KR20210154415A

KR20210154415A - 봉독 내 푸트레신 검출방법

Info

Publication number: KR20210154415A
Application number: KR1020200071404A
Authority: KR
Inventors: 한상미; 우순옥; 김세건; 김효영; 최홍민; 문효정
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2020-06-12
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2021-12-21
Also published as: KR102342404B1

Abstract

본 발명은 봉독(bee venom) 내 푸트레신(putrescine) 검출방법에 관한 것으로, 본 발명은 봉독 성분 중 푸트레신을 검출하고 이의 함유량을 측정함으로써, 약리 효능 또는 독성을 보이는 적정용량을 설정할 수 있고, 이를 기능성 소재로 활용함으로써 그 활용성을 더욱 높일 수 있다.

Description

봉독 내 푸트레신 검출방법 {Detection method of putrescine from bee venom}

본 발명은 봉독(bee venom) 내 푸트레신(putrescine) 검출방법에 관한 것이다.

봉독(bee venom)은 꿀벌 중 일벌의 독낭에서 분비되는 분비물이며, 기본적으로 꿀벌이 자신을 보호하기 위해 만들어내는 독소이다. 봉독은 펩타이드와 단백질, 활성 아민 등 40가지 이상의 물질로 구성되어 있으며, 알려진 성분 중에서는 진통억제, 소염, 항균 작용, 뇌하수체 호르몬 분비 촉진 및 혈액순한 촉진 효과가 있음이 알려졌다.

봉독은 주로 관절염, 요통 및 동맥경화의 치료를 위해 이용되고 있다. 또한, 봉독의 면역기능 활성 효과가 알려져, 몇몇 농가에서는 시범적으로 생봉침액을 이용한 가축의 질병 예방을 시도하고 있기도 하며, 그 외 봉독을 이용한 화장품, 동물약품 및 의약품 등의 개발이 꾸준히 이루어지고 있다.

생봉독의 75%는 단백질이고, 이의 주성분은 멜리틴(mellitin)으로 건조 봉독의 40~50%를 차지하며, 1954년에 뉴만과 하버만이 직접 용혈성 요소인 것을 발견하였고, 1972년 하버만이 적혈구 용해시의 세포막 활성 성질을 관찰하였다. 멜리틴은 26개의 아미노산을 함유하고 있으며, 대식세포의 이동을 강하게 억제하고, 포스포리파제 A2와 상승적으로 작용하여 상호 활동성을 증가시킨다. 또한, 뇌하수체와 부신피질체계를 자극하여 카테콜라민(catecholamine)과 코르티손(cortisone)의 분비를 촉진하고, 리소좀의 세포막을 안정화시켜 항염증 작용을 한다.

포스포리파아제(phospholipase) A2는 봉독의 12%를 차지하고 있고, 이 효소는 세포막 구성 지질인 포스포리피드의 그리세린의 B에 결합하는 지방산을 유리시켜 리조포스파티드로 만들기 때문에 세포조직 파괴성과 용혈작용을 가지고 촉매작용을 한다.

이외에도 봉독의 성분으로 히스타민(histamin), 아파민(apamine), 엠시디 펩타이드(M.C.D-peptide), 히알루로니다아제(hyaluronidase), 아돌라핀(adolapin), 도파민(dopamine), 프로테아제 억제인자(protease inhibitor), 세카핀(secapine), 텔티아핀(tertiapin), 프로카민(procamine) A, B 및 α-글루코스다아제 등이 있다.

그러나 봉독도 독성을 가지기 때문에, 상기와 같은 봉독의 기능성 효과를 유지하면서도 독성을 나타내지 않은 최적의 함량을 결정하기 위해, 봉독이 포함하는 특정의 물질을 검출하고, 함량을 분석하기 위한 방법의 마련이 필요한 실정이다.

한국공개특허 제10-2016-0126102호(2016.11.02)에는, 초고성능액체크로마토그래피를 이용한 축산물 내 봉독 성분 최적 분석법에 관하여 개시되어 있다.

본 발명은 서양종꿀벌(Apis mellifera)은 물론 벌목과 곤충의 봉독 성분 분석을 위한 푸트레신(putrescine) 검출 및 봉독 성분 내 푸트레신 함유량을 측정할 수 있는 방법을 개발하여 봉독의 다양한 약리효능 및 독성을 보이는 적정용량의 설정에 활용하고자 하였다.

