KR20220006364A - Composition for preventing, alleviating or treating liver cancer comprising alpha mangostin glycoside - Google Patents

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KR20220006364A
KR20220006364A KR1020200084232A KR20200084232A KR20220006364A KR 20220006364 A KR20220006364 A KR 20220006364A KR 1020200084232 A KR1020200084232 A KR 1020200084232A KR 20200084232 A KR20200084232 A KR 20200084232A KR 20220006364 A KR20220006364 A KR 20220006364A
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정혜진
송재경
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선문대학교 산학협력단
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Abstract

The present invention relates to a composition for preventing, alleviating or treating liver cancer comprising alpha-mangostin glycoside. The alpha-mangostin glycoside of the present invention not only has excellent bioavailability, but also exhibits an excellent effect in the treatment of liver cancer such as an ability to kill liver cancer cells, inhibit cancer cell metastasis, inhibit angiogenesis, inhibit HIF-1α accumulation, inhibit tumor sphere formation, thereby being able to be usefully used in related medicines and health functional food fields.

Description

알파 망고스틴 글리코사이드를 포함하는 간암 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, alleviating or treating liver cancer comprising alpha mangostin glycoside}A composition for preventing, alleviating or treating liver cancer comprising alpha mangostin glycoside;

본 발명은 알파 망고스틴 글리코사이드를 포함하는 간암 예방, 개선 또는 치료용 조성물 등에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for preventing, improving or treating liver cancer comprising alpha mangosteen glycoside.

간세포암종(Hepatocellular carcinoma, HCC)은 세계에서 가장 흔한 암 중 하나로, 간암의 모든 사례의 85 % 내지 90 %를 차지하며 전 세계적으로 두 번째로 많은 암사망률을 나타내는 것으로 보고되었다. HCC는 흡연, 알코올, 곰팡이 독소, 인간 간염 바이러스, 피로 및 비만으로 인한 다인성 질환으로, 현재 HCC 치료법에는 외과 수술, 고주파 절제 및 화학 요법이 포함되나 전이와 높은 재발률로 인해 치료 결과가 만족스럽지 않다.Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common cancers in the world, accounting for 85% to 90% of all cases of liver cancer, and has been reported as the second leading cause of cancer mortality worldwide. HCC is a multifactorial disease caused by smoking, alcohol, mycotoxin, human hepatitis virus, fatigue and obesity. Current HCC treatments include surgery, radiofrequency ablation, and chemotherapy, but the treatment results are not satisfactory due to metastasis and high recurrence rates. .

한편, 알파 망고스틴은 열대 과일 망고스틴(Garcinia mangostana Linn.)의 과피에서 분리된 폴리페놀성 크산톤이다. 파이토케미칼은 항산화제, 항염증제, 항종양제, 항당뇨병제, 항균제, 항진균제, 항비만제, 심장 보호제 및 신경 보호 효과와 같은 다양한 생물학적 활성을 갖는 것으로 보고되었다. 다양한 in vitro 및 in vivo 연구를 통해 알파 망고스틴이 광범위한 암세포 유형에 대해 화학 예방 및 화학 치료 가능성을 갖는 것으로 확인하였다. 그러나 1차통과대사(first-pass metabolism)로 인한 알파 망고스틴의 낮은 경구 생체 이용률, 낮은 수용성으로 인한 열악한 흡수 및 P-글리코프로틴 유출 효과는 추가적인 임상 적용을 제한한다.On the other hand, alpha mangosteen is a polyphenolic xanthone isolated from the peel of a tropical fruit mangosteen (Garcinia mangostana Linn.). Phytochemicals have been reported to have various biological activities such as antioxidant, anti-inflammatory, anti-tumor, anti-diabetic, anti-bacterial, anti-fungal, anti-obesity, cardioprotective and neuroprotective effects. Various in vitro and in vivo studies have confirmed that alpha-mangosteen has chemopreventive and chemotherapy potential against a wide range of cancer cell types. However, the low oral bioavailability of alpha-mangosteen due to first-pass metabolism, poor absorption due to low water solubility and the effect of P-glycoprotein efflux limit further clinical applications.

따라서, 생체 이용률을 향상시키기 위한 새로운 알파 망고스틴 유도체 설계가 요구되나 이에 대한 연구는 미흡한 실정이다.Therefore, a novel alpha-mangosteen derivative design is required to improve bioavailability, but research on this is insufficient.

대한민국 특허등록공보 10-1621162Korean Patent Registration Publication No. 10-1621162

본 발명의 목적은 알파-망고스틴-3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.An object of the present invention is alpha-mangosteen-3-O-β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin- 3-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside) or a pharmaceutically acceptable To provide a pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer comprising a salt as an active ingredient.

본 발명의 목적은 알파-망고스틴-6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.An object of the present invention is alpha-mangosteen-6-O-β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin- 6-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside) or a pharmaceutically acceptable To provide a pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer comprising a salt as an active ingredient.

본 발명의 목적은 알파-망고스틴-3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.An object of the present invention is alpha-to β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin- 3-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside) or a salt thereof, an active ingredient-mangosteen-3-O It is to provide a food composition for preventing or improving liver cancer comprising.

본 발명의 목적은 알파-망고스틴-6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.An object of the present invention is alpha-to β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin- 6-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside) or a salt thereof, an active ingredient-mangosteen-6-O It is to provide a food composition for preventing or improving liver cancer comprising.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 알파-망고스틴-3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention to achieve the above object of the present invention is alpha-mangosteen-3-O-β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin- 3-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside) Or it provides a pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer comprising a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

또한, 본 발명은 알파-망고스틴-6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention is alpha-mangosteen-6-O-β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin- 6-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside) or a pharmaceutically acceptable It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer comprising a salt as an active ingredient.

또한, 본 발명은 알파-망고스틴-3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.The present invention is alpha-to β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin- 3-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside) or a salt thereof, an active ingredient-mangosteen-3-O It provides a food composition for preventing or improving liver cancer, including.

또한, 본 발명은 알파-망고스틴-6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.The present invention is alpha-to β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin- 6-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside) or a salt thereof, an active ingredient-mangosteen-6-O It provides a food composition for preventing or improving liver cancer, including.

본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 자가포식 억제제(autophagy inhibitor)를 더 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the composition may further include an autophagy inhibitor.

본 발명의 일 구현예로, 상기 자가포식 억제제는 3-메틸아데닌(3-methyladenine)일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the autophagy inhibitor may be 3-methyladenine.

본 발명의 일 구현예로, 상기 자가포식 억제제와 유효성분인 화합물의 몰 농도비는 1: 15 내지 25일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the molar concentration ratio of the autophagy inhibitor and the active ingredient compound may be 1: 15 to 25.

본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 종양구(tumorsphere)의 형성을 억제할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the composition may inhibit the formation of tumor spheres.

본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 Nanog, Oct4, Sox2, CD44 및 CD133으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 암줄기세포 마커 발현을 억제할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the composition can inhibit the expression of one or more cancer stem cell markers selected from the group consisting of Nanog, Oct4, Sox2, CD44 and CD133.

본 발명의 알파 망고스틴 글리코사이드는 생체 이용율이 우수할 뿐만 아니라 간암세포 사멸능, 암세포 전이 억제능, 혈관신생 억제능, HIF-1α 축적 억제능, 종양구 형성 억제능 등 간암 치료에 우수한 효과를 보이므로 관련 의약 및 건강기능식품 분야에 유용하게 이용될 수 있다.The alpha-mangosteen glycoside of the present invention has excellent bioavailability and exhibits excellent effects in the treatment of liver cancer, such as hepatocarcinoma cell killing ability, cancer cell metastasis inhibition ability, angiogenesis inhibition ability, HIF-1α accumulation inhibition ability, and tumor cell formation inhibition ability. And it can be usefully used in the field of health functional food.

