KR20220008213A - 에스트로겐을 포함하는 장내 미생물총 변화를 통한 남성의 대장암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
에스트로겐을 포함하는 장내 미생물총 변화를 통한 남성의 대장암 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 에스트로겐, 구체적으로 에스트라디올을 유효성분으로 포함하는 남성에서 대장암 예방 또는 치료용 조성물, 특정 문 또는 속에 속하는 미생물 검출할 수 있는 제제를 포함하는 남성 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 물질 스크리닝용 조성물 및 스크리닝 방법, 남성 피험자에서의 대장암 위험도 예측 또는 진단용 조성물, 키트, 및 정보제공방법에 관한 것으로, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물, 키트 및 정보제공방법은 에스트라디올을 유효성분으로 포함하여 장내 미생물총을 변화시킴으로써 남성 대장암을 예방 또는 치료하는 우수한 효과가 있으며, 특정 미생물을 검출할 수 있는 제제를 이용하여 남성 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 물질을 스크리닝하고 남성 피험자에서의 대장암 위험도를 예측 또는 진단할 수 있는 우수한 효과가 있다.
Description
본 명세서에는 에스트로겐, 구체적으로 에스트라디올을 유효성분으로 포함하는 남성에서 대장암 예방 또는 치료용 조성물, 특정 문 또는 속에 속하는 미생물 검출할 수 있는 제제를 포함하는 남성 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 물질 스크리닝용 조성물 및 스크리닝 방법, 남성 피험자에서의 대장암 위험도 예측 또는 진단용 조성물, 키트, 및 정보제공방법이 개시된다.
위암(colorectal cancer, CRC)는 미국에서 2019년에는 각각 101,420 건과 51,020 건의 새로운 암 케이스 및 암-관련 사망이 추정되는 등 남성 및 여성 모두에서 암 사망의 세 번째 주요 원인이다[Siegel, R. L., Miller, K. D. & Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J. Clin. 69, 7-34. https ://doi.org/10.3322/caac.21551 (2019)]. 바이러스 또는 박테리아 감염에 따른 만성 염증은 대장암(CRC)[Lakatos, P. L. & Lakatos, L. Risk for colorectal cancer in ulcerative colitis: changes, causes and management strategies. World J. Gastroenterol. 14, 3937-3947. https ://doi.org/10.3748/wjg.14.3937 (2008)]을 포함하는, 인간 발암(carcinogenesis)에 관여하는 중요한 위험 요소로 간주되며, 이의 관련성은, 특히 바이러스성 간염 및 간세포 암종[Zamor, P. J., deLemos, A. S. & Russo, M. W. Viral hepatitis and hepatocellular carcinoma: etiology and management. J. Gastrointest. Oncol. 8, 229-242. https ://doi.org/10.21037 /jgo.2017.03.14 (2017)]과 같은 감염 및, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 및 위선암에서 보고되었다[Parsonnet, J. et al. Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma. N. Engl. J. Med. 325, 1127-1131. https ://doi. org/10.1056/NEJM1 99110 17325 1603 (1991)]. 더욱이, 기회 감염균(opportunistic pathogen)은 대장암 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 대장균(Escherichia coli), 스트렙토코커스 갈롤리티커스(Streptococcus gallolyticus)(이전에는 S. bovis로 알려짐), 엔테로보버스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 및 장 독소 생성 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis)(독소 생성 박테리아)는 대장암 발생을 일으키는 원이이 되는 후보 미생물로 간주되어 왔다[Sears, C. L. & Garrett, W. S. Microbes, microbiota, and colon cancer. Cell Host Microbe 15, 317-328. https ://doi.org/10.1016/j.chom.2014.02.007 (2014)]. 또한, 여러 동물 실험 결과로부터 얻은 결과는 이러한 박테리아가 대장암 발생의 원인이되는 미생물일 수 있다[Sears, C. L. & Garrett, W. S. Microbes, microbiota, and colon cancer. Cell Host Microbe 15, 317-328. https ://doi.org/10.1016/j.chom.2014.02.007 (2014)]. 최근 연구에 따르면, F. nucleatum 감염은 대장암 모델에서 바큘로 바이러스 IAP 반복-함유 3 (BIRC3)의 발현을 상향 조절함으로써 5-플루오로우라실에 대한 화학 저항성을 촉진하였다[Zhang, S. et al. Fusobacterium nucleatum promotes chemoresistance to 5-fluorouracil by upregulation of BIRC3 expression in colorectal cancer. J. Exp. Clin. Cancer Res. 38, 14. https ://doi.org/10.1186/s1304 6-018-0985-y (2019)]. 또한, F. nucleatum의 풍부함은 진행 대장암의 환자에서 관찰되는 화학 저항성과 관련이 있을 수 있다[Zhang, S. et al. Fusobacterium nucleatum promotes chemoresistance to 5-fluorouracil by upregulation of BIRC3 expression in colorectal cancer. J. Exp. Clin. Cancer Res. 38, 14. https ://doi.org/10.1186/s1304 6-018-0985-y (2019)]. 그러나, F. nucleatum과 대장암 사이의 명확한 인과관계는 밝혀지지 않았다.
장내 미생물총의 조성은 개인의 식이요법, 항생제 치료, 모계 미생물총(maternal microbiota), 및 유전자형과 같은 많은 요인에 의해 결정된다[Claesson, M. J. et al. Gut microbiota composition correlates with diet and health in the elderly. Nature 488, 178-184. https ://doi.org/10.1038/natur e1131 9 (2012); Martin, F. P. et al. Probiotic modulation of symbiotic gut microbial-host metabolic interactions in a humanized microbiome mouse model. Mol. Syst. Biol. 4, 157. https ://doi.org/10.1038/msb41 00190 (2008); Makivuokko, H. et al. Association between the ABO blood group and the human intestinal microbiota composition. BMC Microbiol. 12, 94. https ://doi.org/10.1186/1471-2180-12-94 (2012)]. 따라서, 인간의 장내 미생물총에 대한 연구를 수행하는 것은 매우 어렵다. 대신, 동일한 제어 환경 및 식이로 수용되고 투여된 유전적으로 균질한 마우스는 조건의 변동성이 적다. 아족시메탄 (AOM, 발암 물질) 및 덱스트란 황산 나트륨 염 (DSS, 화학 콜리토젠(colitogen))으로 처리된 동물에 의해 만들어진 마우스 모델은 대장염 및 대장염-관련 대장암의 분자 병인의 조사에 가장 널리 사용된다[Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S. & Tanaka, T. Sequential observations on the occurrence of preneoplastic and neoplastic lesions in mouse colon treated with azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 95, 721-727. https ://doi.org/10.1111/j.1349-7006.2004.tb032 52.x (2004); Thaker, A. I., Shaker, A., Rao, M. S. & Ciorba, M. A. Modeling colitis-associated cancer with azoxymethane (AOM) and dextran sulfate sodium (DSS). J. Vis. Exp. https ://doi.org/10.3791/4100 (2012)]. 이 동물 모델은 비정상적인 crypt foci (ACF)-선종-선암종 과정(adenoma-carcinoma sequence)의 존재를 기반으로 다단계 종양 진행을 식별하기 위해 잘 확립되었으며, 이를 통해 분자적 변경이 발암 과정에서 평가되었다[De Robertis, M. et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: from pathways to diagnosis and therapy studies. J. Carcinog. 10, 9. https ://doi.org/10.4103/1477-3163.78279 (2011)]. 여러 보고서에 따르면, 장내 미생물총의 조성의 풍부도 및 다양성은 AOM 및/또는 DSS의 처리로 변화한다[Wang, C. Z. et al. Role of intestinal microbiome in American ginseng-mediated colon cancer prevention in high fat diet-fed AOM/DSS mice [corrected]. Clin. Transl. Oncol. Offic. Publ. Fed. Span. Oncol. Soc. Natl. Cancer Inst. Mex. 20, 302-312. https ://doi.org/10.1007/s1209 4-017-1717-z (2018); Zackular, J. P. et al. The gut microbiome modulates colon tumorigenesis. mBio 4, e00692-e1613. https ://doi.org/10.1128/mBio.00692-13 (2013); Ibrahim, A. et al. Colitis-induced colorectal cancer and intestinal epithelial estrogen receptor beta impact gut microbiota diversity. Int. J. Cancer 144, 3086-3098. https ://doi.org/10.1002/ijc.32037 (2019)]. 특히, 4% DSS로 처리된 암컷 C57Bl/6 마우스에서, 락토바실러스 (Lactobacillus) 군의 상대 존재비는 엔테로박테리아새애(Enterobacteriaceae), 아커만시아(Akkermansia) 및 디설포비브리오(Desulfovibrio) 보다 낮았다[Hakansson, A. et al. Immunological alteration and changes of gut microbiota after dextran sulfate sodium (DSS) administration in mice. Clin. Exp. Med. 15, 107-120. https ://doi.org/10.1007/s1023 8-013-0270-5 (2015)].
