KR20210145238A - 염증성 질환의 치료를 위한 신규 화합물 및 그의 약학 조성물 - Google Patents

염증성 질환의 치료를 위한 신규 화합물 및 그의 약학 조성물 Download PDF

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오스카 만모리티
헬렌 마리 자리
미스라브 올서릭
데나나 블반
마리자나 코막
레지널드 크리스토퍼 사비에르 브리시
라리드 아카리
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갈라파고스 엔.브이.
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Abstract

본 발명은 하기 화학식 I에 따른 화합물을 개시한다:
화학식 I
Figure pct00190

상기에서 R1, R2, R5 및 Cy는 본원에서 정의된 바와 같다. 본 발명은 화합물, 상기 화합물의 제조 방법, 상기 화합물을 포함하는 약학 조성물, 및 상기 화합물의 투여에 의한 염증성 질병, 자가면역 질병, 통증, 섬유증 및/또는 증식성 질병의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다.

Description

염증성 질환의 치료를 위한 신규 화합물 및 그의 약학 조성물
본 발명은 염증성 질병, 자가면역 질병, 통증, 섬유증 및/또는 증식성 질병의 예방 및/또는 치료에 유용할 수 있는 화합물에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 화합물은 염증성 질병, 자가면역 질병, 통증, 섬유증 및/또는 증식성 질병에 관련된 키나제 패밀리인 인터류킨-1 수용체 연관된 키나제(IRAK), 및 보다 특히 IRAK-4를 억제할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 제조 방법, 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물, 본 발명의 화합물의 투여에 의한 염증성 질병, 자가면역 질병, 통증, 섬유증 및/또는 증식성 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
키나제는 세포 생리학의 다수의 필수적인 과정, 예를 들어 단백질 인산화에 관련된다. 특히, 단백질 및 지질 키나제는 세포의 활성화, 성장, 분화 및 생존에 관련된다. 단백질 키나제는 티로신 잔기를 우선적으로 인산화하는 것과, 세린 및/또는 쓰레오닌 잔기를 우선적으로 인산화하는 것으로 나뉠 수 있다.
수년간, 키나제는 소염 약물의 개발에 매우 중요한 표적으로 성장하여 왔다(Cohen, 2009). 특히, IRAK 키나제, 및 보다 특히 IRAK-4는 염증 및 자가면역 질병에 한 역할을 하는 것으로서 확인되었다(Ringwood and Li, 2008; Wang et al., 2009).
IRAK는 다수의 세포 유형에서 발현되며 인터류킨-1(IL-1) 및 톨-형 수용체(TLR)를 포함한 다양한 세포 수용체로부터의 신호를 매개한다. IRAK 패밀리에서, 4개의 구성원, 즉 IRAK 1-4가 식별되었으며(Wang et al., 2009), 패밀리의 가장 최근의 구성원인 IRAK-4는 매력적인 치료 표적을 나타낸다(Li et al., 2002). 실제로, IRAK-4는 IL-1 수용체 및 TLR(TLR3 제외)의 하류에서 조기 활성화되어, IRAK-1 및 IRAK-2의 빠른 활성화를 개시하여, 본래의 면역 반응을 초래하는 핵심적인 단백질 키나제인 것으로 여겨진다. 또한, 다른 인터류킨, 예를 들어 IL-18 및 IL-33은 신호전달을 위해서 IRAK-4에 의존한다. 이와 같이, 이들 사이토카인이 발병 과정에 관련되는 질병(예를 들어 섬유증(Li et al., 2014; McHedlidze et al., 2013; Rankin et al., 2010) 및 아토피성 피부염(Salimi et al., 2013))이 IRAK-4 억제제에 의한 치료에 잠재적인 표적 질병이다.
야생형 대신에 불활성 IRAK-4 돌연변이체를 발현하는 마우스에서, 다수의 TLR 작용물질에 의해 촉발되는 패혈성 쇼크에 대한 완전한 내성뿐만 아니라 IL-1에 대한 손상된 반응이 관찰된다. 더욱 또한, 야생형 대신에 불활성 IRAK-4 돌연변이체를 발현하는 마우스는 자가면역 질병, 예를 들어 류마티스성 관절염(Koziczak-Holbro et al., 2009) 및 다발성 경화증(Staschke et al., 2009)의 다수의 모델에서 부분적으로 보호된다. 흥미롭게도, 류마티스성 관절염 및 전신 홍반성 루푸스 환자의 혈청은 형질세포양 수지상 세포를 IRAK-4 의존적인 방식으로 활성화하는 것으로 나타났다(Chiang et al., 2011). 최종적으로, 재발성 화농성 세균 감염이 IRAK-4 불활성을 초래하는 유전적 결함을 앓고 있는 아동에서 관찰되었다. 이러한 화농성 감염은 불활성화 IRAK-4 돌연변이를 갖는 성인에서는 관찰되지 않으므로, IRAK-4 신호전달 시스템은 성인 선천 면역의 몇몇 태양에 대해 불필요한 것으로 보인다.
선천 면역계의 신호전달 성분의 조절이상은 또한 암의 개시 및 진행에 중요한 인자로 점점 더 인식되고 있다(Rhyasen and Starczynowski, 2015). 실제로, IL-1이 종양 세포 성장, 혈관형성, 침습, 약물 내성 및 전이에 직접적인 역할을 한다는 증거가 존재한다(Carmi et al., 2013; Vidal-Vanaclocha et al., 2000). 추가로, TLR은 종양 세포 상황에 따라 다수의 종양 반응에 관여한다. IL-1 수용체 및 TLR 신호전달의 필수적인 매개체로서, IRAK 패밀리 키나제는 유망한 암 약물 표적을 나타낸다. 또한, 다수의 암 유형이, IRAK-4를 활성화하는 TLR 및 IL-1R의 하류 어댑터 분자인 MYD88의 활성화된 형태에 의존하는 것으로 나타났다. 활성화 MYD88 돌연변이가 예를 들어 미만성 큰 B-세포 림프종(DLBCL)(Ngo et al., 2011), 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Treon et al., 2012)에서 식별되었다. 또 다른 보고서는 종양학, 특히 T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL) 분야에서 IRAK-4의 역할을 지지한다(Li et al., 2015). IRAK-4의 약물학적 억제는 T-ALL의 화학요법제에 대한 민감성을 증대시키는 것으로 나타났다.
IL-33은 섬유성 및 알러지성 질병, 특히 천식 및 아토피성 피부염의 발생에 한 역할을 하는 것으로 나타났다(Nabe, 2014). 이러한 사이토카인은 IRAK-4 의존적인 경로를 통해 신호를 전달하기 때문에(Kroeger et al., 2009), 이들 질병도 또한 IRAK-4 억제제에 대한 표적을 나타낼 수 있다.
최종적으로, 다수의 자가염증성 질병이 IL-1 활성에 의존적이며, 결과적으로 IL-1 차단 생물학 제제가 이러한 환자에게 일부 이득을 보이는 것으로 나타났다. 통풍, 소아 특발성 관절염, 머클-웰스 질병, 가족성 지중해열, 베체트병, 성인 발병 스틸병이 상기와 같은 자가염증성 질병의 예이다(Dinarello et al., 2012).
소분자에 의한 사이토카인 신호전달의 억제는 면역-염증성 질병에서 질병 결과를 감소시키는데 일조할 수 있다(Sundberg et al., 2014). 특히, 사이토카인은 병원체 및 감염에 대한 유기체의 방어에 한 역할을 할 수 있다. 그러나, 한편으로는, 면역-염증성 질병에 대한 신규 요법의 개발시에, 다수의 사이토카인 반응 경로의 동시 억제가 면역계를 과도하게 약화시킬 수도 있기 때문에 적응 및/또는 선천 면역 반응을 손상시키지 않으면서 억제될 수 있는 경로에 관련된 표적을 선택하는 것이 중요하다. 그러나, 키나제에 대한 약물 선택성은 성취하기에 어렵지만(Bain et al., 2003; Fabian et al., 2005), 특히 만성 치료의 상황에서 표적-외 연관된 부작용을 피하기 위해서는 매우 바람직하다(Broekman et al., 2011; Dy and Adjei, 2013; Force and Kolaja, 2011).
특히, 최근에 IL-1 차단제(아나킨라) 및 TNFα 차단제(에타너셉트)의 동반 사용이 호중구감소증 및 감염의 위험을 증가시키는 것으로 나타났다(Genovese et al., 2004, 2003). 이러한 발견은 신약의 개발시에 선택성이 중요한 요소이며, 따라서 다른 것들에 영향을 미치지 않으면서 신호전달 경로를 선택적으로 조절할 수 있는 화합물, 특히 TNFα 신호전달 경로에 영향을 미치지 않으면서 IL-1 반응을 선택적으로 조절할 수 있는 화합물을 개발하는 것이 바람직할 수 있음을 강조한다.
현행 요법은 만족스럽지 못하며 따라서 염증성 질병, 자가면역 질병 및/또는 증식성 질병의 예방 및/또는 치료에 유용할 수 있는, 표적-외 관련된 부작용이 감소된 추가의 화합물을 식별할 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명은 염증성 질병, 자가면역 질병, 통증, 섬유증 및/또는 증식성 질병의 예방 및/또는 치료에 유용할 수 있는 화합물에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 화합물은 염증성 질병, 자가면역 질병, 통증, 섬유증 및/또는 증식성 질병에 관련된 키나제 패밀리인 인터류킨-1 수용체 연관된 키나제(IRAK), 및 보다 특히 IRAK-4를 억제할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 제조 방법, 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물, 본 발명의 화합물의 투여에 의한 염증성 질병, 자가면역 질병, 통증, 섬유증 및/또는 증식성 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 첫 번째 태양에서, 하기 화학식 I을 갖는 본 발명의 화합물을 제공한다:
[화학식 I]
Figure pct00001
상기 식에서
R1은
a) 하나 이상의 독립적으로 선택된 -OH, -CN, C1-4　알콕시, 할로, 또는 -S(=O)2-C1-4　알킬로 치환된 C2-6 알킬, 또는
b) 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 S, N 또는 O 원자를 포함하는 6원 헤테로사이클로알킬(헤테로사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, 할로 또는 C1-4　알킬로 치환되고, 알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 할로로 치환된다)이고;
R2는
a) C1-4　알콕시(알콕시는 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로 또는 -OH로 치환된다),
b) -O-C3-4　사이클로알킬(사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로 또는 -OH로 치환된다), 또는
c) -C(=O)NR3aR3b이고;
Cy는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 R4 치환체로 치환된, 1 또는 2개의 N 원자를 포함하는 6원 헤테로아릴이고;
각각의 R3a 및 R3b는
a) H,
b) C1-4　알킬(알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, -CN, C1-4　알콕시, 또는 C3-7　사이클로알킬로 치환되고, 사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로로 치환된다),
c) C3-6　사이클로알킬(사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4 알킬, C1-4　알콕시, 또는 할로로 치환된다), 또는
d) 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 N, S 또는 O 원자를 포함하는 4-6원 헤테로사이클로알킬(헤테로사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4 알킬, C1-4　알콕시, 또는 할로로 치환된다)
중에서 독립적으로 선택되거나;
R3a 및 R3b는 이들이 부착된 N 원자와 함께 4-6원 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬을 형성할 수 있고;
각각의 R4 는 독립적으로
a) 옥소,
b) -OH,
c) -CN,
d) 할로,
e) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C1-4 알킬,
f) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C1-4　알콕시, 또는
g) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C3-7　사이클로알킬이고;
R5는 H, 할로, -CH3 또는 -CF3 중에서 선택된다.
하나의 태양에서, 본 발명의 화합물을 염증성 질병, 자가면역 질병, 통증, 섬유증 및/또는 증식성 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위해 제공한다. 특정한 태양에서, 본 발명의 화합물은 IRAK 키나제 패밀리 구성원, 및 보다 특히 IRAK-4를 억제할 수 있다.
추가의 태양에서, 본 발명의 화합물은 양호한 대사 안정성 및 양호한 반감기를 나타낼 수 있으며, 이는 보다 낮은 투여량 섭생을 생성시킬 수 있다. 특정한 태양에서, 본 발명의 화합물은 간세포에서 양호한 안정성을 보이며, 이는 낮은 간 클리어런스를 생성시킬 수 있다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명의 화합물은 양호한 용해도, 특히 열역학적 용해도를 나타낼 수 있으며, 이는 개선된 제조역량을 생성시킬 수 있다.
더욱 추가의 태양에서, 본 발명의 화합물은 IRAK-4에 대한 선택성을 나타낼 수 있으며, 이는 개선된 안전성을 생성시키고 표적-외 관련된 부작용을 낮출 수 있다.
추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명의 화합물, 및 약학 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 태양에서, 약학 조성물은 본 발명의 화합물과 함께 사용하기에 적합한 추가의 치료학적 활성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 보다 특정한 태양에서, 추가의 치료학적 활성 성분은 염증성 질병, 자가면역 질병, 통증, 섬유증 및/또는 증식성 질병의 예방 및 치료를 위한 작용제이다.
더욱이, 본원에 개시된 약학 조성물 및 치료 방법에 유용한 본 발명의 화합물은 제조 및 사용시 약학적으로 허용가능하다.
본 발명의 추가의 태양에서, 본 발명은 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 약학 조성물 또는 화합물을 투여함을 포함하는, 본원에 나열된 상태 중에서 선택된 상태, 및 특히 염증성 질병, 자가면역 질병, 통증, 섬유증 및/또는 증식성 질병에 걸린 포유동물, 특히 인간의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 약물에 사용하기 위한 본 발명의 화합물, 및 적합한 약학 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 태양에서, 약학 조성물은 염증성 질병, 자가면역 질병, 통증, 섬유증 및/또는 증식성 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것이다.
추가의 태양에서, 본 발명은 나중에 본원에 개시되는 전형적인 합성 프로토콜 및 경로에 의해 본 발명의 조성물을 합성하는 방법을 제공한다.
다른 목적 및 이점은 이어지는 상세한 설명을 고려하여 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다.
정의
하기의 용어는 하기에 함께 제공된 의미를 갖고자 하며 본 발명의 개시 및 의도된 범위를 이해하는데 유용하다.
화합물, 상기와 같은 화합물을 함유하는 약학 조성물 및 상기와 같은 화합물 및 조성물의 사용 방법을 포함할 수 있는 본 발명을 개시할 때, 하기의 용어(존재하는 경우)는 달리 나타내지 않는 한 하기의 의미를 갖는다. 본 발명에 개시될 때 이후 하기에 정의되는 부분 중 임의의 부분은 다양한 치환체로 치환될 수 있으며, 각각의 정의가 하기에 설명되는 바와 같은 그의 범위내에 상기와 같은 치환된 부분을 포함하고자 함은 또한 물론이다. 달리 서술되지 않는 한, "치환된"이란 용어는 하기에 설명되는 바와 같이 정의되어야 한다. "기" 및 "라디칼"이란 용어는 본 발명에서 사용시 호환 가능한 것으로 간주될 수 있음도 또한 물론이다.
'하나의'란 관사는 본 발명에서 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나보다 많은(즉 적어도 하나)을 지칭하는데 사용될 수 있다. 예로서 '하나의 유사체'는 하나의 유사체 또는 하나보다 많은 유사체를 의미한다.
'알킬'은 명시된 탄소수를 갖는 직쇄 또는 분지된 지방족 탄화수소를 의미한다. 특정한 알킬기는 탄소수 1 내지 6 또는 1 내지 4를 갖는다. 분지된은 하나 이상의 알킬기, 예를 들어 메틸, 에틸 또는 프로필이 선형 알킬쇄에 부착됨을 의미한다. 특정한 알킬기는 메틸(-CH3), 에틸(-CH2-CH3), n-프로필(-CH2-CH2-CH3), 이소프로필(-CH(CH3)2), n-부틸(-CH2-CH2-CH2-CH3), 3급-부틸(-CH2-C(CH3)3), 2급-부틸(-CH(CH3)-CH2-CH3), 이소부틸(-CH2-CH(CH3)2), n-펜틸(-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3), n-헥실(-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3), 및 1,2-디메틸부틸(-CHCH3)-C(CH3)H-CH2-CH3)이다. 특정한 알킬기는 탄소수 1 내지 4를 갖는다.
'알케닐'은 명시된 탄소 원자의 수를 갖는 1가 올레핀형(불포화) 탄화수소기를 지칭한다. 특정한 알케닐은 직쇄 또는 분지될 수 있는 탄소수 2 내지 8, 및 보다 특히 탄소수 2 내지 6을 가지며 하나 이상 및 특히 1 내지 2개의 올레핀 불포화 부위를 갖는다. 특정한 알케닐기는 에테닐(-CH=CH2), n-프로페닐(-CH2CH=CH2), 이소프로페닐(-C(CH3)=CH2) 등을 포함한다.
'알킬렌'은 명시된 탄소 원자의 수를 갖는, 특히 탄소수 1 내지 6 및 보다 특히 탄소수 1 내지 4를 갖는, 직쇄이거나 분지될 수 있는 2가 알켄 라디칼기를 지칭한다. 용어는 메틸렌(-CH2-), 에틸렌(-CH2-CH2-) 또는 -CH(CH3)- 등과 같은 기에 의해 예시된다.
'알키닐렌'은 명시된 탄소 원자의 수 및 삼중 결합의 수를 갖는, 특히 탄소수 2 내지 6 및 보다 특히 탄소수 2 내지 4를 갖는, 직쇄이거나 분지될 수 있는 2가 알킨 라디칼기를 지칭한다. 용어는 -C≡C-, -CH2-C≡C-, 및 -C(CH3)H-C≡CH-와 같은 기에 의해 예시된다.
'알콕시'는 O-알킬기를 지칭하며, 이때 알킬기는 명시된 수의 탄소 원자를 갖다. 특히 용어는 -O-C1-6 알킬기를 지칭한다. 특정한 알콕시기는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 3급-부톡시, 2급-부톡시, n-펜톡시, n-헥속시, 및 1,2-디메틸부톡시이다. 특정한 알콕시기는 저급 알콕시, 즉 탄소수 1 내지 6을 갖는 알콕시다. 추가의 특정한 알콕시기는 탄소수 1 내지 4를 갖는다.
'아미노'는 라디칼 -NH2를 지칭한다.
'아릴'은 모 방향족 고리 시스템의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자의 제거에 의해 유도된 1가 방향족 탄화수소기를 지칭한다. 특히 아릴은 명시된 고리 원자의 수를 갖는, 모노사이클릭 또는 축합된 폴리사이클릭 방향족 고리 구조를 지칭한다. 구체적으로, 용어는 6 내지 10개의 고리 구성원을 포함하는 기를 포함한다. 특히 아릴기는 페닐 및 나프틸을 포함한다.
'사이클로알킬'은 명시된 고리 원자의 수를 갖는, 모노사이클릭, 축합된 폴리사이클릭, 가교된 폴리사이클릭, 또는 스피로사이클릭 비-방향족 하이드로카빌 고리 구조를 지칭한다. 사이클로알킬은 탄소수 3 내지 12, 특히 3 내지 10, 및 보다 특히 탄소수 3 내지 7을 가질 수 있다. 상기와 같은 사이클로알킬기는 예로서 단일 고리 구조, 예를 들어 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 및 사이클로헵틸을 포함한다.
'시아노'는 라디칼 -CN을 지칭한다.
'할로' 또는 '할로겐'은 플루오로(F), 클로로(Cl), 브로모(Br) 및 요오도(I)를 지칭한다. 특정한 할로기는 플루오로 또는 클로로이다.
'헤테로'는 화합물 또는 화합물상에 존재하는 기를 기재하는데 사용될 때 화합물 또는 기 중의 하나 이상의 탄소 원자가 질소, 산소 또는 황 헤테로원자에 의해 치환되었음을 의미한다. 헤테로를 상술한 하이드로카빌기 중 어느 하나, 예를 들어 1 내지 4, 및 특히 1 내지 3개의 헤테로원자, 보다 전형적으로는 1 또는 2개의 헤테로원자, 예를 들어 단일 헤테로원자를 갖는 알킬, 예를 들어 헤테로알킬, 사이클로알킬, 예를 들어 헤테로사이클로알킬, 아릴, 예를 들어 헤테로아릴 등에 적용할 수 있다.
'헤테로아릴'은 O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자 및 명시된 고리 원자의 수를 포함하는, 모노사이클릭 또는 축합된 폴리사이클릭 방향족 고리 구조를 의미한다. 특히, 방향족 고리 구조는 5 내지 9개의 고리원을 가질 수 있다. 헤테로아릴기는 예를 들어 축합된 5원 및 6원 고리 또는 2개의 축합된 6원 고리, 또는 추가의 예로서 2개의 축합된 5원 고리로부터 형성되는 5원 또는 6원 모노사이클릭 고리 또는 축합된 비사이클릭 구조일 수 있다. 각각의 고리는 전형적으로 질소, 황 및 산소 중에서 선택된 4개 이하의 헤테로원자를 함유할 수 있다. 전형적으로 상기 헤테로아릴 고리는 4개 이하, 보다 전형적으로는 3개 이하, 보다 대개는 2개 이하의 헤테로원자, 예를 들어 단일 헤테로원자를 함유할 것이다. 하나의 구현예에서, 헤테로아릴 고리는 적어도 하나의 고리 질소 원자를 함유한다. 헤테로아릴 고리 중 질소 원자는 이미다졸 또는 피리딘의 경우에서와 같이 염기성이거나, 또는 인돌 또는 피롤 질소의 경우에서와 같이 필수적으로 비-염기성일 수 있다. 일반적으로 헤테로아릴기 중에 존재하는 염기성 질소 원자의 수는 고리의 임의의 아미노기 치환체를 포함하여, 5 미만일 것이다.
5원 모노사이클릭 헤테로아릴기의 예는 비제한적으로 피롤릴, 퓨라닐, 티오페닐, 이미다졸릴, 퓨라자닐, 옥사졸릴, 옥사디아졸릴, 옥사트리아졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴 및 테트라졸릴기를 포함한다.
6원 모노사이클릭 헤테로아릴기의 예는 비제한적으로 피리디닐, 피라지닐, 피리다지닐, 피리미디닐 및 트리아지닐을 포함한다.
또 다른 5원 고리에 축합된 5원 고리를 함유하는 비사이클릭 헤테로아릴기의 특정한 예는 비제한적으로 이미다조티아졸릴 및 이미다조이미다졸릴을 포함한다.