도 1은 알파 망고스틴 및 알파 망고스틴 글리코사이드 화합물의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 간세포암종(HCC)에 대한 알파 망고스틴 글리코사이드의 성장 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 Hep3B 세포 이동 억제에 대한 알파 망고스틴 글리코사이드의 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 세포의 세포주기 및 세포 사멸에 대한 알파 망고스틴 글리코사이드의 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 Hep3B 세포에서 미토콘드리아 매개 세포사멸 조절자 발현에 대한 알파 망고스틴 글리코사이드의 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 Hep3B 세포 자가포식에 대한 알파 망고스틴 글리코사이드의 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 Hep3B 세포에서 c-Met 신호 전달 경로에 대한 알파 망고스틴 글리코사이드의 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 Hep3B 세포 유도 혈관신생에 대한 알파 망고스틴 글리코사이드의 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 Hep3B 세포에서 HIF-1α 활성에 대한 알파 망고스틴 글리코사이드의 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 종양구 형성 및 암줄기세포 마커 발현에 대한 알파 망고스틴 글리코사이드의 효과를 나타낸 것이다.
1 shows the structures of alpha-mangosteen and alpha-mangosteen glycoside compounds.
Figure 2 shows the growth inhibitory effect of alpha-mangosteen glycoside on hepatocellular carcinoma (HCC).
3 shows the effect of alpha mangosteen glycoside on the inhibition of Hep3B cell migration.
Figure 4 shows the effect of alpha mangosteen glycoside on the cell cycle and apoptosis of cells.
5 shows the effect of alpha mangosteen glycoside on the expression of mitochondrial-mediated apoptosis regulators in Hep3B cells.
6 shows the effect of alpha mangosteen glycoside on Hep3B cell autophagy.
7 shows the effect of alpha mangosteen glycoside on the c-Met signaling pathway in Hep3B cells.
8 shows the effect of alpha mangosteen glycoside on Hep3B cell-induced angiogenesis.
9 shows the effect of alpha mangosteen glycoside on HIF-1α activity in Hep3B cells.
Figure 10 shows the effect of alpha mangosteen glycoside on tumorisphere formation and cancer stem cell marker expression.

본 발명의 발명자들은 인간 간세포에 대한 알파-망고스틴-3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 및 알파-망고스틴-6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside)의 항암 활성을 집중적으로 평가한 결과, 본 발명의 화합물이 c-Met 신호 전달의 억제 및 HIF-1α 발현 억제 등을 통해 HCC의 성장, 이동, 혈관 신생 및 암세포의 줄기능(stemness)을 억제함을 입증하여 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention are alpha to the human hepatocyte-mangosteen-3-O-β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin- 3-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside) and alpha- Mangosteen - 6-O - β -D- 2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin- 6-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside) a result of intensive evaluation of the antitumor activity of the compounds of the invention The present invention was completed by demonstrating that HCC growth, migration, angiogenesis, and stemness of cancer cells were inhibited through inhibition of c-Met signal transduction and inhibition of HIF-1α expression.

이에, 본 발명은 알파-망고스틴-3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Thus, the present invention is alpha-mangosteen-3-O-β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin- 3-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside) or a pharmaceutically acceptable It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer comprising a salt as an active ingredient.

또한 본 발명은 알파-망고스틴-6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention is alpha-mangosteen-6-O-β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin- 6-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside) or a pharmaceutically acceptable salt thereof It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer comprising as an active ingredient.

상기 알파-망고스틴-3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside)는 하기 화학식 1의 구조를 가지며 HCC에 대한 높은 항암 활성을 가진다.The alpha-mangosteen-3-O-β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin-3 -O- β -D-2-deoxyglucopyranoside) is to have the structure of formula (I) for the HCC It has high anticancer activity.

[화학식 1][Formula 1]

Figure pat00001
Figure pat00001

상기 알파-망고스틴-6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside)는 하기 화학식 2의 구조를 가지며 HCC에 대한 높은 항암 활성을 가진다.The alpha-mangosteen-6-O-β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin- 6-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside) is to have the structure of formula (II) for the HCC It has high anticancer activity.

[화학식 2][Formula 2]

Figure pat00002
Figure pat00002

본 발명의 조성물은 간암(liver cancer) 치료, 예방 또는 개선용으로 적용될 수 있다. 상기 간암은 원발성(primary) 간암 또는 전이성(metastatic) 간암을 모두 포함하는 것이며, 간세포암종(hepatocellular carcinoma) 또는 담관암(cholagiocarcinoma)을 모두 포함하는 것이나, 바람직하게는 간세포암종에 적용될 수 있다. 또한, 상기 간암은 초기 간암, 진행성 간암 또는 말기 간암일 수 있다.The composition of the present invention may be applied for treatment, prevention or improvement of liver cancer. The liver cancer includes both primary liver cancer or metastatic liver cancer, and includes both hepatocellular carcinoma and cholagiocarcinoma, but preferably can be applied to hepatocellular carcinoma. In addition, the liver cancer may be early stage liver cancer, advanced liver cancer, or end stage liver cancer.

본 발명에서 "약학적으로 허용가능한 염"은 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성 및 물성을 손상시키지 않는 임의의 무기산 또는 유기산 또는 염기와 형성된 염을 의미한다. 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염과 같이, 당업계에서 통상적으로 사용되는 염을 사용할 수 있다.In the present invention, "pharmaceutically acceptable salt" means a salt formed with any inorganic or organic acid or base that does not cause serious irritation to the administered organism and does not impair the biological activity and physical properties of the compound. As the salt, a salt commonly used in the art may be used, such as an acid addition salt formed with a pharmaceutically acceptable free acid.

본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 간암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term “prevention” refers to any act of inhibiting or delaying the onset of liver cancer by administering the pharmaceutical composition according to the present invention.

본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 간암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term “treatment” refers to any action in which the symptoms of liver cancer are improved or beneficially changed by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 알파-망고스틴-3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside), 알파-망고스틴-6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 또는 이들의 염을 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.A pharmaceutical composition according to the invention are alpha-mangosteen-3-O-β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin- 3-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside), alpha-mango Stein- 6-O - β -D-2-deoxyglucopyranoside (α-mangostin- 6-O-β- D-2-deoxyglucopyranoside) or a salt thereof is included as an active ingredient, and is pharmaceutically acceptable possible carriers. The pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in formulation, and includes, but is not limited to, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposome, and the like. It does not, and may further include other conventional additives, such as antioxidants and buffers, if necessary. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, lubricants, etc. may be additionally added to form an injectable formulation such as an aqueous solution, suspension, emulsion, etc., pills, capsules, granules, or tablets. Regarding suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations, formulations can be preferably made according to each component using the method disclosed in Remington's literature. The pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited in formulation, but may be formulated as an injection or oral ingestion.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (eg, intravenously or subcutaneously) according to a desired method, and the dosage may vary depending on the patient's condition and weight, the degree of disease, drug form, Although it varies depending on the route and time of administration, it may be appropriately selected by those skilled in the art.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type, severity, and drug activity of the patient. , can be determined according to factors including sensitivity to drug, administration time, administration route and excretion rate, duration of treatment, concurrent drugs, and other factors well known in the medical field. The composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or may be administered in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple. In consideration of all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있다.Specifically, the effective amount of the composition according to the present invention may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, and may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, and the like.

다른 양태로서 본 발명은 알파-망고스틴-3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.In another aspect the present invention is alpha-mangosteen-3-O-β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin- 3-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside) or a salt thereof of the active ingredient It provides a food composition for preventing or improving liver cancer comprising a.

또한 본 발명은 알파-망고스틴-6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention is alpha-mangosteen-6-O-β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin- 6-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside) or a salt thereof as an active ingredient comprising a It provides a food composition for preventing or improving liver cancer.

상기 식품 조성물은 건강기능성 식품을 포함하는 개념이다.The food composition is a concept including health functional food.

본 발명에서 사용되는 용어, “개선”이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term “improvement” refers to any action that at least reduces a parameter related to a condition to be treated, for example, the severity of symptoms.

