KR20210148182A - 클로스트리디움 디피실레 감염 및 재발성 감염 관리를 위한 조작된 디스바이오시스-센싱 프로바이오틱 - Google Patents

클로스트리디움 디피실레 감염 및 재발성 감염 관리를 위한 조작된 디스바이오시스-센싱 프로바이오틱 Download PDF

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매튜 욱 장
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내셔널 유니버시티 오브 싱가포르
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Abstract

본 발명은 인간 위장관 내에서 씨. 디피실레 내생포자의 발아 및 콜로니화를 억제하기 위한 담즙염 가수분해효소를 생산하기 위한 박테리아 세포의 대사 공학 방법에 관한 것이다. 담즙염 가수분해효소는 시알산-유도성 프로모터인 pNanA에 작동 가능하게 연결되며, 이 중 pNanA가 결국 nanR의 억제인자에 의해 제어된다. 담즙염 가수분해효소를 발현하는 재조합 박테리아가 씨. 디피실레 감염의 예방 또는 치료에 사용되는 프로바이오틱 균주일 수 있다.

Description

클로스트리디움 디피실레 감염 및 재발성 감염 관리를 위한 조작된 디스바이오시스-센싱 프로바이오틱
본 발명은 인간 위장관 내에서 씨. 디피실레(C. difficile) 내생포자의 발아 및 콜로니화(colonisation)를 억제하기 위한 담즙염 가수분해효소(bile salt hydrolase)를 생산하기 위한 세포의 대사 공학 방법, 프로바이오틱(probiotic), 및 씨. 디피실레 감염의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
클로스트리디움 디피실레 (클로스트리디오이데스 디피실레(Clostridioides difficile)라고도 분류됨)는 씨. 디피실레 감염 (CDI) 및 재발성(recurring) CDI (rCDI)를 유발하는 원인이 되는 병원체이다. CDI는 전 세계적으로 흔한 병원-획득 감염 중 하나이다. 그러나, CDI의 치료는 항생제 치료를 회피하는 박테리아 내생포자의 형성으로 인해 어렵다. CDI의 재발은 환자의 20.9%에서 발생하며 이들 감염으로 인한 사망률은 9.3%이다. 고유(native) 마이크로바이옴(microbiome), 또는 디스바이오시스(dysbiosis)의 붕괴에 따른 휴면 내생포자의 발아는 감염뿐만 아니라 재발을 야기하는 것으로 상정된다 (도 1). 내생포자의 발아는 주로 인간의 위장관에서 담즙염 타우로콜레이트에 의해 촉진된다. 인간의 위장관에서 마이크로바이옴의 디스바이오시스는 유리 타우로콜레이트의 양을 증가시키고 내생포자의 발아를 촉진하는 것으로 상정된다.
분변 미생물군 이식(Fecal microbiota transplantation) (FMT)은 CDI에 대한 실험적 치료법이다. FMT에서, 건강한 공여자로부터 추출한 액체 분변 현탁액을 CDI를 앓고 있는 환자에게 주입한다. 이는 위장관에서의 미생물 균형을 회복시키는 것을 목표로 한다. 질환의 예후가 일반적으로 개선되지만, 치료의 적응은 제한적이다. 이는 부분적으로는 분변물 사용에 대한 안전 문제 때문이다. 더욱이, 이 전략은 감염을 억제하는 데 필요한 마이크로바이옴의 구체적 종을 식별하지 않는 블랙 박스 공학(black box engineering)의 한 형태이다. 예후 개선의 이면에 있는 메커니즘은 붕괴된 마이크로바이옴의 대량의(bulk) 대체로 가정되는 것은 별문제로 하고 주로 공지되어 있지 않다.
본 발명은 인간 위장관 내에서 씨. 디피실레 내생포자의 발아를 억제할 수 있는 조작된(engineered) 프로바이오틱 균주의 형태를 취한다. 프로바이오틱은 씨. 디피실레 내생포자 발아제(germinant) 타우로콜레이트를 콜레이트로 탈접합시키는 담즙염 가수분해효소를 발현한다. 타우로콜레이트와는 대조적으로, 콜레이트는 더 낮은 내생포자 발아 효율을 갖는다. 더욱이, 콜레이트는 영양형(vegetative) 씨. 디피실레에 대한 성장 억제를 나타낸다. 이들은 내생포자 발아를 억제할 뿐만 아니라 씨. 디피실레 증식 및 콜로니화의 시작을 지체시킨다 (도 2). 이 지연 동안 마이크포바이옴의 회복은 CDI 및 rCDI를 예방할 수 있다. 프로바이오틱은 마이크로바이옴의 디스바이오시스에 반응하도록 추가로 증가된다. 디스바이오시스는 위장관에서 상승된 유리 시알산 수준의 원인이 되는 것으로 보고되었다. 담즙염 가수분해효소의 발현은 시알산-반응성 요소의 제어 하에 놓인다. 이는 마이크로바이옴의 변화시 담즙염 가수분해효소의 적시 발현을 가능하게 한다. 게다가, 프로바이오틱 전달 섀시(chassis)를 통한 효소의 발현은 인간의 위장관 내에서 콜로니화를 통해 장기적이고 강력한 발현을 가능하게 한다. 본 발명은 미처리 대조군과 비교하여 시험관내에서 씨. 디피실레의 발아를 97.8% 억제하는 것으로 나타났다.
본 발명은 임상적으로 관련이 있다. 이는 CDI 및 rCDI에 대한 예방적 필요성을 해결한다. 두 군의 환자가 본 발명으로부터 특히 이익을 얻을 것이다. 현재 병원에서 항생제 요법을 받고 있는 환자와 같이 CDI의 위험에 처한 환자는 본 발명이 CDI 발병에 대한 예방으로서 도움이 될 것이라는 것을 알 것이다. 이는 또한 rCDI에 대한 예방으로서 현재 CDI 환자에게 투여할 수 있다.
첫 번째 측면에서, 본 발명은
i) 담즙염 가수분해효소 유전자(bile salt hydrolase gene), 및
ii) 상기 담즙염 가수분해효소 유전자에 작동 가능하게 연결된 시알산-반응성 프로모터(sialic acid-responsive promoter)
를 포함하는 발현 카세트(expression cassette)에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 담즙염 가수분해효소 유전자는, 바람직하게는 서열번호: 13 또는 그의 기능적 변이체에 제시된 아미노산 서열을 암호화(encoding)하는, 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens)로부터의 Cbh 단백질-암호화 폴리뉴클레오티드 서열이다.
일부 실시양태에서, 담즙염 가수분해효소 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 8 또는 서열번호: 9에 제시된 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 서열 동일성 또는 100% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
유전자 코드(genetic code)의 중복성으로 인해 폴리뉴클레오티드 서열이 100% 미만의 동일성을 가질 수 있고 여전히 동일한 아미노산 서열, 예컨대 서열번호: 13에 제시된 담즙산 가수분해효소의 아미노산 서열을 암호화할 수 있음이 이해될 것이다.
일부 실시양태에서, 시알산-반응성 프로모터는, 바람직하게는 서열번호: 4 또는 그의 기능적 변이체에 제시된 핵산 서열을 포함하는 이.콜라이(E.coli)로부터의 pNanA이다.
일부 실시양태에서, pNanA의 억제인자(repressor)는 시알산의 부재 하에 pNanA의 발현이 있을 때 pNanA의 상류에 위치하며, 여기서 바람직하게는 억제인자는, 바람직하게는 서열번호: 11 또는 그의 기능적 변이체에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는, NanR 단백질-암호화 폴리뉴클레오티드 서열이다.
일부 실시양태에서, NanR 단백질-암호화 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 5에 제시된 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 서열 동일성 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 카세트는 NanR에 작동 가능하게 연결된 구성적 프로모터를 추가로 포함하고, 여기서 프로모터는 AraC와 함께 pBad; rbs2, rbs3 또는 rbs5와 함께 J23108; 및 rbs4와 함께 J23113을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, NanR에 작동 가능하게 연결된 구성적 프로모터는 J23113-rbs4이다.
일부 실시양태에서, 카세트는, 바람직하게는 서열번호: 6 또는 그의 기능적 변이체에 제시된 핵산 서열을 포함하는, J23113-rbs4-NanR을 포함한다.
일부 실시양태에서, 카세트는 Cbh의 발현을 증가시키기 위한 활성인자(activator) 및 프로모터, 예컨대 전사 활성인자 CadC 단백질-암호화 서열 및 프로모터 pCadBA를 추가로 포함하고, 여기서 CadC는 pNanA의 하류에 그리고 제어 하에 위치하고 pCadBA는 CadC의 하류에 위치하고 담즙염 가수분해효소 Cbh 단백질-암호화 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다.
일부 실시양태에서, CadC 아미노산 서열은 서열번호: 12 또는 그의 기능적 변이체에 제시된다. 일부 실시양태에서, CadC 핵산 서열은 서열번호: 14 또는 그의 기능적 변이체에 제시된다.
일부 실시양태에서, 활성인자 및 프로모터 핵산 서열은 서열번호: 7 또는 그의 기능적 변이체에 제시된 핵산 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 카세트는 하나 이상의 플라스미드 벡터(vector)에 포함된다.
일부 실시양태에서, 플라스미드 벡터는, 바람직하게는 서열번호: 1에 제시된 핵산 서열을 포함하는 pEaat이다. 이 벡터는 복제 기점, alr 선택 마커 (서열번호: 2 및 3), 카나마이신 내성 마커, 및 여러 복제 부위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 카세트는 그의 제거를 가능하게 하기 위해 FRT 부위에 의해 플랭킹된 항생제 내성 유전자를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, cbh에 대한 유전자 폴리뉴클레오티드 서열은 프로바이오틱 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화(codon-optimised)된다. cbh에 대한 코돈-최적화된 유전자 서열의 예는 서열번호: 9에 제시된 핵산 서열이다.
일부 실시양태에서, cbh에 대한 유전자 폴리뉴클레오티드 서열은 이. 콜라이 종(E. coli sp.), 박테로이데스 종 (Bacteroides sp.), 클로스트리디움 종(Clostridium sp.), 파에칼리박테리움 종(Faecalibacterium sp.), 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis), 및 락토바실러스 종(Lactocbacillus sp.)을 포함하는 군으로부터 선택된 프로바이오틱 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다
본 발명의 또 다른 측면에서, 담즙염 가수분해효소 단백질의 재조합 생산을 위한 본 발명의 임의의 측면에 따른 발현 카세트의 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에서,
a) 프로바이오틱 박테리아; 및
b) 본 발명의 임의의 측면에 따른 발현 카세트
를 포함하는 조성물이며,
여기서 프로바이오틱 박테리아는 담즙염 가수분해효소의 생산을 위한 발현 카세트를 포함하는 것인 조성물을 제공한다.
프로바이오틱 박테리아는 프로바이오틱 박테리아의 임의의 적합한 속으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로바이오틱 박테리아는 이. 콜라이 종, 박테로이데스 종, 클로스트리디움 종, 파에칼리박테리움 종, 락토코커스 락티스, 및 락토바실러스 종을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 프로바이오틱 박테리아는 영양요구성(auxotrophic)이다.
일부 실시양태에서, 영양요구성 박테리아는 알라닌 라세마제 유전자가 결실되어 D-알라닌의 부재 하에 분열할 수 없다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 씨. 디피실레 감염 (CDI) 및/또는 재발성 CDI (rCDI)를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 임의의 측면에 따른 조성물이 제공된다.
일부 실시양태에서, CDI 및/또는 rCDI는 디스바이오시스에 기인한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 유효량의 본 발명의 임의의 측면에 따른 조성물을 이러한 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하는 것을 포함하는 치료 또는 예방 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 씨. 디피실레 감염 (CDI) 또는 재발성 CDI를 갖는다.
본 발명의 또 다른 측면에서, CDI 및/또는 rCDI의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 임의의 측면에 따른 조성물이 제공된다.
일부 실시양태에서, 씨. 디피실레 감염 (CDI) 및/또는 재발성 CDI는 디스바이오시스 때문이다.
도 1은 씨. 디피실레의 디스바이오시스-유도 감염 및 재발하는 감염의 개략도를 나타낸다. 1) 환경으로부터 획득한 씨. 디피실레 (CD) 내생포자는 마이크로바이옴의 휴면 구성원으로서 존재할 수 있다. 2) 정상적인 마이크로바이옴의 붕괴는 씨. 디피실레 콜로니화를 위한 생태학적 지위(niche)를 생성한다. 3) 내생포자는 영양 세포로 발아하고 마이크로바이옴 내의 생태학적 지위로 더 확장되어 숙주의 감염을 야기한다. 4) 감염의 후기 단계에서, 영양 세포에 의해 추가적인 내생포자가 생성될 것이다. 5) 이들 내생포자는 항생제 치료를 회피할 수 있다. 마이크로바이옴의 지속성 디스바이오시스는 일단 치료가 중단되면 내생포자가 발아할 수 있으므로 재발하는 감염에 대한 취약성의 창을 제공한다. 6) 감염으로부터의 회복에도, 내생포자는 여전히 지속되어 디스바이오시스가 발생하면 감염을 촉발할 수 있다.
도 2는 씨. 디피실레 내생포자의 억제를 달성하기 위해 본 발명에 의해 사용된 전략의 개략도를 나타낸다. 마이크로바이옴의 디스바이오시스는 위장관의 대사산물 프로파일을 변화시킨다. 이는 상승된 수준의 유리 시알산을 포함한다. 조작된 프로바이오틱스는 시알산에 의해 활성화되어 담즙염 가수분해효소를 발현한다. 효소는 씨. 디피실레 내생포자 발아제 타우로콜레이트를 더 약한 발아제 콜레이트로 탈접합시킬 수 있다. 따라서 씨. 디피실레 내생포자 발아의 억제가 달성되고, 씨. 디피실레의 무병독성(avirulent)으로부터 병독성(virulent) 형태로의 전이가 방지된다.
도 3은 디스바이오시스-유도 씨. 디피실레 감염의 메커니즘에 대한 제안된 모델을 나타낸다. 마이크로바이옴 (최상부)에 있는 두 군의 미생물은 디스바이오시스 (기저부)의 경우에 붕괴된다. i) 첫 번째 군은 소장 (SI)으로부터 담즙염의 탈접합을 매개한다. 디스바이오시스 동안에 이 미생물 군의 소실은 씨. 디피실레 (CD) 내생포자가 있는 결장에서 접합된 담즙염을 결과한다. 접합된 담즙염은 내성포자의 영양형 씨. 디피실레로의 발아를 촉발한다. ii) 시알산 활용 종 및 시알리다제-발현 종으로 구성된 두 번째 군은 위장관내 유리 시알산 수준을 조절한다. 디스바이오시스 동안 종의 균형의 혼란상태(upset)는 시알산의 상승을 결과한다. 발아된 씨. 디피실레는 숙주 감염을 야기하는 그의 확장을 위한 탄소 공급원으로 시알산을 활용할 수 있다.
