KR20210157007A

KR20210157007A - 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자 및 이를 활용한 다약제 내성을 갖는 암의 치료

Info

Publication number: KR20210157007A
Application number: KR1020200074751A
Authority: KR
Inventors: 성대경; 최원일; 나윤희; 우지섭
Original assignee: 한국세라믹기술원
Priority date: 2020-06-19
Filing date: 2020-06-19
Publication date: 2021-12-28
Also published as: KR102479728B1

Abstract

본 발명은 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자 및 이를 활용한 다약제 내성 (multidrug resistance, MDR)을 갖는 암의 치료에 관한 것이다.

Description

초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자 및 이를 활용한 다약제 내성을 갖는 암의 치료 {Ultrasensitive reactive oxygen species-responsive ferrocene nanoparticles and method for treating cancer with multidrug resistance using the same}

항암화학요법 (chemotherapy)은 가장 효과적인 암환자 치료 방법 중의 하나로 잘 알려져 있으나, 항암제의 지속적 투여는 항암화학요법의 실패를 초래하는 원인이다. 이는 세포가 항암제에 내성을 획득하게 되기 때문이며, 한 종류의 항암제에 대해 내성을 획득하면 구조가 서로 다른 항암제에 대해서도 내성을 획득하는 것으로 알려져 있다. 이와 같이 암세포가 항암제 구조에 상관없이 비특이적인 내성을 획득하는 것을 다약제 내성 (Multidrug Resistance: MDR)이라 한다 (Gottesman et al., Nat Rev Cancer 2:48-58, 2002; Ambudkar et al., Oncogene 22:7468-85, 2003). 이러한 암세포의 MDR 획득은 항암화학요법 실패의 가장 큰 원인 중 하나이다. 항암제 내성이 생기는 원인은 크게 2가지로 분류될 수 있는데 하나는 약물이 세포내로 유입되지 못해 생기는 것이고, 또 다른 하나는 암세포 자체가 유전적 또는 후생유전적 (epigenetic) 변화로 인해 항암제에 대한 감수성이 떨어져 생길 수 있다.

암세포가 MDR을 획득하는 기전을 자세하게 살펴보면 크게 5가지 정도로 나눌 수 있다. 첫째, ATP-의존적 수송체와 같은 유출 펌프 (efflux pump)를 이용하여 세포내 약물을 세포외로 쉽게 유출시켜 세포내 유효약물 농도보다 낮은 농도로 유지하여 내성을 유발할 수 있다 (약물의 세포외 유출 증가). 둘째, 약물수송체 또는 엔도시토시스를 통한 약물 유입 감소로 인하여 세포내 유효약물농도가 유지되지 못해 내성이 발생할 수 있다 (약물의 세포내 유입 감소). 셋째, 세포내로 유입된 약물의 대사를 촉진 또는 불활성화시켜 약물내성을 유도한다 (약물대사효소의 활성화). 넷째, 약물에 의한 DNA 손상을 복구할 수 있는 시스템의 활성화로 약물의 작용을 무력화하여 내성을 발현시킬 수 있다 (DNA 복구 시스템 활성화). 다섯째, 약물에 의해 유도되는 세포사멸을 억제할 수 있는 방어 체계의 활성화로 인하여 내성을 유발할 수 있다 (세포사멸 회피기전 활성화).

이중에서 약물 유출 펌프 과발현에 의한 암세포의 MDR 획득은 효과적인 치료를 위해 항암제를 고용량 투여해야하는 문제를 발생하게 하고, 또한 기존 항암제의 가장 큰 문제인 골수 독성 (bone marrow toxicity)을 야기할 수 있다. 즉, 항암화학요법을 수행할 때, 암세포가 유출 펌프 과발현에 의해 내성을 획득한 경우 암세포는 항암제를 효과적으로 세포외로 유출시켜 생존할 수 있으나, 골수에서는 유출 펌프 발현이 적어 항암제에 감수성이 높아져 세포사멸이 일어나고 골수 독성이 증가될 수 있다.