본 발명의 식품 조성물은 알파-망고스틴-3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside), 알파-망고스틴-6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 또는 이들의 염을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 알파-망고스틴-3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside), 알파-망고스틴-6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 또는 이들의 염은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.Food compositions of the present invention are alpha-mangosteen-3-O-β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin- 3-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside), alpha-mangosteen - 6-O - β -D-2-deoxyglucopyranoside (α-mangostin- 6-O-β -D-2-deoxyglucopyranoside) or a salt thereof is added to food as it is or combined with other food or food ingredients. may be used, and may be appropriately used according to a conventional method. Alpha-mangosteen-3-O-β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin- 3-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside), alpha-mangosteen-6-O-β- D-2-deoxyglucopyranoside (α-mangostin- 6-O-β- D-2-deoxyglucopyranoside) or a salt thereof may be appropriately determined depending on the purpose of its use (for prevention or improvement). In general, in the production of food or beverage, the composition of the present invention is added in an amount of 15% by weight or less, preferably 10% by weight or less, based on the raw material. However, in the case of long-term ingestion for health and hygiene purposes or for health control purposes, the amount may be less than or equal to the above range.

본 발명의 건강기능성식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.The health functional food composition of the present invention is not particularly limited in other ingredients other than containing the above ingredients as an essential ingredient in the indicated ratio, and may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients like a conventional beverage. . Examples of the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; disaccharides such as maltose, sucrose and the like; and polysaccharides such as conventional sugars such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol. As flavoring agents other than those described above, natural flavoring agents (taumatin, stevia extract (eg, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used. The proportion of the natural carbohydrate can be appropriately determined by the selection of a person skilled in the art.

상기 외에 본 발명의 건강기능성식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.In addition to the above, the health functional food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic and natural flavoring agents, colorants and thickeners (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, Alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like may be contained. These components may be used independently or in combination. The proportion of these additives may also be appropriately selected by those skilled in the art.

본 발명에서 상기 약학적 조성물은 자가포식 억제제(autophagy inhibitor)를 더 포함할 수 있으며 상기 자가포식 억제제는 바람직하게는 3-메틸아데닌(3-methyladenine)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the pharmaceutical composition may further include an autophagy inhibitor, and the autophagy inhibitor may preferably be 3-methyladenine, but is not limited thereto.

본 발명에서 상기 자가포식 억제제와 유효성분의 몰 농도비는 1: 15 내지 25 일 수 있으며 바람직하게는 1: 20일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the molar concentration ratio of the autophagy inhibitor and the active ingredient may be 1: 15 to 25, preferably 1: 20, but is not limited thereto.

본 발명에서 상기 조성물은 종양구(tumorsphere)의 형성을 억제할 수 있다.In the present invention, the composition may inhibit the formation of tumor spheres.

본 발명에서 상기 조성물은 Nanog, Oct4, Sox2, CD44 및 CD133으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 암줄기세포 마커 발현을 억제할 수 있다.In the present invention, the composition can inhibit the expression of one or more cancer stem cell markers selected from the group consisting of Nanog, Oct4, Sox2, CD44 and CD133.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, the following examples are intended to illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.

<실시예 1: 재료 및 준비><Example 1: Materials and Preparation>

실시예 1-1. 재료Example 1-1. material

알파 망고스틴, 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 3-메틸아데닌 (3-methyladenine, 3-MA), 디메틸옥살리글리신(dimethyloxalylglycine, DMOG), Z-DEVD-FMK, 크리스탈 바이올렛, 젤라틴 및 3-(4,5- 디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)는 Sigma-Aldrich (미국 미주리 주 세인트루이스)에서 구입 하였다. CellTiter-Glo® 발광 세포 생존력 분석 키트는 Promega (미국 위스콘신 주 매디슨 소재)로부터 구입하였다. 알파 망고스틴 글리코사이드, 알파 망고스틴-3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노 사이드(α-mangostin-3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside, Man-3DG) 및 알파 망고스틴-6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin 6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside, Man-6DG)는 생체 촉매 글리코실화 반응을 적용하여 얻었다. 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG를 DMSO를 사용하여 50mM의 농도로 제조하였다. 소태아혈청 (fetal bovine serum, FBS), 둘베코변형이글배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM) 및 최소 필수 배지 (minimum essential medium, MEM)는 깁코(Gibco)(미국 뉴욕 주 그랜드 아일랜드)에서 구입하였다.Alpha mangosteen, dimethyl sulfoxide (DMSO), 3-methyladenine (3-MA), dimethyloxalylglycine (DMOG), Z-DEVD-FMK, crystal violet, gelatin and 3 -(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT) is Sigma - It was purchased from Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay Kit was purchased from Promega (Madison, Wis.). Alpha Mangostin Glycoside, Alpha Mangostin-3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside (α-mangostin-3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside, Man-3DG) and Alpha Mango Steen-6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside (α-mangostin 6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside, Man-6DG) was obtained by applying a biocatalytic glycosylation reaction. Alpha mangosteen, Man-3DG and Man-6DG were prepared using DMSO at a concentration of 50 mM. Fetal bovine serum (FBS), Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) and minimum essential medium (MEM) were purchased from Gibco (Grand Island, New York, USA). .

내피성장배지-2(endothelial growth medium-2, EGM-2) 및 페니실린-스트렙토 마이신-암포테리신 B(penicillin-streptomycin-amphotericin B)는 Lonza (Walkersville, MD, USA)로부터 입수하였다. 마트리겔 및 트랜스 웰 챔버 시스템은 BD Biosciences (미국 캘리포니아 주 산호세) 및 Corning Costar (미국 매사추세츠 주 Acton)로부터 입수하였다. Anti-cleaved caspase-3, anti-cleaved caspase-9, anti-Bcl-XL, anti-Bax, anti-Atg5, anti-Beclin-1, anti-LC3B, anti-p62, anti-phospho-Met, anti-Met, anti-phospho-AKT, anti-AKT, anti-phospho-ERK1/2, anti-ERK1/2, anti-HIF-1α, anti-Nanog, anti-Oct4, anti-Sox2, anti-CD44, anti-CD133, and anti-β-actin 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.Endothelial growth medium-2 (EGM-2) and penicillin-streptomycin-amphotericin B were obtained from Lonza (Walkersville, MD, USA). Matrigel and transwell chamber systems were obtained from BD Biosciences (San Jose, CA) and Corning Costar (Acton, MA). Anti-cleaved caspase-3, anti-cleaved caspase-9, anti-Bcl-XL, anti-Bax, anti-Atg5, anti-Beclin-1, anti-LC3B, anti-p62, anti-phospho-Met, anti- Met, anti-phospho-AKT, anti-AKT, anti-phospho-ERK1/2, anti-ERK1/2, anti-HIF-1α, anti-Nanog, anti-Oct4, anti-Sox2, anti-CD44, anti- CD133, and anti-β-actin antibodies were purchased from Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA).

실시예 1-2. 세포 배양 및 저산소 상태Example 1-2. Cell culture and hypoxia

인간 간암 세포 (HepG2, Huh7 및 Hep3B) 및 인간 제대 정맥 내피 세포 (human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)는 각각 한국 세포주 은행 (Seoul, Korea) 및 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 각각 얻었다. 상기 HepG2 및 Huh7 세포는 10 % FBS 및 1 % 항생제가 보충된 DMEM에서 배양하였다. Hep3B 세포 및 HUVEC를 각각 10 % FBS 및 1 % 항생제가 보충된 MEM 및 EGM-2에서 성장시켰다. 세포를 가습된 5 % CO2 배양기 (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland)에서 37 ℃로 유지시켰다.Human liver cancer cells (HepG2, Huh7 and Hep3B) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were obtained from the Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea) and the American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), respectively. . The HepG2 and Huh7 cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 1% antibiotics. Hep3B cells and HUVECs were grown in MEM and EGM-2 supplemented with 10% FBS and 1% antibiotics, respectively. Cells were maintained at 37 °C in a humidified 5% CO 2 incubator (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland).

저산소 조건의 경우, Hep3B 세포를 5% CO2 및 1% O2하에 N2와 균형을 이루는 저산소 챔버 (Forma Scientific, 미국 오하이오 주 마리에타)에서 배양하였다.For hypoxic conditions, Hep3B cells were cultured in a hypoxic chamber (Forma Scientific, Marietta, Ohio) balanced with N 2 under 5% CO 2 and 1% O 2 .

