KR20210149062A - 보다 강력한 nk 세포를 설계하기 위한 stat3 전사체 - Google Patents

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KR20210149062A
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니틴 챠크라바티
딘 앤소니 리
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더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈
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Abstract

일부 양상에서, 활성화된 STAT3 전사체를 포함하는 확장된 NK 세포 조성물 및 이를 사용하여 질환을 치료, 저해, 감소, 개선 및/또는 예방하는 방법이 개시된다.

Description

보다 강력한 NK 세포를 설계하기 위한 STAT3 전사체
본 출원은 미국 가출원 제62/815,625호(출원일: 2019년 3월 8일)의 이익을 주장하며, 이의 전문은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
면역요법은 면역 체계의 활성화 또는 억제에 의해서 질환을 치료하는 것이다. 면역 체계로부터 유래된 세포는 면역 기능성 및 특징을 개선시킬 의도의 세포 기반 요법으로서 조작되고 변형될 수 있다. 최근, 면역요법은 특히 다양한 형태의 암을 치료할 가능성으로 인해서 연구원, 의사 및 제약 회사에 상당한 관심이 되어 왔다. 면역조절 치료요법은 보통 감염 질환(미생물 및 바이러스 질환)을 치료하는 경우 내성을 생성시킬 가능성이 적은 것을 비롯하여 기존의 약물보다 더 적은 부작용을 갖는다. 세포 기반 요법, 예컨대, CAR-T 접근법은 다양한 장벽, 예컨대, 표적화 가능한 항원의 비-사용 가능성, 생산 및 전달에 수반되는 비용 및 부작용을 갖는다.
종래의 암 치료는 화학요법, 수술 및/또는 방사선을 사용하여 암 세포를 사멸시키거나 제거하는 것에 초점을 맞춘다. 그러나, 치료용 면역 세포 분야는 암을 치료하거나, 예방하거나, 암의 발병을 지연시키기 위해서 종래의 치료와 함께 또는 일부 경우에는 종래의 치료 대신에 사용될 수 있다. 면역 효과기 세포, 예컨대, 림프구, 대식세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포(NK 세포), 세포독성 T 림프구(CTL) 등은 자연적으로 함께 작용하여 종양 세포의 표면 상에서 발현되는 비정상적인 항원을 표적으로 함으로써 신체를 암에 대해서 방어한다. 자연 살해(NK) 세포는 종종 바이러스 감염 또는 악성 형질전환으로 인한 비정상적인 세포에 대한 첫 번째 방어선이며, 입양 전달 또는 잠재적인 생체내 자극에 의한 NK 세포 기능의 회복은 NK 세포 수를 증가시키고 효과기 기능을 개선하기 위한 생체외 배양에 의해서 가능해지는 암 또는 다른 질병에 대한 유망한 요법이다. 필요한 것은 이러한 요법에 사용하기 위해 NK 세포를 확장하고, 활성화하는 새로운 개선된 방법이다.
자연 살해 세포를 확장 및 변형하기 위한 방법 및 조성물이 개시되며, 여기서 변형된 세포는 선택적으로 하기에 보다 상세하게 기재된 바와 같은 변형된 비-자연 발생 STAT3 전사체를 포함한다.
일 양상에서, 본 명세서에는 다양한 형태의 조작된 막 결합된 IL-21(membrane bound IL-21: mbIL-21)의 사용을 통해서, 변형된 STAT3 전사체를 갖는 상태로 이루어진 비-자연 발생을 포함하는 확장 및 변형된 자연 살해 세포가 개시된다. 일 양상에서, 변형된 자연 살해 세포는 미경험 자연 살해 세포와 비교할 때, 변경된 후성유전학, 변경된 전사체 및/또는 외부 자극에 반응하는 변경된 능력 및 향상된 표현형을 갖는 변형된 자연 살해 세포를 초래하는 게놈 또는 유전자 발현 시스템의 구조적 상태를 인공적으로 조작함으로써 달성될 수 있다. 일 양상에서, 확장된, 변형된 자연 살해 세포는 텔로미어 조직, 유사분열의 조절, DNA 수선, 면역, 사이토카인 신호전달, 변경된 대사, 해당과정, 포도당신생합성(gluconeogenesis), 세포독성 활성화, p53 경로에 관여된 1종 이상의 차등적으로 발현되는 유전자(예를 들어, 도 3 또는 4에 개시된 유전자 중 임의의 것, 예를 들어, 비제한적으로 HIST1H1B, HIST1H2AB, HIST1H2AG, HIST1H2AH, HIST1H2AI, HIST1H2AJ, HIST1H2AL, HIST1H2BB, HIST1H2BE, HIST1H2BH, HIST1H2BJ, HIST1H2BL, HIST1H2BM, HIST1H2BO, HIST1H3B, HIST1H3C, HIST1H3F, HIST1H3G, HIST1H3H, HIST1H3J, HIST1H4A, HIST1H4D, HIST1H4L, HIST2H3C, HIST2H4B, HIST3H2BA, HIST3H2BB, ABCA1, AK5, ASCL2, B3GAT1, CACNA2D2, CCR5, CXCR2, ENPP5, FBLN2, FCRL3, GNAL, GPRASP1, GRIK4, GTSE1, HIST3H2BB, IL1B, ITGA2, KIF13A, KIF4A, LINC00599, LONRF3, LRRN3, MSC-AS1, NFIX, NUAK1, NUAK2, PCDH1, PLXNA4, RAD51, RNF157, SLC1A7, SPON2, TYMS, WWC2, ZNF442, ZNF727 및 ZSCAN18)를 포함할 수 있는 변형된 STAT3 전사체를 포함할 수 있다.
또한, 본 명세서에는 임의의 상기 양상의 자연 살해 세포가 개시되며, 여기서 하향조절된 유전자 대 과발현된 유전자 또는 상향조절된 유전자 대 억제된 유전자의 비율은 약 1.5이다.
일 양상에서, 본 명세서에는 임의의 상기 양상의 변형된 자연 살해 세포가 개시되며, 여기서 자연 살해 세포는 BIRCS, MK167, TOP2A, CKS2 및 RACGAPl로 이루어진 군으로부터 선택된 상향조절된 1종 이상의 단백질을 포함한다.
또한 본 명세서에는 임의의 상기 양상의 변형된 자연 살해 세포가 개시되며, 여기서 자연 살해 세포는 PTCHl, TGFB3 및 ATM으로 이루어진 군으로부터 선택된 하향조절된 1종 이상의 단백질을 포함한다.
본 개시내용은 또한 임의의 상기 양상의 확장된, 변형된 자연 살해 세포를 포함하고, 여기서 세포는 NK 세포를 IL-21, IL-15 및/또는 4-BBL과 접촉시킴으로써 생체내 또는 생체외에서 확장되고 변형된다. 일 양상에서, IL-21, IL-15 및/또는 4-BBL은 피더 세포(feeder cell), 원형질막 소포, 리포솜 및/또는 엑소좀의 표면 상에서 제공된다. 따라서, 일 양상에서, 본 명세서에는 임의의 상기 양상의 자연 살해 세포가 개시되며, 여기서 세포는 NK 세포를 막 결합된 IL-21, IL-15 및/또는 4-BBL을 발현하도록 조작된 원형질막 소포, 리포솜, 엑소좀 또는 피더 세포와 접촉시킴으로써 생체내 또는 생체외에서 확장되고, 변형된다. 일 양상에서, IL-21, IL-15 및/또는 4-BBL과의 접촉은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 150분, 3, 4, 5,6 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 32, 36, 42, 48, 60시간, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 45, 60, 61, 62일, 3, 4, 5 또는 6개월 동안 일어날 수 있다.
또한 본 명세서에는 대상체에게 치료적 유효량의 임의의 상기 양상의 확장된, 변형된 자연 살해 세포를 투여하는 단계를 포함하는 암 및/또는 전이를 치료, 저해, 감소, 개선 및/또는 예방하는 방법이 개시된다.
일 양상에서, 본 명세서에는 유효량의 활성화된 변형된 STAT3 전사체를 포함하는 확장된, 변형된 자연 살해 세포를 투여하거나 또는 변형된 STAT3 전사체를 활성화시켜 생체내에서 변형된 NK 세포를 얻음으로써 내인성 NK 세포를 활성화시키기 위한 작용제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 체계(예를 들어, 면역 반응)를 조절하는 방법이 개시된다.
본 명세서에 포함되고 본 명세서의 일부를 구성하는 첨부 도면은 여러 실시형태를 예시하고, 설명과 함께 개시된 구성 및 방법을 예시한다.
도 1A, 도 1B, 도 1C, 도 1D, 도 1E 및 도 1F는 미경험 NK 세포 및 생체외 확장된, 변형된 NK 세포에서 게놈 전체(genome-wide) STAT3-결합을 도시한다. 도 1A는 IL-21 자극에 대한 반응으로 STAT3의 인산화를 나타낸 웨스턴 블롯. NK 세포를 30분 동안 IL-21로 처리하고, 단백질을 추출하고, 총 STAT3, 포스포-Y705-STAT3(pSTAT3) 및 로딩 대조군으로서 β-액틴에 대해 블로팅하였다. 도 1B는 자극된-미경험(적색) 및 -확장된, 유전자 변형된(청색) NK 세포에서 STAT3 ChIP-seq 피크 정상(MACS에 의해서 정의됨)을 나타낸 벤 다이어그램. 도 1C는 STAT3가 IL-21-처리된 NK 세포에서 그 자체 프로모터에 결합함을 나타낸 도면. 이것은 STAT3 유전자 주변에서 STAT3 ChIP-seq 태그 밀도의 게놈 뷰(genomic view)이다. 도 1D는 미경험 NK 세포 및 확장된, 유전자 변형된 NK 세포에서 STAT3 결합 부위의 전체 목록(우측 모티프)으로부터 HOMER에 의해 회수된 새로운 모티프를 도시한 도면. 도 1E는 30분 동안 IL-21로 처리된 NK 세포에서 모든 단백질-암호 유전자의 TSS 주변 STAT3 결합 거리의 공간 분포 및 히트맵 표현을 도시한 도면. 도 1F는 RefSeq 유전자에 대한 STAT3 결합 부위 위치의 분포를 도시한 도면. 결합 부위의 위치는 원위 프로모터(TSS의 -1 내지 -3kb 상류), 근위 프로모터(-1 내지 0kb), 5' UTR, 엑손, 인트론, 3' UTR, 근위 하류(TSS 0 내지 1kb의 하류), 원위 하류(TSS 1 내지 3kb의 하류) 및 원위 유전자간(유전자로부터 3kb 초과)으로 나뉜다.
도 2A 및 도 2B는 (2A) 미경험 NK 세포 및 (2B) 확장된, 유전자 변형된 NK 세포에서 STAT3 ChIP에 의해 식별된 유전자의 유전자 온톨로지(gene Ontology: GO) 분석을 도시한 도면. 생물학적 과정(녹색), 분자 기능(진홍색) 및 PANTHER 신호전달 경로(청색)를 나타낸, GREAT를 사용하여 STAT3-결합 부위 모두의 분석으로부터 발생한 과도하게 표현된 GO 항목(term).
도 3A, 도 3B, 도 3C 및 도 3D는 IL-21 자극된 미경험 NK 세포 및 확장된, 변형된 NK 세포의 전체-전사체 분석을 도시한 도면. 도 3A는 IL-21 자극에 대한 반응으로 확장 NK 세포 및 미경험 NK 세포의 상향조절된 전사체 및 하향조절된 전사체를 나타내는 화산 플롯. 개별 유전자의 배수 변화의 로그(x축)를 밑수 10(y축)에 대한 p-값의 음의 로그에 대해 플로팅한다. 양의 log2(배수 변화) 값은 미경험 세포와 비교하여 확장된 NK 세포의 상향조절을 나타내고, 음의 값은 하향조절을 나타낸다. 점선 위의 원은 다중 시험에 대한 보정 후 p<0.05로 천식과 대조군 사이에서 차등적으로 발현되는 유전자를 나타낸다. 도 3B는 조립된 모든 전사체 단편의 발현 값을 나타낸 산점도. 발현은 상향조절된 전사체(녹색) 및 하향조절된 전사체(적색)를 포함하여 FPKM의 log2로 표현된다. 도 3C는 상이한 기증자에 걸친 상위 100개의 농축된 전사체 및 고갈된 전사체의 히트 맵. 색상-암호는 로그-변환 판독 카운트 값을 기반으로 한다. 도 3D는 자극된 NK 세포에서 GO 경로의 식별을 도시한 도면.
