KR20220011846A - Nix 단백질 발현을 증가시키는 물질을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 등에 관한 것으로, 본 발명에서는 글루코코르티코이드에 의하여 NIX 의존적인 미토파지가 감소되고 이로 인한 시냅스 기능 이상 및 인지 장애가 유발됨을 확인하였으며, 글루코코르티코이드가 GR-PGC1α-NIX 축을 통하여 NIX 단백질을 감소시키는 기전을 구체적으로 확인하였다. 이에, 스트레스로 인해 손상된 미토콘드리아의 미토파고솜으로의 변환이 억제되고 신경세포 시냅스 및 말단에 적절히 배치되지 않아 발생되는 신경퇴행성 질환의 발병요인을 밝힘으로써 세포 내 수송을 조절하는 타겟 단백질을 발굴하고 미토콘드리아의 기능을 회복시키는 치료 방법을 제안할 수 있다.

Description

NIX 단백질 발현을 증가시키는 물질을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 치료 방법 {A composition and method for preventing or treating neurodegenerative diseases, comprising a substance that increases NIX protein expression}

본 발명은 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 미토콘드리아에서 NIX 단백질 발현을 증가시키는 물질을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물; 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물; 및 미토콘드리아에서 NIX 단백질 발현을 증가시키는 물질을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

알츠하이머 병(AD)의 주요 요인인 글루코코르티코이드는 스트레스 증가, 제한된 운동성, Drp1 인산화를 통한 분열, Ca²+ 완충 장애 및 과도한 미토콘드리아 반응성 산소종(mtROS)과 같은 미토콘드리아 손상을 초래한다 [Hernandez-Alvarez MI, Paz JC, Sebasti

n D, et al. Antioxid Redox Signal.2013;19(4):366-378.]. 정상 뉴런에서 손상된 미토콘드리아는 비대칭 핵분열을 겪어 오토파고솜을 목표로하며, 이어서 리소좀의 분해 또는 원위 축삭에서의 제거를 위해 소마로 돌아간다 [Bhujabal Z, Birgisdottir

B, Sjøttem E, et al. FKBP8 recruits LC3A to mediate Parkin- independent mitophagy. EMBO Rep. 2017;18(6):947-961.]. 미토 파지 (mitophagy) 라 불리는 이 과정은 미토콘드리아 풀에서 적절한 수의 건강한 소기관을 유지하기 위함이며, 특히 미토콘드리아 풀은 대부분의 ATP가 필요한 시냅스에 적절하게 국한되어 있습니다. 그러나, 글루코코르티코이드 처리된 뉴런에서는 신경돌기의 미세소관으로부터의 기능 장애 미토콘드리아의 분리 및 핵 주위로의 축적이 관찰된다 [Choi GE, et al. Cell Death Dis. 2018;9(11):1137.]. 또한, 다른 스트레스 유발 인자인 에피네프린은 자가 포식과 미토 파지를 모두 억제하여 뉴런 세포 손상을 초래한다. 스트레스 유발 뉴런에서 손상된 미토콘드리아를 제거하지 못하면 시냅스 항상성에 이상을 유발하고, 궁극적으로 AD를 포함하는 신경 퇴행성 질환을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, 미토 파지 메커니즘의 적절한 활성화 및 미토콘드리아 활성 조절에 대해 글루코코르티코이드가 미치는 자세한 메커니즘이 규명될 필요가 있다.

미토콘드리아 막 탈분극의 유도시, PTEN-유도된 키나제 1 (PINK1)-파킨 경로는 몇몇 신경 퇴행성 질환을 개선하기 위해 활성화되는 것으로 잘 알려져 있다. 그러나, 파킨의 생리학적 수준이 미토 파지를 유도하기에 충분하지 않다는 문제가 있다 [Villa E, Marchetti S, Ricci J-E. No Parkin zone: mitophagy without Parkin. Trends Cell Biol. 2018; 28(11):882-895.]. 구체적으로, PINK1-파킨 경로에 의해 매개되는 미토 파지는 basal 미토 파지를 조절하는데 크게 요구되지 않으며, 이는 신경 조직에서 정상 상태 또는 만성 질환 조건 하에서 연속 미토콘드리아 하우스키핑을 의미한다. 그러나, PINK1 독립적인 수용체-매개 {BCL 상호 작용 단백질 3 (BNIP3), BCL 상호 작용 단백질 3 (BNIP3L) / NIX, 1을 포함하는 FUN 14 도메인 등} 미토 파지는 basal 미토 파지와 밀접한 관련이 있으며, 뇌를 포함한 에너지 요구 조직에서 더 중요하다. 따라서, 수용체-매개 미토 파지 조절 인자는 신경계 장애에서 미토 파지 메커니즘을 강화하기 위한 잠재적 치료 표적이 될 것으로 생각된다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 글루코코르티코이드에 의한 NIX 단백질 감소 효과, 이로 인한 신경세포 내 미토콘드리아 미토 파지 억제 및 신경세포 퇴행의 유도 메커니즘을 상세하게 규명하고, NIX 단백질 발현 조절이 가능한 인자를 통해 스트레스성 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료가 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은, 미토콘드리아에서 NIX 단백질 발현을 증가시키는 물질을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은, 미토콘드리아에서 NIX 단백질 발현을 증가시키는 물질을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은, 미토콘드리아에서 NIX 단백질 발현을 증가시키는 물질을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 미토콘드리아에서 NIX 단백질 발현을 증가시키는 물질을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 미토콘드리아에서 NIX 단백질 발현을 증가시키는 물질을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 미토콘드리아에서 NIX 단백질 발현을 증가시키는 물질을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명은 글루코코르티코이드에 의하여 NIX 의존적인 미토파지가 감소되고 이로 인한 시냅스 기능 이상 및 인지 장애가 유발됨을 확인하였으며, 글루코코르티코이드가 GR-PGC1α-NIX 축을 통하여 NIX 단백질을 감소시키는 기전을 구체적으로 확인하였다. 이에, 스트레스로 인해 손상된 미토콘드리아의 미토파고솜으로의 변환이 억제되고 신경세포 시냅스 및 말단에 적절히 배치되지 않아 발생되는 신경퇴행성 질환의 발병요인을 밝힘으로써 세포 내 수송을 조절하는 타겟 단백질을 발굴하고 미토콘드리아의 기능을 회복시키는 치료 방법을 제안할 수 있다.