온도, pH 및 활성산소 (reactive oxygen species, ROS)를 포함하는 자극-반응성 나노 입자 시스템이 예상되는 시간에, 특히 MDR 종양에서 표적 부위로 약물의 정밀하고 제어된 방출을 달성하기 위하여 개발되고 있다. 이들 중에서, 활성산소 반응성 나노 입자는 종양에서 활성산소의 증가된 수준을 활성산소 자극에 의한 제어된 약물 방출을 초래할 수 있기 때문에 이상적인 담체로 여겨지고 있다. 활성산소 반응성 나노 입자의 현저한 발전에도 불구하고, 종양에서 이들의 비교적 느리고 불완전한 약물 방출은 약물의 치료 효능 및 생체 이용률을 상당히 제한하고 있다. 따라서, 암 치료를 향상시키기 위해 특정 활성산소 미세 환경에 빠르게 반응할 수 있는 초민감성 활성산소 반응성 나노 입자 시스템의 개발이 시급한 실정이다.

한편, 페로센(ferrocene)은 매우 안정한 구조의 무독성 유기금속(organometallic) 복합체로 소수성(hydrophobic) 특성을 가지고 있기 때문에 소수성 결합을 통한 코어 형성이 가능하며, 본 발명자들은 특허출원 제10-2018-0126529호에서 “활성산소 민감성 페로센 기반 나노입자 및 이의 제조방법”을 개시한바 있다. 상기 페로센 기반 나노입자는 페로세닐메틸 메타크릴레이트(ferrocenylmethyl methacrylate, FMMA), 및 상기 페로세닐메틸 메타크릴레이트에 결합된 메타크릴레이트(methacrylate, MA)를 포함하는 복합체가 자기-조립(self-assembled)하여 형성되어 활성산소에 민감성을 나타낼 수 있음을 확인하였다. 그러나, MDR 관련 암의 효과적인 치료를 위해 활성산소 환경에서 페로센 나노 입자의 감도가 더욱 개선될 것이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 다약제 내성을 갖는 암 치료에서 사용하기 위한 페로센 기반 나노입자를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 페로센 나노입자의 제조시 용매로서 에탄올을 사용하는 경우 페로센 나노입자의 크기가 감소될 수 있고, 활성산소에 대한 감도가 현저히 증가되며, 항암제의 로딩 효율 및 조절된 방출 효과를 증가시킬 뿐만 아니라, Pgp 억제제의 사용 없이도 항암제의 항암 효능을 개선시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자를 유효성분으로 포함하는 다약제 내성 억제용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자를 포함하는 항암제 보조용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "다약제 내성 (multidrug resistance)"은 세포 특히, 특정 질병을 유발하는 세포가 매우 다른 화학 구조를 갖는 다양한 약물들 또는 화합물들에 대해 내성을 갖는 특성을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "P-당단백질 (P-glycoprotein)"은 ATP-결합 카세트 (ATP-binding cassette, ABC)를 갖는 세포막에 존재하는 수송단백질 (transporter protein)의 일종을 의미하고, 상기 P-당단백질은 약물과 결합하여 ATP를 에너지원으로 사용하는 능동적 수송 기작에 약물을 세포 밖으로 방출시켜 세포에 약물내성을 부여한다. 특히, 암세포에서 발현되는 P-당단백질은 항암 약물에 대한 내성을 증가시켜 항암치료 효능을 현저히 떨어뜨리는 것으로 알려져 있다.

제1구현예에 따르면,

본 발명은

(a) 페로세닐메틸 메타크릴레이트(ferrocenylmethyl methacrylate, FMMA)에 메타크릴레이트(methacrylate, MA)를 결합시켜 페노세닐메틸 메타크릴레이트-메타크릴레이트 복합체를 제조하는 단계;

(b) 상기 페노세닐메틸 메타크릴레이트-메타크릴레이트 복합체를 용매에 용해시키는 단계;

(c) 상기 용매를 제거하여 페노세닐메틸 메타크릴레이트-메타크릴레이트 복합체 필름층을 형성시키는 단계; 및

(d) 상기 필름 층에 친수성 용매를 처리하여 페노세닐메틸 메타크릴레이트-메타크릴레이트 나노입자를 자기-조립(selfassemble)시키는 단계를 포함하는 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자의 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자에 있어서, 상기 단계 (b)에서 용매는 테트라하이드로푸란 (THF), 에탄올 및 테트라하이드로푸란 및 에탄올을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 테트라하이드로푸란 및 에탄올의 부피비는 3:1 내지 1:3일 수 있다.