따라서, 본 발명의 하나의 목적은 봉독 내 푸트레신 검출방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 봉독 내 푸트레신 분석방법 및 봉독 내 푸트레신 분석 키트를 제공하는 것이다.

본 발명은 (a) 봉독을 0.01N~1.0N 염산(HCl)에 녹여 수용액을 준비하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 수용액에, 암조건에서 단실클로라이드(dansyl chloride)를 포함하는 아세톤 용액을 첨가하여 반응시키는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 용액에, L-프롤린(L-proline) 용액을 첨가하여 반응시켜 봉독을 유도체화하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 유도체화된 봉독을 액체크로마토그래피 검출용 컬럼에 주입하는 단계;를 포함하는 봉독 내 푸트레신 검출방법을 제공한다.

본 발명의 검출방법에 있어, 상기 (a) 단계의 수용액은, 바람직하게 62.5ppm 내지 1,000ppm의 봉독 농도로 제조되는 것이 좋다.

본 발명의 검출방법에 있어, 상기 (b) 단계의 단실클로라이드(dansyl chloride)를 포함하는 아세톤 용액은, 바람직하게 아세톤 100㎖를 기준으로 단실클로라이드 500㎎~1,000㎎을 혼합하여 제조되는 것이 좋다.

본 발명의 검출방법에 있어, 상기 (c) 단계의 L-프롤린(L-proline) 용액은, 바람직하게 증류수 10㎖를 기준으로 L-프롤린을 0.5~2g을 혼합하여 제조되는 것이 좋다.

본 발명의 검출방법에 있어, 상기 (c) 단계의 유도체화는, 바람직하게 50~70℃에서 수행되는 것이 좋다.

본 발명의 검출방법에 있어, 상기 (d) 단계의 액체크로마토그래피 검출용 컬럼은, 일 예로 옥타실란, 도데실실란 및 옥타데실실란 중 선택되는 어느 하나로 충전된 역상 비극성 칼럼일 수 있다.

본 발명의 검출방법에 있어, 상기 봉독은, 일 예로 꿀벌, 뒤영벌 및 장수말벌 중 선택되는 어느 하나의 봉독일 수 있다.

본 발명은 상기한 본 발명의 검출방법에, 바람직하게 e) 아세토니트릴(acetonitrile) 용액을 액체크로마토그래피 검출용 컬럼에 흘러주는 단계;를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 아세토니트릴(acetonitrile) 용액은, 바람직하게 이동시간이 4분 미만일 때 아세토니트릴이 60%(v/v) 이하; 이동시간이 4분 이상에서 16분 미만일 때 아세토니트릴이 60%(v/v) 초과 72% 이하; 이동시간이 16분 이상에서 26분 미만일 때 아세토니트릴이 72%(v/v) 초과 75% 이하; 및 이동시간이 26분 이상에서 40분 미만일 때 아세토니트릴이 75%(v/v) 초과 95% 이하;인 것이 좋다.

한편, 본 발명은 (a) 봉독을 0.01N~1.0N 염산(HCl)에 녹여 수용액을 준비하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 수용액에, 암조건에서 단실클로라이드(dansyl chloride)를 포함하는 아세톤 용액을 첨가하여 반응시키는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 용액에, L-프롤린(L-proline) 용액을 첨가하여 반응시켜 봉독을 유도체화하는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 유도체화된 용액을 액체크로마토그래피 검출용 컬럼에 주입하는 단계; 및 (e) 흡광도 분석을 통해 봉독 내의 푸트레신의 함량을 분석하는 단계;를 포함하는 봉독 내 푸트레신 분석방법을 제공한다.

한편, 본 발명은 ⅰ) 아세톤 100㎖에 500~1,000㎎의 단실클로라이드를 포함하는 단실클로라이드 용액; ⅱ) 증류수 10㎖에 0.5~5.0g의 L-프롤린(L-proline)을 포함하는 L-프롤린 용액; 및 ⅲ) 액체크로마토그래피 검출용 컬럼;을 포함하는 봉독 내 푸트레신 분석용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에 있어, 상기 액체크로마토그래피 검출용 컬럼은, 일 예로 옥타실란, 도데실실란 및 옥타데실실란 중 선택되는 어느 하나로 충전된 역상 비극성 칼럼일 수 있다.

본 발명은 봉독 성분 중 푸트레신을 검출하고 이의 함유량을 측정함으로써, 약리 효능 또는 독성을 보이는 적정용량을 설정할 수 있고, 이를 기능성 소재로 활용함으로써 그 활용성을 더욱 높일 수 있다.