5원 고리에 축합된 6원 고리를 함유하는 비사이클릭 헤테로아릴기의 특정한 예는 비제한적으로 벤조퓨라닐, 벤조티오페닐, 벤조이미다졸릴, 벤즈옥사졸릴, 이소벤즈옥사졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조이소티아졸릴, 이소벤조퓨라닐, 인돌릴, 이소인돌릴, 인돌리지닐, 퓨리닐(예를 들어 아데닌, 구아닌), 인다졸릴, 피라졸로피리미디닐, 트리아졸로피리미디닐, 및 피라졸로피리디닐기를 포함한다.
2개의 축합된 6원 고리를 함유하는 비사이클릭 헤테로아릴기의 특정한 예는 비제한적으로 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 피리도피리디닐, 퀴녹살리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 프탈라지닐, 나프티리디닐 및 프테리디닐기를 포함한다. 특정한 헤테로아릴기는 티오페닐, 피롤릴, 벤조티오페닐, 벤조퓨라닐, 인돌릴, 피리디닐, 퀴놀리닐, 이미다졸릴, 옥사졸릴 및 피라지닐로부터 유도된 것들이다.
전형적인 헤테로아릴의 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00002
상기에서, 각각의 Y는 >C=O, NH, O 및 S 중에서 선택된다.
'헤테로사이클로알킬'은 O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자 및 명시된 고리 원자의 수를 포함하는, 모노사이클릭, 축합된 폴리사이클릭, 스피로사이클릭 또는 가교된 폴리사이클릭의 완전히 포화된 비-방향족 고리 구조를 의미한다. 헤테로사이클로알킬 고리 구조는 4 내지 12개의 고리 구성원, 특히 4 내지 10개의 고리 구성원, 및 보다 특히 4 내지 7개의 고리 구성원을 가질 수 있다. 각각의 고리는 전형적으로 질소, 황 및 산소 중에서 선택된 4개 이하의 헤테로원자를 함유할 수 있다. 전형적으로 헤테로사이클로알킬 고리는 4개 이하의 헤테로원자, 보다 전형적으로는 3개 이하의 헤테로원자, 보다 대개는 2개 이상, 예를 들어 단일의 헤테로원자를 함유할 것이다. 헤테로사이클릭 고리의 예는 비제한적으로 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐(예를 들어 1-피롤리디닐, 2-피롤리디닐 및 3-피롤리디닐), 테트라하이드로퓨라닐(예를 들어 1-테트라하이드로퓨라닐, 2-테트라하이드로퓨라닐 및 3-테트라하이드로퓨라닐), 테트라하이드로티오페닐(예를 들어 1-테트라하이드로티오페닐, 2-테트라하이드로티오페닐 및 3-테트라하이드로티오페닐), 피페리디닐(예를 들어 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐 및 4-피페리디닐), 테트라하이드로피라닐(예를 들어 4-테트라하이드로피라닐), 테트라하이드로티오피라닐(예를 들어 4-테트라하이드로티오피라닐), 모폴리닐, 티오모폴리닐, 디옥사닐, 또는 피페라지닐을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, '헤테로사이클로알케닐'이란 용어는 적어도 하나의 이중 결합을 포함하는 '헤테로사이클로알킬'을 의미한다. 헤테로사이클로알케닐기의 특정한 예는 하기 예시적인 예로 나타낸다:
Figure pct00003
상기에서, 각각의 W는 CH2, NH, O 및 S 중에서 선택되고; 각각의 Y는 NH, O, C(=O), SO2 및 S 중에서 선택되고; 각각의 Z는 N 또는 CH 중에서 선택된다.
모노사이클릭 고리의 특정한 예는 하기의 예시적인 예들로 나타낸다:
Figure pct00004
상기에서, 각각의 W 및 Y는 독립적으로 -CH2-, -NH-, -O- 및 -S- 중에서 선택된다.
축합된 비사이클릭 고리의 특정한 예는 하기의 예시적인 예들로 나타낸다:
Figure pct00005
상기에서, 각각의 W 및 Y는 독립적으로 -CH2-, -NH-, -O- 및 -S- 중에서 선택된다.
가교된 비사이클릭 고리의 특정한 예는 하기의 예시적인 예들로 나타낸다:
Figure pct00006
상기에서, 각각의 W 및 Y는 독립적으로 -CH2-, -NH-, -O- 및 -S- 중에서 선택되고, 각각의 Z는 N 또는 CH 중에서 선택된다.
스피로사이클릭 고리의 특정한 예는 하기의 예시적인 예들로 나타낸다:
Figure pct00007
상기에서, 각각의 Y는 -CH2-, -NH-, -O- 및 -S- 중에서 선택된다.
'하이드록실'은 라디칼 -OH를 지칭한다.
'옥소'는 라디칼 =O를 지칭한다.
'치환된'은 하나 이상의 수소 원자가 동일하거나 상이한 치환체(들)로 각각 독립적으로 치환된 기를 지칭한다.
'설포' 또는 '설폰산'은 -SO3H와 같은 라디칼을 지칭한다.
'티올'은 -SH 기를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, '하나 이상으로 치환된'이란 용어는 1 내지 4개의 치환체를 지칭한다. 하나의 구현예에서, 상기는 1 내지 3개의 치환체를 지칭한다. 추가의 구현예에서, 상기는 1 또는 2개의 치환체를 지칭한다. 더욱 추가의 구현예에서, 상기는 하나의 치환체를 지칭한다.
'티오알콕시'는 -S-알킬기를 지칭하며, 이때 알킬기는 명시된 탄소원자의 수를 갖는다. 특히 용어는 -S-C1-6 알킬기를 지칭한다. 특정한 티오알콕시기는 티오메톡시, 티오에톡시, n-티오프로폭시, 이소티오프로폭시, n-티오부톡시, 3급-티오부톡시, 2급-티오부톡시, n-티오펜톡시, n-티오헥속시, 및 1,2-디메틸티오부톡시이다. 특정한 티오알콕시기는 저급 티오알콕시, 즉 1 내지 6개의 탄소원자를 갖는 티오알콕시이다. 추가의 특정한 알콕시기는 1 내지 4개의 탄소원자를 갖는다.
유기 합성 분야의 통상적인 숙련가는 안정한, 화학적으로 가능한 헤테로사이클릭 고리 중의 헤테로원자의 최대수는, 상기가 방향족이든 비방향족이든 간에, 고리의 크기, 불포화도 및 헤테로원자의 원자가에 의해 결정됨을 알 것이다. 일반적으로, 헤테로사이클릭 고리는 헤테로방향족 고리가 화학적으로 가능하고 안정한 한 1 내지 4개의 헤테로원자를 가질 수 있다.
'약학적으로 허용가능한'은 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관 또는 미국 이외 국가의 해당 당국에 의해 승인되거나 승인 가능함, 또는 동물, 및 보다 특히 인간에의 사용에 대해 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에 나열됨을 의미한다.
'약학적으로 허용가능한 염'은 약학적으로 허용가능하고 모 화합물의 목적하는 약물학적 활성을 갖는 화합물의 염을 지칭한다. 특히, 상기와 같은 염은 무독성이며 무기 또는 유기 산 부가염 및 염기 부가염일 수 있다. 구체적으로, 상기와 같은 염은 (1) 무기산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 형성된 산 부가염; 또는 유기산, 예를 들어 아세트산, 프로피온산, 헥산산, 사이클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 퓨마르산, 타타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-하이드록시벤조일) 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄-디설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄포설폰산, 4-메틸비사이클로[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, 3급 부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 하이드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산 등과 형성된 산 부가염; 또는 (2) 모 화합물 중에 존재하는 산성 양성자가 금속 이온, 예를 들어 알칼리 금속 이온, 알칼리 토 이온, 또는 알루미늄 이온에 의해 치환되거나; 또는 유기 염기, 예를 들어 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, N-메틸글루카민 등과 배위하는 경우 형성된 염을 포함한다. 염은 단지 예로서, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄 등; 및 화합물이 염기성 작용기를 함유하는 경우, 무독성 유기 또는 무기산의 염, 예를 들어 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 타르트레이트, 메실레이트, 아세테이트, 말리에이트, 옥살레이트 등을 추가로 포함한다. '약학적으로 허용가능한 양이온'이란 용어는 산성 작용기의 허용가능한 양이온성 대이온을 지칭한다. 상기와 같은 양이온은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄 양이온 등에 의해 예시된다.
'약학적으로 허용가능한 비히클'은 본 발명의 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 담체를 지칭한다.
'전구약물'은, 절단 가능한 기를 가지며 가용매분해에 의해서 또는 생리학적 조건 하에서 생체 내에서 약학적으로 활성인 본 발명의 화합물로 되는, 본 발명 화합물의 유도체를 포함한 화합물을 지칭한다. 상기와 같은 예는 비제한적으로 콜린 에스테르 유도체 등, N-알킬모폴린 에스테르 등을 포함한다.
'용매화물'은 용매와, 대개는 가용매분해 반응에 의해 회합되는 화합물의 형태를 지칭한다. 이러한 물리적 회합은 수소 결합을 포함한다. 통상적인 용매는 물, EtOH, 아세트산 등을 포함한다. 본 발명의 화합물을 예를 들어 결정성 형태로 제조할 수 있으며 용매화 또는 수화시킬 수 있다. 적합한 용매화물은 약학적으로 허용가능한 용매화물, 예를 들어 수화물을 포함하며, 화학량론적 용매화물 및 비-화학량론적 용매화물을 모두 추가로 포함한다. 몇몇 예에서, 용매화물은, 예를 들어 하나 이상의 용매 분자가 결정성 고체의 결정 격자 중에 통합된 경우 단리될 수 있을 것이다. '용매화물'은 용액-상 및 단리 가능한 용매화물 모두를 포함한다. 전형적인 용매화물은 수화물, 에탄올레이트 및 메탄올레이트를 포함한다.
'피실험자'는 인간을 포함한다. '인간', '환자' 및 '피실험자'란 용어는 본원에서 호환적으로 사용된다.
'유효량'은 질병의 치료를 위해 환자에게 투여 시, 질병에 대해 상기와 같은 치료를 수행하기에 충분한 본 발명 화합물의 양을 의미한다. '유효량'은 화합물, 질병 및 그의 중증도, 및 치료하려는 환자의 연령, 체중 등에 따라 변할 수 있다.
'예방하는' 또는 '예방'은 질병 또는 질환을 얻거나 상기가 발병할 위험을 감소시킴(즉 질병 유발제에 노출되거나 또는 질병 개시에 앞서 질병의 소인이 있을 수 있는 환자에게서 질병의 임상적인 증상들 중 하나 이상이 발생하지 않게 함)을 지칭한다.
'예방학'이란 용어는 '예방'과 관련되며, 질병의 치료 또는 치유보다는 예방을 목적으로 하는 조치 또는 시술을 지칭한다. 예방학적 조치의 비제한적인 예는 백신의 투여; 예를 들어 고정화에 기인하여 혈전증의 위험이 있는 입원 환자에 대한 저 분자량 헤파린의 투여; 및 말라리아가 풍토병이거나 또는 말라리아와 접촉할 위험성이 높은 지리학적 지역의 방문에 앞서 항-말라리아제, 예를 들어 클로로퀸의 투여를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 임의의 질병 또는 질환을 '치료하는' 또는 '치료'는 질병 또는 질환을 개선시킴(즉 질병을 억제하거나 질병의 임상적 증상들 중 하나 이상의 징후, 정도 또는 중증도를 감소시킴)을 지칭한다. 또 다른 구현예에서 '치료하는' 또는 '치료'는 환자가 알아차릴 수 없는 하나 이상의 물리적 매개변수의 개선을 지칭한다. 더욱 또 다른 구현예에서, '치료하는' 또는 '치료'는 질병 또는 질환을 물리적으로(예를 들어 알아차릴 수 있는 증상의 안정화), 생리적으로(예를 들어 물리적 매개변수의 안정화), 또는 이들 둘 다에 의해 완화시킴을 지칭한다. 추가의 구현예에서, "치료하는" 또는 "치료"는 질병의 진행을 늦춤에 관한 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이 '알러지성 질병(들)'이란 용어는 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식, 비염), 아토피성 피부염, 부비동염, 습진 및 두드러기뿐만 아니라 음식 알러지 또는 곤충 독에 대한 알러지를 포함하여 면역계의 과민성 질환을 특징으로 하는 상태의 그룹을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이 '천식'이란 용어는 원인이 무엇이든(내인성, 외인성, 또는 둘 다; 알러지성 또는 비-알러지성) 기도 수축과 연관된 폐 기체 흐름의 변화를 특징으로 하는 폐의 임의의 질환을 지칭한다. 천식이란 용어는 원인을 나타내기 위해 하나 이상의 형용사와 함께 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이 '염증성 질병(들)'이란 용어는 류마티스성 관절염, 골관절염, 소아 특발성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식, 비염), 만성 폐쇄성 폐 질병(COPD), 염증성 장 질환(IBD, 예를 들어 크론병, 궤양성 대장염), 과민성 장 증후군, 내독소-구동된 질병 상태(예를 들어 우회술 후 합병증 또는 예를 들어 만성 심부전에 기여하는 만성 내독소 상태), 성인-발병 스틸병, 머클-웰스 증후군, 가족성 감기 자가염증성 증후군(FCAS), 베체트병, 크라이오피린-연관된 주기 증후군(CAPS), 가족성 지중해열(FMF), 통풍, 신생아 발병 다기관 염증성 질병(NOMID), 슈니츨러 증후군, 및 연골 관련된 질병, 예를 들어 관절 질병을 포함하는 상태의 그룹을 지칭한다. 특히 용어는 류마티스성 관절염, 소아 특발성 관절염, 건선, 골관절염, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식), 만성 폐쇄성 폐 질병(COPD) 및 염증성 장 질병을 지칭한다. 보다 특히 용어는 류마티스성 관절염, 소아 특발성 관절염, 건선, 만성 폐쇄성 폐 질병(COPD) 및 염증성 장 질환을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 '자가면역 질병(들)'은 COPD와 같은 상태를 포함한 폐쇄성 기도 질병, 천식(예를 들어 내인성 천식, 외인성 천식, 먼지 천식, 소아 천식), 특히 만성 또는 고질성 천식(예를 들어 말기 천식 및 기도 과민반응), 기관지 천식을 포함한 기관지염, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 피부 홍반 루푸스, 루푸스 신염, 피부근염, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 건선, 안구건조증, I형 당뇨병 및 이와 관련된 합병증, 아토피성 습진(아토피성 피부염), 화농 한선염(HS), 갑상선염(하시모토 및 자가면역 갑상선염), 접촉 피부염 및 추가의 습진성 피부염, 염증성 장 질병(예를 들어 크론병 및 궤양성 대장염), 죽상동맥경화증 및 근위축성 측삭 경화증을 포함한 질병의 그룹을 지칭한다. 특히 용어는 COPD, 천식, 전신 홍반성 루푸스, I형 당뇨병, 아토피성 피부염 및 염증성 장 질병을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, '통증'이란 용어는 강렬하거나 손상을 주는 자극에 의해 종종 유발되는 불쾌한 느낌을 특징으로 하는 질병 또는 질환을 지칭하며, 비제한적으로 침해수용성 통증(예를 들어 내장 통증 및/또는 체성 통증), 염증성 통증(조직 손상 및 염증성 세포 침윤과 연관된) 및 신경병성 또는 기능장애 통증(신경계의 손상 또는 비정상적인 기능에 의해 유발됨), 및/또는 본원에서 언급한 상태와 연관되거나 상기 상태에 의해 유발된 통증을 포함한다. 통증은 급성 또는 만성일 수 있다. 특히, 용어는 염증성 및/또는 신경병성 통증을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, '섬유증'이란 용어는 전신 경화증, 특발성 폐 섬유증 및 다른 형태의 폐 섬유증 및 간질성 폐 질병, 알콜성 지방간염, 비-알콜성 지방간염, 신 섬유증, 및 염증성 장 질병의 결과로서 결장의 섬유증을 지칭한다. 특히, 용어는 경피성 만성 이식편 대 숙주병을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, '증식성 질병(들)'이란 용어는 암(예를 들어 자궁 평활근육종 또는 전립선암), 골수증식성 질환(예를 들어 진성적혈구증가증, 본태성 혈소판증가증 및 골수섬유증), 백혈병(예를 들어 급성 골수성 백혈병, 급성 및 만성 림프모구성 백혈병), 다발성 골수종, 건선, 재협착증, 피부경화증 또는 섬유증과 같은 상태를 지칭한다. 특히 용어는 암, 백혈병, 다발성 골수종 및 건선을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, '암'이란 용어는 피부 또는 신체 기관, 예를 들어 비제한적으로 유방, 전립선, 폐, 신장, 췌장, 위 또는 장 중 세포의 악성 또는 양성 증식을 지칭한다. 암은 인접 조직내로 침윤하여 먼 기관, 예를 들어 뼈, 간, 폐 또는 뇌로 확산(전이)하는 경향이 있다. 본원에 사용되는 바와 같이 암이란 용어는 전이성 종양 세포 유형(예를 들어 비제한적으로 흑색종, 림프종, 백혈병, 섬유육종, 횡문근육종, 및 비만세포종) 및 조직 암종의 유형(예를 들어 비제한적으로 결장직장암, 전립선암, 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암, 유방암, 췌장암, 방광암, 신장암, 위암, 교모세포종, 원발성 간암, 난소암, 전립선암 및 자궁 평활근육종)을 모두 포함한다. 특히, '암'이란 용어는 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성백혈병, 부신피질 암종, 항문암, 맹장암, 성상세포종, 비정형 유기형/간상 종양, 기저세포 암종, 담즙관암, 방광암, 골암(골육종 및 악성 섬유성 조직구증), 뇌간 신경교종, 뇌 종양, 뇌 및 척수 종양, 유방암, 기관지 종양, 버킷 림프종, 경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장암, 결장직장암, 두개암종, 피부 T-세포 림프종, 배아성 종양, 자궁내막암, 뇌실막모세포종, 상의세포종, 식도암, 유잉 육종 계열 종양, 눈암, 망막모세포종, 담낭암, 위장(위)암, 위장관 유암종, 위장간질종양(GIST), 위장기질세포 종양, 생식세포 종양, 신경교종, 털세포 백혈병, 두경부암, 간세포(간)암, 호지킨 림프종, 하인두암, 안내 흑색종, 섬세포 종양(내분비 췌장), 카포시 육종, 신장암, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 털세포 백혈병, 간암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 버킷 림프종, 피부 T-세포림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 림프종, 수모세포종, 수질상피종, 흑색종, 중피종, 구강암, 만성 골수성 백혈병, 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 비인두암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 구강암, 구강인두암, 골육종, 뼈의 악성 섬유성 조직구증, 난소암, 난소상피암, 난소생식세포 종양, 난소 저 악성 잠재성 종양, 췌장암, 유두종, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 중간 분화의 송과체 실질 종양, 송과체모세포종 및 천막상 원시신경외배엽성 종양, 뇌하수체 종양, 혈장세포 신생물/다발성 골수종, 흉막폐모세포종, 원발성 중추신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신장 세포(신장)암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종, 유잉 육종 계열 종양, 카포시 육종, 세자리 증후군, 피부암, 소세포 폐암, 소장암, 연조직 육종, 편평세포 암종, 위(위장)암, 천막상 원시신경세포외배엽 종양, T-세포 림프종, 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 요도암, 자궁암, 자궁육종, 질암, 음문암, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 및 빌름 종양을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이 '백혈병'이란 용어는 혈액 및 혈액 형성 기관의 신생물 질병을 지칭한다. 상기와 같은 질병은 골수 및 면역계 기능장애를 야기할 수 있으며, 이는 숙주를 감염 및 출혈에 매우 민감하게 한다. 특히 백혈병이란 용어는 급성 골수성 백혈병(AML) 및 급성 림프모구성 백혈병(ALL) 및 만성 림프모구성 백혈병(CLL)을 지칭한다.
'본 발명의 화합물(들)' 및 동등한 표현은 본원에 개시된 바와 같은 화학식(들)의 화합물을 포함함을 의미하며, 상기 표현은 약학적으로 허용가능한 염 및 용매화물, 예를 들어 수화물, 및 약학적으로 허용가능한 염의 용매화물(문맥상 그렇게 허용되는 경우)을 포함한다. 유사하게, 중간체에 대한 언급은, 중간체 자체의 청구 여부에 관계 없이, 중간체의 염, 용매화물(문맥상 그렇게 허용되는 경우)을 포함함을 의미한다.
본원에서 범위를 언급하는 경우, 예를 들어 비제한적으로 C1-8 알킬의 경우, 범위의 인용은 상기 범위의 각 구성원들을 나타내는 것으로 간주해야 한다.
본 발명 화합물의 다른 유도체는 그의 산 및 산 유도체 형태 모두의 활성을 갖지만, 산 민감성 형태로 종종, 포유동물 유기체에 대한 용해도, 조직 적합성 또는 지연된 방출의 이점을 제공한다(Bundgaard, H, 1985). 전구약물은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지된 산 유도체, 예를 들어 모 산과 적합한 알콜과의 반응에 의해 제조된 에스테르, 또는 모 산 화합물과 치환되거나 비치환된 아민과의 반응에 의해 제조된 아미드, 또는 산 무수물 또는 혼합된 무수물을 포함한다. 본 발명의 화합물 상에 매달린 산성 그룹으로부터 유도된 간단한 지방족 또는 방향족 에스테르, 아미드 및 무수물이 특히 유용한 전구약물이다. 일부의 경우에 이중 에스테르 유형의 전구약물, 예를 들어(아실옥시)알킬 에스테르 또는((알콕시카보닐)옥시)알킬에스테르를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 상기와 같은 전구약물은 본 발명 화합물의 C1-8 알킬, C2-8 알케닐, C6-10 임의로 치환된 아릴, 및(C6-10 아릴)-(C1-4 알킬) 에스테르이다.