본 발명에 따른 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자에 있어서, 상기 단계 (b)에서 용매는 에탄올인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자의 제조방법에 있어서, 상기 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자는 하기의 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 한다:

<화학식 1>

(상기 화학식 1에서,

상기 l 및 m은 서로 독립적으로 1 내지 10,000의 정수를 나타낸다.)

본 발명에 따른 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자의 제조방법에 있어서, 상기 페로세닐메틸 메타크릴레이트와 메타크릴레이트의 몰비는 1:1 내지 1:10, 바람직하기는 1:2 내지 1:8인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자의 제조방법에 있어서, 상기 활성산소 민감성 페로센 기반 나노입자는 1 nm 내지 5,000 nm의 크기를 갖는 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 나노입자의 크기는 50-1,000 nm, 바람직하기는 50-500 nm, 더욱 바람직하기는 50-300 nm일 수 있다.

본 발명에 따른 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자에 있어서, 상기 활성산소 민감성 페로센-메틸아크릴레이트 나노입자는 운반대상(cargo)을 봉입하고 있는 것을 특징으로 한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "봉입"은 운반대상의 포집을 포함하는 넓은 개념으로 사용된다.

본 발명에 따른 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자에 있어서, 상기 운반대상은 약물인 것을 특징으로 한다. 상기 약물에는 친수성 약물, 소수성 약물, 화학약물 및 바이오 약물이 모두 포함된다. 예를 들면, 상기 약물은 항암제, 항산화제, 항염증증제, 진통제, 항관절염제, 진정제, 항우울증제, 항정신병 약물, 신경안정제, 항불안제, 항혈관신생 억제제, 면역억제제, 항바이러스제, 항생제, 식용억제제, 항히스타민제, 호르몬제, 항혈전제, 이뇨제, 항고혈압제, 심혈관질환 치료제 및 혈관 확장제 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자에 있어서, 상기 페로센 나노입자는 활성산소 또는 산화제에 의하여 와해(disassembled or disruption) 되어 봉입된 운반대상을 주위로 방출시킬 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자가 항암제를 봉입하는 경우, 상기 나노입자는 종양 조직에 선택적으로 축적될 수 있으므로, 활성산소 또는 산화제에 의하여 나노입자가 와해됨으로써 암조직으로 항암제를 방출할 수 있고, 방출된 항암제에 의하여 암 치료효과를 거둘 수 있다.

제2구현예에 따르면,

본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자를 유효성분으로 포함하는 다약제 내성 억제용 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 다약제 내성 억제용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 다약제 내성은 P-당단백질 (P-glycoprotein)에 의한 다중약물 내성인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 다약제 내성 억제용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 다약제 내성은 항암제에 대한 다약제 내성인 것을 특징으로 한다. 상기 항암제는 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 5-FU, 암사크린(amsacrine), 도노마이신(daunomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 나벨빈(navelbine), 파클리탁셀(paclitaxel), 탁소테르(taxotere), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 콜히친(colchicine), 미톡산트론(mitoxantrone), 닥티노마이신(dactinomycin), 토포테칸(topotecan), 트리메트렉스산(trimetrexate), 미트라마이신(mithramycin) 또는 미토마이신 C(mitomycin C)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 항암제는 구강암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암 또는 요관암에 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것을 아니다.

본 발명에 따른 다약제 내성 억제용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 다약제 내성 억제용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를들 수 있다. 제제 화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 다약제 내성 억제용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 전신 투여가 더 바람직하며, 정맥 내 투여가 가장 바람직하다.

본 발명에 따른 다약제 내성 억제용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 0.03 g/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 8 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

제3구현예에 따르면,

본 발명은 항암제와 병용투여 하기 위한 상기 방법에 의해 제조된 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자를 포함하는 항암제 보조용 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.

상기 항암제 보조용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 항암제는 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 5-FU, 암사크린(amsacrine), 도노마이신(daunomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 나벨빈(navelbine), 파클리탁셀(paclitaxel), 탁소테르(taxotere), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 콜히친(colchicine), 미톡산트론(mitoxantrone), 닥티노마이신(dactinomycin), 토포테칸(topotecan), 트리메트렉스산(trimetrexate), 미트라마이신(mithramycin) 및 미토마이신 C(mitomycin C)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

상기 항암제 보조용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 항암제는 구강암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암 또는 요관암에 사용되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자의 제조 방법에 따르면, 페로센 나노입자의 크기가 감소될 수 있고, 활성산소에 대한 감도가 현저히 증가되며, 항암제의 로딩 효율 및 조절된 방출 효과를 증가시킬 뿐만 아니라, Pgp 억제제의 사용 없이도 항암제의 항암 효능을 개선시킬 수 있다.