도 1은 본 발명의 검출방법에 의한 봉독 내 푸트레신 검출결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 봉독 내 푸트레신 검출방법의 민감도를 검증한 결과를 나타낸 도이다 (X 축; 표준품의 농도(ppm), Y축; 피크(peak)의 면적; area(μV×sec)).

푸트레신(putrescine)은 동물조직이나 체액에서 검출되는 활성아민(Biogenci Amine)으로 세포성장 과정에 DNA, RNA 및 단백질 합성 과정에서 생성되는 물질로 알려졌다. 활성아민은 중추신경 전달물질 또는 혈관계에 작용하는 다양한 생리활성을 나타내는 필수 성분이기도 하지만 다량을 섭취할 경우 독성을 나타내기도 한다.

따라서, 본 발명은 봉독 성분 중 푸트레신의 검출 및 함유량을 측정할 수 있는 방법을 개발하여 봉독의 다양한 약리효능 및 독성을 보이는 적정용량의 설정에 활용하고자 한다.

이를 위하여, 본 발명은 (a) 봉독을 0.01N~1.0N 염산(HCl)에 녹여 수용액을 준비하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 수용액에, 암조건에서 단실클로라이드(dansyl chloride)를 포함하는 아세톤 용액을 첨가하여 반응시키는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 용액에, L-프롤린(L-proline) 용액을 첨가하여 반응시켜 봉독을 유도체화하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 유도체화된 봉독을 액체크로마토그래피 검출용 컬럼에 주입하는 단계;를 포함하는 봉독 내 푸트레신 검출방법을 제공한다.

본 발명의 검출방법에 있어, 상기 (a) 단계의 수용액은, 바람직하게 62.5ppm 내지 1,000ppm의 봉독 농도로 제조되는 것이 좋다. 이때, 상기 봉독 수용액의 농도가 62.5ppm 미만이거나 1,000ppm을 초과하면, 봉독 내 푸트레신의 검출이 어려울 수 있다.

본 발명의 검출방법에 있어, 상기 (b) 단계의 단실클로라이드(dansyl chloride)를 포함하는 아세톤 용액은, 바람직하게 아세톤 100㎖를 기준으로 단실클로라이드 500㎎~1,000㎎을 혼합하여 제조되는 것이 좋다. 이때, 상기 단실클로라이드의 농도가 아세톤 100㎖를 기준으로 단실클로라이드의 첨가량이 500㎎ 미만이거나 1,000㎎을 초과하면, 봉독 내 푸트레신의 검출이 어려울 수 있다.

본 발명의 검출방법에 있어, 상기 (c) 단계의 L-프롤린(L-proline) 용액은, 바람직하게 증류수 10㎖를 기준으로 L-프롤린을 0.5~2g을 혼합하여 제조되는 것이 좋다. 이때, 상기 L-프롤린 용액의 농도가 증류수 10㎖를 기준으로 L-프롤린의 첨가량이 0.5g 미만이거나 2g을 초과하면, 봉독 내 푸트레신의 검출이 어려울 수 있다.

본 발명의 검출방법에 있어, 상기 (c) 단계의 유도체화는, 바람직하게 50~70℃에서 수행되는 것이 좋다. 이때, 시료 주입 전에 컬럼 온도가 상기한 온도로 준비되는 것이 바람직하다.

본 발명의 검출방법에 있어, 상기 (d) 단계의 액체크로마토그래피 검출용 컬럼의 규격은 통상적으로 사용되는 범위 내에서 가능하다. 그러나 컬럼의 길이와 내경 및 입자크기는 분석시간 및 분리도와 관계가 있는 것이므로, 신속성과 선택성을 고려하여 적절한 범주에서 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 컬럼은, 일 예로 옥타실란, 도데실실란 및 옥타데실실란 중 선택되는 어느 하나로 충전된 역상 비극성 칼럼일 수 있으며, 바람직하게는 옥타데실실란으로 이루어진 군에서 선택된 물질로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용하는 것이 좋다.