실시예 1-3. 세포 성장 분석Examples 1-3. cell growth assay

HepG2, Huh7 및 Hep3B 세포 (2 × 103 세포/웰)를 96-웰 배양 플레이트에 시딩하였다. 세포를 다양한 농도(0-100 μM)의 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG로 처리하고 72 시간 동안 배양 하였다. 그 후, 50㎕의 MTT 용액 (2mg / mL)을 각 웰에 첨가하고 3 시간 동안 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 후, 포르마잔 결정을 각 웰에 대해 100 μL의 DMSO에 용해시켰다. 각각의 웰의 흡광도는 마이크로 플레이트 리더 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 540 nm의 파장에서 측정되었다.HepG2, Huh7 and Hep3B cells (2×10 3 cells/well) were seeded in 96-well culture plates. Cells were treated with various concentrations (0-100 μM) of alpha mangosteen, Man-3DG and Man-6DG and incubated for 72 hours. After that, 50 μl of MTT solution (2 mg/mL) was added to each well and incubated for 3 h. After incubation, formazan crystals were dissolved in 100 μL of DMSO for each well. The absorbance of each well was measured at a wavelength of 540 nm using a microplate reader (Thermo Fisher Scientific).

실시예 1-4. 콜로니 형성 확인Examples 1-4. Confirm colony formation

HepG2, Huh7 및 Hep3B 세포 (5 × 102 세포/웰)를 6-웰 배양 플레이트에 시딩하고 10 μM의 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG로 처리하였다. 7 일 후, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 각 웰에 대해 콜로니 수를 세었다.HepG2, Huh7 and Hep3B cells (5×10 2 cells/well) were seeded in 6-well culture plates and treated with 10 μM of alpha mangosteen, Man-3DG and Man-6DG. After 7 days, cells were stained with crystal violet and colonies were counted for each well.

실시예 1-5. 상처 치유 분석Examples 1-5. wound healing analysis

Hep3B 세포 (3 x 105 세포/웰)를 24-웰 배양 플레이트에 시딩 하였다. 융합된 단층 세포를 팁을 사용하여 긁은 다음, 각 웰을 인산 완충 식염수 (PBS)로 세척하여 부유 세포를 제거하였다. 세포를 10 μM의 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG로 처리 한 후 48 시간 동안 배양하였다. 세포 이미지를 광학 현미경 (미국 캘리포니아 주 펜실베니아 주 센터 밸리 소재의 올림푸스) 하에서 상이한 시기(0, 24 및 48 시간)에서 100x 배율로 캡처 하였다.Hep3B cells (3 x 10 5 cells/well) were seeded in 24-well culture plates. The fused monolayer cells were scraped using a tip, and then each well was washed with phosphate buffered saline (PBS) to remove floating cells. Cells were treated with 10 μM of alpha mangosteen, Man-3DG and Man-6DG and then cultured for 48 hours. Cell images were captured at 100x magnification at different times (0, 24 and 48 hours) under an optical microscope (Olympus, Center Valley, PA).

실시예 1-6. 세포 주기 분석Example 1-6. cell cycle analysis

10 μM의 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG로 처리된 Hep3B 세포 (3 x 105 세포/웰)를 트립신으로 처리한 다음 차가운 PBS로 세척하고, 차가운 70 % 에탄올로 고정시켜 -20℃에서 밤새 보관 하였다. 세포를 PBS로 세척하고 100 μg / mL 프로피디움 아이오디드(propidium iodide, PI) 용액 (Muse Cell Cycle Assay Reagent; Millipore, Hayward, CA, USA)에서 30 분 동안 어두운 곳에서 실온에서 배양 하였다. 그리고 유세포 분석법 (Muse Cell Analyzer; Millipore)을 사용하여 세포 DNA 함량을 분석하였다. Hep3B cells (3 x 10 5 cells/well) treated with 10 µM of alpha-mangosteen, Man-3DG and Man-6DG were trypsinized, washed with cold PBS, fixed with cold 70% ethanol, and fixed at -20 °C. was stored overnight in Cells were washed with PBS and incubated in 100 μg/mL propidium iodide (PI) solution (Muse Cell Cycle Assay Reagent; Millipore, Hayward, CA, USA) for 30 min in the dark at room temperature. And the cellular DNA content was analyzed using flow cytometry (Muse Cell Analyzer; Millipore).

실시예 1-7. 세포사멸 분석Example 1-7. apoptosis assay

40 μM의 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG로 처리된 Hep3B 세포 (3 × 105 세포 / 웰)를 수확하고, PBS로 세척한 다음, 100 ㎕의 아넥신 V-FITC 및 PI 용액 (Muse Annexin V & Dead Cell Reagent; Millipore)으로 20 분 동안 실온에서 염색 한 후 100 ㎕의 배지를 사용하여 현탁시켰다. 염색된 세포를 유세포 분석법 (Muse Cell Analyzer; Millipore)으로 분석하였다. Hep3B cells (3 × 10 5 cells/well) treated with 40 μM alpha-mangosteen, Man-3DG and Man-6DG were harvested, washed with PBS, and then 100 μl of annexin V-FITC and PI solution ( After staining with Muse Annexin V & Dead Cell Reagent; Millipore) at room temperature for 20 minutes, 100 μl of the medium was used to suspend. The stained cells were analyzed by flow cytometry (Muse Cell Analyzer; Millipore).

실시예 1-8. 웨스턴 블롯 분석Examples 1-8. Western blot analysis

24 시간 동안 α-망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG (10 및 20 μM)로 처리한 후, Hep3B 세포를 수확하고 2x Laemmli 샘플 완충액 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)에 용해시켰다. 세포 용해물에 10 % 소듐도데실 설페이트-폴리 아크릴 아미드 겔 전기영동(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)을 수행하고, 분리된 단백질을 표준 전기 블롯팅 절차를 사용하여 폴리비닐리덴디플루오라이드 (polyvinylidene difluoride, PVDF)막 (밀리 포어)으로 옮겼다. 블롯을 실온에서 1 시간 동안 5 % 또는 1 % 탈지유를 사용하여 차단하고 cleaved caspase-3, cleaved caspase-9, Bax, Bcl-XL, Atg5, Beclin-1, LC3B, p62, phospho-Met (Tyr1234/1235), Met, phospho-AKT (Ser473), AKT, phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204), ERK1/2, HIF-1α, Nanog, Oct4, Sox2, CD44, CD133 및 β-actin (dilution 1:2000)에 대한 1차 항체로 4℃에서 밤새 표지 하였다. 총 2 시간 동안 tris buffered saline with Tween 20(TBST)으로 3 회 세척한 후, 토끼 또는 마우스에 대한 2 차 항체 (희석 1 : 3000)를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 배양 하였다. 제조업체의 지침에 따라 ECL (Enhanced Chemiluminescence) 키트 (Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 사용하여 면역 표지를 검출했다.After treatment with α-mangosteen, Man-3DG, and Man-6DG (10 and 20 μM) for 24 h, Hep3B cells were harvested and lysed in 2x Laemmli sample buffer (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). made it Cell lysates were subjected to 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and the isolated proteins were subjected to polyvinylidene dilution using standard electroblotting procedures. It was transferred to a fluoride (polyvinylidene difluoride, PVDF) membrane (Millipore). Blots were blocked using 5% or 1% skim milk for 1 h at room temperature, and cleaved caspase-3, cleaved caspase-9, Bax, Bcl-XL, Atg5, Beclin-1, LC3B, p62, phospho-Met (Tyr1234/Tyr1234/ 1235), Met, phospho-AKT (Ser473), AKT, phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204), ERK1/2, HIF-1α, Nanog, Oct4, Sox2, CD44, CD133 and β-actin (dilution 1: 2000), and labeled overnight at 4°C. After washing 3 times with tris buffered saline with Tween 20 (TBST) for a total of 2 hours, secondary antibody (dilution 1:3000) to rabbit or mouse was added and incubated for 1 hour at room temperature. Immunolabeling was detected using an Enhanced Chemiluminescence (ECL) kit (Bio-Rad Laboratories, Inc.) according to the manufacturer's instructions.