도 4A 및 도 4B는 NK 세포 기능과 연관된 독창성 경로 분석(IPA) 기반 네트워크를 도시한 도면. 도 4A는 IL-21 자극된, 확장된, 변형된 및 미경험 NK 세포에서 차등적으로 발현되는 유전자 목록의 IPA-기반 경로 분석을 도시한 도면(P-값:'.S 0.01 및 배수-변화 2:1.5). 도 4B는 세포 사멸 및 생존, 감염 질환, 세포 기능 및 유지, 혈액 질환에 해당하는 IPA 소프트웨어로 식별된 최고 점수 규제 네트워크를 도시한 도면. 생체외에서 확장되고, 활성화되고, 따라서 변형된 NK 세포에서 (미경험 세포와 비교할 때) 상향조절되는 유전자 및 하향조절되는 유전자를 각각 적색 및 녹색 노드 내에 나타낸다. 유전자 사이의 실선 및 점선은 각각 공지된 직접 및 간접 유전자 상호작용을 나타낸다. 노드의 형상은 각각의 유전자 산물의 기능적 클래스를 반영한다: 전사 조절자(가로 타원), 막관통 수용체(세로 타원), 효소(세로 마름모), 사이토카인/성장.
도 5A 및 도 5B는 STAT3 결합이 인근 유전자의 발현을 조절함을 도시한 도면. Enrichr에 의해서 계산된 과도하게 표현된 GO 항목의 선택된 카테고리의 요약. (5A) 상향조절된 유전자 및 (5B) 하향조절된 유전자를 사용하여 GO 항목 과도한 표현을 결정하였다. GO 카테고리를 좌측에 열거하고, 연관된 log10 p-값에 따라 순위 매긴다.
도 6은 확장된, 변형된 NK 세포에서 STAT3-매개 경로의 활성화를 도시한 도면. RNA-seq 데이터를 사용하는 IPA에 의한 기능적 네트워크 분석을 IL-21 자극 상태에서 4시간째에 세포에 대해서 나타낸다. 상위 스코어링 경로(즉, IFNγ 신호전달)와 관련된 유전자 및 STAT3 경로와의 상호 작용을 나타낸다. 적색 노드는 그 경우에서 상향조절을 나타내고, 녹색 노드는 하향조절을 나타낸다(액터(actor)(사각형), 키나제(역삼각형) 및 복합체/그룹/기타(원)).
도 7은 염색질의 개방 및 유전자 발현과 직접적인 상관관계를 나타내는 ATACseq의 플롯.
본 화합물, 조성물, 물품, 장치 및/또는 방법이 개시 및 기재되기 전에, 이것은 달리 명시되지 않는 한 특정 합성 방법 또는 특정 재조합 생명공학 방법 또는 달리 명시되지 않는 한 특정 시약에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 하며, 물론 달라질 수도 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어는 특정 실시형태만을 설명하기 위한 목적이며, 이를 제한하도록 의도되는 것이 아님을 이해해야 한다.
A. 정의
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 표현은 그 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "약제학적 담체"는 둘 이상의 이러한 담체 등의 혼합물을 포함한다.
범위는 본 명세서에서 "약" 하나의 특정 값 및/또는 "약" 또 다른 특정 값으로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현되는 경우, 또 다른 실시형태는 하나의 특정 값으로부터 그리고/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값이 근사치로 표현되는 경우, 선행사 "약"을 사용하여 특정 값이 또 다른 실시형태를 형성함을 이해할 것이다. 범위 각각의 종점은 다른 종점과 관련하여 그리고 다른 종점과는 독립적으로 모두 중요하다는 것이 추가로 이해될 것이다. 본 명세서에 다수의 값이 개시되어 있고, 각각의 값은 또한 그 값 자체에 추가하여 그 특정 값이 "약"으로서 본 명세서에 개시되어 있음을 이해해야 한다. 예를 들어 값 "10"이 개시되면, "약 10"도 개시된다. 값이 개시된 경우, 그 값 "이하", "그 값 이상" 및 값들 사이의 가능한 범위가 또한 당업자에 의해서 적절하게 이해되는 바와 같이 개시되는 것으로 또한 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 개시되면 "10 이하"뿐만 아니라 "10 이상"이 또한 개시된다. 또한 본 출원 전반에 걸쳐 데이터가 다수의 상이한 형식으로 제공되며, 이 데이터는 종점 및 시작점, 그 데이터 지점의 임의의 조합물에 대한 범위를 나타낸다. 예를 들어, 특정 데이터 지점 "10" 및 특정 데이터 지점 15가 개시되면, 10 및 15 초과, 이상, 미만, 이하 및 10 및 15뿐만 아니라 10과 15 사이가 개시되는 것으로 간주되는 것으로 이해된다. 또한, 2개의 특정 단위 사이의 각각의 단위가 또한 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어 10과 15가 개시되면 11, 12, 13, 14가 또한 개시된다.
하기 본 명세서 및 청구범위에서, 언급은 다음의 의미를 갖는 것으로 정의되어야 하는 다수의 용어에 대한 것일 것이다:
"선택적" 또는 "선택적으로"는 그 후에 기재된 사건 또는 상황이 일어나거나 일어나지 않을 수 있는 의미하며, 그 설명은 상기 사건 또는 상황이 일어난 예 및 그렇지 않은 예를 포함한다.
본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 상기에 기재된 세포 및 방법에서 다양한 변경이 이루어질 수 있기 때문에, 상기 설명 및 하기 주어진 실시예에 포함된 모든 사항은 제한의 의미가 아닌 예시적인 것으로 해석되어야 하도록 의도된다.
"증가시키다"는 더 많은 양의 증상, 질환, 조성, 병태 또는 활성을 초래하는 임의의 변화를 지칭할 수 있다. 증가는 통계적으로 유의한 양의 병태, 증상, 활성, 조성에서의 임의의 개별, 중위 또는 평균 증가일 수 있다. 따라서 증가는 그 증가가 통계적으로 유의한 한, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100% 증가일 수 있다.
"감소시키다"는 더 작은 양의 증상, 질환, 조성, 병태 또는 활성을 초래하는 임의의 변화를 지칭할 수 있다. 물질이 있는 유전자 산물의 유전적 결과물이 물질이 없는 유전자 산물의 결과물에 비해서 적은 경우 물질은 또한 유전자의 유전적 결과물을 감소시키는 것으로 이해된다. 또한 예를 들어, 감소는 이전에 관찰된 것보다 증상이 덜하도록 하는 장애의 증상의 변화일 수 있다. 감소는 통계적으로 유의한 양의 병태, 증상, 활성, 조성에서의 임의의 개별, 중위 또는 평균 감소일 수 있다. 따라서 감소는 그 감소가 통계적으로 유의한 한, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100% 감소일 수 있다.
"저해하다", "저해하는" 및 "저해"는 활성, 반응, 병태, 질환 또는 다른 생물학적 파라미터를 감소시키는 것을 의미한다. 이것은 활성, 반응, 병태 또는 질환의 완전한 절제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 이것은 또한 예를 들어, 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 활성, 반응, 병태 또는 질환의 10% 감소를 포함할 수 있다. 따라서, 감소는 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 또는 그 사이의 임의의 양의 감소일 수 있다.
"감소시키다" 또는 "감소시키는" 또는 "감소"와 같은 단어의 다른 형태는 사건 또는 특징(예를 들어, 종양 성장)을 낮추는 것을 의미한다. 이것은 전형적으로 일부 표준 또는 예측 값과 관련이 있으며, 다시 말해서 그것은 상대적이지만, 참조될 표준 또는 상대 값이 항상 필요한 것은 아니라는 점을 이해해야 한다. 예를 들어, "종양 성장을 감소시키다"는 표준 또는 대조군에 비해 종양 성장 속도를 감소시키는 것을 의미한다.
"예방하다" 또는 "예방하는" 또는 "예방"과 같은 단어의 다른 형태는 특정 사건 또는 특징을 중지시키거나, 특정 사건 또는 특징의 발달 또는 진행을 안정화시키거나 또는 지연시키거나, 또는 특정 사건 또는 특징이 발생할 가능성을 최소화하는 것을 의미한다. 예방하다는, 그것이 전형적으로 예를 들어, 감소시키는 것보다 더 절대적이므로, 대조군과 비교할 필요가 없다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 무언가가 감소될 수 있지만, 예방되지 않을 수 있고, 그러나 감소되는 무언가는 또한 예방될 수 있다. 마찬가지로, 무언가는 예방될 수 있지만, 감소되지 않을 수 있고, 그러나 예방되는 무언가는 또한 감소될 수 있다. 감소하다 또는 예방하다가 사용되는 경우, 달리 구체적으로 제시되지 않는 한, 다른 단어의 사용이 또한 명시적으로 개시되는 것으로 이해된다.
용어 "대상체"는 투여 또는 치료의 표적인 임의의 개체를 지칭한다. 대상체는 척추동물, 예를 들어, 포유동물일 수 있다. 일 양성에서, 대상체는 인간, 비-인간 영장류, 소, 말, 돼지, 개 또는 고양이일 수 있다. 대상체는 기니피그, 래트, 햄스터, 토끼, 마우스 또는 두더지일 수도 있다. 따라서, 대상체는 인간 또는 수의과 환자일 수 있다. 용어 "환자"는 임상의, 예를 들어, 의사의 치료 하에 있는 대상체를 지칭한다.
용어 "치료적으로 유효한"은 사용된 조성물의 양이 질환 또는 장애의 1종 이상의 원인 또는 증상을 개선하기에 충분한 양을 갖는 것을 지칭한다. 이러한 개선은 감소 또는 변경만을 요구하며, 반드시 제거할 필요는 없다.
용어 "치료"는 질환, 병리학적 병태 또는 장애를 치유, 개선, 안정화 또는 예방할 의도를 가진 환자의 의학적 관리를 지칭한다. 이 용어는 적극적인 치료, 즉, 구체적으로 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 개선에 대한 치료를 포함하며, 원인 치료, 즉, 관련 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 제거에 대한 치료를 또한 포함한다. 또한 이 용어는 완화적 치료, 즉, 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 치유가 아니라 증상의 완화를 위해 설계된 치료; 예방적 치료, 즉, 관련 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 발생을 최소화하거나 부분적으로 또는 완전히 저해하는 치료; 및 지지적 치료, 즉, 관련 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 개선에 대한 또 다른 특정 요법을 보완하기 위해 사용되는 치료를 포함한다.
대상체에 대한 "투여"는 대상체에게 작용제를 도입하거나 전달하는 임의의 경로를 포함한다. 투여는 경구, 국소, 정맥내, 피하, 피부경유(transcutaneous), 경피, 근육내, 관절내, 비경구, 세동맥내, 피부내, 뇌실내, 두개내, 복강내, 병변내, 비강내, 직장, 질내, 흡입에 의해, 이식된 저장소를 통해, 비경구(예를 들어, 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활막내, 흉골내, 척추강내, 복강내, 간내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술) 등을 비롯한 임의의 적합한 경로에 의해 수행될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "동반 투여", "조합 투여", "동시 투여" 또는 "동시에 투여되는"은 화합물이 동일한 시점에 투여되거나 본질적으로 서로 직후에 투여됨을 의미한다. 후자의 경우, 두 화합물은 관찰된 결과가 동일한 시점에 화합물을 투여할 때 달성된 결과와 구별할 수 없을 정도로 충분히 가까운 시간에 투여된다. "전신 투여"는 예를 들어, 순환계 또는 림프계를 통해서, 대상체 신체의 광범위한 영역(예를 들어, 신체의 50% 초과)에 작용제를 도입하거나 전달하는 경로를 통해 대상체에게 작용제를 도입하거나 전달하는 것을 의미한다. 대조적으로, "국소 투여"는 투여 지점에 바로 인접한 영역 또는 영역에 작용제를 도입하거나 전달하는 경로를 통해 대상체에게 작용제를 도입하거나 또는 전달하는 것을 지칭하며, 치료적으로 유의한 양의 작용제를 전신으로 도입하지 않는다. 예를 들어, 국지적으로 투여된 작용제는 투여 지점의 국지적 부근에서 쉽게 검출될 수 있지만, 대상체 신체의 원위 부분에서는 검출될 수 없거나 무시할 수 있는 양으로 검출될 수 있다. 투여는 자가 투여 및 또 다른 사람에 의한 투여를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "치료하다", "치료하는", "치료" 및 이들의 문법적 변형은 1종 이상의 질환 또는 병태, 질환의 강도 또는 빈도, 질환 또는 병태의 증상 또는 질환 또는 병태의 근본 원인을 부분적으로 또는 완전히 예방, 지연, 치료, 치유, 완화, 경감, 변경, 교정, 개선, 향상, 안정화, 진정 및/또는 감소시킬 의도 또는 목적으로 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명에 따른 치료는 예방적으로, 예방학적으로, 완화적으로 또는 치료적으로 적용될 수 있다. 예방적 치료는 발병 전(예를 들어, 암의 명백한 징후 전), 조기 발병 동안(예를 들어, 암의 초기 징후 및 증상 시) 또는 확립된 암 발병 후에 대상체에게 투여된다. 예방적 투여는 질환 또는 감염의 증상이 나타나기 전 수 일(들)에서 수 년 동안 발생할 수 있다.