본 발명의 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자를 유효성분으로 포함하는 다약제 내성 억제용 약제학적 조성물에 따르면, 상기 약학적 조성물은 P-당단백질(P-gp)활성을 저해함으로써 세포 밖으로의 항암제의 배출을 억제하여 암세포 내로의 항암제의 축적을 증가시켜 항암 효능을 증진시키는 다약제 내성 억제용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 실시예 1에 따라 제조된 페로센 중합체의 1H NMR 결과를 나타낸다.
도 2는 실시예 1에 따라 제조된 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자 (UFNP)의 물리적 화학적특성을 나타낸다. (a) 유체역학적 직경, (b) 다분산 지수 (PDI), (c) 표면 전하 및 (d) UFNP의 주사 전자 현미경 (SEM) 이미지 (A : UFNP1, B : UFNP2, C : UFNP3, D : UFNP4 , E : UFNP5, 스케일 바 : 200 nm).
도 3은 본 발명에 따른 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자 (UFNP)의 안정성을 확인한 실험 결과를 나타낸다. 100 rpm 및 37 ℃에서 (a) 수용액 (DI water, 1 차 조건) 및 (b) 생물학적 완충제 (PBS, 2 차 조건)에서 UFNP의 안정성 분석
도 4는 본 발명에 따른 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자 (UFNP)의 활성산소-반응 특성을 나타낸다. (a) 유체역학적 직경, (b) 표면 전하 및 (c) 0.1 % H2O2로 산화 후 UFNP의 TEM 이미지 (A : 산화 전 UFNP5, B : UFNP5 산화 후 0.5 시간, C : UFNP5 후 1 시간 산화)
도 5는 본 발명에 따른 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자 UFNP5의 PTX에 대한 활성산소 반응성 방출프로파일을 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자 UFNP5 및 UFNP1의 PTX에 대한 활성산소 반응성 방출프로파일을 비교한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자 (UFNP5)의 시험관내 항암 효과를 나타낸다.

이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<물질 및 방법>

1. 물질

페로세닐메틸 메타크릴레이트 (FMMA) (95 %), 메타크릴산 (MA) (99 %) 및 테트라하이드로푸란 (THF, 무수, 99.9 %)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 얻었다. 2,2-아조비스이소부티로니트릴 (AIBN, 99 %)은 Daejung (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 에탄올 (99.9 %)은 Merck KGaA (Darmstadt, Germany)로부터 얻었다. 과산화수소 (H₂O₂, 30 %)는 Junsei Chemical Co. (Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 시험관내 (in vitro) 세포 배양을 위해, DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640은 HyClone (Logan, UT, USA)에서 구입하였다. FBS (Fetal bovine serum), 트립신 (0.25 %) 및 페니실린-스트렙토 마이신은 Gibco (Grand Island, NY, USA)로부터 입수 하였다. 파클리탁셀 (PTX)은 Lc Laboratories (Woburn, MA, USA)로부터 구입 하였다. 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT)는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. 탈이온 (DI) 수 및 포스페이트 완충 식염수 (PBS)는 HyClone (Logan, UT, USA)으로부터 수득 하였다. 모든 용매를 추가 정제 없이 그대로 사용 하였다.

실시예 1. 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자 (UFNP)의 제조

페로세닐메틸 메타크릴레이트 (FMMA, 0.4mmol), 메타크릴레이트 (MA, 2mmol), 2,2-아조비스이소부티로유니니트릴 (AIBN, 0.12mmol)을 이용하여 라디칼 중합에 의해 페로센 중합체를 합성하였다. 합성된 페로센 중합체를 양성자 핵 자기 공명 (¹H NMR, 400 MHz, JEOL JNM-ECZ400S/L1)로 평가하여 페로센 중합체가 성공적으로 합성되었음을 확인하였다 (도 1). 또한, 페로센 중합체의 분자량 (Mw) 및 분자량 분산 지수 (Mw/Mn)를 용리액으로서 THF를 사용하여 35 ℃에서 1.0 mL/분의 유속으로 겔 투과 크로마토그래피 (GPC, Agilent 1200S/miniDAWN TREOS)를 통해 분석하여 페로센 중합체의 분자량 및 분산 지수는 Mw = 9,680, Mw / Mn = 1.9임을 확인하였다.