대장 종양의 발생은 여성보다 남성에 더 빈번한 것으로 알려졌으며[McCashland, T. M., Brand, R., Lyden, E., de Garmo, P. & Project, C. R. Gender differences in colorectal polyps and tumors. Am. J. Gastroenterol. 96, 882-886. https ://doi.org/10.1111/j.1572-0241.2001.3638_a.x (2001)], 성별과 관련된, CRC 발병에서의 차이는, 전세계적으로 존재한다[Kim, S. E. et al. Sex- and gender-specific disparities in colorectal cancer risk. World J. Gastroenterol. 21, 5167-5175. https ://doi.org/10.3748/wjg.v21.i17.5167 (2015)]. 많은 역학 데이터는 여성 성 호르몬인 에스트로겐이 CRC 발생에 대해 보호 효과를 발휘함을 제안해왔다[Gierisch, J. M. et al. Oral contraceptive use and risk of breast, cervical, colorectal, and endometrial cancers: a systematic review. Cancer Epidemiol. Biomark. Prev. Publ. Am. Assoc. Cancer Res. Cosponsored Am. Soc. Prev. Oncol. 22, 1931-1943. https ://doi.org/10.1158/1055-9965.EPI-13-0298 (2013); Chlebowski, R. T. et al. Estrogen plus progestin and colorectal cancer in postmenopausal women. N. Engl. J. Med. 350, 991-1004. https ://doi.org/10.1056/NEJMo a0320 71 (2004)]. 따라서, 폐경기 여성의 경우, CRC 발생 가능성이 높아질 수 있다. 실제로, CRC는 한국에서 65세 초과의 노인 여성의 주요 사망 원인으로 여겨진다[Jung, K. W. et al. Cancer statistics in Korea: incidence, mortality, survival, and prevalence in 2011. Cancer Res. Treat. 46, 109-123. https ://doi.org/10.4143/crt.2014.46.2.109 (2014)]. 흥미롭게도, 새로운 증거는 에스트로겐과 장내 미생물총 사이의 상호작용이 숙주의 미세환경 및 대사에 영향을 미칠 가능성을 제안했다[Tremaroli, V. & Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature 489, 242-249. https://doi.org/10.1038/natur e1155 2 (2012)]. 장내 미생물총은 에스트로겐에 의해 조절되고, 에스트로겐의 수준이 또한 장내 미생물총 조성에 의해 상당히 영향을 받는 것으로 밝혀졌다[Baker, J. M., Al-Nakkash, L. & Herbst-Kralovetz, M. M. Estrogen-gut microbiome axis: physiological and clinical implications. Maturitas 103, 45-53. https ://doi.org/10.1016/j.matur itas.2017.06.025 (2017)]. 동물 모델에서, 양측 난소 절제술 (bilateral ovariectomy (OVX))는 미생물총 장내 불균형(dysbiosis)을 유발한다[Org, E. et al. Sex differences and hormonal effects on gut microbiota composition in mice. Gut Microbes 7, 313-322. https ://doi.org/10.1080/19490 976.2016.12035 02 (2016); Cox-York, K. A. et al. Ovariectomy results in differential shifts in gut microbiota in low versus high aerobic capacity rats. Physiol. Rep. https ://doi.org/10.14814 /phy2.12488 (2015)]. 또한, 장내 미생물총에 의해 생산된 단쇄 지방산 (SCFA)은 대사 신호 분자로 인식되고 이들의 수준은 OVX 랫에서 상당히 감소된 것으로 보고된다[Cox-York, K. A. et al. Ovariectomy results in differential shifts in gut microbiota in low versus high aerobic capacity rats. Physiol. Rep. https ://doi.org/10.14814 /phy2.12488 (2015)]. 인간에서, OVX는 클로스트리디움 볼태애(Clostridium bolteae)의 상대 존재비의 증가와 관련 있는 것으로 보고되었다[Sinha, T. et al. Analysis of 1135 gut metagenomes identifies sex-specific resistome profiles. Gut Microbes 10, 358-366. https ://doi.org/10.1080/19490 976.2018.15288 22 (2019)]. 남성 및 폐경기 여성에서, 전체 소변 내 에스트로겐의 수준은 장내 미생물총의 종 풍부도 및 α-다양성과 강한 상관관계가 있을 수 있다[Flores, R. et al. Fecal microbial determinants of fecal and systemic estrogens and estrogen metabolites: a cross-sectional study. J. Transl. Med. 10, 253. https ://doi.org/10.1186/1479-5876-10-253 (2012)]. 이들 비-난소 전신 에스트로겐은 비-클로스트리디움 목을 포함하는, 클로스트리디움(Clostridia) 강, 및 루미노코카시애(Ruminococcaceae) 과에 속하는 3 종의 속의 분류학적 풍부도와 양의 상관관계가 있었다[Flores, R. et al. Fecal microbial determinants of fecal and systemic estrogens and estrogen metabolites: a cross-sectional study. J. Transl. Med. 10, 253. https ://doi.org/10.1186/1479-5876-10-253 (2012)]. 또한, 비피도박테리아(Bifidobacteria) 수준의 증가 및 클로스트리아새애(Clostridiaceae)의 억제를 포함하는 장내 미생물총의 조성물의 변화는, 에스트로겐 활성을 나타내는 식물-유래 화합물인, 콩 이소클라본과 같은 피토에스트로겐의 투여 시 폐경기 여성에서 관찰되었다[Vieira, A. T., Castelo, P. M., Ribeiro, D. A. & Ferreira, C. M. Influence of oral and gut microbiota in the health of menopausal women. Front. Microbiol. 8, 1884. https ://doi.org/10.3389/fmicb .2017.01884 (2017)].
이전에, 본 발명자들은 AOM/DSS 뮤린 모델에서 CRC의 심각도가 MPO 및 IL-1β와 같은 염증 매개체의 증가된 수준으로 입증된 것과 같이, 암컷 마우스보다 수컷 마우스에서 더 크다는 것을 보고하였다[Lee, S. M. et al. The effect of sex on the azoxymethane/dextran sulfate sodium-treated mice model of colon cancer. J. Cancer Prev. 21, 271-278. https ://doi.org/10.15430 /JCP.2016.21.4.271 (2016).]. E2 (10 mg/kg)는 AOM/DSS 처리된 수컷 ICR 마우스에서 상향 조절된 Nrf2 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2)에 의해 CRC의 유도를 억제하였다[Son, H. J. et al. Effect of estradiol in an azoxymethane/dextran sulfate sodium-treated mouse model of colorectal cancer: implication for sex difference in colorectal cancer development. Cancer Res. Treat. 51, 632-648. https ://doi.org/10.4143/crt.2018.060 (2019).]. 또한, E2 처리는 TNF-α-자극된 인간 여성 정상 상피 CCD841CoN 세포[Son, H. J. et al. 17beta-Estradiol reduces inflammation and modulates antioxidant enzymes in colonic epithelial cells. Korean J. Intern. Med. https ://doi.org/10.3904/kjim.2018.098 (2018).] 및 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)에서 COX-2 또는 iNOS의 발현을 상당히 하향 조절하여, 총체적으로 이의 항-염증 효과를 나타낸다[Song, C. H., Kim, N., Kim, D. H., Lee, H. N. & Surh, Y. J. 17-beta estradiol exerts anti-inflammatory effects through activation of Nrf2 in mouse embryonic fibroblasts. PLoS ONE 14, e0221650. https ://doi.org/10.1371/journ al.pone.02216 50 (2019)].
이에 기초하여, 본 발명자는 성 호르몬이 장내 미생물총 및 이후 CRC의 발병에 영향을 끼칠 수 있다는 가설을 세웠다. 이러한 가설을 평가하기 위해, 본 발명자는 미생물총 변화에 집중하였고, 특히 정상 또는 에스트로겐 처리된 AOM/DSS-처리된 수컷 마우스, 및 난소 절제술을 통해 에스트로겐의 존재가 제거된 암컷 마우스에서 기회 감염균의 상대 존재비에 집중하여, 서로 간의 관련성을 조사할 목적으로 연구를 수행하였다. 그 결과 대장암 수컷 마우스에 에스트라디올 투여 시 장내 미생물총의 조성이 변화하여 대장암을 예방 또는 치료하는 효과를 확인하였다.
본 발명자는 대장암, 구체적으로 남성에서의 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 유효성분으로 에스트라디올을 발굴하고, 에스트라디올 투여 시 장내 미생물총의 조성이 변화함으로써 대장암을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다.
이에, 일 측면에서, 본 발명의 목적은, 남성에서의 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 특정 미생물을 검출함으로써 남성 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 물질 스크린용 조성물 및 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 특정 미생물을 검출함으로써 남성 피험자에서 대장암의 위험도를 예측 또는 진단하기 위한 조성물 및 정보제공방법을 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 에스트라디올, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하는, 남성에서의 대장암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물 및 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 남성 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 물질 스크리닝용 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, (a) 대장암 모델에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 시험 물질을 처리한 대장암 모델에서 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물의 존재비에 대한 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물의 존재비의 비율(F/B) 비율을 측정하는 단계; 를 포함하는, 남성 대장암 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물 및 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 남성 피험자에서의 대장암 위험도 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 상기 조성물을 포함하는, 남성 피험자에서의 대장암 위험도 예측 또는 진단용 키트를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 남성 피험자의 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 게놈 DNA에 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물 및 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 미생물에 특이적인 프라이머를 반응시키는 단계; 및 상기 반응물을 증폭시키는 단계;를 포함하는, 남성 피험자에서의 대장암 위험도 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명은 일 측면에서, AOM/DSS를 투여받아 대장염-관련 대장암(CRC)에 걸린 수컷 마우스에 에스트라디올, 구체적으로 17β-에스트라디올 투여 시, 장내 미생물총에서 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물의 존재비에 대한 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물의 존재비의 비율(F/B 비율)이 감소되고, 알리스티페스(Alistipes) 속에 속하는 미생물의 존재비가 증가하며, 구체적으로 조작 분류 단위(OUT)의 수, 차오 1(Chao 1) 지수, 및 샤넌(Shannon) 지수가 감소하고, 심슨(Simpson) 지수가 증가하는 등 알파 다양성 지수가 변화하며, 부티리비브리오(Butyrivibrio)_g1, 무리바큘라세애(Muribaculaceae)_uc, KE159538_g와 같은 공생 박테리아의 상대 존재비와 슈도플라보니프랙터(Pseudoflavonifractor), 네글렉타(Neglecta)와 같은 기회 감염균의 상대 존재비가 감소하는 등 장내 미생물총을 변화시킴을 확인하였는바, 에스트라디올을 유효성분으로 포함하는 조성물은 남성에서 대장암을 예방 또는 치료하는 우수한 효과가 있고, 상기와 같은 미생물을 검출할 수 있는 제제를 이용하여 남성 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 물질을 스크리닝하고 남성 피험자에서의 대장암 위험도를 예측 또는 진단할 수 있는 우수한 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 장내 미생물총 변화에 대한 에스트라디올(E2)에 따른 성별 및 대장암의 역할을 평가하기 위한 실험 계획을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 문(phylum) 및 과(family) 수준에서 샘플 클러스터링 및 장내 미생물총 조성 결과를 나타낸 도이다. 도 2의 데이터는 평균 ± SEM으로 표현되며, Whiskers는 최소 및 최대값을 보여준다. 도 2에서 약어는 다음과 같다: Con, 대조군(control); E2, 17-β에스트라디올(17-β Estradiol); OVX, 난소 절제술을 받은 군(ovariectomized); AOM, 아족시메탄(azoxymethane); DSS, 덱스트란 황산 나트륨 염(dextran sulfate sodium salt).