도 1 내지 도 9는 글루코코르티코이드가 미토콘드리아의 잘못된 국소화, 시냅스 기능 장애 및 세포 사멸을 유도하는 것에 관한 것이다.
도 10 내지 도 17은 글루코코르티코이드가 해마 뉴런 및 SH-SY5Y 세포에서 미토 파지를 억제함을 나타낸 것이다.
도 18 내지 도 25는 PINK1-parkin 경로와 독립적인 NIX 발현에 대한 글루코 코르티코이드의 억제 효과을 나타낸 것이다.
도 26 내지 도 36은 NIX 상향 조절이 글루코코르티코이드 유발 미토콘드리아 기능 장애를 회복함을 나타낸 것이다.
도 37 내지 도 44는 PGC1α를 통한 NIX 발현의 GR- 의존적 억제에 관한 것이다.
도 45 내지 도 51은 NIX 의존적 미토 파지에서의 PGC1α의 역할에 관한 것이다.
도 52 내지 도 57은 코르티코스테론이 PGC1α의 감소를 통해 NIX- 의존적 미토 파지에 영향을 미침을 나타낸 것이다.
도 58은 본 발명에서 규명한 각 인자들의 작용 기전을 나타낸 모식도이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 발명에서는 해마 신경세포의 퇴행을 일으키는 주요 요인인 글루코코르티코이드가 수용체들 중 NIX 단백질에 의존적으로 미토파지의 감소 및 시냅스 기능 이상을 유발함을 규명하였다. 이를 통해 글루코코르티코이드의 발현을 감소시키는 물질, 또는 NIX 단백질의 발현량을 증가시키는 물질을 활용하여, 알츠하이머병이나 파킨슨병과 같은 신경 퇴행성 질환의 치료제를 제공한다.

본 발명은 일 관점에서, 미토콘드리아에서 NIX 단백질 발현 또는 활성을 증가시키는 물질을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, 미토콘드리아에서 NIX 단백질 발현을 증가시키는 물질을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, 미토콘드리아에서 NIX 단백질 발현을 증가시키는 물질을 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, 미토콘드리아에서 NIX 단백질 발현을 증가시키는 물질을 검출하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 글루코코르티코이드의 발현을 감소시키는 물질을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 글루코코르티코이드에 의한 미토파지의 감소를 억제하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물의 상기 NIX 단백질 발현을 증가시키는 물질은 PGC1α 의 발현을 증가시키는 물질인 것일 수 있다. 또한, 상기 NIX 단백질 발현을 증가시키는 물질은 PGC1α 단백질 또는 Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)인 것일 수 있으며, 상기 조성물은 PGC1α 단백질 및/또는 Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)을 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 다발성 경화증 및 근위축성 측삭 경화증으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 글루코코르티코이드 수용체(GR) 길항제를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 GR 길항제는 RU 486인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 CREB 저해제를 바람직하게는 0.01 내지 99.9 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

상기 약학적 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 적어도 면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 상기 약학적 조성물의 경구투여를 위한, 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 조성물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 통상의 방법에 의할 수 있고, 일 예로 경구 및 직장 또는 정맥등의 방법을 통하여 투여 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 신체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 건강기능식품 조성물은 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 건강기능식품 조성물의 식품의 종류에는 특별히 제한은 없다. 본 발명의 유효성분으로 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서 건강식품을 모두 포함한다.

실시예 1: 실험 재료 및 방법

1-1. 세포 배양

마우스 해마 뉴런의 배양은 변형된 프로토콜에 따라 수행되었다(Kaech S, Banker G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 2006;1(5):2406-2415). E18 마우스 배아의 해마 뉴런은 성상 세포의 피더층 위로 뒤집힌 폴리-D-리신을 갖는 커버 슬립에서 저밀도로 배양되거나, 2% B27 보충제가 보충된 신경 기저 배지 (Gibco)에서 폴리-D-리신으로 코팅된 6-웰 플레이트상에서 고밀도로 배양되었다. 인간 신경 모세포종 세포주 SH-SY5Y는 한국 세포주 은행에서 인수하였다. SH-SY5Y 세포를 10 % 소태아 혈청 및 5% CO₂로 37 ℃로 유지된 1 % 항생제-항진균 성 혼합물을 함유하는 고포도당 DMEM 배지에서 배양 하였다. 혈청 감소를 위해, SH-SY5Y 세포를 24시간 동안 1% 항생제-항진균제 용액을 함유하는 무혈청 DMEM으로 배양 하였다.

1-2. 플라스미드 DNA의 형질 감염

글루코코르티코이드 처리 전에, 세포를 플라스미드 DNA, MEM 및 리포펙타민 3000(Thermo Fisher)의 혼합물과 함께 배양하였다. 리포펙타민 3000을 사용한 지질-기반 형질 감염 방법은 뉴런 커버 슬립에서 변형된 프로토콜에 따라 12-웰 플레이트에 사용되었다 (Kaech S, Banker G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 2006;1(5):2406-2415). 60-90 분 후, 뉴런을 2 % B27 보충제를 함유한 새로운 neurobasal 배지로 교체하였다. SH-SY5Y 세포는 변형된 프로토콜에 따라 리포펙타민 3000을 사용하여 플라스미드로 형질 감염되었다 (Zhu J, Dagda RK, Chu CT. Monitoring mitophagy in neuronal cell cultures. Methods Mol Biol. 2011;793:325-339). 6 시간 동안 인큐베이션한 후, 리포펙타민 시약을 제거하고 새로운 starvation 배지로 교체 하였다.

1-3. 유전자 침묵을 위한 작은 간섭 RNA (siRNA)의 형질 감염

플레이트의 60 % confluency가 이루어질 때까지 세포를 성장시켰다. 글루코 코르티코이드 처리 전에, 제조사의 지시에 따라 세포를 25 nM의 indicated siRNA 및 turbofect 형질 감염 시약 (Thermo Fisher)과 함께 24 시간 동안 배양하였다. 인간/마우스 GR에 특이적인 siRNA는 Bioneer Corporation에서 구매하였다. 인간 BNIP3L 및 비 표적화 (NT)에 특이적인 siRNA는 Dharmacon에서 얻었다.

