORF1+ UVEC 약 200-300 x 106개를 쉽게 수득할 수 있다. 출발 물질의 양과 증폭기의 기간은 원하는 ntEC 양이 수득되도록 필요에 따라 조정할 수 있다. 적절한 경우, 생물반응조 시스템을 사용해 통제된 조건에서 ntEC를 다량 생산할 수 있다. 예를 들어, Quantum Cell Expansion System (Quantum, Terumo BCT) 생물반응조 시스템이 사용될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 원하는 용도에 적합한 조작된 ntEC 집단 (예, E4ORF1+, BMP4+ 또는 BMP4+E4ORF1+ ntEC)를 구축하기 위해 전술한 프로토콜에 변형을 행할 수 있음을 알 것이다.
조작된 ntEC 냉동보존
전술한 바와 같이 구축된 또는 다른 수단을 이용해 구축된 조작된 ntEC는 바로 사용되거나 또는 사용시까지 배양 상태로 유지시킬 수 있으며, 일부 경우에는, 예를 들어, ntEC를 이후 시점에 이용할 수 있도록, ntEC를 냉동보존하거나 및/또는 ntEC 세포 은행을 구축하는 것이 바람직할 수 있다. 내피 세포와 함께 이용하기에 적합한 다양한 냉동보존 프로토콜 및 냉동보존 시약들이 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 임의의 이러한 방법/시약을 이용할 수 있다. 예를 들어, 조작된 ntEC는 인간 혈청 알부민 (HSA: Griffols)이 최종 농도 약 20% HSA로 첨가된 CryoStor CS5 냉동보존 시약 (BioLife Solutions, Seattle, Washington)을 사용해 냉동보존할 수 있다. 냉동보존된 ntEC는 필요시까지 냉동 저장할 수 있다. 전형적으로, 필요시에, ntEC를 해동시켜 EC 배양 배지로 옮긴 다음 원하는 수준으로 배양 증폭한다.
조작된 ntEC 정성 관리
정성 관리 검사는 조작된 ntEC에 대해 생산 공정 중 임의 단계에서 및/또는 사용하기 전에 필요에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어, 정성 관리 분석을 수행하여 세포 생존성, 오염원의 결여, (예, RT-PCR에 의한) BMP4 발현의 존재, (예, ELISA에 의한) BMP4 분비의 존재, (예, RT-PCR에 의한) E4ORF1 발현의 존재 등을 평가 및 검증할 수 있다. 예를 들어, 예시적인 정성 관리 데이터 평가는 ELISA에 의해 검출되는 바와 같이 분비된 BMP4 단백질의 검출에 기반하여 수행하였다. BMP4+ E4ORF1+ HUVEC를 함유한 웰로부터 컨디셔닝화된 매질을 수득하였다. BMP4는 컨디셔닝화된 매질에서 대략 60,000 (n=2개의 독립 로트, 2세트로 수행)의 평균 농도에서 검출되었다. 여러가지 BMP4+ E4ORF1+ HUVEC 세포주에 대해 수행된 다른 정성 관리 평가에서, 컨디셔닝화된 매질내 BMP4의 평균 농도는 제1 세포주의 경우 대략 29,104pg/mL, 제2 세포주의 경우 대략 4,542pg/mL, 제3 세포주의 경우 대략 1,798pg/mL, 제4 세포주의 경우 대략 3,211pg/mL이었다.
실시예 2
비-흉선 내피 세포의 혈청 고갈에 대한 저항성
인간 제대정맥 내피 세포를 단리하여, 완전 배지 (20% 소 태아 혈청 및 섬유모세포 성장인자-2; FGF-2가 첨가된 배지)에서 컨플루언트로 배양하였다. 세포를 각각 내피 세포 100,000개씩 웰 6개에 분할하여 넣고, 완전 배지를 첨가하였다. 웰 1과 2의 세포는 대조군 (비-형질감염)으로 사용하고; 웰 3 및 4의 세포는 BMP4 유전자를 운반하는 레트로바이러스로 형질감염하였다. 웰 5 및 6의 세포는 아데노바이러스의 E4ORF1 영역을 운반하는 레트로바이러스로 형질감염하였으며, E4ORF1은 혈청 고갈에 대해 내성을 부여하는 것으로 알려져 있다.
웰 2, 4 및 6의 세포들 모두 4일간 무혈청 배지로 교체하고; 웰 1, 3 및 5의 세포는 4일간 완전 배지에서 유지시켰다. 4일 종료시, 각 웰을 조사하여 세포 증식을 확인하였다. 그 결과는 아래 표 1에 요약 개시한다.
표 1
웰 형질전이 혈청 고갈 결과
1 비-형질전이 정상 혈청 증식 양성
2 혈청 고갈 증식 안됨
3 EBMP4로 형질전이 정상 혈청 증식 양성
4 혈청 고갈 증식 안됨
5 E4ORF1으로 형질전이 정상 혈청 증식 양성
6 혈청 고갈 증식 양성
그 결과, 유전자 형질전이하지 않았을 경우 혈청 고갈시 세포 증식은 관찰되지 않았다 (웰 1 및 2). BMP4의 형질전이는 혈청 고갈에 대해 저항성을 부여하지 않았지만 (웰 3 및 4), 아데노바이러스 E4ORF1의 형질전이는 저항성을 부여하였다 (웰 5 및 6).
이들 실험의 결과를 아래 표 2에 추가로 요약 개시하며, 아래 표는 HUVEC가 혈청 부재 조건에서 증식하는 능력에 대한 E4ORF1 단독, BMP4 단독 또는 E4ORF1와 BMP4 둘다의 HUVEC (상대적인 형태로) 형질감염 효과를 보여준다. "-" 및 "+" 기호는 세포 수를 대략적으로 나타낸 것으로, "+" 기호가 많을수록 세포수가 많은 것을 의미한다.