도 4는 접합된 담즙염 타우로콜레이트가 씨. 디피실레 내생포자의 보다 효율적인 발아제이고 탈접합된 담즙염 콜레이트가 씨. 디피실레의 성장을 억제한다는 것을 나타낸다. A) 접합된 담즙염 타우로콜레이트는 담즙염 가수분해효소에 의해 1차 담즙염 콜레이트 및 타우린으로 탈접합된다. B) 상이한 농도의 타우로콜레이트 (채워진 원) 및 콜레이트 (빈 원)를 사용한 인큐베이션(incubation)에 의한 씨. 디피실레 균주 i) CD630, ii) VPI10463, iii) BAA-1870, 및 iv) 9689로부터 추출한 내생포자로부터의 발아. 오차 막대는 이중실험(duplicate)의 S.E.M을 나타낸다. C) 타우로콜레이트 (채워진 원) 및 콜레이트 (빈 원)를 사용한 씨. 디피실레 균주 i) CD630, ii) VPI10463, iii) BAA-1870, 및 iv) 9689의 성장.
도 5는 항생제 선택이 없는 프로바이오틱 섀시의 공학 계획을 나타낸다. A) D-알라닌 영양요구성 항생제 선택이 없는 섀시의 개략도. 알라닌 라세마제 유전자에 대한 붕괴는 내인성으로 D-알라닌을 생산의 불능을 결과한다. D-알라닌의 결핍은 세포벽 합성 및 세포 증식을 억제한다. 이 표현형은 플라스미드로부터 알라닌 라세마제의 발현에 의해 구제될 수 있다. 이는 플라스미드에 대한 선택, 및 그것과 함께 합성 유전적 회로를 가능하게 한다. B) pEaat 벡터에 대한 플라스미드 지도 (서열번호: 1). alr(서열번호: 3)은 고유 프로모터 (서열번호: 2)의 제어 하에 알라닌 라세마제 (서열번호: 10)를 암호화하고; NeoR은 항생제 내성 유전자 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 암호화한다. 이는 Flp를 통한 절제를 위해 한 쌍의 FRT 서열에 의해 플랭킹되며; 복제 기점 CoIE1에 대해 암호화된 ori; 9개의 특유의 제한 부위가 의도적으로 추가되었다. 1차 삽입 부위는 BglBrick 표준에 따라 BglII와 BamHI 사이이다. C) D-알라닌 보충제를 사용하지 않거나 (빈 사각형) 또는 사용한 (빈 원) ECN의 성장 검정, 및 pEaat 플라스미드 (회색 원)를 사용한 표현형 구제. 대조군으로서 포함된 야생형 EcN (흑색 원). D) D-알라닌 보충제를 사용하고 (채워진) 또는 사용하지 않은 (빈칸), pBbE8K-J23108-lasR-pLas-gfp (정사각형)를 발현하는 EcN WT의 플라스미드 또는 pEaat-J23108-lasR-pLas-gfp (삼각형)를 발현하는 EcN의 플라스미드 상에서 공동-발현되는 neoR 플라스미드를 발현하는 생존 세포의 백분율. 세포를 항생제 선택 없이 매일 계대배양하였다. 세포의 생존력은 플라스미드의 존재를 나타낸다.
도 6은 NanR-의존성 시알산 유도성 프로모터의 최적화를 나타낸다. A) pNanA의 초기 특성화를 위한 플라스미드 설계도 (pEaat-pNanA-gfp). SA는 시알산 유도를 나타낸다. B) 다양한 농도의 시알산 유도에서 T10 (좌측) 및 EcN (우측)에서 pEaat-pNanA-gfp 특성화를 위한 10,000개 샘플의 유세포 분석 형광 판독의 히스토그램. C) NanR (서열번호: 11) 및 pNanA (pSC101-pBad-nanR)의 특성화를 위한 공동-발현된 플라스미드의 플라스미드 설계도. LA는 L-아라비노스 유도를 나타내고; SA는 시알산 유도를 나타낸다. D) 시알산 (SA) 및 L-아라비노스 (LA) 유도의 각각의 조합에 대한 유세포 분석에서 10,000개 샘플의 중앙값 GFP 형광 판독의 매트릭스 데이터. 각각의 셀의 색상은 스케일에 따라 등급이 매겨진다. E) pEaat-pNanA-gfp에서 nanR의 공동-발현을 위한 플라스미드 설계도. F) nanR 발현을 조정함으로써 pNanA 발현의 최적화. 상이한 프로모터 및 리보솜 결합 부위 하에 nanR을 발현하는 작제물(construct)의 상대적인 GFP 형광 발현. 세포를 0.2% 시알산으로 유도하였다.
도 7은 위장-특이적 조건 하에 조작된 시알산 바이오센서의 특성을 나타낸다. A) 시알산 유도성 작제물 (pEaat-J2113r4-nanR-pNanA-gfp) 및 B) 시알산 억제성(repressible) 작제물 (pEaat-pNanA-gfp)의 시알산 및 글루코스 조합에 의한 유도에 대한 반응. 논리 게이트 다이어그램은 입력으로서 시알산 및 글루코스에 대한 반응을 도시한다. C) 시알산 유도성-증폭기 작제물 (pEaat-J2113r4-nanR-pNanA-cadC-pCadBA-gfp)의 플라스미드 설계도. D) LB 및 E) 글리세롤을 가진 M9 최소 배지에서 시알산 유도성 작제물 및 시알산 유도성-증폭기 작제물의 특성화. 유도 3시간 및 6시간 후의 상대적 형광 발현이 표시된다. F) 상이한 pH 하에 시알산 유도성-증폭기 작제물의 특성화. 유도 3시간 후의 상대적 형광 발현이 표시된다. G) 탄소 공급원이 없는 M9 최소 배지에서 시알산 유무에 따른 EcN의 성장.
도 8은 정제된 Cbh-his6이 타우로콜레이트를 콜레이트로 탈접합시키고 씨. 디피실레 내생포자 발아를 억제함을 나타낸다. A) IMAC 및 크기 배제 크로마토그래피 후 정제된 Cbh-his6의 12% SDS-PAGE 해상도. Cbh-his6의 예상 크기는 38 kDa이다. L은 단백질 래더(ladder)를 나타낸다. HPLC 분석으로부터의 B) 타우로콜레이트 및 C) 콜레이트 농도에 대한 스펙트럼 영역의 표준 곡선. D) 10 μM 정제 Cbh-his6의 3시간 처리 유무에 따른 타우로콜레이트 및 콜레이트의 농도. 스튜던트 t-검정(스튜던트 t-검정)은 처리와 미처리 사이의 타우로콜레이트 농도에 대해 수행하였다. * P < 0.005. 체류 시간 각각 12.2분 및 19.6분에서 각각 E) 타우로콜레이트 및 F) 콜레이트의 용리에 상응하는 피크의 HPLC 스펙트럼. G) 씨. 디피실레의 CFU 계수(enumeration)에 기초한 Cbh-his6 처리 후 담즙염의 발아 효율. 타우로콜레이트가 없는 음성 대조군 및 효소가 없는 양성 대조군을 수행하였다. 스튜던트 t-검정은 처리와 양성 대조군 사이에 수행하였다. * P < 0.05. 오차 막대는 이중실험의 S.E.M을 나타낸다.
도 9는 프로바이오틱스에서의 Cbh 발현이 씨. 디피실레 내생포자의 발아를 억제함을 나타낸다. A) 씨. 디피실레의 CFU 계수에 기초한 Cbh-발현 EcN 처리 후 담즙염의 발아 효율. 증폭기 모듈(증폭기 module)이 하나는 없고 (pNanA; 빈 컬럼) 다른 하나는 있는 (pNanA-cadC-pCadBA; 채워진 컬럼), 두 세트의 작제물을 사용하였다. 각각의 실험 세트는 gfp 발현 대조군, 비-유도 대조군, 및 무-타우로콜레이트 음성 대조군으로 수행하였다. 무세포 양성 대조군 (회색 컬럼)도 수행하였다. 일원 ANOVA 및 스튜던트 t-검정은 증폭기 작제물 상에서 수행하였다. * P < 0.005. 오차 막대는 이중실험의 S.E.M을 나타낸다. B) EcN과 상이한 프로모터 하에 발현된 Cbh-his6의 면역블롯. pBad 작제물 (pEaat-araC-pBad)은 0.2% L-아라비노스, pNanA (pEaat-J23113r4-nanR-pNanA) 및 pNanA-cadC-pCadBA 증폭기 (pEaat-J23113r4-nanR-pNanA-cadC-pCadBA) 작제물은 0.2% 시알산에 의해 유도되었다. 세포 밀도는 단백질 추출 전에 OD600에 의해 조정하였다. L은 단백질 래더를 나타내고; S는 가용성 분획을 나타내고; IS는 불용성 분획을 나타낸다. Cbh-his6의 예상 크기는 38 kDa이다. C) 증폭기 작제물로부터 Cbh-발현 EcN으로 처리한 후 타우로콜레이트 및 콜레이트의 농도. 무세포 양성 대조군, gfp 발현 대조군, 비-유도 대조군, 및 무-타우로콜레이트 음성 대조군을 수행하였다. 스튜던트 t-검정은 처리와 gfp 발현 대조군 사이에 타우로콜레이트 농도에 대해 수행하였다. * P < 0.001.
도 10은 Cbh-처리된 씨. 디피실레 내생포자가 감소된 외독소 분비를 나타내고 Caco-2 세포의 감염 예후를 개선함을 나타낸다. A) 씨. 디피실레 배양물 발아 각각의 시점에서 수집된 10배 농축된 상청액으로부터 TcdA의 면역블롯. 발아제 타우로콜레이트를 씨. 디피실레 내생포자와 함께 인큐베이션하기 전에 상이한 조건 하에 처리하였다. 좌측부터, 무세포 양성 대조군, gfp 발현 대조군, cbh 발현 처리, 및 무-타우로콜레이트 음성 대조군. L은 단백질 래더를 나타낸다. TcdA의 예상 크기는 308 kDa이다. 각각의 조건, 즉 B) 무세포 양성 대조군, C) gfp 발현 대조군, D) cbh 발현 처리, 및 E) 무-타우로콜레이트 음성 대조군 하에 씨. 디피실레 배양물 발아로부터 수집된 상청액으로 처리된 Caco-2의 상대적 세포 생존력. 상청액을 1배 (채워진), 0.1배 (회색), 및 0.01배 (빈칸)의 최종 농도로 희석하였다. 상대적 세포 생존력은 미처리 Caco-2 대조군에 대해 정규화된 MTT 검정에 의해 제공되었다. 숫자로 나타낸 상대 세포 생존력 데이터는 매트릭스에 표시된다. F) 최종 농도가 1배가 되도록 각각의 상청액으로 24시간 처리한 후 Caco-2 세포의 도립광 현미경검사 사진. tau는 타우로콜레이트를 나타내고; SA는 시알산을 나타낸다.
도 11은 씨. 디피실레에 감염된 뮤린 CDI 모델의 치료에서 Cbh-발현 EcN의 효능을 나타낸다. A) 처리, 프로바이오틱, 및 씨. 디피실레 투여 시점을 나타내는 감염 검정의 실험적 시각표. B) 실험군 및 조작된 프로바이오틱스의 발현 작제물이 제공된 표. 9일에 걸쳐 C) 생존 곡선 및 D) 씨. 디피실레 세포 감염 후 각각의 군의 평균 중량. 게한-브로슬로-윌콕슨 검정(Gehan-Breslow-Wilcoxon test)는 처리군과 대조군 사이에 수행하였다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001. E) 6일에 걸쳐 씨. 디피실레 세포 감염 후 각각의 군 내의 각각의 마우스에 의해 나타난 최대 임상 질환 점수 (CSS). 쌍형성되지 않은 스튜던트 t-검정은 처리군과 대조군 사이에 수행하였다. ** P < 0.01, *** P < 0.001.
정의
명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에 사용된 특정 용어는 편의를 위해 여기에 수집된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아미노산" 또는 "아미노산 서열"은 올리고펩티드, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 서열, 또는 이들 중 임의의 것의 단편, 및 천연 발생 또는 합성 분자를 지칭한다. "아미노산 서열"이 천연 발생 단백질 분자의 아미노산 서열을 지칭하기 위해 본원에 언급되는 경우, "아미노산 서열" 및 유사한 용어는 아미노산 서열을 언급된 단백질 분자와 연관된 완전한 고유 아미노산 서열로 제한하는 것을 의미하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "기능적 변이체" 또는 "변이체"는 하나 이상의 아미노산에 의해 변경되나, 비변이체 참조 서열, 예를 들어 담즙염 가수분해효소와 동일한 기능을 유지하는 아미노산 서열을 지칭한다. 변이체는 "보존적" 변화를 가질 수 있으며, 여기서 치환된 아미노산은 유사한 구조적 또는 화학적 특성(예를 들어, 류신을 이소류신으로 대체)을 갖는다. 더 드물게, 변이체는 "비보존적" 변화를 가질 수 있다 (예를 들어, 글리신을 트립토판으로 대체). 유사한 경미한 변이는 또한 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 생물학적 또는 면역학적 활성을 없애지 않고 아미노산 잔기가 치환, 삽입, 또는 결실될 수 있는 지를 결정하는 데 있어서 지침은 관련 기술분야에 널리 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, DNASTAR® 소프트웨어 (디나스타, 인크.(DNASTAR, Inc.), 미국 위스콘신주 매디슨(Madison))를 사용하여 찾을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는" 또는 "포함한"은 언급된 바와 같이 명시된 특징, 정수, 단계 또는 구성요소의 존재를 특정하는 것으로 해석되어야 하지만, 하나 이상의 특징, 정수, 단계 또는 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 그러나, 본 개시내용의 맥락에서, 용어 "포함하는" 또는 "포함한"은 또한 "~로 이루어진"을 포함한다. "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(comprises)"와 같은 단어 "포함하는(comprising)" 및 "포함한다(include)" 및 "포함한다(includes)"와 같은 "포함한"의 변형은 상응하게 다양한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로바이오틱"은 장관, 요로 또는 질에서 그의 효과를 통해 환자에게 유익한 영향을 미치는 생존 가능한 미생물 보충제를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "예방"은 CDI-관련 질환의 예방과 같이 질환을 예방하기 위해 제공된 치료 또는 취해진 조치를 지칭한다.
본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "치료"는 개선적, 치료적 또는 치유적 치료를 지칭한다.
