KR20210145499A

KR20210145499A - 유기산 기체를 이용한 박과 식물 종자의 살균 방법

Info

Publication number: KR20210145499A
Application number: KR1020200062470A
Authority: KR
Inventors: 류지훈; 신혜정
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2020-05-25
Publication date: 2021-12-02

Abstract

본 발명은 유기산 기체를 이용한 박과 식물 종자의 살균 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 특정 상대습도와 온도 조건에서 특정 유기산을 자연 기화하도록 유도함으로써 박과 종자의 발아율은 저해하지 않으면서 박과 종자에 존재하는 식물병원균과 식중독균을 멸균시키기 위한 살균 방법에 관한 것이다.

Description

유기산 기체를 이용한 박과 식물 종자의 살균 방법{Method for sterilizing Cucurbitaceae seeds using organic acid vapor}

본 발명은 유기산 기체를 이용한 박과 식물 종자의 살균 방법에 관한 것이다.

박과 종자의 유해미생물 감염현황 및 경제적 손실은 다음과 같다.

아시도보락스 시트룰리(Acidovorax citrulli)는 그람 음성균으로 편모를 이용한 운동능력을 지니고 있는 세균이다. 수박 등 박과 종자에서 과일썩음병(Bacterial fruit blotch, BFB)를 발생시키며, 작물 표면에 올리브색의 반점이 생기고 썩게 하여 박과 작물 산업에 경제적 손해를 야기시켰다. 또한, 1989년도에 미국의 수박 재배 지역에서 발견되어, 전체 수박의 수확량 손실을 야기한 사례가 있으며 멜론, 호박 등 박과 작물에 BFB를 유발하여 작물에 피해를 준 사례도 다양하다.

살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)는 장내세균과에 속하는 그람 음성균으로, 주로 질병을 유발하는 아종은 S. enterica supspecies enterica (I)으로 알려져 있다. 살모넬라의 감염으로 인한 증상은 발열, 복통, 설사, 구토와 같은 가벼운 증상뿐만 아니라, 혈액을 동반한 설사와 같은 심각한 질병을 동반하기도 한다. 살모넬라가 포함된 박과 작물을 섭취함으로써 감염된 보고는 허니듀멜론과 Cantaloupe 멜론으로, 이를 섭취하여 질병을 앓은 137개의 사례가 2019년도 미국의 10개주에서 보도된 바 있다.

장출혈성 대장균(Escherichia coli O157:H7)은 병원성 E. coli 균주에 속하는 그람음성균이며 시가독을 생성하는 장출혈성 균으로, 출혈성 대장염과 용혈성 요독 증후군과 같은 심각한 질병을 유발한다. 박과 작물을 섭취하며 발생한 E. coli O157:H7 감염에 대한 사례로는 1993년도 미국에서 Cantaloupe를 섭취하여 보고된 27명의 케이스, 2000년도 미국에서 수박을 섭취하여 보고된 23명의 케이스 등이 있다.

리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)는 병원성을 지닌 그람양성균으로, 0.4℃의 낮은 온도와 pH 4.4의 낮은 pH에서 생존할 수 있기 때문에 우유, 가금류, 가축의 분변 등 다양한 오염원에 존재한다. 리스테리아 모노사이토제네스에 의해 리스테리아병(Listeriosis)가 발병되면, 다양한 질병에 노출될 수 있으며 특히, 노인과 임산부와 같은 면역력이 약한 환자에게 패혈증 또는 뇌수막염을 유발할 수 있다. 리스테리아병은 작물을 섭취하여 발생한 사례가 있는데, 이는 미국 28개 주에서 147 케이스가 리스테리아 모노사이토제네스에 의한 감염이라 보고되었으며, 이는 콜로라도 주에 있는 Jensen Farms로부터 재배된 Cantaloupe의 섭취에 의한 것이라 보고되었다.

식중독 집단 발병을 일으킨 박과 작물 오염은 대부분 종자 상태에서 이미 식중독균에 오염되어 있는 것으로 알려져 있다. 그러므로 박과 종자에서 식중독균과 같은 유해미생물을 제어하는 것이 중요하다.

또한, 작물이 재배되는 환경은 미생물이 성장하기에 적당한 온도와 습도를 제공하기 때문에 박과 작물 종자에 낮은 수준으로 병원균이 오염되어 있다고 하더라도 작물 생산의 최종 단계에서 병원균이 높은 수준으로 존재할 수 있다. 그러므로, 종자의 오염 제거 과정을 통해 종자에 존재하는 식물병원균이나 식중독균을 단순히 저감화하는 것이 아니고 완전히 제거해야만 궁극적으로 작물이 이러한 병원균으로부터 오염되는 것을 예방할 수 있다.

즉, 박과 작물에서 문제가 되는 식중독균 또는 식물병원균 등 종자에 존재하는 유해미생물은 대부분 종자 자체에서 기인한다.

종자에 존재하는 유해미생물들은 살균소독제 처리 등으로 저감화가 되더라도 완전 멸균하지 않으면 작물의 발아와 재배과정에서 다시 증식하여 식물병, 식중독, 부패 등의 문제를 일으키게 된다.

그러므로 종자의 유해미생물 살균기술은 유해미생물을 멸균시킬 수 있어야 하며, 동시에 종자의 발아율에 영향을 주어서는 안된다.