UFNP를 제조하기 위해, 페로센 중합체를 다양한 비율의 공-용매에 용해시켰다 (UFF1의 경우 THF:Ethanol = 100:0; UFNP1의 경우 75:25, UFNP3의 경우 50:50, UFNP4의 경우 25:75, UFNP5의 경우 0:100). 부드럽게 교반하면서 중합체 용액을 탈이온수에 적가하였다. 그 다음, 공-용매를 2 시간 동안 진공 건조시켜 완전히 제거하였다. 수득된 UFNP의 직경, 다분산 지수 (PDI) 및 표면 전하를 전기 영동 광 산란 분광 광도계 (ELS-Z2, Otsuka Electronics Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 동적 광산란 (DLS)에 의해 측정하였다. UFNP의 형태는 전계 방출-주사 전자 현미경 (FE-SEM, MiRa3, TESCAN, Czech Republic)을 사용하여 수득하였다.

그 결과, 에탄올 비율이 UFNP1에서 UFNP5로 증가함에 따라 UFNP의 크기는 점점 감소하는 것으로 나타났으며, 특히 UFNP5의 직경은 약 70nm로 나타났다. UFNP의 표면 전하는 에탄올의 비율이 감소함에 따라 -22 내지 -43 mV 범위에서 매우 - Charge가 되는 것으로 확인되었다. 또한, UFNP의 입자 크기 분포는 0.2 미만의 PDI에서 허용 가능하며, 이는 UFNP가 양친매성 페로센-함유 중합체에서 적절한 친수성/소수성 균형으로 인해 자기-조립될 수 있음을 나타낸다. 더욱이, 모든 UFNP의 형태학적 연구는 구형을 나타내고 SEM을 통해 관찰된 UFNP의 직경은 DLS를 통해 측정된 것과 유사하였다 (도 2).

실시예 2. UFNP의 안정성 확인

UFNP의 안정성은 두 가지 다른 조건에서 시간에 대한 함수로서 분석하였다. UFNP (1mg/mL)의 모양과 유체역학적 직경은 100 rpm 및 37 ℃에서 수용액 (DI water, 제 1 조건)에서 4 주 동안 각 시점 및 생물학적 완충액 (PBS, 제 2 조건)에서 선택된 시점 (1, 3, 5 및 7d)에서 측정하였다.

그 결과, 4주 동안 수용액에서 모든 UFNP 의 직경 변화는 관찰되지 않았으며, 또한 생물학적 완충액에서도 모든 UFNP는 일주일이 지난 후에도 응집된 형태를 보이지 않음에 따라 UFNP가 높은 안정성을 갖고 있음이 확인되었다 (도 3).

실시예 3. UFNP의 활성산소-반응 특성 확인

UFNP의 활성산소-민감성 거동을 확인하기 위해, 산화제로서 0.1 %의 과산화수소 (H₂O₂)를 온화하게 교반하면서 상기 제조된 UFNP 함유 수용액 (1 mg/mL)에 첨가하였다. 그 다음, 산화에 의한 나노 입자의 크기 및 표면 전하의 변화를 DLS 기기를 사용하여 각 시점 (0h, 0.5h, 1h, 2h 및 4h)에서 모니터링하였다. 또한, 산화된 UFNP의 형태학적 변화 및 외관을 투과 전자 현미경 (TEM, JEM-2100PlusHR, JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하여 선택된 시점 (0 시간, 0.5 시간 및 1 시간)에서 분석하고 UV-vis 스펙트럼을 Mega-900 UV-Vis 분광 광도계 (SCINCO, Seoul, Korea) 상에 기록하였다.

그 결과, 실험된 모든 UFNP의 직경은 과산화수소 처리 후 배양 시간이 증가함에 따라 현저히 증가하는 것으로 확인되었으며, 특히 UFNP5의 경우 직경이 가장 작음에도 불구하고 과산화후소 처리 후 0.5 시간 동안 크기가 5,000 nm 이상으로 증가하여 활성산소에 대한 반응성이 현저히 높은 것으로 나타났다 (도 4).