용어 "대상체"는 본원에서 척추동물, 특히 포유동물, 보다 특히 인간으로서 정의된다. 연구 목적을 위해, 대상체는 특히 적어도 하나의 동물 모델, 예를 들어, 마우스, 래트(rat) 등일 수 있다. 특히, 디스바이오시스, 보다 구체적으로 CDI-관련 질환의 치료 또는 예방을 위해, 대상체는 인간일 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 명세서에서 언급된 참고문헌은 편의상 실시예의 말미에 열거되어 있다. 이러한 참고문헌 목록의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
CDI 및 rCDI의 메커니즘에 대한 일반적인 합의는 마이크포바이옴의 디스바이오시스와 결과로서 휴면 내생포자의 후속 발아를 포함한다 (도 1) [Petrosillo, N. Med. Mal. Infect. 48(1): 18-22 (2018)]. 정상적인 건강한 마이크로바이옴에서 씨. 디피실레는 생태학적 지위 부족으로 인해 감염을 일으키지 않고 인간 위장관에서 공생 휴면 내생포자로 남을 수 있다. 역설적으로, 광범위 항생제의 투여는 CDI를 촉진시키는 위험 인자로 확립되었다 [Petrosillo, N. Med. Mal. Infect. 48(1): 18-22 (2018); Roberts, A. P., & Mullany, P. Clostridium difficile: methods and protocols. Ed: P.Mullany, A. Roberts. Springer US, New York. 3-8 (2010)]. 항생제의 투여는 기존 마이크로바이옴의 균형을 혼란상태가 되게 하고 디스바이오시스를 야기하는 것으로 가정된다 [Gebhart, D., et al. mBio. 6(2): doi: 10.1128/mBio.02368-14 (2015)]. 발아된 휴면 내생포자로부터 또는 환경으로부터 새로 획득한 씨. 디피실레는 이 기회를 이용하여 감염을 야기하는 병독성 부하로 빠르게 확장할 수 있다 [Gebhart, D., et al. mBio. 6(2): doi: 10.1128/mBio.02368-14 (2015); Sorg, J. A., & Soenenshein, A. L. J. Bacteriol. 190(7): 2505-12 (2008)]. 문제를 가중시키는 것은 항생제 치료로부터의 선택 압력으로 인해 발생하는 항생제 내성에 더하여, 씨. 디피실레 내생포자는 항생제에 자연적으로 내성을 갖는다 [Petrosillo, N. Med. Mal. Infect. 48(1): 18-22 (2018); Roberts, A. P., & Mullany, P. Clostridium difficile: methods and protocols. Ed: P.Mullany, A. Roberts. Springer US, New York. 3-8 (2010)]. 이는 내생포자가 박멸 치료를 회피할 수 있게 하며, 마이크로바이옴 항상성이 회복될 때까지 취약성의 창을 따라 재발을 통해 rCDI의 원인으로 의심된다 [Petrosillo, N. Med. Mal. Infect. 48(1): 18-22 (2018)]. 증거는 마이크로바이옴 내에서 씨. 신덴스(C. scindens)와 같은 담즙염 대사 종은 씨. 디피실레에 대한 콜로니화 저항성을 부여하는 것을 시사한다 [Chilton, C. H., Pickering, D. S., & Freeman, J. Clin. Microbiol. Infect. Published ahead of print. doi: 10.1016/j.cmi.2017.11.017 (2018); Buffie, C. G., et al. Nat. Lett. 517: 205-8 (2015)]. 담즙염은 씨. 디피실레의 발아균제로 공지되어 있으며 [Sorg, J. A., & Soenenshein, A. L. J. Bacteriol. 190(7): 2505-12 (2008)] 붕괴된 장내 마이크로바이옴으로 인해 담즙염 대사의 붕괴는 CDI를 야기하는 발아를 결과할 수 있다.
인간에서, 담즙염은 간에서 합성되어 담낭을 통해 소장의 십이지장에서 위장관으로 분비된다 [Sorg, J. A., & Soenenshein, A. L. J. Bacteriol. 190(7): 2505-12 (2008)]. 담즙염은 그의 접합체 및 관능기에 따라 상이한 분자 형태로 존재한다. 인간의 간으로부터 배출된 담즙염은 1차 담즙염으로서 존재하여 타우린 또는 글리신과 접합하여 각각 타우로콜레이트 또는 글리코콜레이트를 형성한다. 타우로콜레이트는 씨. 디피실레의 공지된 발아제이며 박테리아의 실험실 조작에서 내생포자 발아를 유도하는 데 일상적으로 사용된다 [Sorg, J. A., & Soenenshein, A. L. J. Bacteriol. 190(7): 2505-12 (2008)]. 담즙염은 하부 위장관으로 내려가면서 마이크로바이옴에 의해 변형되는 것으로 이해된다 [Ridlon, J. M., Kang, D., & Hylemon, P. B. J. Lipid. Res. 47: 241-59 (2006); Begley, M., Gahan, C. G. M., & Hill, C. FEMS. Microbiol. Rev. 25: 625-51 (2005)]. 특히, 공액 담즙염의 1차 비접합 담즙염으로의 탈접합, 및 1차 담즙염의 2차 담즙염으로의 7α-탈히드록실화. 후자의 반응은 이전에 언급된 씨. 신덴스에 의해 매개될 수 있다 [Ridlon, J. M., & Hylemon, P. B. J. Lipid. Res. 53: 66-76 (2012)]. 더욱이, 2차 담즙염인 데옥시콜레이트는 씨. 디피실레 콜로니화를 억제하는 것으로 나타났다 [Sorg, J. A., & Soenenshein, A. L. J. Bacteriol. 190(7): 2505-12 (2008)]. 이들 변형의 결과로서, 결장의 담즙염은 주로 비접합 1차 또는 2차 형태로서 존재한다 [Sorg, J. A., & Soenenshein, A. L. J. Bacteriol. 190(7): 2505-12 (2008)].
디스바이오시스로 인한 CDI 발병을 야기하는 메커니즘의 모델이 여기에서 제안된다 (도 3). 디스바이오시스로 인한 두 사건이 CDI를 유도하는 것으로 시사된다. 디스바이오시스가 담즙염 변형에 관여하는 마이크로바이옴에서 이들한 종을 붕괴하였다고 가정한다. 이는 하부 위장관에서 담즙염 조성의 조절장애를 결과하였다. 접합된 담즙염, 특히 타우로콜레이트의 증가된 농도는 발아를 위한 방아쇠 작용을 하고 씨. 디피실레 콜로니화를 위한 마이크로바이옴 내의 빈 생태학적 지위를 의미한다. 두 번째 사건은 위장관에서 유리 시알산의 상승을 포함한다. 균주를 활용하는 시알산의 소실 및/또는 시알리다제-발현 균주의 증식을 야기하는 미생물군의 디스바이오시스 붕괴 [Ng, K. M., et al. Nat. Lett. 502: 96-9910 (2013)]. 이것은 위장관 내에 유리 시알산의 상승을 유발한다. 발아된 영양형 씨. 디피실레는 CDI를 야기하는 추가 증식 및 확장을 위해 탄소 공급원으로서 유리 시알산을 활용한다.
여기에서, 우리는 CDI의 예방을 위한 예방적 항균 전략을 발명하고자 하였다. 씨. 디피실레의 발병기전에 대한 이해를 통해, 씨. 디피실레 내생포자의 발아가 감염의 진행을 예방할 수 있는 잠재적 개입점으로서 확인되었다. 감염의 발병 메커니즘은 내생포자의 발아를 조정하기 위해 조작된 프로바이오틱스에 의해 이용될 수 있다.
디스바이오시스-유도 CDI에서 제안된 메커니즘 모델에서, 접합된 담즙염은 씨. 디피실레 내생포자 발아를 위한 구동 발아제인 것으로 가정된다. 마이크로바이옴의 항상성 상태 동안, 접합된 담즙염은 CDI 동안 씨. 디피실레이가 콜로니하는 결장에 도달하기 전에 미생물군에 의해 대사된다. 이것은 디스바이오시스 동안 붕괴된다. 모델에 대한 원리-증명으로서, 접합 및 비접합 담즙염의 발아 효율을 검정하였다. 타우로콜레이트는 효소 담즙염 가수분해효소에 의해 콜레이트와 타우린으로 분해된다 (효소 위원회 번호(Enzyme Commission number): EC3.5.1.24) [Coleman, J. P., & Hudson, L. L. Appl. Environ. Microbiol. 61(7): 2514-20 (1995)] (도 4A). 비접합 담즙염은 타우로콜레이트와 비교하여 유의하게 감소된 발아 효율을 표시하였다 (도 4B). 더 높은 농도의 콜레이트는 기존 보고서와 일치하여 발아를 추가로 억제한다 [Sorg, J. A., & Soenenshein, A. L. J. Bacteriol. 190(7): 2505-12 (2008); Begley, M., et al., FEMS. Microbiol. Rev. 25: 625-51 (2005)]. 더욱이, 콜레이트는 영양형 씨. 디피실레 세포의 성장을 억제하는 것으로 나타났다 (도 4C). 이들 결과는 씨. 디피실레 내생포자의 발아를 방지하고 그의 후속 성장을 억제하기 위한 담즙염 탈접합의 조절이 씨. 디피실레에 대한 실행 가능한 예방적 항균 전략으로서 기능할 수 있음을 시사한다.
우리는 조작된 프로바이오틱 균주 EcN (D-알라닌 영양요구성 에스케리치아 콜라이 니슬(Nissle))을 활용하는 예방적 항균 전략을 구상하여 [Hwang, I, Y., et al., Nat. Commun. 8: 15028. doi: 10.1038/ncomms15028 (2017)] 담즙염 가수분해효소의 생체내 발현을 통해 담즙염 탈접합을 조정한다. 이러한 담즙염 가수분해효소의 발현은 국소 타우로콜레이트 농도를 감소시킬 수 있으며, 이는 결국 씨. 디피실레 내생포자의 발아를 억제한다. 내생포자로부터의 씨. 디피실레 발아의 지연 및 성장 억제는 CDI 또는 rCDI를 야기하는 과도한 확장을 방지할 수 있다. 클로스트리디움 페르프린겐스로부터의 담즙염 가수분해효소, Cbh는 적용을 위해 선택되었다 [Coleman, J. P., & Hudson, L. L. Appl. Environ. Microbiol. 61(7): 2514-20 (1995)]. 효소의 발현은 시알산-반응성 프로모터, pNanA (서열번호: 4)에 커플링된다. 시알산은 마이크로바이옴의 디스바이오시스 동안 상향 조절하는 것으로 나타났다 (10). pNanA를 Cbh 발현에 커플링함으로써, pNanA는 생체내 디스바이오시스 사건에서 Cbh의 발현을 조절할 수 있다. 이 설계 하에, 디스바이오시스 동안 유리 시알산 수준이 상승하는 경우, pNanA가 반응하고 Cbh를 발현할 것이다. 이는 디스바이오시스의 발병에 대한 자율적인 생체내 반응을 가능하게 한다.
EcN은 설계된 전략을 전달하기 위한 섀시로서 활용된다. 그람-음성 박테리아인 EcN은 CDI 치료를 위해 통상적으로 투여되는 그람-양성-표적화 반코마이신에 덜 감수성이다 [Nelson, R. Cochrane. Database. Syst. Rev. 18(3): CD004610 (2007)]. 이는 치료를 위한 항생제와 rCDI를 예방하기 위한 프로바이오틱의 공동 투여를 허용할 것이다. 더욱이, EcN은 대사에 시알산을 활용할 수 있다. 프로바이오틱 균주로서, 그들은 마이크로바이옴의 일부로 콜로니화한다. 따라서, 이들은 위장관 내의 빈 생태학적 지위뿐만 아니라 영양소에 대해 씨. 디피실레와 경쟁할 수 있다. 게다가, EcN의 영양요구성 특성은 항생제 없이 유지될 수 있는 플라스미드의 설계를 가능하게 할 것이다. 균주는 게놈에서 알라닌 라세미 유전자의 결실을 통해 D-알라닌에 대한 영양요구성 표현형을 나타내도록 조작되었다 [Hwang, I, Y., et al., Nat. 통신 8: 15028. doi: 10.1038/ncomms15028 (2017)]. 필수 알라닌 라세마제 유전자는 조작된 회로를 운반하는 플라스미드에서 선택 마커로서 사용된다. 생성된 조작된 균주는 추가 선택 압력 없이 장기간 동안 설계된 플라스미드를 안정적으로 유지할 수 있다. 종합하면, 조작된 EcN은 위장관에서 CDI에 대한 장기적인 예방 효과를 부여할 것이다.
실시예
관련 기술분야에 공지되어 있고 구체적으로 기재되지 않은 표준 분자 생물학 기술을 일반적으로 문헌 [Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (2001)]에 기재된 바와 같이 따랐다.
실시예 1
항생제 선택이 없는 프로바이오틱 섀시의 공학
생체내에서 조작된 프로바이오틱스를 구현하는 데 있어서 도전과제 중 하나는 섀시에서 유전적 회로의 장기적인 안정성을 보장하는 것이다. 조작된 유전적 회로는 통상적으로 플라스미드 상에서 조작되고 항생제 선택에 의해 유지되나, 이러한 기술은 생체내 적용에는 실현 가능하지 않다. 지속적인 항생제 선택에 의한 플라스미드 안정성의 유지는 위장관에서 콜로니화된 프로바이오틱스에 대해 편리하게 구현될 수 없다.
항생제 유지가 필요하지 않은 플라스미드-섀시 시스템을 가능하게 하기 위해, 영양요구성 표현형을 이. 콜라이 니슬 야생형 균주에서 생성하였다. D-알라닌 생합성에 필수적인 알라닌 라세마제 유전자는 이. 콜라이 니슬 게놈으로부터 삭제되어 균주 EcN을 생성하였다 (도 5A). D-알라닌은 박테리아 세포벽의 생합성에 필요하다. D-알라닌의 부재는 박테리아가 추가의 세포 분열을 하지 못하게 하여, 영양요구성 표현형을 생성한다.
플라스미드는 EcN 섀시에서 영양요구성 표현형을 구제하도록 설계되었다 (도 5B). 이 플라스미드는 선택 유전자로 기능하는 알라닌 라세마제의 카피를 함유하였다. 이는 또한 특성화 및 증폭 목적을 위해 카나마이신 내성 유전자를 함유하였다. 이 카나마이신 내성 유전자는 Flp 레콤비나제의 발현을 통해 유전자가 제거될 수 있게 하는 FRT 부위에 의해 플랭킹되어 있었다. 이 디자인은 항생제 내성 유전자를 쉽게 제거하여 자기-선택 플라스미드를 함유하는 최종 프로바이오틱 균주를 생성하는 것을 가능하게 한다. 이는 적용 중에 조작된 균주로부터 마이크포바이옴으로 내성 유전자의 잠재적인 수평적 유전자 전달을 방지하기 위해 작동한다
알라닌-결실 EcN 균주는 알라닌 영양요구성 표현형을 성공적으로 표시하였다 (도 5C). 표현형은 설계된 플라스미드 pEaat의 발현에 의해 구제되었다. 균주는 또한 D-알라닌의 외인성 보충에 의해 구제되었다. 이는 균주가 실험실 조건에서 유지 가능하게 한다. 더욱이, 플라스미드는 어떤 항생제 선택 없이도 1개월 동안 EcN에서 안정적으로 유지되었다 (도 5D). 항생제 내성 유전자를 가진 플라스미드를 EcN 또는 야생형 균주로 형질전환시켰다. 세포는 항생제 부재 하에 성장하였다. 이어서, 세포를 플라스미드의 존재에 대해 일정 간격으로 시험하였다. 조작된 EcN에서만 플라스미드가 거의 100%에서 일관되게 유지되는 것으로 밝혀졌다. 종합해서, 이들 결과는 생체내에서 조작된 유전적 회로의 장기적인 전달을 위한 섀시로서 기능하는 EcN의 적용 가능성을 나타낸다.
실시예 2
NanR-의존성 시알산-유도성 프로모터의 최적화
MG1655 이. 콜라이 게놈으로부터 시알산 유도성-프로모터 pNanA (서열번호: 4)의 서열은 EcoCyc 데이터베이스로부터 수득하였다 [Keseler, I. M. et al. Nuc. Acids. Res. 41: 605-12 (2013)]. 프로모터는 pEaat 플라스미드 (pEaat-pNanA-gfp)에서 gfp 유전자의 상류로 서브클로닝된 다음에 발현 특성화를 위해 T10 및 EcN으로 형질전환되었다 (도 6A). 놀랍게도, 이. 콜라이의 두 균주는 시알산 유도에 대해 상이한 반응을 표시하였다 (도 6B). 시알산의 유도는 GFP 발현을 야기하는 T10 pNanA 프로모터의 전방 활성화를 결과하였다. 다른 한편으로는, EcN에서 pNanA 프로모터 하에서의 gfp는 시알산의 부재 하에 강하게 발현되었고 대신에 고농도의 시알산 유도로 억제되었다.