기존에 종자 살균을 위해 가장 많이 사용되는 방법은 액상의 살균소독제에 종자를 침지시키는 방법이다. 종자 처리에 자주 이용되는 액상의 살균소독제로는 차아염소산칼슘, 차아염소산나트륨, 이산화염소, 과산화수소, 에탄올, 그리고 유기산 등이 있다

그러나, 많은 연구자들이 이러한 액체 살균소독제들을 사용한 경우에 종자에 접종된 균이 검출한계 이하로 저감화가 가능하였지만 완전 멸균시키기는 어렵다고 보고하여 왔다. 그래서 종자에 오염된 식물병원균이나 식중독균을 멸균하기 위하여 액상의 살균소독제와 함께 다른 종류의 스트레스들 (건조 또는 건열처리)를 조합하기도 한다. 특히, Beuchat (1997)은 액체상 살균제를 이용하였을 때, 종자에 존재하는 균을 완전히 제거하기 어려운 이유는 종자의 균일과 틈새에 병원균이 갇히게 되어, 액상 화학제가 접근하기 힘들다고 추측하였다[비특허문헌 1]. 이러한 종자살균의 단점을 극복할 방안으로 기체상 살균제의 장점들이 주목받고 있다. 즉, 기체상 살균소독제는 종자의 균일과 틈새에 침투하기가 용이하기 때문에 병원균은 살균하는데 더 효율적일 수 있다. Han et al. (2001)는 기체상 이산화염소 살균제는 액상 이산화염소 살균제에 비해 침투력이 우수하여 살균 효능이 증대된다고 보고하였다 [비특허문헌 2]. 또한, 종자의 수분함량에 변화를 많이 주지 않기 때문에 종자의 건조과정이 최소화되기 때문에 종자의 발아율에도 상대적으로 영향을 적게 미칠 것이다.

유기산은 살균소독제로 이용될 수 있으며, 유기산은 항균력이 있고, 식품의 품질을 보존하는데 도움을 주고, 가격이 저렴한 살균제이다. 특히, 일부 유기산은 FDA에서 승인된 안전한 물질(GRAS)로 지정되어 있다.

이제까지 유기산을 이용하여 식품에 존재하는 유해미생물을 제어하고자 하는 노력은 다양하게 보고가 되어 왔다. 예를 들면, 부티르산은 가금류 표면에 존재하는 Salmonella 살균에, 젖산은 육류의 표면에 존재하는 세균을 제거하는데, 포름산은 닭의 사료 또는 작물에 존재하는 살모넬라를 제거하여 연구가 진행되었다[비특허문헌 3~5]. 이러한 유기산을 이용한 식품 또는 종자들에 대한 살균 연구는 대부분 액체 상의 유기산을 이용하여 진행되어 왔다.

유기산은 염소 세척의 좋은 대체제가 되지만, 액체로 이용하게 되면 여전히 종자 내부로의 침투가 제한되고 표면 습윤을 일으킨다는 단점이 있다.

이러한 건조 또는 침지 소독(액상 처리) 등의 기존 기술들이 종자에서 유해미생물에 대한 저감화 효과가 미비하거나 종자의 발아율을 저하시키는 단점, 화학적 살균제가 종자에 잔류하는 문제점을 해결하기 위한 종자 살균법이 필요한 실정이다.

Beuchat, L. R. 1997. Comparison of chemical treatments to kill Salmonella on alfalfa seeds destined for sprout production. International Journal of Food Microbiology. 34: 329-333 Han, Y., Linton, R. H., Nielsen, S. S. and Nelson, P. E. 2001. Reduction of Listeria monocytogenes on green peppers(Capsicum annuum. L) by gaseous and aqueous chlorine dioxide and water washing and its growth at 7 C. Journal of food protection. 64(11): 1730-1738. Immerseel, F. V, Boyen, F., Gantois, I., Timbermont, L., Bohez, L., Pasmans, F., Haesebrouk, F. and Ducatelle, R. 2005. Supplementation of coated butyric acid in the feed reduces colonization and shedding of Salmonella in poultry. Poultry Science. 84:1851- 1856.

Pipek, P., Houska, M., Jelenkova, J., Kyhos, K., Hoke, K., Sikulova. 2004. Microbial decontamination of beef carcasses by combination of steaming and lactic acid spray. Journal of Food Engineering. 67(3): 309-315. Thompson, J. L., Hinton, M. 1997. Antibacterial activity of formic and propionic acids in the diet of hens on salmonellas in the crop. British Poultry Science. 38: 59-65.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 박과 작물 종자의 살균에 최적화된 유기산 기체, 온도 및 상대습도 조건을 찾아냄으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 박과 종자의 발아율을 저해하지 않으면서 종자에 존재하는 식물병원균과 식중독균들을 멸균시키기 위한 박과 식물 종자의 살균 방법을 제공하는데 있다.

건조 또는 침지 소독 (액상 처리) 등의 기존 기술들이 종자에서 유해미생물에 대한 저감화 효과가 미비하거나 종자의 발아율을 저하시키는 단점, 화학적 살균제가 종자에 잔류하는 문제점이 있었다.

유기산 기체를 이용하여 박과 식물 종자 내에 존재하는 미생물을 완전히 제거하는 기술에 대해서는 알려진 바 없다.