이는, 상기 컬럼 중 옥타실란 컬럼 또는 도데실실란 컬럼을 사용할 경우에는 화학적 성질이 비슷한 성분들끼리 겹쳐져 분리도가 감소할 수 있기 때문에, 보다 정확한 분석을 위해서는 상대적으로 비극성 성질이 강한 옥타데실실란 컬럼을 사용하는 것이 바람직하기 때문이다. 상기 옥타데실실란 컬럼은, 컬럼 내부에 비극성인 탄소 18개 체인이 충진되어 있는 것으로, 극성성분은 비극성 컬럼작용기와 결합하지 않기 때문에 빠르게 용출되고 비극성성분은 비극성 작용기와 결합하여 상대적으로 천천히 용출된다.

이때, 상기 컬럼은 길이 80~120㎜, 내경 4~5㎜, 입자크기 2~3㎛인 것을 이용할 수 있으며, 가장 바람직한 컬럼의 길이는 100㎜, 내경은 4.6㎜, 입자크기는 2.7㎛일 수 있다.

한편, 크로마토그래피에 주로 사용되는 실리카가 충진된 컬럼, 아미노기(NH₂)가 충진된 컬럼 또는 니트릴(CN)기가 충진된 컬럼은 극성이 높아 봉독 성분이 흡착되어 용출되지 않기 때문에 본 발명에서 사용하기에 바람직하지 않다.

본 발명의 검출방법에 있어, 상기 봉독은, 일 예로 꿀벌, 뒤영벌 및 장수말벌 중 선택되는 어느 하나의 봉독일 수 있으나, 이에 한정되진 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 꿀벌의 봉독뿐만 아니라, 뒤영벌 및 장수말벌의 봉독에서도 본 발명의 방법을 이용하여 푸트레신을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.

본 발명은 상기한 본 발명의 검출방법에, 바람직하게 e) 아세토니트릴(acetonitrile) 용액을 액체크로마토그래피 검출용 컬럼에 흘러주는 단계;를 더 포함할 수 있다. 액체크로마토그래피의 이동상으로는 통상적으로 이용되는 에탄올, 메탄올 또는 아세토나이트릴 등과 같은 다양한 종류의 유기용매의 사용이 가능하다. 다만, 상기 유기용매만을 사용할 경우에는 몇몇 극성도가 비슷한 성분이 분리되지 않는 경우가 있다.

따라서, 이동상으로 유기용매에 물을 일정비율로 섞은 혼합용매를 사용할 수 있으며, 상기 유기용매는 극성도가 상대적으로 낮은 아세토나이트릴 혼합용매를 이용하는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 아세토나이트릴 혼합용매는 바람직하게 40%(v/v) 이상 45%(v/v) 이하인 아세토나이트릴 혼합용매를 사용하는 것이 좋다.

봉독 내 성분은 컬럼 내의 충진제에 대한 친화력의 차이에 의해 컬럼 통과시간을 달리하게 된다. 화학적 특성에 따라 각 성분들의 고유한 특징인 극성 상태에 차이가 나타나게 되고, 극성의 차이는 충진제에 대한 친화력을 결정하는 요소가 되기 때문에 컬럼을 통과하는데 걸리는 시간 즉 머무름 시간(retention time)이 서로 달리 나타나게된다.

따라서, 본 발명에서는 상기 아세토니트릴(acetonitrile) 용액을, 바람직하게 이동시간이 4분 미만일 때 아세토니트릴이 60%(v/v) 이하; 이동시간이 4분 이상에서 16분 미만일 때 아세토니트릴이 60%(v/v) 초과 72% 이하; 이동시간이 16분 이상에서 26분 미만일 때 아세토니트릴이 72%(v/v) 초과 75% 이하; 및 이동시간이 26분 이상에서 40분 미만일 때 아세토니트릴이 75%(v/v) 초과 95% 이하;인 것을 이용함으로써, 봉독 내 푸트레신을 효과적으로 검출할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면 푸트레신은 Rt 5.102에서 명확히 검출되었다.

본 발명의 봉독 내 푸트레신 분석방법에 있어, 상기 (e) 단계의 흡광도는 자외선 검출기를 200~280㎚ 범위에서 사용할 수 있다. 200㎚ 미만과 280㎚를 초과하는 파장에서는 빛의 흡수가 낮아 푸트레신이 검출되기 어렵기 때문이다.

본 발명의 키트에 있어, 상기 액체크로마토그래피 검출용 컬럼은, 일 예로 옥타실란, 도데실실란 및 옥타데실실란 중 선택되는 어느 하나로 충전된 역상 비극성 칼럼일 수 있으며, 바람직하게는 옥타데실란으로 이루어진 군에서 선택된 물질로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용하는 것이 좋다.