용어 "NK 세포(들)"는 "자연 살해 세포(들)"의 약어이며, 두 용어는 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다.
NK 세포를 설명하기 위해 본 명세서에 사용된 용어 "변형된"은 에피게놈, 전사체 및/또는 프로테옴이 인공적이도록 인공적으로 변경된 후성유전체, 전사체 및/또는 인공적으로 변경된 프로테옴을 갖는 세포를 지칭한다. 변경된 후성유전체, 전사체 또는 프로테옴 중 임의의 하나 또는 전부는 본 명세서에 기재된 방법이 적용되지 않거나 본 명세서에 기재된 조작된 조성물과 접촉되지 않은 미경험 NK 세포와 비교할 때 인공적으로 변경된 세포 기능을 초래할 수 있다. 변형된 NK 세포는 미경험 NK 세포에 비해 활성화된 NK 세포일 수 있거나, 미경험 NK 세포에 비해 다른 이로운 특성을 갖는 NK 세포일 수 있다. "활성화된" NK 세포는 증가된 NK 세포 기능, 예컨대, 증가된 세포독성, 증가된 수명 또는 생존력, 증가된 생리학적 지속성, 외부 자극에 대한 반응하는 능력의 변화, 대사 증가 등을 반영하는 인공적으로 유도된 표현형을 갖는 세포이다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 변형된 NK 세포는 반드시 활성화된 NK 세포인 것은 아니지만, 활성화된 NK 세포는 변형된 NK 세포이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자 조작된"은 유전자 서열의 특정 변화, 예컨대, 점 돌연변이, 유전자 삽입, 유전자 결실, 전위 또는 DNA 염기 쌍의 서열에서의 임의의 변화를 사용함으로써 유전자가 추가로 변형될 수 있는 자연 살해 세포를 기술한다. DNA 염기쌍 서열에서의 변화는 바이러스 벡터를 통해서, 예컨대, 레트로바이러스 방법, 렌티바이러스 방법, 아데노바이러스(AAV) 방법, Cre-lox 방법, 메가뉴클레아제 방법, TALEN 방법, CRISPR 기반(예를 들어, CRISPR-Cas9) 방법, 트랜스포사제 방법, 화학적 변경 또는 임의의 다른 DNA 염기쌍 서열 편집 방법을 통해서 도입될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "차등적으로 발현되는"은 STAT3 전사체의 활성화로 식별된 STAT3-조절 유전자의 특징을 설명하며, 이는 유전자의 발현이 미경험 NK 세포에 비해 적어도 50%만큼(즉, 1.5 이상의 발현 비율의 배수 변화) 증가(즉, 상향조절)되거나 감소(즉, 하향조절)된다는 것을 의미한다.
본 출원 전반에 걸쳐 다양한 간행물이 참조된다. 이들 간행물의 개시내용은 이에 관련된 최신 기술을 보다 완전하게 설명하기 위해 본 출원에 참조에 의해 포함된다. 개시된 참고문헌은 또한 참고문헌에 의존하는 문장에서 논의된 참고문헌에 포함된 자료에 대해 개별적으로 그리고 구체적으로 참조에 의해 포함된다.
B. 조성물
본 명세서에 개시된 조성물을 제조하기 위해 사용되는 성분뿐만 아니라 본 명세서에 개시된 방법에서 사용되는 조성물 자체가 개시된다. 이러한 물질 및 다른 물질이 본 명세서에 개시되며, 이들 물질의 조합, 하위세트, 상호작용, 군 등이 개시되는 경우, 이들 화합물의 각각의 다양한 개별 및 집합적 조합 및 순열에 관련된 특정 언급이 명백하게 개시되지 않을 수도 있으며, 각각은 구체적으로 고안되며 본 명세서에 기술되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 특정 변형된 자연 살해(NK) 세포가 개시되고, 논의되며, 변형된 NK 세포를 포함하는 다수의 분자를 제조할 수 있는 수 많은 변형이 논의되는 경우, 구체적으로 달리 제시되지 않는 한 변형된 NK 세포의 각각 및 모든 조합 및 순열, 및 가능한 변형이 구체적으로 고려된다. 따라서, 분자 A, B 및 C의 클래스뿐만 아니라 분자 D, E 및 F의 클래스 및 조합 분자의 예 A-D가 개시된 경우, 이들 각각이 개별적으로 언급되지 않더라도 각각은 개별적 및 집합적으로 고려되며, 이는 조합 A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E 및 C-F가 개시된 것으로 간주된다. 마찬가지로, 이들의 임의의 하위세트 또는 조합이 개시된다. 따라서, 예를 들어 A-E, B-F 및 C-E 하위군이 개시되는 것으로 간주될 것이다. 이러한 개념은 반드시 이에 제한되는 것은 아니지만 본 명세서에 개시된 조성물을 제조하고 사용하는 방법에서 단계를 포함하는 이러한 적용의 모든 양상에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가 단계가 존재하는 경우 이러한 추가 단계 각각은 개시된 방법의 임의의 특정 실시형태 또는 실시형태의 조합으로 수행될 수 있음을 이해해야 한다.
일 양상에서, 본 명세서에는 활성화된 STAT3 전사체를 포함하는 변형된 자연 살해 세포가 개시된다.
자연 살해 세포는 면역 체계의 세포독성 림프구의 유형이다. NK 세포는 신속한 반응을 제공하여 바이러스 감염된 세포에 대한 신속한 반응을 제공하고, 형질전환된 세포에 반응한다. NK 세포와 상반되게, T 세포는 감염된 세포의 표면 상의 주 조직적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex: MHC) 분자가 제시하는 병원체의 펩타이드를 감지하여, 사이토카인 방출을 촉발하여, 용해 또는 아폽토시스를 유발한다. 그러나, NK 세포는 병원체로부터의 펩타이드가 MHC 분자에 존재하는지의 여부에 관계없이 스트레스를 받은 세포를 인식하는 능력이 있기 때문에 고유하다. 이들은 표적을 사멸시키기 위해서 사전 활성화가 필요하지 않다는 초기 개념 때문에 "자연 살해자"라고 명명되었다. NK 세포는 큰 과립 림프구(large granular lymphocyte: LGL)이며, 골수에서 분화 및 성숙되고, 그 다음 이곳으로부터 순환계로 들어간다고 공지되어 있다. 일부 양상에서, NK 세포는 유전자 조작된 CAR NK 세포일 수 있거나 예를 들어, 화학적 또는 바이러스 벡터 또는 벡터 전달 시스템을 사용하여 달성된 다른 유전자, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다. 선택적으로, 표적화된 게놈 편집 기술, 예를 들어 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease: TALEN) 및 가이드 RNA(gRNA)를 사용하는 CRISPR 기반이 사용될 수 있다.
면역요법 동안 많은 수의 면역 세포(예를 들어, 기억-유사 NK 세포, CAR NK 세포 및 활성화된 NK 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 NK 세포)를 투여할 수 있는 것이 도움이 되기 때문에, 일부 실시형태에서 변형된 면역 세포는 확장된 면역 세포이다. 확장된 면역 세포는 많은 수의 면역 세포를 얻기 위해서 세포의 초기 집단으로부터 시작하여 생체 외에서 성장한 것이다. 일부 실시형태에서, 확장된 면역 세포는 면역 반응을 유발하지 않으면서 대상체에게 용이하게 투여될 수 있는 자가 세포이다. 그러나, 일부 실시형태에서, 확장된 면역 세포는 동종이계 면역 세포이며, 여기서 이의 고유 동종반응성이 이점이 될 수 있다. 추가 실시형태에서, 확장된 면역 세포는 면역 세포가 병변이 있는 조직을 표적으로 하는 것을 돕기 위해서 키메라 항원 수용체를 포함하도록 추가로 유전자 조작된다. 유전자 조작된 자연 살해 세포는 유전자 서열의 조작된 변화, 예컨대, 유전자 삽입, 유전자 결실, 전위 또는 DNA 염기쌍의 서열의 임의의 변화를 통해서 생산될 수 있다. DNA 염기쌍 서열에서의 변화는 바이러스 벡터를 통해서, 예컨대, 레트로바이러스 방법, 렌티바이러스 방법, 아데노바이러스(AAV) 방법, Cre-lox 방법, 메가뉴클레아제 표적화 방법, 징크 핑거 뉴클레아제 표적화 방법, CRISPR 기반(예를 들어, CRISPR-Cas9 표적화) 방법, 트랜스포사제 방법, 화학적 변경 또는 임의의 다른 DNA 염기쌍 서열 편집 방법을 통해서 도입될 수 있다. 확장된 면역 세포의 제조는 면역 세포의 활성화 및 확장 둘 다를 포함한다. 다수의 사이토카인(IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, I형 IFN 및 TGF-β)이 생체외 면역 세포를 변형 및 확장시키는 데 유용한 것으로 밝혀져 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 평가될 NK 세포는 IL-21 확장된 NK 세포이다. 따라서, 일 양상에서, 본 명세서에는 치료적 유효량의 강력한 면역 세포를 전달하기 전에 적어도 1종의 강력한 면역 세포를 확장시키는 단계를 더 포함하는 면역요법 방법이 개시된다.
상기에 언급된 바와 같이, 본 개시내용은 확장된, 변형된 자연 살해 세포에 관한 것이다. 확장은 넓게는 NK 세포의 집단이 증가되도록 하는 NK 세포의 생체외 증식을 지칭한다. 활성화는 NK 세포의 후성적, 전사체, 표현형 상태를 조작하기 위해서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 다양한 인공 수단 및 방법을 통한 NK 세포의 자극을 지칭한다. 변경된 표현형 상태는 미경험 NK 세포에 비해서 하기 변형 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 변경된 유전자 조절(전사 및 번역), 후성유전학을 통한 변경된 각인, 수용체 표현형 발현, 변경된 대사, 표적에 대한 변경된 세포독성, 변경된 기억-유사 표현형 등. 피더 세포, PM-입자 또는 엑소좀을 보유하는 IL-21에 의해 자극된 NK 세포 내에서 유도된 전사 특징은 프로테오믹 특성을 통해 나타날 수 있으며, 더욱이 대사, 세포 사멸 활성 및 기타 유용한 기능에 대한 변경된 고유 기능 표현형을 지원할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 NK 세포는 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포로부터 확장되고, 활성화될 수 있다. 그러나, 변형된 NK 세포는 또한 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포와 같은 다른 유형의 세포로부터 제조될 수 있다. 초기 혈액 또는 줄기 세포는 태반, 제대혈, 태반 혈액, 말초 혈액, 비장 또는 간과 같은 다양한 공급원으로부터 단리될 수 있다. 다른 공급원은 iPSC 또는 ESC로부터 분화된 NK 세포를 포함할 수 있다. 제조는 세포 배양 배지에서 일어난다. 적합한 세포 배양 배지는 당업자에게 공지되어 있다. 변형된 NK 세포는 세포 배양에서 유지될 수 있는 복수의 세포인 세포주로서 제공될 수 있다. 변형된 NK 세포는 IL-21 자극에 의해 후성적 패턴의 변화를 통해 각인되어 표현형이 확장 시 딸 세포로 전달될 수 있다. 이러한 변형된 NK 세포는 동결보존될 수 있고, 그 다음 잠재적으로 해동 후에 추가로 변형될 수 있다. 따라서, 일 양상에서, 본 명세서에는 치료적 유효량의 강력한 면역 세포를 전달하기 전에 적어도 1종의 강력한 면역 세포를 변형시키는 단계를 더 포함하는 면역요법 방법이 개시된다. 일부 양상에서, 면역 세포는 면역 세포의 효력을 결정하는 방법을 수행하기 전에 공지된 방법을 사용하여 대상체로부터 추출되었다. 대안적으로, 면역 세포는 세포 배양물의 확장으로부터 공급될 수 있다.
본 출원 전반에 걸쳐 언급된 바와 같이, 본 명세서에 개시된 자연 살해 세포는 구조적으로 변형되는데, 이는 확장될 뿐만 아니라 구조적으로 변경된 인공 전사체 및/또는 프로테옴을 갖고, 활성화될 수 있음을 의미한다. 일 양상에서 본 명세서에는 변형된 NK 세포가 개시되며, 여기서 변형된 NK 세포는 미경험 또는 이전에 처리된 NK 세포를 IL-21, IL-15 및/또는 4-BBL과 접촉시킴으로써 생체내 또는 생체외에서 변형된다. 일 양상에서, IL-21, IL-15 및/또는 4-BBL은 1종 이상의 피더 세포, 원형질막 소포, 리포솜 및/또는 엑소좀 또는 이들의 임의의 조합의 표면 상에 제공된다. 따라서, 일 양상에서, 본 명세서에는 변형된 NK 세포가 개시되며, 여기서 변형된 NK 세포는 NK 세포를 막 결합된 IL-21, IL-15 및/또는 4-BBL을 발현하도록 조작된 원형질막 소포, 리포솜, 엑소좀 또는 피더 세포 또는 이들의 임의의 조합물과 접촉시킴으로써 생체내 또는 생체외에서 변형된다.