본 발명의 일 구현예에서, 살균의 대상이 되는 박과 식물 종자의 종류는 제한되지 않으나, 예를 들어, 오이, 수세미, 여주, 호박, 멜론 및 수박 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 유기산은 아세트산 또는 프로피온산일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 아세트산 기체 또는 프로피온산 기체의 농도는 90 내지 300 mg/L일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 농도가 높을수록 살균력은 우수할 수 있으나, 상기 농도를 초과하는 경우에는 종자의 발아율이 저하될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 유기산 기체의 처리는 45 내지 55℃ 의 온도 조건에서 수행될 수 있다. 유기산 기체의 처리 온도가 미생물 살균 효과 및 식물 종자의 발아율에 미치는 영향을 확인한 결과, 상기 온도 범위에서 박과 식물 종자의 발아율에 영향을 미치지 않고, 미생물 살균 효과가 극대화됨을 확인할 수 있었다.

본 발명의 일 구현예에서, 유기산 기체의 처리는 35 내지 50%(40 내지 46%) 또는 80% 이상(85% 내지 99%)의 상대습도 조건에서 수행될 수 있다. 유기산 기체의 처리 시, 상대습도가 미생물 살균 효과 및 박과 식물 종자의 발아율에 미치는 영향을 확인한 결과, 상기 범위에서 식물 종자의 발아율에 영향을 미치지 않고, 미생물 살균 효과가 극대화됨을 확인할 수 있었다.

본 발명의 일 구현예에서, 유기산 기체의 처리는 유기산 종류, 상기 범위의 온도 및 상대습도를 조합한 조건 하에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 아세트산 또는 프로피온산 기체의 처리는 45 내지 55℃의 온도 및 35 내지 50% 또는 80% 이상의 상대습도 조건에서 수행될 수 있다. 세 가지 조건을 모두 조합하는 경우, 박과 식물 종자 내에 존재하는 위해 미생물의 저감 효과를 극대화할 수 있다.

상기 유해 미생물은 식물병원균 또는 식중독균일 수 있으며, 구체적으로 식물병원균은 아시도보락스 시트룰리(Acidovorax citrulli)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 식중독균은 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 장출혈성 대장균(Escherichia coli O157:H7) 및 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 중에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 유기산 기체 발생부; 박과 식물 종자 처리부; 및 상기 유기산 기체 발생부에서 발생되는 유기산 기체와 상기 박과 식물 종자 처리부에 존재하는 박과 식물 종자를 접촉시키기 위하여, 상기 유기산 기체 발생부 및 상기 박과 식물 종자 처리부를 연결하는 연결부를 포함하는 박과 식물 종자 살균 장치를 포함한다 (도 1).

본 발명에 따른 박과 식물 종자 살균 장치는 유기산 기체를 박과 식물 종자에 접촉시킬 수 있는 형태라면 어떤 구성을 취하여도 무방하다.

일 구현예에서, 유기산 기체 발생부 및 박과 식물 종자 처리부를 연결하는 연결부는 유기산 기체 투입량 조절용 밸브를 추가로 포함할 수 있다. 기체 투입량 조절 밸브를 추가함으로써, 식물 종자에 처리되는 유기산 기체의 양을 조절할 수 있다.

본 발명은 또한, 외부 용기; 및 유기산 기체 발생부 및 상기 유기산 기체 발생부 상단의 이격된 위치에 구비되는 식물 종자 처리부를 포함하는 내부 용기를 포함하는 박과 식물 종자 살균 장치를 제공한다.

일 구현예에서, 외부 용기는 밀폐 용기일 수 있다. 밀폐된 용기를 사용하여, 발생된 유기산 기체가 외부로 빠져나가는 것을 방지할 수 있다. 외부 용기를 밀폐시키기 위하여, 외부 용기는 뚜껑 및 클립을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 박과 식물 종자 처리부는 기체 투과성 플레이트를 포함할 수 있다. 기체 투과성 플레이트를 통하여, 유기산 기체 발생부로부터 발생한 유기산 기체가 식물 종자 처리부에 전달되어, 상기 유기산 기체를 박과 식물 종자에 접촉시킴으로써, 박과 식물 종자를 살균할 수 있다.

일 구현예에서, 외부 용기 외측에 구비되는 유기산 기체 농도 측정부를 추가로 포함할 수 있다. 유기산 기체 농도 측정부는 주입부, 상기 주입부를 연결하는 실리콘 튜브, 밸브 및 스탑콕을 포함할 수 있다. 유기산 기체의 농도를 측정하여, 용기 내의 유기산 기체의 농도를 적절하게 유지할 수 있다. 스탑콕은 외부 용기와 주입부 튜브의 연결관이다. 유기산 기체의 농도 측정 시, 유기산 기체 측정 검지관을 주입부에 삽입하고, 밸브를 열어 유기산 기체가 검지관으로 유입될 수 있는 상태로 만들어준다. 검지관의 펌프를 잡아 당겨 용기 내의 유기산 기체를 검지관으로 유입시킴으로써, 유입된 유기산 기체의 농도를 측정할 수 있다.

본 발명의 유기산 기체를 이용한 박과 식물 종자의 살균 방법은 건조 또는 침지 소독(액상 처리) 등의 기존 기술들이 종자에서 유해미생물에 대한 저감화 효과가 미비하거나 종자의 발아율을 저하시키는 단점, 화학적 살균제가 종자에 잔류하는 문제점을 극복하였다. 즉, 본 발명은 박과 식물 종자의 발아율을 유지하면서, 종자에 존재하는 식물병원균 또는 식중독균을 멸균시킬 수 있다. 또한, 액상 유기산에 비해 처리하는 양이 적어 경제적이며, 직접적으로 처리하지 않기 때문에 종자의 표면 변화를 최소화할 수 있다.