1-4. 역전사-중합 효소 연쇄 반응 및 실시간 PCR

RNA 샘플을 MiniBEST 범용 RNA 추출 키트(Takara)를 사용하여 추출하였다. Maxime RT-PCR 프리믹스 키트(인트론 바이오 테크놀로지)와 함께 45 ℃에서 1 시간 동안 RNA를 사용하여 95 ℃에서 5분 동안 수행하여 역전사를 통해 cDNA를 수득 하였다. 이어서, Quanti NOVA SYBR Green PCR Kits (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 cDNA 샘플을 증폭시켰다. RNA 표적의 실시간 정량화는 Rotor-Gene 6000 실시간 열 사이클링 시스템 (Corbett Research)으로 수행하였다. 정량적 실시간 PCR을 다음과 같이 수행 하였다: DNA 폴리머라제 활성화를 위해 95 ℃에서 10 분; 94 ° C에서 15 초, 54 ° C에서 30 초, 72 ° C에서 30 초의 50 회 사이클을 진행하고, PCR 곡선의 특이성 및 동일성 확인을 위해 용융 곡선 분석을 수행하였다. ACTB 유전자를 대조군으로 하여 유전자 발현 수준을 정규화 하였다.

1-5. RT2 인간 핵 수용체 및 응고제 PCR 어레이

RT2 프로파일러 PCR (# PAHS-056Y, Qiagen)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 12시간 동안 코티솔로 처리된 세포에서 인간 핵 수용체 및 응고제의 유전자 발현을 분석하였다. 본 어레이에서, 일련의 최적화된 프라이머 분석법은 StepOnePlus 실시간 PCR 시스템(Thermo Fisher)으로 검출된 96개 웰에서 84개의 유전자 및 5개의 하우스 키핑 유전자에 대한 mRNA 전사를 검출하였다. Qiagen 웹 사이트의 GeneGlobe Data Analysis Center를 사용하여 PCR 어레이 데이터를 분석하고, p값이 0.05 미만인 유전자를 선택하였다.

1-6. DNA 추출 및 mtDNA 함량 (손상) 분석

제조사의 지시에 따라 AccuPrep® Genomic DNA 추출 키트 (Bioneer Corporation)를 사용하여 DNA 샘플을 추출하였다. 동일한 실험 조건에서 측정된 mtDNA 및 nDNA 모두 상기 기재된 실시간 PCR로 평가되었다. 미토콘드리아 16SrRNA 유전자를 표적으로 하는 mtDNA 프라이머 및 B2m/β2-마이크로글로불린 유전자를 표적으로 하는 nDNA 프라이머를 사용한 실시간 PCR은 잘 알려진 미토파지 평가 절차이다. 미토파지 과정 동안, mtDNA는 리소좀의 DNAseII에 의해 분해되었다. 불충분한 미토 파지는 mtDNA의 불완전한 소화를 야기시킨다. 즉, mtDNA 함량은 미토 파지에 반비례한다. nDNA로 정규화된 mtDNA는 mtDNA 양을 평가하기 위해 정량화하였다. 프라이머 서열은 이전 연구 [Tang C, Han H, Yan M, et al. PINK1-PRKN/PARK2 pathway of mitophagy is activated to protect against renal ischemia-reperfusion injury. Autophagy. 2018;14(5):880-897.]에서 수득하였다.

1-7. 웨스턴 블롯 분석

수확된 샘플을 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 적절한 완충액과 함께 얼음에서 30분 동안 배양 하였다. 세포 잔해물을 원심 분리 (4 ℃에서 30 분 동안 13,000Хg)로 제거하였다. 비친코니닉산 정량 분석 키트 (Thermo Fisher)에 의해 단백질 측정을 수행 하였다. 동일한 양의 샘플 단백질 (1-5 μg)을 8-15 % SDS-PAGE에 제조한 다음 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로 옮겼다. 막을 0.2 % 트윈-20 용액{TBST; 150mM NaCl, 10mM 트리스-HCl (pH 7.6), 0.1 % 트윈-20}을 함유하는 트리스-버퍼 식염수 내의 5% 소혈청 알부민 (Sigma Chemical Company) 또는 5 % 탈지유 (Gibco)로 30 분 동안 블로킹하였다. 차단된 막을 1 차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양 하였다. 이어서 막을 3 회 세척하고 실온에서 2 시간 동안 HRP-접합된 이차 항체와 함께 인큐베이션 하였다. 웨스턴 블로팅 밴드는 화학 발광 용액 (BioRad, Hercules, CA, USA)으로 검출되었고 정량화에 대한 밀도 측정 분석은 Image J 소프트웨어 (West Rasband, National Institutes of Health, Bethesda)를 사용하여 수행하였다.

1-8. 공동 면역 침강

일차 항체는 SureBeadsTM 단백질 G 자성 비드 (BioRad)로 고정하였다. 고정화된 자성 비드를 4 ℃에서 밤새 총 세포 용해물 (300 ㎍)과 함께 배양 하였다. 자석에 의해 자성 비드를 끌어 내린 후 수집 하였다. 용출 완충액 (Thermo Fisher)에서 배양하여 항체 결합 단백질을 획득하였다. 항-마우스 또는 토끼 IgG 항체를 음성 대조군으로 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 단백질 분석을 수행 하였다.

1-9. 면역 세포 화학

coverslip 또는 공초점 접시 (Thermo Fisher)의 SH-SY5Y 세포에 있는 해마 뉴런을 15 % 동안 4 % 파라포름알데히드로 고정시킨 다음 0.3 % 트윈-20에서 5 분 동안 배양 하였다. 세포를 1 시간 동안 PBS 중의 5 % 정상 염소 혈청 (NGS)에 넣고 5 % NGS에 용해된 1 차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 이어서, 세포를 Alexa FluorTM 2 차 항체와 함께 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션 하였다. 이미지는 Eclipse Ts2 형광 현미경 (일본 도쿄, 니콘) 또는 초해상 방사형 변동 (SRRF) 이미징 시스템 (Andor Technology)에 의해 획득되었다. Pearson의 상관 계수를 이용한 형광 강도 분석 및 공동 국소화 분석은 Fiji 소프트웨어 (미국 메릴랜드 베데스다의 National Institutes of Health)에 의해 획득되었다.

1-10. 미토콘드리아 함량/형태, 미토콘드리아 ROS 및 미토콘드리아 막 전위 측정

미토콘드리아 함량/모폴로지, 미토콘드리아 ROS 및 미토콘드리아 막 전위를 측정하기 위해, Mitotracker Green/Red (MTG/MTR, #M7514/#M22425, Thermo Fisher), MitoSOX Red (#M36008, Thermo Fisher) 및 TMRE (#87917, Sigma Chemical Company)를 각각 사용하였다.

농도는 제조업체의 지시에 따라 측정하였다. 형광 강도를 발광 측정기 (Victor3; Beckman Coulter)에서 측정하고 총 세포 수로 정규화 하였다. 미토콘드리아의 형태는 SRRF 이미징 시스템으로 시각화하였다.