본 개시는 (i) 주어진 원자번호의 모든 원자가 자연에서 우세한 질량수(또는 질량수의 혼합물)를 갖는 형태(본원에서 '천연 동위원소 형태'로서 지칭된다)든, 또는 (ii) 하나 이상의 원자가, 동일한 원자번호를 갖지만 자연에서 우세한 원자의 질량수와 상이한 질량수를 갖는 원자에 의해 교체된 형태(본원에서 '비천연 변형 동위원소 형태'로서 지칭된다)간에, 본원에 제공된 본 발명의 화합물의 모든 동위원소 형태를 포함한다. 원자는 자연적으로는 질량수의 혼합물로서 존재할 수 있는 것으로 이해된다. "비천연 변형 동위원소 형태"란 용어는 또한 자연 중에 덜 통상적으로 발견되는 질량수를 갖는 주어진 원자번호의 원자(본원에서 "통상적이지 않은 동위원소"로서 지칭된다)의 비율이 천연인 경우에 비해, 상기 원자 번호의 원자의 수에 의해, 예를 들어 >20%, >50%, >75%, >90%, >95% 또는 > 99%의 수준까지 증가된 구현예를 포함한다(후자의 구현예는 "동위원소 풍부 변형 형태"로서 지칭된다). "비천연 변형 동위원소 형태"란 용어는 또한 통상적이지 않은 동위원소의 비율이 천연인 경우에 비해 감소된 구현예를 포함한다. 동위원소 형태는 방사성 형태(즉 방사성동위원소를 포함한다) 및 비-방사성 형태를 포함할 수 있다. 방사성 형태는 전형적으로 동위원소 풍부한 변형 형태일 것이다.
따라서 화합물의 비천연 변형 동위원소 형태는 하나 이상의 원자 중에 하나 이상의 인공적인 또는 통상적이지 않은 동위원소, 예를 들어 중수소(2H 또는 D), 탄소-11(11C), 탄소-13(13C), 탄소-14(14C), 질소-13(13N), 질소-15(15N), 산소-15(15O), 산소-17(17O), 산소-18(18O), 인-32(32P), 황-35(35S), 염소-36(36Cl), 염소-37(37Cl), 불소-18(18F) 요오드-123(123I), 요오드-125(125I)를 함유하거나 또는 하나 이상의 원자 중에, 자연에서 우세한 비율에 비해 증가된 비율의 상기 동위원소를 함유할 수 있다.
방사성동위원소를 포함하는 비천연 변형 동위원소 형태는, 예를 들어 약물 및/또는 기질 조직 분포 연구에 사용될 수 있다. 방사성 동위원소인 삼중소수, 즉 3H 및 탄소-14, 즉 14C가 그들의 통합 용이성 및 편리한 검출 수단에 비추어 상기 목적에 특히 유용하다. 중수소, 즉 2H 또는 D를 포함하는 비천연 변형 동위원소 형태는 보다 큰 대사 안정성으로부터 생성되는 몇몇 치료학적 장점, 예를 들어 증가된 생체내 반감기 또는 감소된 투여량 요구를 제공할 수 있으며, 따라서 일부 상황에서 바람직할 수 있다. 더욱이, 양전자 방출 동위원소, 예를 들어 11C, 18F, 15O 및 13N이 통합된 비천연 변형 동위원소 형태를 제조할 수 있으며, 이는 기질 수용체 점유를 조사하기 위한 양전자 방출 단층촬영(PET) 연구에 유용할 것이다.
동일한 분자식을 갖지만 원자들의 결합 성질 또는 순서 또는 상기 원자들의 공간 배열이 상이한 화합물을 '이성질체'라 칭함을 또한 알아야 한다. 원자들의 공간 배열이 상이한 이성질체를 '입체이성질체'라 칭한다.
서로 거울상이 아닌 입체이성질체를 '부분입체이성질체'라 칭하며 서로 겹쳐지지 않는 거울상인 이성질체를 '거울상 이성질체'라 칭한다. 화합물이 비대칭 중심을 갖는 경우, 예를 들어 4 개의 상이한 그룹에 결합되는 경우, 한 쌍의 거울상 이성질체가 가능하다. 거울상 이성질체는 그의 비대칭 중심의 절대 배열을 특징으로 할 수 있으며, 이는 칸과 프레로그(Cahn and Prelog)의 R- 및 S-서열화 법칙에 의해서 또는 분자가 편광면을 회전하는 방식에 의해 개시되고 우회전성 또는 좌회전성(즉 각각(+) 또는(-)-이성질체)으로 표시된다. 키랄 화합물은 개별적인 거울상 이성질체로서 또는 이들의 혼합물로서 존재할 수 있다. 같은 비율의 거울상 이성질체를 함유하는 혼합물을 '라세미 혼합물'이라 칭한다.
'토오토머'는 특정한 화합물 구조의 상호전환 가능한 형태이고 수소 원자 및 전자의 치환이 다양한 화합물을 지칭한다. 따라서, 2 개의 구조는 π 전자 및 원자(대개는 H)의 이동을 통해 평형으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 에놀과 케톤은 산 또는 염기에 의한 처리에 의해 신속하게 상호전환되기 때문에 토오토머이다. 토오토머화의 또 다른 예는 산 또는 염기에 의한 처리에 의해 마찬가지로 형성되는 페닐니트로메탄의 산- 및 질소-형태이다.
토오토머 형태는 관심 화합물의 최적의 화학 반응성 및 생물 활성의 획득에 적합할 수 있다.
본 발명의 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 가질 수 있으며; 따라서 상기와 같은 화합물은 개별적인 (R)- 또는(S)-입체이성질체로서 또는 이들의 혼합물로서 생성될 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, 본원 및 청구의 범위에서 특정 화합물의 기술 또는 명칭은 개별적인 거울상 이성질체 및 이들의 라세미 또는 다른 혼합물 모두를 포함함을 의미한다. 입체이성질체의 입체화학의 결정 및 분리를 위한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 화합물이 대사되어 생물학적으로 활성인 대사산물을 제공할 수 있음을 알 것이다.
본 발명
본 발명은 염증성 질병, 자가면역 질병, 통증, 섬유증 및/또는 증식성 질병의 예방 및/또는 치료에 유용할 수 있는 화합물에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 화합물은 염증성 질병, 자가면역 질병, 통증, 섬유증 및/또는 증식성 질병에 관련된 키나제 패밀리인 인터류킨-1 수용체 연관된 키나제(IRAK), 및 보다 특히 IRAK-4를 억제할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 제조 방법, 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물, 본 발명의 화합물의 투여에 의한 염증성 질병, 자가면역 질병, 통증, 섬유증 및/또는 증식성 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 첫 번째 태양에서, 하기 화학식 I을 갖는 본 발명의 화합물을 제공한다:
화학식 I
Figure pct00008
상기 식에서
R1은
a) 하나 이상의 독립적으로 선택된 -OH, -CN, C1-4　알콕시, 할로, 또는 -S(=O)2-C1-4　알킬로 치환된 C2-6 알킬, 또는
b) 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 S, N 또는 O 원자를 포함하는 6원 헤테로사이클로알킬(헤테로사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, 할로 또는 C1-4　알킬로 치환되고, 알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 할로로 치환된다)이고;
R2는
a) C1-4　알콕시(알콕시는 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로 또는 -OH로 치환된다),
b) -O-C3-4　사이클로알킬(상기 사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로 또는 -OH로 치환된다), 또는
c) -C(=O)NR3aR3b이고;
Cy는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 R4 치환체로 치환된, 1 또는 2개의 N 원자를 포함하는 6원 헤테로아릴이고;
각각의 R3a 및 R3b는
a) H,
b) C1-4　알킬(알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, -CN, C1-4　알콕시, 또는 C3-7　사이클로알킬로 치환되고, 사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로로 치환된다),
c) C3-6　사이클로알킬(사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4 알킬, C1-4　알콕시, 또는 할로로 치환된다), 또는
d) 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 N, S 또는 O 원자를 포함하는 4-6원 헤테로사이클로알킬(헤테로사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4 알킬, C1-4　알콕시, 또는 할로로 치환된다)
중에서 독립적으로 선택되거나;
R3a 및 R3b는 이들이 부착된 N 원자와 함께 4-6원 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬을 형성할 수 있고;
각각의 R4 는 독립적으로
a) 옥소,
b) -OH,
c) -CN,
d) 할로,
e) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C1-4 알킬,
f) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C1-4　알콕시, 또는
g) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C3-7　사이클로알킬이고;
R5는 H, 할로, -CH3 또는 -CF3 중에서 선택된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R5가 H, F, -CH3, 또는 -CF3인 화학식 I에 상응한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R5가 H인 화학식 I에 상응한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R1이 하나 이상의 독립적으로 선택된 -OH, -CN, C1-4　알콕시, 할로, 또는 -S(=O)2-C1-4　알킬로 치환된 C2-6 알킬인 화학식 I에 상응한다. 특정한 구현예에서, R1은 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 -OH, -CN, C1-4　알콕시, 할로, 또는 -S(=O)2-C1-4　알킬로 치환된 C2-6 알킬이다. 특정한 구현예에서, R1은 하나 이상의 독립적으로 선택된 -OH, -CN, -OCH3, F, Cl, 또는 -S(=O)2CH3로 치환된 C2-6 알킬이다. 보다 특정한 구현예에서, R1은 하나의 -OH 또는 -S(=O)2CH3로 치환된 C2-6 알킬이다. 또 다른 보다 특정한 구현예에서, R1은 -CH2-CH3, -CH2-CH2-CH2-CH3, -CH2-CH2-CH(CH3)2이고, 이들은 각각 하나의 -OH 또는 -S(=O)2CH3로 치환된다. 가장 특정한 구현예에서, R1은 -CH2-CH2-C(CH3)2-OH이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R1이 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 S, N 또는 O 원자를 포함하는 6원 헤테로사이클로알킬인 화학식 I에 상응한다. 하나의 구현예에서, R1은 테트라하이드로피라닐, 디옥사닐, 모폴리닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 티오모폴리닐, 또는 1,4-옥사티아닐이다. 보다 특정한 구현예에서, R1은 디옥사닐이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R1이 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 S, N 또는 O 원자를 포함하는 6원 헤테로사이클로알킬이며, 헤테로사이클로알킬이 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, 할로 또는 C1-4 알킬로 치환되고, 알킬이 비치환되거나 또는 하나 이상의 할로로 치환된 화학식 I에 상응한다. 특정한 구현예에서, R1은 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 S, N 또는 O 원자를 포함하는 6원 헤테로사이클로알킬이며, 헤테로사이클로알킬은 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 옥소, 할로 또는 C1-4 알킬로 치환되고, 알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 할로로 치환된다. 또 다른 특정한 구현예에서, R1은 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 S, N 또는 O 원자를 포함하는 6원 헤테로사이클로알킬이며, 헤테로사이클로알킬은 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 옥소, F, Cl, -CH3, -CH2-CH3, 또는 -CF3로 치환된다. 보다 특정한 구현예에서, R1은 테트라하이드로피라닐, 디옥사닐, 모폴리닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 티오모폴리닐, 또는 1,4-옥사티아닐이고, 이들은 각각 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 옥소, 할로 또는 C1-4 알킬로 치환되고, 알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 할로로 치환된다. 또 다른 보다 특정한 구현예에서, R1은 테트라하이드로피라닐, 디옥사닐, 모폴리닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 티오모폴리닐 또는 1,4-옥사티아닐이고, 이들은 각각 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 옥소, F, Cl, -CH3, -CH2-CH3, 또는 -CF3로 치환된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 IIa에 상응한다:
[화학식 IIa]
Figure pct00009
상기 식에서 R2 및 Cy는 앞서 정의된 바와 같다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 IIb에 상응한다:
[화학식 IIb]
Figure pct00010
상기 식에서 R2 및 Cy는 앞서 정의된 바와 같다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R2가 C1-4 알콕시이고 알콕시가 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로 또는 -OH로 치환되는 화학식 I, IIa 또는 IIb에 상응한다. 특정한 구현예에서, R2는 -OCH3, 또는 -OCH2CH3이고, 이들은 각각 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로 또는 -OH로 치환된다. 보다 특정한 구현예에서, R2는 -OCH3, -OCH2CH3, 또는 -OCF3이다. 가장 특정한 구현예에서, R2는 -OCH3이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R2가 -O-C3-4 사이클로알킬이고 사이클로알킬이 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로 또는 -OH로 치환되는 화학식 I, IIa 또는 IIb에 상응한다. 특정한 구현예에서, R2는 -O-사이클로프로필 또는 -O-사이클로부틸이고, 이들은 각각 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로 또는 -OH로 치환된다. 보다 특정한 구현예에서, R2는 -O-사이클로프로필이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R2가 -C(=O)NR3aR3b이고 각각의 R3a 및 R3b가 앞서 기재된 바와 같은 화학식 I, IIa 또는 IIb에 상응한다. 특정한 구현예에서, R3a은 H이고 R3b는 앞서 기재된 바와 같다. 보다 특정한 구현예에서, R3a는 앞서 기재된 바와 같고, R3b는 H이다. 보다 특정한 구현예에서, R3a 및 R3b는 H이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R2가 -C(=O)NR3aR3b이고, R3b가 앞서 기재된 바와 같고, R3a가 C1-4　알킬인 화학식 I, IIa 또는 IIb에 상응한다. 특정한 구현예에서, R3a는 -CH3, -CH2-CH3, 또는 -CH(CH3)2이다. 보다 특정한 구현예에서, R3a는 -CH3이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R2가 -C(=O)NR3aR3b이고, R3b가 앞서 기재된 바와 같고, R3a가 C1-4　알킬이고, 알킬이 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, -CN, C1-4　알콕시, 또는 C3-7　사이클로알킬로 치환되고, 사이클로알킬이 비치환되거나 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로로 치환되는 화학식 I, IIa 또는 IIb에 상응한다. 특정한 구현예에서, R3a는 -CH3, -CH2-CH3, 또는 -CH(CH3)2이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, -CN, C1-4　알콕시, 또는 C3-7　사이클로알킬로 치환되고, 사이클로알킬은 비치환되거나 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로로 치환된다. 보다 특정한 구현예에서, R3a는 C1-4　알킬이고, 알킬은 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, -CN, -OCH3, 사이클로프로필 또는 사이클로부틸로 치환된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R2가 -C(=O)NR3aR3b이고, R3a 앞서 기재된 바와 같고, R3b가 C1-4　알킬인 화학식 I, IIa 또는 IIb에 상응한다. 특정한 구현예에서, R3b는 -CH3, -CH2-CH3, 또는 -CH(CH3)2이다. 보다 특정한 구현예에서, R3b는 -CH3이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R2가 -C(=O)NR3aR3b이고, R3a가 앞서 기재된 바와 같고, R3b가 C1-4　알킬이고, 알킬이 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, -CN, C1-4　알콕시, 또는 C3-7　사이클로알킬로 치환되고, 사이클로알킬이 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로로 치환되는 화학식 I, IIa 또는 IIb에 상응한다. 특정한 구현예에서, R3b는 -CH3, -CH2-CH3, 또는 -CH(CH3)2이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, -CN, C1-4　알콕시, 또는 C3-7　사이클로알킬로 치환되고, 사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로로 치환된다. 보다 특정한 구현예에서, R3b는 C1-4　알킬이고, 알킬은 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, -CN, -OCH3, 사이클로프로필 또는 사이클로부틸로 치환된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R2가 -C(=O)NR3aR3b이고, R3b가 앞서 기재된 바와 같고, R3a가 C3-6　사이클로알킬인 화학식 I, IIa 또는 IIb에 상응한다. 특정한 구현예에서, R3a는 사이클로프로필, 사이클로부틸 또는 사이클로펜틸이다. 보다 특정한 구현예에서, R3a는 사이클로프로필이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R2가 -C(=O)NR3aR3b이고, R3b가 앞서 기재된 바와 같고, R3a가 C3-6　사이클로알킬이고, 사이클로알킬이 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4　알킬, C1-4　알콕시, 또는 할로로 치환된 화학식 I, IIa 또는 IIb에 상응한다. 특정한 구현예에서, R3a는 C3-6　사이클로알킬이고, 사이클로알킬은 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, -CH3, -CH2-CH3, -OCH3, -OCH2CH3, F 또는 Cl로 치환된다. 보다 특정한 구현예에서, R3a는 사이클로프로필, 사이클로부틸 또는 사이클로펜틸이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4　알킬, C1-4　알콕시, 또는 할로로 치환된다. 또 다른 보다 특정한 구현예에서, R3a은 사이클로프로필, 사이클로부틸 또는 사이클로펜틸이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, -CH3, -CH2-CH3, -OCH3, -OCH2CH3, F 또는 Cl로 치환된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R2가 -C(=O)NR3aR3b이고, R3a가 앞서 기재된 바와 같고, R3b가 C3-6　사이클로알킬인 화학식 I, IIa 또는 IIb에 상응한다. 특정한 구현예에서, R3b는 사이클로프로필, 사이클로부틸 또는 사이클로펜틸이다. 가장 특정한 구현예에서, R3b는 사이클로프로필이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R2가 -C(=O)NR3aR3b이고, R3a가 앞서 기재된 바와 같고, R3b가 C3-6　사이클로알킬이고, 사이클로알킬이 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4　알킬, C1-4　알콕시, 또는 할로로 치환되는 화학식 I, IIa 또는 IIb에 상응한다. 특정한 구현예에서, R3b는 C3-6　사이클로알킬이고, 사이클로알킬은 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, -CH3, -CH2-CH3, -OCH3, -OCH2CH3, F 또는 Cl로 치환된다. 보다 특정한 구현예에서, R3b는 사이클로프로필, 사이클로부틸 또는 사이클로펜틸이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4　알킬, C1-4　알콕시, 또는 할로로 치환된다. 또 다른 보다 특정한 구현예에서, R3b는 사이클로프로필, 사이클로부틸 또는 사이클로펜틸이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, -CH3, -CH2-CH3, -OCH3, -OCH2CH3, F 또는 Cl로 치환된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R2가 -C(=O)NR3aR3b이고, R3b가 앞서 기재된 바와 같고, R3a가 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 N, S 또는 O 원자를 포함하는 4-6원 헤테로사이클로알킬인 화학식 I, IIa 또는 IIb에 상응한다. 특정한 구현예에서, R3a는 아제티디닐, 옥세타닐, 피롤리디닐, 테트라하이드로퓨라닐, 모폴리닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 티오모폴리닐이다. 가장 특정한 구현예에서, R3a는 아제티디닐 또는 옥시라닐이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R2가 -C(=O)NR3aR3b이고, R3b가 앞서 기재된 바와 같고, R3a가 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 N, S 또는 O 원자를 포함하는 4-6원 헤테로사이클로알킬이고, 헤테로사이클로알킬이 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4　알킬, C1-4　알콕시, 또는 할로로 치환되는 화학식 I, IIa 또는 IIb에 상응한다. 보다 특정한 구현예에서, R3a는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 N, S 또는 O 원자를 포함하는 4-6원 헤테로사이클로알킬이고, 헤테로사이클로알킬은 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, -CH3, -CH2-CH3, -OCH3, -OCH2CH3, F 또는 Cl로 치환된다. 보다 특정한 구현예에서, R3a는 아제티디닐, 옥세타닐, 피롤리디닐, 테트라하이드로퓨라닐, 모폴리닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 티오모폴리닐이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4　알킬, C1-4　알콕시, 또는 할로로 치환된다. 또 다른 보다 특정한 구현예에서, R3a는 아제티디닐, 옥세타닐, 피롤리디닐, 테트라하이드로퓨라닐, 모폴리닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 티오모폴리닐이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, -CH3, -CH2-CH3, -OCH3, -OCH2CH3, F 또는 Cl로 치환된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R2가 -C(=O)NR3aR3b이고, R3a가 앞서 기재된 바와 같고, R3b가 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 N, S 또는 O 원자를 포함하는 4-6원 헤테로사이클로알킬인 화학식 I, IIa 또는 IIb에 상응한다. 특정한 구현예에서, R3b는 아제티디닐, 옥세타닐, 피롤리디닐, 테트라하이드로퓨라닐, 모폴리닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 티오모폴리닐이다. 가장 특정한 구현예에서, R3b는 아제티디닐 또는 옥시라닐이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R2가 -C(=O)NR3aR3b이고, R3a가 앞서 기재된 바와 같고, R3b가 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 N, S 또는 O 원자를 포함하는 4-6원 헤테로사이클로알킬이고, 헤테로사이클로알킬이 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4　알킬, C1-4　알콕시, 또는 할로로 치환되는 화학식 I, IIa 또는 IIb에 상응한다. 보다 특정한 구현예에서, R3b는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 N, S 또는 O 원자를 포함하는 4-6원 헤테로사이클로알킬이고, 헤테로사이클로알킬은 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, -CH3, -CH2-CH3, -OCH3, -OCH2CH3, F 또는 Cl로 치환된다. 보다 특정한 구현예에서, R3b는 아제티디닐, 옥세타닐, 피롤리디닐, 테트라하이드로퓨라닐, 모폴리닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 티오모폴리닐이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4　알킬, C1-4　알콕시, 또는 할로로 치환된다. 또 다른 보다 특정한 구현예에서, R3b는 아제티디닐, 옥세타닐, 피롤리디닐, 테트라하이드로퓨라닐, 모폴리닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 티오모폴리닐이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, -CH3, -CH2-CH3, -OCH3, -OCH2CH3, F 또는 Cl로 치환된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R2가 -C(=O)NH2, -C(=O)N(CH3)2, 또는 -C(=O)NHCH3인 화학식 I, IIa 또는 IIb에 상응한다. 가장 특정한 구현예에서, R2는 -C(=O)NH2이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 R2가 -C(=O)NR3aR3b이고, R3a 및 R3b가 이들이 부착된 N 원자와 함께 4-6원 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬을 형성할 수 있는 화학식 I, IIa 또는 IIb에 상응한다. 특정한 구현예에서, R2는
Figure pct00011
이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 IIIa, IIIb 또는 IIIc에 상응한다:
[화학식 IIIa]
Figure pct00012
[화학식 IIIb]
Figure pct00013
[화학식 IIIc]
Figure pct00014
상기에서 Cy는 앞서 정의된 바와 같다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 IVa, IVb 또는 IVc에 상응한다:
[화학식 IVa]
Figure pct00015
[화학식 IVb]
Figure pct00016
[화학식 IVc]
Figure pct00017
상기에서 Cy는 앞서 정의된 바와 같다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 Cy가 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 R4 치환체로 치환된, 1 또는 2개의 N 원자를 포함하는 6원 헤테로아릴인 화학식 I-IVc 중 어느 하나에 상응한다. 특정한 구현예에서, Cy는 피리디닐 또는 피라지닐이고, 이들은 각각 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 R4 치환체로 치환된다. 보다 특정한 구현예에서, Cy는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 R4 치환체로 치환된 피리디닐이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 Cy가 앞서 정의된 바와 같고, R4가 옥소인 화학식 I-IVc 중 어느 하나에 상응한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 Cy가 앞서 정의된 바와 같고, R4가 -OH인 화학식 I-IVc 중 어느 하나에 상응한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 Cy가 앞서 정의된 바와 같고, R4가 -CN인 화학식 I-IVc 중 어느 하나에 상응한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 Cy가 앞서 정의된 바와 같고, R4가 할로인 화학식 I-IVc 중 어느 하나에 상응한다. 특정한 구현예에서, R4는 F 또는 Cl이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 Cy가 앞서 정의된 바와 같고, R4가 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH 또는 -CN으로 치환된 C1-4 알킬인 화학식 I-IVc 중 어느 하나에 상응한다. 특정한 구현예에서, R4는 -CH3, -CH2-CH3, 또는 -CH(CH3)2이고, 이들은 각각 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH 또는 -CN으로 치환된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 Cy가 앞서 정의된 바와 같고, R4가 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH 또는 -CN으로 치환된 C1-4 알콕시인 화학식 I-IVc 중 어느 하나에 상응한다. 특정한 구현예에서, R4는 -OCH3, -OCH2-CH3, 또는 -OCH(CH3)2이고, 이들은 각각 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH 또는 -CN으로 치환된다. 보다 특정한 구현예에서, R4는 -OCH3이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 Cy가 앞서 정의된 바와 같고, R4가 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH 또는 -CN으로 치환된 C3-7 사이클로알킬인 화학식 I-IVc 중 어느 하나에 상응한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 Cy가 앞서 정의된 바와 같고, 각각의 R4가 옥소, -CN, -OH, F, Cl, -CH3, -CH2-CH3, -CH(CH3)2, -CF3, -CHF3, -CH2CF3, -CH2CN, -CH2OH, -CH2CH2-CN, -O-CH2-CH3, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 F 또는 -CN으로 치환된 사이클로프로필, 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 F, -OH 또는 -CN으로 치환된 사이클로부틸 중에서 독립적으로 선택되는 화학식 I-IVc 중 어느 하나에 상응한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 화학식 I-IVc 중 어느 하나, 보다 특히 화학식 IIIa에 상응하며, 여기에서 Cy는 하기와 같다:
Figure pct00018
상기 식에서,
R6a는
a) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C1-4 알킬, 또는
b) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C3-7　사이클로알킬이고;
R6b는
a) -OH,
b) -CN,
c) 할로,
d) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C1-4 알킬,
e) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C1-4　알콕시, 또는
f) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C3-7　사이클로알킬이고;
아래첨자 n은 0, 1 또는 2이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 Cy가 Cy1이고, R6a 및 아래첨자 n이 앞서 정의된 바와 같고, R6b가 -CN, -OH, F, Cl, -CH3, -CH2-CH3, -CH(CH3)2, -CF3, -CHF3, -CH2CF3, -CH2CN, -CH2OH, -CH2CH2-CN, -OCH3, -OCH2-CH3, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 F 또는 -CN으로 치환된 사이클로프로필, 또는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 F, -OH 또는 -CN으로 치환된 사이클로부틸인 화학식 I-IVc 중 어느 하나, 보다 특히 화학식 IIIa에 상응한다. 특정한 구현예에서, R6b 는 F, Cl, -CH3, -CF3, 또는 -CHF2, 또는 -OCH3이다. 보다 특정한 구현예에서, R6b는 F이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 Cy가 Cy1이고, R6a가 앞서 정의된 바와 같고, 아래첨자 n이 1이고, R6b가 -CN, -OH, F, Cl, -CH3, -CH2-CH3, -CH(CH3)2, -CF3, -CHF3, -CH2CF3, -CH2CN, -CH2OH, -CH2CH2-CN, -OCH3, -OCH2-CH3, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 F 또는 -CN으로 치환된 사이클로프로필, 또는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 F, -OH 또는 -CN으로 치환된 사이클로부틸인 화학식 I-IVc 중 어느 하나, 보다 특히 화학식 IIIa에 상응한다. 특정한 구현예에서, R6b 는 F, Cl, -CH3, -CF3, 또는 -CHF2, 또는 -OCH3이다. 보다 특정한 구현예에서, R6b는 F이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 Cy가 Cy1이고, R6b 및 아래첨자 n이 앞서 정의된 바와 같고, R6a가 -CH3, -CH2-CH3, -CH(CH3)2, -CF3, -CHF3, -CH2CF3, -CH2CN, -CH2OH, -CH2CH2-CN, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 F 또는 -CN으로 치환된 사이클로프로필, 또는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 F, -OH 또는 -CN으로 치환된 사이클로부틸인 화학식 I-IVc 중 어느 하나, 보다 특히 화학식 IIIa에 상응한다. 특정한 구현예에서, R6a는 -CH3, -CF3, -CHF2, 사이클로프로필 또는 사이클로부틸이다. 보다 특정한 구현예에서, R6a는 -CH3 또는 사이클로프로필이다. 가장 특정한 구현예에서, R6a는 사이클로프로필이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 Cy가 Cy1이고, R6b가 앞서 정의된 바와 같고, 아래첨자 n이 1이고, R6a가 -CH3, -CH2-CH3, -CH(CH3)2, -CF3, -CHF3, -CH2CF3, -CH2CN, -CH2OH, -CH2CH2-CN, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 F 또는 -CN으로 치환된 사이클로프로필, 또는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 F, -OH 또는 -CN으로 치환된 사이클로부틸인 화학식 I-IVc 중 어느 하나, 보다 특히 화학식 IIIa에 상응한다. 특정한 구현예에서, R6a는 -CH3, -CF3, -CHF2, 사이클로프로필 또는 사이클로부틸이다. 보다 특정한 구현예에서, R6a는 -CH3 또는 사이클로프로필이다. 가장 특정한 구현예에서, R6a는 사이클로프로필이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 Cy가 Cy1이고, R6a가 앞서 정의된 바와 같고, 아래첨자 n이 0인 화학식 I-IVc 중 어느 하나, 보다 특히 화학식 IIIa에 상응한다. 특정한 구현예에서, R6a는 -CH3, -CH2-CH3, -CH(CH3)2, -CF3, -CHF3, -CH2CF3, -CH2CN, -CH2OH, -CH2CH2-CN, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 F 또는 -CN으로 치환된 사이클로프로필, 또는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 F, -OH 또는 -CN으로 치환된 사이클로부틸이다. 특정한 구현예에서, R6a는 -CH3, -CF3, -CHF2, 사이클로프로필 또는 사이클로부틸이이다. 보다 특정한 구현예에서, R6a는 -CH3 또는 사이클로프로필이다. 가장 특정한 구현예에서, R6a는 사이클로프로필이다.