표 2
시험관내 결과 HUVEC HUVEC E4ORF1+ HUVEC BMP4 + HUVEC E4ORF1 + BMP4+
혈청 부재 조건에서의 증식 능력 -
(세포 사멸)		 ++++ -
(세포 사멸)		 ++++
실시예 3
혈청 존재 조건에서 비-흉선 내피 세포의 증식
본 실험에서, 인간 제대정맥 내피 세포를 단리하여, 완전 배지 (20% 소 태아 혈청 및 섬유모세포 성장인자-2; FGF-2가 첨가된 배지)에서 컨플루언트로 배양하였다. 이후, 세포를 각각 내피 세포 100,000개씩 웰 4개에 분할하여 넣고, 완전 배지를 첨가하였다. 웰 1의 세포는 대조군 (비-형질감염)으로 사용하고; 웰 2의 세포는 BMP4 유전자를 운반하는 레트로바이러스로 형질감염하였다. 웰 3의 세포는 아데노바이러스의 E4ORF1 영역을 운반하는 레트로바이러스로 형질감염하였다 (E4ORF1은 세포에 증식 이점을 부여하는 것으로 알려져 있음).
세포들 모두 컨플루언스로 배양한 다음 계대 배양하여 웰 당 세포 150,000개를 접종한 다음 15일간 배양하였다. 모든 배양은 4-6일마다 계대 배양하였다. 각 계대 배양에서 트리판 블루 염료 배제 및 헤모사이토미터를 사용해 세포 수를 측정하였다.
그 결과, BMP4 단독으로 형질전이된 세포는 비-형질전이 세포보다 더 빨리 증식되진 않았지만, E4ORF1 형질전이 세포는 현저하게 더 빠른 증식율을 나타내었다. 도 1을 참조한다. 따라서, 인간 제대정맥 내피 세포에 BMP4의 형질전이는 세포에 실질적인 증식율 증가를 부여하지 않는다. 반면, 아데노바이러스 E4ORF1 영역의 형질전이는 실질적인 증식 이점을 부여한다. 이들 실험의 결과를 아래 표 3에 요약 개시하며, 아래 표는 혈청 존재 조건에서 배양한 HUVEC의 증식력에 대한 E4ORF1 단독, BMP4 단독 또는 E4ORF1과 BMP4의 형질감염의 효과를 (상대적인 정량적인 형태로) 보여준다. "+" 기호는 세포수를 대략적으로 나타낸 것으로, "+" 기호가 많을수록 세포수가 많은 것을 의미한다. 실제 세포 수는 해당 데이터 도를 참조한다.
표 3
시험관내 결과 HUVEC HUVEC E4ORF1 + HUVEC BMP4 + HUVEC E4ORF1 + BMP4+
혈청 존재 하 증식력 +
(제한적인 증식)		 ++++
(강건한 증식)		 +
(제한적인 증식)		 ++++
(강건한 증식)
실시예 4
BMP4 + E4ORF1 + 비-흉선 내피 세포는 생체내 흉선 상피 재생을 자극한다
BMP4+E4ORF1+ ntEC는 기본적으로 이전 실시예에 기술된 바와 같이 구축하였다. C57Bl/6 마우스를, 전신 조혈 및 흉선 손상을 유도하기에 충분한 준-치사 선량인 650 Rad의 전신 방사선 조사 (TBI)에 노출시켰다. 방사선 조사 후 6시간 경과시, 마우스에 마우스 흉선 내피 세포 (mutEC) 또는 BMP4+E4ORF1+ 골수 내피 세포 (도 2에서 "muBMECs+BMP4"로 표시됨) 1x106개를 생리 식염수 (포스페이트 완충화된 염수 - "PBS")에 현탁하여 주사하였다. 또한, PBS만 주사한 마우스 "no EC" 주입 대조군도 사용하였다. TBI 후 9일째에 조직을 회수하였다. 살아있는 흉선 세포, 살아있는 수질 흉선 상피 세포 (mTEC) 및 회수된 살아있는 피질 흉선 상피 세포 (cTEC)의 수를 결정하였다. 그 결과는 회수된 살아있는 흉선 세포 2A), 살아있는 수질 상피 세포 (mTEC)(도 2B) 및 살아있는 피질 상피 세포 (cTEC)(도 2C)의 수를 각 그래프로 작성하여 도 2에 제시한다. 데이터는, 마우스 BMP4+ E4ORF1+ 골수 내피 세포가 준-치사 선량 조사 후 흉선 회복을 가속화함을 보여준다.
흉선 재생에서 흉선 상피 세포 (TEC)의 여러가지 아종 - 즉, mTEC 및 cTEC의 역할을 식별하기 위해, BMP4+ E4ORF1+ ntEC 처리에 의해 영향을 받은 세포 유형 (도 3에서 "AB245" 세포로 언급됨)을 동정하기 위해 추가적인 실험을 수행하였다. C57Bl/6 마우스를 650 Rad TBI에 노출하여 흉선 손상을 유도하였다. 대조군 방사선 조사 마우스를, 방사선 조사 후 1일 3일에 BMP4+ E4ORF1+ HUVEC 투여한 군과 비교하였다. 방사선 조사 후 4일차에 동물을 희생시켜, BMP4+ E4ORF1+ HUVEC 이식 효과를 관찰하였다. 초기 시점에, 이식된 동물은 비-이식 동물과 비교해 흉선 상피 세포의 크기가 거의 2배 되었으며 (CD45- EpCam+ 세포의 수로 측정)(도 3A), 활발하게 증식하는 (CD45- EpCam+ Ki67+) 이들 세포의 총 수는 거의 4배 증가하였다 (도 3B). 마커 EpCam+, α6 인테그린+ 및 Sca1+ (도 3C)에 의해 식별되는 흉선 상피 선조 세포 (TEPC)의 수, 및 CD45-,K5+,K8+ 세포 (도 3E)의 수는, 세포 이식되지 않은 동물과 비교해 현저하게 증가하였다. 이들 TEPC의 증식성 집단 역시 증가하였으며, BMP4+ E4ORF1+ HUVEC 투여 동물은 세포 이식하지 않은 동물과 비교해 수적으로 2배 내지 4배 더 높게 관찰되었다 (도 3, D, F).