반응의 차이는 pNanA가 T10과 EcN 사이에서 상이하게 조절됨을 시사한다. NanR (서열번호: 5)은 이전에 이. 콜라이에서 시알산 이화작용의 전사 조절인자로서 확인되었다 [Kalivoda, K. A., et al., J. Bacteriol. 185(16): 4806-15]. MG1655 게놈 (진뱅크(GenBank) 수탁 CP012868.1)에서의 nanR의 서열이 확인되었다. 유전자의 500 bp 상류 및 500 bp 하류의 플랭킹 서열과 함께 유전자 서열을 단리하였다 (nanR±500). 문의(query)로서 nanR±500을 사용하고 대상으로서 T10 (DH10β로서 확인; 진뱅크 수탁 CP000948.1) 또는 니슬 (진뱅크 수탁 CP007799.1) 게놈 서열을 사용하여 BLASTn 검색을 수행하였다. T10 게놈 서열은 MG1655 게놈과 100% 일치를 수득하였다. 니슬 게놈 서열은 nanR 서열 및 500 bp 하류에 대해 96%의 강력한 일치를 복귀하였다. 그러나, nanR의 500 bp 상류에 대한 어떤 유사성도 없다. nanR의 조절 요소는 유전자의 200 bp 상류에서 발견되었다. 이는 니슬이 nanR 서열을 갖고 있긴 하지만, K-12 혈통의 이. 콜라이와 대조적으로 니슬에서 그 유전적 조절이 붕괴된다는 것을 시사한다.
NanR은 nan 오페론 발현에서 전사 억제인자로서 기능하는 것으로 가설이 세워졌으며 니슬에서 nanR의 붕괴된 게놈 발현은 관찰된 pNanA 프로모터의 활성을 결과하였다. 가설을 시험하기 위해, nanR을 MG1655 게놈으로부터 pBad 프로모터 (pSC101-pBad-nanR) 하에 pSC101 벡터로 서브클로닝하였다 (도 6C). 플라스미드를 pEaat-pNanA-gfp와 함께 EcN으로 공동-형질전환시켰다. 프로모터 pBad는 공동-발현된 AraC에 의해 조절되고 L-아라비노스에 의해 유도될 수 있다. 상이한 조합에서 L-아라비노스와 시알산의 공동-유도는 pNanA로부터 이상적인 반응을 도출하는 데 필요한 nanR의 발현 수준을 결정할 수 있다. 유도된 세포는 10,000개의 크기-게이트된 샘플의 중앙값 GFP 형광 판독에 대해 유세포 분석에 의해 정량화되었다. 결과로부터, L-아라비노스 유도의 부재 하에도, NanR의 기저 발현은 pNanA 기저 활성을 유의하게 억제한다 (도 6D). 이는 또한 pNanA 프로모터가 시알산에 의한 발현을 유도하는 것을 가능하게 하였다. NanR의 향상된 발현은 pNanA 기저 및 유도된 활성을 둘 다 감소시켰다. 이는 NanR이 pNanA 발현의 상류 조절인자이며 조절에 낮은 수준의 NanR만 필요하다는 것을 시사한다.
NanR 발현은 EcN에서 pNanA의 시알산-유도성 반응을 달성하는 데 필요하기 때문에, 유전적 작제물 pEaat-pNanA-gfp는 구성적 발현 하에서 nanR을 공동-발현하도록 재설계되었다 (도 6E). 유전자 nanR은 리보솜 결합 부위 rbs5, rbs3 또는 rbs2를 가진 구성적 프로모터 J23108 하에 서브클로닝되었다. 3개의 리보솜 결합 부위는 상이한 번역 개시 속도를 가지며, rbs5가 가장 강력하고 rbs2가 가장 약하다. 플라스미드는 시알산 유도로 GFP 발현의 특성화를 위해 EcN으로 형질전환되었다. 유세포 분석 결과와 일치하게, 리보솜 결합 부위 rbs2 하에 NanR의 약한 구성적 발현이 시알산으로 더 양호한 유도성을 나타내는 것으로 밝혀졌다 (도 6F). NanR의 발현은 구성적 프로모터가 J23113으로 대체되고 리보솜 결합 부위가 rbs4 (J23113-rbs4-NanR; 서열번호: 6)로 대체된 작제물에서 추가로 감소되었다. 이들 작제물에서 시알산 유도시 GFP 발현의 특성화는 NanR의 더 약한 발현에도 불구하고 이전 작제물과 비교하여 유사한 발현 수준을 유지하였다.
NanR 전사 조절인자의 공동-발현을 통해, 프로모터 pNanA의 활성은 억제성 프로모터의 활성으로부터 시알산의 유도성 프로모터의 활성으로 성공적으로 역전되었다. 추가로, pNanA의 기저 발현이 감소하였다. 이들은 조작된 회로망에 따라 시알산에 상이하게 반응할 수 있는 EcN용 다용도의 이중-기능 프로모터를 결과하였다. 프로모터 pNanA는 NanR의 존재에 따라 유도성 프로모터 또는 시알산의 억제된 프로모터로서 기능할 수 있다. 게다가, nanR은 추가 제어 층을 가능하게 하기 위해 추가 유도성 또는 억제성 발현 하에 배치될 수 있다. 작제물 pEaat-J23113r4-nanR-pNanA-gfp는 시알산-기반 디스바이오시스 바이오센서로서의 추가 특성화를 위해 선택되었다.
실시예 3
위장-특이적 조건(gastrointestinal-specific condition) 하에 조작된 시알산 바이오센서의 특성화
EcN의 부모 균주(parental strain)는 하부 위장관, 구체적으로 결장 및 직장에 우선적으로 콜로니화한다 [Sonnenborn, U., & Schulze, J. Micob. Ecol. Health Dis. 21: 122-58 (2009); Schultz, M. Inflamm Bowel Dis. 14(7): 1012-8 (2008)]. 이는 하부 위장관을 위한 디스바이오시스 바이오센서로서 이상적이 되도록 한다. 선택된 작제물은 그의 적합성을 평가하기 위해 하부 위장관에 특이한 일련의 조건 하에 특성화되었다.
pNanA 서열은 위치 4 → 8에 이화산물 활성인자 단백질 (CAP) 결합 부위를 함유하다는 점을 주목하였다. CAP는 시클릭 AMP (cAMP)에 결합될 때 전사 과정을 시작하는 전사 활성인자 단백질이다. cAMP 수준은 글루코스의 부재 하에 상승하여, 낮은 글루코스 반응을 위한 전사 활성인자로서 효과적으로 기능한다. 유도성 (pEaat-J23113r4-nanR-pNanA-gfp) 또는 억제성 (pEaat-pNanA-gfp) 작제물을 보유하는 EcN은 시알산 및/또는 글루코스 유도로 GFP 발현 특성화에 적용되었다. 예상대로, 유도성 작제물을 발현하는 EcN은 고전적인 lac 오페론과 유사한 반응을 나타냈다. GFP 발현은 시알산이 존재하는 경우에도 글루코스의 존재 하에 억제되었다 (도 7A 및 7B). 이는 NanR이 LacI와 기능적으로 유사할 수 있음을 시사한다. 흥미롭게도, 억제성 작제물을 발현하는 EcN은 글루코스에 유사하게 반응하여, GFP 발현이 글루코스의 존재 하에 침묵된다. 이들 결과는 pNanA의 전사가 cAMP-CAP에 의해 구동됨을 시사한다. 글루코스 존재 하에 프로모터의 억제는 글루코스 수준이 상당히 더 낮을 것으로 예상되는 하부 위장관에서 사용하기에 이상적이 되도록 한다. 유도성 및 억제성 작제물 둘 다 침묵하고 상부 위장관에서 시알산에 반응하지 않을 가능성이 높으므로, 그의 효과는 상부 위장관을 통과하는 동안 최소화된다.
EcN에서 pNanA 활성의 경향이 시알산 억제성 프로모터에서 유도성 프로모터로 역전되었긴 하지만, 유도성 작제물의 유도된 신호는 억제성 작제물의 억제된 신호보다도 상당히 더 낮았다는 점을 주목하였다. 낮은 유도 발현 수준은 타우로콜레이트를 탈접합시키기에 충분한 Cbh 발현에 대한 문제였다. 이 문제를 극복하기 위해 증폭기 모듈을 설계하고 유도성 작제물에 부가하였다. 전사 활성인자 CadC (서열번호: 12)를 암호화하는 유전자를 pNanA 프로모터 하에 서브클로닝하였다. CadC에 의해 조절되는 프로모터 pCadBA는 gfp (J23113r4-nanR-pNanA-cadC-pCadBA-gfp)의 상류에 서브클로닝되었다. 이 설계에서, 시알산 유도시, pNanA 하에 CadC의 발현은 결국 GFP의 더 강한 발현을 위해 pCadBA 프로모터를 활성화할 것이다 (도 7C). 여기에서, CadC 및 pCadBA는 pNanA로부터의 신호를 증폭시키고 GFP의 더 강한 발현을 야기하는 중간 형질도입 모듈로서 작용한다. 더욱이, CadC는 이후의 특성화 (도 7F)로부터 명백한 바와 같이 외부 pH에 대한 그의 반응성으로 인해 선택되었다. 작제물을 특성화하고 유도된 GFP 형광 신호가 유의하게 개선되는 것으로 나타났다. 회로에 cadC-pCadBA (서열번호: 7)의 부가는 유도성 작제물로부터의 신호 증폭을 성공적으로 가능하게 하였다 (도 7D). 그러나, 비-증폭기 작제물과 비교하여 GFP 발현의 시간적 지연이 관찰되었다. 이는 중간 CadC 발현이 필요하여, 반응이 지연될 뿐만 아니라, 기저 발현 수준이 증가하기 때문일 수 있을 것이다.
바이오센서 콜로니화의 표적 부위는 환경의 영양 수준이 열악할 것으로 예상되는 하부 위장관에 있다. 모든 이전의 특성화 검정은 영양-풍부 LB에서 수행하였다. 전체적인 영양 수준이 상이한 장 환경에서는 작제물이 상이하게 작용할 가능성이 있다. 바이오센서가 위장에서 의도한 바와 같이 기능할 수 있는지를 결정하기 위해, 시알산 유도성 (J23113r4-nanR-pNanA-gfp) 및 시알산 유도성-증폭기 (J23113r4-nanR-pNanA-cadC-pCadBA-gfp) 작제물은 장 환경에 더 가깝게 기능한 M9 최소 배지에서 특성화되었다. M9 최소 배지는 전형적으로 글루코스 형태의 탄소 공급원을 함유한다. 글루코스가 pNanA 활성을 방해하는 경우 이전에 나타낸 바와 같이, 글리세롤은 M9 최소 배지의 탄소 공급원으로서 사용되었다. 영양-부족 조건에도 불구하고, 시알산 유도성 구출물을 발현하는 EcN은 시알산 유도에 의도한 대로 반응할 수 있었다 (도 7E). 추가로, 이전에 관찰된 시간 응답 지연은 M9 최소 배지에서 특성화하는 동안 두드러지지 않았다. 이전에 이론화된 바와 같이 pNanA 발현은 cAMP-CAP에 의해 구동될 수 있을 것이다. M9 최소 배지의 더 낮은 영양소 함량은 높은 수준의 cAMP를 결과할 수 있으며, 따라서 시알산 유도에 대한 더 빠른 반응을 야기할 수 있다. 그러나, 현재 결과는 여전히 이 제안을 검증하기에는 결정적이지 않다. 그럼에도 불구하고, 결과는 더 낮은 영양 조건이 유도성 작제물의 활성에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다.
시뮬레이션된 또 다른 장(gut) 환경 조건은 pH 수준이었다. 위장관의 pH 수준은 동적이며 건강 상태를 포함한 요인에 따라 상이하다. 건강한 대상체의 pH 범위는 위 1.6 내지 4.2, 소장 6.7 내지 7.3, 맹장 5.4 내지 6.5, 그리고 결장 6.0 내지 7.2의 범위로 보고되었다 [Maurer, et al. PLoS. One. 10(7): e0129076 doi: 10.1371/journal.pone.0129076 (2015)]. 시알산 유도성-증폭기 작제물은 3 내지 9의 범위의 pH에서 글리세롤 배지를 사용하여 M9에서 특성화되었다. pH 수준은 작제물의 활성에 영향을 미치는 것으로 관찰되었다 (도 7F). 3 내지 5의 낮은 pH에서는 어떤 유도 활성도 관찰되지 않았다. 놀랍게도, 대신에 시알산의 존재 하에 GFP의 발현이 억제되었다. 기저 발현 수준은 pH 6에서 증가하고 이후에 감소하였다. cad 오페론은 pH에 민감한 것으로 보고되었으며 pH 5.8에서 활성화되었다 [Watson, N., et al., J. Bacteriol. 174(2): 530-40(1992)]. 이는 pH 6에서 기저 활성을 결과하고, 이후 더 높은 pH에서 감소할 수 있었을 것이다. 작제물은 pH에서 기저 수준으로부터 약간 유도되었으나 7 내지 9의 높은 pH에서 강하게 유도되었다. 데이터로부터, 바이오센서는 낮은 pH 환경으로 인해 위에서 불활성일 것으로 예상할 수 있다. pH가 6.0 내지 7.3인 소장 및 결장에서 그의 활성이 더 높을 것으로 예상된다. 추가로, CDI 환자의 87%가 pH 7 초과의 분변을 가진 씨. 디피실레 감염 동안 결장 및 직장의 pH가 염기성으로 이동하는 것으로 보고되었다 [Gupta, P., et al., South. Med. J. 109(2): 91-6 (2016)]. 보고와 일치하게, 보다 낮은 pH는 씨. 디피실레 감염에 대한 보호 효과와 연관이 있다 [May, T., et al., Scand. J. Gastroenterol. 29(10): 916-22 (1994)]. pH 이동이 마이크로바이옴의 디스바이오시스의 결과인지 또는 병원체 확장의 결과인지는 분명하지 않다. 그럼에도 불구하고, pH의 변화는 바이오센서가 더 강한 반응을 도출하는 것을 가능하게 할 수 있다.
EcN은 글리세롤이 없는 M9 최소 배지에서 성장을 위한 탄소 공급원으로서 시알산을 활용할 수 있음이 관찰되었다 (도 7G). 글리세롤을 함유하는 M9 최소 배지에서는 성장률의 차이가 관찰되지 않았다. 시알산은 감염 동안 확장을 위해 씨. 디피실레 및 병원성 이. 콜라이에 의해 활용되는 것으로 보고되었다 [Ng, K. M., et al., Nat. Lett. 502: 96-99 (2013); Huang, Y. L., et al., Nat. Commun. 6: 8141. doi: 10.1038/ncomms9141 (2015)]. 이는 EcN이 바이오센서 또는 전달 섀시가 되는 것에 더하여 시알산에 대한 병원체에 대한 영양소 경쟁자로서 두 배가 되는 것을 가능하게 할 수 있다. 추가로, EcN 성장에 대한 보충은 Cbh (서열번호: 13)의 발현을 증폭시킬 수 있다.