하나의 구현예에서, 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 하기 중에서 선택된다:
1-사이클로프로필-N-[2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-6-메톡시피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소피리딘-3-카복스아미드,
N-[2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-6-메톡시피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-1-메틸-2-옥소피리딘-3-카복스아미드,
N-[2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-6-메톡시피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카복스아미드,
2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복스아미드, 및
2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-N-메틸-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복스아미드.
추가의 구현예에서, 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 하기 중에서 선택된다:
1-사이클로프로필-N-[6-메톡시-2-(2-메틸설포닐에틸)피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소-피리딘-3-카복스아미드,
1-(디플루오로메틸)-N-[2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소-피리딘-3-카복스아미드,
2-(1,1-디옥소티안-3-일)-N-메틸-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복스아미드,
1-(디플루오로메틸)-N-[6-에톡시-2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소-피리딘-3-카복스아미드,
2-(1-메틸-4-피페리딜)-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복스아미드 포름산 염,
2-테트라하이드로피란-4-일-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복스아미드,
N-메틸-2-(1-메틸-4-피페리딜)-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복스아미드,
1-사이클로프로필-N-[2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)-6-메톡시-7-메틸-피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소-피리딘-3-카복스아미드,
N-메틸-2-테트라하이드로피란-4-일-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복스아미드,
5-[[6-(디플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]-N-메틸-2-테트라하이드로피란-4-일-피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복스아미드,
5-[[6-(디플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]-2-테트라하이드로피란-4-일-피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복스아미드,
1-사이클로프로필-N-[6-에톡시-2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소-피리딘-3-카복스아미드,
N-[6-에톡시-2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-1-메틸-2-옥소-피리딘-3-카복스아미드,
5-[[6-(디플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]-2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)-N-메틸-피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복스아미드,
5-[[6-(디플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]-2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복스아미드,
1-사이클로부틸-N-[2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소-피리딘-3-카복스아미드,
1-사이클로프로필-N-[2-(2-플루오로-3-하이드록시-3-메틸-부틸)-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소-피리딘-3-카복스아미드,
1-사이클로프로필-N-[6-메톡시-2-[4,4,4-트리듀테리오-3-하이드록시-3-(트리듀테리오메틸)부틸]피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소-피리딘-3-카복스아미드,
1-사이클로프로필-N-[2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-6-(트리듀테리오메톡시)피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소피리딘-3-카복스아미드,
1-사이클로프로필-N-[2-(2-플루오로-3-하이드록시-3-메틸-부틸)-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소-피리딘-3-카복스아미드 거울상이성질체 A, 및
1-사이클로프로필-N-[2-(2-플루오로-3-하이드록시-3-메틸-부틸)-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소-피리딘-3-카복스아미드 거울상이성질체 B.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 1-사이클로프로필-N-[2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-6-메톡시피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소피리딘-3-카복스아미드이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 화합물은 1-사이클로프로필-N-[2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-6-메톡시피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소피리딘-3-카복스아미드가 아니다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 천연 동위원소 형태로 제공된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 비천연 변형 동위원소 형태로 제공된다. 특정한 구현예에서, 비천연 변형 동위원소 형태는 본 발명의 화합물의 하나 이상의 원자에서 수소가 화학 구조 중에 명시되는 경우 중수소(즉 2H 또는 D)가 통합된 형태이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물의 원자는 방사성이 아닌 동위원소 형태이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물의 하나 이상의 원자는 방사성인 동위원소 형태이다. 적합한 방사성 동위원소는 안정한 동위원소이다. 적합하게 비천연 변형 동위원소 형태는 약학적으로 허용가능한 형태이다.
하나의 구현예에서, 화합물의 단일 원자가 비천연 변형 동위원소 형태로 존재하는 본 발명의 화합물을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 2개 이상의 원자가 비천연 변형 동위원소 형태로 존재하는 본 발명의 화합물을 제공한다.
비천연 동위원소 변형 형태는 일반적으로 당업자에게 공지된 통상적인 기법에 의해 또는 본원에 기재된 과정, 예를 들어 천연 동위원소 형태의 제조에 대해서 첨부된 실시예에 기재된 바와 유사한 과정에 의해서 제조될 수 있다. 따라서, 비천연 동위원소 변형 형태를 실시예로서 예시된 실시예에 사용된 통상적인 시약 대신에 적합한 동위원소 변형(또는 표지된) 시약을 사용함으로써 제조할 수 있었다.
하나의 태양에서 본원에 기재된 구현예 중 어느 하나에 따른 본 발명의 화합물은 유리 염기로서 존재한다.
하나의 태양에서 본원에 기재된 구현예 중 어느 하나에 따른 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용가능한 염이다.
하나의 태양에서 본원에 기재된 구현예 중 어느 하나에 따른 본 발명의 화합물은 화합물의 용매화물이다.
하나의 태양에서 본원에 기재된 구현예 중 어느 하나에 따른 본 발명의 화합물은 화합물의 약학적으로 허용가능한 염의 용매화물이다.
각 구현예의 명시된 그룹들을 별도로 상기에 일반적으로 나열하였지만, 본 발명의 화합물은 상기 화학식뿐만 아니라 본 발명에 제공된 다른 화학식의 다수의 또는 각각의 구현예가 각각의 변수에 대해서 각각 나타낸 특정한 구성원 또는 그룹 중 하나 이상으로부터 선택된 것이다. 따라서, 본 발명은 그의 범위내에 상기와 같은 구현예의 모든 조합을 포함하고자 한다.
각 구현예에 대해 명시된 그룹들을 상기에 별도로 일반적으로 나열하였지만, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 변수(예를 들어 R 기)가 상기 나열된 화학식(들) 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 구현예 중에서 선택된 것일 수 있다. 따라서, 본 발명은 그의 범위내에 개시된 구현예 중 어느 하나로부터의 변수의 모든 조합을 포함하고자 한다.
한편으로, 그룹 또는 구현예로부터의 명시된 변수 중 하나 이상, 또는 이들의 조합의 제외도 또한 본 발명에 의해 고려된다.
몇몇 태양에서, 본 발명은 상기 화학식에 따른 화합물의 전구약물 및 유도체를 제공한다. 전구약물은 대사적으로 절단가능한 그룹을 가지며 용매분해에 의해서 또는 생리학적 조건하에서 본 발명의 화합물로 되는, 생체내에서 약학적으로 활성인 본 발명의 화합물의 유도체이다. 상기와 같은 예는 비제한적으로 콜린 에스테르 유도체 등, N-알킬모폴린 에스테르 등을 포함한다.
본 발명의 화합물의 다른 유도체는 상기 화합물의 산 및 산 유도체 형태 모두에서 활성을 갖지만, 종종 산 민감성 형태가 용해도, 조직 적합성, 또는 포유동물 유기체에서 지연된 방출의 이점을 제공한다(Bundgaard 1985). 전구약물은 당해 분야의 전문가에게 널리 공지된 산 유도체, 예를 들어 모산과 적합한 알콜과의 반응에 의해 제조된 에스테르, 또는 모산 화합물과 치환되거나 비치환된 아민과의 반응에 의해 제조된 아미드, 또는 산 무수물, 또는 혼합된 무수물을 포함한다. 본 발명의 화합물에 대해 펜던트인 산성 기로부터 유도된 간단한 지방족 또는 방향족 에스테르, 아미드 및 무수물이 바람직한 전구약물이다. 일부의 경우에 이중 에스테르 유형의 전구약물, 예를 들어(아실옥시)알킬 에스테르 또는((알콕시카보닐)옥시)알킬에스테르를 제조하는 것이 바람직하다. 본 발명의 화합물의 C1 내지 C8 알킬, C2-C8 알케닐, 아릴, C7-C12 치환된 아릴, 및 C7-C12 아릴알킬 에스테르가 특히 유용하다.
조항
하기 화학식 I에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 용매화물, 또는 용매화물의 염, 또는 그의 대사산물:
화학식 I
Figure pct00019
상기 식에서
R1은
a) 하나 이상의 독립적으로 선택된 -OH, -CN, C1-4　알콕시, 할로, 또는 -S(=O)2-C1-4　알킬로 치환된 C2-6 알킬, 또는
b) 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 S, N 또는 O 원자를 포함하는 6원 헤테로사이클로알킬(헤테로사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, 할로 또는 C1-4　알킬로 치환되고, 알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 할로로 치환된다)이고;
R2는
a) C1-4　알콕시(알콕시는 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로 또는 -OH로 치환된다),
b) -O-C3-4　사이클로알킬(사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로 또는 -OH로 치환된다), 또는
c) -C(=O)NR3aR3b이고;
Cy는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 R4 치환체로 치환된, 1 또는 2개의 N 원자를 포함하는 6원 헤테로아릴이고;
각각의 R3a 및 R3b는
a) H,
b) C1-4　알킬(알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, -CN, C1-4　알콕시, 또는 C3-7　사이클로알킬로 치환되고, 사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로로 치환된다),
c) C3-6　사이클로알킬(사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4 알킬, C1-4　알콕시, 또는 할로로 치환된다), 또는
d) 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 N, S 또는 O 원자를 포함하는 4-6원 헤테로사이클로알킬(헤테로사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4 알킬, C1-4　알콕시, 또는 할로로 치환된다)
중에서 독립적으로 선택되거나;
R3a 및 R3b는 이들이 부착된 N 원자와 함께 4-6원 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬을 형성할 수 있고;
각각의 R4 는 독립적으로
a) 옥소,
b) -OH,
c) -CN,
d) 할로,
e) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C1-4 알킬,
f) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C1-4　알콕시, 또는
g) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C3-7　사이클로알킬이고;
R5는 H, 할로, -CH3 또는 -CF3 중에서 선택된다.
2. 1항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R5는 H, F, -CH3, 또는 -CF3이다.
3. 1항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R5는 H이다.
4. 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R1은 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 -OH, -CN, C1-4　알콕시, 할로, 또는 -S(=O)2-C1-4　알킬로 치환된 C2-6 알킬이다.
5. 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R1은 하나 이상의 독립적으로 선택된 -OH, -CN, -OCH3, F, Cl, 또는 -S(=O)2CH3로 치환된 C2-6 알킬이다.
6. 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R1은 -CH2-CH3, -CH2-CH3, -CH2-CH2-CH2-CH3, -CH2-CH2-CH(CH3)2이고, 이들은 각각 하나의 -OH 또는 -S(=O)2CH3로 치환된다.
7. 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R1은 -CH2-CH2-C(CH3)2-OH이다.
8. 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R1은 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 S, N 또는 O 원자를 포함하는 6원 헤테로사이클로알킬이다.
9. 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R1은 테트라하이드로피라닐, 디옥사닐, 모폴리닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 티오모폴리닐, 또는 1,4-옥사티아닐이다.
10. 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R1은 디옥사닐이다.
11. 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R1은 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 S, N 또는 O 원자를 포함하는 6원 헤테로사이클로알킬이며, 헤테로사이클로알킬은 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, 할로 또는 C1-4 알킬로 치환되고, 알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 할로로 치환된다.
12. 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R1은 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 S, N 또는 O 원자를 포함하는 6원 헤테로사이클로알킬이며, 헤테로사이클로알킬은 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 옥소, F, Cl, -CH3, -CH2-CH3, 또는 -CF3로 치환된다.
13. 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R1은 테트라하이드로피라닐, 디옥사닐, 모폴리닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 티오모폴리닐, 또는 1,4-옥사티아닐이고, 이들은 각각 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 옥소, F, Cl, -CH3, -CH2-CH3, 또는 -CF3로 치환된다.
14. 1항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, 화합물은 하기 화학식 IIa에 상응한다:
화학식 IIa
Figure pct00020
상기 식에서 R2 및 Cy는 앞서 정의된 바와 같다.
15. 1항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, 화합물은 하기 화학식 IIb에 상응한다:
화학식 IIb
Figure pct00021
상기 식에서 R2 및 Cy는 앞서 정의된 바와 같다.
16. 1항 내지 15항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R2는 C1-4 알콕시이고 알콕시는 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로 또는 -OH로 치환된다.
17. 1항 내지 15항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R2는 -OCH3, 또는 -OCH2CH3이고, 이들은 각각 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로 또는 -OH로 치환된다.
18. 1항 내지 15항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, 보다 특정한 구현예에서, R2는 -OCH3, -OCH2CH3, 또는 -OCF3이다.
19. 1항 내지 15항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R2는 -O-C3-4 사이클로알킬이고 사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로 또는 -OH로 치환된다.
20. 1항 내지 15항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R2는 -O-사이클로프로필 또는 -O-사이클로부틸이고, 이들은 각각 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로 또는 -OH로 치환된다.
21. 1항 내지 15항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R2는 -O-사이클로프로필이다.
22. 1항 내지 15항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R2는 -C(=O)NR3aR3b이다.
23. 22항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3a은 H이다.
24. 22항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3a는 C1-4　알킬이다.
25. 22항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3a는 -CH3, -CH2-CH3, 또는 -CH(CH3)2이다.
26. 22항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3a는 C1-4　알킬이고, 알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, -CN, C1-4　알콕시, 또는 C3-7　사이클로알킬로 치환되고, 사이클로알킬은 비치환되거나 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로로 치환된다.
27. 22항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3a는 C3-6　사이클로알킬이다.
28. 22항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3a는 사이클로프로필, 사이클로부틸 또는 사이클로펜틸이다.
29. 22항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3a는 사이클로프로필이다.
30. 22항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3a는 C3-6　사이클로알킬이고, 사이클로알킬은 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4　알킬, C1-4　알콕시, 또는 할로로 치환된다.
31. 22항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3a는 C3-6　사이클로알킬이고, 사이클로알킬은 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, -CH3, -CH2-CH3, -OCH3, -OCH2CH3, F 또는 Cl로 치환된다.
32. 22항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3a는 사이클로프로필, 사이클로부틸 또는 사이클로펜틸이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, -CH3, -CH2-CH3, -OCH3, -OCH2CH3, F 또는 Cl로 치환된다.
33. 22항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3a는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 N, S 또는 O 원자를 포함하는 4-6원 헤테로사이클로알킬이다.
34. 22항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3a는 아제티디닐, 옥세타닐, 피롤리디닐, 테트라하이드로퓨라닐, 모폴리닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 티오모폴리닐이다.
35. 22항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3a는 아제티디닐 또는 옥시라닐이다.
36. 22항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3a는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 N, S 또는 O 원자를 포함하는 4-6원 헤테로사이클로알킬이고, 헤테로사이클로알킬은 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4　알킬, C1-4　알콕시, 또는 할로로 치환된다.
37. 22항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3a는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 N, S 또는 O 원자를 포함하는 4-6원 헤테로사이클로알킬이고, 헤테로사이클로알킬은 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, -CH3, -CH2-CH3, -OCH3, -OCH2CH3, F 또는 Cl로 치환된다.
38. 22항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3a는 아제티디닐, 옥세타닐, 피롤리디닐, 테트라하이드로퓨라닐, 모폴리닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 티오모폴리닐이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4　알킬, C1-4　알콕시로 치환된다.
39. 22항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3a는 아제티디닐, 옥세타닐, 피롤리디닐, 테트라하이드로퓨라닐, 모폴리닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 티오모폴리닐이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, -CH3, -CH2-CH3, -OCH3, -OCH2CH3, F 또는 Cl로 치환된다.
40. 22항 내지 39항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3b은 H이다.
41. 22항 내지 39항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3b는 C1-4　알킬이다.
42. 22항 내지 39항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3b는 -CH3, -CH2-CH3, 또는 -CH(CH3)2이다.
43. 22항 내지 39항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3b는 C1-4　알킬이고, 알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, -CN, C1-4　알콕시, 또는 C3-7　사이클로알킬로 치환되고, 사이클로알킬은 비치환되거나 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로로 치환된다.
44. 22항 내지 39항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3b는 C3-6　사이클로알킬이다.
45. 22항 내지 39항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3b는 사이클로프로필, 사이클로부틸 또는 사이클로펜틸이다.