상기한 실험의 결과는 아래 표 4A 및 4B에 추가로 요약 개시하며, 이들 표는 준-치사 선량 조사 후 흉선에서 열거된 흉선 세포 타입(들)의 회복을 가속화하는 지정된 ntEC의 능력을 (상대적인 형태로) 보여준다 ("치료 결과" 참조). 표 4A에 요약 개시된 데이터 (도 2의 데이터)는 BMP4+E4ORF1+ 골수 EC 투여에 의해 유도된 회복을 요약 개시한다. 표 4B에 요약 개시된 데이터 (도 3의 데이터)는 BBMP4+E4ORF1+ HUVEC 투여에 의해 유도된 회복을 요약 개시한다. "+" 기호는 세포 수를 대략적으로 나타낸 것으로, "+" 기호가 많을수록 세포수가 많은 것을 의미한다. 실제 세포 수는 해당 데이터 도를 참조한다.
표 4A
치료 결과
(방사선 조사로부터 회복 이후의 흉선 세포 수, 세포 유형별) 		EC 비-투여 마우스 흉선 EC BMP4 + E4ORF1 + 마우스 골수 EC 데이터 도
재세포화 (총 흉선 수) + ++ ++++ 도 2A
mTEC + ++ ++++ 도 2B
cTEC + ++ ++++ 도 2C
표 4B
치료 결과
(방사선 조사로부터 회복 수 흉선 세포 수, 세포 유형별) 		EC 비-투여 HUVEC BMP4 + HUVEC BMP4 + E4ORF1 + HUVEC 데이터 도
EpCAM+ + * * ++++ 도 3A
EpCAM+ Ki67+ + * * ++++ 도 3B
EpCAM+ α6+Sca1+ + * * ++++ 도 3C
EpCAM+ α6+Sca1+ Ki67+ (증식선) + * * ++++ 도 3D
CD45-K5+K8+ + * * ++++ 도 3E
CD45-K5+K8+ Ki67+ (증식성) + * * ++++ 도 3F
* HUVEC 및 BMP4+ HUVEC (E4ORF1 비-함유)는 생체내 실험에 사용하기에 충분한 수로 배양할 수 없었다 (도 1 참조).
실시예 5
조작된 비-흉선 내피 세포는 흉선 T 세포 및 흉선 상피 세포 둘다의 회복을 자극한다.
조작된 ntEC가 림프구 재구성을 자극하는 능력을 마우스 (C57Bl/마우스 6마리) 조혈 줄기 세포 이식 모델을 이용해 조사하였다. 조작된 ntEC (E4ORF1+, BMP4+, 또는 BMP4+ E4ORF1+ HUVEC)를 기본적으로 전술한 실시예에 기술된 바와 같이 구축하였다. 동물을 다음과 같이 치료군과 대조군으로 할당하였다:
군 1 (대조군) - 마우스 16마리를 대조군으로 할당하였으며; 이들 동물에는 방사선 조사, 골수 주입 도는 내피 세포 주입을 수행하지 않았다.
군 2-4 (치료군) - 마우스에 전신 선량 1,000 cGy으로 방사선 조사하였다. 방사선 조사 후 약 10-16시간 후, 방사선 조사 처리된 마우스들 모두에 골수 (BM) 세포 500,000 를 정맥내 주입하였다. 치료군은 다음과 같다:
군 2 - 동물에 동계 골수 세포 500,000개만 투여하였다.
군 3 - 동물에 동계 골수 세포 500,000개 및 아데노바이러스의 E4ORF1 영역을 발현하도록 조작된 인간 제대정맥 내피 세포 500,000개를 주입하였다. 이들 내피 세포 500,000개를 추가적인 정맥내 주입으로 1차 주입 후 약 48시간 후에 주입하고, 제2 주입 후 약 48시간 후 다시 주입하였다.
군 4 - 각 주입에서 E4ORF1 및 BMP4 둘다 형질전이된 내피 세포를 투여하는 것을 제외하고는, 군 3과 동일한 절차를 동물에 이행하였다.
방사선 조사 후 3주차에, 동물들 모두 안락사시켰다. 각 동물의 흉선을 적출하여, 작은 단편으로 자르고, 콜라게나제 처라하여 흉선의 세포 성분을 포함하는 단일 세포 현탁물로 분리하였다. 이후, 이들 세포에 대해 유세포 측정을 분석하여, 존재하는 주 조혈 및 상피 세포 타입을 특정화하였다. 결과는 다음과 같다.
A. 재세포화 ( recellularization ) - 전체 세포 회복
유핵 흉선 세포의 수는 골수만 주입한 방사선 처리 동물에서 90% 이상으로 감소하였다 (도 4). 전체 세포 충실도 (cellularity)는 여전히 방사선 비-조사 동물보다 현저하게 낮았지만, 골수 단독과 비교해 E4ORF1 단독 형질전환 ntEC 또는 E4ORF1 및 BMP4 형질도입 ntEC의 공동-주입에 의해 현저하게 개선되었다 (도 4; E4ORF1 단독 형질전이 ntEC와 비교시 p<0.05, 및 E4ORF1과 BMP4로 형질전이된 ntEC와 비교시 p<0.01).