원형질막(PM) 입자는 세포의 원형질막에서 만들어지거나 인공적으로 만들어진(즉, 리포솜) 소포이다. PM 입자는 지질 이중층 또는 단순히 단일 지질층을 포함할 수 있다. PM 입자는 단일 라멜라, 다중 라멜라 또는 반전된 형태로 제조될 수 있다. PM 입자는 공지된 원형질막 제조 프로토콜 또는 리포솜 제조를 위한 프로토콜, 예컨대, 전체 개시내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제9,623,082호에 기재된 것을 사용하여, 본 명세서에 기재된 바와 같은 mbIL21-결합된 피더 세포로부터 제조될 수 있다. 특정 양상에서, 본 명세서에는 개시된 바와 같은 PM 입자는 약 170 내지 약 300㎚의 평균 직경 범위이다.
엑소좀은 다수의 그리고 아마도 모든 진핵 유체에 존재하는 세포-유래 소포이다. 엑소좀은 기원의 세포 유형을 반영하는 RNA, 단백질, 지질 및 대사산물을 함유한다. 엑소좀의 보고된 직경은 30 내지 100㎚이다. 엑소좀은 다소포체가 원형질막과 융합할 때 세포로부터 방출되거나 또는 원형질막으로부터 직접 방출된다. 일부 실시형태에서, 엑소좀은 암 세포로부터 얻어진다. 일부 실시형태에서, 엑소좀은 백혈병 세포 엑소좀이다. 본 개시내용이 면역 세포의 효력을 결정하기 위해서 엑소좀을 사용하는 것의 맥락에서 제공되어 있지만, 다른 세포외 소포가 또한 면역 세포의 효력을 결정하기 위해서 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포외 소포"는 임의의 기전에 의해서 세포로부터 방출되는 모든 소포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "세포외 소포"는 세포 표면으로부터 흘러나오는 다소포체 및 미세소포로부터 방출된 엑소좀을 포함한다. "세포외 소포"는 엑소사이토시스 또는 엑토사이토시스에 의해서 생성된 소포를 포함한다. "세포외 소포"는 다소포체로부터 방출된 엑소좀, 역 버딩(reverse budding), 막(들)의 분열에 의해서 방출된 소포, 다소포성 엔도좀, 엑토솜, 미세소포, 미세입자 및 아폽토시스체에 의해서 방출된 소포 및 원형질막 성분을 함유하는 혼성 소포를 포함한다. 세포외 소포는 기원 세포에 일반적인 단백질, 핵산, 지질 및 다른 분자를 함유할 수 있다.
일 양상에서, 원형질막 입자, 피더 세포, 리포솜, 엑소좀 또는 이들의 임의의 조합물은 면역 세포(예를 들어 NK 세포)를 자극하는 피더 세포로부터 정제될 수 있다. 본 명세서에 개시된 조작된 원형질막 입자, 조작된 피더 세포, 조작된 리포솜 또는 조작된 엑소좀을 제조하는 데 사용하기 위한, 청구된 발명에서 사용하기 위한 면역 세포 자극 피더 세포는 조사된(irradiated) 자가 또는 동종이계 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 비조사된(nonirradiated) 자가 또는 동종이계 PBMC, RPMI8866, HFWT, 721.221, K562 세포, EBV-LCL, 1종 이상의 막 결합된 IL-21, 막 결합된 IL-15, 막 결합된 4-1BBL, 막 결합된 OX40L 및/또는 막 TNF-α가 형질주입된 T 세포(예를 들어, 막 결합된 IL-21이 형질주입된 T 세포, 막 결합된 4-1BBL이 형질주입된 T 세포, 막 결합된 IL-15 및 4-1BBL이 형질주입된 T 세포, 막 결합된 IL-21 및 4-1BBL이 형질주입된 T 세포), 막 결합된 IL-21이 형질주입된 NK 세포(PBMC, RPMI8866, NK-92, NK-92MI, NK-YTS, NK, NKL, KIL, KIL C.2, NK 3.3, NK-YS, HFWT, K562 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않음), 막 결합된 4-1BBL이 형질주입된 NK 세포(PBMC, RPMI8866, NK-92, NK-92MI, NK-YTS, NK, NKL, KIL, KIL C.2, NK 3.3, NK-YS, HFWT, K562 세포), 막 결합된 IL-15 및 4-1BBL이 형질주입된 NK 세포(PBMC, RPMI8866, NK-92, NK-92MI, NK-YTS, NK, NKL, KIL, KIL C.2, NK 3.3, NK-YS, HFWT, K562 세포, 자가 암 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않음) 또는 막 결합된 IL-21 및 4-1BBL이 형질주입된 NK 세포(PBMC, RPMI8866, NK-92, NK-92MI, NK-YTS, NK, NKL, KIL, KIL C.2, NK 3.3, NK-YS, HFWT, K562 세포, 자가 암 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않음)뿐만 아니라 다른 비-HLA 또는 저-HLA 발현 세포주 또는 환자 유래 일차 종양일 수 있다.
개시된 방법에서 사용되는 또는 개시된 변형된 NK 세포를 변형시키기 위한 원형질막 입자, 피더 세포, 리포솜, 엑소좀 및/또는 이들의 임의의 조합물은 면역 세포(예를 들어, NK 세포)를 확장 및/또는 활성화시키는 것을 포함하여, 이를 변형시키기 위해서 추가 효과기 작용제를 더 포함할 수 있다. 따라서, 일 양상에서 본 명세서에는 변형된 NK 세포가 개시되며, 여기서 개시된 조작된 리포솜, 조작된 엑소좀, 조작된 피더 세포, 조작된 원형질막 입자 또는 이들의 임의의 조합물을 생성시키는 데 사용되는 피더 세포는 세포 표면 상에 적어도 1종의 추가 면역 세포 효과기 작용제를 더 포함하고, 적어도 1종의 추가 면역 세포 효과기 작용제는 사이토카인, 접착 분자 또는 면역 세포 활성화제(예를 들어, 4-1BBL, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, MICA, LFA-1, 2B4, CCR7, OX40L, UBLP2, BCM1/SLAMF2, NKG2D 효능제, CD137L, CD137L, CD155, CD112, Jagged1, Jagged2, Delta-1, Pref-1, DNER, Jedi, SOM-11, wingless, CCN3, MAGP2, MAGP1, TSP2, YB-1, EGFL7, CCR7, DAP12 및 DAP10, Notch 리간드, NKp46 효능제, NKp44 효능제, NKp30 효능제, 다른 NCR 효능제, CD16 효능제)이다. 일 양상에서 적어도 1종의 추가 면역 세포 효과기 작용제는 IL-21, 4-1BBL, IL-15, IL-21 및 4-1BBL, IL-21 및 IL-15 또는 IL-15 및 4-1BBL을 포함한다. 따라서, 일 양상에서, 상기 피더 세포에 의해서 생성되는 피더 세포, 리포솜, 원형질막 입자, 엑소좀 또는 이들의 임의의 조합물은 면역 세포 활성화제(예를 들어, 4-1BBL, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, MICA, LFA-1, 2B4, CCR7, OX40L, UBLP2, BCM1/SLAMF2, NKG2D 효능제, CD137L, CD155, CD112, Jagged1, Jagged2, Delta-1, Pref-1, DNER, Jedi, SOM-11, wingless, CCN3, MAGP2, MAGP1, TSP2, YB-1, EGFL7, CCR7, DAP12 및 DAP10, Notch 리간드, NKp46 효능제, NKp44 효능제, NKp30 효능제, 다른 NCR 효능제, CD16 효능제)의 임의의 조합물의 막 결합된 버전을 포함할 수 있다. 예를 들어, 엑소좀 또는 원형질막 입자는 이의 막 상에 IL-15, IL-21 및/또는 4-1BBL을 가질 수 있다. 일 양상에서, NK 세포는 생체외 배양물에 직접 첨가되거나, NK 세포를 제공받은 대상체에게 투여되거나, 생체외 또는 생체내에서 배양물 중의 피더 세포, 원형질막 소포, 리포솜 또는 엑소좀에 의해서 분비될 수 있는 가용성 4-1BBL, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, MICA, LFA-1, 2B4, CCR7, OX40L, UBLP2, BCM1/SLAMF2, NKG2D 효능제, CD137L, CD155, CD112, Jagged1, Jagged2, Delta-1, Pref-1, DNER, Jedi, SOM-11, wingless, CCN3, MAGP2, MAGP1, TSP2, YB-1, EGFL7, CCR7, DAP12 및 DAP10, Notch 리간드, NKp46 효능제, NKp44 효능제, NKp30 효능제, 다른 NCR 효능제, CD16 효능제와 함께 확장될 수 있다. 따라서, NK 세포는 생체외 또는 생체내에서 확장될 수 있다고 이해되고, 본 명세서에서 고려된다.
면역 세포가 사이토카인을 생성하도록 유도되는 충분한 시간 동안 입자 또는 엑소좀에 노출되어야 한다는 것이 이해되고, 본 명세서에서 고려된다. 일 양상에서, 본 명세서에는 면역 세포의 효력을 검정하는 방법이 개시되며, 여기서 면역 세포는 유효량의 원형질막 입자, 리포솜, 엑소좀 또는 이들의 임의의 조합물(조작된 입자, 리포솜 및/또는 엑소좀을 포함하지만 이것으로 제한되지 않음)과 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 150분, 3, 4, 5, 6 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 32, 36, 42, 48, 60시간, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 45, 60, 61, 62일, 3, 4, 5 또는 6개월 동안 접촉된다.
일 양상에서, 변형된 NK 세포의 변형된 STAT3 전사체는 텔로미어 조직, 유사분열의 조절, DNA 수선, 면역, 사이토카인 신호전달, 해당과정, 포도당신생합성, p53 경로에 관여된 1종 이상의 차등적으로 발현되는 유전자(예를 들어, 도 3 또는 4에 개시된 유전자 중 임의의 것, 예를 들어, 비제한적으로 HIST1H1B, HIST1H2AB, HIST1H2AG, HIST1H2AH, HIST1H2AI, HIST1H2AJ, HIST1H2AL, HIST1H2BB, HIST1H2BE, HIST1H2BH, HIST1H2BJ, HIST1H2BL, HIST1H2BM, HIST1H2BO, HIST1H3B, HIST1H3C, HIST1H3F, HIST1H3G, HIST1H3H, HIST1H3J, HIST1H4A, HIST1H4D, HIST1H4L, HIST2H3C, HIST2H4B, HIST3H2BA, HIST3H2BB, ABCA1, AK5, ASCL2, B3GAT1, CACNA2D2, CCR5, CXCR2, ENPP5, FBLN2, FCRL3, GNAL, GPRASP1, GRIK4, GTSE1, HIST3H2BB, IL1B, ITGA2, KIF13A, KIF4A, LINC00599, LONRF3, LRRN3, MSC-AS1, NFIX, NUAK1, NUAK2, PCDH1, PLXNA4, RAD51, RNF157, SLC1A7, SPON2, TYMS, WWC2, ZNF442, ZNF727 및 ZSCAN18)를 포함할 수 있다.
일 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 개시된 변형된 NK 세포 중 임의의 것이 개시되며, 여기서 하향조절되는 유전자 대 과발현되는 유전자의 비는 약 1.5이다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 변형된 NK 세포 중 임의의 것은 BIRCS, MK167, TOP2A, CKS2 및 RACGAPl로 이루어진 군으로부터 선택된 상향조절된 1종 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 또한 본 명세서에는 변형된 NK 세포가 개시되며, 여기서 자연 살해 세포는 PTCHl, TGFB3 및 ATM으로 이루어진 군으로부터 선택된 하향조절된 1종 이상의 단백질을 포함한다.
1. 약제학적 담체/약제학적 제품의 전달
상기에 기재된 바와 같이, 조성물은 또한 약제학적으로 허용 가능한 담체로 생체내에 투여될 수 있다. "약제학적으로 허용 가능한"이란, 생물학적이 아닌 또는 달리 바람직하지 않은 물질을 의미하며, 즉, 그 물질은 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 일으키지 않거나 그것이 함유된 약제학적 조성물의 다른 성분 중 임의의 것과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서, 핵산 또는 벡터와 함께 대상체에 투여될 수 있다. 담체는 당업자에게 널리 공지된 바와 같이, 활성 성분의 임의의 분해를 최소화하고 대상체에서 임의의 유해한 부작용을 최소화하도록 자연적으로 선택될 것이다.