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 각 그룹의 장내 미생물총의 알파 다양성 결과를 나타낸 도이다. 도 3의 데이터는 평균 ± SEM으로 표현되고, Whiskers는 최소 및 최대값을 보여주며, Kruskal-Wallis 시험에 대한 p-값이 도 3에 지정되어 있다. 도 3에서 약어는 다음과 같다: Con, 대조군(control); E2, 17-β 에스트라디올(17-β Estradiol); OVX, 난소 절제술을 받은 군(ovariectomized); AOM, 아족시메탄(azoxymethane); DSS, 덱스트란 황산 나트륨 염(dextran sulfate sodium salt).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 각 그룹의 선형 판별 분석 (LDA) 효과 크기 (LEfSe) 분석 결과로서, 성별 및 대장암에 대한 에스트라디올에 의한 장내 미생물총의 풍부 비율의 변화를 나타낸 도이다. 도 4에서 a 내지 c는 그룹 1, d 및 e는 그룹 2에서 LEfSe 분석으로 존재비에서 유의한 차이를 가진 종 수준의 막대 그래프를 보여주고, 색깔 막대는 각 그룹 또는 군에서 풍부한 유전자의 LDA 점수를 보여준다: (a, c, d) 파란색 (수컷 대조군 마우스), (a) 하늘색 (E2-처리된 수컷 마우스), (b, c) 빨간색 (암컷 대조군 마우스), (b) 분홍색 (난소 절제된 암컷 마우스), 및 (d,e) 보라색 (AOM/DSS-유도 CRC). 또한, 도 4에서 속명에 대한 각 색깔은 각 속의 특징을 나타낸다: 공생 박테리아의 경우 노란색, 기회 병원균의 경우 주황색, 특징지어지지 않은 박테리아의 경우 초록색. 도 4의 (f)는 각 비교 군에서 LEfSe 결과에 기초한 기회 병원체에 대한 공생 박테리아의 비율을 나타낸다. 도 4에서 약어는 다음과 같다: Con, 대조군(control); E2, 17-β 에스트라디올(17-β Estradiol); OVX, 난소 절제술을 받은 군(ovariectomized); AOM, 아족시메탄(azoxymethane); DSS, 덱스트란 황산 나트륨 염(dextran sulfate sodium salt); N, 수(number); NC, 계산되지 않음(not calculated).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 각 그룹의 장유형 클러스터링 결과를 나타낸 도이다. 도 5의 최적의 클러스터 수는 Calinski-Harabasz (CH) 지수 값을 최대화하여 결정되었으며, 도 5의 (c) 및 (d) 각각은 (c) 그룹 1 및 (d) 그룹 2 마우스 샘플의 각 장유형에서 우세 속을 보여준다. 도 5의 (e) 및 (f)는 알리스티페스(Alistipes) 및 (g) 및 (h)는 박테로이데스(Bacteroides)의 상대 존재비를, 도 5의 (i) 및 (j)는 그룹 1 및 (f), (h) 및 (j)는 그룹 2의 F/B 비율을 나타낸다. 도 5의 데이터는 평균 ± SEM로 표현되고, Whiskers는 최소 및 최대값을 보여주며, Kruskal-Wallis 시험에 대한 p-값은 그림에 지정되어 있다. 도 5에서 약어는 다음과 같다: Con, 대조군(control); E2, 17-β 에스트라디올(17-β Estradiol); OVX, 난소 절제술을 받은 군(ovariectomized); AOM, 아족시메탄(azoxymethane); DSS, 덱스트란 황산 나트륨 염(dextran sulfate sodium salt).
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 문(phylum) 및 과(family) 수준에서 샘플 클러스터링 및 장내 미생물총 조성 결과를 나타낸 도이다. 도 2의 데이터는 평균 ± SEM으로 표현되며, Whiskers는 최소 및 최대값을 보여준다. 도 2에서 약어는 다음과 같다: Con, 대조군(control); E2, 17-β에스트라디올(17-β Estradiol); OVX, 난소 절제술을 받은 군(ovariectomized); AOM, 아족시메탄(azoxymethane); DSS, 덱스트란 황산 나트륨 염(dextran sulfate sodium salt).
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 각 그룹의 장내 미생물총의 알파 다양성 결과를 나타낸 도이다. 도 3의 데이터는 평균 ± SEM으로 표현되고, Whiskers는 최소 및 최대값을 보여주며, Kruskal-Wallis 시험에 대한 p-값이 도 3에 지정되어 있다. 도 3에서 약어는 다음과 같다: Con, 대조군(control); E2, 17-β 에스트라디올(17-β Estradiol); OVX, 난소 절제술을 받은 군(ovariectomized); AOM, 아족시메탄(azoxymethane); DSS, 덱스트란 황산 나트륨 염(dextran sulfate sodium salt).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 각 그룹의 선형 판별 분석 (LDA) 효과 크기 (LEfSe) 분석 결과로서, 성별 및 대장암에 대한 에스트라디올에 의한 장내 미생물총의 풍부 비율의 변화를 나타낸 도이다. 도 4에서 a 내지 c는 그룹 1, d 및 e는 그룹 2에서 LEfSe 분석으로 존재비에서 유의한 차이를 가진 종 수준의 막대 그래프를 보여주고, 색깔 막대는 각 그룹 또는 군에서 풍부한 유전자의 LDA 점수를 보여준다: (a, c, d) 파란색 (수컷 대조군 마우스), (a) 하늘색 (E2-처리된 수컷 마우스), (b, c) 빨간색 (암컷 대조군 마우스), (b) 분홍색 (난소 절제된 암컷 마우스), 및 (d,e) 보라색 (AOM/DSS-유도 CRC). 또한, 도 4에서 속명에 대한 각 색깔은 각 속의 특징을 나타낸다: 공생 박테리아의 경우 노란색, 기회 병원균의 경우 주황색, 특징지어지지 않은 박테리아의 경우 초록색. 도 4의 (f)는 각 비교 군에서 LEfSe 결과에 기초한 기회 병원체에 대한 공생 박테리아의 비율을 나타낸다. 도 4에서 약어는 다음과 같다: Con, 대조군(control); E2, 17-β 에스트라디올(17-β Estradiol); OVX, 난소 절제술을 받은 군(ovariectomized); AOM, 아족시메탄(azoxymethane); DSS, 덱스트란 황산 나트륨 염(dextran sulfate sodium salt); N, 수(number); NC, 계산되지 않음(not calculated).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 각 그룹의 장유형 클러스터링 결과를 나타낸 도이다. 도 5의 최적의 클러스터 수는 Calinski-Harabasz (CH) 지수 값을 최대화하여 결정되었으며, 도 5의 (c) 및 (d) 각각은 (c) 그룹 1 및 (d) 그룹 2 마우스 샘플의 각 장유형에서 우세 속을 보여준다. 도 5의 (e) 및 (f)는 알리스티페스(Alistipes) 및 (g) 및 (h)는 박테로이데스(Bacteroides)의 상대 존재비를, 도 5의 (i) 및 (j)는 그룹 1 및 (f), (h) 및 (j)는 그룹 2의 F/B 비율을 나타낸다. 도 5의 데이터는 평균 ± SEM로 표현되고, Whiskers는 최소 및 최대값을 보여주며, Kruskal-Wallis 시험에 대한 p-값은 그림에 지정되어 있다. 도 5에서 약어는 다음과 같다: Con, 대조군(control); E2, 17-β 에스트라디올(17-β Estradiol); OVX, 난소 절제술을 받은 군(ovariectomized); AOM, 아족시메탄(azoxymethane); DSS, 덱스트란 황산 나트륨 염(dextran sulfate sodium salt).
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
일 측면에서, 본 발명은 에스트라디올, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하는, 남성에서의 대장암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따른 에스트라디올(estradiol)은 성호르몬인 동시에 주된 에스트로겐 (estrogen)이며 주로 여성에게서 나타나는 호르몬으로서, 여성에서만 나타나는 것은 아니며, 남성에서는 테스토스테론의 대사산물로 생성된다. 남성과 마찬가지로 여성에서도 테스토스테론이 생성되지만 여성은 아로마티아제(aromatiase)라는 효소를 가지고 있어 테스토스테론에서 에스트라디올로의 변환이 가능하다. 본 발명의 일 측면에 따른 에스트라디올은 구체적으로 17β-에스트라디올(17β-estradiol, E2)일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, "약학적으로 허용 가능"이란 통상의 의약적 복용량(medicinal dosage)으로 이용할 때 상당한 독성 효과를 피함으로써, 동물, 더 구체적으로는 인간에게 사용할 수 있다는 정부 또는 이에 준하는 규제 기관의 승인을 받을 수 있거나 승인 받거나, 또는 약전에 열거되거나 기타 일반적인 약전에 기재된 것으로 인지되는 것을 의미한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, "약학적으로 허용 가능한 염"은 약학적으로 허용 가능하고 모 화합물(parent compound)의 바람직한 약리 활성을 갖는 본 발명의 일측면에 따른 염을 의미한다. 상기 염은 (1) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산으로 형성되거나; 또는 아세트산, 프로파이온산, 헥사노산, 시클로펜테인프로피온산, 글라이콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일) 벤조산, 신남산, 만델산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 1,2-에테인-디설폰산, 2-히드록시에테인설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄퍼설폰산, 4-메틸바이시클로 [2,2,2]-oct-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로파이온산, 트리메틸아세트산, tert-부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가염(acid addition salt); 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 프로톤이 치환될 때 형성되는 염을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, "이성질체"는 특히 광학 이성질체(optical isomers)(예를 들면, 본래 순수한 거울상 이성질체(essentially pure enantiomers), 본래 순수한 부분 입체 이성질체(essentially pure diastereomers) 또는 이들의 혼합물)뿐만 아니라, 형태 이성질체(conformation isomers)(즉, 하나 이상의 화학 결합의 그 각도만 다른 이성질체), 위치 이성질체(position isomers)(특히, 호변이성체(tautomers)) 또는 기하 이성질체(geometric isomers)(예컨대, 시스-트랜스 이성질체)를 포함한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, "수화물(hydrate)"은 물이 결합되어 있는 화합물을 의미하며, 물과 화합물 사이에 화학적인 결합력이 없는 내포 화합물을 포함하는 광범위한 개념이다.
본 발명의 일 측면에 있어서, "용매화물"은 용질의 분자나 이온과 용매의 분자나 이온 사이에 생긴 고차의 화합물을 의미한다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 남성에서의 대장암 예방 또는 치료용일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 측면에 따른 대장암은 대장염(colitis) 관련 대장암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 따른 남성은 장내 미생물총에서 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물의 존재비에 대한 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물의 존재비의 비율(F/B 비율)이 정상 대조군에 비하여 높을 수 있다. 본 발명의 일 측면에 따른 박테로데테스(Bacterodetes) 문 또는 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물은 인간의 미생물총을 구성하는 가장 흔한 박테리아 문(phyla)로서, F/B 비율은 다른 미생물총 군집 간을 비교하는 대표적인 지수로서 사용되었으며, F/B 비율이 낮을수록 건강한 상태를 의미한다[Mariat, D. et al. The firmicutes/bacteroidetes ratio of the human microbiota changes with age. BMC Microbiol. 9, 123. https ://doi.org/10.1186/1471-2180-9-123 (2009); Turnbaugh, P. J. et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature 444, 1027-1031. https ://doi.org/10.1038/natur e0541 4 (2006)]. 또한, F/B 비율의 증가가 대장암 환자에서 관찰되었으며, 이는 장내 세균 불균형(intestinal dysbiosis)의 중요한 마커이다[Gagniere, J. et al. Gut microbiota imbalance and colorectal cancer. World J. Gastroenterol. 22, 501-.518. https ://doi.org/10.3748/wjg.v22.i2.501 (2016); Lucas, C., Barnich, N. & Nguyen, H. T. T. Microbiota, inflammation and colorectal cancer. Int. J. Mol. Sci. 1, 8. https ://doi.org/10.3390/ijms1 80613 10 (2017).]. 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 상기 남성의 장내 미생물총에서 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물의 존재비에 대한 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물의 존재비의 비율(F/B 비율)을 감소시키는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 성별 및 에스트로겐의 존부의 차이로 구분되는 샘플에서 F/B 비율의 유의한 차이는 관찰되지 않은 반면, AOM/DSS 투여로 대장암 유발된 수컷 군에 비하여 이와 같은 수컷 군에 에스트라디올을 투여한 군에서 F/B 비율이 유의하게 감소함을 확인하였다(실험예 1 및 도 2). 이를 통해 남성 대장암 환자에서 에스트라디올 투여가 F/B 비율을 감소시켜 장내 세균 불균형을 감소시킴으로써 대장암을 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 일 측면에 따른 남성은 장내 미생물총에서 알리스티페스(Alistipes) 속에 속하는 미생물의 존재비가 정상 대조군에 비하여 낮을 수 있다. 또한, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 상기 남성의 장내 미생물총에서 알리스티페스(Alistipes) 속에 속하는 미생물의 존재비를 증가시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 수컷 정상 대조군과 비교할 때 AOM/DSS 투여로 대장암이 유발된 수컷 대장암 군에서 알리스티페스(Alistipes) 속의 존재비는 감소했으나, 상기 수컷 대장암 군에 에스트라디올 투여 시 상기 알리스티페스(Alistipes) 속의 존재비는 유의하게 증가함을 확인하였다(실험예 1 및 도 2).