E4ORF1과 BMP4 조합으로 형질전이된 ntEC의 투여 동물에서 총 세포 충실도는 E4ORF1 단독 형질전이된 ntEC의 투여 동물과 비교해 수치적으로 더 높았으나, 이러한 차이는 통계적으로 유의하지 않았다.
모든 세포 로트의 BM-단독, E4ORF1+ ntEC 또는 E4ORF1+BMP4+ ntEC가 처리된 군의 데이터들을 종합하여, 일원식 크루스칼-왈리스 ANOVA와 이후 Dunn의 다중 비교 분석 검정으로 분석하였다. Dunn 검정은 각 군의 평균 값을 대조군 골수-단독 처리군의 평균과 비교하였다. 데이터는 도 4에 나타낸다.
B. 조혈 기원의 세포 및 흉선 기질 세포의 회복
T 림프구 발달에 중요한 일차 림프 장기인 흉선내 세포는 조혈 기원의 세포 (CD45+ 골수 조혈 줄기 세포로부터 유래)와 흉선 기질 (상피) 세포로 나눌 수 있다. 이들 2가지 집단 및 각각의 아집단의 회복을 아래에 요약 개시한 바와 같이 각각 분석하였다.
C. CD45 + 세포 회복
CD45.1 이소형을 발현하는 C57Bl/6 마우스 및 CD45.2 이소형을 발현하는 숙주 마우스로부터 유래된 도너 골수의 사용은 도너와 숙주-유래 CD45+ 세포를 구분할 수 있게 해주었다.
방사선 조사 후 3주차에 흉선내 도너 CD45+ 세포의 수 (도 5)는 일반적으로 총 세포의 수를 반영하였다 (도 4). 총 세포수와 관련하여, ntEC-처리 동물은 흉선에서 CD45+ 세포의 수가 골수만 주입한 동물과 비교해 현저하게 높았다. E4ORF1 및 BMP4 둘다 형질전이된 ntEC 주입시, E4ORF1 단독 형질전이된 ntEC에서 관찰된 것 보다 더 높은 수준으로 CD45+ 세포가 회복되었다. 이러한 차이는 통계적으로 유의하였다 (도 5).
D. CD3 + 세포 회복
T-림프구는 CD3 표면 마커의 발현에 의해 특정된다. CD45.1+/CD3+ T 세포 집단의 회복은 CD45의 회복과 동일한 패턴을 따른다 (도 6). CD45 회복과의 연관성은, 흉선내 CD45+ 세포 대부분이 T 세포라는 점을 감안하면, 놀라운 결과가 아니다 (도 6B). CD45+ 세포와 마찬가지로, E4ORF1과 BMP4가 형질전이된 ntEC의 처리 군에서 T 세포가 더 많이 관찰되었다. 이 군에서 T 세포의 수는 E4ORF1 단독 형질전이된 ntEC의 처리 군과 비교해 통계학적으로 유의하게 더 많았다.
중요하게도, CD3을 또한 발현하는 CD45+ 세포 %에서 군들 간의 차이는 관찰되지 않았다. 이는, 양쪽 ntEC 형태에서 관찰되는 차이가 CD45 아집단보다는 CD3 회복 가속화가 원인이라는 점을 시사해준다.
E. CD3 +/ CD4 + 및 CD3 +/ CD8 + 세포 회복
CD4 또는 CD8을 발현하는 CD3+ 세포의 수는 ntEC-처리 후 증가하였다 (도 7). 다른 집단에서와 같이, E4ORF1 및 BMP4 형질도입 ntEC를 처리한 후 회복성은 E4ORF1 단독 형질전이 ntEC를 처리한 경우와 비교해 수치적으로 더 높았다.
이들 2가지 집단에 대한 상대적인 값 (각 %는 각각 총 CD3+ 세포를 나타냄)은 방사선 조사된 동물에서 달라졌으며, CD8 세포가 상대적으로 증가하고 CD4 세포는 대응되게 감소하였다 (도 8). E4ORF1 및 BMP4 형질전이된 ntEC가 처리된 동물에서 양쪽 집단의 평균적인 상대적인 기여는, ntEC 비-투여 동물 또는 E4ORF1 단독 형질전환된 ntEC의 투여 동물보다는 방사선 비-조사 동물에 더 유사한 경향을 나타내었다.
F. 흉선 성숙 마커
흉선 내 T-림프구의 발달은 표면 마커에 대해 잘-이해된 패턴을 따른다 (도 9). 이들 마커를 이용해, 후술한 바와 같아 T-림프구 발달에 대한 ntEC-처리 효과를 분석할 수 있다.
G. CD4 및 CD8을 발현하는 CD3 세포의 회복 (이중 양성 세포)
이중-양성 (DP) 세포의 수는 2가지 형태의 ntEC 처리에 의해 증가되었지만, 다른 매개변수와 마찬가지로, 골수 단독 대비 개선은 E4ORF1 단독 형질전이한 경우와 비교해 E4ORF1 및 BMP4 형질전이된 ntEC에서 수치적으로 더 높았다 (도 10A). 이중-양성 세포의 상대적인 수 (전체 CD3-양성 세포에 대한 %)는 모든 군들에서 동일하였으며, 이는 ntEC 처리가 흉선 T 세포 회복을 강화하지만 왜곡하지 않는다는 것을 시사해준다 (도 10B).