46. 22항 내지 39항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3b는 사이클로프로필이다.
47. 22항 내지 39항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3b는 C3-6　사이클로알킬이고, 사이클로알킬은 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4　알킬, C1-4　알콕시, 또는 할로로 치환된다.
48. 22항 내지 39항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3b는 C3-6　사이클로알킬이고, 사이클로알킬은 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, -CH3, -CH2-CH3, -OCH3, -OCH2CH3, F 또는 Cl로 치환된다.
49. 22항 내지 39항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3b는 사이클로프로필, 사이클로부틸 또는 사이클로펜틸이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, -CH3, -CH2-CH3, -OCH3, -OCH2CH3, F 또는 Cl로 치환된다.
50. 22항 내지 39항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3b는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 N, S 또는 O 원자를 포함하는 4-6원 헤테로사이클로알킬이다.
51. 22항 내지 39항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3b는 아제티디닐, 옥세타닐, 피롤리디닐, 테트라하이드로퓨라닐, 모폴리닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 티오모폴리닐이다.
52. 22항 내지 39항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3b는 아제티디닐 또는 옥시라닐이다.
53. 22항 내지 39항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3b는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 N, S 또는 O 원자를 포함하는 4-6원 헤테로사이클로알킬이고, 헤테로사이클로알킬은 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4　알킬, C1-4　알콕시, 또는 할로로 치환된다.
54. 22항 내지 39항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3b는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 N, S 또는 O 원자를 포함하는 4-6원 헤테로사이클로알킬이고, 헤테로사이클로알킬은 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, -CH3, -CH2-CH3, -OCH3, -OCH2CH3, F 또는 Cl로 치환된다.
55. 22항 내지 39항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3b는 아제티디닐, 옥세타닐, 피롤리디닐, 테트라하이드로퓨라닐, 모폴리닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 티오모폴리닐이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4　알킬, C1-4　알콕시로 치환된다.
56. 22항 내지 39항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3b는 아제티디닐, 옥세타닐, 피롤리디닐, 테트라하이드로퓨라닐, 모폴리닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 티오모폴리닐이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, -CH3, -CH2-CH3, -OCH3, -OCH2CH3, F 또는 Cl로 치환된다.
57. 1항 내지 15항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R2는 -C(=O)NH2, -C(=O)N(CH3)2, 또는 -C(=O)NHCH3이다.
58. 1항 내지 15항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R2는 -C(=O)NH2이다.
59. 22항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R3a 및 R3b는 이들이 부착된 N 원자와 함께 4-6원 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬을 형성할 수 있다.
60. 1항 내지 15항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R2는
Figure pct00022
이다.
61. 1항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 IIIa, IIIb 또는 IIIc에 상응한다:
화학식 IIIa
Figure pct00023
화학식 IIIb
Figure pct00024
화학식 IIIc
Figure pct00025
62. 1항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 IVa, IVb 또는 IVc에 상응한다:
화학식 IVa
Figure pct00026
화학식 IVb
Figure pct00027
화학식 IVc
Figure pct00028
63. 1항 내지 62항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, Cy는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 R4 치환체로 치환된, 1 또는 2개의 N 원자를 포함하는 6원 헤테로아릴이다.
64. 1항 내지 62항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, Cy는 피리디닐 또는 피라지닐이고, 이들은 각각 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 R4 치환체로 치환된다.
65. 1항 내지 62항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, Cy는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 R4 치환체로 치환된 피리디닐이다.
66. 63항 내지 65항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R4는 옥소이다.
67. 63항 내지 65항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R4는 -OH이다.
68. 63항 내지 65항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R4는 -CN이다.
69. 63항 내지 65항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R4는 할로이다.
70. 63항 내지 65항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R4는 F 또는 Cl이다.
71. 63항 내지 65항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R4는 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH 또는 -CN으로 치환된 C1-4 알킬이다.
72. 63항 내지 65항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R4는 -CH3, -CH2-CH3, 또는 -CH(CH3)2이고, 이들은 각각 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH 또는 -CN으로 치환된다.
73. 63항 내지 65항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R4는 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH 또는 -CN으로 치환된 C1-4 알콕시이다.
74. 63항 내지 65항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R4는 -OCH3, -OCH2-CH3, 또는 -OCH(CH3)2이고, 이들은 각각 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH 또는 -CN으로 치환된다.
75. 63항 내지 65항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R4는 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH 또는 -CN으로 치환된 C3-7 사이클로알킬이다.
76. 63항 내지 65항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, 각각의 R4는 옥소, -OH, -CN, F, Cl, -CH3, -CH2-CH3, -CH(CH3)2, -CF3, -CHF3, -CH2CF3, -CH2CN, -CH2OH, -CH2CH2-CN, -O-CH2-CH3, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 F 또는 -CN으로 치환된 사이클로프로필, 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 F, -OH 또는 -CN으로 치환된 사이클로부틸 중에서 독립적으로 선택된다.
77. 1항, 14항, 15항, 61항 또는 62항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, Cy는 하기와 같다:
Figure pct00029
상기 식에서,
R6a는
a) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C1-4 알킬, 또는
b) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C3-7　사이클로알킬이고;
R6b는
a) -OH,
b) -CN,
c) 할로,
d) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C1-4 알킬,
e) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C1-4　알콕시, 또는
f) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C3-7　사이클로알킬이고;
아래첨자 n은 0, 1 또는 2이다.
78. 77항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R6b는 -CN, -OH, F, Cl, -CH3, -CH2-CH3, -CH(CH3)2, -CF3, -CHF3, -CH2CF3, -CH2CN, -CH2OH, -CH2CH2-CN, -OCH3, -OCH2-CH3, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 F 또는 -CN으로 치환된 사이클로프로필, 또는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 F, -OH 또는 -CN으로 치환된 사이클로부틸이다.
79. 77항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R6b 는 F, Cl, -CH3, -CF3, -CHF2, 또는 -OCH3이다.
80. 77항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R6b는 F이다.
81. 77항 내지 80항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, 아래첨자 n은 1이다.
82. 77항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, 아래첨자 n은 0이다.
83. 77항 내지 82항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R6a는 -CH3, -CH2-CH3, -CH(CH3)2, -CF3, -CHF3, -CH2CF3, -CH2CN, -CH2OH, -CH2CH2-CN, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 F 또는 -CN으로 치환된 사이클로프로필, 또는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 F, -OH 또는 -CN으로 치환된 사이클로부틸이다.
84. 77항 내지 82항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R6a는 -CH3, -CF3, -CHF2, 사이클로프로필 또는 사이클로부틸이다.
85. 77항 내지 82항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R6a는 -CH3 또는 사이클로프로필이다.
86. 77항 내지 82항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염에서, R6a는 사이클로프로필이다.
약학 조성물
본 발명의 화합물은 약제로서 사용될 때, 전형적으로는 약학 조성물의 형태로 투여된다. 상기와 같은 조성물은 제약 분야에 널리 공지된 방식으로 제조될 수 있으며 하나 이상의 화학식 I에 따른 본 발명의 활성 화합물을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 화합물을 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 실제 투여되는 화합물의 양은 전형적으로는 의사에 의해, 관련된 상황, 예를 들어 치료하려는 질환, 선택된 투여 경로, 실제 투여되는 화합물, 개인 환자의 연령, 체중 및 반응, 환자의 증상의 중증도 등에 비추어 결정될 것이다.
본 발명의 약학 조성물을 경구, 직장, 경피, 피하, 관절-내, 정맥 내, 근육 내 및 비 내를 포함한 다양한 경로에 의해 투여할 수 있다. 의도하는 전달 경로에 따라, 본 발명의 화합물을 바람직하게는 주사성 또는 경구 조성물로서 또는 연고로서, 로션으로서 또는 모든 경피 투여의 경우 패치로서 제형화한다.
경구 투여용 조성물은 벌크 액체 용액 또는 현탁액, 또는 벌크 분말의 형태를 취할 수 있다. 그러나, 보다 통상적으로, 조성물을 단위 투여형으로 제공하여 정확한 투여를 용이하게 한다. '단위 투여형'이란 용어는 인간 환자 및 다른 포유동물에 대해 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 목적하는 치료 효과를 생성시키도록 계산된 소정량의 활성 물질을, 적합한 약학 부형제, 비히클 또는 담체와 함께 함유한다. 전형적인 단위 투여형은 액체 조성물의 미리 충전되거나, 미리 측정된 앰풀 또는 주사기 또는 고체 조성물의 경우에 환제, 정제, 캡슐 등을 포함한다. 상기와 같은 조성물에서, 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 대개 소량 성분(약 0.1 내지 약 50 중량% 또는 바람직하게는 약 1 내지 약 40 중량%)이며, 나머지는 다양한 비히클 또는 담체 및 목적하는 투여형의 형성에 도움이 되는 가공 보조제이다.
경구 투여용으로 적합한 액체 형태는 완충제, 현탁 및 분배제, 착색제, 풍미제 등과 함께 적합한 수성 또는 비수성 비히클을 포함할 수 있다. 고체 형태는 예를 들어 하기의 성분들 중 임의의 것 또는 유사한 성질의 화합물을 포함할 수 있다: 결합제, 예를 들어 미정질 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들어 전분 또는 락토오스, 붕해제, 예를 들어 알긴산, 프리모젤(Primojel), 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트; 활주제, 예를 들어 콜로이드성 이산화 규소; 감미제, 예를 들어 슈크로스 또는 사카린; 또는 풍미제, 예를 들어 페퍼민트, 또는 오렌지향.
주사성 조성물은 전형적으로는 주사성 멸균 염수 또는 포스페이트-완충된 염수 또는 당해 분야에 공지된 다른 주사성 담체를 기본으로 한다. 이전과 같이, 상기와 같은 조성물 중의 화학식 I에 따른 본 발명의 활성 화합물은 전형적으로는 소량 성분(종종 약 0.05 내지 10 중량%)이며, 나머지는 주사성 담체 등이다.
경피 조성물을 전형적으로는 활성 성분(들)을 일반적으로 약 0.01 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 10 중량%, 및 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 약 15 중량% 범위의 양으로 함유하는 국소 연고 또는 크림으로서 제형화한다. 연고로서 제형화 시, 활성 성분을 전형적으로는 파라핀성 또는 수-혼화성 연고 베이스와 배합할 것이다. 한편으로, 활성 성분을 예를 들어 수중 유적형 크림 베이스와 함께 크림으로 제형화할 수도 있다. 상기와 같은 경피 제형은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 일반적으로는 활성 성분 또는 제형의 피부 침투 안정성을 증대시키기 위해서 추가적인 성분들을 포함한다. 모든 상기와 같은 공지된 경피 제형 및 성분들은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 화합물을 또한 경피 장치에 의해 투여할 수 있다. 따라서, 경피 투여를 수용조 또는 다공성 막 유형, 또는 고체 기질 잡동사니의 패치를 사용하여 수행할 수 있다.
경구 투여성, 주사성 또는 국소 투여성 조성물에 대한 상술한 성분들은 단지 예시적인 것이다. 다른 물질들뿐만 아니라 가공 기법 등이 본 발명에 참고로 인용된 문헌[Part 8 of Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th edition, 1985, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]에 나열되어 있다.(1985)
본 발명의 화합물을 또한 서방성 형태로 또는 서방성 약물 전달 시스템으로부터 투여할 수 있다. 전형적인 서방성 물질에 대한 명세를 문헌[Remington’s Pharmaceutical Sciences]에서 찾을 수 있다.(1985)
하기의 제형예는 본 발명에 따라 제조될 수 있는 전형적인 약학 조성물을 예시한다. 그러나, 본 발명을 하기의 약학 조성물로 제한하지 않는다.
제형 1 - 정제
화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 대략 1:2 중량비로 건조 젤라틴 결합제와 함께 건조 분말로서 혼합할 수 있다. 소량의 마그네슘 스테아레이트를 윤활제로서 첨가할 수도 있다. 혼합물을 정제 프레스에서 240 내지 270 ㎎ 정제(정제당 80 내지 90 ㎎의 화학식 I에 따른 본 발명의 활성 화합물)로 형성시킬 수 있다.
제형 2 - 캡슐
화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 대략 1:1 중량비로 전분 희석제와 함께 건조 분말로서 혼합할 수 있다. 혼합물을 250 ㎎ 캡슐에 충전할 수 있다(캡슐당 125 ㎎의 화학식 I에 따른 본 발명의 활성 화합물).
제형 3 - 액체
화학식 I에 따른 본 발명의 화합물(125 ㎎)을 슈크로스(1.75 g) 및 잔탄 검(4 ㎎)과 혼합하고, 생성된 혼합물을 블렌딩하고, 10번 메쉬 U.S. 체에 통과시키고, 이어서 앞서 제조된 미정질 셀룰로스와 나트륨 카복시메틸 셀룰로스(11:89, 50 ㎎)의 수중 용액과 혼합할 수 있다. 나트륨 벤조에이트(10 ㎎), 풍미제 및 착색제를 물로 희석하고, 교반하면서 첨가할 수도 있다. 이어서 충분한 물을 교반하면서 가할 수 있다. 이어서 충분한 물을 가하여 총 5 ㎖의 부피를 생성시킬 수 있다.
제형 4 - 정제
화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 대략 1:2 중량비로 건조 젤라틴 결합제와 함께 건조 분말로서 혼합할 수 있다. 소량의 마그네슘 스테아레이트를 윤활제로서 첨가할 수 있다. 혼합물을 정제 프레스에서 450 내지 900 ㎎ 정제(150 내지 300 ㎎의 화학식 I에 따른 본 발명의 활성 화합물)로 형성시킨다.
제형 5 - 주사액
화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 대략 5 ㎎/㎖의 농도로 완충된 멸균 염수 주사성 수성 매질에 용해시키거나 현탁시킬 수 있다.
제형 6 - 국소용
스테아릴 알콜(250 g) 및 백색 바셀린(250 g)을 약 75 ℃에서 용융시키고 이어서 수(약 370 g) 중에 용해된 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물(50 g), 메틸파라벤(0.25 g), 프로필파라벤(0.15 g), 나트륨 라우릴 설페이트(10 g), 및 프로필렌 글리콜(120 g)의 혼합물을 가하고, 생성되는 혼합물을 응결시까지 교반할 수 있다.
치료 방법
하나의 구현예에서, 본 발명은 약물에 사용하기 위한 본 발명의 화합물, 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 염증성 질병, 자가면역 질병, 통증, 섬유증 및/또는 증식성 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 염증성 질병, 자가면역 질병, 통증, 섬유증 및/또는 증식성 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
추가의 치료 방법 태양에서, 본 발명은 염증성 질병, 자가면역 질병, 통증, 섬유증 및/또는 증식성 질병에 걸린 포유동물의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 방법은 유효량의 본 발명의 화합물 또는 상기 상태의 치료 또는 예방을 위해 본 명세서에 기재된 약학 조성물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 화합물, 및 또 다른 치료제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 구현예에서, 다른 치료제는 염증성 질병, 자가면역 질병, 통증, 섬유증 및/또는 증식성 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 작용제이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 염증성 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 구현예에서, 염증성 질병은 류마티스성 관절염, 골관절염, 소아 특발성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식, 비염), 만성 폐쇄성 폐 질병(COPD), 염증성 장 질환(예를 들어 크론병, 궤양성 대장염), 내독소-구동된 질병 상태(예를 들어 우회술 후 합병증 또는 예를 들어 만성 심부전에 기여하는 만성 내독소 상태), 및 연골 관련된 질병, 예를 들어 관절 질병 중에서 선택된다. 보다 특히, 염증성 질병은 류마티스성 관절염, 건선 또는 소아 특발성 관절염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 염증성 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 구현예에서, 염증성 질병은 류마티스성 관절염, 골관절염, 소아 특발성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식, 비염), 만성 폐쇄성 폐 질병(COPD), 염증성 장 질환(예를 들어 크론병, 궤양성 대장염), 내독소-구동된 질병 상태(예를 들어 우회술 후 합병증 또는 예를 들어 만성 심부전에 기여하는 만성 내독소 상태), 및 연골 관련된 질병, 예를 들어 관절 질병 중에서 선택된다. 보다 특히, 염증성 질병은 류마티스성 관절염, 건선 또는 소아 특발성 관절염이다.
추가의 치료 방법 태양에서, 본 발명은 염증성 질병에 걸린 포유동물의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 방법은 유효량의 본 발명의 화합물 또는 상기 상태의 치료 또는 예방을 위해 본 명세서에 기재된 약학 조성물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 특정한 구현예에서, 염증성 질병은 류마티스성 관절염, 골관절염, 소아 특발성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식, 비염), 만성 폐쇄성 폐 질병(COPD), 염증성 장 질환(예를 들어 크론병, 궤양성 대장염), 내독소-구동된 질병 상태(예를 들어 우회술 후 합병증 또는 예를 들어 만성 심부전에 기여하는 만성 내독소 상태), 및 연골 관련된 질병, 예를 들어 관절 질병 중에서 선택된다. 보다 특히, 염증성 질병은 류마티스성 관절염, 건선 또는 소아 특발성 관절염이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 화합물, 및 또 다른 치료제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 구현예에서, 다른 치료제는 염증성 질병 치료제이다. 특정한 구현예에서, 염증성 질병은 류마티스성 관절염, 골관절염, 소아 특발성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식, 비염), 만성 폐쇄성 폐 질병(COPD), 염증성 장 질환(예를 들어 크론병, 궤양성 대장염), 내독소-구동된 질병 상태(예를 들어 우회술 후 합병증 또는 예를 들어 만성 심부전에 기여하는 만성 내독소 상태), 및 연골 관련된 질병, 예를 들어 관절 질병 중에서 선택된다. 보다 특히, 염증성 질병은 류마티스성 관절염, 건선 또는 소아 특발성 관절염이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 자가면역 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 구현예에서, 자가면역 질병은 COPD와 같은 상태를 포함한 폐쇄성 기도 질병, 천식(예를 들어 내인성 천식, 외인성 천식, 먼지 천식, 소아 천식), 특히 만성 또는 고질성 천식(예를 들어 말기 천식 및 기도 과민반응), 기관지 천식을 포함한 기관지염, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 피부 홍반 루푸스, 루푸스 신염, 피부근염, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 건선, 안구건조증, I형 당뇨병 및 이와 관련된 합병증, 아토피성 습진(아토피성 피부염), 갑상선염(하시모토 및 자가면역 갑상선염), 접촉 피부염 및 추가의 습진성 피부염, 염증성 장 질병(예를 들어 크론병 및 궤양성 대장염), 죽상동맥경화증 및 근위축성 측삭 경화증 중에서 선택된다. 보다 특히 자가면역 질병은 전신 홍반성 루푸스이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 자가면역 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 구현예에서, 자가면역 질병은 COPD와 같은 상태를 포함한 폐쇄성 기도 질병, 천식(예를 들어 내인성 천식, 외인성 천식, 먼지 천식, 소아 천식), 특히 만성 또는 고질성 천식(예를 들어 말기 천식 및 기도 과민반응), 기관지 천식을 포함한 기관지염, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 피부 홍반 루푸스, 루푸스 신염, 피부근염, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 건선, 안구건조증, I형 당뇨병 및 이와 관련된 합병증, 아토피성 습진(아토피성 피부염), 갑상선염(하시모토 및 자가면역 갑상선염), 접촉 피부염 및 추가의 습진성 피부염, 염증성 장 질병(예를 들어 크론병 및 궤양성 대장염), 죽상동맥경화증 및 근위축성 측삭 경화증 중에서 선택된다. 보다 특히 자가면역 질병은 전신 홍반성 루푸스이다.
추가의 치료 방법 태양에서, 본 발명은 자가면역 질병에 걸린 포유동물의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 방법은 유효량의 본 발명의 화합물 또는 상기 상태의 치료 또는 예방을 위해 본 명세서에 기재된 약학 조성물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 특정한 구현예에서, 자가면역 질병은 COPD와 같은 상태를 포함한 폐쇄성 기도 질병, 천식(예를 들어 내인성 천식, 외인성 천식, 먼지 천식, 소아 천식), 특히 만성 또는 고질성 천식(예를 들어 말기 천식 및 기도 과민반응), 기관지 천식을 포함한 기관지염, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 피부 홍반 루푸스, 루푸스 신염, 피부근염, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 건선, 안구건조증, I형 당뇨병 및 이와 관련된 합병증, 아토피성 습진(아토피성 피부염), 갑상선염(하시모토 및 자가면역 갑상선염), 접촉 피부염 및 추가의 습진성 피부염, 염증성 장 질병(예를 들어 크론병 및 궤양성 대장염), 죽상동맥경화증 및 근위축성 측삭 경화증 중에서 선택된다. 보다 특히 자가면역 질병은 전신 홍반성 루푸스이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 화합물, 및 또 다른 치료제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 구현예에서, 다른 치료제는 자가면역 질병 치료제이다. 특정한 구현예에서, 자가면역 질병은 COPD와 같은 상태를 포함한 폐쇄성 기도 질병, 천식(예를 들어 내인성 천식, 외인성 천식, 먼지 천식, 소아 천식), 특히 만성 또는 고질성 천식(예를 들어 말기 천식 및 기도 과민반응), 기관지 천식을 포함한 기관지염, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 피부 홍반 루푸스, 루푸스 신염, 피부근염, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 건선, 안구건조증, I형 당뇨병 및 이와 관련된 합병증, 아토피성 습진(아토피성 피부염), 갑상선염(하시모토 및 자가면역 갑상선염), 접촉 피부염 및 추가의 습진성 피부염, 염증성 장 질병(예를 들어 크론병 및 궤양성 대장염), 죽상동맥경화증 및 근위축성 측삭 경화증 중에서 선택된다. 보다 특히 자가면역 질병은 전신 홍반성 루푸스이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 통증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 구현예에서, 통증은 침해수용성 통증(예를 들어 내장 통증 및/또는 체성 통증), 염증성 통증(조직 손상 및 염증성 세포 침윤과 연관된) 및 신경병성 또는 기능장애 통증(신경계의 손상 또는 비정상적인 기능에 의해 유발됨), 및/또는 본원에서 언급한 상태와 연관되거나 상기 상태에 의해 유발된 통증 중에서 선택된다. 보다 특히, 통증은 염증성 및/또는 신경병성 통증이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 통증 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 구현예에서, 통증은 침해수용성 통증(예를 들어 내장 통증 및/또는 체성 통증), 염증성 통증(조직 손상 및 염증성 세포 침윤과 연관된) 및 신경병성 또는 기능장애 통증(신경계의 손상 또는 비정상적인 기능에 의해 유발됨), 및/또는 본원에서 언급한 상태와 연관되거나 상기 상태에 의해 유발된 통증 중에서 선택된다. 보다 특히, 통증은 염증성 및/또는 신경병성 통증이다.