도 1은 유기산 기체 생성 및 종자 처리를 위해 제작된 밀폐용기를 나타낸다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[실시예]

실시예 1: 유기산 기체 생성 및 종자 처리를 위한 밀폐용기 제작

휘발성 유기산을 자연 기화되도록 유도하여 기체를 생성하고, 기화된 유기산 기체를 종자에 처리하기 위한 장치를 제작하였다.

유기산 기체 생성 및 종자 처리를 위한 장치는 크게 유기산 용액으로부터 유기산 기체가 발생되는 기체발생부와 발생된 이산화염소 기체가 종자에 처리될 수 있는 종자처리부로 구분된다.

도 1에 실제 실험에 사용한 박과 식물 종자 살균 장치를 도시하였다.

뚜껑을 닫아 밀폐시킬 수 있는 외부용기, 유기산 기체 발생부 및 박과 식물 종자 처리부를 포함하는 내부 용기가 있고, 상기 내부 용기 윗면에는 유기산 용액을 담아 유기산 기체를 발생시킬 수 있는 폴리스틸렌(polystyrene) 재질의 디쉬(100 mm × 40 mm)가 존재한다. 상기 디쉬 상에, 유기산 기체가 박과 작물 종자에 처리될 수 있도록 ventilation hole (40.00 mm hole size와 0.053 mm mesh pore size)이 포함된 기체투과용 채반 (lid; 100 mm × 40 mm)으로 존재한다.

실시예 2: 휘발성 유기산의 선별

본 실험에서는 아세트산, 프로피온산, 포름산을 1.8 L airtight container에서 100 mg/L가 되도록 각각 158 μL, 168 μL, 141 μL 분주하여 1시간 이내로 완전히 기화되는 것을 확인하였다.

상대습도를 43%로 조절하기 위하여 실시예 1에서 제작된 밀폐용기에 150 mL 의 탄산칼륨 (potassium carbonate) 포화 용액을 넣었으며, 상대습도를 85%로 조절하는 경우에는 150 mL 의 염화칼륨 (potassium chloride) 포화용액을 밀폐용기에 넣었다. 포화용액이나 물을 넣은 후, 밀폐용기를 닫고, 24시간 동안 50℃에 저장하였다.

유기산 용액은 아세트산 (99.7%), 프로피온산 (99.5%), 포름산 (96.0%)를 준비하였다.

먼저, 실시예 1에서 제작된 밀폐용기의 상대습도를 43% 또는 85%로 조절한 후, 아세트산, 프로피온산, 또는 포름산 용액을 각각 158, 168, 141 μL를 용기의 유기산 기체 발생부에 넣고, 50℃에서 1시간 동안 저장하면서 액상 유기산이 완전히 자연 기화된 것을 확인하였다.

그 결과, 100 mg/L가 되도록 각각 158 μL, 168 μL, 141 μL 분주한 유기산 3종 (아세트산, 프로피온산, 포름산)이 1.8 L 밀폐용기 내부에 있는 디쉬에서 1시간 이내로 완전히 기화되는 것을 육안으로 확인하였다.

실시예 3: 유기산(아세트산, 프로피온산, 포름산) 기체, 습도, 온도 처리가 박과 식물(오이, 허니듀멜론, 수박) 종자의 발아율에 미치는 영향 확인

박과(오이, 허니듀, 수박) 종자의 발아율에 영향을 주지 않는 유기산(아세트산, 프로피온산, 포름산) 기체 처리 조건을 확인하였다.

상대습도를 43%로 조절하기 위하여 실시예 1에서 제작된 밀폐용기에 150 mL의 탄산칼륨 (potassium carbonate) 포화 용액을 넣었으며, 상대습도를 85%로 조절하는 경우에는 150 mL의 염화칼륨 (potassium chloride) 포화용액을 밀폐 용기에 넣었다. 그 후, 50℃에서 24시간 동안 저장하였다. (주) 코레곤으로부터 제공받은 오이 (Cucumis sativus), 허니듀 멜론(Cucumis melo), 그리고 수박 (Citrulllis lanatus)를 각각 5 g씩 계량하여 멸균 채반에 펼쳐두었다.

상대습도가 43% 또는 85%로 조절된 밀폐용기 내부에 있는 페트리디쉬 위에 아세트산, 프로피온산, 포름산 액체가 기화되었을 때 100 mg/L of air가 되도록 각각 158, 168, 141 μL 분주한 후, 박과 종자가 놓여진 멸균 채반을 디쉬 위에 두었다. 상대습도와 종자가 놓여진 dish가 포함된 용기를 용기의 뚜껑을 이용하여 밀폐시킨 후에 50℃로 맞춰진 배양기에서 1 시간 또는 2 시간 동안 노출시켰다.