실시예 4
정제된 담즙염 가수분해효소 Cbh는 타우로콜레이트를 콜레이트로 탈접합(deconjugating)시키고 씨. 디피실레 내생포자 발아를 억제한다
cbh에 대한 고유 유전자 서열 (서열번호: 8)은 BglBrick 표준에 대한 적합성뿐만 아니라 이. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈-최적화되었다. 코돈-최적화된 서열은 서열번호: 9에 제시되어 있다. C-말단 his6-태그 서열이 부가되고 최종 유전자 서열은 pEaat-araC 벡터에서 pBad 프로모터 하에 서브클로닝되었다. 이어서, 플라스미드를 단백질 발현을 위해 이. 콜라이 균주 BL21로 형질전환시켰다. Cbh-his6은 L-아라비노스에 의해 발현을 유도한 다음에 먼저 IMAC에 의해, 이어서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이어서, Cbh-his6을 함유하는 분획을 2 mL로 농축하고 최종 농도 30.66 μM을 수득하였다. Cbh-his6에 상응하는 크기를 가진 단백질은 정제된 단백질의 SDS-PAGE 분석에서 관찰할 수 있다 (도 8A).
Cbh의 활성은 타우로콜레이트에서 콜레이트로의 전환에 의해 결정되었다. 효소 처리 후 담즙염의 농도를 결정하기 위해 HPLC를 활용하였다. HPLC 분석은 먼저 공지된 농도의 타우로콜레이트 및 콜레이트에 대해 시행하여 체류 시간을 결정하고 표준 곡선을 수득하였다. 담즙염의 검출은 205 nm에서 수행하였다. 타우로콜레이트는 대략 12.2분 시행시간(runtime)에 용리되었으며, 한편 콜레이트는 약 19.6분 시행시간에 용리되었다. 타우로콜레이트와 콜레이트의 표준 곡선이 구축되었다 (도 8B 및 8C).
Cbh의 활성은 10 mM의 타우로콜레이트와 함께 10μM의 정제된 Cbh-his6을 인큐베이션함으로써 타우로콜레이트에 대해 시험되었다. 담즙염을 추출하고 HPLC로 분석하였다. 타우로콜레이트와 콜레이트 둘 다의 농도는 Cbh-his6이 없는 실험 및 음성 대조군에 대해 결정되었다 (도 8D-8F). 음성 대조군에서는 어떤 콜레이트도 검출되지 않았다. 다른 한편으로는, 단백질과 함께 인큐베이션은 타우로콜레이트 농도의 100배 감소를 결과하였다. 정반대로, 높은 농도의 콜레이트가 검출되었다. 타우린에 상응하는 피크는 HPLC 작동 조건에 의해 제한되는 범위 내에서 검출되지 않았다. 이종 발현된 Cbh-his6은 타우로콜레이트를 콜레이트로 탈접합시키는 그의 고유 활성을 유지하였다고 추론할 수 있다. 추가로, 결과는 정제된 Cbh-his6와 함께 인큐베이션한 지 3시간 이내에 대략 99%의 타우로콜레이트가 탈접합되는 것으로 나타났다.
Cbh-his6과 타우로콜레이트의 추가 반응을 적절한 대조군으로 설정하고 분취액을 수집하였다. 이어서, 분취액을 정제된 씨. 디피실레 내생포자와 함께 인큐베이션하였다. 내생포자의 발아는 CFU 집계에 의해 열거하였다. 타우로콜레이트 조성은 Cbh-his6와 함께 인큐베이션시 콜레이트로의 탈접합으로 인해 감소하였기 때문에, 분취액의 것으로부터의 발아 효율이 감소할 것으로 예상되었다. 예상대로, Cbh-his6과 함께 인큐베이션된 타우로콜레이트는 양성 대조군과 비교하여 내생포자 발아가 12배 감소한 것으로 나타났다 (도 8G). 이 결과는 타우로콜레이트 및 콜레이트 발아 효율에 대해 수행된 원리 증명과 일치한다 (도 4B). 이들 결과는 담즙염 조성 조정을 통한 CDI 예방을 위한 제안된 전략을 뒷받침하였다.
실시예 5
프로바이오틱스에서 담즙염 가수분해효소 Cbh 발현은 씨. 디피실레 내생포자의 발아를 억제한다
유전자 cbh-his6은 시알산 유도성 작제물 pEaat-J23113r4-nanR-pNanA에서 pNanA 프로모터 하에 서브클로닝되었다. cbh 대신에 gfp를 발현하는 작제물은 발현 대조군으로서 기능하였다. 생성된 플라스미드 pEaat-J23113r4-nanR-pNanA-cbh--his6 및 pEaat-J23113r4-nanR-pNanA-gfp를 EcN 섀시로 형질전환시켰다. 균주를 타우로콜레이트 및 시알산과 함께 인큐베이션하였다. 무세포 양성 대조군, 비유도 cbh-his6 발현 균주 대조군, 및 무-타우로콜레이트 cbh-his6 발현 균주 음성 대조군도 설정하였다. 이어서, 각각의 실험으로부터 여과된 배양 배지를 수집하고 씨. 디피실레 내생포자 발아 효율을 시험하였다. Cbh-his6을 발현하는 EcN 균주는 GFP 발현 음성 대조군과 비교하여 시알산 유도 후 대략 1배까지 씨. 디피실레 내생포자 발아를 감소시켰다 (도 9A; 공백 컬럼). 이는 유망한 결과이긴 하지만, 배수 변화는 정제된 Cbh-his6으로부터 수득된 것들과 비교하여 상당히 더 낮다. 차이는 시알산-유도성 작제물의 낮은 발현 수준 때문이었다. 항-his 항체로 면역블롯을 수행하였고, pEaat-J23113r4-nanR--pNanA 작제물 하에서의 Cbh-his6의 발현 수준은 pEaat-araC-pBad 작제물 하에서보다 상당히 낮은 것으로 밝혀졌다 (도 9B; 레인 2-5). 이는 우리의 디스바이오시스 센서 특성화 데이터와 일치하였다. 이 문제를 해결하기 위해, CadC 증폭기 모듈은 앞서 개요를 서술한 바와 같이 유도성 발현을 증폭하는 유전적 회로로 설계되었다.
유전자 cbh-his6은 증폭기 작제물 pEaat-J23113r4-nanR--pNanA-cadC-pCadBA 하에 서브클로닝되었다. EcN 균주에서 Cbh-his6의 발현은 면역블롯에 의해 검정되었다 (도 9B; 레인 6-9). 발현 수준이 증폭되었으나, 이는 또한 높은 기저 발현 수준을 결과하였다. 이어서, 우리는 새로운 증폭기 회로망 하에 Cbh-his6 또는 GFP를 발현하는 EcN으로 씨. 디피실레 내생포자 발아 검정을 반복하였다. 씨. 디피실레 내생포자 발아 감소의 현저한 개선이 관찰되었다 (도 9A, 채워진 컬럼). Cbh-his6을 발현하는 EcN 균주는 발현 대조군과 비교하여 시알산 유도 후 씨. 디피실레 내생포자 발아를 대략 40배 감소시킬 수 있었다. 시알산 유도의 부재 하에, 내생포자 발아의 대략 10배 감소가 달성되었다. 이는 Cbh-his6의 강한 기저 발현에 기인할 수 있을 것이다.
실험 및 대조군으로부터 여과된 배양 배지를 또한 HPLC 분석을 위해 수집하였다 (도 9C). 타우로콜레이트 및 콜레이트 농도는 이전에 확인된 체류 시간을 기준으로 검출되었다. 무세포 양성 대조군 및 GFP 발현 대조군에서는 어떤 콜레이트도 검출되지 않았으며, 한편 유도된 Cbh-his6 발현 균주에서는 어떤 타우로콜레이트도 검출되지 않았다. 유도되지 않은 Cbh-his6 발현 균주는 내생포자 발아의 10배 감소에도 불구하고 타우로콜레이트의 단지 대략 45% 탈접합을 나타냈다. 이는 효과적인 씨. 디피실레 내생포자 발아를 달성하기 위해 타우로콜레이트의 높은 축적이 필요함을 시사한다. 정반대로, 타우로콜레이트의 빌드-업에 약간의 붕괴는 내생포자의 발아를 크게 감소시킬 수 있다. 이들 결과는 수행된 원리 증명 발아 효율 검정과 일치한다 (도 4B). 증폭기 작제물은 Cbh-his6의 강한 기저 발현 수준을 나타냈다. Cbh-his6의 이러한 기저 발현은 시알산 유도의 부재 하에도 타우로콜레이트의 임의의 축적에 대해 즉시 반응을 제공한다.
실시예 6
담즙염 가수분해효소 Cbh-처리된 씨. 디피실레 내생포자는 감소된 외독소 분비를 나타내고 Caco-2 세포의 감염 예후를 개선한다
EcN 세포에서 Cbh의 발현은 담즙염 접합 상태의 조정에 의해 씨. 디피실레 내생포자 발아를 억제하는 것으로 나타났다. 내생포자 발아의 억제는 결국 식물 씨. 디피실레의 확장을 지연시킬 것이다. 지연된 확장이 CDI의 병리의 차이를 나타내는지 여부를 결정하기 위해, 발아된 씨. 디피실레를 결장직장 선암종으로부터 단리된 인간 결장 상피 세포주인 Caco-2 세포에 대해 시험하였다.
씨. 디피실레 및 Caco-2는 동일한 실험실 조건에서 성장할 수 없으므로, 시차를 둔 공동배양을 수행하였다. 이는 분비되는 외독소인 CDI의 병인으로 인해 가능하게 되었다 [Carter, G. P., et al., mBio. 6(3): e00551. doi: 10.1128/mBio.00551-15 (2015)]. 발아된 씨. 디피실레는 먼저 일정 간격으로 수집된 배양 배지를 사용하여 허용되는 조건에서 성장시켰다. 이어서, 여과된 배양 배지를 농축하고 Caco-2 세포와 함께 인큐베이션하기 전에 완충제를 교환하였다. 이 방법은 씨. 디피실레와 Caco-2 세포 간의 직접적인 상호 작용을 고려하지 않긴 하지만, 이는 씨. 디피실레로부터 분비된 독소를 Caco-2 세포에 대해 시험할 수 있게 한다.
이전의 시험관내 검정과 유사한 실험 및 대조군이 설정되었다. 씨. 디피실레 내생포자는 무세포 타우로콜레이트 양성 대조군 (도 10A, 레인 2-4; 10B; 10F 상단 중간 패널), GFP-발현 EcN 발현 대조군 (도 10A, 레인 5-7; 10C; 10F 우측 상단 패널), 또는 무-타우로콜레이음성 대조군 (도 10A, 레인 11-13; 10E; 10F 우측 하단 패널)과 함께, Cbh-발현 EcN (도 10A, 레인 8-10; 10D; 10F 좌측 하단 패널)으로 처리된 타우로콜레이트로 발아되었다. 일정 간격으로 수집된 실험으로부터 10배 농축 여과된 상청액에 대해 면역블롯을 수행하고, 독소 TcdA에 대해 탐침하였다. 결과는 Cbh-발현 EcN으로 처리되는 경우 상청액으로 분비되는 TcdA의 양이 감소되었음을 나타냈다 (도 10A). 독소의 시간-의존성 축적이 또한 일관되게 관찰될 수 있다. 씨. 디피실레 내생포자 발아의 억제는 영양 세포의 성장을 지연시키고 배지로 분비되는 독소 부하를 감소시키는 것으로 시사될 수 있다.
발아를 위한 씨. 디피실레 유도 후 상청액을 일정 간격으로 수집하였다. 상청액을 농축한 다음에 Caco-2 세포와 함께 인큐베이션할 때 1배 내지 0.01배로 연속 희석하였다. Caco-2의 세포 생존력은 48시간 배양 후 MTT로 검정되었다. 예상대로, Cbh-발현 EcN 처리된 씨. 디피실레로부터 수집된 상청액과 함께 인큐베이션된 Caco-2는 발현 대조군의 것들과 비교하여 더 높은 최종 세포 생존력을 나타냈다 (도 10B-10E). 이는 상청액의 TcdA의 양과 일치한다. 추가로, Caco-2의 세포 형태는 Cbh-발현 EcN과 발현 대조군으로부터의 상청액 처리에서 상이한 것으로 관찰되었다 (도 10F). Cbh-발현 EcN으로부터의 상청액으로 처리된 Caco-2는 미처리 Caco-2에 가까운 형태를 나타냈다. 다른 한편으로는, 발현 대조군으로부터의 상청액 처리는 양성 대조군으로부터의 상청액 처리와 유사한 형태를 결과한다. Caco-2 세포는 배양 플레이트로부터의 박리 및 세포 사멸과 연관된 위축된 세포 형상을 나타냈다.
전반적으로, 검정은 Cbh-발현 EcN이 생체외 Caco-2 세포 배양의 예후를 개선할 수 있음을 나타냈다. EcN으로부터 발현된 Cbh는 타우로콜레이트를 콜레이트로 탈접합시켜 씨. 디피실레 내생포자의 감소된 발아를 결과할 수 있다. 발아 지연은 외독소의 배양 배지로의 분비에 영향을 미치고, 이는 결국 Caco-2 감염 예후의 개선을 결과하였다. TcdA는 Cbh 처리로부터 상청액으로 계속 분비되었고 전적으로 억제되지는 않았다는 점을 주목하였다. 이는 시험관내 검정, 조작된 EcN으로 처리한 후에도 작은 씨. 디피실레 발아와 일치한다 (도 9A). 이들 영양 세포는 TcdA의 분비를 야기하는 배양 배지에서 증식하였다. 조작된 EcN으로 치료한 후에도 외독소가 축적될 수 있다는 것이 가능하다. 그러나, 생체내 영양-부족 환경은 씨. 디피실레의 증식을 제한할 수 있으며, 세포의 초기 발아는 후속 증식보다 전체 유독성 부하에 더 큰 영향을 미친다. 이들 동력학의 정도는 치료의 효과를 결정하기 위해 생체내에서 추가로 해명되어야 한다. 그럼에도 불구하고, 조작된 EcN으로 씨. 디피실레 내생포자의 처리는 분비되는 외독소의 감소된 양을 결과한다는 것이 결정적이다. 이는 결국 발현 대조군과 비교하여 Caco-2 세포 생존력을 개선시켰다.
실시예 7
디스바이오시스 센서-제어 담즙염 가수분해효소 Cbh를 발현하는 조작된 프로바이오틱스를 사용한 전처리는 뮤린 모델에서 씨. 디피실레로부터의 감염에 대한 보호를 제공하였다
CDI의 뮤린 모델은 이전에 입증되었다 [Chen, X., et al., Gastroenterology. 135: 1984-1992 (2008)]. 이 모델은 조작된 EcN의 효능을 시험하기 위해 이 연구에서 적합화 및 변형되었다 (도 11A). 간단히 말해서, 마우스에게는 감염 3일 전에 (-3일차) 조작된 프로바이오틱스 (처리 또는 대조군) 또는 블랭크(감염 대조군)의 용량이 주어졌다. 씨. 디피실레 (107 CFU)에 의한 감염을 0일차에 수행하였다. 이어서, 마우스의 사망률, 체중, 및 임상 증상을 9일에 걸쳐 기록하였다. 이어서, 임상 증상을 이전에 확립된 표준에 따라 채점하고 표로 작성하였다 [Shelby, R. D., et al., Int. J. Surg. doi: 10.1080/08941939.2019.1571129 (2019)].