실시예 4. PTX-로딩된 UFNP의 준비 및 특성 확인

항암제로서 PTX를 사용하여 정상 환경 및 활성산소-풍부한 환경과 같은 다른 조건에서 UFNP의 활성산소-반응 방출 특성을 평가하였다. PTX (각 공-용매에서 500 ㎍/mL)를 5 mg의 페로센 중합체와 혼합한 다음, 실온에서 2 시간 동안 회전 진탕 하에서 서로 반응시켰다. 그 다음, 혼합물을 실린지 펌프를 사용하여 온화하게 교반하면서 5 mL DI 수에 적가하고, 진공 건조에 의해 용매를 제거하였다. 마지막으로, 로딩되지 않은 PTX를 UFNP로 3,000 rpm 및 5 분 동안 Amicon Ultra-15 원심 분리 필터 (MWCO 100 kDa)를 사용하여 한외 여과에 의해 정제하였다. UFNP로의 약물의 로딩 함량 (L.C.) 및 로딩 효율 (L.E.)은 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC, Waters 2695, Waters Corp., MO, USA, MO)를 사용하여 로딩되지 않은 PTX를 측정함으로써 확인하고, 그 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.

	UFNP1	UFNP2	UFNP3	UFNP4	UFNP5
로딩 함량 (L.C.)	9.9wt %	9.9wt %	19.9wt %	19.8wt %	28.9wt %
로딩 효율 (L.E.)	99.9 %	99.9 %	99.7 %	99.2 %	96.4 %

상기 표 1로부터 알 수 있듯이, PTX의 로딩 함량은 UFNP5가 28.9wt %로 가장 우수한 것으로 확인되었다.

실시예 5. UFNP로부터 PTX의 활성산소 반응성 방출 프로파일

PTX 로딩된 UFNP (1 mg/mL)를 100 kDa의 분자량 컷오프 (MWCO)를 갖는 Float-A-Lyzer G2 투석 장치에 넣었다 (Spectra/Pro Dialysis membrane, Repligen, Massachusetts, USA). 그 다음, 방출 장치를 진탕 배양기에서 100 rpm 및 37 ℃에서 0.1 % H₂O₂를 함유하는 10 mL의 포스페이트 완충 식염수 용액 (PBS)에 침지시켰다. 방출된 배지를 선택된 시점에서 24 시간 동안 수집하고 HPLC를 사용하여 측정하였다.

그 결과, H₂O₂ 산화제가 존재하는 경우 UFNP5로부터 PTX는 H₂O₂ 산화제가 존재하지 않는 경우에 비해 현저하게 빠른 속도로 방출되는 것으로 나타났다. H₂O₂ 산화제가 없는 경우, PTX의 대략 17 %가 2 시간 내에 UFNP5로부터 방출되었고 24 시간 후에 누적 방출이 약 27 %에 도달하였다. 반면, H₂O₂ 를 함유하는 PTX @ UFNP5의 유의적 초기 버스트 방출 곡선은 2 시간 및 24 시간 후에 각각 54 % 및 85 %를 크게 증가되는 것으로 나타났다 (도 5). 또한, UFNP1과 UFNP5를 비교해 보면, UFNP5가 UFNP1에 비해 PTX의 더 빠른 방출을 가능하게 하는 것으로 나타났다 (도 6). 이로써 UFNP5가 활성산소 미세 환경에서 PTX의 방출을 극적으로 제어하여 암 치료의 유익한 후보가 될 수 있음이 확인되었다.