추가의 치료 방법 태양에서, 본 발명은 통증에 걸린 포유동물의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 방법은 유효량의 본 발명의 화합물 또는 상기 상태의 치료 또는 예방을 위해 본 명세서에 기재된 약학 조성물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 특정한 구현예에서, 통증은 침해수용성 통증(예를 들어 내장 통증 및/또는 체성 통증), 염증성 통증(조직 손상 및 염증성 세포 침윤과 연관된) 및 신경병성 또는 기능장애 통증(신경계의 손상 또는 비정상적인 기능에 의해 유발됨), 및/또는 본원에서 언급한 상태와 연관되거나 상기 상태에 의해 유발된 통증 중에서 선택된다. 보다 특히, 통증은 염증성 및/또는 신경병성 통증이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 화합물, 및 또 다른 치료제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 구현예에서, 다른 치료제는 통증 치료제이다. 특정한 구현예에서, 통증은 침해수용성 통증(예를 들어 내장 통증 및/또는 체성 통증), 염증성 통증(조직 손상 및 염증성 세포 침윤과 연관된) 및 신경병성 또는 기능장애 통증(신경계의 손상 또는 비정상적인 기능에 의해 유발됨), 및/또는 본원에서 언급한 상태와 연관되거나 상기 상태에 의해 유발된 통증 중에서 선택된다. 보다 특히, 통증은 염증성 및/또는 신경병성 통증이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 섬유증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 구현예에서, 섬유증은 전신 경화증, 특발성 폐 섬유증 및 다른 형태의 폐 섬유증 및 간질성 폐 질병, 알콜성 지방간염, 비-알콜성 지방간염, 신 섬유증, 및 염증성 장 질병의 결과로서 결장의 섬유증 중에서 선택된다. 보다 특히, 섬유증은 경피성 만성 이식편 대 숙주병이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 통증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 구현예에서, 섬유증은 전신 경화증, 특발성 폐 섬유증 및 다른 형태의 폐 섬유증 및 간질성 폐 질병, 알콜성 지방간염, 비-알콜성 지방간염, 신 섬유증, 및 염증성 장 질병의 결과로서 결장의 섬유증 중에서 선택된다. 보다 특히, 섬유증은 경피성 만성 이식편 대 숙주병이다.
추가의 치료 방법 태양에서, 본 발명은 통증에 걸린 포유동물의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 방법은 유효량의 본 발명의 화합물 또는 상기 상태의 치료 또는 예방을 위해 본 명세서에 기재된 약학 조성물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 특정한 구현예에서, 섬유증은 전신 경화증, 특발성 폐 섬유증 및 다른 형태의 폐 섬유증 및 간질성 폐 질병, 알콜성 지방간염, 비-알콜성 지방간염, 신 섬유증, 및 염증성 장 질병의 결과로서 결장의 섬유증 중에서 선택된다. 보다 특히, 섬유증은 경피성 만성 이식편 대 숙주병이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 화합물, 및 또 다른 치료제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 구현예에서, 다른 치료제는 섬유증 치료제이다. 특정한 구현예에서, 섬유증은 전신 경화증, 특발성 폐 섬유증 및 다른 형태의 폐 섬유증 및 간질성 폐 질병, 알콜성 지방간염, 비-알콜성 지방간염, 신 섬유증, 및 염증성 장 질병의 결과로서 결장의 섬유증 중에서 선택된다. 보다 특히, 섬유증은 경피성 만성 이식편 대 숙주병이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 증식성 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 구현예에서, 증식성 질병은 암(예를 들어 자궁 평활근육종 또는 전립선암), 골수증식성 질환(예를 들어 진성적혈구증가증, 본태성 혈소판증가증 및 골수섬유증), 백혈병(예를 들어 급성 골수성 백혈병, 급성 및 만성 림프모구성 백혈병), 다발성 골수종, 건선, 재협착증, 피부경화증 또는 섬유증 중에서 선택된다. 특정한 구현예에서, 증식성 질병은 경피성 만성 이식편 대 숙주병(cGvHD)이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 증식성 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 구현예에서, 증식성 질병은 암(예를 들어 자궁 평활근육종 또는 전립선암), 골수증식성 질환(예를 들어 진성적혈구증가증, 본태성 혈소판증가증 및 골수섬유증), 백혈병(예를 들어 급성 골수성 백혈병, 급성 및 만성 림프모구성 백혈병), 다발성 골수종, 건선, 재협착증, 피부경화증 또는 섬유증 중에서 선택된다. 특정한 구현예에서, 증식성 질병은 경피성 만성 이식편 대 숙주병(cGvHD)이다.
추가의 치료 방법 태양에서, 본 발명은 증식성 질병에 걸린 포유동물의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 방법은 유효량의 본 발명의 화합물 또는 상기 상태의 치료 또는 예방을 위해 본 명세서에 기재된 약학 조성물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 특정한 구현예에서, 증식성 질병은 암(예를 들어 자궁 평활근육종 또는 전립선암), 골수증식성 질환(예를 들어 진성적혈구증가증, 본태성 혈소판증가증 및 골수섬유증), 백혈병(예를 들어 급성 골수성 백혈병, 급성 및 만성 림프모구성 백혈병), 다발성 골수종, 건선, 재협착증, 피부경화증 또는 섬유증 중에서 선택된다. 특정한 구현예에서, 증식성 질병은 경피성 만성 이식편 대 숙주병(cGvHD)이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 화합물, 및 또 다른 치료제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 구현예에서, 다른 치료제는 증식성 질병 치료제이다. 특정한 구현예에서, 증식성 질병은 암(예를 들어 자궁 평활근육종 또는 전립선암), 골수증식성 질환(예를 들어 진성적혈구증가증, 본태성 혈소판증가증 및 골수섬유증), 백혈병(예를 들어 급성 골수성 백혈병, 급성 및 만성 림프모구성 백혈병), 다발성 골수종, 건선, 재협착증, 피부경화증 또는 섬유증 중에서 선택된다. 특정한 구현예에서, 증식성 질병은 경피성 만성 이식편 대 숙주병(cGvHD)이다.
주사 용량 수준은 모두 약 1 내지 약 120h 및 특히 24 내지 96h 동안 약 0.1 ㎎/㎏/h 내지 적어도 10 ㎎/㎏/h의 범위이다. 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏ 이상의 프리로딩 일시주사를 또한 투여하여 적합한 정상 상태 수준을 성취할 수 있다. 최대 총 용량은 40 내지 80 ㎏ 인간 환자의 경우 약 1 g/일을 초과하지 않을 것으로 예상된다.
장기적인 상태, 예를 들어 퇴행 상태의 예방 및/또는 치료를 위해서, 치료 섭생을 대개는 수개월 또는 수년에 걸쳐 늘릴 수 있으며 따라서 경구 투여가 환자의 편의성 및 허용성을 위해 바람직하다. 경구 투여의 경우, 매일 1 내지 4 회의 정규 용량, 특히 매일 1 내지 3회의 정규 용량, 전형적으로는 매일 1 내지 2회의 정규 용량, 및 가장 전형적으로는 매일 1회의 정규 용량이 전형적인 섭생이다. 한편으로, 장기간 지속 효과의 약물의 경우, 경구 투여에 의해, 2주마다 1회, 매주 1회, 및 하루에 1회가 전형적인 섭생이다. 특히, 투여량 섭생은 1 내지 14일마다, 보다 특히 1 내지 10일마다, 훨씬 더 특히 1 내지 7일마다, 및 가장 특히는 1 내지 3일마다일 수 있다.
이러한 투여 패턴을 사용하는 경우, 각각의 용량은 약 1 내지 약 1000 ㎎의 본 발명의 화합물을 제공하며, 특히 각각의 용량은 약 10 내지 약 500 ㎎ 및 특히 약 30 내지 약 250 ㎎을 제공한다.
경피 용량은 일반적으로 주사 용량을 사용하여 성취되는 것과 유사하거나 더 낮은 혈중 수준을 제공하도록 선택된다.
질환의 발병을 예방하기 위해 사용될 때, 본 발명의 화합물을 질환이 발병할 위험이 있는 환자에게, 전형적으로는 의사의 충고 및 감독 하에서, 상술한 투여량 수준으로 투여할 것이다. 특정 질환이 발병할 위험이 있는 환자는 일반적으로 질환의 가족력이 있는 환자 또는 상기 질환의 발병에 특히 민감한 것으로 유전자 시험 또는 선별에 의해 확인된 환자를 포함한다.
본 발명의 화합물을 단독 활성제로서 투여하거나 또는 다른 치료제, 예를 들어 동일하거나 유사한 치료 활성을 나타내고 병행 투여에 대해 안전하고 효능 있는 것으로 결정된 본 발명의 다른 화합물과 함께 투여할 수 있다. 특정한 구현예에서, 2개(이상)의 작용제의 동시 투여는 각각 현저하게 더 낮은 용량의 사용을 허용하며, 이에 의해 나타나는 부작용이 감소된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 약제로서 투여한다. 특정 구현예에서, 상기 약학 조성물은 추가의 활성 성분을 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물을 염증을 수반하는 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정한 작용제는 비제한적으로 면역조절제, 예를 들어 아자티오프린, 코르티코스테로이드(예를 들어 프레드니솔론 또는 덱사메타손), 사이클로포스파미드, 사이클로스포린 A, 타크로리무스, 마이코페놀레이트 모페틸, 뮤로모냅-CD3(OKT3, 예를 들어 오르쏘클론(Orthoclone)®), ATG, 아스피린, 아세트아미노펜, 이부프로펜, 나프록센 및 피록시캄을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물을 관절염(예를 들어 류마티스성 관절염)의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정한 작용제는 비제한적으로 진통제, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAIDS), 스테로이드, 합성 DMARDS(예를 들어 비제한적으로 메토트렉세이트, 레플루노미드, 설파살라진, 아우라노핀, 나트륨 아우로티오말레이트, 페니실라민, 클로로퀸, 하이드록시클로로퀸, 아자티오프린, 토파시티니브, 바리시티니브, 포스타마티니브, 및 사이클로스포린), 및 생물학적 DMARDS(예를 들어 비제한적으로 인플릭시맵, 에타너셉트, 아달리뮤맵, 리툭시맵, 및 아바타셉트)를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물을 증식성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정한 작용제는 비제한적으로 메토트렉세이트, 류코보린, 아드리아마이신, 프레니손, 블레오마이신, 사이클로포스파미드, 5-플루오로유라실, 패클리탁셀, 도세탁셀, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 독소루비신, 타목시펜, 토레미펜, 메제스트롤 아세테이트, 아나스트로졸, 고세렐린, 항-HER2 단클론 항체(예를 들어 허셉틴(Herceptin)TM), 카페시타빈, 랄록시펜 하이드로클로라이드, EGFR 억제제(예를 들어 이레사(Iressa)®, 타세바(Tarceva)TM, 에르비툭스(Erbitux)TM), VEGF 억제제(예를 들어 아바스틴(Avastin)TM), 프로테오솜 억제제(예를 들어 벨케이드(Velcade)TM), 글리벡(Glivec)® 및 hsp90 억제제(예를 들어 17-AAG)를 포함한다. 추가로, 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 다른 요법, 예를 들어 비제한적으로 방사선요법 또는 수술과 함께 투여할 수 있다. 특정 구현예에서 증식성 질환은 암, 골수증식성 질병 또는 백혈병 중에서 선택된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물을 자가면역 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정한 작용제는 비제한적으로 글루코코르티코이드, 세포성장 억제제(예를 들어 퓨린 유사체), 알킬화제(예를 들어 질소 머스터드(사이클로포스파미드), 니트로소유레아, 본 발명의 백금 화합물 등), 대사길항물질(예를 들어 메토트렉세이트, 아자티오프린 및 머캅토퓨린), 세포독성 항생제(예를 들어 닥티노마이신 안트라사이클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 및 미트라마이신), 항체(예를 들어 항-CD20, 항-CD25, 또는 항-CD3(OTK3) 단클론 항체, 아트감(Atgam)® 및 티모글로불린(Thymoglobulin)®), 사이클로스포린, 타크로리무스, 라파마이신(시로리무스), 인터페론(예를 들어 INF-β), TNF 결합 단백질(예를 들어 인플릭시맵, 에타너셉트 또는 아달리뮤맵), 마이코페놀레이트, 핑고리모드 및 미리오신을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물을 이식 거부의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정한 작용제는 비제한적으로 칼시뉴린 억제제(예를 들어 사이클로스포린 또는 타크로리무스(FK506)), mTOR 억제제(예를 들어 시로리무스, 에베로리무스), 증식-방지제(예를 들어 아자티오프린, 마이코페놀산), 코르티코스테로이드(예를 들어 프레드니솔론, 하이드로코르티손), 항체(예를 들어 단클론 항-IL-2Rα 수용체 항체, 바실릭시맵, 다클리주맵), 다클론성 항-T-세포 항체(예를 들어 항-흉선세포 글로불린(ATG), 항-림프구 글로불린(ALG))를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물을 천식 및/또는 비염 및/또는 COPD의 치료 및/또는 예방을 위한 작용제와 함께 투여하며, 특정한 작용제는 비제한적으로 베타2-아드레날린 수용체 작용물질(예를 들어 살부타몰, 레발부테롤, 터뷰탈린 및 비톨테롤), 에피네프린(흡입형 또는 정제), 항콜린제(예를 들어 이프라트로피움 브로마이드), 글루코코르티코이드(경구 또는 흡입형), 오래 작용하는 β2-작용물질(예를 들어 살메테롤, 포모테롤, 밤부테롤, 및 서방성 경구 알부테롤), 흡입형 스테로이드와 오래 작용하는 기관지 확장제의 조합(예를 들어 플루티카손/살메테롤, 부데소니드/포모테롤), 류코트리엔 길항물질 및 합성 억제제(예를 들어 몬테류카스트, 자피르류카스트 및 질류톤), 매개체 방출 억제제(예를 들어 크로모글리케이트 및 케토티펜), IgE 반응의 생물학적 조절제(예를 들어 오말리주맵), 항히스타민제(예를 들어 세테리진, 신나리진, 펙소페나딘), 및 혈관수축제(예를 들어 옥시메타졸린, 자일로메타졸린, 나파졸린 및 트라마졸린)를 포함한다.
추가로, 본 발명의 화합물을 천식 및/또는 COPD에 대한 응급 요법과 함께 투여할 수도 있으며, 상기와 같은 요법은 산소 또는 헬리옥스 투여, 분무된 살부타몰 또는 터부탈린(항콜린제(예를 들어 이프라트로피움)와 임의로 병용됨), 전신 스테로이드(경구 또는 정맥 내, 예를 들어 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손 또는 하이드로코르티손), 정맥 내 살부타몰, 비-특이적 베타-작용물질, 주사제 또는 흡입제(예를 들어 에피네프린, 이소에타린, 이소프로테레놀, 메타프로테레놀), 항콜린제(IV 또는 분무형, 예를 들어 글리코피롤레이트, 아트로핀, 이프라트로피움), 메틸잔틴(테오필린, 아미노필린, 바미필린), 기관지확장 효과를 갖는 흡입 마취제(예를 들어 이소플루란, 할로탄, 엔플루란), 케타민, 및 정맥 내 황산 마그네슘을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물을 염증성 장 질병(IBD)의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정한 작용제는 비제한적으로 글루코코르티코이드(예를 들어 프레드니손, 부데소니드) 합성 질병 변형, 면역조절제(예를 들어 메토트렉세이트, 레플루노미드, 설파살라진, 메살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린 및 시클로스포린) 및 생물학적 질병 변형, 면역조절제(인플릭시맵, 아다리뮤맵, 리툭시맵 및 아바타셉트)를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물을 SLE의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정한 작용제는 비제한적으로 인간 단클론 항체(벨리뮤맵(벤리스타(Benlysta)), 질병-변형 항류마티스 약물(DMARD), 예를 들어 항말라리아약(예를 들어 플라퀘닐, 하이드록시클로로퀸), 면역억제제(예를 들어 메토트렉세이트 및 아자티오프린), 사이클로포스파미드 및 마이코페놀산, 면역억제성 약물 및 진통제, 예를 들어 비스테로이드성 소염 약물, 오피에이트(예를 들어 덱스트로프로폭시펜 및 코-코다몰), 오피오이드(예를 들어 하이드로코돈, 옥시코돈, MS 콘틴, 또는 메타돈), 및 펜타닐 듀라제식 경피 패치를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물을 건선의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정한 작용제는 비제한적으로 국소 치료제, 예를 들어 입욕액, 보습제, 콜 타르를 함유하는 약물첨가된 크림 및 연고, 디트라놀(안트랄린), 코르티코스테로이드 유사 데속시메타손(토피코트(Topicort)TM), 플루오시노니드, 비타민 D3 유사체(예를 들어 칼시포트리올), 아르간 오일 및 레티노이드(에트레티네이트, 아시트레틴, 타자로텐), 전신 치료제, 예를 들어 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 레티노이드, 티오구아닌, 하이드록시유레아, 설파살라진, 마이코페놀레이트 모페틸, 아자티오프린, 타크로리무스, 푸마르산 에스테르 또는 생물제, 예를 들어 아메비브(Amevive)TM, 엔브렐(Enbrel)TM, 휴미라(Humira)TM, 레미케이드(Remicade)TM, 라프티바(Raptiva)TM 및 유스테키누맵(IL-12 및 IL-23 차단제)을 포함한다. 추가로, 본 발명의 화합물을 다른 요법들, 예를 들어 비제한적으로 광선요법, 또는 광화학요법(예를 들어 프소랄렌 및 자외선 A 광선요법(PUVA))과 함께 투여할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물을 알러지 반응의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정한 작용제는 비제한적으로 항히스타민제(예를 들어 세티리진, 디펜하이드라민, 펙소페나딘, 레보세티리진), 글루코코르티코이드(예를 들어 프레드니손, 베타메타손, 베클로메타손, 덱사메타손), 에피네프린, 테오필린 또는 항-류코트리엔(예를 들어 몬테류카스트 또는 자피르류카스트), 항-콜린제 및 울혈완화제를 포함한다.
동시 투여는 숙련가에게 자명한 바와 같이 2개 이상의 치료제를 동일한 치료 섭생의 부분으로서 환자에게 전달하는 임의의 수단을 포함한다. 2개 이상의 작용제를 단일 제형으로, 즉 단일 약학 조성물로서 동시에 투여할 수도 있지만, 이는 필수적인 것은 아니다. 작용제를 상이한 제형으로 상이한 시점에서 투여할 수도 있다.
화학 합성 과정
일반적인 내용
본 발명의 화합물을 하기의 일반적인 방법 및 과정을 사용하여 쉽게 입수할 수 있는 출발 물질로부터 제조할 수 있다. 전형적이거나 바람직한 공정 조건(즉 반응 온도, 시간, 반응물들의 몰비, 용매, 압력 등)이 주어지는 경우, 달리 나타내지 않는 한 다른 공정 조건을 또한 사용할 수 있음을 알 것이다. 최적의 반응 조건은 사용되는 특정 반응물 또는 용매에 따라 변할 수 있지만, 상기와 같은 조건은 통상적인 최적화 과정에 의해 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다.
추가로, 당해 분야의 숙련가들에게 자명한 바와 같이, 몇몇 작용기가 바람직하지 못한 반응을 겪지 않도록 하기 위해서 통상적인 보호기가 필요할 수 있다. 특정 작용기에 적합한 보호기뿐만 아니라 보호 및 탈보호에 적합한 조건의 선택은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(Greene, T W; Wuts, P G M;, 1991).
하기의 방법을 본 발명에서 상기에 나열한 본 발명의 화합물의 제조에 관한 상세한 내용과 함께 제공한다. 본 발명의 화합물을 유기 합성 분야의 숙련가에 의해 공지되거나 상업적으로 입수할 수 있는 출발 물질 및 시약으로부터 제조할 수 있다.
모든 시약은 상업적인 등급의 것이며 달리 나타내지 않는 한 추가의 정제 없이 제공받은 대로 사용되었다. 상업적으로 입수할 수 있는 무수 용매를 불활성 분위기 하에서 수행된 반응에 사용하였다. 달리 나타내지 않는 한 다른 모든 경우는 시약 등급 용매가 사용되었다. 컬럼 크로마토그래피를 실리카젤 60(35 내지 70 ㎛)상에서 수행하였다. 박층 크로마토그래피를 사전-코팅된 실리카젤 F-254 플레이트(두께 0.25 ㎜)를 사용하여 수행하였다. 1H NMR 스펙트럼은 예를 들어 브룩커(Bruker) DPX 400 NMR 분광계(400 MHz) 또는 브룩커 어밴스 300 NMR 분광계(300 MHz) 상에 기록되었다. 1H NMR 스펙트럼에 대한 화학 이동(δ)은 내부 기준으로서 테트라메틸실란(δ 0.00) 또는 적합한 잔류 용매 피크, 즉 CHCl3(δ 7.27)에 대한 백만당 부(ppm)로 보고되었다. 다중도는 단일선(s), 이중선(d), 삼중선(t), 사중선(q), 오중선(quin), 다중선(m) 및 브로드(br)로서 제공된다. 전기분무 MS 스펙트럼을 워터스(Waters) 플랫폼 LC/MS 분광계상에서 또는 워터스 매스(Waters Mass) 검출기 3100 분광계에 커플링된 워터스 액퀴티(Waters Acquity) H-클래스 UPLC로 획득하였다. 사용된 컬럼: 워터스 액퀴티 UPLC BEH C18 1.7 ㎛, 2.1 ㎜ ID x 50 ㎜ L, 워터스 액퀴티 UPLC BEH C18 1.7 ㎛, 2.1 ㎜ ID x 30 ㎜ L, 또는 워터스 엑스테라(Waters Xterra) MS 5 ㎛ C18, 100 x 4.6 ㎜. 방법은 MeCN/H2O 구배(H2O는 0.1% TFA 또는 0.1% NH3을 함유한다) 또는 MeOH/H2O 구배(H2O는 0.05% TFA를 함유한다)를 사용한다. 마이크로웨이브 가열을 바이오테이지 이니시에이터(Biotage Initiator)로 수행하였다.