처리 군 ('EcN-cbh')에게는 Cbh-발현 작제물 (pEaat-J23113r4-nanR--pNanA-cadC-pCadBA-cbh)을 함유하는 프로바이오틱스가 주어졌다. 이 작제물은 센서, 증폭기, 및 작동기와 같은 여러 유전적 모듈로 이루어진다. 완전히 조작된 프로바이오틱스의 효능을 적당하게 입증하기 위해, 각각의 유전적 모듈 중 하나가 결핍된 작제물을 포함하도록 다양한 대조군 프로바이오틱스를 생성하였다. 이들 대조군에 대해 생성된 프로바이오틱스는 도 11B에 요약되어 있다. 무-센서 대조군 ('EcN-pCon-cbh')에는 디스바이오시스 센서 없이 Cbh를 구성적으로 발현하는 조작된 프로바이오틱스가 주어졌다. 무-증폭기 대조군 ('EcN-pNanA-cbh')에는 증폭기 모듈이 결핍된 조작된 프로바이오틱스가 주어졌다. 무-작동기 대조군 ('EcN-gfp)에는 Cbh 대신에 GFP를 발현하는 조작된 프로바이오틱스가 주어졌다. 모든 프로바이오틱스는 -3일차에 109 CFU의 단일 용량으로 투여되었고, 감염 대조군에는 조작된 프로바이오틱스 대신에 수크로스가 주어졌다.
마우스를 검정 0일차에 107 CFU의 씨. 디피실레로 감염시켰다 (도 11A). 처리군의 생존은 모든 대조군보다 유의하게 더 양호하게 수행하였다. 마우스의 100%는 감염 대조군 (70.0%; P = 0.0461), 무-센서 대조군 (14.3%; P < 0.0001), 무-증폭기 대조군 (50.0%; P = 0.0063), 및 무-작동기 대조군 (25.0%; P = 0.0005)과 비교하여 감염에서 생존하였다 (도 11C). 감염된 마우스는 2일차 내지 4일차에 중증 증상을 나타냈다. 이 기간 동안 처리군의 상대 체중은 10% 초과의 상대 체중 감소를 나타낸 모든 대조군에 대해 비교적 더 안정적이었다 (도 11D). 각각의 마우스에는 0일차 내지 6일차까지 매일 0 내지 12의 범위의 임상 질병 점수 (CSS)가 할당되었다. CSS는 세 가지 기준: 분변, 거동 및 체중 감소에 따라 할당된다 [Shelby, R. D., et al., Int. J. Surg. doi: 10.1080/08941939.2019.1571129 (2019)]. CSS를 기준으로, 감염의 중증도는 정상 (0 내지 2), 경증 (3 내지 5), 중등도 (6 내지 8) 및 중증 (9 내지 12)으로서 기재될 수 있다. 이어서, 각각의 마우스에 의해 채점된 CSS를 사용하여 군의 평균 점수를 표로 작성하였다 (도 11D). 처리 군은 평균 3.3으로 모든 군과 비교하여 가장 낮은 CSS 점수를 받았다. 이 점수는 감염 대조군 (7.0; P = 0.0075), 무-센서 대조군 (8.7; P = 0.0005), 무-증폭기 대조군 (7.5; P = 0.0026), 및 무-작동기 대조군 (8.5; P = 0.0011)과 비교하여 유의하게 낮다. 종합하면, 이들 결과는 씨. 디피실레 감염 전에 조작된 프로바이오틱스의 투여가 사망률을 낮추고 증상의 중증도를 감소시킴으로써 감염 예후를 개선하는 예방적 보호를 부여할 수 있음을 입증한다.
추가로, 결과는 무-센서 군에서 Cbh의 구성적 발현이 무-작동기 대조군과 비교하여 마우스의 생존을 개선시키지 않는다는 것을 나타냈다 (P = 0.247). 정반대로, 무-증폭기 군에서 디스바이오시스 센서로부터의 Cbh의 발현은 무-센서 군에 비해 생존의 개선을 나타냈다 (P = 0.0305). 이는 시험관내에서 구성적 프로모터로부터의 Cbh의 발현 수준이 pNanA 프로모터로부터의 발현 수준보다 더 높음에도 불구하고이다. 다양한 대조군의 결과는 씨. 디피실레 감염을 조정하는 의도된 기능을 달성하는 데 Cbh의 주문식 생체내 발현을 구동하는 디스바이오시스 감지 모듈이 필요함을 시사한다. 하부 위장관의 영양소 수준은 더 불량할 것으로 예상되며, 효소의 지속성의 발현을 위한 영양소의 비효율적인 할당은 무-센서 프로바이오틱스에 대해 효과가 있었을 수 있다. 결과는 생체내 CDI에 대한 높은 활성을 달성하기 위해 조작된 프로바이오틱스로부터 Cbh의 발현을 제어하는 데 있어 디스바이오시스 센서의 중요성을 강조한다.
종합하면, 이들 결과는 디스바이오시스 센서-제어 담즙염 가수분해효소 Cbh를 발현하는 조작된 프로바이오틱스가 씨. 디피실레 감염에 대한 예방적 내성을 제공할 수 있음을 입증한다. 담즙염 대사의 회복 및 디스바이오시스-감지 모듈 둘 다가 감염에 대한 보호를 제공하는 데 중요한 것으로 입증되었다. 종합하면, 프로바이오틱스는 씨. 디피실레 감염에 대한 예방으로서 높은 효능을 입증하였다.
실시예 8
유사한 치료 기능을 달성하기 위한 다른 프로바이오틱 균주에서의 유전적 회로의 발현
본 발명에서의 유전적 회로는 그람 음성 및 그람 양성 둘 다의 다른 프로바이오틱 종에서 쉽게 발현될 수 있다. 많은 종의 고유 프로바이오틱스가 살아있는 생물치료제로서 조작될 수 있다 [O'Toole, P. W., Marchesi, J. R., & Hill, C. Nat. Microbiol. 2: 17057. doi: 10.1038/nmicrobiol.2017.57 (2017)]. 이러한 종의 예는 박테로이데스 종, 클로스트리디움 종, 파에칼리박테리움 종, 락토코커스 락티스, 및 락토바실러스 종 을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명은 효소 발현 및 디스바이오시스에 대한 반응의 어려운 기술적 문제를 해결한다. 발현은 유사한 치료 기능을 달성하기 위해 다른 프로바이오틱 종에 그래프트될 수 있다. 이는 조작된 프로바이오틱스가 십이지장, 공장 또는 회장과 같은 위장관의 다른 위치를 콜로니화하고 표적화하는 것을 가능하게 한다.
실시예 9
항생제 선택이 없는 프로바이오틱 섀시를 적용하여 다른 유전적 회로를 동일계내( in situ ) 전달할 수 있다.
이. 콜라이 니슬 균주에서 영양요구성 표현형의 생성을 통해 항생제 선택이 없는 프로바이오틱 섀시를 조작하였다. 이 섀시는 선택 마커로서 알라닌 라세마제 유전자로 이루어진 플라스미드를 동반한다. 이 섀시는 조작된 유전자 회로를 계내 전달 가능하게 하고 병원체 표적화, 암 표적화, 및 대사산물/생물학적 합성 및 전달과 같은 다른 목적에 활용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
실시예 10
시알산-기반 센서는 디스바이오시스에 대한 프록시로서 기능하며 다른 디스바이오시스-연관 질환 및 감염에 적용될 수 있다.
본 발명은 시알산-반응성 프로모터를 기반으로 한 디스바이오시스 사건에 반응한다. 시알산-반응성 프로모터는 시알산의 상향조절 또는 하향조절에 반응하도록 조작될 수 있다. 마이크로바이옴의 디스바이오시스는 또한 염증성 장 질환, 병원성 감염, 제2형 진성 당뇨병, 천식, 비만, 자폐증, 및 류마티스 관절염과 같은 다수의 다른 질환과 연관이 있으나, 이에 제한되지는 않는다 [Packey, C., D., & Sartor, R. B. Curr. Opin. Infect. Dis. 22(3): 292-301 (2009)]. 시알산-기반 센서는 이러한 질환을 표적으로 하는 조작된 생물치료제에 적용될 수 있다.
실시예 11
유전적 회로를 최적화하고 EcN 게놈에 통합하여 추가 안정성을 부여할 수 있다.
본 발명에서 유전적 회로는 플라스미드에서 발현된다. 대안적으로, 유전적 회로는 추가 안정성을 위해 게놈에 통합될 수 있다. 이는 마이크로바이옴으로의 불필요하나 잠재적인 수평적 유전자 이동을 피할 것이다. 다수의 통합 부위가 EcN 게놈에서 확인되었다 [Isabella, V. M., et al., Nat. Biotech. 36: 857-864 (2018)]. 이 유전적 회로의 통합은 통합 유전적 회로의 자발적 소실 또는 불활성화에 저항하면서, 프로바이오틱 균주의 게놈 안정성을 붕괴하지 않고 이들 부위에서 수행될 수 있다.
요약
조작된 프로바이오틱 섀시 EcN
본 발명의 실시양태는 추가 선택 없이 연장된 기간 동안 선택 마커로서 알라닌 라세마제 유전자를 함유하는 플라스미드를 유지할 수 있는, 게놈으로부터 결실된 2개의 알라닌 라세마제 유전자를 갖는 이. 콜라이 니슬을 제공한다. 이는 마이크로바이옴에 대한 항생제 내성 유전자의 불필요한 노출을 피한다. 이어서, EcN은 위장관에 콜로니화하고 씨. 디피실레에 대한 항균 활성을 발휘하기 위해 씨. 디피실레-표적 항생제 요법과 함께 공동-투여될 수 있다. 조작된 프로바이오틱은 장기간 동안 위장관에 남아 있어, 예방적 적용을 가능하게 한다.
시알산 유도성 시스템
본 발명의 실시양태에서, pNanA 프로모터 및 임의적 NanR 전사 인자, CadC 전사 인자 및 그의 프로모터 pCadBA를 포함한 유전적 회로로 이루어진 시알산 유도성 시스템이 제공된다. NanR은 pNanA의 유도성을 역전시키고 CadC-pCadBA는 전반적인 발현 수준을 증폭시킨다. 이 시스템은 시스템에 사용되는 부분에 따라 시알산의 변화에 반응한다. 상승된 시알산 수준은 위장 마이크로바이옴의 디스바이오시스와 연관이 있으므로, 시스템은 디스바이오시스 사건의 발생으로 제한되는 치료 단백질의 발현을 통해 디스바이오시스 사건에 시기적절한 반응을 제공한다.
CadC 증폭 시스템
본 발명의 일 실시양태에서, 요소 CadC 단백질 및 pCadBA 프로모터는 중간 전사 활성인자 발현을 통해 시알산-반응성 프로모터로부터의 발현을 증폭시키기 위해 제공된다. 1차 기능은 담즙염 가수분해효소의 발현을 치료학적으로 유의한 수준으로 증폭시키는 것이다. 2차 기능은 유전적 회로가 pH에 민감하도록 하는 것이고; 이는 담즙염 가수분해효소 발현에 대한 추가 제어 층을 제공한다.
담즙염 가수분해효소 발현
담즙염 가수분해효소는 CDI에 선행하는 사건인 디스바이오시스 동안 상승된 담즙염에 기인한 씨. 디피실레의 내생포자 발아 효율을 감소시키기 위해 타우로콜레이트의 콜레이트로의 탈접합을 촉매하기 위해 발현된다. 상기 효소는 내생포자의 발아를 억제하고 씨. 디피실레에 의해 분비되는 독소의 전반적인 감소를 야기한다.
디스바이오시스에 대한 반응으로 담즙염 가수분해효소를 선제적으로 발현함으로써, 프로바이오틱은 CDI에 대한 자율적 예방 기능을 할 수 있다. 이 전략은 rCDI 예방에도 효과적일 것이다. 따라서, 이 프로바이오틱은 CDI 관리의 격차를 해결하고 CDI 및 rCDI의 위험에 처한 환자를 표적으로 할 수 있다.
본 발명의 이점은 CDI 및 rCDI를 제어하기 위한 무-살박테리아성 접근법을 제공한다는 점이며; 따라서 이 방법에 대한 저항을 피할 수 있다.
참고문헌
이 명세서에서 명백히 이전에-공개된 문서의 임의의 목록이나 논의는 반드시 이러한 문서가 최신 기술의 일부이거나 통상의 일반 지식이라는 인정으로서 간주되어야 하는 것은 아니다.