1-11. Cell ELISA kit에서 human citrate synthase assay kit과 MitoBiogenesis TM를 이용한 미토콘드리아 생성 측정

미토콘드리아 생체 생성은 해당 작용, 산화적 인산화 및 더 큰 미토콘드리아 대사 능력을 위한 대사 효소를 증가시킨다. 시트레이트 신타제는 미토콘드리아 효소이자, 산화 능력의 정량적 지표이기 때문에 미토콘드리아 발생에 대한 마커로 인간 시트레이트 신타제 활성 분석 키트 (# ab119692)를 사용하여 SH531-SY5Y 세포에서 미토콘드리아 생물 발생을 평가하였다. 또한, 미토콘드리아 생체 생성을 측정하기 위해 abcam(#ab140359)으로부터 구매한 Cell ELISA 키트의 MitoBiogenesis TM를 SH-SY5Y 세포에 사용하였다. 사용되는 2개의 단백질은, mtDNA로 코딩된 COXI 단백질과 nDNA로 코딩된 SDH-A는 단백질이다. SDH-A 합성에 대한 COXI 단백질 합성은 미토콘드리아 발생 및 함량에 대한 정량적 측정을 위함이다.

1-12. TUNEL 분석

뉴런 세포에서 미토콘드리아 DNA 파괴를 평가하기 위해 Click-itTM TUNEL Alexa FluorTM 488 Imaging Assay (# C10617, Thermo Fisher)를 사용하여 TUNEL 분석을 수행하였다. 미토콘드리아를 시각화하기 위해 MTR 539를 염색하였다. 샘플이 고정된 후, EdUTP를 dsDNA 가닥 파괴로 TdT 혼입하는 과정 및 EdUTP를 검출하는 형광 염료와 함께 인큐베이션 하는 과정을 진행하였다. MTR과 TUNEL 형광 사이의 공동-국소화는 mtDNA 손상을 검출하기 위해 시각화되었으며, 이는 Fiji 소프트웨어를 사용하여 미토 파지 손상에 의한 mtDNA의 불완전한 소화로 인한 것이다.

1-13. 해마 뉴런에서 시냅스 소포 라벨링 및 리사이클링의 및 형광 이미징

재활용 시냅스 소포를 측정하기 위해 FM4-64 염료 (# T3166, Thermo Fisher) 및 시냅토타민-1 항체를 사용하였다. 해마 뉴런에 FM4-64 염료를 로딩하고 높은 K+-용액으로 자극 하였다. 높은 K+-용액으로 염색하기 전과 후에 이미지를 촬영하고, destaining kinetics을 분석 하였다. 표지를 위해, 해마 뉴런을 신경 기저 배지에서 시냅토타민-1 항체의 존재하에 탈분극 완충제로 자극하였다. 여러 번 세척한 후, 뉴런을 고정시키고 면역 세포 화학을 수행 하였다.

1-14. 아넥신 V-FITC/PI 염색

아넥신 V-FITC 및 PI 염색은 아넥신 V-FITC 아폽토시스 검출 키트 (#BD 556547, BD Bioscience)를 사용하여 수행하였다. 처리 후, SH-SY5Y 세포를 결합 완충액에 현탁시켰다. 이어서 아넥신 V-FITC 및 PI를 샘플에 첨가하고 15분 동안 실온에서 인큐베이션 하였다. 유세포 분석법 (Quanta SC; Beckman Coulter)으로 샘플의 아폽토시스를 확인 하였다.

1-15. 미토콘드리아 스트레스 테스트 분석

XF 세포 미토 스트레스 테스트 키트 (# 103015-100) 및 해마 XF24 세포 외 플럭스 분석기 (Agilent Technologies, Santa Clara)를 사용하여 미토콘드리아 스트레스 테스트 분석 하에서 산소 소비율을 분석하였다. 해마 뉴런 및 SH-SY5Y 세포를 XF24 세포 배양 마이크로 플레이트에서 배양하였다. 기초/최대 호흡, 양성자 누출 및 ATP 생성을 포함하는 미토콘드리아 호흡을 결정하기 위해 올리고마이신, FCCP 및 항 마이신 A/로테논 혼합물을 세포 배양으로 처리 하였다.

1-16. 크로마틴 면역 침전

EZ-ChIP 크로마틴 면역 침전 키트 (# 17-371, EMD Millipore)를 사용하여 칩 분석을 수행하였다. 단백질-크로마틴 복합체를 포함하는 샘플을 GR, IgG 및 RNA 폴리머라제 (RNAPol)에 대한 ChIP 등급 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 정상 IgG 및 RNAPol을 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용하였다. 공급된 컬럼에 의해 샘플 DNA를 추출하고 설계된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. PPARGC1A 프라이머의 순서는 다음과 같다: 정방향 프라이머, 5'-GAAAAATAGGAGCCGGGAAT-3 '및 역방향 프라이머, 5'-CCGAAGAGTTGCTGCAGTTT-3'. 샘플 크로마틴 추출물의 1 %가 투입물로 사용되었다.

1-17. 동물실험 설계

코르티코스테론에 노출된 수컷 ICR 마우스는 스트레스에 의해 유도된 마우스 모델이다. 생쥐의 해마는 뇌 중에서 가장 풍부한 GR을 가지고 있기 때문에 미토 파지에 대한 글루코코르티코이드 효과를 평가하는데 주로 사용되었다. 서울대학교의 동물 관리 위원회 (SNU-190917-6)에 따라 7 주령의 수컷 ICR 마우스를 사용 하였다. 동물은 표준 환경 조건 (22 ° C 상대 습도 70 %; 12 시간 빛:어두운주기; 음식 및 음료 용액에 대한 임의의 접근)하에서 우리당 6 마리씩 수용되었다. 7 주령 수컷 ICR 마우스의 총 48 개가 생체 내 연구에 사용되었다. 연구 전반에 걸쳐 각 그룹에 6 마리의 마우스를 사용 하였다. 간섭 결과를 포함하여 큰 N 크기보다 매우 낮은 p 값이 관찰되는 경우 샘플 크기 (최소 n = 3)를 적용 할 수 있다. 따라서 통계적 유효성을 얻기 위해 최소 n = 3 (웨스턴 블로팅, 면역 조직 화학) 및 n = 6 (행동 테스트)을 설정했다. 주관적 영향을 최소화하기 위해 동물을 무작위로 배정했다.