[표 I]
실험 섹션에 사용되는 약어의 목록:
약어 정의
AcOH 아세트산
aq. 수성
atm 분위기
BINAP (+/-)-2,2'-비스(디페닐포스피노)-1,1'-비나프틸
Boc 3급-부틸옥시-카보닐
br 브로드 신호
BSA 소 혈청 알부민
calc 계산치
cpd 화합물
d 이중선
d 화학 이동
DCM 디클로로메탄
DIPEA 디이소프로필에틸아민
DMAP 디메틸아미노피리딘
DMF 디메틸포름아미드
DMSO 디메틸설폭사이드
DTT 디티오쓰레이톨
EDCI N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
eq. 당량
ES- 전기분무 음성
ES+ 전기분무 양성
Et2O 디에틸 에테르
EtOAc 에틸 아세테이트
EtOH 에탄올
g 그램
h 시간
HATU 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
Hz 헤르츠
Int 중간체
iPrOH 이소프로판올
LiOMe 리튬 메톡사이드
LiOtBu 리튬 3급-부톡사이드
m 다중선
MeCN 아세토니트릴
MeOH 메탄올
mg 밀리그램
MgOAc 마그네슘 아세테이트
MHz 메가헤르츠
min 분
mL 밀리리터
mmol 밀리몰
mol 몰
MS 질량 분광분석
MW 분자량
N 노르말농도
NaBH(OAc)3 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드
NaOtBu 나트륨 3급-부틸레이트
NBS N-브로모숙신이미드
ND 측정 안 됨
NMR 핵 자기 공명
Obs 실측치
PBS 포스페이트-완충된 염수
PBST 트윈 20과 함께 포스페이트-완충된 염수
Pd(OAc)2 팔라듐 디아세테이트
Pd/C 탄소상 팔라듐
ppm 백만당 부
q 사중선
quin 오중선
r.t. 실온
s 단일선
sat. 포화된
SEM 평균의 표준오차
t 삼중선
TEA 트리에틸아민
TFA 트리플루오로아세트산
THF 테트라하이드로퓨란
UPLC 초고성능 액체 크로마토그래피
본 발명 화합물의 합성적 제조
실시예 1. 본 발명의 예시적인 화합물에 대한 중간체의 제조
1.1. 중간체 1: 에틸 펜트-4-이노에이트
Figure pct00030
10 ㎖의 농축된 황산을 EtOH(110 ㎖) 중의 펜트-4-이노산(10.0 g, 102.0 mmol)의 용액에 가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 H2O(250 ㎖) 및 H2O(25 ㎖) 중 5% NaOH로 희석하고 Et2O(3 x 200 ㎖)로 추출하였다. 유기층을 건조시키고(소수성 프릿을 통한 여과) 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.2. 중간체 2: 2-메틸헥스-5-인-2-올
Figure pct00031
무수 Et2O(24.0 ㎖) 중의 에틸 펜트-4-이노에이트(5.00 g, 39.6 mmol, 1.0 eq.)의 용액을 -78℃에서 무수 Et2O(50.0 ㎖) 중에서 희석된 Et2O(27.7 ㎖, 83.2 mmol, 2.1 eq.) 중의 3M 메틸마그네슘 브로마이드의 혼합물에 적가하였다. 반응 혼합물을 -78℃에서 1h 동안 교반하고 이어서 30분의 기간에 걸쳐 실온으로 가온되게 하였다. 혼합물을 NH4Cl(포화된 용액, 80 ㎖) 및 수(20 ㎖)로 급냉시키고 Et2O(3 x 50 ㎖)로 추출하였다. 유기층을 건조시키고 감압하에서 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 70:30 사이클로헥산/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.3. 중간체 3: 3급-부틸-(1,1-디메틸펜트-4-이녹시)-디메틸-실란
Figure pct00032
[3급-부틸(디메틸)실릴] 트리플루오로메탄설포네이트(5.6 g, 21.2 mmol, 1.25 eq.)를 DCM(40 ㎖) 중의 2-메틸헥스-5-인-2-올(1.9 g, 16.9 mmol, 1.0 eq.) 및 피리딘(3.41 ㎖, 42.3 mmol, 2.5 eq.)의 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2h 동안 교반하였다. 혼합물을 포화된 수성 NaHCO3로 처리하였다. 혼합물을 DCM으로 추출하였다. 유기층을 건조시키고(Na2SO4), 여과하고 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 사이클로헥산)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.4. 중간체 4: 에틸 6-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-6-메틸-헵트-2-이노에이트
Figure pct00033
헥산 중 2.5M n-부틸리튬(7.0 ㎖, 17.4 mmol, 1.2 eq.)을 -78℃에서 무수 THF(150 ㎖) 중의 3급-부틸-(1,1-디메틸펜트-4-이녹시)-디메틸-실란(3.3 g, 14.5 mmol, 1.0 eq.)의 용액에 가하였다. 혼합물을 -78℃에서 1h 동안 교반하고 에틸 클로로포르메이트(2.37 g, 21.8 mmol, 1.5 eq.)를 가하였다. 생성 혼합물을 -78℃에서 1h 동안 교반하고 이어서 실온으로 가온되게 하였다. 혼합물을 급냉시키고(포화된 NH4Cl 수용액, 150 ㎖) 추출하였다(Et2O). 유기층을 건조시키고 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 80:20 사이클로헥산/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.5. 중간체 5: 3급-부틸 N-(3-메톡시-4-피리딜)카바메이트
Figure pct00034
DIPEA(4.6 ㎖, 26.2 mmol, 2.1 eq.) 및 디-3급-부틸 디카보네이트(3.0 g, 13.7 mmol, 1.1 eq.)를 THF(15.5 ㎖) 중의 3-메톡시피리딘-4-아민 HCl 염(2.0 g, 12.5 mmol, 1.0 eq.)의 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 혼합물을 포화된 수성 NH4Cl로 처리하고 추출하였다(EtOAc). 유기층을 세척하고(염수) 건조시키고(Na2SO4) 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.6. 중간체 6: 에틸 5-(3급-부톡시카보닐아미노)-2-[3-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-3-메틸-부틸]-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-3-카복실레이트
Figure pct00035
1.6.1. 단계 i (3급-부틸 N-(1-아미노-3-메톡시-피리딘-1-이움-4-일)카바메이트 2,4-디니트로페놀레이트 염;
MeCN(27 ㎖) 중의 N-(3-메톡시-4-피리딜)카바메이트(3.46 g, 15.4 mmol, 1.0 eq.) 및 O-(2,4-디니트로페닐)하이드록실아민(6.14 g, 30.9 mmol, 2.0 eq.)의 혼합물을 50℃에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.6.2. 단계 ii, 에틸 5-(3급-부톡시카보닐아미노)-2-[3-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-3-메틸-부틸]-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-3-카복실레이트
DMF(8 ㎖) 중의 2.0 g의 단계 i로부터 수득된 3급-부틸 N-(1-아미노-3-메톡시-피리딘-1-이움-4-일)카바메이트 2,4-디니트로페놀레이트 염 및 K2CO3(1.96 g, 14.2 mmol)를 함유하는 혼합물을 실온에서 1h 동안 교반하였다. 최소량의 DMF에 용해된 에틸 6-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-6-메틸헵트-2-이노에이트(1.41 g, 4.7 mmol)를 반응 혼합물에 가하고 이를 실온에서 대략 20h 동안 교반 방치하였다. 추가로 0.28 g의 에틸 6-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-6-메틸헵트-2-이노에이트(0.9 mmol)를 가하고 혼합물을 실온에서 추가로 20h 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O로 희석하였다. 생성 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 세척하고(H2O, 염수), 건조시키고(Na2SO4), 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 75:25 n-헥산/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.7. 중간체 7: 2-[3-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-3-메틸-부틸]-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-5-아민
Figure pct00036
9:1 MeOH/H2O 중의 에틸 5-(3급-부톡시카보닐아미노)-2-[3-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-3-메틸-부틸]-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-3-카복실레이트(427 ㎎, 0.8 mmol, 1.0 eq.) 및 LiOH(382 ㎎, 15.9 mmol, 20.0 eq.)의 혼합물을 100℃에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc와 H2O 사이에 분배시켰다. 2개 상이 분리되었으며 수성층을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔사를 톨루엔(8.5 ㎖)에 용해시키고 70분간 환류시켰다. 혼합물을 농축시키고 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(50:50 n-헥센/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.8. 중간체 8: 4-(5-아미노-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-2-일)-2-메틸-부탄-2-올
Figure pct00037
DCM(40 ㎖) 중의 2-[3-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-3-메틸-부틸]-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-5-아민(409 ㎎, 1.125 mmol, 1.0 eq.) 및 TFA(1.7 ㎖, 22.5 mmol, 20.0 eq.)의 혼합물을 실온에서 16h 동안 교반하였다. 톨루엔(20 ㎖)을 가하고 혼합물을 농축시켰다. 잔사를 MeOH(1 ㎖)에 용해시키고 혼합물을 양이온 교환 흡수제(SCX)를 함유하는 컬럼상에 로딩하였다. 컬럼을 MeOH로 세척하고 컬럼을 MeOH 중의 7N NH3로 플러싱시켜 생성물을 회수하였다. 그렇게 수득된 혼합물을 농축시키고 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 95:5 DCM/MeOH)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.9. 중간체 9: 에틸 6-클로로-4-[(4-메톡시페닐)메틸아미노]피리딘-3-카복실레이트
Figure pct00038
DMSO(45 ㎖) 중의 에틸 4,6-디클로로피리딘-3-카복실레이트(5.0 g, 22.7 mmol, 1.0 eq.), (4-메톡시페닐)메탄아민(3.12 g, 22.7 mmol, 1.0 eq.) 및 TEA(6.34 ㎖, 45.4 mmol, 2.0 eq.)의 혼합물을 실온에서 48h 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc로 희석하였다. 생성 혼합물을 세척하고(H2O, 염수), 건조시키고(Na2SO4), 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 70:30 사이클로헥산/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.10. 중간체 10: 에틸 4-아미노-6-클로로-피리딘-3-카복실레이트
Figure pct00039
TFA(40 ㎖) 중의 4-(5-아미노-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-2-일)-2-메틸-부탄-2-올(5.6 g, 17.4 mmol, 1.0 eq.)의 혼합물을 50℃에서 72h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각되게 하고 1M NaOH를 pH가 대략 9일때까지 가하였다. 생성 혼합물을 추출하였다(EtOAc). 유기층을 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 70:30 사이클로헥산/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.11. 중간체 11: 에틸 4-(3급-부톡시카보닐아미노)-6-클로로-피리딘-3-카복실레이트
Figure pct00040
DMAP(0.213 g, 1.74 mmol, 0.1 eq.) 및 3급-부톡시카보닐 3급-부틸 카보네이트(4.19 g, 19.2 mmol, 1.1 eq.)를 0℃에서 에틸 4-아미노-6-클로로-피리딘-3-카복실레이트(3.50 g, 17.4 mmol, 1.0 eq.) 및 TEA(9.73 ㎖, 69.8 mmol, 4.0 eq.)의 혼합물에 가하였다. 혼합물을 실온에서 4.5h 동안 교반하였다. 반응물을 얼음으로 급냉시키고 H2O로 희석하였다. 생성 혼합물을 추출하였다(EtOAc). 2개 상이 분리되었으며 유기층을 세척하고(염수), 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 90:10 사이클로헥산/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.12. 중간체 12: 에틸 4-(3급-부톡시카보닐아미노)-6-[5-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-5-메틸-헥스-1-이닐]피리딘-3-카복실레이트
Figure pct00041
무수 DMF(5.0 ㎖) 중의 에틸 4-(3급-부톡시카보닐아미노)-6-클로로-피리딘-3-카복실레이트(1.0 g, 3.33 mmol, 1.0 eq.) 및 3급부틸-(1,1-디메틸펜트-4-이녹시)-디메틸-실란(1.13 g, 5.0 mmol, 1.5 eq.)의 혼합물을 불활성 분위기하에서 무수 DMF(25 ㎖) 중의 PdCl2(PPh3)2(0.117 g, 0.166 mmol, 0.05 eq.), CuI(0.063 g, 0.33 mmol, 0.1 eq.) 및 TEA(6.49 ㎖, 46.6 mmol, 14.0 eq.)의 혼합물에 가하였다. 혼합물을 90℃에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 100℃에서 추가로 2h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화된 수성 NH4Cl로 급냉시켰다. 생성 혼합물을 추출하고(EtOAc) 2개 상이 분리되었다. 유기층을 세척하고(염수), 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 90:10 사이클로헥산/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.13. 중간체 13: 에틸 5-(3급-부톡시카보닐아미노)-2-[3-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-3-메틸-부틸]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트
Figure pct00042
1.13.1. 단계 i (에틸 1-아미노-4-(3급-부톡시카보닐아미노)-6[5-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-5-메틸-헥스-1-이닐]피리딘-1-이움-3-카복실레이트 2,4-디니트로페놀레이트 염:
1:1 THF/H2O(20 ㎖) 중의 에틸 4-(3급-부톡시카보닐아미노)-6-[5-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-5-메틸-헥스-1-이닐]피리딘-3-카복실레이트(2.23 g, 4.54 mmol, 1.0 eq.) 및 O-(2,4-디니트로페닐)하이드록실아민(1.81 g, 9.09 mmol, 2.0 eq.)의 혼합물을 50℃에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.13.2. 단계 ii 에틸 5-(3급-부톡시카보닐아미노)-2-[3-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-3-메틸-부틸]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트
DMF(30 ㎖) 중의 단계 I로부터 수득된 에틸 1-아미노-4-(3급-부톡시카보닐아미노)-6-[5-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-5-메틸-헥스-1-이닐]피리딘-1-이움-3-카복실레이트 2,4-디니트로페놀레이트 염의 혼합물을 DMF 중에서 48h 동안 교반하였다. 혼합물을 수성 NaHCO3로 희석하고 EtOAc로 추출하였다. 2개 상이 분리되었다. 유기층을 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 90:10 사이클로헥산/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.14. 중간체 14: 에틸 5-아미노-2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트
Figure pct00043
TFA(1.36 ㎖, 18.0 mmol, 20.0 eq.)를 0℃에서 DCM(20 ㎖) 중의 에틸 5-(3급-부톡시카보닐아미노)-2-[3-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-3-메틸-부틸]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트(449 ㎎, 0.89 mmol, 1.0 eq.)의 용액에 가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 농축시키고 잔사를 양이온 교환 흡수제(SCX)를 함유하는 컬럼상에 로딩하였다. 컬럼을 MeOH로 세척하고 컬럼을 MeOH 중의 7N NH3로 플러싱시켜 생성물을 회수하였다. 그렇게 수득된 혼합물을 농축시키고 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 0:100 DCM/90:4:1 DCM/MeOH/NH4OH로 구성된 3원 혼합물)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.15. 중간체 15: 에틸 2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트
Figure pct00044
DCM(8 ㎖) 중의 에틸 5-아미노-2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트(148.0 ㎎, 0.51 mmol, 1.0 eq.), DIPEA(0.18 ㎖, 1.02 mmol, 2.0 eq.), 6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카복실산(116 ㎎, 0.61 mmol, 1.2 eq.) 및 HATU, CAS# 148893-10-1(232 ㎎, 0.61 mmol, 1.2 eq.)의 혼합물을 실온에서 4h 동안 교반하였다. 추가로 0.3 eq.의 6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카복실산 및 추가로 0.3 eq.의 HATU, CAS# 148893-10-1을 가하고 혼합물을 실온에서 추가로 4h 동안 교반하였다. 혼합물을 희석하고(DCM), 세척하고(포화된 수성 NH4Cl, 포화된 수성 NaHCO3, 염수), 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 20:80 DCM/90:4:1 DCM/MeOH/NH4OH로 구성된 3원 혼합물)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.16. 중간체 16: 2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실산
Figure pct00045
4:1 THF/H2O 중의 에틸 2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트(184 ㎎, 0.396 mmol, 1.0 eq.) 및 LiOH(29.0 ㎎, 1.2 mmol, 3.0 eq.)의 혼합물을 실온에서 5h 동안 교반하였다. THF를 감압하에서 제거하고 수성 혼합물을 1M HCl의 적가에 의해 pH<5로 산성화하였다. 고체가 형성되었으며, 이를 여과하고 H2O로 세척하여 목적하는 생성물을 생성시켰다.
1.17. 중간체 17: 3급-부틸 N-(2-브로모-5-메톡시-4-피리딜)카바메이트
Figure pct00046
2-브로모-5-메톡시-피리딘-4-아민(175.0 g, Angene에 의해 제공됨, 배치 G02-16436-2)을 EtOAc(2 L)에 용해시키고 수(2 L)를 가하였다. 층이 분리되었다. 수성층을 EtOAc(2 x 500 ㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 혼합물을 증발 건조시켰다. DCM(1 L) 중의 이렇게 수득된 잔사(155.0 g, 762 mmol, 1.0 eq.) 및 TEA(425 ㎖, 3.05 mol, 4.0 eq.)를 함유하는 용액을 불활성 분위기하에 5 L 반응기에서 DCM(2.5 L) 중의 디-3급-부틸 디카보네이트(216.0 g, 990.0 mmol, 1.3 eq.) 및 DMAP(9.3 g, 76.0 mmol, 0.1 eq.)를 함유하는 혼합물에 0℃에서 가하였다. 첨가는 온도를 2℃ 아래에서(∼30-35분) 유지시키면서 조금씩 수행되었다. 첨가 후에, 반응 혼합물을 22℃로 가온하고 밤새 교반시켰다. 혼합물을 20 L 반응기로 옮기고 포화된 수성 NaHCO3(5 L)를 가하여 급냉시켰다. 층이 분리되었다. 수성층을 DCM(3 x 1 L)으로 추출하였다. 합한 유기층을 증발 건조시켰다. 잔사를 실리카젤 패드(20 ㎝ 두께, 19 ㎝ 직경) 상에 로딩하고 25 L에 걸쳐 0-30% EtOAc/사이클로헥산 구배로 용출시켰다. 분획을 수집하고, 합하고 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.18. 일반적인 방법 B: 피리딘 유도체의 N-아민화에 이은 피라졸로[1,5-a]피리딘으로의 환화
Figure pct00047
1.18.1. 단계 i:
O-(2,4-디니트로페닐)하이드록실아민(2.0 eq.)을 1:1 THF/H2O(대략 0.2 M) 중의 피리딘 유도체(1 eq.)의 혼합물에 조금씩 나누어 가한다. 혼합물을 45 내지 50℃에서 16h 동안 교반한다. 혼합물을 농축시킨다.
1.18.2. 단계 ii:
잔사를 DMF(0.2 내지 0.4 M)에 용해시키고 혼합물을 90℃에서 16h 동안 교반한다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 염기성 수용액(포화된 NaHCO3 또는 포화된 Na2CO3)으로 급냉시킨다. 혼합물을 EtOAc로 추출한다. 층이 분리되며 유기 혼합물은 추가의 세척을 겪을 수 있다. 유기층을 건조시키고 농축시킨다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 예상된 생성물을 제공한다.
방법 B의 예시적인 실시예, 중간체 19: 3급-부틸 N-[2-[3-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-3-메틸-부틸]-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]카바메이트의 합성
Figure pct00048
1.18.3. 단계 i:
O-(2,4-디니트로페닐)하이드록실아민(14.0 g, 70.3 mmol, 2.0 eq.)을 1:1 THF/H2O(240 ㎖) 중의 N-[2-[5-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-5-메틸-헥스-1-이닐]-5-메톡시-4-피리딜]카바메이트(16.0 g, 34.6 mmol, 1.0 eq.)의 혼합물에 조금씩 나누어 가하였다. 혼합물을 45℃에서 밤새 교반하고 농축시켰다.
1.18.4. 단계 ii:
단계 i로부터의 잔사를 DMF(80 ㎖)에 용해시키고 생성 혼합물을 90℃에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 포화된 수성 Na2CO3로 급냉시켰다. 생성 혼합물을 추출하였다(EtOAc). 층이 분리되었으며 유기 혼합물을 세척하고(H2O 및 염수), 건조시키고(MgSO4) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 80:20 n-헵탄/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.19. 중간체 21: 3급-부틸 N-[6-메톡시-2-(2-메틸설포닐에틸)피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]카바메이트
Figure pct00049
O-(2,4-디니트로페닐)하이드록실아민(2.75 g, 13.8 mmol, 2.0 eq.)을 4:1 THF/H2O(250 ㎖) 중의 3급-부틸 N-[5-메톡시-2-(4-메틸설포닐부트-1-이닐)-4-피리딜]카바메이트(2.44 g, 6.88 mmol, 1.0 eq.)의 혼합물에 조금씩 나누어 가하였다. 생성 혼합물을 45℃에서 20h 동안 교반하고 EtOAc로 희석하였다. 생성 혼합물을 세척하고(H2O, 포화된 NaHCO3 및 염수), 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 7:2 내지 2:8 n-헵탄/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.20. 일반적인 방법 C1: 2-할로피리딘 유도체와 알킨 유도체간의 소노가시라 교차 커플링
Figure pct00050
DMF(0.2 내지 0.5 M) 중의 피리딜 할라이드(1.0 eq.), 알킨 유도체(2.0 eq.) 및 TEA(14.0 eq.)의 혼합물을 불활성 기체로 플러싱시킨다. CuI(0.2 eq.) 및 PdCl2(PPh3)2(0.1 eq.)을 가하고 생성 혼합물을 불활성 기체로 플러싱시킨다. 반응물을 95 내지 100℃에서 2 내지 16h 동안 교반한다. 혼합물을 수성 후처리하고 플래시 컬럼 크로마토그래피시켜 목적하는 생성물을 제공한다.