H. CD4 & CD8에 음성인 CD3 세포 (이중-음성 세포)의 회복
이중-음성 (DN) 세포의 수는 다른 매개변수에서와 마찬가지로 2가지 ntEC 형태의 처리에 의해 증가하였으며, 골수 단독 대비 개선은 E4ORF1 단독 형질전이 경우와 비교해 E4ORF1 및 BMP4 형질전이 ntEC에서 수적으로 더 높았다 (도 11). (전체 CD3-양성 세포에 대한 %로서) DN 세포의 상대적인 평균 수는 E4ORF1 및 BMP4 형질전이 ntEC-처리한 동물에서 약간 더 낮았다 (정상에 더 가까움)(도 11B).
도 9에 나타낸 바와 같이, 이중-음성 CD3+ DN 세포는 인터루킨 2 (IL-2) 수용체의 α-쇄인 CD25와, 림프구 활성화, 재순환 회귀 및 조혈 등의 매우 다양한 세포 기능에 참여하는 부착성 분자인 CD44의 발현을 토대로, 4가지 세포 유형으로 추가로 분류할 수 있다. 이들 4가지 유형은 DN1, DN2, DN3 및 DN4로 명명되며, 숫자가 높을수록 T 세포 발달이 더 후기인 세포를 나타낸다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 각 DN 아집단의 수는 E4ORF1 단독 형질전환 ntEC 또는 E4ORF1과 BMP4 형질전이된 ntEC로 처리한 동물에서 더 높았다. 다른 집단에서와 마찬가지로, E4ORF1과 BMP4 형질전이 ntEC로 처리한 동물은 E4ORF1 단독 형질전환 ntEC로 처리된 동물과 비교해 수적으로 더 높은 수치를 나타내었나, 이러한 차이는 임의의 DN 아집단에서 통계적으로 유의하지 않았다.
도 13에 나타낸 바와 같이, DN1, DN2 및 DN4 세포의 상대적인 양 / 아집단은 E4ORF1 단독 형질전환 ntEC 또는 BMP4와 E4ORF1 형질전환 ntEC로 처리된 동물에서 더 높았다. DN3 세포의 %는 대응되는 감소를 나타내었다. 가장 큰 상대적인 차이는 최초기에, E4ORF1과 BMP4 형질도입 ntEC의 투여 동물에서의 증가가 통계학적으로 유의한 가장 드문 아집단 (DN1 및 DN2)에서 존재하였다.
이들 데이터는, 흉선 T 세포의 재집단 (repopulation)이 ntEC 처리 동물에서 상당히 개선되고 BMP4와 E4ORF1 형질전이 ntEC로 처리된 동물이 E4ORF1 단독 형질전이 ntEC로 처리된 동물보다 더 높은 유익성을 나타낸다는 점에서, 일치되는 패턴을 나타낸다. 이러한 회복 증가는, 분석한 최초기 T 세포 전구체 세포 (DN1)에서부터 가장 성숙한 단일 양성 CD3/CD4 및 CD4/CD8 세포에 이르기까지 명백하였다.
I. 흉선 기질 세포의 회복
흉선 상피 세포는 EpCAM 발현 및 CD45 부재로 특정된다. 본 실험의 결과, 흉선 T-세포 집단에 대해, ntEC 공동-주입 동물은 골수 단독 투여 동물과 비교해 EpCAM+ 세포의 수가 더 많았다 (도 14). 흥미롭게도, 골수 단독 투여 동물에서 이들 세포의 평균 수는 비-손상 동물과 비교해 더 낮았지만, ntEC-처리 동물에서의 수는 비-손상 동물에서와 동일 (E4ORF1 단독)하거나 또는 더 높았다 (E4+BMP4)(도 14). 이는 대부분 EpCAM-양성 세포의 수가 매우 높은 동물의 적은 수로 인한 것임에도 불구하고 더 많은 오버슈트 (overshoot) 현상을 시사한다 (도 14). 다양한 아종의 흉선 기질 세포의 회복에 대한 데이터를 아래에 제시한다.
J. 흉선 상피 선조 세포 ( TEPC )의 회복
Sca1+ (도 15) 및 Sca1+/ α6+ (도 16) 흉선 상피 선조세포에 대한 분석 결과, 비-흉선 세포 처리 후 양쪽 집단이 증가하였으며, 그 효과는 BMP4 (E4ORF1 및 E4/BMP4 각각) 형질전이된 비-흉선 내피 세포를 이용해 증폭되는 것으로, 확인되었다.
K. 피질 흉선 상피 세포 ( cTEC )의 회복
성숙한 피질 흉선 상피 세포 (cTEC, 도 17)에 대한 분석 결과, 골수 단독 군과 비교해 E4/BMP4 처리 동물 군에서 세포 수가 현저하게 더 많이 관찰되었다. 증식성 Ki67+ cTEC에 대한 분석도 비슷한 경향을 나타내었다 (도 18).
L. 수질 흉선 상피 세포 ( mTEC )의 회복
성숙한 피질 흉선 상피 세포 (mTEC, 도 19)에 대한 분석 결과, 골수 단독 군과 비교해 E4/BMP4 처리 동물 군에서 세포수가 현저하게 더 많이 관찰되었다. 증식성 Ki67+ mTEC에 대한 분석에서도 비슷한 경향이 관찰되었다 (도 20).
상기 실험의 결과는 아래 표 5에 추가로 요약 개시하며, 하기 표는 HUVEC, E4ORF1+ HUVEC, BMP4+ HUVEC 또는 E4ORF1+ HUVEC가 준치사 선량의 방사선 조사 후 흉선에서 열거된 세포 타입(들)의 회복을 가속화하는 능력을 (상대적인 형태로) 나타낸다 ("치료 결과" 칸 참조). "+" 기호는 세포 수를 대략적으로 나타낸 것으로, "+" 기호가 많을수록 세포수가 많은 것을 의미한다. 실제 세포 수는 해당 데이터 도를 참조한다.