실시예 6. 시험관내 ( In vitro ) 항암 효과

세포 생존율은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 분석법을 사용하여 측정하였다. 다제내성 암 모델로서 Pgp 과발현을 갖는 인간 결장 직장 선암 세포 (ATCT로부터의 HCT 15)를 10 % 태아 소 혈청 및 1 % 페니실린이 보충된 RPMI 1640에서 성장시키고 37 ℃, 5 % CO₂의 인큐베이터에서 유지시켰다. 세포를 웰당 1 x 10⁴ 세포 농도로 96-웰 플레이트에 시딩하고 밤새 인큐베이션 하였다. 그 다음, 세포를 샘플 (PTX, PTX-로딩된 UFNP5 및 블랭크 UFNP5)로 처리하고 4 시간, 8 시간, 24 시간 및 48 시간 동안 배양하였다. 결정된 시점에서, 배지를 MTT (1mg/mL)를 함유하는 RPMI 배지로 교체하고 세포를 추가로 2 시간 동안 배양하였다. 마지막으로, 배지를 DMSO로 대체하여 포르마잔 결정을 용해시켰다. 570 nm에서 마이크로 플레이트 리더 (Bio Tek, Winooski, USA)를 사용하여 흡광도를 검출하였다. 세포 생존율은 하기 식을 사용하여 백분율로 평가하였다:

(약물-처리된 샘플의 A570 / 비처리된 샘플의 A570) × 100

모든 실험은 3 회 수행되었고 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현하였다. 통계 분석은 스튜던트 t- 검정을 사용하여 수행하고 p <0.05 (*) 및 p <0.01 (**)에서 유의한 것으로 간주하였다.

그 결과, UFNP5 자체는 세포 독성은 거의 없는 것으로 나타났으며, 유리 PTX이 비해 PTX @ UFNP5의 세포 독성은 크게 향상되는 것으로 확인되었다. 구체적으로, 유리 PTX는 MDR 관련 암 세포상의 P-gp가 PTX로부터 빠르게 펌핑되기 때문에 48 시간 동안 30 % 항암 효과를 갖는 반면, PTX @ UFNP5는 임의의 P-gp 억제제를 사용하지 않고 P-gp 과발현 암 세포에 대한 항암 효과를 유의하게 개선시켜, 24 시간 내에 각각 4 시간 및 20 %에 60 %까지 생존율에 증가시키는 것으로 확인되었다 (도 7).

따라서, PTX @ UFNP의 세포 독성은 화학 요법 및 화학 역학적 요법의 상승효과에 기인하는 것으로 나타났으며, 이러한 상승작용 반응 기반 나노 약물이 MDR 종양 세포를 효과적으로 치료할 수 있고 치료제의 투여량을 크게 감소시킬 수 있을 것으로 기대된다.

실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

(a) 페로세닐메틸 메타크릴레이트(ferrocenylmethyl methacrylate, FMMA)에 메타크릴레이트(methacrylate, MA)를 결합시켜 페노세닐메틸 메타크릴레이트-메타크릴레이트 복합체를 제조하는 단계;
(b) 상기 페노세닐메틸 메타크릴레이트-메타크릴레이트 복합체를 용매에 용해시키는 단계;
(c) 상기 용매를 제거하여 페노세닐메틸 메타크릴레이트-메타크릴레이트 복합체 필름층을 형성시키는 단계; 및
(d) 상기 필름 층에 친수성 용매를 처리하여 페노세닐메틸 메타크릴레이트-메타크릴레이트 나노입자를 자기-조립(selfassemble)시키는 단계를 포함하는 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자의 제조방법에 있어서,
상기 용매는 테트라하이드로푸란 (THF), 에탄올, 및 테트라하이드로푸란 및 에탄올을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 테트라하이드로푸란 및 에탄올의 부피비는 3:1 내지 1:3인 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 용매는 에탄올인 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자를 유효성분으로 포함하는 다약제 내성 억제용 약제학적 조성물.
제4항에 있어서,
상기 다약제 내성은 P-당단백질 (P-glycoprotein)에 의한 다중약물 내성인 것을 특징으로 하는 것인, 약제학적 조성물.
항암제와 병용 투여하기 위한 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해해 제조된 초민감성 활성산소 반응성 페로센 나노입자를 포함하는 항암제 보조용 약제학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 항암제는 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 5-FU, 암사크린(amsacrine), 도노마이신(daunomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 나벨빈(navelbine), 파클리탁셀(paclitaxel), 탁소테르(taxotere), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 콜히친(colchicine), 미톡산트론(mitoxantrone), 닥티노마이신(dactinomycin), 토포테칸(topotecan), 트리메트렉스산(trimetrexate), 미트라마이신(mithramycin) 및 미토마이신 C(mitomycin C)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인, 항암제 보조용 약제학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 항암제는 구강암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암 또는 요관암에 사용되는 것을 특징으로 하는 것인, 항암제 보조용 약제학적 조성물.