본 발명의 일 측면에 따른 남성의 장내 미생물총은 정상 대조군에 비하여 높은 조작 분류 단위(OUT, operational taxonomic unit)의 수, 정상 대조군에 비하여 높은 차오 1(Chao 1) 지수, 정상 대조군에 비하여 높은 샤넌(Shannon) 지수 및 정상 대조군에 비하여 낮은 심슨(Simpson) 지수로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 알파 다양성 지수를 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 상기 남성의 장내 미생물총에서 조작 분류 단위(OUT)의 수의 감소, 차오 1(Chao 1) 지수의 감소, 샤넌(Shannon) 지수의 감소 및 심슨(Simpson) 지수의 증가로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 알파 다양성 지수를 변화시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 수컷 정상 대조군과 비교할 때 AOM/DSS 투여로 대장암이 유발된 수컷 대장암 군에서 OUT의 수, 차오1 지수 및 샤넌(Shannon) 지수가 높고 심슨(Simpson) 지수가 낮으나, 상기 수컷 대장암 군에 에스트라디올 투여 시 OUT의 수, 차오1 지수 및 샤넌(Shannon) 지수가 감소하고 심슨(Simpson) 지수가 증가하는 등 알파 다양성 지수가 변함을 확인하였다(실험예 2 및 도 3).
본 발명의 일 측면에 따른 남성은 장내 미생물총에서 부티리비브리오(Butyrivibrio)_g1, 무리바큘라세애(Muribaculaceae)_uc, 및 KE159538_g로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공생 박테리아(commensal bacteria)의 상대 존재비; 또는 슈도플라보니프랙터(Pseudoflavonifractor) 및 네글렉타(Neglecta)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기회 감염균(oppotunistic pathogen)의 상대 존재비가 정상 대조군에 비하여 높을 수 있다. 또한, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 상기 남성의 장내 미생물총에서 부티리비브리오(Butyrivibrio)_g1, 무리바큘라세애(Muribaculaceae)_uc, 및 KE159538_g로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공생 박테리아의 상대 존재비; 또는 슈도플라보니프랙터(Pseudoflavonifractor) 및 네글렉타(Neglecta)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기회 감염균의 상대 존재비를 감소시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 수컷 정상 대조군에 비하여 대장암 유발된 수컷 대장암 군에서 부티리비브리오(Butyrivibrio)_g1, 무리바큘라세애(Muribaculaceae)_uc, 및 KE159538_g를 포함하는 공생 박테리아(commensal bacteria), 및 슈도플라보니프랙터(Pseudoflavonifractor) 및 네글렉타(Neglecta)를 포함하는 기회 감염균(oppotunistic pathogen)의 상대 존재비가 높았으나, 상기 수컷 대장암 군에 에스트라디올 투여 시 상기 공생 박테리아 및 기회 감염균의 상대 존재비가 감소함을 확인하였다(실험예 3 및 도 4).
다른 측면에서, 본 발명은 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물 및 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 남성 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 물질 스크리닝용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따른 남성 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 물질 스크리닝용 조성물은 알리스티페스(Alistipes) 속에 속하는 미생물; 부티리비브리오(Butyrivibrio)_g1, 무리바큘라세애(Muribaculaceae)_uc, 및 KE159538_g로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공생 박테리아(commensal bacteria) 미생물; 또는 슈도플라보니프랙터(Pseudoflavonifractor) 및 네글렉타(Neglecta)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기회 감염균(oppotunistic pathogen) 미생물;을 검출할 수 있는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 검출할 수 있는 제제는 샘플 내에서 남성 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 물질을 스크리닝하기 위한 미생물인 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물; 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물; 알리스티페스(Alistipes) 속에 속하는 미생물; 부티리비브리오(Butyrivibrio)_g1, 무리바큘라세애(Muribaculaceae)_uc, 및 KE159538_g로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공생 박테리아(commensal bacteria) 미생물; 또는 슈도플라보니프랙터(Pseudoflavonifractor) 및 네글렉타(Neglecta)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기회 감염균(oppotunistic pathogen) 미생물의 존재를 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 미생물에 특이적으로 존재하는 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 미생물 검출 제제는 항체일 수 있으며, 항원-항체 반응을 기반으로 한 면역학적 방법을 사용하여 해당 미생물을 검출할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크 테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence activated cell sorter), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 미생물을 검출할 수 있는 제제는 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물; 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물; 알리스티페스(Alistipes) 속에 속하는 미생물; 부티리비브리오(Butyrivibrio)_g1, 무리바큘라세애(Muribaculaceae)_uc, 및 KE159538_g로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공생 박테리아(commensal bacteria) 미생물; 또는 슈도플라보니프랙터(Pseudoflavonifractor) 및 네글렉타(Neglecta)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기회 감염균(oppotunistic pathogen) 미생물에 특이적인 프라이머일 수 있다. 상기 프라이머란, 주형 가닥에 상보적인 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 프라이머는 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물; 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물; 알리스티페스(Alistipes) 속에 속하는 미생물; 부티리비브리오(Butyrivibrio)_g1, 무리바큘라세애(Muribaculaceae)_uc, 및 KE159538_g로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공생 박테리아(commensal bacteria) 미생물; 또는 슈도플라보니프랙터(Pseudoflavonifractor) 및 네글렉타(Neglecta)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기회 감염균(oppotunistic pathogen) 미생물의 16S rRNA를 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다. 상기 16s rRNA는, 원핵생물 리보솜의 30S 소단위체를 구성하고 있는 rRNA로, 염기서열이 대부분이 상당히 보존되어 있는 한편, 일부 구간에서는 높은 염기서열 다양성이 나타난다. 특히 동종 간에는 다양성이 거의 없는 반면에 타종 간에는 다양성이 나타나므로 16S rRNA의 서열을 비교하여 원핵생물을 유용하게 동정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 대장암 유발된 수컷 대장암 군에 에스트라디올 투여 시, 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물의 존재비에 대한 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물의 존재비의 비율(F/B 비율)이 유의하게 감소하고; 알리스티페스(Alistipes) 속의 존재비는 유의하게 증가하며; OUT의 수, 차오1 지수 및 샤넌(Shannon) 지수가 감소하고 심슨(Simpson) 지수가 증가하는 등 알파 다양성 지수가 변하고; 상기 공생 박테리아 및 기회 감염균의 상대 존재비가 감소하는바, 상기 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 조성물은 남성 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 물질을 빠르고 간단하게 스크리닝할 수 있음을 알 수 있었다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 대장암 모델에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 시험 물질을 처리한 대장암 모델에서 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물의 존재비에 대한 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물의 존재비의 비율(F/B) 비율을 측정하는 단계;를 포함하는, 남성 대장암 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 박테로데테스 문, 퍼미큐티스 문, F/B 비율에 대한 설명은 상술한 바와 같다. 또한, 상기 남성 대장암 예방 또는 치료하기 위한 물질 스크리닝용 조성물에 대한 설명은 상기 스크리닝 방법에 적용될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 대장암 모델은 동물 대장암 모델일 수 있고, 구체적으로 대장암이 유발된 마우스, 래트, 기니피그 및 햄스터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 설치류일 수 있으나, 시험 물질 처리 전후 장내 미생물총 분석을 수행할 수 있는 동물 모델이라면 그 종류는 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 따른 스크리닝 방법은 상기 (b) 단계의 F/B 비율을 측정한 결과 F/B 비율이 감소한 경우, 상기 시험 물질을 남성 대장암 예방 또는 치료용 물질로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 스크리닝 방법은 상기 (a) 단계의 시험 물질을 처리한 대장암 모델에서 알리스티페스(Alistipes) 속에 속하는 미생물의 존재비; 장내 미생물총에서의 조작 분류 단위(OUT)의 수, 차오 1(Chao 1) 지수, 샤넌(Shannon) 지수 및 심슨(Simpson) 지수로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 알파 다양성 지수; 부티리비브리오(Butyrivibrio)_g1, 무리바큘라세애(Muribaculaceae)_uc, 및 KE159538_g로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공생 박테리아의 상대 존재비; 또는 슈도플라보니프랙터(Pseudoflavonifractor) 및 네글렉타(Neglecta)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기회 감염균의 상대 존재비;를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 스크리닝 방법은 측정 결과 상기 알리스티페스(Alistipes) 속에 속하는 미생물의 존재비가 증가하거나; 조작 분류 단위(OUT)의 수의 감소, 차오 1(Chao 1) 지수의 감소, 샤넌(Shannon) 지수의 감소 및 심슨(Simpson) 지수의 증가로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 알파 다양성 지수가 변화하거나; 부티리비브리오(Butyrivibrio)_g1, 무리바큘라세애(Muribaculaceae)_uc, 및 KE159538_g로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공생 박테리아의 상대 존재비가 감소하거나; 또는 슈도플라보니프랙터(Pseudoflavonifractor) 및 네글렉타(Neglecta)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기회 감염균의 상대 존재비가 감소한 경우, 상기 시험 물질을 남성 대장암 예방 또는 치료용 물질로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물 및 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 남성 피험자에서의 대장암 위험도 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다. 상기 박테로데테스(Bacterodetes) 문, 퍼미큐티스(Firmicutes) 문, 미생물을 검출할 수 있는 제제, 대장암에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