본 발명에서 봉독 내 푸트레신은 초고성능액체크로마토그래피 UPLC(Ultra-high performance liquid chromatography)를 이용하여 분석할 수 있다. UPLC의 원리는 각각의 시료가 갖는 물질의 고유한 성질이 극성 분자량 구조 등을 이용하여 컬럼(Column) 내부에 팩킹(packing)되어 있는 물질과의 흡착정도에 따라 상을 분리하는데에 있다. 따라서, 봉독 성분들은 컬럼 내의 충진제에 대한 친화력의 차이에 의해 컬럼 통과시간을 달리하게 된다. 또한, 화학적 특성에 따라 각 성분들의 고유 특징인 극성 상태에 차이가 나타나게 되고, 극성의 차이는 충진제에 대한 친화력을 결정하는 요소가 되기 때문에 컬럼을 통과하는데 걸리는 시간, 즉 머무름 시간(retent time)이 서로 다르게 나타난다. 상기 컬럼을 통과한 봉독 성분은 용리 시간에 따라 차례대로 자외부 흡광광도계(UV)상에서 흡광도의 증가인 피크(peak)를 통해 검출된다. 검출된 봉독 성분은 표준 물질과의 용리 시간 비교에 의해 성분 확인이 이루어지며(정성 분석), 피크의 높이 또는 면적에 의해 시료 내에 포함된 특정 성분의 함량을 계산할 수 있다(정량 분석). 이러한 원리에 따라, 본 발명의 일 실시예에 의하면, 꿀벌 봉독의 푸트레신 함량은 0.51%, 뒤영벌 봉독의 푸트레신 함량은 0.87%, 장수말벌 봉독의 푸트레신 함량은 1.01%로 함유되어 있음을 확인하였다.

본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 제조예 1: 봉독 시료의 제조]

서양종꿀벌(Apis mellifera) 일벌의 봉독은 봉독채집장치를 이용하여 채집한 후, 간이정제방법으로 정제한 정제봉독을 이용하였다. 또한, 서양뒤영벌(Bombus terrestris) 일벌의 봉독 및 장수말벌(Vespa mandarinia) 일벌의 봉독은 각각 독낭을 채취하여 봉독만을 수거한 후, 동결건조한 봉독을 이용하였다.

[ 실시예 1: 봉독 내 푸트레신의 검출]

가. 봉독의 전 처리 공정( 봉독의 유도체화 )

제조예 1의 봉독을 0.1N 염산(HCl)에 녹여 각각 1,000ppm, 500ppm, 250ppm, 125ppm, 62.5ppm 농도로 용액을 제조하였다. 이후, 60℃, 암조건에서 봉독 용액에 750㎎의 단실클로라이드(dansyl chlotide)를 아세톤 100㎖에 녹여서 제조한 유도체화 용액을 첨가하고, L-프롤린(proline) 1g을 증류수 10㎖에 녹여 제조한 L-프롤린 용액을 첨가하여 반응시켰다.

나. 액체크로마토그래피 수행

상기에서 유도체화한 봉독을 액체크로마토그래피를 사용하여 표 1과 같은 조건으로 분석하였다.

Item	Condition
Column	Halo C18(2.1×100㎜, 1.7㎛)
Flow rate	0.4㎖/min
Column temperature	20℃
Injection volume	2㎕
Wavelength	254㎚
Mobile phase	Time(min)	MeCN ( % )	Water
	0	60	40
	4.1	72	28
	4.68	72	28
	16.68	75	25
	18.96	75	25
	26.56	95	5
	32.66	95	5
	40	100	0

실험 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, Rt 5.102에서 푸트레신이 명확히 검출되었음을 확인할 수 있었고, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 푸트레신 검출방법은 62.5ppm 농도의 봉독에서도 푸트레신을 검출할 수 있어, 민감도가 매우 높음을 확인할 수 있었다.

한편, 254㎚에서 흡광도를 측정한 결과, 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 꿀벌 봉독의 푸트레신 함량은 0.51%, 뒤영벌 봉독의 푸트레신 함량은 0.87%, 장수말벌 봉독의 푸트레신 함량은 1.01%로 나타나, 장수말벌의 봉독에서 푸트레신의 함량이 매우 높게 존재함을 확인할 수 있었다.