50℃ 배양기에서 최대 2 시간 처리를 마친 밀폐 용기를 laminar flow biosafety hood (22±2℃)에 둔 후 밀폐 용기의 뚜껑을 열어 내부에 종자가 포함된 멸균 채반을 멸균 핀셋을 이용하여 꺼내 클린 벤치 위에 놓아두었다. 유기산 기체를 처리한 또는 처리하지 않은 50 개의 종자들을 멸균 핀셋을 이용하여 발아용기 (1.1 L, 240 mm long × 150 mm wide × 50 mm high) 내부에 있는 pleated filter paper (50 double pleats)에 위치하였다. 종자와 pleated paper가 포함된 발아 용기에 30 mL의 증류수를 분주한 후, 변온 인큐베이터 (20℃로 6시간, 30℃로 8시간)에 최대 8일 또는 14일 동안 치상하였다. 허니듀멜론과 오이 종자는 5 일간 재배한 후, 1차 발아율을 측정하였고, 8 일간 재배 후 2차 발아율을 측정하였다. 수박 종자는 5일간 재배한 후, 1차 발아율을 측정하였고, 14일간 재배 후 2차 발아율을 측정하였다. 발아율은 국립종자검정협회(ISTA)의 지침서에 따라 측정하였으며, 퍼센트(%)로 산출되었다.

다음 표 1은 아세트산, 프로피온산, 또는 포름산 기체 (100 mg/L of air)를 43% 또는 85% 상대습도와 50℃에서 2시간 동안 처리한 또는 처리하지 않은 (0 mg/L of air) 오이 종자의 1차 또는 2차 발아율을 나타낸 결과이다.

다음 표 2는 아세트산, 프로피온산, 또는 포름산 기체 (100 mg/L of air)를 43% 또는 85% 상대습도와 50℃에서 2시간 동안 처리한 또는 처리하지 않은 (0 mg/L of air) 허니듀멜론 종자의 1차 또는 2차 발아율을 나타낸 결과이다.

다음 표 3은 아세트산, 프로피온산, 또는 포름산 기체 (100 mg/L of air)를 43% 또는 85% 상대습도와 50℃에서 2시간 동안 처리한 또는 처리하지 않은 (0 mg/L of air) 수박 종자의 1차 또는 2차 발아율을 나타낸 결과이다.

아무런 처리도 하지 않은 오이, 허니듀멜론, 수박 종자의 1차 발아율은 각각 ca. 92.0, 93.3, 87.3% 그리고 2차 발아율은 98.7, 98.7, 98.0%였다. 오이, 허니듀멜론, 수박 종자는 유기산 기체 없이 43% 또는 85%와 50℃에서 최대 2시간 처리했을 때, 종자의 발아율은 각각 90.0-98.0%, 94.0-98.7%, 85.3-98.7%를 보였고, 상대습도가 증가함에 따라 유의적인 차이를 보이지 않았다 (P > 0.05). 아세트산 또는 프로피온산 (ca. 100 mg/L of air)를 처리하였을 때, 3종의 종자는 상대습도와 처리시간에 관계 없이 유의적인 발아율 감소를 보이지 않았다 (P > 0.05). 반면, 포름산 (ca. 100 mg/L of air)을 처리한 경우, 실험된 모든 상대습도와 처리 시간에서 오이, 허니듀멜론, 또는 수박 종자의 발아율이 유의적으로 감소한 것(P≤0.05)을 확인하였다. 결과적으로, 포름산 (ca. 100 mg/L of air)은 50℃에서 실험된 상대습도와 처리시간에 상관없이 오이, 허니듀멜론, 또는 수박 종자의 발아율을 유의적으로 감소시켰기 때문에(P≤0.05) 이어지는 유기산 기체들의 종자에 접종된 미생물들에 대한 항균력 측정 시험에서 제외되었다.

실시예 4: 박과 식물(오이, 허니듀멜론, 수박) 종자에 접종된 식물병원균 에 대한 유기산 기체 (아세트산, 프로피온산)의 살균력 확인

박과 식물(오이, 허니듀멜론, 수박) 종자에 존재하는 식물병원균 아시도보락스 시트룰리(Acidovorax citrulli)에 대한 유기산 기체의 살균 효과를 확인하였다.

5 종류의 A. citrulli 균주인 KACC 17000 (수박에서 분리), KACC 17001 (수박에서 분리), KACC 17005 (수박에서 분리), KACC 17909 (수박에서 분리), KACC 17910 (수박에서 분리)가 실험에 이용되었다. 냉동 보존된 5 종류의 A. citrulli 균주를 각각 10 mL NB(nutrient broth)에 접종하여 30℃에서 48시간 배양하여 활성화시킨 후, 30℃에서 48시간 간격으로 세 차례 계대 배양하였다. 계대 배양된 5 가지 균주의 A. citrulli를 각 균주별로 2 mL씩 혼합하여 총 10 mL의 A. citrulli 혼합액 (ca. 9.0 log CFU/mL)을 제조하였다. 10 mL의 A. citrulli 혼합액은 상온 (22±2℃)에서 15분간 원심분리(2,002 Х g)되었다. 원심분리 후 상등액을 제거하여 얻어진 pelleted cells에 PBS(phosphate-buffered saline)[pH 7.4]를 사용하여 균질화시켰다. 위의 과정을 한번 더 반복하여 얻은 균질액을 PBS를 이용하여 십진 희석한 후, A. citrulli 접종액 (ca. 8.0 log CFU/mL)을 제조하였다.