본 발명의 일 측면에 따른 “대장암 예측"이란 피험자에 대하여 대장암이 발병할 가능성이 있는지, 대장암이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 대장암의 원인인자가 무엇인지, 또는 대장암이 이미 발병하였는지 여부를 예측 또는 진단하는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 일 측면에서, "대장암 진단"이란 피험자에 대하여 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명의 일 측면에 따른 목적상, 진단은 대장암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명의 일 측면에 따른 조성물, 키트 또는 방법은 임의의 특정 환자에 대한 대장암 발병 위험도가 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물, 키트 또는 방법은 대장암을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 남성 피험자에서의 대장암 위험도 예측 또는 진단용 조성물은 알리스티페스(Alistipes) 속에 속하는 미생물; 부티리비브리오(Butyrivibrio)_g1, 무리바큘라세애(Muribaculaceae)_uc, 및 KE159538_g로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공생 박테리아(commensal bacteria) 미생물; 또는 슈도플라보니프랙터(Pseudoflavonifractor) 및 네글렉타(Neglecta)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기회 감염균(oppotunistic pathogen) 미생물;을 검출할 수 있는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 검출할 수 있는 제제는 샘플 내에서 남성 피험자의 대장암 위험도를 예측 또는 진단하기 위한 미생물인 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물; 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물; 알리스티페스(Alistipes) 속에 속하는 미생물; 부티리비브리오(Butyrivibrio)_g1, 무리바큘라세애(Muribaculaceae)_uc, 및 KE159538_g로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공생 박테리아(commensal bacteria) 미생물; 또는 슈도플라보니프랙터(Pseudoflavonifractor) 및 네글렉타(Neglecta)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기회 감염균(oppotunistic pathogen) 미생물의 존재를 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 미생물에 특이적으로 존재하는 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 대장암 유발된 수컷 대장암 군은 수컷 정상 대조군 군에 비하여 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물의 존재비에 대한 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물의 존재비의 비율(F/B 비율)이 높고; 알리스티페스(Alistipes) 속의 존재비가 낮으며; OUT의 수, 차오1 지수 및 샤넌(Shannon) 지수가 높고 심슨(Simpson) 지수가 낮은 등의 알파 다양성 지수를 가지고; 상기 공생 박테리아 및 기회 감염균의 상대 존재비가 높은바, 상기 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 조성물은 남성 피험자에서 대장암 위험도를 빠르고 간단하게 예측 또는 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 남성 피험자에서의 대장암 위험도 예측 또는 진단용 조성물을 포함하는, 남성 피험자에서의 대장암 위험도 예측 또는 진단용 키트를 제공한다. 상기 남성 피험자에서의 대장암 위험도 예측 또는 진단용 조성물에 대한 설명은 상기 키트에 적용될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 남성 피험자에서의 대장암 위험도 예측 또는 진단용 키트는 키트는 피험자의 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 소변 또는 대변 샘플에 적용되는 것일 수 있고, 구체적으로 상기 키트는 비침습적 방법으로 남성 피험자에서의 대장암의 위험도를 예측 또는 진단할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 키트는 피험자의 샘플 채취를 위한 흡수성 패드, 채변 스틱, 면봉, 스포이드, 스푼, 스왑 및 이쑤시개로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 샘플 채취용 포집 기구를 추가로 포함할 수 있으나, 샘플을 포집할 수 있는 것이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 키트는 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 설명서에는 피험자의 샘플로부터 얻어진 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물의 존재비에 대한 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물의 존재비의 비율(F/B 비율)이 정상 대조군 샘플에 비하여 높거나; 알리스티페스(Alistipes) 속의 존재비가 낮으며; OUT의 수, 차오1 지수 및 샤넌(Shannon) 지수가 정상 대조군 샘플에 비하여 높고 심슨(Simpson) 지수가 정상 대조군 샘플에 비하여 낮은 등의 알파 다양성 지수를 가지거나; 부티리비브리오(Butyrivibrio)_g1, 무리바큘라세애(Muribaculaceae)_uc, 및 KE159538_g로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공생 박테리아(commensal bacteria) 미생물, 또는 슈도플라보니프랙터(Pseudoflavonifractor) 및 네글렉타(Neglecta)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기회 감염균(oppotunistic pathogen) 미생물의 상대 존재비가 정상 대조군 샘플에 비하여 높으면 대장암을 예측 또는 진단하는 것이 기재될 수 있으며, 또는 남성 피험자에서의 대장암의 위험도를 예측 또는 진단하기 위하여 피험자의 샘플을 채취하라는 것이 기재될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 남성 피험자의 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 게놈 DNA에 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물 및 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 미생물에 특이적인 프라이머를 반응시키는 단계; 및 상기 반응물을 증폭시키는 단계;를 포함하는, 남성 피험자에서의 대장암 위험도 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다. 상기 남성 피험자에서의 대장암 위험도 예측 또는 진단용 조성물 또는 키트에 대한 설명은 상기 정보제공방법에 적용될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 정보제공방법은 상기 추출된 게놈 DNA에 알리스티페스(Alistipes) 속에 속하는 미생물; 부티리비브리오(Butyrivibrio)_g1, 무리바큘라세애(Muribaculaceae)_uc, 및 KE159538_g로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공생 박테리아(commensal bacteria) 미생물; 또는 슈도플라보니프랙터(Pseudoflavonifractor) 및 네글렉타(Neglecta)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기회 감염균(oppotunistic pathogen) 미생물에 특이적인 프라이머를 반응시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 게놈 DNA 추출 단계의 상기 피험자의 샘플은 남성 대장암 환자 또는 대장암이 예상되는 남성의 몸에서 채취된 것으로, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장 타액 또는 소변과 같은 샘플 등을 포함할 수 있고, 구체적으로 상기 샘플은 피험자의 소변 또는 대변일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 게놈 DNA 추출은 당업계에 알려진 일반적인 기술을 적용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 정보제공방법은 상기 반응물을 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 반응물 증폭 단계에서, 반응물을 증폭시키는 방법은 당업계에 알려진 일반적인 증폭 기술들, 예를 들어 중합효소 연쇄반응, SYBR 실시간 PCR, 역전사-중합효소 연쇄반응, 멀티플렉스 PCR, 터치다운 PCR, 핫 스타트 PCR, 네스티드 PCR, 부스터 PCR, 실시간 PCR, 분별 디스플레이 PCR, cDNA 말단의 신속 증폭, 인버스 PCR, 벡토레트 PCR, TAIL-PCR, 리가아제 연쇄 반응, 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제, 타깃 염기서열의 선택적 증폭 반응을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 정보제공방법은 상기 증폭 단계 후 상기 증폭 산물의 양을 정상 대조군 시료의 증폭산물과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 동물 및 실험 설계
3 및 4주령 암컷 및 수컷 ICR 마우스 (Orient Co., Ltd., Seoul, Korea)를 23℃에서 케이지에 보관하고 특정 병원균 없는 조건에서 12/12-h 명/암 주기에 적용하였다. 실험 설계는 도 1과 같다. 실험을 (1) 그룹 1로서 성별 및 OVX 군, 및 (2) 그룹 2로서 수컷에서의 대장암 군의 2 카테고리로 나누어서 모델에서 수행하였다. 그룹 1은 또한 4개의 하위그룹으로 나누었다: (1) 정상 수컷 대조군 마우스(Male_Con) (n = 5), (2) E2 투여된 수컷 마우스(Male_E2) (n = 12), (3) 정상 암컷 대조군 마우스(Female_Con) (n = 11), 및 (4) 난소 절제(OVX) 암컷 마우스(Female_OVX) (n = 7) (도 1a). 유사하게, 그룹 2를 3개의 하위그룹으로 나누었다: (1) 정상 수컷 대조군 마우스(Male_Con) (n = 5), (2) AOM/DSS-처리된 수컷 마우스(Male_AOM/DSS) (n = 12), 및 (3) E2 보충된 AOM/DSS-처리 수컷 마우스(Male_AOM/DSS/E2) (n = 12) (도 1b).
1주일의 순응 후, 내인성 여성 성 호르몬의 제거를 통해 폐경기 동안의 생리학을 모사할 수 있는 동물 모델을 생성하기 위해 4주령 암컷 마우스를 난소 절제술을 수행하였다. 정상 암컷 대조군 마우스는 위약 수술(sham operation)을 수행하였다. E2 (10 mg/kg; Sigma-Aldrich, E8876)를 올리브오일에 용해시키고 Male_E2 마우스 군에 7일 동안 매일 E2를 복강 내 주사하였다. Male_E2 군을 제외하고, 다른 군들에는 비히클로서 올리브오일을 주사하였다.
대장염-관련 대장암(CRC)을 유도하기 위해, 5주령 수컷 마우스에 AOM (10 mg/kg; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 복강내 주사하고 2.5% (w/v) DSS (MP Biomedicals, Aurora, OH, USA)를 AOM 주사 후 1주 후부터 7일 동안 식수를 통해 처리하였다[Yum, H. W. et al. Oligonol inhibits dextran sulfate sodium-induced colitis and colonic adenoma formation in mice. Antioxid. Redox Signal. 19, 102-114. https ://doi.org/10.1089/ars.2012.4626 (2013)]. E2-보충 마우스는 7일 동안 올리브오일에 용해된 E2를 복강 내 주사하였다. DSS 소비 시에 주사를 투여하였다. 15개의 별개 케이지에서 59마리 수컷 및 암컷 마우스 각각으로부터 배설물을 새로 수집하였다. 모든 배설물 샘플을 액체 질소로 즉시 동결하고 -80℃에서 보관하였다. 동물들은 CO2 질식에 의해 안락사되었다 (도 1). Son, H. J. et al 및 Song, C. H. et al.에서 사용한 실험 세트[Son, H. J. et al. Effect of estradiol in an azoxymethane/dextran sulfate sodium-treated mouse model of colorectal cancer: implication for sex difference in colorectal cancer development. Cancer Res. Treat. 51, 632-648. https ://doi.org/10.4143/crt.2018.060 (2019)][Song, C. H. et al. Effects of 17beta-estradiol on colorectal cancer development after azoxymethane/dextran sulfate sodium treatment of ovariectomized mice. Biochem. Pharmacol. 164, 139-151. https ://doi.org/10.1016/j.bcp.2019.04.011 (2019)]의 대변을 취하여 하기 실시예들 및 실험예들을 수행하였다. 마우스는 선적 그룹에서 무작위적으로 분류되었다. 모든 마우스는 필터 상단 케이지의 동일한 방에서, 케이지 당 3 내지 5 마리의 마우스가 수용되었다. 마우스를 마크하여 개별 마우스가 실험 기간동안 추적될 수 있게 하였다. 모든 실험 절차는 분당서울대학교의 동물 보호 이용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다 (BA1310-139/091-01). 절차는 ARRIVE (Animals in Research: Reporting of in Vivo Experiments) 가이드라인에 따라 수행되었다.
[실시예 2] DNA 추출 및 16S rRNA 유전자의 메타게놈 시퀀싱
상기 실시예 1에서 수득한 대변으로부터 게놈 DNA를 준비한 후, 각 그룹 및 하위그룹에서의 장내 미생물총의 차이를 확인하기 위해 고-처리량 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다.
구체적으로, 게놈 DNA를 QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, United States)를 사용하여 제조사의 권장사항에 따라 동결 대변 샘플로부터 추출하였다. PCR 증폭을 추출된 DNA의 16S rRNA 유전자의 V3 내지 V4 영역을 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 수행하여 메타게놈 시퀀싱을 수행하였으며, 이는 다음과 같다[Lee, S. M. et al. Gut microbiota and butyrate level changes associated with the long-term administration of proton pump inhibitors to old rats. Sci. Rep. 9, 6626. https ://doi.org/10.1038/s4159 8-019-43112 -x (2019)].