표 5
치료 결과
(방사선 조사로부터 회복된 흉선 세포 수, 세포 유형별) 		EC 비-투여 (BM 단독) HUVEC E4ORF1 + HUVEC BMP4 + HUVEC BMP4 + E4ORF1 + HUVEC 데이터 세부항목
재세포화 (총 흉선 세포) + * ++ * ++++ A
조혈 계통 세포 / 흉선세포 / T 세포 & T 세포 선조세포
CD45+ + * ++ * ++++ C
CD3+ + * ++ * ++++ D
CD3+ CD4+ + * ++ * ++++ E
CD3+ CD8+ + * ++ * ++++ E
CD3+ CD4+ CD8+ (DP) + * ++ * ++++ G
CD3+ CD4- CD8- (DN) + * ++ * ++++ H
흉선 기질 / 상피 세포
CD45- EpCAM+ + * ++ * ++++ I
CD45- EpCAM+ Sca1+ (TEPC) + * ++ * ++++ J
CD45- EpCAM+ Sca1+α6+ (TEPC) + * ++ * ++++ J
CD45- EpCAM+ (cTEC) + * ++ * ++++ K
CD45- EpCAM+ Ki67+ (cTEC) - 증식성 + * ++ * ++++ K
CD45- EpCAM+ (mTEC) + * +++ * ++++ L
CD45- EpCAM+ Ki67+ (mTEC) 증식성 + * +++ * ++++ L
* HUVEC 및 BMP4+ HUVEC (E4ORF1 비-함유)는 생체내 실험에서 이용할만큼 충분한 개수로 배양할 수 없었다 (도 1 참조).
실시예 6
BMP4 + E4ORF1 + ntEC는 전신 방사선 조사 & 골수 이식 후 생존성을 강화한다
BMP4+ 및 E4ORF1+ ntEC를 기본적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 구축하였다. C57Bl6 마우스에 1,000 cG (치사 선량)로 전신 방사선 조사 (TBI)하여 골수고갈한 후, 동계 마우스 유래 전체 골수 (WBM) 세포 200,000 또는 500,000개를 투여하였다. 일부 동물 코호트 (도 21에서 "+EC"로 표시됨)는 TBI 후 (1일, 3일 및 5일에 세포 500,000개) BMP4+E4ORF1+ HUVEC를 투여하였다.
도 21에 나타낸 시간대에 생존성을 평가하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, BMP4+E4ORF1+ HUVEC (도 5에서 BMP4 ntEC로 표시됨) 및 WBM을 저 선량으로 처리한 동물에서는 ntEC 비-처리 동물과 비교해 감소된 사망율이 관찰되었다 (사망율은 64%로 감소됨, P<0.05). BMP4+E4ORF1+ ntEC 및 더 높은 선량의 WBM 처리 동물에서는 사망율이 급격하게 감소하였다 (생존성은 100%임, P<0.05). 도 21. 따라서, 양쪽 WBM 선량에서, BMP4+E4ORF1+ ntEC 처리시 생존율에 급격하고 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되었다.
전술한 실험의 결과들을 아래 표 6에 추가로 요약 개시하며, 아래 표는 치사 선량으로 방사선 조사 후 생존성에 대한 MP4+E4ORF1+ ntEC의 효과를 상대적인 형태로 요약 개시한다. "+" 기호는 생존율을 대략적으로 나타낸 것으로, "+" 기호가 많을수록 생존율이 높은 것을 의미한다. 생존율 수치에 대해서는 해당 데이터 도를 참조한다. HUVEC 및 BMP4+ HUVEC (E4ORF1 비-함유)는 이러한 생체내 실험에 사용하기에 충분한 수로 배양할 수 없음에 유념하여야 한다 (도 1 참조).
표 6
치료 결과 EC 비-투여 (BM 단독) BMP4 + E4ORF1 + HUVEC
치사 선량의 방사선 조사 및 준-최적 (200k) 골수 투여 후 생존성 ++ ++++
치사 선량의 방사선 조사 및 증가된 골수 용량 (500k) 이식 후 생존성 ++ ++++
실시예 7
BMP4 + E4ORF1 + ntEC의 인간 임상 실험
골수파괴성 컨디셔닝 (MAC)이 시술되고 매칭되는 관련 및 비관련 (MRD 또는 MUD) 동종이계 조혈 세포 이식 (HCT)이 수행된 혈액 악성을 가진 인간 성인에 대해, BMP4+ E4ORF1+ ntEC에 대한 1상 오픈-라벨 비-무작위, 다-기관 다중 용량 증가 전향적인 실험을 수행하였다. 이 실험은 표준관리 성체 동종이계 HCT 후 BMP4+ E4ORF1+ ntEC 치료에 대한 안전성 및 예비 효과를 평가한다.
여러가지 조직 기원의 ntEC를 이용한다 (지방세포 조직, 피부, 폐, 심장, 신장 및/또는 골수 유래의 HUVEC 및 EC). BMP4+ E4ORF1+ ntEC는 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조한다.
등록한 개체는 치료 종양 전문의가 선택한 다음과 같은 MAC 용법들 중 한가지로 기관 표준에 따라 계획된 HCT를 시술받는다:
전신 방사선 조사 (>1000 cGY) (TBI) 및 사이클로포스파미드 (120 mg/kg) (Cy/TBI);
에토포시드 120 mg/kg 및 TBI (>1000 cGY), 부설판 (16 mg/kg 경구 또는 12.8 mg/kg IV) 및 사이클로포스파미드 (120 mg/kg) (Bu/Cy);
부설판 (16 mg/kg PO 또는 12.8 mg/kg IV) 및 플루다라빈 (120-180 mg/m2) (Bu/Flu).