시료	Putrescine 함량
시료	(mg/g)	(%)
꿀벌 봉독	5.1	0.51
뒤영벌 봉독	8.7	0.87
장수말벌 봉독	10.1	1.01

상기 결과를 통해, 낮은 농도의 봉독 시료에서도 푸트레신의 검출이 가능하여, 흡광도 분석을 통한 봉독 시료 내 푸트레신의 정량분석도 가능함을 확인하였다. 따라서, 독성을 유발할 수 있는 함량의 푸트레신을 포함하는 봉독을 사전에 확인함으로써, 안전하게 봉독을 이용할 수 있다.

Claims

(a) 봉독을 0.01N~1.0N 염산(HCl)에 녹여 수용액을 준비하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 수용액에, 암조건에서 단실클로라이드(dansyl chloride)를 포함하는 아세톤 용액을 첨가하여 반응시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 용액에, L-프롤린(L-proline) 용액을 첨가하여 반응시켜 봉독을 유도체화하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 유도체화된 봉독을 액체크로마토그래피 검출용 컬럼에 주입하는 단계;를 포함하는 봉독 내 푸트레신 검출방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계의 수용액은,
62.5ppm 내지 1,000ppm의 봉독 농도로 제조되는 것을 특징으로 하는 봉독 내 푸트레신 검출방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계의 단실클로라이드(dansyl chloride)를 포함하는 아세톤 용액은,
아세톤 100㎖를 기준으로 단실클로라이드 500㎎~1,000㎎을 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 하는 봉독 내 푸트레신 검출방법.
제1항에 있어서,
상기 (c) 단계의 L-프롤린(L-proline) 용액은,
증류수 10㎖를 기준으로 L-프롤린을 0.5~2g을 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 하는 봉독 내 푸트레신 검출방법.
제1항에 있어서,
상기 (c) 단계의 유도체화는,
50~70℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 봉독 내 푸트레신 검출방법.
제1항에 있어서,
상기 (d) 단계의 액체크로마토그래피 검출용 컬럼은,
옥타실란, 도데실실란 및 옥타데실실란 중 선택되는 어느 하나로 충전된 역상 비극성 칼럼인 것을 특징으로 하는 봉독 내 푸트레신 검출방법.
제1항에 있어서,
상기 봉독은,
꿀벌, 뒤영벌 및 장수말벌 중 선택되는 어느 하나의 봉독인 것을 특징으로 하는 봉독 내 푸트레신 검출방법.
제1항에 있어서,
e) 아세토니트릴(acetonitrile) 용액을 액체크로마토그래피 검출용 컬럼에 흘러주는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 봉독 내 푸트레신 검출방법.
제8항에 있어서,
상기 아세토니트릴(acetonitrile) 용액은,
이동시간이 4분 미만일 때 아세토니트릴이 60%(v/v) 이하;
이동시간이 4분 이상에서 16분 미만일 때 아세토니트릴이 60%(v/v) 초과 72% 이하;
이동시간이 16분 이상에서 26분 미만일 때 아세토니트릴이 72%(v/v) 초과 75% 이하; 및
이동시간이 26분 이상에서 40분 미만일 때 아세토니트릴이 75%(v/v) 초과 95% 이하;인 것을 특징으로 하는 봉독 내 푸트레신 검출방법.
(a) 봉독을 0.01N~1.0N 염산(HCl)에 녹여 수용액을 준비하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 수용액에, 암조건에서 단실클로라이드(dansyl chloride)를 포함하는 아세톤 용액을 첨가하여 반응시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 용액에, L-프롤린(L-proline) 용액을 첨가하여 반응시켜 봉독을 유도체화하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 유도체화된 용액을 액체크로마토그래피 검출용 컬럼에 주입하는 단계; 및
(e) 흡광도 분석을 통해 봉독 내의 푸트레신의 함량을 분석하는 단계;를 포함하는 봉독 내 푸트레신 분석방법.
ⅰ) 아세톤 100㎖에 500~1,000㎎의 단실클로라이드를 포함하는 단실클로라이드 용액;
ⅱ) 증류수 10㎖에 0.5~5.0g의 L-프롤린(L-proline)을 포함하는 L-프롤린 용액; 및
ⅲ) 액체크로마토그래피 검출용 컬럼;을 포함하는 봉독 내 푸트레신 분석용 키트.
제11항에 있어서,
상기 액체크로마토그래피 검출용 컬럼은,
옥타실란, 도데실실란 및 옥타데실실란 중 선택되는 어느 하나로 충전된 역상 비극성 칼럼인 것을 특징으로 하는 봉독 내 푸트레신 분석용 키트.