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SEQUENCE LISTING <110> National University of Singapore <120> ENGINEERED DYSBIOSIS-SENSING PROBIOTIC FOR CLOSTRIDIUM DIFFICILE INFECTIONS AND RECURRING INFECTIONS MANAGEMENT <130> SP100743WO <150> SG10201902947W <151> 2019-04-02 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3641 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pEaat plasmid <400> 1 aagcttaagt gatcattggc gcgccgtgta ggctggagct gcttcgaagt tcctatactt 60 tctagagaat aggaacttcg gaataggaac ttcaagatcc ccttattaga agaactcgtc 120 aagaaggcga tagaaggcga tgcgctgcga atcgggagcg gcgataccgt aaagcacgag 180 gaagcggtca gcccattcgc cgccaagctc ttcagcaata tcacgggtag ccaacgctat 240 gtcctgatag cggtccgcca cacccagccg gccacagtcg atgaatccag aaaagcggcc 300 attttccacc atgatattcg gcaagcaggc atcgccatgg gtcacgacga gatcctcgcc 360 gtcgggcatg cgcgccttga gcctggcgaa cagttcggct ggcgcgagcc cctgatgctc 420 ttcgtccaga tcatcctgat cgacaagacc ggcttccatc cgagtacgtg ctcgctcgat 480 gcgatgtttc gcttggtggt cgaatgggca ggtagccgga tcaagcgtat gcagccgccg 540 cattgcatca gccatgatgg atactttctc ggcaggagca aggtgagatg acaggagatc 600 ctgccccggc acttcgccca atagcagcca gtcccttccc gcttcagtga caacgtcgag 660 cacagctgcg caaggaacgc ccgtcgtggc cagccacgat agccgcgctg cctcgtcctg 720 cagttcattc agggcaccgg acaggtcggt cttgacaaaa agaaccgggc gcccctgcgc 780 tgacagccgg aacacggcgg catcagagca gccgattgtc tgttgtgccc agtcatagcc 840 gaatagcctc tccacccaag cggccggaga acctgcgtgc aatccatctt gttcaatcat 900 gcgaaacgat cctcatcctg tctcttgttc agatcatgat cccctgcgcc atcagatcct 960 tggcggcaag aaagccatcc agtttacttt gcagggcttc ccaaccttac cagagggcgc 1020 cccagctggc aattccggtt cgcttgctgt ccataaaacc gcccagtcta gctatcgcca 1080 tgtaagccca ctgcaagcta cctgctttct ctttgcgctt gcgttttccc ttgtccagat 1140 agcccagtag ctgacattca tccggggtca gcaccgtttc tgcggactgg ctttctacgt 1200 gttccgcttc ctttagcagc ccttgcgccc tgagtgcttg cggcagcgtg agcttcaaaa 1260 gcgctctgaa gttcctatac tttctagaga ataggaactt cgaactgcag gtcgacggat 1320 ctccggaata cgcgtttcga attcaagaga tctaaaggat cctaactcga gtaaggatct 1380 ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 1440 gtttgtcggt gaacgctctc tactagagtc acactggctc accttcgggt gggcctttct 1500 gcgtttatac ctagggcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 1560 tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 1620 aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 1680 ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 1740 aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 1800 cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 1860 cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 1920 aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 1980 cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 2040 ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 2100 ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 2160 gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 2220 agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 2280 acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgactagt gcttggattc 2340 tcaccaataa aaaacgcccg gcggcaaccg agcgttctga acaaatccag atggagttct 2400 gaggtcatta ctggatctat caacaggagt ccaagcgagc tctcgaaccc cagagtgata 2460 tcttaatcca cgtatttcat cgcgactctt gaagtcaggc gcgtaataag ttcgtaagcg 2520 cttactttcg tcatttcagc gatacgttct acgggcaaac cttcgcccca taaaatgacc 2580 gggtccccgg ctttgtcctg cgcctgtgga cctaagtcta cgcagatcat atccatcgcg 2640 actcgcccga caatcggcac ttcgcgaccg ttcaccagca ctggcgtacc ggacggcgcg 2700 gcgcgcggat aaccatcgcc atagcccatc gcgactacgc caagacgagt atcacgttcg 2760 cttacccagg ttccaccata accgacaggc tctccggctt tatgctcacg cacggcaatc 2820 aggctggagg ttaaagacat gactggctga cagccaaaat cagcccctgt cgtgccatct 2880 tccagcggcg agacaccgta aagaatgatc cccggacgcg cccagtcaaa atgcgactgc 2940 ggccataaca aaatgccgcc tgatgccgca attgagcgtt gccccggttt accttcacaa 3000 aaggtgttga aaatatcgag ctgcttttca gtcgcgccgc tttgcggttc atcggcacgg 3060 gcgaagtgac taacaatgtt caccggctgg cggacatttt tacactggct cagacgctga 3120 taaaacgcct cggcctgttc cggcaatacg cccaaacggt gcattccggt atcgagcttc 3180 atccagacgg tgacaggctc tttaagttca gcgttttcga gggcgacaag ctgctcttca 3240 ttgtggactg cggtatgcag atgttcagcg gagatcgtcg gcaaatcgtc tgcttcaaaa 3300 aaaccttcca gtaacaaaat aggtcgcgtg ataccccccg cccgcagccg tagggcttct 3360 tcgagacggg caacgccaaa ggcgtcagca tcggggagcg ttcgcgcggt ctcaatcaga 3420 ccgtgaccgt aggcgttcgc tttcaccacc gcaaccagtt tactggcggg ggccagttca 3480 cgcagacgtt gcaggttgtg tcgcagagcg cggcggttaa tcaaaacagt tgccgcttgc 3540 atttgtattc ctttttttca ggttctgccc accagtgcaa aacctcgcta aacagatatg 3600 accggagtat gctattccac atccagggat gggtttataa a 3641 <210> 2 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alr promoter <400> 2 tttataaacc catccctgga tgtggaatag catactccgg tcatatctgt ttagcgaggt 60 tttgcactgg tgggcagaac ctgaaaaaaa ggaatacaa 99 <210> 3 <211> 1080 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alr ORF <400> 3 atgcaagcgg caactgtttt gattaaccgc cgcgctctgc 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aatcgatttg ctggcaaaag cactggaaat caacagtcag 480 tcgctggata acaacgcggc attcattcgt tcagacgttg atttccaccg cgtgctggcg 540 gagatccccg gtaacccaat cttcatggcg atccacgttg ccctgctcga ctggcttatt 600 gccgcacgcc caacggttac cgatcaggca ctgcacgaac ataacaacgt tagttatcaa 660 cagcatattg cgatcgttga tgcgatccgc cgtcatgatc ctgacgaagc cgatcgtgcg 720 ttgcaatcgc atctcaacag cgtctctgct acctggcacg ctttcggtca gaccaccaac 780 aaaaagaaat aa 792 <210> 6 <211> 1094 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J23113-rbs4-NanR <400> 6 tataaacgca gaaaggccca cccgaaggtg agccagtgtg actctagtag agagcgttca 60 ccgacaaaca acagataaaa cgaaaggccc agtctttcga ctgagccttt cgttttattt 120 gatgcctgga gatccttatt tctttttgtt ggtggtctga ccgaaagcgt gccaggtagc 180 agagacgctg ttgagatgcg attgcaacgc acgatcggct tcgtcaggat catgacggcg 240 gatcgcatca acgatcgcaa tatgctgttg ataactaacg ttgttatgtt cgtgcagtgc 300 ctgatcggta accgttgggc gtgcggcaat aagccagtcg agcagggcaa cgtggatcgc 360 catgaagatt gggttaccgg ggatctccgc cagcacgcgg tggaaatcaa cgtctgaacg 420 aatgaatgcc gcgttgttat ccagcgactg actgttgatt tccagtgctt ttgccagcaa 480 atcgatttgc tcatcggtgg catgttcagc cgcatagcgc accagactgg attcaaagaa 540 cagacgtaat tgttcgaaat gggcaatccc accgggatga gaaaggaaat ctttcgccat 600 gccggaaagc tcaccgatga tagtgtccgc agaaggacgc gagacgcgag cgcgttcgcc 660 gttgtttatt tgcaccagac ctttgcgttt taacgctgcc agcgcttcac gcaccgaagg 720 acgcccgacg ttaaagaacg ccatcagttc gcgttcagac ggtaattgtt caccttcgcc 780 aaattcacga cggcggatca tctgttccag ctcttcttcc accatttcgg agagtttttt 840 acgcgccagc gggcggctac gcaagttgcg accaattgca ggtgaagaat cttcggtttg 900 cgaatcaaat gcgttcataa ggcccataga tccgtcctgt gtgaagatcc gctagcataa 960 tccctaggac tgagctagcc atcagggatc tagatcgcat tataagcttt ctgtatgggg 1020 tgttgcttaa ttgatctggt ataacaggta taaaggtata tcgtttatca gacaagggat 1080 ctaaagagga gaaa 1094 <210> 7 <211> 1923 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cadC-pCadBA amplifier <400> 7 atgcaacaac ctgtagttcg cgttggcgaa tggcttgtta ctccgtccat aaaccaaatt 60 agccgcaatg ggcgtcaact tacccttgag ccgagattaa tcgatcttct ggttttcttt 120 gctcaacaca gtggcgaagt acttagcagg gatgaactta tcgataatgt ctggaagaga 180 agtattgtca ccaatcacgt tgtgacgcag agtatctcag aactacgtaa gtcattaaaa 240 gataatgatg aagatagtcc tgtctatatc gctactgtac caaagcgcgg ctataaatta 300 atggtgccgg ttatctggta cagcgaagaa gagggagagg aaataatgct atcttcgcct 360 ccccctatac cagaggcggt tcctgccaca gattctccct cccacagtct taacattcaa 420 aacaccgcaa cgccacctga acaatcccca gttaaaagca aacgattcac taccttttgg 480 gtatggtttt ttttcctgtt gtcgttaggt atctgtgtag cactggtagc gttttcaagt 540 cttgatacac gtcttcctat gagcaaatcg cgtattttgc tcaatccacg cgatattgac 600 attaatatgg taaataaaag ttgtaacagc tggagttccc cgtatcagct ctcttacgcg 660 ataggcgtgg gtgatttggt ggcgacatca cttaacacct tctccacctt tatggtgcat 720 gacaaaatca actacaacat tgatgaaccg agcagttccg gtaaaacatt atctattgcg 780 tttgttaatc agtgccaata ccgtgctcaa caatgcttta tgtcgataaa attggtagac 840 aatgcagatg gttcaaccat gctggataaa cgttatgtca tcactaacgg taatcagctg 900 gcgattcaaa atgatttact ggagagttta tcaaaagcgt taaaccaacc gtggccacaa 960 cgaatgcagg agacgctcca gaaaattttg ccgcatcgtg gtgcgttatt aactaatttt 1020 tatcaggcac atgattattt actgcatggc gatgataaat cattgaaccg tgccagtgaa 1080 ttattaggtg agattgttca atcatcccca gaatttacct acgcgagagc agaaaaagca 1140 ttagttgata tcgtgcgcca ttctcaacat cctttagatg aaaaacaatt agcagcactg 1200 aacacagaaa tagataacat tgttacactg ccggaattga acaacctgtc cattatatat 1260 caaataaaag cggtcagtgc tctggtaaaa ggtaaaacag atgagtctta ccaggcgata 1320 aatactggca ttgatcttga aatgtcctgg ctaaattatg tgttgcttgg caaggtttat 1380 gaaatgaagg ggatgaaccg ggaagcagct gatgcatatc tcaccgcctt taatttacgc 1440 ccaggggcaa acacccttta ctggattgaa aatggtatat tccagacttc tgttccttat 1500 gttgtacctt atctcgacaa atttcttgct tcagaataag gatctagact tctgttcctt 1560 atgttgtacc ttatctcgac aaatttcttg cttcagaata agtaactccg ggttgattta 1620 tgctcggaaa tatttgttgt tgagtttttg tatgttcctg ttggtataat atgttgcggc 1680 aatttatttg ccgcataatt tttattacat aaatttaacc agagaatgtc acgcaatcca 1740 ttgtaaacat taaatgttta tcttttcatg atatcaactt gcgatcctga tgtgttaata 1800 aaaaacctca agttctcact tacagaaact tttgtgttat ttcacctaat ctttaggatt 1860 aatccttttt tcgtgagtaa tcttatcgcc agtttggtct ggtcaggaaa taaagaggag 1920 aaa 1923 <210> 8 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cbh ORF native <400> 8 atgtgtacag gattagcctt agaaacaaaa gatggattac atttgtttgg aagaaatatg 60 gatattgaat attcatttaa tcaatctatt atatttattc ctaggaattt taaatgtgta 120 aacaaatcaa acaaaaaaga attaacaaca aaatatgctg ttcttggaat gggaactatt 180 tttgatgatt atcctacctt tgcagatggt atgaatgaaa agggattagg gtgtgctggc 240 ttaaatttcc ctgtttatgt tagctattct aaagaagata tagaaggtaa aactaatatt 300 ccagtatata atttcttatt atgggtttta gctaatttta gctcagtaga agaggtaaag 360 gaagcattaa aaaatgctaa tatagtggat atacctatta gcgaaaatat tcctaataca 420 actcttcatt ggatgataag cgatataaca ggaaagtcta ttgtggttga acaaacaaag 480 gaaaaattaa atgtatttga taataatatt ggagtattaa ctaattcacc tacttttgat 540 tggcatgtag caaatttaaa tcaatatgta ggtttgagat ataatcaagt tccagaattt 600 aagttaggag atcaatcttt aactgcttta ggtcaaggaa ctggtttagt aggattacca 660 ggggacttta cacctgcatc tagatttata agagtagcat ttttaagaga tgcaatgata 720 aaaaatgata aagattcaat agacttaatt gaatttttcc atatattaaa taatgttgct 780 atggtaagag gatcaactag aactgtagaa gaaaaaagtg atcttactca atatacaagt 840 tgcatgtgtt tagaaaaagg aatttattat tataatacct atgaaaataa tcaaattaat 900 gcaatagaca tgaataaaga aaacttagat ggaaatgaaa ttaaaacata taaatacaac 960 aaaactttaa gtattaatca tgtaaattag 990 <210> 9 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cbh ORF codon optimised <400> 9 atgtgtaccg gtttggcatt ggagaccaag gatggtctcc acttatttgg tcgcaatatg 60 gatattgagt atagctttaa ccaatcgatt atttttatcc cgcgcaactt taaatgcgta 120 aataaatcta ataagaaaga actgactacg aaatatgcgg tcctcggtat ggggacgatt 180 ttcgatgatt atcccacgtt tgcagacggc atgaacgaaa agggtctggg gtgtgcgggt 240 cttaattttc ctgtgtacgt cagttatagt aaggaagaca tcgagggaaa aaccaatatt 300 ccggtatata acttcttgct gtgggttctg gcaaatttta gctcagtcga agaagtgaag 360 gaagcgttaa aaaatgccaa tatcgtggat attccgatta gcgaaaacat tccgaatact 420 acgttgcact ggatgatctc ggacattact ggcaaaagca ttgtggtaga acagactaaa 480 gaaaaactga atgtcttcga caacaatatc ggggttttaa ccaattctcc gacttttgac 540 tggcatgtag ctaacttgaa tcagtatgtg ggactgcgtt ataaccaagt cccggagttc 600 aaactgggcg accagtcttt aaccgcgctg ggccagggca ccggcctggt ggggctgccg 660 