- 341F (5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3') 및
- 805R (5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3').
Lee, S. M. et al에 서술된 바에 따라 다음 절차를 수행하였다[Lee, S. M. et al. Gut microbiota and butyrate level changes associated with the long-term administration of proton pump inhibitors to old rats. Sci. Rep. 9, 6626. https://doi.org/10.1038/s4159 8-019-43112-x (2019)]. 간략히, PCR 생성물의 동정을 전기 영동을 사용하여 확인되었다. 이들을 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 Nextera XT Index Kit (Illumina, San Diego, CA, USA)의 Illumina 표시 및 어댑터로 태그하였다. 짧은 DNA 단편을 FavorPrep Gel/PCR Purification Kit (Favorgen, Taiwan)를 사용하여 제거하였다. PCR 앰플리콘을 Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 정량화하였다. DNA 풀링 후 (샘플 당 300 ng), PCR 생성물을 FavorPrep Gel/PCR Purification Kit (Favorgen, Taiwan)를 사용하여 정제하였다. DNA의 무결성 및 산물 크기를 확인하기 위한 품질 평가를 ChunLab, Inc. (Seoul, South Korea)에서 DNA 7,500 칩을 이용한 Bioanalyzer 2,100 (Agilent, Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. ChunLab, Inc. (Seoul, South Korea)에서 Illumina MiSeq 플랫폼을 사용하여 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다.
Trimmomatic 0.32을 사용하여 저품질 (< Q25) 판독을 필터링하는 품질을 먼저 체크하여 원시 판독을 처리하였다[Bolger, A. M., Lohse, M. & Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics (Oxford, England) 30, 2114-2120. https ://doi.org/10.1093/bioin forma tics/btu17 0 (2014)]. 페어드-엔드(paried-end) 서열 데이터를 PANDAseq를 사용하여 병합하였다[Masella, A. P., Bartram, A. K., Truszkowski, J. M., Brown, D. G. & Neufeld, J. D. PANDAseq: paired-end assembler for illumine sequences. BMC Bioinform. 13, 31. https ://doi.org/10.1186/1471-2105-13-31 (2012)]. 그런 다음 ChunLab, Inc. (Seoul, South Korea)의 인하우스 프로그램을 사용하여 0.8의 유사성 컷 오프로 프라이머 서열을 손질했다. 16S rRNA를 코딩하지 않는, 비-특이적 앰플리콘을 16S rRNA 프로파일에 기초하여 HMMER program hmmsearch을 사용하여 동정하였다[Eddy, S. R. Accelerated profile HMM searches. PLoS Comput. Biol. 7, e1002195. https ://doi.org/10.1371/journ al.pcbi.10021 95 (2011)]. 서열은 DUDESeq을 사용하여 노이즈를 제거하였고, 비-불필요한 판독을 UCLUST-clustering을 통해 추출하였다[Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics (Oxford, England) 26, 2460-2461. https ://doi.org/10.1093/bioin forma tics/btq46 1 (2010)]. EzBioCloud 데이터 베이스를 USEARCH (8.1.1861_i86linux32)를 사용하여 분류학적 배치를 수행하는 데 이용하였고 이후 더 정확한 쌍 정렬을 수행하였다[Myers, E. W. & Miller, W. Optimal alignments in linear space. Comput. Appl. Biosci. CABIOS 4, 11-17 (1988)]. EzBioCloud로부터 UCHIME66 및 비-키메릭 16S rRNA 데이터베이스를 사용하여 97% 미만의 최고 적중 유사율을 포함하는 판독에 대해 키메라를 검출하였다. 서열 데이터를 그런 다음 CD-HIT67 및 UCLUST64를 사용하여 클러스터링하였다.
얻어진 OUT에 대한 희박화를 BIOiPLUG (ChunLab, Inc.)를 사용하여 계산하였다. 판독은 7,525로 정규화하여 분석을 수행하였다. 미생물총 다양성(관찰된 OTU 수, Chao1, Shannon, 및 Simpson 지수)을 BIOiPLUG를 사용하여 조사하였다. 샘플에서 차이를 시각화하기 위하여, 일반화된 UniFrac를 사용하여 PCoA를 평가했다. 샘플의 클러스터링을 주 좌표 (PC)의 값을 기초로 설명하였다. 또한, 산술 평균 트리가 있는 비가중 쌍 그룹 방법(UPGMA)을 BIOiPLUG (ChunLab, Inc.)을 사용하여 생성하였다. 베타 다양성 거리를 일반화된 UniFrac를 사용하여 계산하였다. 그룹 간의 분리의 유의성을 변량의 순열 다변량 분석 (PERMANOVA) 시험으로 계산하였다. 분류학적 요약 막대 차트를 GraphPad Prism (version 5.01)을 사용하여 문(phylum) 및 과(family) 수준에서 OUT 존재비 (%)를 결정하기 위해 생성하였다. 속(genus) 수준의 장내 미생물총 장유형 분류를 R 패키지 "clusterSim"를 사용하여 계산하였다. 최적의 클러스터 수를 Calinski-Harabasz (CH) 지수의 값을 최대화하여 결정하였다[Liu, Y., Li, Z., Xiong, H., Gao, X. & Wu, J. In 2010 IEEE International Conference on Data Mining, 911-916].
[실시예 3] 선형 판별 분석 (LDA) 효과 크기 (LEfSe)를 통한 바이오마커 발견
상기 실시예 2에서 확인된 상대적 분류학적 존재비에 기초하여, 분류학적 바이오마커 발견 및 관련 통계학적 유의성을 LEfSe 방법으로 평가하였다[Segata, N. et al. Metagenomic biomarker discovery and explanation. Genome Biol 12, R60. https ://doi.org/10.1186/gb-2011-12-6-r60 (2011)]. LEfSe 분석을 수행하기 위한 기준은 다음과 같다:
(1) 0.05 미만인 그룹과 비교할 때 할당된 분류군 간의 계승 Kruskal-Wallis H 시험에 대한 알파 값,
(2) 0.05 미만의 분류학적 조성 중에서 쌍별 Wilcoxon 시험에 대한 알파 값,
(3) 2.0 미만의 차별적 특징에 대한 로그 LDA 점수의 임계값, 및
(4) 모두에 대한 다중-클래스 분석.
이 과정 후, 또한 LEfSe 플롯을 단순화하였다.
(5) 중첩된 박테리아 선택,
(6) 검색 및 보고된 논문을 참고하여 박테리아 특징을 분류: 공생 박테리아, 기회 감염균, 특징지어지지 않은 박테리아, 및
(7) "특징 지어지지 않은" 박테리아에서만 비-중첩 박테리아를 제거.
LEfSe 플롯에서, 공생 박테리아 및 기회 병원체 및 오직 중첩된 "특징지어지지 않은" 박테리아 모두가 포함되었다.
박테리아 군집의 기능적 바이오마커 프로파일을 예측하기 위해, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database (www.kegg.jp/kegg/kegg1 .html)에 기초하여 비관찰된 상태의 재구성을 통한 계통 발생 조사(PICRUSt)를 수행했다[Langille, M. G. et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nat. Biotechnol. 31, 814-821. https ://doi.org/10.1038/nbt.2676 (2013)]. 기능적 바이오마커의 발견 및 관련 통계학적 유의성은 LEfSe에 기초하여 평가되었다.
[실시예 4] 통계 분석 및 데이터 가용성
피로시퀀싱 데이터를 제외한 통계 계산은 PASW Statistics version 18.0.0 (SPSS Inc., 2009, Chicago, IL, USA)을 사용하여 수행되었다. 그룹들을 Kruskal-Wallis H 시험의 결과에 기초하여 비교하였다. 그런 다음, 2개의 그룹을 Mann-Whitney U 시험 (Wilcoxon rank sum 시험으로도 알려짐)을 사용하여 비교하였고, p-값 < 0.05가 유의한 것으로 고려되었다. 다중 비교의 조정을 위해, FDR(false discovery rate)의 수정된 q-값을 5% 미만의 유의성에 대해 계산하였다.
또한, 본 연구 동안 생성된, 16S rRNA의 원시 가공되지 않은 유전자 데이터세트를 NCBI Sequence Read Archive (SRA Accession Number PRJNA590320), https ://www.ncbi.nlm.nih. gov/sra/PRJNA 590320로 사용할 수 있다.
[실험예 1] 에스트로겐 처리 후 군집(clustering) 및 문(phylum) 조성에 대한 성별 및 대장암(CRC)의 영향
상기 실시예 2로부터 수득한 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱을 수행 결과, 49개 샘플 모두의 희박화 곡선(rarefaction curve)은 안정기(plateau, 정체기)를 형성했다. 또한, 여러 그룹 사이의 장내 미생물 군집에서 발생하는 변이를 일반화된 UniFrac 거리를 기준으로 평가했으며, 주 좌표 분석 (PCoA) 결과는 에스트로겐 첨가에 따라 박테리아 군집이 구별될 수 있음을 보여준다 (도 2a). 성별 및 OVX 그룹을 보여주는, 그룹 1에 속하는 Male_E2 샘플을 제외하고는, 성별 또는 OVX에서의 차이에 따른 명확한 차이는 관찰되지 않았으며, 각각 수컷에서 대장암의 발병을 나타내는 그룹 1 및 그룹 2의 멤버로부터 얻은 샘플에서 AOM/DSS 또는 E2 처리가 관찰되었다 (도 2a 및 b). PERMANOVA 결과는 그룹 1 (p=0.001) 사이 및 그룹 2 (p=0.017) 사이의 베타 세트-유의성을 입증했다 (도 2a 및 b).
그룹 1에서, 문(phylum)과 과(family) 분류 수준에서의 장내 미생물총의 상이한 조성이 관찰되었다 (도 2c 및 e). 문(phylum) 수준에서, 시아노박테리아(Cyanobacteria) 문에 속하는 미생물의 존재비가 수컷을 포함하는 그룹에서 에스트로겐 처리로 인해 상당히 감소하였다 (Kruskal-Wallis 시험 기준 p < 0.001; Male_Con 대 Male_E2의 경우 p < 0.001) (도 2c). 또한, 베루코마이크로비아(Verrucomicrobia) 문에 속하는 미생물의 존재비는 암컷 그룹에서 에스트로겐 부재 (OVX) 시에 유의하게 증가하였다 (Kruskal-Wallis 시험 기준 p = 0.054; Female_con 대 Female_OVX의 경우 p = 0.007) (도 2c). 그룹 2에 속하는 개체들의 장내 미생물총의 차이는 오직 과(family) 분류 수준에서만 관찰되었다 (도 2d 및 f). 또한, 퍼미큐티스(Firmicutes) 대 박테로데테스(Bacterodetes)의 비율 (F/B 비율)은 그룹 1의 개체들 사이에서 유의하게 다르지 않았다 (도 2g). 흥미롭게도, F/B 비율은 그룹 2의 AOM/DSS 그룹에서보다 E2 보충된 AOM/DSS 그룹에서 유의하게 낮았다 (Kruskal-Wallis 시험의 경우 p = 0.061, Male_AOM/DSS 대 Male_AOM/DSS/E2의 경우 p = 0.050) (도 2h).