코르티코스테론 (10 mg / kg)을 PBS 중 50 % 프로필렌글리콜을 함유한 용액에 용해시키고 복강 내 주사 하였다. 비히클-처리된 마우스에 프로필렌 및 PBS를 함유하는 용액을 유사하게 주사 하였다. PMA (200 ㎍ / kg)를 1 % DMSO 및 99 % 옥수수 오일 (Sigma Chemical Company)을 함유하는 용액에 용해시켰다. 비히클 용액은 PBS 중의 1 % DMSO 및 50 % 프로필렌글리콜을 포함한다. RU 486 (5 mg / kg)을 에탄올을 함유한 용액에 용해시키고 PMA 및 RU 486을 복강 내 주사하였다. 비히클-처리된 마우스에 프로필렌글리콜, 에탄올 및 DMSO를 함유하는 용액을 유사하게 주사 하였다. 모든 실험 동안 마우스를 하루에 2 회 모니터링 하였다.

1-18. Y- 미로 자발적 교대 시험

Y- 미로 자발적 교대 테스트에서는 설치류의 선천적 특성에 따라 새로운 환경을 다르게 탐색한다. 이 행동 테스트는 동물의 인지 장애를 정량화하는 데 널리 사용된다. 설치류는 일반적으로 이전에 탐험했던 곳으로 돌아 가지 않고 Y-미로의 새로운 위치에 도전하는 것을 선호한다. 시험 전에 스트레스를 최소화하기 위해 동물을 시험실의 홈 케이지에 3 시간 동안 두었다. 이어서, 마우스를 삼정사 (한국 서울)로부터 구입한 Y 형 미로를 탐색하도록 10분 동안 방치 한 후, arm 유입 및 triads 수를 기록하여 계산 하였다. 4개의 다리가 모두 arm에 있을 때만 계수되었다. 대체량은 총 트라이어드 (전체 항목-2)로 나눈 대체 횟수를 나타낸다. 동물이 더 높은 교대 백분율을 나타내는 경우, 동물은 기억 기능을 정상적으로 유지하는 경향이 있는 것이다.

1-19. 면역 조직 화학 (IHC)

마우스는 졸레틸 (50 mg / kg)로 마취를 받았고 무칼슘 티로이드 용액에 4 % 파라 포름알데히드를 심근 관통시켰다. 제거된 뇌를 4 % 파라포름알데히드에서 2 시간 동안 고정시킨 후, 4 ℃에서 24 시간 동안 PBS에서 30 % 수크로스에서 탈수시켰다. 일련의 횡단면 (40 μm)을 크라이오스탯 (Leica Biosystems, Nussloch, Germany)을 사용하여 수행하였다. 해마를 함유하는 뇌 조직을 4 % 파라포름알데히드로 고정한 다음 PBS 중의 0.1 % 트리톤 X-100을 함유하는 5 % NGS로 실온에서 1 시간 동안 사전 차단 하였다. 샘플을 1차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, 2 시간 동안 실온에서 2 차 항체를 인큐베이션 하였다. 완성된 샘플은 SRRF 이미징 시스템을 사용하여 시각화하였고, Fiji 소프트웨어를 사용하여 형광 강도 분석을 수행하였다.

1-20. 통계 분석

결과는 평균값 ± 평균의 표준 오차 (S.E.M.)로 표시되고 GraphPad Prism 6 소프트웨어로 분석하였다. 두 실험 그룹 사이의 비교는 t-테스트를 사용하였다. 그룹과 비교할 필요가 있는 실험은 다중 t 테스트로 처리 수단을 대조군과 비교하였다. p 값이 <0.05인 결과는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

실시예 2: 실험 결과

2-1. 글루코코르티코이드의 미토파지 결함으로 인한 시냅스 기능 장애 유발

학습과 기억에 필수적인 역할을 하는 해마는 글루코코르티코이드에 반응하는 뇌 영역으로, 본 발명에서는 해마 뉴런 배양을 수행하여 미토파지, 시냅스 기능 및 인지 기능에 대한 글루코코르티코이드의 효과를 확인하였다. 스트레스 반응을 유발하기 위한 적절 농도의 글루코코르티코이드를 고려하면, 비교적 낮은 농도의 생리학적 혈장 농도는 대략 7-35ng/ml이다. '스트레스' 수준의 글루코코르티코이드로 간주되는 고농도는 70 ng/ml 이상에서 시작된다. 낮은 글루코코르티코이드 수준은 일반적으로 미네랄 코르티코이드 수용체-매개 반응을 활성화시키는 반면, 높은 글루코코르티코이드 수준 또는 스트레스 노출은 GR 의존적 신호 전달을 지배적으로 유발한다. 이전 연구에 따르면, 스트레스가 있는 마우스에서 코르티코스테론 수치는 대조군에 비해 최대 5 배 증가하였다. 쥐는 스트레스 후 300-500 ng/ml의 코르티코스테론을 보인 반면 스트레스가 없는 쥐는 약 50 ng / ml의 코르티코스테론을 나타냈다 [Snyder JS, Soumier A, Brewer M, et al. Adult hippocampal neurogenesis buffers stress responses and depressive behaviour. Nature. 2011;476(7361):458-461.] 따라서, 세포 시스템에서 1μM의 글루코 코르티코이드를 처리하여 뉴런 세포에서 미토 파지에 대한 스트레스의 영향을 평가하고자 하였다.

해마 뉴런에서, 대부분의 미토콘드리아는 일반적으로 원위 수상 돌기 또는 축삭 과정에 국한된다. 따라서, dendrites에 대한 MAP2, 축삭에 대한 Tau, 그리고 미토콘드리아에 대한 mitotracker 레드 (MTR)를 염색하는 원위 neurites에 미토콘 드리아 분포를 평가했다. 원위 신경 돌기의 길이는 일반적으로 약 100 μm로 설정된다. 본 발명에서는 MAP2 또는 타우와 MTR의 피어슨 상관 계수를 측정하여 원위 신경 돌기에서 미토콘드리아의 분포를 결정하였다.