실시예 1-9. 종양 세포-유도 혈관 신생 분석Examples 1-9. Tumor cell-induced angiogenesis assay

화학 침습 분석에 기초한 in vitro 공동 배양 시스템을 사용하여 종양 세포-유발 화학 침습 분석을 수행하였다. Hep3B 세포를 하부 챔버에 시딩하고 10 및 20 μM의 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG을 24 시간 동안 처리 하였다. 하부 챔버의 배지를 새로운 배지로 교체하고, 혈청이 고갈된 HUVEC (8 × 104 세포/웰)를 상부 챔버에 첨가하였다. 챔버를 37 ℃에서 18 시간 동안 인큐베이션 하였다. 하부 챔버에 침입 한 HUVEC를 70 % 메탄올을 사용하여 고정시키고 실온에서 5분 동안 헤 마톡실린 및 에오신 (H & E)으로 염색하였다. 총 침습된 세포를 촬영하고 광학 현미경 (Olympus)을 사용하여 100 배율로 계수 하였다.Tumor cell-induced chemical invasion assays were performed using an in vitro co-culture system based on chemical invasion assays. Hep3B cells were seeded in the lower chamber and treated with 10 and 20 μM of alpha-mangosteen, Man-3DG and Man-6DG for 24 h. The medium in the lower chamber was replaced with fresh medium, and serum-depleted HUVECs (8×10 4 cells/well) were added to the upper chamber. The chamber was incubated at 37 °C for 18 h. HUVECs that invaded the lower chamber were fixed using 70% methanol and stained with hematoxylin and eosin (H&E) for 5 min at room temperature. Totally invaded cells were photographed and counted at 100 magnification using an optical microscope (Olympus).

실시예 1-10. 엘라이자(ELISA)을 이용한 VEGF 측정Examples 1-10. VEGF measurement using ELISA

10 및 20 μM의 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG로 처리된 Hep3B 세포로부터 생성된 배지에서의 VEGF 농도는 제조사의 지시에 따라 VEGF 면역 분석 키트 (Koma Biotech, Seoul, Korea)를 사용하여 분석되었다. 결과는 각 웰로부터 단백질의 총량에 대한 VEGF의 농도로서 표현되었다.The VEGF concentration in the medium generated from Hep3B cells treated with 10 and 20 μM of alpha-mangosteen, Man-3DG and Man-6DG was measured using a VEGF immunoassay kit (Koma Biotech, Seoul, Korea) according to the manufacturer's instructions. analyzed. Results were expressed as the concentration of VEGF relative to the total amount of protein from each well.

실시예 1-11. 3차원 세포 배양Examples 1-11. 3D cell culture

Hep3B 세포를 1x B-27 무혈청 보충제 (Gibco), 5 μg / mL 헤파린 (Sigma-Aldrich), 2 mM을 함유하는 둘베코변형된 이글배지 / 영양 혼합물 F-12 (DMEM / F12; Gibco), L- 글루타민 (Gibco), 20ng / mL 표피 성장 인자 (EGF; Gibco), 20ng / mL 기본 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF; Koma Biotech) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (Gibco)에서 배양 하였다. Hep3B cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium/nutrient mixture F-12 (DMEM/F12; Gibco) containing 1x B-27 serum-free supplement (Gibco), 5 µg/mL heparin (Sigma-Aldrich), 2 mM, Cultured in L-glutamine (Gibco), 20 ng/mL epidermal growth factor (EGF; Gibco), 20 ng/mL basic fibroblast growth factor (bFGF; Koma Biotech) and 1% penicillin/streptomycin (Gibco).

실시예 1-12. CellTiter-Glo® 발광 세포 생존력 분석Examples 1-12. CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay

Hep3B 세포 (3 × 103 세포 / 웰)를 96-화이트-웰 배양 플레이트에 시딩 하였다. 세포를 다양한 농도 (0-25 μM)의 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG로 처리하고 7일 동안 무혈청 현탁 스페로이드 배양 조건에서 배양 하였다. 그 후, 20㎕의 기질 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 배양 플레이트를 2분 동안 진탕시키고 8분 동안 어두운 곳에서 인큐베이션 하였다. 발광은 다중 모드 마이크로 플레이트 리더 (BioTek, Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 검출되었다.Hep3B cells (3 × 10 3 cells/well) were seeded in 96-white-well culture plates. Cells were treated with various concentrations (0-25 μM) of alpha-mangosteen, Man-3DG and Man-6DG and cultured in serum-free suspension spheroid culture conditions for 7 days. Then, 20 μl of the substrate solution was added to each well, the culture plate was shaken for 2 minutes and incubated in the dark for 8 minutes. Luminescence was detected using a multimode microplate reader (BioTek, Inc., Winooski, VT, USA).

실시예 1-13. 종양구 형성 분석Examples 1-13. Oncosphere formation assay

Hep3B 세포 (3 x 103 세포 / 웰)를 96-웰 배양 플레이트에 시딩하고 3.13 μM의 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG로 처리 하였다. 7일 동안 3D 배양 환경에서 배양한 후, 100 x 광학 현미경 (Olympus)으로 종양구의 크기와 수를 확인했다.Hep3B cells (3 x 10 3 cells/well) were seeded in 96-well culture plates and treated with 3.13 μM of alpha mangosteen, Man-3DG and Man-6DG. After culturing in a 3D culture environment for 7 days, the size and number of tumor spheres were checked with a 100 x optical microscope (Olympus).

실시예 1-14. 통계 분석Examples 1-14. statistical analysis

모든 실험은 3 회 이상 반복하였다. 결과는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표현되었으며 SPSS 통계 패키지 (SPSS 9.0; SPSS Inc.)를 사용한 분산 분석 (ANOVA)을 사용하여 그룹 간의 차이를 분석했다. 사후 분석은 Tukey의 테스트에 의해 수행되었고 <0.05의 p-값은 통계적으로 유의미한 차이를 나타내는 것으로 간주되었다.All experiments were repeated at least 3 times. Results were expressed as mean ± standard deviation (SD) and differences between groups were analyzed using analysis of variance (ANOVA) using the SPSS statistics package (SPSS 9.0; SPSS Inc.). Post hoc analysis was performed by Tukey's test and a p-value of <0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

<실시예 2: 알파 망고스틴 글리코사이드가 HCC 세포 성장에 미치는 영향 분석><Example 2: Analysis of the effect of alpha mangosteen glycoside on HCC cell growth>

세가지 다른 HCC 세포주 (HepG2, Huh7 및 Hep3B)의 성장에 대한 알파 망고스틴 글리코사이드, Man-3DG 및 Man-6DG의 효과를 조사하였다. 상기 세포를 72 시간 동안 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG(0-100 μM)로 처리하고 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 통해 세포 성장을 측정하였다.The effect of alpha mangosteen glycoside, Man-3DG and Man-6DG on the growth of three different HCC cell lines (HepG2, Huh7 and Hep3B) was investigated. The cells were treated with alpha-mangosteen, Man-3DG and Man-6DG (0-100 μM) for 72 hours and analyzed by MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Cell growth was measured through

그 결과, 도 2의 A에 도시된 바와 같이, 알파 망고스틴 글리코사이드는 HepG2, Huh7 및 Hep3B 세포의 성장을 강력하게 억제하였다(알파 망고스틴 IC50 = 7.3, 15.9 및 13.1 μM; Man-3DG는 각각 IC50 = 12.6, 22.3 및 25.0 μM; Man-6DG는 각각 IC50 = 7.0, 14.7 및 12.5 μM). 특히, Man-6DG는 알파 망고스틴과 유사한 정도로 HCC 세포에 대한 성장 억제 효과를 나타냈다.As a result, as shown in Fig. 2A, alpha mangosteen glycoside strongly inhibited the growth of HepG2, Huh7 and Hep3B cells (alpha mangosteen IC 50 = 7.3, 15.9 and 13.1 μM; Man-3DG was IC 50 = 12.6, 22.3 and 25.0 μM, respectively; Man-6DG has IC 50 = 7.0, 14.7 and 12.5 μM, respectively). In particular, Man-6DG exhibited a growth inhibitory effect on HCC cells to a degree similar to that of alpha mangosteen.