알리스티페스(Alistipes) 속에 속하는 미생물은 수컷과 암컷 군에서, 각각 전체의 26% 및 24%로 계수되는, 감지된 가장 우성 미생물이었다. 에스트로겐 투여 수컷 군 (Male_E2) 및 에스트로겐 제거 암컷 군 (Female_OVX)에서, 박테로데테스(Bacterodetes)는 각각 전체의 약 21% 및 14로, 확인된 가장 우성 속(genus)이었다. 그룹 2에서, 알리스티페스(Alistipes)는 Male_Con 군 (26%)과 비교할 때 Male_AOM/DSS 군 (17%)에서 감소했다. 흥미롭게도 알리스티페스(Alistipes)의 감소는 Male_AOM/DSS 군에서 에스트로겐 보충에 의해(Male_AOM/DSS/E2)(20%) 약간 회복하였다.
이를 통해, 성별 및 에스트로겐의 존부의 차이에서는 F/B 비율의 유의한 차이는 나타나지 않은 반면, 에스트로겐, 구체적으로 에스트라디올이 AOM/DSS 처리로 대장염-유도 대장암에 걸린 수컷 마우스에서 F/B 비율을 감소시켜 장내 미생물총을 변화시킴으로써 장내 세균 불균형을 감소시켜 남성에서 대장암을 예방 또는 치료하는 효과가 있음을 확인하였다.
[실험예 2] 장내 미생물총의 다양성에 대한 에스트로겐 투여 후 성별 및 대장암의 영향
상기 실시예 2에서 수득한 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱을 통해 장내 미생물총의 다양성 분석을 수행하였다.
그 결과, 그룹 1에서 OUT 수는 대조군과 비교할 때, 에스트로겐 투여된 수컷 및 암컷 대조군 군에서 모두 유의하게 증가하였다 (Male_Con 대 Male_E2의 경우 p = 0.002, Male_Con 대 Female_Con의 경우 p = 0.008) (도 3a, 표 1).
[표 1]
대변 내용물의 미생물총의 알파 다양성
데이터는 중앙값으로 표시된다. p-값 < 0.05은 유의한 것으로 고려되고 굵은 글씨체로 표시되었다. 독립적 2개 그룹 간의 비교 차이를 위한 Mann-Whitney U-시험이 a, b, c, e, 및 f에서 수행되었다. 그룹 1 간의 및 그룹 2 간의 차이는 d 및 g에서 Kruskal-Wallis H 시험으로 분석되었다.
ap-값: Male_Con 대 Male_E2;
bp-값: Female_Con 대 Female_OVX;
cp-값: Male_Con 대 Female_Con;
dp-값: 그룹 1 사이;
ep-값: Male_Con 대 Male_AOM/DSS;
fp-값: Male_AOM/DSS 대 Male_AOM/DSS/E2;
gp-값: 그룹 2 사이.
OTU, 조작 분류 단위(operational taxonomic unit);
Con, 대조군(control);
E2, 17-β 에스트라디올(Estradiol);
OVX, 난소 절제술을 받은 군(ovariectomized);
AOM, 아족시메탄(azoxymethane);
DSS, 덱스트란 황산 나트륨 염(dextran sulfate sodium salt).
OUT 수와 유사하게, Chao 1 지수에 의해 표시된 대로, 장내 미생물총의 종 풍부도는 또한 수컷 대조군과 비교할 때 에스트로겐(에스트라디올) 투여된 수컷 및 암컷 대조군에서 유의하게 증가된 것으로 밝혀졌다 (Male_Con 대 Male_E2의 경우 p = 0.002, Male_Con 대 Female_Con의 경우 p = 0.008) (도 3c, 표 1). 그러나, 관찰된 OUT 수 및 Chao 1 지수는 암컷 대조군 군과 비교할 때 난소 절제술 후 변하지 않았다 (도 3a 및 c, 표 1). 흥미롭게도 알파 다양성 지수의 중요한 변화가 암컷 대조군과 비교할 때 OVX 군에서 관찰되었다 (Female_Con 대 Female_OVX의 경우 Shannon 지수, p = 0.013; Simpson 지수, p = 0.006) (도 3e 및 g, 표 1). 또한, 그룹 2에서, 수컷 대조군에서 결정된 것과 비교하면 AOM/DSS로 수컷 마우스를 처리하는 것이 OUT 수 (Male_Con 대 Male_AOM/DSS의 경우 p = 0.006) 및 Chao 1 지수의 값이 유의하게 변화하였음을 발견하였다 (도 3b 및 d, 표 1). 반면, 알파 다양성 지수 (Shannon 및 Simpson)는 AOM/DSS 수컷 군에서 E2의 보충에 따라 유의하게 변하였다 (Male_AOM/DSS 대 Male_AOM/DSS/E2의 경우 Shannon 지수, p = 0.033 및 Simpson 지수, p = 0.028) (도 3f 및 h, 표 1).
이를 통해, 에스트로겐, 구체적으로 에스트라디올을 유효성분으로 포함하는 조성물은 대장암에 걸린 남성에서 조작 분류 단위(OUT)의 수의 감소, 차오 1(Chao 1) 지수의 감소, 샤넌(Shannon) 지수의 감소 및 심슨(Simpson) 지수의 증가 등 알파 다양성 지수를 변화시켜, 장내 미생물총을 변화시킴으로써 대장암을 예방 또는 치료하는 효과가 있음을 확인하였다.
[실험예 3] 장내 미생물총의 조성에 대한 에스트로겐 투여로 인한 성별 및 대장암의 영향
상기 실시예 3에서 수행한 선형 판별 분석 (LDA) 및 효과 크기 (LEfSe) 분석을 통해 장내 미생물총의 분류학적 바이오마커를 동정하였다.
LEfSe 분석 결과에 따르면, 장내 미생물총을 구성하는 소수의 속(genera)의 일부가 그룹 1 및 그룹 2 모두에서 유의하게 더 높거나 낮았다 (도 4). 수컷 대조군 마우스에서, 네글렉타(Neglecta), 유박테리움(Eubacterium)_g23, 루미노코쿠스(Ruminococcus), 및 유박테리움(Eubacterium)_g17을 포함하는 기회 감염균(opportunistic pathogen)의 상대 존재비는 에스트로겐 투여에 대한 대응으로 감소했다 (p = 0.022, 0.039, 0.034, 및 0.026, 각각) (도 4a). 암컷 대조군 마우스에서, 유박테리움(Eubacterium)_g8 및 아커만시아(Akkermansia)를 포함하는 기회 감염균의 상대 존재비는 증가한 반면 (p = 0.022 및 0.007 각각), 에스트로겐 제거 (OVX)에 대한 대응으로 공생 박테리아 알리스티페스(Alistipes)의 상대 존재비는 감소했다 (p = 0.013)(도 4b). 수컷 대조군 마우스에서, 기회 감염체 네글렉타(Neglecta)의 상대 존재비는 더 높은 반면 (p = 0.019), KE159571_g 및 KE159538_g를 포함하는 공생 박테리아의 상대 존재비는 암컷 대조군 마우스에 비해 더 낮았다 (p = 0.041 및 0.006 각각)(도 4c). 흥미롭게도, 공생 박테리아 부티리시모나스(Butyricimonas)의 존재비는 수컷에서 관찰된 것에 비하여 암컷 대조군 마우스에서 더 낮았다 (p = 0.047)(도 4c). 이러한 결과 외에도, 기회 감염균에 대한 공생 박테리아의 비율은 Male_Con 또는 Female_OVX 군보다 Male_E2 및 Female_Con 군에서 더 높게 나타났다 (도 4f).
기회 감염균 로세부리아(Roseburia)의 상대 존재비는 Male_Con 군보다 Male_AOM/DSS 군에서 감소하였다 (p = 0.009)(도 4d). 놀랍게도, 부티리비브리오(Butyrivibrio)_g1, 무리바큘라세애(Muribaculaceae)_uc, 및 KE159538_g을 포함하는 공생 박테리아의 상대 존재비는 Male_Con 군보다 Male_AOM/DSS 군에서 더 높았다 (p = 0.022, 0.045 및 0.020 각각) (도 4d). 또한, PAC000664_g 및 포세아(Phocea)을 포함하는 공생 박테리아(p = 0.007 및 0.001 각각) 및 슈도플라보니프랙터(Pseudoflavonifractor) 및 네글렉타(Neglecta)을 포함하는 기회 감염균 (p = 0.012 및 0.003 각각) 모두의 상대 존재비는 Male_AOM/DSS 군보다 Male_AOM/DSS/E2 군에서 감소했다 (도 4e). 예상치 못하게, 기회 감염균에 대한 공생 박테리아의 비율은 Male_Con 또는 Male_AOM/DSS/E2 군보다 Male_AOM/DSS 군에서 더 높았다 (도 4f).
이를 통해, 에스트로겐, 구체적으로 에스트라디올을 유효성분으로 포함하는 조성물은 대장암에 걸린 남성에서 부티리비브리오(Butyrivibrio)_g1, 무리바큘라세애(Muribaculaceae)_uc, 및 KE159538_g로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공생 박테리아의 상대 존재비; 또는 슈도플라보니프랙터(Pseudoflavonifractor) 및 네글렉타(Neglecta)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기회 감염균의 상대 존재비를 감소시켜, 장내 미생물총을 변화시킴으로써 대장암을 예방 또는 치료하는 효과가 있음을 확인하였다.
[실험예 4] 장내 미생물총을 구성하는 장유형(entrotype)
LEfSe 분석으로 결정될 수 없었던 장내 미생물총의 특성을 확인하기 위해, 그룹 1 및 그룹 2 샘플을 추가로 장유형으로 분류하였다.