설치류에서 글루코코르티코이드의 주요 형태인 코르티코스테론은 수상 돌기와 축색 돌기로부터 미토콘드리아를 재분배하였다 (도 1). 손상된 미토콘드리아는 일반적으로 리소좀과의 융합이 분해되도록 역행 방향으로 소마(soma)로 이동한다. 건강한 미토콘드리아는 시냅스 항상성을 유지하는 뉴런의 원위 구획으로 되돌아간다. 본 발명자들은 미토콘드리아 마커에 대한 TOMM20, 핵 마커에 대한 DAPI, 및 시냅스 마커에 대한 시냅토피신과 함께 해마 뉴런의 면역 염색을 수행하였다. 피어슨 상관 계수를 사용하여 TOMM20과 핵/시냅스 사이의 colocalization을 분석하였고, 시냅스에서 핵에 대한 미토콘드리아 국소화의 비율을 측정하여 미토콘드리아 분포를 평가하였다. 그 결과, 글루코코르티코이드가 시냅스 말단보다는 핵 주위에 미토콘드리아의 축적을 유발함을 확인하였다 (도 2). 유사하게, 인간에서 글루코코르티코이드의 주요 형태인 코르티솔로 SH-SY5Y 세포를 처리한 후, 미토콘드리아는 미토콘드리아 마커 TOMM20과 DAPI 사이의 피어슨 상관 계수 값에 의해 평가된 대조군에서 핵 주위에 축적되는 것으로 확인되었다 (도 3). 미토콘드리아 기능 장애 및 잘못된 국소화는 결과적으로 ATP 생산 부족 및 불충분 한 Ca²+ 완충으로 인한 시냅스 이상을 초래한다. 본 발명에서는 코르티코스테론이 수상 돌기 길이를 단축시키는 것을 확인하였다 (도 4). 일반적으로 시냅스 가소성을 평가하기 위해 시냅토피신 및 PSD95 단백질이 관찰된다. 시냅토피신은 중요한 시냅스 전 소포 단백질이고, PSD95는 시냅스 밀도와 밀접한 관련이 있는 시냅스 후 스캐폴드 단백질이다.

본 발명에서는 코르티코스테론이 시냅스 밀도 (도 5)와 시냅스 마커 (도 6)를 상당히 감소시켰음을 확인했다. 시냅스 기능 감소로 인해, 코르티코스테론으로 처리된 해마 뉴런은 시냅토타민 흡수 분석에 의해 조사된 바와 같이 감소된 시냅스 소포 재생을 나타냈다 (도 7). 또한, 코르티코스테론은 FM4-64 염료 방출 속도를 억제하고 시냅스 전류를 감소시켰다 (도 8). SH-SY5Y 세포는 또한 코티솔 (cortisol)로 처리하에 상당한 아폽토시스를 겪는 것으로 나타났다 (도 9). 따라서, 글루코코르티코이드는 시냅스 기능 장애 및 세포 사멸을 유도함을 알 수 있다.

손상된 미토콘드리아는 일반적으로 미토 파지를 겪고, 건강한 미토콘드리아는 뉴런 말단을 향해 운반된다. 그러나, 본 결과에서, 글루코코르티코이드는 핵 주위에 미토콘드리아 축적을 유도하였다. 따라서, hippocampal 뉴런 및 SH SY5Y 세포에서 미토파지에 대한 글루코코르티코이드의 효과를 조사하였다. 미토파지 리포터 미토콘드리아-표적된 케이마(mt-Keima)를 사용하여 미토 파지를 평가 하였다. 글루코코르티코이드는 해마 뉴런 및 SH-SY5Y 세포에서 적색과 녹색 형광의 합에 대한 적색의 비율을 감소시켰다 (도 10, 11). 이러한 결과로 글루코코르티코이드가 감소된 mt-Keima 신호로 표시되는 바와 같이, 미토 파지를 상당히 억제한다는 것을 알 수 있다. 글루코코르티코이드 처리 후, 두 세포 유형은 또한 AutophagSense 및 DsRed2-mito 플라스미드 형질 감염 (도 12-15)을 사용하여 측정된 바와 같이, 대조군과 비교하여 LC3와 미토콘드리아 사이의 공동-국소화가 감소된 것으로 나타났다. Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) 분석을 사용하여 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 손상의 양을 측정하였다. 글루코코르티코이드는 mtDNA 제거에 부정적인 영향을 미치는 것으로 밝혀졌으며, 이는 핵 DNA (nDNA) 수준에 의해 회복되었다 (도 16). 다음으로, 시트레이트 신타제 활동 분석 키트를 사용하여 미토콘드리아 생성을 측정하였다. 그 결과, 글루코코르티코이드가 미토콘드리아 생체 생성을 감소 시켰으며, mtDNA의 증가가 미토콘드리아 생체 생성의 증가를 포함하지 않음을 알 수 있다. 따라서 글루코코르티코이드에 의해 증가된 mtDNA 함량은 글루코 코르티코이드에 의한 미토 파지 수준의 감소가 있는 것으로 볼 수 있다. 또한 해마 뉴런의 미토콘드리아 함량에 대한 코르티코스테론의 효과를 확인하기 위해 웨스턴 블롯팅을 통해 TOMM20 수준을 분석하였다. 그 결과, 코르티코스테론은 미토콘드리아 함량을 증가시키는 것으로 관찰되었으며, 이는 미토 파지 기능이 감소되었음을 나타낸다 (도 17). 미토파고솜의 역행이 아닌 세포 내 미토 파지는 뉴런의 축삭에서 발생하는 것으로 알려져 있다. 글루코코르티코이드에 의한 미토 파지 억제가 주로 세포 내 미토 파지에 의해 유도되는지 여부를 밝히기 위해, 우리는 해마 뉴런에서 축삭 요소의 성상 세포 식세포 작용의 부산물 인 γ-시누클레인(synuclein)의 존재를 확인하였다. 대조군과 코르티코스테론 군 사이에서 γ-시누클레인 수준에서 유의한 변화가 검출되지 않았다. 이러한 결과는, 글루코코르티코이드에 의해 결함이 있는 미토 파지는 뉴런 세포에서 적절한 미토콘드리아 분포 및 시냅스 항상성을 손상시킬 가능성이 있음을 시사한다.