실험에 대한 의료 모니터에 의해 승인되는 경우에는 전술한 방법 이외의 다른 대안적인 MAC 용법을 이용한다. 이식 후 면역억제 및 지지 관리를 기관 가이드라인에 따라 실시한다.
줄기 세포의 주입과 관련한 급성 반응이 발생하지 않는 것으로 관찰되면, 1일에 동종이계 (MRD 또는 MUD) HCT 주입 완료 후 2시간 경과시 BMP4+ E4ORF1+ ntEC를 정맥내 투여한다. 급성 주입 관련 반응은 HCT 주입 중에 발생하면, 반응을 치료하고, 개체에 대한 실험은 더 이상 진행하지 않는다.
BMP4+ E4ORF1+ ntEC는 하기 표 7에 나타낸 바와 같이 4가지 코호트를 포함하여 용량 증가 방식으로 투여한다 (환자 6명 이상 각각에 대해).
표 7
코호트 1 0, 3 및 5일에 5 x 106 세포/개체 체중 kg으로 투여
코호트 2 0, 3 및 5일에 10 x 106 세포/개체 체중 kg으로 투여
코호트 3 0, 3 및 5일에 20 x 106 세포/개체 체중 kg으로 투여
코호트 4 코호트 1-3에서 최선의 결과를 나타내는 세포는 단일 투여로서 검사함 (코호트 1-3에서 3가지 투여와 반대임).
***
본 발명은 하기 청구항에서 추가로 기술된다.
<110> ANGIOCRINE BIOSCIENCE, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR THYMIC REGENERATION AND T-CELL RECONSTITUTION <130> ANGIOCRINE.024.WO1 <150> 62/853,452 <151> 2019-05-28 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1227 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgattcctg gtaaccgaat gctgatggtc gttttattat gccaagtcct gctaggaggc 60 gcgagccatg ctagtttgat acctgagacg gggaagaaaa aagtcgccga gattcagggc 120 cacgcgggag gacgccgctc agggcagagc catgagctcc tgcgggactt cgaggcgaca 180 cttctgcaga tgtttgggct gcgccgccgc ccgcagccta gcaagagtgc cgtcattccg 240 gactacatgc gggatcttta ccggcttcag tctggggagg aggaggaaga gcagatccac 300 agcactggtc ttgagtatcc tgagcgcccg gccagccggg ccaacaccgt gaggagcttc 360 caccacgaag aacatctgga gaacatccca gggaccagtg aaaactctgc ttttcgtttc 420 ctctttaacc tcagcagcat ccctgagaac gaggtgatct cctctgcaga gcttcggctc 480 ttccgggagc aggtggacca gggccctgat tgggaaaggg gcttccaccg tataaacatt 540 tatgaggtta tgaagccccc agcagaagtg gtgcctgggc acctcatcac acgactactg 600 gacacgagac tggtccacca caatgtgaca cggtgggaaa cttttgatgt gagccctgcg 660 gtccttcgct ggacccggga gaagcagcca aactatgggc tagccattga ggtgactcac 720 ctccatcaga ctcggaccca ccagggccag catgtcagga ttagccgatc gttacctcaa 780 gggagtggga attgggccca gctccggccc ctcctggtca cctttggcca tgatggccgg 840 ggccatgcct tgacccgacg ccggagggcc aagcgtagcc ctaagcatca ctcacagcgg 900 gccaggaaga agaataagaa ctgccggcgc cactcgctct atgtggactt cagcgatgtg 960 ggctggaatg actggattgt ggccccacca ggctaccagg ccttctactg ccatggggac 1020 tgcccctttc cactggctga ccacctcaac tcaaccaacc atgccattgt gcagaccctg 1080 gtcaattctg tcaattccag tatccccaaa gcctgttgtg tgcccactga actgagtgcc 1140 atctccatgc tgtacctgga tgagtatgat aaggtggtac tgaaaaatta tcaggagatg 1200 gtagtagagg gatgtgggtg ccgctga 1227 <210> 2 <211> 408 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ile Pro Gly Asn Arg Met Leu Met Val Val Leu Leu Cys Gln Val 1 5 10 15 Leu Leu Gly Gly Ala Ser His Ala Ser Leu Ile Pro Glu Thr Gly Lys 20 25 30 Lys Lys Val Ala Glu Ile Gln Gly His Ala Gly Gly Arg Arg Ser Gly 35 40 45 Gln Ser His Glu Leu Leu Arg Asp Phe Glu Ala Thr Leu Leu Gln Met 50 55 60 Phe Gly Leu Arg Arg Arg Pro Gln Pro Ser Lys Ser Ala Val Ile Pro 65 70 75 80 Asp Tyr Met Arg Asp Leu Tyr Arg Leu Gln Ser Gly Glu Glu Glu Glu 85 90 95 Glu Gln Ile His Ser Thr Gly Leu Glu Tyr Pro Glu Arg Pro Ala Ser 100 105 110 Arg Ala Asn Thr Val Arg Ser Phe His His Glu Glu His Leu Glu Asn 115 120 125 Ile Pro Gly Thr Ser Glu Asn Ser Ala Phe Arg Phe Leu Phe Asn Leu 130 135 140 Ser Ser Ile Pro Glu Asn Glu Val Ile Ser Ser Ala Glu Leu Arg Leu 145 150 155 160 Phe Arg Glu Gln Val Asp Gln Gly Pro Asp Trp Glu Arg Gly Phe His 165 170 175 Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Val Met Lys Pro Pro Ala Glu Val Val Pro 180 185 190 Gly His Leu Ile Thr Arg Leu Leu Asp Thr Arg Leu Val His His Asn 195 200 205 Val Thr Arg Trp Glu Thr Phe Asp Val Ser Pro Ala Val Leu Arg Trp 210 215 220 Thr Arg Glu Lys Gln Pro Asn Tyr Gly Leu Ala Ile Glu Val Thr His 225 230 235 240 Leu His Gln Thr Arg Thr His Gln Gly Gln His Val Arg Ile Ser Arg 245 250 255 Ser Leu Pro Gln Gly Ser Gly Asn Trp Ala Gln Leu Arg Pro Leu Leu 260 265 270 Val Thr Phe Gly His Asp Gly Arg Gly His Ala Leu Thr Arg Arg Arg 275 280 285 Arg Ala Lys Arg Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys 290 295 300 Asn Lys Asn Cys Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val 305 310 315 320 Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr Gln Ala Phe Tyr 325 330 335 Cys His Gly Asp Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr 340 345 350 Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Ser Ile 355 360 365 Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu 370 375 380 Tyr Leu Asp Glu Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Glu Met 385 390 395 400 Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg 405