구체적으로, Calinski-Harabasz (CH) 지수의 가장 높은 값을 기반으로 가장 최적의 수 'k'를 결정하였다. 그룹 1을 구성하는 샘플은 가장 높은 CH 값이 2여서 2 종의 장유형으로 나뉘었다 (도 5a). 그룹 2에 속하는 샘플은 CH 지수가 클러스터 수가 5일 때 최대화되어서 5종의 장유형으로 분리되었다 (도 5b). 그룹 1의 장유형 1은 (Group 1-E1) 5개의 Male_Con, 11개의 Female_Con, 및 7개의 Female_OVX 샘플로 구성되고, 알리스티페스(Alistipes) 속이 지배적이고 (평균 21%), 뒤따라 박테로이데스(Bacteroides) (12%), 및 PAC000186_g (11%) 속이 지배적이었다 (도 5c). 반대로, 그룹 1의 장유형 2는 (Group 1-E2) 오직 12개의 Male_E2 군으로만 구성되고 박테로이데스(Bacteroides) (21%), PAC001063_g (19%), 및 PAC000186_g (10%) 순으로 지배적이었다 (도 5c). 그룹 2의 장유형 1은 (Group 2-E1) 2개의 Male_Con, 6개의 Male_AOM/DSS, 및 3개의 Male_AOM/DSS/E2 샘플로 구성된다 (도 5d). Group 2-E1는 알리스티페스(Alistipes) (21%), PAC000186_g (20%), 및 박테로이데스(Bacteroides) (7%)가 지배적이었다 (도 5d). Group 2-E2는 2개의 Male_Con, 2개의 Male_AOM/DSS, 및 5개의 Male_AOM/DSS/E2 샘플로 이루어지고 PAC000186_g (23%), 알리스티페스(Alistipes) (16%), 및 박테로이데스(Bacteroides) (16%)가 지배적이었다 (도5d). Group 2-E3는 1개 Male_Con, 1개 Male_AOM/DSS, 및 3개 Male_AOM/DSS/E2 샘플로 구성되고 알리스티페스(Alistipes) (28%), 박테로이데스(Bacteroides) (19%), 및 PAC000186_g (8%)이 지배적이었다 (도 5d). Group 2-E4는 오직 3개 Male_AOM/DSS 샘플만으로 구성되고 알리스티페스(Alistipes) (19%), KE159538_g (15%), 및 KE159628_g (9%)가 지배적이었다 (Fig. 5d). Group 2-E5는 오직 1개의 Male_AOM/DSS/E2 샘플만으로 구성되고 아커만시아(Akkermansia) (58%), PAC000186_g (13%), 및 KE159628_g (9%)가 지배적이었다 (도 5d).
또한, 그룹 1 및 그룹 2 내에서 장유형 간의 지배적 속의 상대 존재비를 추가로 분석했다. 그룹 1에서, 알리스티페스(Alistipes) (Bacteroidetes: Bacteroidia: Bacteroidales: Rikenellaceae에 속하는 속)의 존재비는 장유형 1 보다 장유형 2에서 유의하게 낮았다 (p < 0.001) (도 5e). 박테로이데스(Bacteroides) (Bacteroidetes: Bacteroidia: Bacteroidales: Bacteroidaceae에 속하는 속)의 존재비는 장유형 1과 비교할 때 장유형 2에서 유의하게 더 높았다 (p = 0.003) (도 5g). F/B 비율은 또한 장유형 1과 비교할 때 장유형 2에서 유의하게 감소했다 (p = 0.045) (도 5i). 그룹 2에서는, 알리스티페스(Alistipes)의 존재비에 있어서 유의한 차이가 관찰되지 않았다 (도 5f). 박테로이데스(Bacteroides)의 존재비는 장유형 1 (Kruskal-Wallis test를 기반으로 p = 0.027)보다 장유형 2 (p = 0.025) 및 3 (p = 0.008)에서 유의하게 더 높았다 (도 5h). F/B 비율은 각 장유형에서 다르게 조절되었다 (도 5j).
[실험예 5] 성별이 다르고 에스트로겐 투여된 대장암 마우스에서 미생물총 군집의 기능적 프로파일
상기 실시예 3 및 실험예 3의 결과를 통해 장내 미생물총의 분류학적 바이오마커를 동정하였다. 이를 위해 장내 미생물총의 잠재적 기능을 조사하고 Kyoto Encyclopedia of Genes 및 Genomes (KEGG) Ortholog (KO) (www.kegg.jp/kegg/kegg1.html)에 기초하여 이들의 분류를 예측하기 위해 PICRUSt 분석을 수행하였다.
그 결과, 그룹 1 (표 2) 및 그룹 2 (표 3)에서 차별적으로 강화된 기능적 바이오마커를 식별했다. Group 1에서, 2개의 병렬상동체(ortholog)가 Male_Con 또는 Female_OVX 군과 비교할 때 Male_E2 및 Female_Con 군에서 더 높았으며, 이는 ABC-2형 수송 시스템 ATP-결합 단백질 (K01990) 및 TonB-의존성 전분-결합 외막 구성원 단백질 SusC (K21573)이었다 (표 2). 그룹 2에서, Male_Con. 또는 Male_AOM/DSS/E2 군과 비교할 때 Male_AOM/DSS 군에서 각각 17개의 병렬상동체가 증가했고 8개의 병렬상동체가 감소했다 (표 3).
[표 2]
그룹 1의 예측된 기능 바이오마커
데이터는 중앙값으로 표시된다. 데이터는 에스트로겐 노출 (Male_E2 및 Female_Con)에 의해 증가된 병렬상동체를 보여준다.
LDA 효과 크기, 선형 판별 분석 (LDA) 효과 크기;
FDR, 거짓 발견 비율;
Con, 대조군(control);
E2, 17-β 에스트라디올(Estradiol);
OVX, 난소 절제술을 받은 군(ovariectomized).
[표 3]
그룹 1의 예측된 기능적 바이오마커
데이터는 중앙값으로 표시된다.
데이터는 AOM/DSS 군 (Male_AOM/DSS)에서 증가 및 감소된 병렬상동체를 나타낸다.
LDA 효과 크기, 선형 판별 분석 (LDA) 효과 크기;
FDR, 거짓 발견 비율;
Con, 대조군(control);
E2, 17-β 에스트라디올(Estradiol);
OVX, 난소 절제술을 받은 군(ovariectomized).
Claims (20)
- 에스트라디올, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하는, 남성에서의 대장암 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 에스트라디올은 17β-에스트라디올인, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 남성은 장내 미생물총에서 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물의 존재비에 대한 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물의 존재비의 비율(F/B 비율)이 정상 대조군에 비하여 높은, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 남성은 장내 미생물총에서 알리스티페스(Alistipes) 속에 속하는 미생물의 존재비가 정상 대조군에 비하여 낮은, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 남성의 장내 미생물총은 정상 대조군에 비하여 높은 조작 분류 단위(OUT, operational taxonomic unit)의 수, 정상 대조군에 비하여 높은 차오 1(Chao 1) 지수, 정상 대조군에 비하여 높은 샤넌(Shannon) 지수 및 정상 대조군에 비하여 낮은 심슨(Simpson) 지수로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 알파 다양성 지수를 갖는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 남성은 장내 미생물총에서 부티리비브리오(Butyrivibrio)_g1, 무리바큘라세애(Muribaculaceae)_uc, 및 KE159538_g로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공생 박테리아(commensal bacteria)의 상대 존재비; 또는 슈도플라보니프랙터(Pseudoflavonifractor) 및 네글렉타(Neglecta)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기회 감염균(oppotunistic pathogen)의 상대 존재비가 정상 대조군에 비하여 높은, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 대장암은 대장염(colitis) 관련 대장암인, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 상기 남성의 장내 미생물총에서 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물의 존재비에 대한 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물의 존재비의 비율(F/B 비율)을 감소시키는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 상기 남성의 장내 미생물총에서 알리스티페스(Alistipes) 속에 속하는 미생물의 존재비를 증가시키는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 상기 남성의 장내 미생물총에서 조작 분류 단위(OUT)의 수의 감소, 차오 1(Chao 1) 지수의 감소, 샤넌(Shannon) 지수의 감소 및 심슨(Simpson) 지수의 증가로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 알파 다양성 지수를 변화시키는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 상기 남성의 장내 미생물총에서 부티리비브리오(Butyrivibrio)_g1, 무리바큘라세애(Muribaculaceae)_uc, 및 KE159538_g로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공생 박테리아의 상대 존재비; 또는 슈도플라보니프랙터(Pseudoflavonifractor) 및 네글렉타(Neglecta)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기회 감염균의 상대 존재비를 감소시키는, 조성물. - 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물 및 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 남성 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 물질 스크리닝용 조성물.
- 제12항에 있어서,
상기 조성물은 알리스티페스(Alistipes) 속에 속하는 미생물; 부티리비브리오(Butyrivibrio)_g1, 무리바큘라세애(Muribaculaceae)_uc, 및 KE159538_g로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공생 박테리아(commensal bacteria) 미생물; 또는 슈도플라보니프랙터(Pseudoflavonifractor) 및 네글렉타(Neglecta)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기회 감염균(oppotunistic pathogen) 미생물;을 검출할 수 있는 제제를 추가로 포함하는, 남성 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 물질 스크리닝용 조성물. - 남성 대장암 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법으로서,
(a) 대장암 모델에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 시험 물질을 처리한 대장암 모델에서 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물의 존재비에 대한 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물의 존재비의 비율(F/B) 비율을 측정하는 단계;
를 포함하는, 남성 대장암 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법. - 제14항에 있어서,
상기 (b) 단계의 F/B 비율을 측정한 결과 F/B 비율이 감소한 경우, 상기 시험 물질을 남성 대장암 예방 또는 치료용 물질로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 남성 대장암 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법. - 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물 및 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 남성 피험자에서의 대장암 위험도 예측 또는 진단용 조성물.
- 제16항에 있어서,
상기 조성물은 알리스티페스(Alistipes) 속에 속하는 미생물; 부티리비브리오(Butyrivibrio)_g1, 무리바큘라세애(Muribaculaceae)_uc, 및 KE159538_g로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공생 박테리아(commensal bacteria) 미생물; 또는 슈도플라보니프랙터(Pseudoflavonifractor) 및 네글렉타(Neglecta)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기회 감염균(oppotunistic pathogen) 미생물;을 검출할 수 있는 제제를 추가로 포함하는, 남성 피험자에서의 대장암 위험도 예측 또는 진단용 조성물. - 제16항에 있어서,
상기 검출 제제는 제제는 미생물에 특이적인 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 남성 피험자에서의 대장암 위험도 예측 또는 진단용 조성물. - 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 남성 피험자에서의 대장암 위험도 예측 또는 진단용 키트.
- 남성 피험자의 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
상기 추출된 게놈 DNA에 박테로데테스(Bacterodetes) 문에 속하는 미생물 및 퍼미큐티스(Firmicutes) 문에 속하는 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 미생물에 특이적인 프라이머를 반응시키는 단계; 및
상기 반응물을 증폭시키는 단계;를 포함하는, 남성 피험자에서의 대장암 위험도 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116356026A (zh) * | 2023-03-06 | 2023-06-30 | 臻傲生物科技检测(深圳)有限公司 | 预测结直肠癌或结直肠腺瘤风险的新型微生物标志物 |
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| KR20190117486A (ko) * | 2016-12-15 | 2019-10-16 | 유니버시티 컬리지 코르크-내셔날 유니버시티 오브 아일랜드, 코르크 | 개체에서 결장직장암 상태를 결정하는 방법 |
| KR20200038970A (ko) * | 2017-08-10 | 2020-04-14 | 4디 파마 리서치 리미티드 | 박테리아 균주를 포함하는 조성물 |
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-
2021
- 2021-05-18 KR KR1020210064346A patent/KR102623834B1/ko active IP Right Grant
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| CN116356026B (zh) * | 2023-03-06 | 2024-10-01 | 臻傲生物科技检测(深圳)有限公司 | 预测结直肠癌或结直肠腺瘤风险的新型微生物标志物 |
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