ggcgacttca cccctgcgtc acgcttcatt cgcgtagcat tccttcgcga tgcgatgatt 720 aaaaatgaca aagacagcat tgacctgatc gagttctttc atattttaaa taatgtggct 780 atggtacggg gctctacgcg cactgtggaa gaaaagagcg acttgaccca gtatacctca 840 tgcatgtgcc tggaaaaagg catttactac tacaatactt atgaaaataa tcagatcaat 900 gccatcgata tgaacaaaga gaacctggac ggtaatgaaa ttaaaaccta taaatacaat 960 aaaacgctgt cgatcaatca tgtcaactaa 990 <210> 10 <211> 359 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alr <400> 10 Met Gln Ala Ala Thr Val Leu Ile Asn Arg Arg Ala Leu Arg His Asn 1 5 10 15 Leu Gln Arg Leu Arg Glu Leu Ala Pro Ala Ser Lys Leu Val Ala Val 20 25 30 Val Lys Ala Asn Ala Tyr Gly His Gly Leu Ile Glu Thr Ala Arg Thr 35 40 45 Leu Pro Asp Ala 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Ser Ala Asp Thr Ile Ile Gly Glu Leu Ser Gly Met Ala Lys 100 105 110 Asp Phe Leu Ser His Pro Gly Gly Ile Ala His Phe Glu Gln Leu Arg 115 120 125 Leu Phe Phe Glu Ser Ser Leu Val Arg Tyr Ala Ala Glu His Ala Thr 130 135 140 Asp Glu Gln Ile Asp Leu Leu Ala Lys Ala Leu Glu Ile Asn Ser Gln 145 150 155 160 Ser Leu Asp Asn Asn Ala Ala Phe Ile Arg Ser Asp Val Asp Phe His 165 170 175 Arg Val Leu Ala Glu Ile Pro Gly Asn Pro Ile Phe Met Ala Ile His 180 185 190 Val Ala Leu Leu Asp Trp Leu Ile Ala Ala Arg Pro Thr Val Thr Asp 195 200 205 Gln Ala Leu His Glu His Asn Asn Val Ser Tyr Gln Gln His Ile Ala 210 215 220 Ile Val Asp Ala Ile Arg Arg His Asp Pro Asp Glu Ala Asp Arg Ala 225 230 235 240 Leu Gln Ser His Leu Asn Ser Val Ser Ala Thr Trp His Ala Phe Gly 245 250 255 Gln Thr Thr Asn Lys Lys Lys 260 <210> 12 <211> 512 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CadC <400> 12 Met Gln Gln Pro Val Val Arg Val Gly Glu Trp Leu Val Thr Pro Ser 1 5 10 15 Ile Asn Gln Ile Ser Arg Asn Gly Arg Gln Leu Thr Leu Glu Pro Arg 20 25 30 Leu Ile Asp Leu Leu Val Phe Phe Ala Gln His Ser Gly Glu Val Leu 35 40 45 Ser Arg Asp Glu Leu Ile Asp Asn Val Trp Lys Arg Ser Ile Val Thr 50 55 60 Asn His Val Val Thr Gln Ser Ile Ser Glu Leu Arg Lys Ser Leu Lys 65 70 75 80 Asp Asn Asp Glu Asp Ser Pro Val Tyr Ile Ala Thr Val Pro Lys Arg 85 90 95 Gly Tyr Lys Leu Met Val Pro Val Ile Trp Tyr Ser Glu Glu Glu Gly 100 105 110 Glu Glu Ile Met Leu Ser Ser Pro Pro Pro Ile Pro Glu Ala Val Pro 115 120 125 Ala Thr Asp Ser Pro Ser His Ser Leu Asn Ile Gln Asn Thr Ala Thr 130 135 140 Pro Pro Glu Gln Ser Pro Val Lys Ser Lys Arg Phe Thr Thr Phe Trp 145 150 155 160 Val Trp Phe Phe Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile Cys Val Ala Leu Val 165 170 175 Ala Phe Ser Ser Leu Asp Thr Arg Leu Pro Met Ser Lys Ser Arg Ile 180 185 190 Leu Leu Asn Pro Arg Asp Ile Asp Ile Asn Met Val Asn Lys Ser Cys 195 200 205 Asn Ser Trp Ser Ser Pro Tyr Gln Leu Ser Tyr Ala Ile Gly Val Gly 210 215 220 Asp Leu Val Ala Thr Ser Leu Asn Thr Phe Ser Thr Phe Met Val His 225 230 235 240 Asp Lys Ile Asn Tyr Asn Ile Asp Glu Pro Ser Ser Ser Gly Lys Thr 245 250 255 Leu Ser Ile Ala Phe Val Asn Gln Cys Gln Tyr Arg Ala Gln Gln Cys 260 265 270 Phe Met Ser Ile Lys Leu Val Asp Asn Ala Asp Gly Ser Thr Met Leu 275 280 285 Asp Lys Arg Tyr Val Ile Thr Asn Gly Asn Gln Leu Ala Ile Gln Asn 290 295 300 Asp Leu Leu Glu Ser Leu Ser Lys Ala Leu Asn Gln Pro Trp Pro Gln 305 310 315 320 Arg Met Gln Glu Thr Leu Gln Lys Ile Leu Pro His Arg Gly Ala Leu 325 330 335 Leu Thr Asn Phe Tyr Gln Ala His Asp Tyr Leu Leu His Gly Asp Asp 340 345 350 Lys Ser Leu Asn Arg Ala Ser Glu Leu Leu Gly Glu Ile Val Gln Ser 355 360 365 Ser Pro Glu Phe Thr Tyr Ala Arg Ala Glu Lys Ala Leu Val Asp Ile 370 375 380 Val Arg His Ser Gln His Pro Leu Asp Glu Lys Gln Leu Ala Ala Leu 385 390 395 400 Asn Thr Glu Ile Asp Asn Ile Val Thr Leu Pro Glu Leu Asn Asn Leu 405 410 415 Ser Ile Ile Tyr Gln Ile Lys Ala Val Ser Ala Leu Val Lys Gly Lys 420 425 430 Thr Asp Glu Ser Tyr Gln Ala Ile Asn Thr Gly Ile Asp Leu Glu Met 435 440 445 Ser Trp Leu Asn Tyr Val Leu Leu Gly Lys Val Tyr Glu Met Lys Gly 450 455 460 Met Asn Arg Glu Ala Ala Asp Ala Tyr Leu Thr Ala Phe Asn Leu Arg 465 470 475 480 Pro Gly Ala Asn Thr Leu Tyr Trp Ile Glu Asn Gly Ile Phe Gln Thr 485 490 495 Ser Val Pro Tyr Val Val Pro Tyr Leu Asp Lys Phe Leu Ala Ser Glu 500 505 510 <210> 13 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cbh <400> 13 Met Cys Thr Gly Leu Ala Leu Glu Thr Lys Asp Gly Leu His Leu Phe 1 5 10 15 Gly Arg Asn Met Asp Ile Glu Tyr Ser Phe Asn Gln Ser Ile Ile Phe 20 25 30 Ile Pro Arg Asn Phe Lys Cys Val Asn Lys Ser Asn Lys Lys Glu Leu 35 40 45 Thr Thr Lys Tyr Ala Val Leu Gly Met Gly Thr Ile Phe Asp Asp Tyr 50 55 60 Pro Thr Phe Ala Asp Gly Met Asn Glu Lys Gly Leu Gly Cys Ala Gly 65 70 75 80 Leu Asn Phe Pro Val Tyr Val Ser Tyr Ser Lys Glu Asp Ile Glu Gly 85 90 95 Lys Thr Asn Ile Pro Val Tyr Asn Phe Leu Leu Trp Val Leu Ala Asn 100 105 110 Phe Ser Ser Val Glu Glu Val Lys Glu Ala Leu Lys Asn Ala Asn Ile 115 120 125 Val Asp Ile Pro Ile Ser Glu Asn Ile Pro Asn Thr Thr Leu His Trp 130 135 140 Met Ile Ser Asp Ile Thr Gly Lys Ser Ile Val Val Glu Gln Thr Lys 145 150 155 160 Glu Lys Leu Asn Val Phe Asp Asn Asn Ile Gly Val Leu Thr Asn Ser 165 170 175 Pro Thr Phe Asp Trp His Val Ala Asn Leu Asn Gln Tyr Val Gly Leu 180 185 190 Arg Tyr Asn Gln Val Pro Glu Phe Lys Leu Gly Asp Gln Ser Leu Thr 195 200 205 Ala Leu Gly Gln Gly Thr Gly Leu Val Gly Leu Pro Gly Asp Phe Thr 210 215 220 Pro Ala Ser Arg Phe Ile Arg Val Ala Phe Leu Arg Asp Ala Met Ile 225 230 235 240 Lys Asn Asp Lys Asp Ser Ile Asp Leu Ile Glu Phe Phe His Ile Leu 245 250 255 Asn Asn Val Ala Met Val Arg Gly Ser Thr Arg Thr Val Glu Glu Lys 260 265 270 Ser Asp Leu Thr Gln Tyr Thr Ser Cys Met Cys Leu Glu Lys Gly Ile 275 280 285 Tyr Tyr Tyr Asn Thr Tyr Glu Asn Asn Gln Ile Asn Ala Ile Asp Met 290 295 300 Asn Lys Glu Asn Leu Asp Gly Asn Glu Ile Lys Thr Tyr Lys Tyr Asn 305 310 315 320 Lys Thr Leu Ser Ile Asn His Val Asn 325 <210> 14 <211> 1539 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CadC ORF <400> 14 atgcaacaac ctgtagttcg cgttggcgaa tggcttgtta ctccgtccat aaaccaaatt 60 agccgcaatg ggcgtcaact tacccttgag ccgagattaa tcgatcttct ggttttcttt 120 gctcaacaca gtggcgaagt acttagcagg gatgaactta tcgataatgt ctggaagaga 180 agtattgtca ccaatcacgt tgtgacgcag agtatctcag aactacgtaa gtcattaaaa 240 gataatgatg aagatagtcc tgtctatatc gctactgtac caaagcgcgg ctataaatta 300 atggtgccgg ttatctggta cagcgaagaa gagggagagg aaataatgct atcttcgcct 360 ccccctatac cagaggcggt tcctgccaca gattctccct cccacagtct taacattcaa 420 aacaccgcaa cgccacctga acaatcccca gttaaaagca aacgattcac taccttttgg 480 gtatggtttt ttttcctgtt gtcgttaggt atctgtgtag cactggtagc gttttcaagt 540 cttgatacac gtcttcctat gagcaaatcg cgtattttgc tcaatccacg cgatattgac 600 attaatatgg taaataaaag ttgtaacagc tggagttccc cgtatcagct ctcttacgcg 660 ataggcgtgg gtgatttggt ggcgacatca cttaacacct tctccacctt tatggtgcat 720 gacaaaatca actacaacat tgatgaaccg agcagttccg gtaaaacatt atctattgcg 780 tttgttaatc agtgccaata ccgtgctcaa caatgcttta tgtcgataaa attggtagac 840 aatgcagatg gttcaaccat gctggataaa cgttatgtca tcactaacgg taatcagctg 900 gcgattcaaa atgatttact ggagagttta tcaaaagcgt taaaccaacc gtggccacaa 960 cgaatgcagg agacgctcca gaaaattttg ccgcatcgtg gtgcgttatt aactaatttt 1020 tatcaggcac atgattattt actgcatggc gatgataaat cattgaaccg tgccagtgaa 1080 ttattaggtg agattgttca atcatcccca gaatttacct acgcgagagc agaaaaagca 1140 ttagttgata tcgtgcgcca ttctcaacat cctttagatg aaaaacaatt agcagcactg 1200 aacacagaaa tagataacat tgttacactg ccggaattga acaacctgtc cattatatat 1260 caaataaaag cggtcagtgc tctggtaaaa ggtaaaacag atgagtctta ccaggcgata 1320 aatactggca ttgatcttga aatgtcctgg ctaaattatg tgttgcttgg caaggtttat 1380 gaaatgaagg ggatgaaccg ggaagcagct gatgcatatc tcaccgcctt taatttacgc 1440 ccaggggcaa acacccttta ctggattgaa aatggtatat tccagacttc tgttccttat 1500 gttgtacctt atctcgacaa atttcttgct tcagaataa 1539

Claims (27)

  1. i. 담즙염 가수분해효소 유전자(bile salt hydrolase gene), 및
    ii. 상기 담즙염 가수분해효소 유전자에 작동 가능하게 연결된 시알산-반응성 프로모터(sialic acid-responsive promoter)
    를 포함하는 발현 카세트(expression cassette).
  2. 제1항에 있어서, 담즙염 가수분해효소 유전자가, 바람직하게는 서열번호: 13 또는 그의 기능적 변이체에 제시된 아미노산 서열을 암호화(encoding)하는, 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens)로부터의 Cbh 단백질-암호화 폴리뉴클레오티드 서열인 발현 카세트.
  3. 제2항에 있어서, Cbh 단백질-암호화 폴리뉴클레오티드 서열이 서열번호: 8 또는 서열번호: 9에 제시된 핵산 서열과 적어도 80% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것인 발현 카세트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시알산-반응성 프로모터가, 바람직하게는 서열번호: 4 또는 그의 기능적 변이체에 제시된 핵산 서열을 포함하는 이.콜라이(E. coli)로부터의 pNanA인 발현 카세트.
  5. 제4항에 있어서, pNanA의 억제인자(repressor)가 시알산의 부재 하에 pNanA의 발현이 있을 때 pNanA의 상류에 위치하며, 여기서 바람직하게는 억제인자는, 바람직하게는 서열번호: 11 또는 그의 기능적 변이체에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는, NanR 단백질-암호화 폴리뉴클레오티드 서열인 발현 카세트.
  6. 제5항에 있어서, NanR 단백질-암호화 폴리뉴클레오티드 서열이 서열번호: 5에 제시된 핵산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것인 발현 카세트.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, NanR에 작동 가능하게 연결된 구성적 프로모터를 추가로 포함하고, 여기서 프로모터는 AraC와 함께 pBad; rbs2, rbs3 또는 rbs5와 함께 J23108; 및 rbs4와 함께 J23113을 포함하는 군으로부터 선택된 것인 발현 카세트.
  8. 제7항에 있어서, NanR에 작동 가능하게 연결된 구성적 프로모터가 J23113-rbs4인 발현 카세트.
  9. 제8항에 있어서, 바람직하게는 서열번호: 6 또는 그의 기능적 변이체에 제시된 핵산 서열을 포함하는, J23113-rbs4-NanR을 포함하는 것인 발현 카세트.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, Cbh의 발현을 증가시키기 위한 활성인자 및 프로모터, 예컨대 전사 활성인자 CadC 단백질-암호화 서열 및 프로모터 pCadBA를 추가로 포함하고, 여기서 CadC는 pNanA의 하류에 그리고 제어 하에 위치하고 pCadBA는 CadC의 하류에 위치하고 담즙염 가수분해효소 Cbh 단백질-암호화 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 것인 발현 카세트.
  11. 제10에 있어서, 활성인자 및 프로모터 핵산 서열이 서열번호: 7 또는 그의 기능적 변이체에 제시된 것인 발현 카세트.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 카세트가 하나 이상의 플라스미드 벡터에 포함되는 것인 발현 카세트.
  13. 제12항에 있어서, 플라스미드 벡터가, 바람직하게는 서열번호: 1 또는 그의 기능적 변이체에 제시된 핵산 서열을 포함하는 pEaat인 발현 카세트.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 그의 제거를 가능하게 하기 위해 FRT 부위에 의해 플랭킹된(flanked) 항생제 내성 유전자를 추가로 포함하는 발현 카세트.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, cbh에 대한 유전자 폴리뉴클레오티드 서열이, 예컨대 서열번호: 9에 제시된 바와 같이, 프로바이오틱 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 것인 발현 카세트.
  16. 제15항에 있어서, cbh에 대한 유전자 폴리뉴클레오티드 서열이 이. 콜라이 종, 박테로이데스 종, 클로스트리디움 종, 파에칼리박테리움 종, 락토코커스 락티스, 및 락토바실러스 종을 포함하는 군으로부터 선택된 프로바이오틱 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 것인 발현 카세트.
  17. 담즙염 가수분해효소 단백질의 재조합 생산을 위한, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트의 용도.
  18. a) 프로바이오틱 박테리아; 및
    b) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 발현 카세트
    를 포함하는 조성물로서,
    여기서 프로바이오틱 박테리아는 담즙염 가수분해효소의 생산을 위한 발현 카세트를 포함하는 것인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 프로바이오틱 박테리아가 이. 콜라이 종, 박테로이데스 종, 클로스트리디움 종, 파에칼리박테리움 종, 락토코커스 락티스, 및 락토바실러스 종을 포함하는 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 프로바이오틱 박테리아가 영양요구성(auxotrophic)인 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 영양요구성 박테리아가 알라닌 라세마제 유전자가 결실되어 D-알라닌의 부재 하에 분열할 수 없는 것인 조성물.
  22. 씨. 디피실레 감염 (CDI) 및/또는 재발성 CDI (rCDI)를 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물.
  23. 제22항에 있어서, CDI 및/또는 rCDI가 디스바이오시스에 기인한 것인 조성물.
  24. 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 정의된 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 이러한 치료 또는 예방 방법.
  25. 제24항에 있어서, 대상체가 씨. 디피실레 감염 (CDI) 또는 재발성 CDI를 갖는 것인 방법.
  26. CDI 및/또는 rCDI의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한, 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  27. 제26항에 있어서, CDI 및/또는 rCDI가 디스바이오시스(dysbiosis)로 인한 것인 용도.
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