2-2. 미토콘드리아 및 시냅스 기능 장애의 주요 인자인 NIX의 감소

글루코코르티코이드 처리 시 미토 파지 조절인자 중 어느 인자가 감소되는지 조사하기 위해, mRNA 발현을 확인하였다. 그 결과, NIX mRNA의 발현은 감소된 반면, BNIP3 및 PINK1의 발현은 코티솔-처리된 세포에서 유지되었다 (도 18). 이와 유사하게, 글루코코르티코이드는 NIX 발현을 하향 조절 하였지만, 해마 뉴런 및 SH-SY5Y 세포에서 PINK1 또는 BNIP3 발현에 영향을 미치지 않았다 (도 19). 결과적으로, 면역 염색 (도 20, 21) 및 미토콘드리아 분획에 의해 밝혀진 바와 같이, 미토콘드리아에서의 NIX의 존재는 글루코코르티코이드 처리시 감소되는 것으로 나타났다. 본 연구에서 코티솔은 파킨(parkin)과 NIX 사이의 결합을 감소 시켰지만 파킨 녹다운은 추가 NIX 하향 조절에 영향을 미치지 않았다 (도 22). 이는 SH-SY5Y 세포에서 파킨이 NIX 발현에서 중요하지 않은 역할을 함을 알 수 있다. 또한, 파킨 상향 조절이 NIX 발현을 회복할 것으로 생각할 수 있다. 이를 확인하기 위해 PARK2 overexpression에 역할을 하는 것으로 알려진 mt-Keima와 hippocampal 뉴런 및 SH-SY5Y 세포를 형질감염하였다. 그 결과 기존 연구와는 달리, 파킨 단백질이 풍부했는지의 여부와 관계 없이 NIX 발현이 감소한다는 것을 확인했다 (도 23). 또한, PINK1-parkin 통로의 주요 다운 스트림 메커니즘인 미토콘드리아의 유비퀴틴화를 평가하기 위해 immunoprecipitation 및 immunocytochemistry를 수행하였다. 미토콘드리아 마커 TOMM20의 유비퀴틴화는 코티솔 처리에 의해 변하지 않았다. 또한, PINK1-파킨 경로 기질 중 하나인 유비퀴틴과 Mfn1 사이의 상호 작용은 코티솔 처리시 변하지 않았다. 이는 글루코코르티코이드가 수용체-매개 미토 파지를 강력하게 억제함을 시사한다. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)는 NIX 인핸서로 널리 사용되고 있다. PMA가 NIX 발현을 촉진시키는데 특정한 영향을 미치는 것을 관찰하기 위해, BNIP3L siRNA를 사용하였다. BNIP3L의 녹다운은 NIX 발현의 유도에서 관찰된 PMA의 효과를 제거하였고, PMA 효과에 NIX의 관여를 확인하여, 대조군의 효과와 비교하여 그 발현을 감소시켰다. 실제로, PMA는 글루코 코르티코이드 처리 하의 세포에서 mtDNA 파손을 회복시켰다 (도 24). SH-SY5Y 세포에서, NIX 과발현은 심지어 코티솔 처리 하에서도 미토 파지를 증가시켰다 (도 25). 종합하면, 본 발명의 결과는 글루코코르티코이드에 의한 NIX 하향 조절이 주로 뉴런 세포에서 파킨-매개 경로로부터 독립적으로 미토 파지를 억제함을 시사한다

다음으로, 글루코코르티코이드에 의해 유도된 미토콘드리아 및 시냅스 기능 장애가 NIX 상향 조절에 의해 회복되는지 여부를 조사 하였다. mtROS 수준을 측정하기 위해 세포 투과성 미토콘드리아 과산화물 지표인 mitoSOX red를 사용했다. 글루코코르티코이드에 의해 유도된 mtROS의 수준은 해마 뉴런 및 SH-SY5Y 세포에서 각각 PMA 및 NIX 과발현에 의해 감소되었다 (도 26). 미토콘드리아 막 전위를 정량화하는데 사용되는 테트라메틸로다민 에틸 에스테르 (TMRE) 강도는 NIX 상향 조절이 억제된 막 전위를 향상 시켰음을 나타냈다 (도 27). 산화 스트레스 및 감소된 미토콘드리아 막 전위는 궁극적으로 미토콘드리아 단편화를 초래한다. 미토콘드리아 핵분열은 해마 뉴런과 SH-SY5Y 세포에서 글루코코르티코이드에 의해 유의하게 증가했지만 NIX 상향 조절에 의해 역전되었다 (도 28, 29). 미토콘드리아 생물 발생은 환경 및 생리 학적 조건에 의해 에너지 요구에 적응하는 기존의 미토콘드리아의 성장 및 분열로부터 새로운 미토콘드리아를 생성하는 세포 과정이다. 미토콘드리아가 노화되거나 결함이 있는 경우, 소기관 제거는 주로 미토 파지를 통해 발생한다. 따라서, 글루코코르티코이드가 세포 ELISA 키트에서 시트레이트 신타제 활성 분석 키트 및 MitoBiogenesis TM를 사용하여 미토콘드리아 생물 발생에 영향을 미치는지 여부를 측정했다. 두 단백질의 평가는 다음 방법으로 수행하였다. 복합체 IV (COXI)의 서브 유닛 I은 mtDNA- 코딩된 단백질이고, 복합체 II (SDH-A)의 70 kDa 서브 유닛은 nDNA- 코딩된 단백질이다. SDH-A 합성에 대한 COXI 단백질 합성은 미토콘드리아 생발생 및 함량에 대한 정량적 측정이다. 결과는 코티솔이 시트레이트 신타제 활성을 감소시키는 반면 NIX 상향 조절은 이를 회복시키는 것을 보여 주었다. 또한, 코티솔은 COXI / SDH A 비율을 감소 시켰지만 NIX 상향 조절은 이를 역전시켰다. 이 두 실험은 글루코코르티코이드에 의한 NIX 감소가 미토콘드리아 생합성을 억제함을 나타냈다. 산소 소비율 (OCR) 자료에 따르면 글루코코르티코이드는 기저 호흡, 최대 호흡, ATP 생성 및 양성자 누출을 감소 시켰다. 그러나 NIX 상향 조절은 이러한 결과를 개선했다 (그림 30-33). 미토콘드리아 기능 감소는 시냅스 기능 장애 및 아폽토시스의 초기 상태이다. 시냅스 마커, 베지클 재활용 및 전류의 감소는 해마 뉴런의 PMA 전 처리에 따라 제어 수준으로 정상화되었다(그림 34-36). 또한, 해마 뉴런 및 SH-SY5Y 세포의 아폽토시스에서 감소된 수상 돌기 길이는 NIX 상향 조절에 의해 회복되었다. 전반적으로, 미토콘드리아 기능 및 시냅스 항상성에 대한 글루코코르티코이드의 손상 효과는 NIX 상향 조절로 회복되었음을 확인하였다.