미생물을 접종하기 이전에 박과 식물 종자에 존재하는 미생물을 제거하기 위하여, 5 g의 오이, 허니듀멜론, 수박 종자를 각각 50 mL 코니칼 튜브에 넣어 parafilm을 이용하여 밀봉한 후, 10 kGy의 감마선을 조사하였다. 앞에서 언급된 방법에 의하여 준비된 15 mL의 A. citrulli 접종액을 5 g의 멸균된 오이, 허니듀멜론, 수박 종자가 포함된 50 mL 코니칼 튜브에 각각 분주하고 5분간 배양하였다. 배양을 마친 후, 멸균 수저를 이용하여 균액이 접종된 종자를 멸균 체 (75 mm diameter, 600 μm pore size)에 펼쳐놓은 후, laminar flow biosafety hood (22±2℃)에서 2시간 동안 건조하였다. 2 시간 후, A. citrulli가 접종된 오이, 허니듀멜론, 수박 종자 5 g을 멸균 수저를 이용하여 멸균 채반 (lid) 위에 위치시켰다. 50℃의 온도에서 43% 또는 85%로 습도가 조절된 1.8 L 용기에 위치한 디쉬 위에 아세트산 (158 μL) 또는 프로피온산 (168 μL)을 분주하여 100 mg/L of air가 자연 기화되도록 하여, 종자가 놓인 멸균 채반을 용기 내부의 디쉬 위에 놓아두었다. 1.8 L 용기는 뚜껑을 이용하여 바로 밀폐시킨 후, 1시간 또는 2시간 동안 50℃에 두었다. 대조군으로는 균이 접종된 종자가 포함된 밀폐용기를 동일한 조건에서 유기산 기체를 처리하지 않고 50℃에 1시간 또는 2시간 동안 두었다.

1시간 또는 2시간 동안 유기산 기체에 노출되었거나 노출되지 않은 오이, 허니듀멜론, 수박 종자(3 g)는 각각 30 mL의 멸균된 NB가 포함된 멸균 균질기 봉지에 넣은 후, 1분간 균질화시켰다. 이를 멸균 시험관에 담은 후, 0.1% 펩톤수를 이용하여 단계적으로 희석하고 NA(Nutrient agar)에 평판 도말한 후 30℃에서 48시간 배양하여 형성된 집락 수를 측정하였다. 증균 결과를 확인하기 위해 30℃에서 48시간 배양한 A. citrulli 균질액은 NA에 stresking하여 48시간 뒤에 형성된 콜로니를 확인하였다.

다음 표 4는 1.8 L 밀폐용기에서 43% 또는 85% 상대습도와 50℃에서 유기산 기체 (아세트산 또는 프로피온산; 100 mg/L of air)를 최대 1시간 동안 처리한 또는 처리하지 않았을 때 (0 mg/L of air) 오이, 허니듀멜론, 수박 종자에 존재하는 A. citrulli의 개체 수를 나타낸다[아가 플레이팅에 대한 검출 한계는 1.0 log CFU/g (10 CFU/g)였다. 증균 배양(enrichment)에 의한 검출 한계는 -0.5 log CFU/g (1 CFU/3 g)였다].

오이, 허니듀멜론, 수박 종자에 부착된 A. citrulli의 초기 개체 수는 각각 ca. 6.9, 7.1, 6.8 log CFU/g이었다. 43% 또는 85% 상대습도 그리고 50℃에서 유기산 기체 없이 최대 1시간 배양하였을 때 (대조군), 오이 또는 허니듀멜론 종자에 존재하는 A. citrulli의 개체 수는 ca. 2.1 - 2.4 log CFU/g (43% RH) 만큼 감소하였고, 3.3 - 3.4 log CFU/g (85% RH) 감소하였다. 앞선 조건에서 수박 종자에 존재하는 A. citrulli의 개체 수의 개체 수는 4.0 log CFU/g (43% RH) 그리고 4.9 log CFU/g (85% RH) 만큼 감소하여, 상대습도가 증가함에 따라 3종의 박과 종자에 부착된 A. citrulli의 개체 수가 유의적으로 감소 (P ≤ 0.05)하는 것을 확인하였다. 43% 또는 85% 상대습도와 50℃에서 아세트산 기체 (ca. 100 mg/L of air)에 1시간 동안 노출시켰을 때, 오이, 허니듀멜론, 수박 종자에 접종된 A. citrulli의 개체 수는 모두 완전 멸균되었다 (<-0.5 log CFU/g).

실시예 5: 박과 식물 (오이, 허니듀멜론, 수박) 종자에 접종된 식중독균 에 대한 유기산 기체 (아세트산, 프로피온산)의 살균력 확인

박과 식물(오이, 허니듀멜론, 수박) 종자에 존재하는 식중독균 S. enterica, E. coli O157:H7, L. monocytogenes에 대한 유기산 기체 (아세트산, 프로피온산)의 살균 효과를 확인하였다.

5 종류의 S. enterica 혈청형인 S. enterica subsp. enterica serovar Enteritidis, Hartford, Heidelberg, Newport, Typhimurium가 실험에 이용되었다. 5 종류의 E. coli O157:H7 균주인 ATCC43894 (사람의 배설물로부터 분리), E0018 (송아지 배설물로부터 분리), F4546 (알파파를 섭취한 환자로부터 분리), H1730 (상추를 섭취한 사람으로부터 분리), 그리고 932 (출혈성 대장염 환자로부터 분리)가 실험에 이용되었다. 5 종류의 L. monocytogenes 균주인 F8027 (샐러리로부터 분리), F8369 (옥수수로부터 분리), F8385 (당근으로부터 분리), G1091 (코우슬로를 섭취한 사람의 배설물로부터 분리), LCDC81861 (양배추로부터 분리)가 실험에 이용되었다.