조성물은 국소 비강내 투여 또는 흡입제에 의한 투여를 포함하여, 경구, 비경구(예를 들어, 정맥내), 근육내 주사, 복강내 주사, 경피, 체외, 국소 등으로 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "국소 비강내 투여"는 콧구멍 중 하나 또는 둘 모두를 통해 코 및 비강으로의 조성물의 전달을 의미하고, 분무 기전 또는 액적 기전에 의한 전달 또는 핵산 또는 벡터의 에어로졸화를 통한 전달을 포함할 수 있다. 흡입제에 의한 조성물의 투여는 분무 또는 액적 메커니즘에 의한 전달을 통해 코 또는 입을 통해 이루어질 수 있다. 또한 삽관을 통해 호흡기계(예를 들어, 폐)의 임의의 면적에 직접 전달될 수 있다. 필요한 조성물의 정확한 양은 대상체의 종, 연령, 체중 및 일반적인 상태, 치료될 알레르기 장애의 중증도, 사용되는 특정 핵산 또는 벡터, 투여 방식에 따라 대상체마다 달라질 것이다. 따라서, 모든 조성물에 대해 정확한 양을 지정하는 것은 불가능하다. 그러나, 적절한 양은 본 명세서의 교시를 고려하여 일상적인 실험만을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
조성물의 비경구 투여는 사용되는 경우 일반적으로 주사를 특징으로 한다. 주사제는 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전 액체 중의 현탁액 용액에 적합한 고체 형태 또는 에멀션으로서 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여에 대한 보다 최근에 개정된 접근법은 일정한 용량이 유지되도록 느린 방출 또는 지속적 방출 시스템의 사용을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 제3,610,795호 참고.
물질은 용액, 현탁액(예를 들어, 마이크로입자, 리포솜 또는 세포에 혼입됨)일 수 있다. 이들은 항체, 수용체 또는 수용체 리간드를 통해 특정 세포 유형에 표적화될 수 있다. 다음 참고 문헌은 종양 조직에 대해 특정 단백질을 표적화하기 위해 이 기술을 사용하는 예이다(문헌[Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); 및 Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)]). "스텔스(stealth)" 및 기타 항체 접합 리포솜(결장 암종에 대한 지질 매개 약물 표적화 포함)과 같은 비히클, 세포 특이적 리간드를 통한 DNA의 수용체 매개 표적화, 림프구 유도 종양 표적화 및 생체내 뮤린 신경교종 세포의 고도로 특이적인 치료용 레트로바이러스 표적화. 다음 참고 문헌은 종양 조직에 대해 특정 단백질을 표적화하기 위해 이 기술을 사용하는 예이다(문헌[Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); 및 Litzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)]). 일반적으로, 수용체는 구성적이거나 리간드로 유도되는 엔도사이토시스(endocytosis) 경로에 관여한다. 이 수용체는 클라트린-코팅된 피츠(pits)에 모여서, 클라트린-코팅된 소포를 통해 세포에 들어가고, 수용체가 분류된 산성화된 엔도솜을 통과한 다음 세포 표면으로 재순환하거나 세포 내에 저장되거나, 리소좀에서 분해된다. 내재화 경로는 영양소 흡수, 활성화된 단백질 제거, 거대분자 제거, 바이러스 및 독소의 기회적 진입, 리간드의 해리 및 분해 및 수용체-수준 조절과 같은 다양한 기능을 제공한다. 많은 수용체는 세포 유형, 수용체 농도, 리간드 유형, 리간드 원자가 및 리간드 농도에 따라 하나 이상의 세포 내 경로를 따른다. 수용체-매개 엔도사이토시스의 분자 및 세포 기전이 검토되어 있다(문헌[Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)]).
a) 약제학적으로 허용 가능한 담체
항체를 포함하는 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 치료적으로 사용될 수 있다.
적합한 담체 및 이의 제형은 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995]에 기재되어 있다. 전형적으로, 제형을 등장성으로 만들기 위해 적절한 양의 약제학적으로 허용 가능한 염이 제형에 사용된다. 약제학적으로 허용 가능한 담체의 예는 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 보다 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 추가의 담체는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스와 같은 지속 방출형 제제를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름, 리포솜 또는 마이크로입자의 형태이다. 특정 담체는 예를 들어, 투여 경로 및 투여되는 조성물의 농도에 따라 더 바람직할 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
약제학적 담체는 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 가장 전형적으로 생리 pH에서 멸균수, 식염수 및 완충 용액과 같은 용액을 포함하여 인간에게 약물을 투여하기 위한 표준 담체일 것이다. 조성물은 근육내 또는 피하 투여될 수 있다. 다른 화합물은 당업자에 의해 사용되는 표준 절차에 따라 투여될 것이다.
약제학적 조성물은 선택된 분자 외에 담체, 증점제, 희석제, 완충제, 보존제, 표면 활성제 등을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 항균제, 항염증제, 마취제 등과 같은 1종 이상의 활성 성분을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 필요한지의 여부 및 치료할 부위에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(안과적으로, 질, 직장, 비강 포함), 경구, 흡입, 또는 비경구, 예를 들어, 정맥내 점적, 피하, 복강내 또는 근육내 주사일 수 있다. 개시된 항체는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 공동내, 또는 경피 투여될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 에멀션을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일 및 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스터를 포함한다. 수성 담체는 물, 알코올/수성 용액, 염수 및 완충 매질을 포함한 에멀션 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제(예컨대, 링거 덱스트로스에 기초한 것) 등을 포함한다. 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제, 및 불활성 기체 등과 같은 보존제 및 다른 첨가제가 또한 존재할 수 있다.
국소 투여용 제형은 연고, 로션, 크림, 겔, 점적액, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약제학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 염기, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다.
경구 투여용 조성물은 분말 또는 과립, 물 또는 비수성 매질 중의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 사쉐(sachet) 또는 정제를 포함한다. 증점제, 향료, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다.
조성물 중 일부는 무기산, 예컨대, 염산, 브롬화수소산, 과염소산, 질산, 티오시안산, 황산 및 인산 및 유기산, 예컨대, 폼산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 석신산, 말레산 및 푸마르산과의 반응에 의해서 또는 무기 염기, 예컨대, 수산화나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨 및 유기 염기, 예컨대, 모노-, 다이-, 트라이알킬 및 아릴 아민 및 치환된 에탄올아민과의 반응에 의해서 형성된 약제학적으로 허용 가능한 산- 또는 염기-부가 염으로서 잠재적으로 투여될 수 있다.
b) 치료 용도
조성물을 투여하기 위한 효과적인 투여량 및 일정은 경험적으로 결정될 수 있으며, 그러한 결정을 내리는 것은 당업계의 기술 범위 내에 있다. 조성물의 투여를 위한 투여량 범위는 장애의 증상이 영향을 받는 원하는 효과를 생성하기에 충분히 큰 것이다. 투여량은 원치 않는 교차 반응, 아나필락시스 반응 등과 같은 유해한 부작용을 일으킬 정도로 커서는 안 된다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 질환의 정도, 투여 경로, 또는 다른 약물이 요법에 포함되는지 여부에 따라 달라질 것이며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 반대 징후가 있는 경우 개별 의사가 조정할 수 있다. 투여량은 다양할 수 있고, 하루 또는 며칠 동안 1일 1회 이상의 용량 투여로 투여될 수 있다. 주어진 종류의 약제학적 제품에 대한 적절한 투여량에 대한 지침은 문헌에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 항체에 대한 적절한 용량을 선택하는 지침은 항체의 치료 용도에 관한 문헌, 예를 들어 문헌[Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389]에서 찾아볼 수 있다. 단독으로 사용되는 항체의 일반적인 1일 투여량은 상기에 언급된 요인에 따라 1일당 약 1μg/kg 내지 최대 100mg/kg 체중 또는 그 초과의 범위일 수 있다.
C. 암의 치료 방법
변형된 NK 세포, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 활성화된, 변형된 STAT3 전사체를 포함하는 것이 면역 반응을 조절할 수 있는 것으로 이해되고, 본 명세서에서 고려된다. 따라서, 한 양상에서, 활성화된 STAT3 전사체를 포함하는 변형된 NK 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 면역계를 조절하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 대안적으로, 본 개시내용은 작용제, 예컨대, PM 입자, 엑소좀 또는 이들의 임의의 조합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여, 활성화된 STAT3 전사체로 내인성 NK 세포를 NK 세포 상태로 자극함으로써 대상체의 면역 체계를 조절하는 것을 고려한다.
일 양상에서, 면역 반응을 조절하는 것은 질환 상태에 대해 임상적으로 이로운 효과를 가질 수 있고, 따라서 질환 또는 병태에 대한 치료제로 작용하거나 질환 또는 병태를 치료하는 데 사용되는 또 다른 요법을 보강할 수 있는 것으로 이해된다. 개시된 조성물은 암과 같이 제어되지 않는 세포 증식이 일어나는 임의의 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 개시된 조성물을 사용하여 치료할 수 있는 암의 대표적이지만 비제한적인 목록은 하기이다: 림프종, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 균상 식육종, 호지킨병, 골수성 백혈병, 방광암, 뇌암, 신경계암, 두경부암, 두경부의 편평 세포 암종, 폐암, 예컨대, 소세포 폐암 및 비소세포폐암, 신경모세포종/교모세포종, 난소암, 피부암, 간암, 흑색종, 구강, 인후, 후두 및 폐의 편평세포암종, 자궁경부암, 자궁경부 암종, 유방암 및 상피암, 신장암, 비뇨생식기암, 폐암, 식도암, 두경부암, 대장암, 조혈암; 고환암; 결장암, 직장암, 전립선암 또는 췌장암. 따라서, 일 양상에서, 본 명세서에는 대상체에게 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 바와 같은 확장된 자연 살해 세포를 투여하는 단계를 포함하는 암 및/또는 전이를 치료, 저해, 감소, 개선 및/또는 예방하는 방법이 개시된다.
D. 실시예
하기 실시예는 본 명세서에 청구된 화합물, 조성물, 물품, 장치 및/또는 방법이 어떻게 제조되고, 평가되는지에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되며, 순수하게 예시이며, 본 개시내용을 제한하려는 의도가 아니다. 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만 일부 오류 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 명시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 온도는 ℃ 또는 주변 온도이며, 압력은 대기압 또는 그 부근이다.
1. 실시예 1 증식성 확장 동안 NK 세포에서 변경된 STAT3 전사체는 대사, 후성적 및 생존 네트워크의 재프로그래밍으로 이어진다.
40여 년보다 더 오래 전에 발견되었음에도 불구하고 자연 살해(NK) 세포는 최근 세포 요법에 대한 잠재력으로 주목을 받았다. NK 세포는 선천 면역 체계의 중요한 부분이며, 미생물 감염 및 종양 진행에 대한 숙주 면역에 중요한 역할을 한다. 점점 더 많은 수의 임상 연구가 NK 세포-기반 면역요법의 유망한 항종양 효과를 강조하고 있다. 그러나, 불충분한 수 및 제한된 수명은 적응 면역요법에서 NK 세포의 적용을 제한하는 장애물이다. 사이토카인을 포함한 NK 세포의 수와 기능을 향상시키기 위해 여러 접근 방식이 사용되고 있다. 이전에, 본 발명자들은 배양에서 최대 6주까지 노화를 겪지 않고, 막-결합 인터류킨-21(mbIL21)을 발현하는 피더 세포와의 공배양 후 강력한 NK-세포 확장을 성공적으로 입증하였다. 그러나, IL-21 신호전달의 전사 영향은 완전히 평가되지 않았다.
IL-21은 NK-세포 활성화, 성숙 및 증식에 필수적인 유형 I 사이토카인이다. 그러나, NK 세포에서 IL-21의 근본적인 효과에 대한 분자 기전은 아직 완전히 이해되지 않았다. IL-21은 야누스 키나제(Janus kinase: JAK) 및 신호 변환기 및 전사 활성화인자(activator of transcription: STAT) 경로를 통해 신호를 전달한다. IL-21 수용체에 대한 IL-21의 결합은 JAK의 인산화 및 STAT3의 동반 활성화를 초래한다. 인산화 시, STAT3은 동종이량체를 형성하며, 이것은 핵으로 이동하여, IL-21 반응성 유전자의 전사를 시작한다.