2-3. PGC1α-NIX 축을 억제하여 미토파지 손상을 초래하는 글루코코르티코이드 수용체

글루코코르티코이드 처리 하에서 NIX 하향 조절의 분자적 원인을 밝히기 위해, 본 발명자들은 글루코코르티코이드의 병태 생리학적 수준에 의해 주로 활성화 된 글루코코르티코이드 수용체 (GR)에 의한 기여를 미토 파지의 억제와 관련하여 확인 하였다. 해마 및 SH-SY5Y 세포에서, GR의 녹다운은 미토 파지 수준을 회복 시켰으며, 이는 TUNEL 분석 및 미토콘드리아 DNA 손상 분석 결과에 따라 글루코코르티코이드에 의해 감소되었다 (도 37-40). 또한, GR의 녹다운이 두 세포 유형 모두에서 NIX 발현을 회복한다는 것을 확인했다 (도 41). 글루코코르티코이드-유도된 NIX 하향 조절에서 우세한 신호 경로를 결정하기 위해, 핵 수용체 및 공동 조절자와 관련된 유전자를 조사했다. PCR 어레이 데이터는 글루코코르티코이드가 HDAC1/2, NR2C2, NR3C1, PPARGC1A, MED12 / 14 / 17 및 NOTCH2를 포함하는 유전자의 발현을 감소 시켰음을 나타냈다. 이 유전자들 중에서 peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC1α)와 GR의 발현이 유의하게 감소하였다 (도 42). 몇 시간의 글루코코르티코이드 노출은 음성 피드백에 대한 GR 발현을 감소시켜 NR3C1을 감소시키는 것이 합리적인 것으로 알려져 있다. 하향 조절된 유전자 중에서, 본 유전자의 프로모터는 다른 하향 조절된 유전자보다 GR- 결합 영역이 더 많기 때문에 PGC1α가 NIX 조절에 대한 강력한 후보인 것으로 추정하였다. 따라서, 본 발명자들은 PGC1α 프로모터 부위에서 TGTTCT 서열을 포함하여 글루코코르티코이드 반응 요소 (GRE)로 알려진 여러 GR-결합 모티프가 유전자의 첫 번째 코돈의 상류에서 -1000 bp 업스트림인 것으로 결정하였다 (도 43). PGC1α는 많은 전사 인자와 상호 작용하거나 외부 생리적 자극과 미토콘드리아 생물 발생 사이의 직접적인 상관 관계를 제공하는 전사 활성화제이다. 따라서 GR이 PGC1α 작용을 억제하여 미토콘드리아 기능 장애를 유발할 가능성이 있다. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) 분석 결과는 또한 PGC1α 프로모터에 대한 GR의 코티솔 유도 결합을 지지하여 리간드 결합 GR이 PGC1α 발현을 트랜스-리프레스 할 수 있음을 나타낸다 (도 44).

이러한 결과를 토대로, 글루코코르티코이드 처리 하에서 PGC1α의 발현 및 국소화 변화를 평가 하였다. 그 결과 글루코코르티코이드가 PGC1α를 감소 시켰지만 GR의 녹다운이 PGC1α 억제를 개선함을 확인하였다 (도 45, 46). 또한 PGC1α의 핵 전위가 글루코코르티코이드에 의해 현저하게 감소되었으며, 이는 면역 염색 및 세포 내 분획 결과에서 관찰된 바와 같이 GR 녹다운에 의해 증가되었다 (도 47-49). 이러한 결과와 일치하게, PGC1α 과발현은 NIX 발현을 회복 시켰으며, 이는 GR-PGC1α 축이 NIX 조절에 특이적임을 시사한다 (도 50). 마지막으로, PGC1α 상향 조절에 의한 NIX의 회복은 글루코코르티코이드에 의한 미토 파지 억제를 강하게 회복시켰다 (도 51). 따라서, 글루코코르티코이드는 PGC1α 유전자 발현을 트랜스-리프레스 한 GR-의존적 신호 전달을 유도함으로써 해마 및 SH-SY5Y 세포에서 NIX-의존적 미토 파지를 완화시켰다.

2-4. 스트레스 유도 마우스 모델에서의 시냅스 및 인지 기능을 개선을 위한 NIX 상향 조절

스트레스 유도 마우스 모델에 대한 in vivo 실험을 수행하였다. 면역 염색을 사용하여 미토 파지를 평가하기 위해, 뇌 샘플을 LC3 및 TOMM20 항체로 염색하였다. LC3는 기능 장애 미토콘드리아와 미토파고솜 요소를 브릿지한 것인 점에서, LC3과 TOMM20을 사용하였다. NIX 상향 조절은 코르티코스테론의 투여시 LC3과 TOMM20 사이의 감소된 공동-국소화가 현저하게 약화되었기 때문에 억제된 미토 파지를 약화시켰다 (도 52). 미토파지 조절자의 활동에 대한 코르티코스테론의 역할을 평가하였으며 NIX가 선택적으로 하향 조절되는 동안, 다른 요인은 변경되지 않은 것으로 확인되었다 (그림 53). 코르티코스테론은 웨스턴 블로팅 및 면역 형광의 결과에서 볼 수 있듯이 PMA 전처리에 의해 회수된 시냅토피신 및 PSD 95를 포함한 해마에서 시냅스 마커 및 밀도를 감소시켰다 (도 54, 55). 해마의 시냅스 가소성 및 기능 감소는 결국 뉴런 세포 사멸 및 행동 변화에서 정점에 이른다. 코르티코스테론으로 처리된 마우스가 유의미하게 손상된 기억 능력을 보였지만, PMA로 전처리된 생쥐는 손상된 인지 기능이 약화되었음을 보여 주었다 (도 56). 또한, GR 길항제 RU의 전처리는 PGC1α 및 NIX 발현에 대한 글루코코르티코이드의 억제 효과로부터 마우스를 회복시킨다는 것을 확인 하였다 (도 57). 종합하면, 생체 내에서 GR-PGC1α 경로의 활성화를 통해 글루코코르티코이드 치료 하에서 NIX-의존성 미토 파지가 억제됨을 알 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

1. 미토콘드리아에서 NIX 단백질 발현 또는 활성을 증가시키는 물질을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 글루코코르티코이드의 발현을 감소시키는 물질을 포함하는 것인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 글루코코르티코이드에 의한 미토파지의 감소를 억제하는 것인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 NIX 단백질 발현을 증가시키는 물질은 PGC1α 의 발현을 증가시키는 물질인 것인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 NIX 단백질 발현을 증가시키는 물질은 PGC1α 단백질 또는 Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)인 것인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
6. PGC1α 단백질 및 Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)을 유효성분으로 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 다발성 경화증 및 근위축성 측삭 경화증으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 글루코코르티코이드 수용체(GR) 길항제를 추가로 포함하는 것인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
9. 미토콘드리아에서 NIX 단백질 발현을 증가시키는 물질을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
   
10. 미토콘드리아에서 NIX 단백질 발현을 증가시키는 물질을 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료방법.
    
11. 미토콘드리아에서 NIX 단백질 발현을 증가시키는 물질을 검출하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법.

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