그 다음, HCC 세포의 클론 성장에 대한 Man-3DG 및 Man-6DG의 효과를 조사하였다. 도 2의 B에 도시된 바와 같이, HepG2, Huh7 및 Hep3B 세포의 콜로니 형성은 10 μM의 농도를 사용하여 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG로 처리한 후에 억제되었다. 또한, 알파 망고스틴 글리코사이드 유사체는 HCC 세포에 대한 항증식 효과를 갖는 것으로 관찰되었다.Next, the effects of Man-3DG and Man-6DG on the clonal growth of HCC cells were investigated. As shown in Fig. 2B, colony formation of HepG2, Huh7 and Hep3B cells was inhibited after treatment with alpha mangosteen, Man-3DG and Man-6DG using a concentration of 10 μM. In addition, an alpha mangosteen glycoside analog was observed to have an antiproliferative effect on HCC cells.

<실시예 3: 알파 망고스틴 글리코사이드가 Hep3B 세포 이동에 미치는 영향 분석><Example 3: Analysis of Effect of Alpha Mangosteen Glycoside on Hep3B Cell Migration>

HCC 세포의 이동에 대한 Man-3DG 및 Man-6DG의 효과를 평가하기 위해, Hep3B 세포를 사용하여 상처 치유 분석(wound-healing assay)을 수행하였다. 그 결과 Man-6DG는 알파 망고스틴에서 관찰된 바와 같이, 대조군 세포와 비교하여 처리 후 48 시간에 Hep3B 세포의 이동을 상당히 감소시켰음을 보여주었다(도 3). 이는 Man-6DG는 HCC 세포의 전이를 억제할 수 있음을 의미한다.To evaluate the effect of Man-3DG and Man-6DG on the migration of HCC cells, a wound-healing assay was performed using Hep3B cells. As a result, it was shown that Man-6DG significantly reduced the migration of Hep3B cells 48 hours after treatment compared to control cells, as observed in alpha mangosteen ( FIG. 3 ). This means that Man-6DG can inhibit the metastasis of HCC cells.

<실시예 4: 알파 망고스틴 글리코사이드가 Hep3B 세포의 세포사멸에 미치는 영향 분석><Example 4: Analysis of the effect of alpha-mangosteen glycoside on apoptosis of Hep3B cells>

비정상적인 세포주기 진행 및 세포사멸(apoptosis)의 회피는 암의 일반적인 특징이다. 따라서, 암 세포에서 세포주기 정지 및 세포사멸의 유도는 항암 작용의 주요 세포 기전으로 간주된다.Abnormal cell cycle progression and avoidance of apoptosis are common features of cancer. Therefore, induction of cell cycle arrest and apoptosis in cancer cells is considered to be a major cellular mechanism of anticancer action.

알파 망고스틴 글리코사이드가 세포주기의 특정 단계에서 정지를 유발함으로써 HCC 세포 성장을 억제하는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 유동 세포 계측 분석을 통해 Hep3B 세포의 세포주기 분포에 대한 Man-3DG 및 Man-6DG의 효과를 조사하였다. 그 결과, 도 4의 A에 도시 된 바와 같이, 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG는 처리되지 않은 대조군 세포와 비교하여 G2/M 단계 세포 집단의 현저한 감소와 함께 G0/G1 단계 세포 집단의 현저한 증가를 유도 하였다. 이들 데이터는 알파 망고스틴 및 이의 글리코사이드가 G0/G1 단계에서 세포주기 정지를 통해 Hep3B 세포의 성장을 억제함을 입증한다.To determine whether alpha-mangosteen glycoside inhibits HCC cell growth by inducing arrest at certain stages of the cell cycle, we analyzed the cell cycle distribution of Man-3DG and Man in Hep3B cells by flow cytometry analysis. The effect of -6DG was investigated. As a result, as shown in Fig. 4A, alpha mangosteen, Man-3DG and Man-6DG showed a significant decrease in the G2/M stage cell population compared to the untreated control cells, along with a G0/G1 stage cell population. induced a significant increase in These data demonstrate that alpha mangosteen and its glycosides inhibit the growth of Hep3B cells through cell cycle arrest in the G0/G1 phase.

추가로 HCC 세포에 대한 Man-3DG 및 Man-6DG의 항증식 효과가 Annexin V-FITC / PI 이중 염색 후 유세포 분석을 통해 아포토시스와 관련이 있는지 여부를 조사했다. 그 결과 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG의 처리는 대조군에서 3.15 %, 알파 망고스틴에서 65.2 %, Man-3DG에서 10.25 %, 및 Man-6DG에서 28.55 % 비율로 Hep3B 세포의 아포토시스를 유의하게 향상 시켰음을 보여 주었다(도 4의 B).We further investigated whether the antiproliferative effects of Man-3DG and Man-6DG on HCC cells were associated with apoptosis by flow cytometry after Annexin V-FITC/PI double staining. As a result, treatment with alpha-mangosteen, Man-3DG, and Man-6DG showed significant apoptosis in Hep3B cells at a rate of 3.15% in the control group, 65.2% in alpha-mangosteen, 10.25% in Man-3DG, and 28.55% in Man-6DG. It was shown that it was significantly improved (FIG. 4B).

알파 망고스틴은 HCC 세포에서 미토콘드리아 의존성 세포사멸을 유도하는 것으로 보고되었다. 따라서, 본 발명자들은 Hep3B 세포에서 미토콘드리아 매개 세포사멸의 중요한 조절 인자의 발현에 대한 Man-3DG 및 Man-6DG의 효과를 평가하였다. 그 결과, 도 5의 A에 도시된 바와 같이, Man-3DG 및 Man-6DG는 cleaved caspase-3, cleaved caspase-9 및 Bax 단백질 수준을 증가시키는 반면, Bcl-XL의 단백질 수준은 감소시켰다. 특히, Man-6DG는 Man-3DG보다 세포사멸 관련 단백질의 발현을 보다 효과적으로 조절하였다. 또한, caspase-3 억제제 Z-DEVD-FMK는 알파 망고스틴 글리코사이드에 의해 억제된 Hep3B 세포의 생존력을 부분적으로 회복시켰다(도 5의 B).Alpha mangosteen has been reported to induce mitochondrial-dependent apoptosis in HCC cells. Therefore, we evaluated the effect of Man-3DG and Man-6DG on the expression of important regulators of mitochondrial-mediated apoptosis in Hep3B cells. As a result, as shown in FIG. 5A , Man-3DG and Man-6DG increased cleaved caspase-3, cleaved caspase-9 and Bax protein levels, while decreasing the protein level of Bcl-XL. In particular, Man-6DG more effectively regulated the expression of apoptosis-related proteins than Man-3DG. In addition, the caspase-3 inhibitor Z-DEVD-FMK partially restored the viability of Hep3B cells inhibited by alpha mangosteen glycoside ( FIG. 5B ).

종합적으로, 상기 결과는 G0/G1 세포주기 정지 및 미토콘드리아 카스파제 의존성 세포사멸 유도에 의해 Man-3DG 및 Man-6DG는 HCC 세포에 대해 항암 활성 우수하다는 것을 의미한다.Collectively, these results suggest that Man-3DG and Man-6DG have excellent anticancer activity against HCC cells by G0/G1 cell cycle arrest and mitochondrial caspase-dependent apoptosis induction.

<실시예 5: 알파 망고스틴 글리코사이드가 Hep3B 세포의 자가 포식에 미치는 영향 분석><Example 5: Analysis of the effect of alpha-mangosteen glycoside on autophagy of Hep3B cells>

자가 포식의 활성화가 HCC 세포에서 알파 망고스틴 글리코 사이드의 항암 효과와 관련이 있는지 확인하기 위해, 본 발명자들은 웨스턴 블롯팅을 통해 Hep3B 세포에서 자가 포식 관련 단백질의 발현에 대한 Man-3DG 및 Man-6DG의 조절 효과를 조사하였다. 그 결과, 도 6의 A에 도시된 바와 같이, Atg5, Beclin-1, LC3B-II 및 p62 단백질 수준은 알파 망고스틴 글리코사이드로 처리한 후 Hep3B 세포에서 상향 조절되었고 이는 Man-3DG 및 Man-6DG는 HCC 세포에서 자가 포식 활성화 및 세포사멸을 유발할 수 있음을 의미한다.To determine whether the activation of autophagy is related to the anticancer effect of alpha-mangosteen glycoside in HCC cells, we analyzed Man-3DG and Man-6DG for the expression of autophagy-related proteins in Hep3B cells by western blotting. was investigated for the modulating effect of As a result, as shown in FIG. 6A , Atg5, Beclin-1, LC3B-II and p62 protein levels were upregulated in Hep3B cells after treatment with alpha mangosteen glycoside, which is Man-3DG and Man-6DG means that it can induce autophagy activation and apoptosis in HCC cells.