냉동 보존된 5 종류의 S. enterica 혈청형 또는 E. coli O157:H7, L. monocytogenes 균주를 각각 10 mL TSB (tryptic soy broth)에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하여 활성화시킨 후, 37℃에서 24시간 간격으로 세 차례 계대 배양하였다. 계대 배양된 5 가지 S. enterica 혈청형 또는 E. coli O157:H7, L. monocytogenes 균주를 각각 2 mL씩 혼합하여 총 10 mL의 균 혼합액 (ca. 9.0 log CFU/mL)을 제조하여, 상온 (22±2℃)에서 15분간 원심분리(2,002 × g)되었다. 원심분리 후 상등액을 제거하여 얻어진 pelleted cells에 PBS (phosphate-buffered saline, pH 7.4)를 사용하여 균질화시켰다. 위의 과정을 한번 더 반복하여 얻은 균질액을 PBS를 이용하여 십진 희석한 후, 균 접종액 (ca. 8.0 log CFU/mL)을 제조하였다. 미생물을 접종하기 이전에 박과 종자에 존재하는 미생물을 제거하기 위하여, 5 g의 오이, 허니듀멜론, 수박 종자를 각각 50 mL 코니칼 튜브에 넣어 parafilm을 이용하여 밀봉한 후, 10 kGy의 감마선을 조사하였다. 앞에서 언급된 방법에 의하여 준비된 15 mL의 S. enterica, E. coli O157:H7, 또는 L. monocytogenes 접종액을 5 g의 멸균된 오이, 허니듀멜론, 수박 종자가 포함된 50 mL 코니칼 튜브에 각각 분주하고 5분간 배양하였다. 배양을 마친 후, 멸균 수저를 이용하여 균액이 접종된 종자를 멸균 체 (75 mm diameter, 600 μm pore size)에 펼쳐놓은 후, laminar flow biosafety hood (22±2℃)에서 2시간 동안 건조하였다.

2시간 후, S. enterica, E. coli O157:H7, 또는 L. monocytogenes가 접종된 오이, 허니듀멜론, 수박 종자 5 g을 멸균 수저를 이용하여 멸균 채반 (lid) 위에 위치시켰다. 50℃의 온도에서 43% 또는 85%로 습도가 조절된 1.8 L 용기에 위치한 페트리디쉬 위에 아세트산 (158 μL) 또는 프로피온산 (168 μL)을 분주하여 100 mg/L of air가 자연 기화되도록 하여, 종자가 놓여진 멸균 뚜껑을 용기 내부의 페트리디쉬 위에 놓아두었다. 1.8 L 용기는 뚜껑을 이용하여 바로 밀폐시킨 후, 1시간 또는 2시간 동안 50℃에 두었다. 대조군으로는 균이 접종된 종자가 포함된 밀폐용기를 동일한 조건에서 유기산 기체를 처리하지 않고 50℃에 1시간 또는 2 시간 동안 두었다.

1시간 또는 2시간 동안 유기산 기체에 노출되었거나 노출되지 않은 오이, 허니듀멜론, 수박 종자 (3 g)은 각각 30 mL의 멸균된 TSB가 포함된 멸균 균질기 봉지에 넣은 후, 1분간 균질화시켰다. 이를 멸균 시험관에 담은 후, 0.1% 펩톤수를 이용하여 단계적으로 희석하고 TSA (Tryptic soy agar)에 평판 도말한 후 37℃에서 24시간 배양하여 형성된 집락수를 측정하였다. 증균 결과를 확인하기 위해 37°C에 서 24시간 배양한 S. enterica 균질액은 XLD 아가(xylose lysine deoxycholate agar), E. coli O157:H7 균질액은 MSA(MacConkey sorbitol agar), L. monocytogenes 균질액은 Oxford agar에 stresking하여 24시간 뒤에 형성된 콜로니를 확인하였다.

다음 표 5는 1.8 L 밀폐용기에서 43% 또는 85% 상대습도와 50℃에서 유기산 기체 (아세트산 또는 프로피온산; 100 mg/L of air)를 최대 2시간 동안 처리한 또는 처리하지 않았을 때 (0 mg/L of air) 오이, 허니듀멜론, 수박 종자에 존재하는 S. enterica의 개체 수를 나타낸다 [아가 플레이팅에 대한 검출 한계는 1.0 log CFU/g (10 CFU/g)였다. 증균 배양(enrichment)에 의한 검출 한계는 -0.5 log CFU/g (1 CFU/3 g)였다].

오이, 허니듀멜론, 수박 종자에 부착된 S. enterica 의 초기 개체 수는 각각 ca. 7.2, 7.5, 7.3 log CFU/g이었다. 43% 또는 85% 상대습도 그리고 50℃에서 유기산 기체 없이 최대 2시간 배양하였을 때 (대조군), 오이 또는 허니듀멜론 종자에 존재하는 S. enterica의 개체 수는 ca. 0.3 - 0.7 log CFU/g (43% RH) 그리고 ca. 0.9 - 1.4 log CFU/g (85% RH) 만큼 감소하였다. 앞선 조건에서 수박 종자에 존재하는 S. enterica의 개체 수는 ca. 1.7 log CFU/g (43% RH) 그리고 ca. 3.0 log CFU/g (85% RH)만큼 감소하였다. 85% 상대습도와 50℃에서 아세트산 또는 프로피온산 기체 (ca. 100 mg/L of air)에 2시간 동안 노출시켰을 때, 오이 종자에 접종된 S. enterica 의 개체 수는 검출한계 이하(<1.0 log CFU/g)로 감소하였으나, 증균 후 콜로니가 발견되었다. 앞선 처리와 동일한 조건에서, 허니듀멜론 또는 수박 종자에 접종된 S. enterica는 아세트산 또는 프로피온산 기체를 처리하였을 때 완전 멸균된 (<-0.5 log CFU/g) 것을 확인하였다.