STAT3은 염증의 음성 조절인자이며, 종양에서 STAT3의 저해는 항-종양 면역이 향상되는 것으로 밝혀져 있다. 대조적으로, STAT3은 인간 NK 세포 발달에서 신호 전달 캐스케이드의 중요한 부분이며, 아폽토시스, 생존 및 증식과 관련된 여러 기능을 갖는다. STAT3은 NK 세포용해 활성을 제어하는 거의 모든 경로뿐만 아니라 NK 세포와 면역 체계의 다른 구성 성분 간의 상호 조절 상호작용을 유도하는 데 관여한다. STAT3 신호전달은 NK 세포 증식 및 세포독성을 유지하는 데 있어서 인간 NK 세포의 mbIL21-매개 증식에 중요하다. 그러나, 게놈-전체 수준에서, 생체외 NK 세포 확장에 대해서 유전자를 조절하는 STAT3 전사체는 보고된 적이 없다.
이를 위해서, 본 발명자들은 STAT3에 의해 조절되는 분자적 사건을 더 잘 이해하기 위해서, IL-21로 자극하기 전과 후에 휴면 인간 말초 혈액(미경험)과 생체외 확장된 인간 NK 세포에 대해 STAT3 ChIP-seq 및 RNA-seq를 수행하였다. 케모카인 및 사이토카인 발현, 세포 증식 및 이동을 제어하는 STAT3-매개 전사체의 이러한 지식은 NK 세포-기반 면역요법의 활성을 개선하는 데 가치가 있다. 여기에서, 게놈-전체 분석 방법과 컴퓨터 데이터 통합의 조합은 NK 세포 확장 전과 후의 직접 및 간접 STAT3 표적을 식별한다.
a) 물질 및 방법
(1) PBMC 획득 및 NK 세포 제조
지역 적십자 혈액 센터(Regional Red Cross Blood Center)(미국 오하이오주 콜럼버스 소재)에서 익명의 일반 기증자 버피 코트를 얻었다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 건강한 기증자 버피 코트 샘플로부터 Ficoll-Paque를 통한 원심분리에 의해 정제시켰다. 신선한 NK 세포를 RosetteSep Human NK Cell Enrichment Cocktail(스템셀 테크놀로지즈사(STEMCELL Technologies), 캐나다 브리티시컬럼비아주 밴쿠버 소재)을 사용하여 95% 이상의 순도(CD3-CD16/56+)로 정제시켰다. 일부 경우에, NK 세포를 ChIP-seq 및 RNA-seq 분석 전에 확장 후 1% 미만의 CD3+까지 추가로 정제시켰다.
(2) NK 세포 생체외 확장
CD137L 및 mbIL21을 발현하도록 부모 K562의 유전자 변형에 의해서 K562-기반 피더 세포(CSTX002)를 생산하였다. 100IU/㎖의 rhIL-2의 존재 하에서 피더 세포로 매주 자극함으로써 NK 세포를 시험관내에서 PBMC로부터 확장시켰다. 세포를 표시된 대로 사이토카인이 있거나 없이, 10% 소태아 혈청(하이클론사(HyClone), 미국 유타주 로건 소재), 2mM l-글루타민(깁코/인비트로젠사(Gibco/Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(셀그로/메디아테크사(Cellgro/Mediatech)이 보충된 RPMI 1640(셀그로/메디아테크사, 미국 버니지아주 매나서스 소재)에서 배양하였다.
(3) 시약
재조합 인간 IL-2(프로류킨(Proleukin))는 노바티스 백신 및 진단사(Novartis Vaccines and Diagnostics)(미국 뉴저지주 이스트 하노버 소재)에서 구입하였고, IL-21은 펩프로테크사(PeproTech)(미국 뉴저지주 록키 힐 소재)에서 구입하였다.
(4) STAT3 인산화의 웨스턴 블롯 분석
IL-21(20ng/㎖)로 자극한 후, 세포를 프로테아제 및 포스파타제 저해제를 함유한 RIPA 용해 완충액에서 용해시키고, 4℃에서 15분 동안 15,000×g에서 원심분리시켰다. 상청액을 SDS 환원 샘플 완충액에서 끓이고, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 실시한 다음 전기영동적으로 폴리바이닐리덴 다이플루오라이드 막으로 옮겼다. 5% 건조 지방 탈지유를 함유하는 TBST(20mM Tris-HCl(pH 7.5), 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)에서 차단한 후, 막을 4℃에서 밤새 1차 항체로 프로빙하였다. 본 연구에 사용된 항체는 셀 시그널링 테크놀로지사(Cell Signaling Technology)(미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)의 항-포스포-STAT3(Tyr-705), 항-STAT3 및 항-β-액틴이었다. 막을 TBST로 광범위하게 세척하고, 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합 항-마우스 또는 항-토끼 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 막을 TBST로 15분 동안 2회 세척하였다. 제조사의 지침에 따라 Amersham ECL 웨스턴 블로팅 검출 시약(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시스사(GE Healthcare Bio-Sciences), 미국 매사추세츠주 말보로 소재)을 사용하여 블롯을 시각화하였다.
(5) 염색질 면역침전(Chromatin immunoprecipitation: ChIP) 검정
미경험 NK 세포 및 확장된 NK 세포를 사이토카인이 없는 배지에서 밤새 휴지시킨 후, 30분 동안 IL-21(20ng/㎖)로 자극하였다. 그런 다음 NK 세포를 1% 폼알데하이드로 15분 동안 고정하고, 0.125M 글리신으로 켄칭하였다. 용해 완충액을 첨가한 후 Dounce 균질화기로 파괴하여 염색질을 단리시켰다. 용해물을 초음파 처리하고, DNA를 300 내지 500bp의 평균 길이로 절단하였다. 염색질의 분취물을 RNase, 프로테이나제 K 및 탈가교를 위한 열로 처리한 후 에탄올 침전시킴으로써 게놈 DNA(입력)를 준비하였다. 펠릿을 재현탁하고, 생성된 DNA를 NanoDrop 분광광도계에서 정량하였다. 본래 염색질 부피에 대한 외삽으로 총 염색질 수율을 정량할 수 있다.
염색질의 분취물(10μg)을 단백질 A 아가로스 비드(인비트로젠사(Invitrogen))로 미리 정화시켰다. 관심대상 게놈 DNA 영역을 STAT3(산타 크루즈사(Santa Cruz), sc-482, Lot C0816)에 대한 항체(2μg)를 사용하여 단리시켰다. 복합체를 세척하고, SDS 완충액으로 비드로부터 용출시키고, RNase 및 프로테이나제 K 처리를 실시하였다. 65oC에서 밤새 인큐베이션시켜 가교를 역전시키고, ChIP DNA를 페놀-클로로폼 추출 및 에탄올 침전에 의해 정제시켰다.
(6) ChIP 서열결정(llumina)
단부-연마(end-polishing), dA-첨가 및 어댑터 결찰의 표준 연속 효소 단계에 의해서 ChIP 및 입력 DNA로부터 Illumina 서열결정 라이브러리를 준비하였다. 최종 PCR 증폭 단계 후, 생성된 DNA 라이브러리를 정량하고, Illumina의 NextSeq 500(75nt 판독물, 단일 단부)에서 서열결정하였다. 판독물을 BWA 알고리즘(디폴트 설정)을 사용하여 인간 게놈(hg38)에 정렬하였다. 중복 판독물을 제거하였고, 고유하게 매핑된 판독물(25 이상의 매핑 품질)만 추가 분석에 사용하였다. 정렬을 인 실리코에서(in silico) 3'-단부에서 200bp 길이로 연장시켰는데, 이는 크기-선택된 라이브러리의 평균 게놈 단편 길이이며, 게놈을 따라 32nt 빈(bin)에 배정되었다. 생성된 히스토그램(게놈 "신호 맵")을 bigWig 파일에 저장하였다. 피크 위치는 p-값 = 1e-7의 컷오프와 함께 MACS 알고리즘(v2.1.0)을 사용하여 결정하였다.
(7) RNA-seq 샘플 준비 및 서열결정
Total RNA Purification Plus Kit(노겐 바이오테크사(Norgen Biotek), 캐나다 온타리오 소재)를 사용하여 IL-21-자극된 미경험 NK 세포 및 확장된 NK 세포에서 총 RNA를 정제시켰다. 생성된 총 RNA를 Nanodrop ND-1000 분광광도계에서 정량하고, Bioanalyzer-2100 장치(애질런트 테크놀로지즈사(Agilent Technologies Inc.), 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)에서 순도 및 온전성을 확인하고, 서열결정을 위해 Nationwide Children's Hospital의 게놈 코어에 제출하였다. 라이브러리를 제조사에서 권장하는 프로토콜에 따라 TruSeq RNA Sample Preparation Kit(일루미나사)를 사용하여 준비하였다. 고감도 D1000 ScreenTape Assay kit를 사용하여 Agilent 4200 Tapeestation을 통해 라이브러리 품질을 결정하고, KAPA qPCR(카파 바이오시스템즈사(KAPA BioSystems))로 정량하였다. Illumina HiSeq4000 플랫폼을 사용하여 라이브러리당 약 6천만 내지 8천만 개의 페어드-엔드 150bp 시퀀스 판독물을 생성시켰다.
스플라이스-인식 정렬기 STAR의 버전 2.5.2b를 사용하여 NCBI로부터의 호모 사피엔스 참조의 GRCh38.p9 어셈블리에 각각의 샘플의 서열결정 판독물을 정렬하였다. 피처 커버리지(feature coverage) 계수치는 NCBI로부터의 어셈블리와 함께 제공된 GFF 파일을 사용하여 HTSeq로 계산하였다. GFF로부터의 특징 유형, 엑손 및 특징 식별자, 유전자 id에 대한 디폴트 옵션을 사용하여 RNA-Seq 분석을 위한 특징을 식별하였다. 샘플 준비 및 정렬에 대한 품질 제어 검사는 STAR의 매핑 품질 메트릭스를 사용하여 판독물의 유형을 계수하고, NCBI로부터의 어셈블리와 함께 제공되는 피쳐 테이블에 의해 정의된 각각의 피쳐 클래스에 정렬된 판독물의 수를 계수하는 맞춤 Perl 스크립트를 사용하여 수행하였다. DESeq2를 사용하는 맞춤 R 스크립트를 사용하여 미분 표현 분석을 수행하였다. 1.5 이상의 절대값의 배수 변경 및 0.10(10% FDR) 이하의 조정된 p-값의 기준으로 상당히 차등적으로 발현되는 특징을 식별하였다.
(8) 통합 오믹스(Integrative omics) 데이터 분석
Ingenuity Pathway Analysis(인줘너티 시스템즈사(Ingenuity Systems))를 사용하여 RNA 수준에서 차등적으로 발현되는 유전자의 분자 네트워크 상호작용의 식별 및 경로 분석을 완료하였다. 직접 및 간접적인 관계가 있는 독창성 지식 기반(유전자 단독)을 사용하고, 인간에서 실험적으로 관찰된 분자 및/또는 관계만 고려하였다.
b) 결과
(1) NK 세포에서 STAT3-결합 부위의 게놈-전체 식별
생체 내에서 미경험 NK 세포 및 확장된 NK 세포에서 IL-21에 의한 STAT3 인산화에 대한 반응으로 STAT3에 의해 결합된 영역을 특징규명하기 위해, 본 발명자들은 ChIP-seq에 의해 STAT3-결합 단편을 서열결정하였다. 이를 위해, 1차 NK 세포를 먼저 30분 동안 IL-21(20ng/㎖)로 처리하고, 강력한 STAT3 인산화가 관찰된 반면, 인산화된 STAT3은 IL-21의 부재 하에서는 검출될 수 없었다(도 1A). 이러한 발견은 IL-21이 NK 세포에서 강력하고, 지속적인 STAT3 인산화를 유도한다는 초기 발견을 뒷받침한다. 다음으로, IL-21-처리된 미경험 세포 및 확장된 세포 둘 다에서 STAT3의 염색질 면역침전을 고속대량처리(high-throughput) 서열결정과 커플링시켰다. 단편화된 염색질을 면역침전시키고, DNA 딥-서열결정하였고, 대조군 ChIP-seq 라이브러리를 생성시키기 위해서 면역침전되지 않은 총 입력 DNA도 마찬가지였다. 대조군 라이브러리와 비교하여 ChIP-seq(MACS) 농축에 대한 모델-기반 분석을 사용하여 피크 식별을 수행하였다. STAT3 면역침전 대 입력 비교에서 10-7 미만의 역치 p-값 및 20% 미만의 거짓 발견율(false discovery rate: FDR)을 사용하여, 본 발명자들은 IL-21-처리된 미경험 NK 세포 및 확장된 NK 세포에서 각각 STAT3에 의해 결합된 2,162 및 4,876개의 피크를 확인하였고, 이들을 전사 시작 부위(transcriptional start site: TSS)와 관련하여 인간 게놈에 매핑하였다. 약 1800개는 확장된 NK 세포에서 TSS(-500에서 +100nt)와 연관되었고, 미경험 NK 세포에서는 약 650개였다. TSS-원위 피크는 유전자내, 가까운 유전자간(TSS로부터 20Kb 미만) 및 먼 유전자간(20Kb 초과)으로 정의되었다(도 1B). 전반적으로, 데이터는 NK 세포에서 IL-21 자극이 프로모터에 대한 pSTAT3의 우선적 결합을 초래함을 나타낸다.