HCC 세포에서 알파 망고스틴 글리코사이드에 의해 유도된 자가 포식 및 세포사멸의 역할을 추가로 이해하기 위해, Hep3B 세포를 자가 포식 억제제인 3-MA의 존재 또는 부재하에 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG로 처리 하였다. 그 결과 도 6의 B에 도시된 바와 같이, 알파 망고스틴 및 Man-3DG 및 Man-6DG 단독 처리와 비교하여 알파 망고스틴 및 그의 글리코사이드와 3-MA 병용 처리는 Hep3B 세포의 생존력을 더욱 강력하게 감소시켰다. 이러한 결과는 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG에 의해 유도 된 자가 포식 활성화가 HCC 세포에서 야기된 세포 사멸에서 보호 역할을 할 수 있음을 의미한다.To further understand the role of autophagy and apoptosis induced by alpha-mangosteen glycosides in HCC cells, Hep3B cells were treated with alpha-mangosteen, Man-3DG and Man in the presence or absence of the autophagy inhibitor 3-MA. Treated with -6DG. As a result, as shown in FIG. 6B , compared to treatment with alpha mangosteen and Man-3DG and Man-6DG alone, treatment with alpha mangosteen and its glycosides and 3-MA more strongly enhanced the viability of Hep3B cells. decreased. These results suggest that autophagy activation induced by alpha-mangosteen, Man-3DG and Man-6DG may have a protective role in apoptosis induced in HCC cells.

<실시예 6: Hep3B 세포에서 c-Met 신호 전달 경로에 대한 알파 망고스틴 글리코 사이드의 효과 확인><Example 6: Confirmation of the effect of alpha-mangosteen glycoside on the c-Met signaling pathway in Hep3B cells>

비정상적인 c-Met 신호는 HCC 진행의 중요한 요인 중 하나이다. MAPK 및 PI3K / AKT를 포함한 여러 다운 스트림 신호 경로는 c-Met에 의해 활성화되어 HCC 세포의 성장과 전이를 상향 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 알파 망고스틴 글리코사이드가 Hep3B 세포에서 c-Met 및 그의 다운스트림 이펙터, p44 / 42 MAPK (ERK1 / 2) 및 AKT의 활성화에 영향을 미치는지 여부를 결정 하였다.Abnormal c-Met signaling is one of the important factors in HCC progression. Several downstream signaling pathways, including MAPK and PI3K/AKT, can be activated by c-Met to upregulate the growth and metastasis of HCC cells. Therefore, we determined whether alpha-mangosteen glycoside affects the activation of c-Met and its downstream effectors, p44/42 MAPK (ERK1/2) and AKT in Hep3B cells.

그 결과, 도 7에 도시 된 바와 같이, Man-3DG 및 Man-6DG는 총 단백질 수준을 억제하지 않으면서 c-Met, AKT 및 ERK1 / 2의 인산화를 효과적으로 억제하여, c-Met 매개된 신호 캐스케이드의 하향 조절을 통해 알파 망고스틴 글리코사이드가 HCC 세포에 대한 항암 활성을 나타낼 수 있음을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 7, Man-3DG and Man-6DG effectively inhibited phosphorylation of c-Met, AKT and ERK1/2 without inhibiting total protein levels, resulting in a c-Met mediated signaling cascade. It was confirmed that alpha-mangosteen glycoside can exhibit anticancer activity against HCC cells through down-regulation of .

<실시예 7: 알파 망고스틴 글리코사이드가 Hep3B 세포 유도된 혈관 신생에 미치는 영향 확인><Example 7: Confirmation of Effect of Alpha Mangosteen Glycoside on Hep3B Cell-induced Angiogenesis>

알파 망고스틴 글리코사이드가 HCC 세포 유도 혈관 신생을 억제하는지 여부를 평가하기 위해, Hep3B 세포에 의해 자극된 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)의 튜브형성 및 침습에 대한 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG의 효과를 조사 하였다. 그 결과, 도 8의 A에 도시된 바와 같이, Hep3B 세포로부터의 조절 배지(CM)는 대조 배지와 비교하여 HUVEC의 튜브 형성을 유도하였다. 그러나 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG로 처리된 CM은 HUVEC의 튜브 형성을 현저히 차단 하였다.To evaluate whether alpha-mangosteen glycoside inhibits HCC cell-induced angiogenesis, alpha-mangosteen, Man-3DG and Man on tubing and invasion of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) stimulated by Hep3B cells. The effect of -6DG was investigated. As a result, as shown in FIG. 8A , the conditioned medium (CM) from Hep3B cells induced tube formation of HUVECs compared to the control medium. However, CMs treated with alpha-mangosteen, Man-3DG and Man-6DG significantly blocked tube formation of HUVECs.

공배양 분석을 사용하여 Hep3B 세포에 의해 유도된 HUVECs 침입에 대한 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG의 효과를 조사했다. Hep3B 세포와 공동 배양된 HUVEC는 대조군과 비교하여 상당한 침습을 나타냈다 (도 8의 B). 그러나, 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG로 처리 된 Hep3B 세포는 HUVEC의 증가된 침입을 효과적으로 방지하여, 알파 망고스틴 글리코사이드가 HCC 세포-유도된 혈관 신생을 억제할 수 있음을 확인하였다.A co-culture assay was used to investigate the effects of alpha mangosteen, Man-3DG and Man-6DG on invasion of HUVECs induced by Hep3B cells. HUVECs co-cultured with Hep3B cells showed significant invasion compared to controls ( FIG. 8B ). However, Hep3B cells treated with alpha-mangosteen, Man-3DG and Man-6DG effectively prevented the increased invasion of HUVECs, confirming that alpha-mangosteen glycoside could inhibit HCC cell-induced angiogenesis. .

<실시예 8: 알파 망고스틴 글리코사이드가 저산소증 유도 HIF-1α 단백질 축적에 미치는 영향 확인><Example 8: Confirmation of the effect of alpha-mangosteen glycoside on hypoxia-induced HIF-1α protein accumulation>

알파 망고스틴 글리코사이드의 종양 혈관 신생 억제 효과를 매개하는데 있어서 HIF-1α의 역할을 평가하기 위해, Hep3B 세포의 HIF-1α 발현에 대한 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG의 효과를 웨스턴 블롯팅을 통해 분석하였다. 그 결과 도 9의 A에 나타난 바와 같이, 이들 모두는 Hep3B 세포에서 HIF-1α 단백질의 저산소증-유도 축적을 현저하게 억제하였다. 또한, ELISA를 통해 VEGF의 발현에 대한 알파 망고스틴 글리코사이드의 효과를 확인하였다. 그 결과, 저산소 상태에서 Hep3B 세포의 VEGF 생성은 α-망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG로 처리함으로써 현저하게 감소됨을 확인하였다(도 9의 B). 이들 데이터는 알파 망고스틴 글리코사이드가 HIF-1α 및 그의 다운스트림 표적 VEGF의 발현을 억제함으로써 HCC 세포 유도된 혈관 신생을 억제할 수 있음을 의미한다.To evaluate the role of HIF-1α in mediating the tumor angiogenesis inhibitory effect of alpha-mangosteen glycoside, the effects of alpha-mangosteen, Man-3DG and Man-6DG on HIF-1α expression in Hep3B cells were westernized. Analyzed by lot. As a result, as shown in FIG. 9A , all of them significantly inhibited the hypoxia-induced accumulation of HIF-1α protein in Hep3B cells. In addition, the effect of alpha mangosteen glycoside on the expression of VEGF was confirmed through ELISA. As a result, it was confirmed that the VEGF production of Hep3B cells in hypoxia was significantly reduced by treatment with α-mangosteen, Man-3DG and Man-6DG ( FIG. 9B ). These data suggest that alpha mangosteen glycoside can inhibit HCC cell-induced angiogenesis by inhibiting the expression of HIF-1α and its downstream target VEGF.