다음 표 6은 1.8 L 밀폐용기에서 43% 또는 85% 상대습도와 50℃에서 유기산 기체 (아세트산 또는 프로피온산; 100 mg/L of air)를 최대 2시간 동안 처리한 또는 처리하지 않았을 때 (0 mg/L of air) 오이, 허니듀멜론, 수박 종자에 존재하는 E. coli O157:H7의 개체 수를 나타낸다 [아가 플레이팅에 대한 검출 한계는 1.0 log CFU/g (10 CFU/g)였다. 증균 배양(enrichment)에 의한 검출 한계는 -0.5 log CFU/g (1 CFU/3 g)였다].

오이, 허니듀멜론, 수박 종자에 부착된 E. coli O157:H7의 초기 개체 수는 각각 ca. 7.6, 7.7, 7.6 log CFU/g이었다. 43% 또는 85% 상대습도 그리고 50℃에서 유기산 기체 없이 최대 2시간 배양하였을 때 (대조군), 오이, 허니듀멜론, 수박 종자에 존재하는 E. coli O157:H7의 개체 수는 6.9-7.3, 7.5, 6.7-7.2 log CFU/g로 초기 개체 수와 비교하여 큰 차이를 보이지 않았다. 한편, 85% 상대습도와 50℃에서 2시간 동안 아세트산 기체 (ca. 100 mg/L of air)에 노출시켰을 때, 오이, 허니듀멜론 또는 수박 종자에 접종된 E. coli O157:H7의 개체 수는 완전멸균 (<-0.5 log CFU/g)되었으며, 동일한 조건에서 프로피온산 기체 (ca. 100 mg/L of air)에 노출시켰을 때, 85% RH에서 검출한계 이하 (< 1.0 log CFU/g)로 감소하였다.

다음 표 7은 1.8 L 밀폐용기에서 43% 또는 85% 상대습도와 50℃에서 유기산 기체(아세트산 또는 프로피온산; 100 mg/L of air)를 최대 2시간 동안 처리한 또는 처리하지 않았을 때 (0 mg/L of air) 오이, 허니듀멜론, 수박 종자에 존재하는 L. monocytogenes의 개체 수를 나타낸다 [아가 플레이팅에 대한 검출 한계는 1.0 log CFU/g (10 CFU/g)였다. 증균 배양(enrichment)에 의한 검출 한계는 -0.5 log CFU/g (1 CFU/3 g)였다].

오이, 허니듀멜론, 수박 종자에 부착된 L. monocytogenes의 초기 개체 수는 각각 ca. 7.6, 7.6, 7.5 log CFU/g이었다. 43% 또는 85% 상대습도 그리고 50℃에서 유기산 기체 없이 최대 2시간 배양하였을 때 (대조군), 오이, 허니듀멜론, 수박 종자에 존재하는 L. monocytogenes의 개체수는 43% 상대습도에서 ca. 0.4 - 2.6 log CFU/g만큼, 85% 상대습도에서 ca. 0.5 - 3.2 log CFU/g (85% RH) 만큼 (by) 감소하였다. 한편, 오이 종자에 접종된 L. monocytogenes의 개체 수는 50℃에서 2시간 동안 아세트산 기체 (ca. 100 mg/L of air)에 노출시켰을 때, 43%와 85% 상대습도에서 검출 한계 이하 (<1.0 log CFU/g)로 감소하였으며, 프로피온산 기체 (ca. 100 mg/L of air)에 노출시켰을 때, ca. 2.2 - 2.3 log CFU/g로 감소하였다. 허니듀멜론 또는 수박 종자에 접종된 L. monocytogenes의 개체 수는 50℃에서 2시간 동안 아세트산 또는 프로피온산 기체 (ca. 100 mg/L of air)에 노출시켰을 때, 43%와 85% 상대습도에서 검출한계 이하 (<1.0 log CFU/g)로 감소하였다. 특히, 85% RH에서 아세트산이나 프로피온산을 2 시간 처리한 경우, L. monocytogenes가 완전히 멸균된 것을 확인하였다.

Claims

아세트산 기체 또는 프로피온산 기체를 박과 식물 종자에 처리하는 것을 포함하는 박과 식물 종자의 살균 방법.
제 1 항에 있어서,
박과 식물은 오이, 수세미, 여주, 호박, 멜론 및 수박 중에서 선택된 1종 이상인 박과 식물 종자의 살균 방법.
식물병원균 또는 식중독균을 멸균시키는 박과 식물 종자의 살균 방법.
제 3 항에 있어서,
식물병원균은 아시도보락스 시트룰리(Acidovorax citrulli)인 박과 식물 종자의 살균 방법.
제 3 항에 있어서,
식중독균은 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 병원성 대장균(pathogenic Escherichia coli) 및 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 박과 식물 종자의 살균 방법.