STAT3은 자신의 발현을 안정화시키는 기능을 하는 다수의 전사 인자(TF)의 고유한 긍정적인 자가-조절 패턴인 그 자신의 전사를 조절한다. 본 발명자들은 IL-21-자극된 미경험 NK 세포 및 확장된 NK 세포에서 STAT3 유전자 자체의 프로모터에서 명확한 피크를 식별하였는데(도 1C), 이는 공지된 STAT3-조절 유전자를 식별하기 위한 STAT3 ChIP-seq 라이브러리의 우수한 품질을 나타낸다. 본 발명자들은 HOMER를 사용하여 신생(de novo) 모티프 발견을 위해 모든 STAT3-결합 피크를 스캔하였고, 원형 STAT3 동종이량체 모티프 TTCCnGGAA(도 1D)를 복구하였지만, 미경험 NK 세포에 비해서 확장된 NK 세포에서 지배적인 배향이 반전되었다. 프로모터 영역의 5kb 내의 피크의 경우, 본 발명자들은 미경험 NK 세포에서 확장된 NK 세포에서 더 높은 STAT3 동종이량체 모티프 빈도를 발견하였다(도 1E). 마지막으로, STAT3 모티프의 위치와 관련하여, 본 발명자들은 확장된 NK 세포에서 전사 활성 영역(TAR)에 대한 STAT3 결합이 3 내지 5배 증가한다는 것을 발견하였다(도 1F). 원위 유전자간 결합에는 차이가 없었는데, 이는 TAR 결합이 확장된 NK 세포에서 우선적으로 증가되었음을 나타낸다. 분석은 STAT3-결합 피크 목록이 인간 NK 세포의 생체외 확장 동안 활성 STAT3 유전자 조절을 정확하게 반영하는 고품질 데이터세트임을 나타낸다.
(2) 생물학적 과정과 연관된 STAT3-결합 부위
GREAT를 사용하여 STAT3-결합 부위의 게놈-전체 기능성 특성을 해석하였다. Gene Ontology(GO) 항목을 사용하여 기능성 주석을 유도하는 대부분의 도구는 유전자의 세트 또는 유전자에 근접한 결합 사건(따라서 대부분의 결합 사건의 폐기)에 대한 계산을 기반으로 하는 반면, GREAT는 게놈의 비무작위 분포를 고려하고, 특히 ChIP-seq 데이터의 게놈-전체 분석에 적합하다. GREAT는 표준 GO 항목-농축 방법을 능가하는 것으로 밝혀져 있고, STAT3-결합 부위 세트에 대한 분석은 주요 면역 기능의 명확한 농축을 보고하였다. 도 2는 다양한 카테고리(GO 생물 과정, GO 분자 기능, PANTHER 경로, MSigDB 경로)와 연관된 유전자 세트 농축 값을 도시한다. 분자 기능 농축에 대한 상위 온톨로지는 미경험 NK 세포 및 확장 NK 세포 둘 다에서 RNA 결합, -대사 및 -헬리카제 활성이었다. MSigDB 경로 카테고리에서 "NK 세포 매개된 세포독성" 및 "사이토카인 신호전달"을 포함한 다중 면역-관련 경로는 미경험 NK 세포에서 풍부한 것으로 밝혀진 반면, mRNA 처리, 세포 주기 및 사이토카인 신호전달 온톨로지는 확장된 NK 세포에서 명확하게 풍부하였다. PANTHER 경로 카테고리를 살펴보면, 아폽토시스, 인터류킨 신호전달 및 JAK-STAT 신호전달과 관련된 항목이 과발현되는데, 이는 확장된 NK 세포에서 IL-21/JAK/STAT3 경로의 역할이 세포 증식 및 생존을 조절하는 것이고, 그 자신의 신호전달 경로를 지원하는 것임을 나타낸다. GO 생물학적 과정 카테고리는 미경험 NK 세포의 면역 반응 및 확장된 NK 세포에서 바이러스 반응 및 세포 증식과 관련된 항목이 풍부하였다. 종합하면, GREAT 분석은 미경험-NK 세포 및 확장된-NK 세포에서 관찰된 STAT3-결합 사건이 면역 세포 기능 및 세포 성장을 조절한다는 증거를 제공하였다.
(3) 미경험 NK 세포 및 확장된 NK 세포에서 차등적 유전자 발현
IL-21 자극에 대한 반응으로 NK 세포 활성의 고유하고 공통적인 특징을 정의하기 위해서, 본 발명자들은 NK 세포의 전체 전사체를 연구하였다. 고속대량처리 RNA 서열결정(RNA-seq)을 사용하여 5명의 기증자에서 휴면 및 IL-21-자극된 미경험 NK 세포 및 확장된 NK 세포의 발현 프로파일을 조사하였다(도 3). 대략 10억 개의 bp를 서열결정하였는데, 이것은 각각의 샘플에 대해 약 6천만 내지 8천만 개의 페어드-엔드 150bp 서열 판독물로 이루어졌다. 스플라이스-인식 정렬기 STAR의 버전 2.5.2b를 사용하여 NCBI로부터의 호모 사피엔스 참조의 GRCh38.p9 어셈블리에 각각의 샘플의 서열결정 판독물을 정렬하였다. 판독물의 대략 96%가 인간 게놈에 성공적으로 정렬되었다. 미경험-NK 세포 및 확장된-NK 세포로부터의 RNA-seq 라이브러리를 조합한 후, 본 발명자들은 각각 전사체의 79% 및 78%를 명확하게 조립할 수 있었다.
본 발명자들은 RNA-seq에 의해 미경험 NK 세포 및 확장된 NK 세포의 전사체를 분석하였다. 본 발명자들은 센스 가닥으로부터 14,183개의 RNA 전사체를 검출하였으며, 이것으로부터, 본 발명자들은 잘못된 차등 발현을 피하기 위해서, 전체 발현 수준(FPKM)이 1인 RNA만 고려하였다. 그런 다음 본 발명자들은 STAT3의 활성화로 인해 발현이 50%를 초과하게 증가하거나 또는 감소하는(1.5 초과의 배수 변화 비율) STAT3-조절 유전자를 정의하기 위해 임의의 역치를 설정하였다. 약 7,951개의 전사체가 미경험 세포와 비교하여 확장된 NK 세포에서 차등적으로 발현되었다(도 3A).
본 발명자들은 확장된/미경험 FPKM 발현 비율이 1.5를 초과하는 2,938개의 과발현된 유전자 및 배수 변화 비율이 1.5 미만인 5,013개의 하향조절된 유전자를 발견하였다(도 3B, 도 3C에 도시된 상위 100개의 상이하게 발현된 유전자). 따라서, 확장된 NK 세포에서 STAT3 자극의 가장 빈번한 효과는 유전자 발현의 하향조절이었다. 이러한 차등적으로 발현되는 전사체가 관여하는 생물학적 경로를 조사하기 위해서, 본 발명자들은 다음으로 GO 유전자 세트를 사용하여 유전자 세트 농축 분석(Enrichr)을 수행하여 각각의 하위세트 내의 연관성을 식별하였다. IL-21로의 자극 후 확장된 NK 세포 대 미경험 NK 세포에서 하향조절된 유전자 중에서, GO 분석은 주로 "전사 조절"과 같은 몇 가지 통계적으로 유의한 카테고리를 나타내었다. 다른 한편, 확장된 NK 세포에서 상향조절된 유전자는 세포 성장 카테고리, 예컨대, "DNA 대사 과정", "유사분열 조절", "미토콘드리아 ATP 합성", "해당과정" 및 "p53 경로"에서 보다 유의하게 농축되었다(도 3D).
본 발명자들은 IPA 패키지(QIAGEN Redwood City)를 사용하여 차등 발현 유전자(differential expressed gene: DEG)가 속하는 경로를 식별하고, 이러한 DEG를 연결하는 신호 전달 네트워크의 존재를 조사하였다. 몇몇 경로가 4,275개의 DEG의 데이터세트에서 상당히 농축되었다(도 4A). 가장 농축된 경로 중에는 산화적 인산화, 뉴클레오타이드 절제 회복(nucleotide excision repair: NER) 경로, 시르투인(sirtuin) 신호전달 경로, 세포 주기 및 그랜자임 A 신호전달이 있다. 차등적으로 발현되는 mRNA 유전자를 또한 IPA 소프트웨어를 사용하여 유전자 규제 네트워크에서 그룹화하였다. 본 발명자들은 다양한 기능과 관련된 25개의 규제 네트워크를 발견하였고, 최고 점수를 받은 것은 세포 사멸 및 생존, 감염 질환, 세포 기능 및 유지, 혈액 질환의 규제 네트워크였다(도 4B).
그런 다음 본 발명자들은 STAT3의 게놈-전체 결합 패턴을 발현 데이터(RNA-seq)와 통합하여 STAT3가 조절하는 유전자에 대한 이의 주요 효과를 밝혀내었다. STAT3-결합 부위는 RNA-seq 데이터에 따라 가장 가까운 발현 유전자(TSS)에 주석을 달았고, 가장 가까운 TSS까지의 거리에 대해 비닝(binning)하였다. STAT3-결합 부위의 거의 약 50%가 우선적으로 유전자 본체 내에 있으며, 가장 가까운 TSS로부터 200kb보다 큰 거리에서 약 10%만 발견된다. IL-21 자극에 대한 유전자 발현의 변화에 대한 전체적인 관점을 얻기 위해서, 유의미한 결합 차이를 갖는 STAT3 결합 영역을 식별한 후, 본 발명자들은 이를 인근 유전자와 연관시킨 다음 차등적으로-조절된 전사체에서 과도하게 표현된 GO 항목을 조사하였다(도 5). 세포 분열, 아폽토시스 및 DNA 손상 반응과 관련된 GO 생물학적 과정 카테고리가 있는 유전자는 미경험 세포에 비해 확장된 NK 세포에서 농축되었다(도 5A). 반면, 염색질 리모델링, 뉴클레오솜 분해 및 전사의 음성 조절과 관련된 GO 항목은 미경험 세포에서 농축되었다(도 5B). 이러한 경로의 발현은 NK 세포가 빠르게 확장하도록 프라이밍하고, IL-21 자극이 신선한 대응물보다 강력한 이유를 설명한다.
c) 논의
NK 세포는 상당한 표현형 및 기능적 다양성을 갖는 타고난 림프구이다. 이들은 바이러스 감염, 병원체 및 종양 세포에 대한 선천 면역 체계 및 즉각적인 효과기 세포의 주요 플레이어여서; 이들을 입양 면역요법에 사용하기 위한 유망한 도구로 만든다. 그러나, NK-세포는 순환 혈액 림프구의 5 내지 15%만 손상시키기 때문에; 입양 NK 세포 면역요법의 주요 장애물은 충분한 세포 수를 얻는 것이다. 이러한 맥락에서, 생체외 배양은 임상 적용 전에 NK 세포의 수를 증가시키고, 항종양 잠재력을 개선하는 매력적인 옵션이다. 이전에, 본 발명자들은 STAT3가 이러한 확장된 NK 세포에서 유전자 발현을 조절하는 핵심 신호 변환요소임을 발견하였다. NK 세포 상의 IL-21R에 대한 IL-21의 결합은 STAT3를 활성화하고; IL-21은 30분 후에 최대 반응으로 확장된 NK 세포에서 STAT3의 인산화를 유도하고, 6시간까지 기준선으로 복귀된다.