Claims (39)

  1. 흉선 재생을 강화하는 방법으로서,
    조작된 비-흉선 내피 세포 (ntEC)를 포함하는 치료학적 조성물을 흉선 재생이 필요한 개체에 유효량으로 투여하는 것을 포함하고, 상기 조작된 ntEC가 E4ORF1+ 또는 BMP4+E4ORF1+이고, 이로써 개체에서 흉선 재생이 강화되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 흉선 재생이 CD45- 흉선 기질 세포 및 CD45+ T 세포로부터 한가지 이상의 세포 타입의 회복을 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 흉선 재생이 CD45- 흉선 기질 세포 및 CD45+ T 세포 둘다의 회복을 포함하는, 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 CD45- 흉선 기질 세포가 흉선 상피 선조 세포 (TEPC), 피질 흉선 상피 세포 (cTEC) 및 수질 흉선 상피 세포 (mTEC)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 CD45+ T 세포가 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 이중-양성 T 세포 (DP), 이중-음성 T 세포 (DN), 이중-음성 타입 1 (DN1) T 세포, 이중-음성 타입 2 (DN2) T 세포, 이중-음성 타입 3 (DN3) T 세포 및 이중-음성 타입 4 (DN4) T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ntEC가 제대정맥 내피 세포 (UVEC), 지방세포 내피 세포, 피부 내피 세포, 폐 내피 세포, 심장 내피 세포, 신장 내피 세포 및 골수 내피 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체가 인간인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ntEC가 인간 제대정맥 내피 세포 (HUVEC)인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ntEC가 상기 개체에 대해 자가의 것인, 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ntEC가 상기 개체에 대해 동종이계인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ntEC가 상기 개체와 MHC/HLA-일치되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체는 화학요법, 방사선 요법, 이식 전 컨디셔닝 용법 또는 골수파괴성 컨디셔닝 용법이 이미 시술된, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체는 면역결핍성인, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 개체는 HIV 감염된, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체는 흉선 조직 중량, 흉선 기능 또는 T 세포 생산에서 노화-관련 결함을 가진, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 ntEC는 상기 개체에 IV 주입에 의해 투여되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 ntEC는 수일 또는 수주 동안에 걸쳐 IV 다중 주입으로 개체에 투여되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체에 조혈 줄기 세포 (HSC)를 포함하는 치료학적 조성물을 투여하는 것을 더 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 조작된 ntEC 및 HSC가 병용 투여되는, 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 조작된 ntEC 및 HSC가 동일한 IV 주입으로 상기 개체에 투여되는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체에 ntEC를 투여하기 전에, ntEC를 E4ORF1을 코딩하는 핵산 분자 및 선택적으로 BMP4를 코딩하는 핵산으로 생체외 형질전이 또는 형질감염하여, ntEC를 유전자 변형하는 초기 단계를 더 포함하는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체에 대해 자가 ntEC를 투여하기 전에, E4ORF1을 코딩하는 핵산 분자 및 선택적으로 BMP4를 코딩하는 핵산으로 ntEC를 생체외 형질전이 또는 형질감염함으로써 상기 개체로부터 유래된 자가 ntEC를 유전자 변형하는 초기 단계를 더 포함하는, 방법.
  23. 조작된 BMP4+E4ORF1+ 비-흉선 내피 세포 (ntEC)의 단리된 집단.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 집단이 실질적으로 순수한 집단인, 집단.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 ntEC가 BMP4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함하는, 집단.
  26. 제25항에 있어서,
    BMP4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 이종의 프로모터에 작동가능하게 연결된, 집단.
  27. 제25항에 있어서,
    ntEC가 E4ORF1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함하는, 집단.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 E4ORF1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 이종의 프로모터에 작동가능하게 연결된, 집단.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 핵산 분자가 발현 벡터인, 집단.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 발현 벡터가 바이러스 벡터인, 집단.
  31. 제29항에 있어서,
    상기 발현 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 집단.
  32. 제29항에 있어서,
    상기 발현 벡터가 레트로바이러스 벡터인, 집단.
  33. 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ntEC가 인간 제대정맥 내피 세포 (HUVEC), 지방세포 내피 세포, 피부 내피 세포, 폐 내피 세포, 심장 내피 세포, 신장 내피 세포 및 골수 내피 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 집단.
  34. 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ntEC가 인간 제대정맥 내피 세포 (HUVEC)인, 집단.
  35. 제23항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 ntEC 집단을 포함하는 조성물.
  36. 제23항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 ntEC 집단과 개체에 투여하기 적합한 용액을 포함하는 치료학적 조성물.
  37. 제23항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 ntEC 집단 및 생체적합한 매트릭스 물질을 포함하는 치료학적 조성물.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 생체적합한 매트릭스 물질이 액체인, 치료학적 조성물.
  39. 제37항에 있어서,
    상기 생체적합한 매트릭스 물질이 고체인, 치료학적 조성물.
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