또한, 알파 망고스틴 글리코사이드에 의한 HIF-1α 억제 효과가 프롤릴-하이드 록실라제(prolyl-hydroxylase, PHD) 활성과 관련이 있는지 평가하였다. 그 결과, 도 9의 C에 도시된 바와 같이, PHD 억제제인 디메틸옥살리글리신(dimethyloxalylglycine, DMOG) 처리는 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG에 의한 HIF-1α 단백질의 분해를 억제 하였다. 이는 화합물이 PHD 활성의 상향 조절을 통해 HIF-1α의 단백질 안정성을 감소시킬 수 있음을 시사한다.In addition, it was evaluated whether the inhibitory effect of HIF-1α by alpha mangosteen glycoside was related to prolyl-hydroxylase (PHD) activity. As a result, as shown in FIG. 9C , treatment with dimethyloxalylglycine (DMOG), a PHD inhibitor, inhibited the degradation of HIF-1α protein by alpha mangosteen, Man-3DG and Man-6DG. This suggests that the compound may decrease the protein stability of HIF-1α through upregulation of PHD activity.

<실시예 9: 알파 망고스틴 글리코사이드가 Hep3B 세포 종양 형성 및 암 줄기능에 미치는 영향 확인><Example 9: Confirmation of Effect of Alpha Mangosteen Glycoside on Hep3B Cell Tumor Formation and Cancer Stem Function>

3D 배양 환경에서 알파 망고스틴 글리코사이드의 항암 효과를 추가로 확인하기 위해 Hep3B 세포를 무혈청 현탁 스페로이드 배양 조건에서 성장시켰다. 그 결과 도 10의 A에 도시된 바와 같이, 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG는 3D 배양 Hep3B 세포의 성장을 강력하게 억제 하였다(각각 IC50 = 4.17, 9.99 및 2.98 μM). To further confirm the anticancer effect of alpha-mangosteen glycoside in a 3D culture environment, Hep3B cells were grown in serum-free suspension spheroid culture conditions. As a result, as shown in FIG. 10A, alpha mangosteen, Man-3DG and Man-6DG strongly inhibited the growth of 3D cultured Hep3B cells (IC 50 = 4.17, 9.99 and 2.98 μM, respectively).

특히, Man-6DG는 알파 망고스틴과 비교하여 3D 배양된 HCC 세포에서 더 우수한 성장 억제 효과를 나타냈다. 또한, Hep3B 세포의 종양구 형성 능력은 3.13 μM의 Man-6DG로 처리시 현저히 억제됨을 확인하였다(도 10의 B 및 10의 C). Man-6DG는 지시된 용량에서 알파 망고스틴 및 Man-3DG와 비교하여 종양구의 크기 및 수를 효과적으로 감소시켰다. In particular, Man-6DG showed a better growth inhibitory effect in 3D cultured HCC cells compared to alpha mangosteen. In addition, it was confirmed that the tumorisphere formation ability of Hep3B cells was significantly inhibited when treated with 3.13 μM Man-6DG ( FIGS. 10B and 10C ). Man-6DG effectively reduced the size and number of tumor cells compared to alpha mangosteen and Man-3DG at the doses indicated.

또한 알파 망고스틴 글리코사이드가 Hep3B 세포의 3D 종양구 배양 조건에서 HCC CSC에 대한 주요 줄기 관련 마커의 발현을 조절하는지 여부를 조사했다. 그 결과 알파 망고스틴, Man-3DG 및 Man-6DG 처리는 3D 종양구 배양 Hep3B 세포에서 Nanog, Oct4, Sox2, CD44 및 CD133을 포함한 암 줄기 조절자의 발현 수준을 현저하게 감소시켰다 (도 10의 D). 특히, 암 줄기 마커의 발현에 대한 Man-6DG의 억제 효과는 알파 망고스틴 및 Man-3DG 보다 더 강력했다. 이들 데이터는 Man-6DG가 생체 내 환경에서 알파 망고스틴 보다 우수한 생체 이용률 뿐만 아니라 HCC CSC를 제거하기위한 우수한 치료 잠재력을 가질 수 있음을 시사한다.We also investigated whether alpha-mangosteen glycoside regulates the expression of key stem-related markers for HCC CSCs in 3D tumorocyte culture conditions of Hep3B cells. As a result, treatment with alpha-mangosteen, Man-3DG and Man-6DG significantly reduced the expression levels of cancer stem regulators including Nanog, Oct4, Sox2, CD44 and CD133 in 3D tumorocyte cultured Hep3B cells (Fig. 10D). . In particular, the inhibitory effect of Man-6DG on the expression of cancer stem markers was stronger than that of alpha mangosteen and Man-3DG. These data suggest that Man-6DG may have superior therapeutic potential to clear HCC CSCs as well as better bioavailability than alpha-mangosteen in the in vivo environment.

Claims (14)

알파-망고스틴-3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
Alpha-by β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin- 3-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside) or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the active ingredient-mangosteen-3-O A pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer, comprising.
알파-망고스틴-6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
Alpha-by β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side (α-mangostin- 6-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside) or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the active ingredient-mangosteen-6-O A pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer, comprising.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 자가포식 억제제(autophagy inhibitor)를 더 포함하는 것인, 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition of claim 1 or 2, wherein the pharmaceutical composition further comprises an autophagy inhibitor.
제3항에 있어서, 상기 자가포식 억제제는 3-메틸아데닌(3-methyladenine)인 것인, 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition of claim 3, wherein the autophagy inhibitor is 3-methyladenine.
제3항에 있어서, 상기 자가포식 억제제와 유효성분인 화합물의 몰 농도비는 1: 15 내지 25인 것인, 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition according to claim 3, wherein the molar concentration ratio of the autophagy inhibitor and the active ingredient compound is 1: 15 to 25.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 종양구(tumorsphere)의 형성을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition according to claim 1 or 2, wherein the composition inhibits the formation of tumorspheres.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 Nanog, Oct4, Sox2, CD44 및 CD133으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 암줄기세포 마커 발현을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition according to claim 1 or 2, wherein the composition inhibits expression of one or more cancer stem cell markers selected from the group consisting of Nanog, Oct4, Sox2, CD44 and CD133.
알파-망고스틴-3-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-3-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 개선용 식품 조성물.
Alpha-mangosteen-3-O-β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side liver cancer or prevention comprising the (α-mangostin- 3-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside) or a salt thereof as an active ingredient A food composition for improvement.
알파-망고스틴-6-O-β-D-2-데옥시글루코피라노사이드(α-mangostin-6-O-β-D-2-deoxyglucopyranoside) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 개선용 식품 조성물.
Alpha-mangosteen-6-O-β -D-2- deoxy gluconic nose Llano side liver cancer or prevention comprising the (α-mangostin- 6-O- β -D-2-deoxyglucopyranoside) or a salt thereof as an active ingredient A food composition for improvement.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 식품 조성물은 자가포식 억제제(autophagy inhibitor)를 더 포함하는 것인, 식품 조성물.
The food composition of claim 8 or 9, wherein the food composition further comprises an autophagy inhibitor.
제10항에 있어서, 상기 자가포식 억제제는 3-메틸아데닌(3-methyladenine)인 것인, 식품 조성물.
The food composition of claim 10, wherein the autophagy inhibitor is 3-methyladenine.
제10항에 있어서, 상기 자가포식 억제제와 유효성분인 화합물의 몰 농도비는 1: 15 내지 25인 것인, 식품 조성물.
The food composition according to claim 10, wherein the molar concentration ratio of the autophagy inhibitor and the active ingredient compound is 1: 15 to 25.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 조성물은 종양구(tumorsphere)의 형성을 억제하는 것인, 식품 조성물.
The food composition of claim 8 or 9, wherein the composition inhibits the formation of tumorspheres.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 조성물은 Nanog, Oct4, Sox2, CD44 및 CD133으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 암줄기세포 마커 발현을 억제하는 것인, 식품 조성물.The food composition of claim 8 or 9, wherein the composition inhibits expression of one or more cancer stem cell markers selected from the group consisting of Nanog, Oct4, Sox2, CD44 and CD133.
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