확장 후 NK 세포 활성을 조절하는 STAT3-조절 유전자의 아이덴티티를 밝히기 위한 노력으로, 본 명세서에서 본 발명자들은 인간의 미경험 NK 세포 및 생체외 확장된 NK 세포 둘 다에서 IL-21 자극에 대한 STAT3-결합 부위의 최조의 게놈-전체 맵을 보고한다. ChIP-seq는 생체내에서 전사 인자에 의해 제어되는 유전자를 위치시키는 가장 강력하고 직접적인 수단이며, 더 양호한 커버리지, 더 높은 분해능 및 더 적은 노이즈를 제공한다. 대부분의 STAT3-결합 부위는 유전자 본체 또는 인접 영역에 우선적으로 위치하며, STAT3 결합은 통상적으로 진화적으로 보존된 게놈 영역에서 일어난다. 본 발명자들은 IL-21 자극에 대해 확장된 NK 세포에서 특이적으로 3,501개의 고품질 STAT3 결합 부위를 식별하였으며, 792개는 미경험 세포에서도 식별되었고, 1322개 결합 영역은 둘 다 유사하였는데, 이는 인산화된 STAT3가 확장 동안 매우 특이적인 전사 반응을 발휘한다는 것을 나타낸다. 또한, GREAT 분석은 세포 성장 및 면역 기능(예를 들어, "인터류킨 신호전달", "JAK-STAT 신호전달 경로", NK 세포 매개 세포독성, 사이토카인 신호전달 및 아폽토시스)에서 STAT3-결합 부위의 관련성에 대한 강력한 증거를 제공하였다. 이러한 관찰은, STAT3가 NK 세포에서 면역-활성화 역할을 하고, STAT3 인산화가 NK 세포 증식 및 세포독성을 조절한다는 이전 보고서를 뒷받침한다.
다수의 시험을 위해 수정한 후, 다양한 기능적 역할을 나타내는 6,464개의 유전자가 확장된 NK 세포와 미경험 NK 세포 사이에서 유의미한 차별적인 발현을 나타내었다. 예를 들어, 확장된 NK 세포에서 가장 많이 발현되는 유전자 중 하나는 BIRC5(서바이빈(Survivin))인데, 이는 아폽토시스 세포 사멸을 예방하는 음성 조절 단백질을 암호화하는 아폽토시스(IAP) 유전자 패밀리의 저해제의 구성원이다. 흥미롭게도, BIRC5는 NK 세포의 발달에 필수적이며, NK 세포 집단에서 BIRC5의 높은 발현은 골수에서 관찰되었으며, 선천성 림프구 발달에서 BIRC5에 대한 비-중복 역할과 일치하였다. BIRC5 유전자의 세포-특이적 결실이 있는 마우스에서, NK 세포의 정상-상태 집단이 심각하게 감소되었다. 이러한 발견은 NK 세포의 증식 및 성숙에서 BIRC5의 중요한 역할을 강조하고, 뒷받침한다. 또한, MKI67(Ki-67), TOP2A, CKS2 및 RACGAP1을 포함한 세포 생존 및 증식을 위한 여러 프로모터는 IL-21에 의해 상향조절되는 반면, 항증식성 또는 프로아폽토시스(proapoptotic) 단백질, 예컨대, PTCH1, TGFB3 및 ATM은 하향조절되었다. 따라서, 유전자 발현 시그니처는 사이토카인 자극 후 NK 세포의 개선된 기능적 활성과 일치한다.
전체-게놈 프로파일링 접근법의 조합은 미경험 NK 세포와 확장된 NK 세포 사이에서 발현이 상이한 모든 유전자의 거의 20% 근처에서 차등적인 STAT3 결합 부위를 나타내는데, 이는 STAT3가 확장된 NK 세포 하위유형에 의해서 나타내는 강력한 성장 및 세포독성의 조절인자임을 나타낸다. STAT3 결합 및 발현 결과는 STAT3가 NK 세포에서 성장 및 성숙을 촉진하기 위해 생물학적 경로를 조절하는 가능한 모델을 나타낸다. 증가된 주변 STAT3 결합으로 인해서 확장된 NK 세포에서 상향조절된 유전자의 온톨로지 분석은 STAT3가 세포 증식, 더 높은 해당 대사, 분열 및 면역 반응을 촉진한다는 것을 나타낸다(도 5A). 또한, 경로 파트너 및 상류 신호전달 분자를 상향조절하고, 집락 자극 인자 경로와의 크로스-토크(cross-talk)를 촉진함으로써 IFNγ의 계속적인 높은 발현을 보장한다(도 6). 가장 중요하게는, STAT3는 아폽토시스 내성의 다수의 기전을 강력하게 상향조절한다. 이러한 효과는 상승작용하여, 생체외 확장 동안 증가된 세포 증식 및 NK 세포의 활성화로 이어질 가능성이 있다.
NK 세포 확장의 유전학, 후성유전학, 전사체 및 프로테옴에 대한 이러한 새로운 통찰력 및 인간 NK 세포에 대한 IL-21의 영향의 이해는 입양 NK-세포 요법에서 생체외 확장된 NK 세포의 구현을 강화한다. 또한, 이러한 결과는 치료-내성 악성종양에 대해서, 예를 들어, CAR 또는 다른 변형을 사용하여 보다 효과적인 변형된 NK 세포를 생성하기 위한 상당한 수의 타당한 표적 분자를 식별하는 데이터를 제공한다.
2. 실시예 2 차등적으로 조절되는 유전자는 후성적으로 조절되거나 후성적 조절인자이다.
본 발명자들은 RNAseq 미경험-대-확장된 비교로부터 상위 200개의 차등적으로-발현되는 유전자를 취한 다음, ATACseq 미경험-대-확장된 비교에서 차등적으로-발현되는 유전자의 별도 목록에서 그러한 유전자를 검색하였다. RNAseq 유전자 중 38개가 또한 ATACseq 목록에 존재하였다. 따라서, 확장된 NK 세포에서 차등적으로-발현되는 유전자의 19%가 후성적 변화에 의해서 영향을 받는다.
그런 다음, 본 발명자들은 ATACseq로부터의 log2 배수 변화와 함께 RNAseq의 DESeqScore를 플로팅하여, 염색질 및 유전자 발현의 개방과 직접적인 상관관계가 있는지 확인하였다. 38개 유전자 중 3개를 제외한 모든 유전자는 높은 통계적 유의성과 함께 예상된 방향으로 상관되었다(도 7). 따라서 염색질 접근성의 후성 유전적 조절은 확장된 NK 세포에서 유전자 발현의 조절과 높은 상관관계가 있다.
상위 200개의 차등적으로-발현되는 유전자 중에서, 이들 중 27개는 히스톤이고, 이들 중 1개만 상기에 기재된 나머지 38개 유전자이다. 이것은 확장된 NK 세포에서 상위 200개의 차등적으로-조절되는 유전자 중 1/3(65)이 후성적 조절인자이거나 후성적으로 조절된다는 것을 의미한다. 이러한 유전자는 다음과 같다: HIST1H1B, HIST1H2AB, HIST1H2AG, HIST1H2AH, HIST1H2AI, HIST1H2AJ, HIST1H2AL, HIST1H2BB, HIST1H2BE, HIST1H2BH, HIST1H2BJ, HIST1H2BL, HIST1H2BM, HIST1H2BO, HIST1H3B, HIST1H3C, HIST1H3F, HIST1H3G, HIST1H3H, HIST1H3J, HIST1H4A, HIST1H4D, HIST1H4L, HIST2H3C, HIST2H4B, HIST3H2BA, HIST3H2BB, ABCA1, AK5, ASCL2, B3GAT1, CACNA2D2, CCR5, CXCR2, ENPP5, FBLN2, FCRL3, GNAL, GPRASP1, GRIK4, GTSE1, HIST3H2BB, IL1B, ITGA2, KIF13A, KIF4A, LINC00599, LONRF3, LRRN3, MSC-AS1, NFIX, NUAK1, NUAK2, PCDH1, PLXNA4, RAD51, RNF157, SLC1A7, SPON2, TYMS, WWC2, ZNF442, ZNF727 및 ZSCAN18.
E. 참고문헌
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004

Claims (20)

  1. 변형된 STAT3 전사체를 포함하는, 확장된, 변형된 자연 살해 세포.
  2. 제1항에 있어서, 1종 이상의 차등적으로 발현되는 유전자를 포함하되, 차등적으로 발현되는 유전자는 미경험 자연 살해 세포에서의 유전자의 발현에 비해서 적어도 약 50% 증가되거나 감소된 발현을 갖는, 확장된, 변형된 자연 살해 세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 STAT3 전사체는 텔로미어 조직(telomere organization)에 관여된 1종 이상의 차등적으로 발현되는 유전자를 포함하는, 확장된, 변형된 자연 살해 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 STAT3 전사체는 유사분열의 조절에 관여된 차등적으로 발현되는 유전자를 포함하는, 확장된, 변형된 자연 살해 세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 STAT3 전사체는 DNA 수선에 관여된 차등적으로 발현되는 유전자를 포함하는, 확장된, 변형된 자연 살해 세포.
  6. 제1항에 있어서, 상기 STAT3 전사체는 면역에 관여된 차등적으로 발현되는 유전자를 포함하는, 확장된, 변형된 자연 살해 세포.
  7. 제1항에 있어서, 상기 STAT3 전사체는 사이토카인 신호전달에 관여된 차등적으로 발현되는 유전자를 포함하는, 확장된, 변형된 자연 살해 세포.
  8. 제1항에 있어서, 상기 STAT3 전사체는 해당과정(glycolysis)에 관여된 차등적으로 발현되는 유전자를 포함하는, 확장된, 변형된 자연 살해 세포.
  9. 제1항에 있어서, 상기 STAT3 전사체는 포도당신생합성(gluconeogenesis)에 관여된 차등적으로 발현되는 유전자를 포함하는, 확장된, 변형된 자연 살해 세포.
  10. 제1항에 있어서, 상기 STAT3 전사체는 p53 경로에 관여된 차등적으로 발현되는 유전자를 포함하는, 확장된, 변형된 자연 살해 세포.
  11. 제1항에 있어서, 상기 STAT3 전사체는 도 3 또는 도 4에 도시된 바와 같은 1종 이상의 차등적으로 발현되는 유전자를 포함하는, 확장된, 변형된 자연 살해 세포.
  12. 제1항에 있어서, 상기 STAT3 전사체는 HIST1H1B, HIST1H2AB, HIST1H2AG, HIST1H2AH, HIST1H2AI, HIST1H2AJ, HIST1H2AL, HIST1H2BB, HIST1H2BE, HIST1H2BH, HIST1H2BJ, HIST1H2BL, HIST1H2BM, HIST1H2BO, HIST1H3B, HIST1H3C, HIST1H3F, HIST1H3G, HIST1H3H, HIST1H3J, HIST1H4A, HIST1H4D, HIST1H4L, HIST2H3C, HIST2H4B, HIST3H2BA, HIST3H2BB, ABCA1, AK5, ASCL2, B3GAT1, CACNA2D2, CCR5, CXCR2, ENPP5, FBLN2, FCRL3, GNAL, GPRASP1, GRIK4, GTSE1, HIST3H2BB, IL1B, ITGA2, KIF13A, KIF4A, LINC00599, LONRF3, LRRN3, MSC-AS1, NFIX, NUAK1, NUAK2, PCDH1, PLXNA4, RAD51, RNF157, SLC1A7, SPON2, TYMS, WWC2, ZNF442, ZNF727 또는 ZSCAN18을 포함하는 차등적으로 발현되는 1종 이상의 유전자를 포함하는, 확장된, 변형된 자연 살해 세포.
  13. 제1항에 있어서, 상기 자연 살해 세포는 BIRCS, MK167, TOP2A, CKS2 및 RACGAPl로 이루어진 군으로부터 선택된 상향조절된 1종 이상의 단백질을 포함하는, 확장된, 변형된 자연 살해 세포.
  14. 제1항에 있어서, 상기 자연 살해 세포는 PTCHl, TGFB3 및 ATM으로 이루어진 군으로부터 선택된 하향조절된 1종 이상의 단백질을 포함하는, 확장된, 변형된 자연 살해 세포.
  15. 제1항에 있어서, 상기 세포는 상기 NK 세포를 막 결합된 IL-21, IL-15 및/또는 4-BBL을 발현하도록 조작된 원형질막 소포, 엑소좀 또는 피더 세포(feeder cell)와 접촉시킴으로써 생체외에서 확장되는, 확장된, 변형된 자연 살해 세포.
  16. 제1항에 있어서, 상기 세포는 상기 NK 세포를 IL-21, IL-15 및/또는 4-BBL와 접촉시킴으로써 생체외에서 확장되는, 확장된, 변형된 자연 살해 세포.
  17. 제1항에 있어서, 상기 세포는 상기 NK 세포를 막 결합된 IL-21, IL-15 및/또는 4-BBL을 발현하도록 조작된 원형질막 소포, 엑소좀 또는 피더 세포와 접촉시킴으로써 생체내에서 확장되는, 확장된, 변형된 자연 살해 세포.
  18. 제1항에 있어서, 상기 세포는 상기 NK 세포를 IL-21, IL-15 및/또는 4-BBL와 접촉시킴으로써 생체내에서 확장되는, 확장된, 변형된 자연 살해 세포.
  19. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 확장된, 변형된 자연 살해 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  20. 대상체의 면역 체계를 조절하는 방법으로서, 유효량의 활성화된 STAT3 전사체를 포함하는 확장된, 변형된 자연 살해 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 면역 체계를 조절하는 방법.
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