방법 C1의 예시적인 실시예, 중간체 18: N-[2-[5-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-5-메틸-헥스-1-이닐]-5-메톡시-4-피리딜]카바메이트의 합성
Figure pct00051
DMF(1 L) 중의 3급-부틸 N-(2-브로모-5-메톡시-4-피리딜)카바메이트(57.8 g, 190.5 mmol, 1.0 eq.), 3급부틸-(1,1-디메틸펜트-4-이녹시)-디메틸-실란(107.8 g, 381 mmol, 2.0 eq.) 및 TEA(370 ㎖, 2.65 mmol, 14.0 eq.)를 함유하는 혼합물을 N2로 플러싱시켰다. CuI(7.7 g, 38.0 mmol, 0.2 eq.) 및 PdCl2(PPh3)2(13.4 g, 19.1 mmol, 0.1 eq.)을 가하고 생성 혼합물을 N2로 플러싱시켰다. 반응물을 95℃에서 2h 동안 교반하였다. 냉각 후에, 혼합물을 셀라이트 패드상에서 여과하였다. 여액을 EtOAc로 희석하였다. 생성 혼합물을 세척하고(H2O 및 염수), 건조시키고(Na2SO4), 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 70:30 n-헵탄/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.21. 일반적인 방법 C2: 2-할로피리딘 유도체와 알킨 유도체간의 소노가시라 교차 커플링
Figure pct00052
DMF(0.2 내지 0.5 M) 중의 CuI(0.2 eq.), PdCl2(PPh3)2(0.1 eq.) 및 TEA(14.0 eq.)를 함유하는 혼합물을 불활성 분위기하에서 교반한다. 피리딜 할라이드(1.0 eq.) 및 알킨 유도체(1.2 내지 2 eq.)를 가하고 생성 혼합물을 실온에서 16h 동안 교반한다. 혼합물을 수성 후처리하고 플래시 컬럼 크로마토그래피시켜 목적하는 생성물을 제공한다.
방법 C2의 예시적인 실시예, 중간체 41: 에틸 4-(3급-부톡시카보닐아미노)-6-(2-테트라하이드로피란-4-일에티닐)피리딘-3-카복실레이트의 합성
Figure pct00053
무수 DMF(75.0 ㎖) 중의 PdCl2(PPh3)2(0.583 g, 0.831 mmol, 0.1 eq.), CuI(0.317 g, 1.66 mmol, 0.2 eq.) 및 TEA(16.2 ㎖, 116.0 mmol, 14.0 eq.)의 혼합물을 Ar 분위기하에서 교반하였다. 에틸 4-(3급-부톡시카보닐아미노)-6-클로로-피리딘-3-카복실레이트(2.50 g, 8.31 mmol, 1.0 eq.) 및 4-에티닐테트라하이드로-2H-피란(1.10 g, 9.98 mmol, 1.2 eq.)을 가하고 혼합물을 실온에서 대략 16h 동안 교반하였다. 포화된 NH4Cl을 가하여 반응을 급냉시켰다. 생성 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기 혼합물을 세척하고(염수), 건조시키고(Na2SO4), 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 사이클로헥산/EtOAc 100:0 내지 70:30)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.22. 일반적인 방법 D: 방향족 아민의 N-Boc 보호
Figure pct00054
THF(0.5-1.5 M) 중의 방향족 아민(1.0 eq.), 디-3급-부틸 디카보네이트(1.1 eq.) 및 DIPEA(1.2 eq.)를 함유하는 혼합물을 실온에서 16 내지 48h 동안 교반한다. 혼합물을 후처리하여 목적하는 생성물을 제공한다. 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 추가로 정제시킬 수 있다.
방법 D의 예시적인 실시예, 중간체 30: 3급-부틸 N-(3-에톡시-4-피리딜)카바메이트의 합성
Figure pct00055
THF(30 ㎖) 중의 3-에톡시피리딘-4-아민(5.0 g, 36.2 mmol, 1.0 eq.), 디-3급-부틸 디카보네이트(8.69 g, 39.8 mmol, 1.1 eq.) 및 DIPEA(7.6 ㎖, 43.4 mmol, 1.2 eq.)를 함유하는 혼합물을 실온에서 17h 동안 교반하였다. 혼합물을 포화된 NH4Cl로 급냉시켰다. 층이 분리되었으며 수성층을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 합하고 농축시켰다. 잔사를 DCM(50 ㎖)에 용해시키고 NaHCO3의 포화된 용액(100 ㎖)을 가하였다. 생성 혼합물을 10분간 교반하였다. 2개의 층이 분리되었으며 유기층을 건조시키고(상 분리기를 통한 여과) 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.23. 일반적인 방법 E: 피리딘 유도체의 N-아민화에 이은 알킨 유도체와의 반응에 의한 피라졸로[1,5-a]피리딘의 형성
Figure pct00056
1.23.1. 단계 i:
O-(2,4-디니트로페닐)하이드록실아민(2.0 eq.)을 MeCN(대략 0.5 M) 중의 피리딘 유도체(1 eq)의 혼합물에 가한다. 혼합물을 50℃에서 16h 동안 교반한다. 혼합물을 농축시킨다.
1.23.2. 단계 ii:
선행 단계에서 수득된 잔사를 DMF(대략 0.5 M)에 용해시킨다. K2CO3(3.0 eq.)를 가하고 혼합물을 실온에서 1h 동안 교반한다. 알킨 유도체(1.05 eq.)를 가하고 혼합물을 실온에서 20 내지 24h 동안 교반한다. 추가적인 알킨을 가하고 혼합물을 추가로 24h 동안 교반할 수 있다. 혼합물을 수성 후처리하고 플래시 컬럼 크로마토그래피시켜 목적하는 생성물을 제공한다.
방법 E의 예시적인 실시예, 중간체 29: 에틸 5-(3급-부톡시카보닐아미노)-2-[3-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-3-메틸-부틸]-6-에톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-3-카복실레이트의 합성
Figure pct00057
1.23.3. 단계 i:
O-(2,4-디니트로페닐)하이드록실아민(16.2 g, 81.3 mmol, 2.0 eq.)을 MeCN(70 ㎖) 중의 3급-부틸 N-(3-에톡시-4-피리딜)카바메이트(9.69 g, 40.7 mmol, 1.0 eq.)의 혼합물에 가하였다. 혼합물을 50℃에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 농축시켰다.
1.23.4. 단계 ii:
단계 i로부터 수득된 잔사를 DMF(60 ㎖)에 용해시켰다. K2CO3(16.7 g, 121.0 mmol, 3.0 eq.)를 가하고 혼합물을 실온에서 1h 동안 교반하였다. 0.5 ㎖의 DMF 중에 용해된 에틸 6-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-6-메틸-헵트-2-이노에이트(12.7 g, 42.4 mmol, 1.05 eq.)를 가하고 혼합물을 실온에서 24h 동안 교반하였다. 추가량의 에틸 6-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-6-메틸-헵트-2-이노에이트(2.7 g, 0.22 eq.)를 가하고 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 H2O(500 ㎖)와 EtOAc(100 ㎖) 사이에 분배하였다. 2개의 층이 분리되었으며 수성층을 DCM(3 x 100 ㎖)으로 추출하였다. 유기상을 합하고, 세척하고(H2O, 염수), 건조시키고(상 분리기를 통한 여과) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 70:30 사이클로헥산/EtAOc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.24. 일반적인 방법 F: 피라졸로[1,5-a]피리딘 유도체의 가수분해, Boc 탈보호 및 데카복실화
Figure pct00058
9:1 MeOH/H2O(대략 0.1 M) 중의 피라졸로[1,5-a]피리딘 유도체(1.0 eq.) 및 LiOH(20.0 eq.)의 혼합물을 100℃에서 16h 동안 교반한다. 반응 혼합물을 EtOAc와 H2O 사이에 분배시킨다. 2개의 상이 분리되며 수성층을 EtOAc로 추출한다. 합한 유기층을 건조시키고 농축시킨다. 잔사를 톨루엔(대략 0.1 M)에 용해시키고 115℃에서 2 내지 4h 동안 교반한다. 혼합물을 농축시키고 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공한다.
방법 F의 예시적인 실시예, 중간체 43: 2-[3-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-3-메틸-부틸]-6-메톡시-7-메틸-피라졸로[1,5-a]피리딘-5-아민의 합성
Figure pct00059
MeOH(60 ㎖)/H2O(7 ㎖) 중의 에틸 5-(3급-부톡시카보닐아미노)-2-[3-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-3-메틸-부틸]-6-메톡시-7-메틸-피라졸로[1,5-a]피리딘-3-카복실레이트(3.7 g, 6.7 mmol, 1.0 eq.) 및 LiOH(3.22 g, 135 mmol, 20.0 eq.)를 100℃에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc와 H2O 사이에 분배시켰다. 2개의 상이 분리되었으며 수성층을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 건조시키고(상 분리기를 통한 여과) 농축시켰다. 잔사를 톨루엔(60 ㎖)에 용해시키고 115℃에서 2h 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 75:25 사이클로헥산/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.25. 일반적인 방법 G: TBAF의 사용에 의한 TBS 보호기의 제거
Figure pct00060
테트라-n-부틸 암모늄 플루오라이드(THF 중의 1.0 M 용액, 20.0 eq.)를 THF(대략 0.05 M) 중의 3급-부틸(디메틸)실릴 보호된 알콜(1.0 eq.) 용액에 가한다. 혼합물을 80℃에서 24h 동안 교반한다. 혼합물을 농축시키고 잔사를 DCM과 포화된 NH4Cl 사이에 분배시킨다. 2개의 층이 분리되며 유기층을 세척하고(포화된 NH4Cl), 건조시키고 농축시킨다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공한다.
방법 G의 예시적인 실시예, 중간체 27: 4-(5-아미노-6-에톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-2-일)-2-메틸-부탄-2-올의 합성
Figure pct00061
테트라-n-부틸 암모늄 플루오라이드(THF 중의 1.0 M 용액 100 ㎖, 100 mmol, 20.0 eq.)를 THF(85 ㎖) 중의 2-[3-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-3-메틸-부틸]-6-에톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-5-아민(1.88 g, 5.0 mmol, 1.0 eq.)의 용액에 가하였다. 혼합물을 80℃에서 24h 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고 잔사를 DCM(50 ㎖)과 포화된 NH4Cl(30 ㎖) 사이에 분배시켰다. 2개의 층이 분리되었으며 유기층을 세척하고(포화된 NH4Cl, 2 x 30 ㎖), 건조시키고(상 분리기를 통한 여과) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 0:100 사이클로헥산/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.26. 일반적인 방법 H: TBS 및 Boc 보호기의 동시 제거
Figure pct00062
1:1:1 THF/MeOH/2 M 수성 HCl(0.1 내지 0.2 M, 대략 3 내지 7 eq.의 HCl) 중의 Boc 및 TBS 보호된 출발 물질(1.0 eq.)의 용액을 80 내지 90℃에서 2 내지 3h 동안 교반한다. 불완전 전환의 경우에, 추가적인 2 M 수성 HCl을 가하고(5 eq.) 혼합물을 80℃에서 추가로 2h 동안 교반한다. 반응 완료 후에, 혼합물을 냉각시키고 NaOH로 중화시킨다. 혼합물을 EtOAc로 추출한다. 유기층을 세척하고, 건조시키고 농축시킨다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 또는 재결정에 의해 정제하여 목적하는 생성물을 수득한다. 대안으로, 반응 완료 후에, 혼합물을 농축시킨다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 직접 정제시켜 목적하는 생성물을 수득하거나 또는 염기성 수용액을 수반하는 수성 후처리를 가할 수 있다. 후자의 경우에, 유기층을 건조시키고 농축시킨다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 또는 재결정에 의해 정제하여 목적하는 생성물을 수득한다.
방법 H의 예시적인 실시예, 중간체 8: 4-(5-아미노-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-2-일)-2-메틸-부탄-2-올의 대안의 합성
Figure pct00063
1:1:1 THF/MeOH/2 M 수성 HCl(204 ㎖, 4.7 eq.의 HCl) 중의 3급-부틸 N-[2-[3-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-3-메틸-부틸]-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]카바메이트(13.7 g, 29.5 mmol, 1.0 eq.)의 용액을 85℃에서 1.5h 동안 교반하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, pH 7-8까지 2 N NaOH 용액(70 ㎖)으로 중화시키고 EtOAc(대략 600 ㎖ 및 이어서 100 ㎖)로 2회 추출하였다. 유기층을 세척하고(H2O, 염수), 건조시키고(MgSO4) 농축시켰다. 잔사를 고온 MeCN(95 내지 100℃에서 대략 250 ㎖)에 용해시켰다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 이어서 0℃로 냉각시켰다. 침전물을 여과하고 MeCN으로 추가로 세척하여 목적하는 생성물을 제공하였다.
방법 H의 예시적인 실시예, 중간체 55: 4-(5-아미노-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-2-일)-3-플루오로-2-메틸-부탄-2-올의 합성
Figure pct00064
탈이온수 중의 HCl(2 M)(2 ㎖, 12 mmol, 10.4 eq.)을 THF/MeOH(1:1, 4 ㎖)의 혼합물 중의 3급-부틸 N-[2-[3-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-2-플루오로-3-메틸-부틸]-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]카바메이트(556 ㎎, 1.1 mmol, 1.0 eq.)의 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 3h 동안 교반하였다. 탈이온수 중의 HCl(2 M)(3 ㎖, 18 mmol, 15.6 eq.)을 다시 가하고 80℃에서의 교반을 추가로 2h 동안 계속하였다. 휘발성 물질을 감압하에서 증발시키고 조 샘플을 96:4 내지 90:10의 DCM/MeOH로 용출시키면서 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적하는 화합물을 제공하였다.
1.27. 일반적인 방법 I: Boc 보호기를 제거하여 피라졸로[1,5-a]피리딘-5-아민 유도체를 수득한다
Figure pct00065
10:1 DCM/TFA(0.05 내지 0.06 M, 대략 20.0 eq.) 중의 Boc 보호된 유도체(1.0 eq.)의 용액을 실온에서 3 내지 16h 동안 교반한다. 불완전한 전환의 경우에, 추가적인 TFA를 가하고(2.0 eq.) 혼합물을 실온에서 1h 동안 추가로 교반한다. 혼합물을 희석하고(DCM) 염기성 수용액으로 세척한다. 2개의 상이 분리되며 유기층을 세척하고, 건조시키고 농축시켜 목적하는 생성물을 제공한다. 한편으로 반응 혼합물을 ISOLUTE® SCX 컬럼상에 흡착시키고 MeOH로 세척하고 NH3/MeOH로 용출시킨다. 용출된 혼합물을 농축시켜 목적하는 생성물을 제공한다.
방법 I의 예시적인 실시예, 중간체 20: 6-메톡시-2-(2-메틸설포닐에틸)피라졸로[1,5-a]피리딘-5-아민의 합성
Figure pct00066
10:1 DCM/TFA(66.0 ㎖, 20.0 eq.) 중의 3급-부틸 N-[6-메톡시-2-(2-메틸설포닐에틸)피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]카바메이트(1.49 g, 4.03 mmol, 1.0 eq.)의 용액을 실온에서 3h 동안 교반하였다. 0.5 ㎖의 TFA(2.0 eq.)를 가하고 혼합물을 실온에서 1h 동안 추가로 교반하였다. 혼합물을 희석하고(DCM) 포화된 NaHCO3로 조심스럽게 세척하였다. 2개의 상이 분리되었으며 유기층을 세척하고(염수), 건조시키고(Na2SO4) 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.28. 중간체 34: 에틸 5-아미노-2-(4-피페리딜)피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트
Figure pct00067
DCM(60 ㎖)/TFA(4.2 ㎖, 20.0 eq.) 중의 에틸 5-(3급-부톡시카보닐아미노)-2-(1-3급-부톡시카보닐-4-피페리딜)피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트(1.35 g, 2.76 mmol, 1.0 eq.)의 용액을 실온에서 16h 동안 교반하였다. 1 ㎖의 TFA(5.0 eq.)를 가하고 혼합물을 실온에서 추가로 3h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 ISOLUTE® SCX 컬럼상에 흡착시키고 MeOH로 세척하고 7 N NH3/MeOH로 용출시켰다. 용출된 혼합물을 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.29. 중간체 33: 에틸 5-아미노-2-(1-메틸-4-피페리딜)피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트
Figure pct00068
포름알데히드(H2O 중 36%, 0.43 ㎖, 5.6 mmol, 4.5 eq.)를 THF(40 ㎖) 중의 에틸 5-아미노-2-(4-피페리딜)피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트(360 ㎎, 1.25 mmol, 1.0 eq.)의 혼합물에 가하였다. 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드(1.5 g, 7.24 mmol, 5.8 eq.)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 포화된 NaHCO3로 희석하였다. 생성 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 2개의 층이 분리되었으며 유기층을 세척하고(염수), 건조시키고(Na2SO4), 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 0:100 DCM/[90:4:1 DCM/MeOH/NH4OH])에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.30. 일반적인 방법 J: 피라졸로[1,5-a]피리딘-5-아민 유도체로부터 아미드의 합성
Figure pct00069
카복실산(1.2 eq.) 및 HATU, CAS# 148893-10-1(1.2 eq.)을 DMF 중의 아민(1.0 eq.) 및 DIPEA(2.0 eq.)의 혼합물에 가한다. 생성 혼합물을 실온에서 5 내지 16h 동안 교반한다. 반응 혼합물을 냉각된 염기성 용액(H2O 및 포화된 수성 NaHCO3)에 적가하고 목적하는 생성물을 침전에 의해 단리한다.
방법 J의 예시적인 실시예, 중간체 46: 에틸 5-[[6-(디플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]-2-테트라하이드로피란-4-일-피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트의 합성
Figure pct00070
6-(디플루오로메틸)피리딘-2-카복실산(145 ㎎, 0.838 mmol, 1.2 eq.) 및 HATU, CAS# 148893-10-1(319 ㎎, 0.838 mmol, 1.2 eq.)을 DMF(11 ㎖) 중의 에틸 5-아미노-2-테트라하이드로피란-4-일-피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트(202 ㎎, 0.698 mmol, 1.0 eq.) 및 DIPEA(0.243 ㎖, 1.40, 2.0 eq.)의 혼합물에 가하고 생성 혼합물을 실온에서 16h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각된 염기성 용액(500 ㎖의 H2O 및 90 ㎖의 포화된 수성 NaHCO3)에 적가하고 목적하는 생성물을 고체의 침전, 여과 및 건조에 의해 단리하였다.
1.31. 중간체 48: 에틸 5-[[6-(디플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]-2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트
Figure pct00071
6-(디플루오로메틸)피리딘-2-카복실산(135 ㎎, 0.783 mmol, 1.2 eq.) 및 HATU, CAS# 148893-10-1(298 ㎎, 0.783 mmol, 1.2 eq.)을 DCM(10 ㎖) 중의 에틸 5-아미노-2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트(190 ㎎, 0.652 mmol, 1.0 eq.) 및 DIPEA(0.227 ㎖, 1.30 mmol, 2.0 eq.)의 혼합물에 가하였다. 생성 혼합물을 실온에서 16h 동안 교반하였다. 6-(디플루오로메틸)피리딘-2-카복실산(23 ㎎, 0.13 mmol, 0.2 eq.) 및 HATU, CAS# 148893-10-1(34 ㎎, 0.13 mmol, 0.2 eq.)를 가하고 혼합물을 추가로 4h 동안 교반하였다. 혼합물을 희석하고(DCM), 세척하고(포화된 NH4Cl, 포화된 NaHCO3 및 염수), 건조시키고(Na2SO4), 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 0:100 DCM/[90:4:1 DCM/MeOH/NH4OH])에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.32. 일반적인 방법 K: 피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트 에스테르 유도체의 에스테르 가수분해
Figure pct00072
LiOH(3.0 eq.)를 4:1 THF/H2O 중의 에스테르 유도체(1.0 eq.)의 혼합물에 가한다. 반응 혼합물을 실온에서 4 내지 24h 동안 교반한다. THF를 감압하에서 제거하고 혼합물을 1 M HCl로 pH≤5로 산성화한다. 침전물 형성의 경우에, 목적하는 생성물을 여과하고, H2O로 세척하고 공기 중에서 건조시킨다. 대안으로 산성화된 혼합물을 유기 용매로 추출한다. 유기 혼합물을 세척하고, 건조시키고 농축시켜 목적하는 생성물을 제공한다.
방법 K의 예시적인 실시예, 중간체 49: 5-[[6-(디플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]-2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실산의 합성
Figure pct00073
LiOH(22.0 ㎎, 0.92 mmol, 3.0 eq.)를 4:1 THF/H2O(10 ㎖) 중의 에틸 5-[[6-(디플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]-2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트(137 ㎎, 0.31 mmol, 1.0 eq.)의 혼합물에 가하였다. 혼합물을 실온에서 4h 동안 교반하였다. THF를 감압하에서 제거하고 혼합물을 1 M HCl로 pH≤5로 산성화하였다. 혼합물을 EtOAc(3x)로 추출하였다. 합한 유기층을 세척하고(염수), 건조시키고(Na2SO4), 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.33. 중간체 32: 에틸 2-(1-메틸-4-피페리딜)-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트
Figure pct00074
6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카복실산(93 ㎎, 0.488 mmol, 1.2 eq.) 및 HATU, CAS# 148893-10-1(186 ㎎, 0.488 mmol, 1.2 eq.)을 DMF(7 ㎖) 중의 에틸 5-아미노-2-(1-메틸-4-피페리딜)피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트(123 ㎎, 0.407 mmol, 1.0 eq.) 및 DIPEA(0.142 ㎖, 0.84 mmol, 2.1 eq.)의 혼합물에 가하였다. 생성 혼합물을 실온에서 19h 동안 교반하였다. 포화된 수성 NaHCO3(30 ㎖)를 가하고 생성 혼합물을 실온에서 10분간 교반하였다. 혼합물을 DCM(3x20 ㎖)으로 추출하였다. 합한 유기층을 건조시키고(상 분리기를 통한 여과) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(®puriFlash SiO2 컬럼, 100:0 내지 0:100 DCM/[90:5:0.5 DCM/MeOH/NH4OH])에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.34. 중간체 50: 메틸 2-플루오로펜트-4-이노에이트
Figure pct00075
단계 i: THF(70 ㎖) 중의 디메틸 2-플루오로말로네이트(10.0 g, 63.3 mmol, 1.0 eq.)의 용액을 질소 흐름하에 환저 플라스크에 넣고 빙욕에서 냉각시켰다. 수소화 나트륨(무기 오일 중 60% 분산액)(3.8 g, 95 mmol, 1.5 eq.)을 나누어 가하고 저온에서 10분간 교반을 계속하였다. 이어서 반응 혼합물을 실온에서 30분간 교반하고 다시 빙욕에서 냉각시켰다. 톨루엔 중의 9.2 M 3-브로모프로프-1-인(10 ㎖, 92 mmol, 1.5 eq.)을 5분의 기간에 걸쳐 적가하였다. 저온에서 교반을 5분간 및 이어서 실온에서 4h 동안 계속하였다. 휘발성 물질을 감압하에서 증발시켰다. 잔사를 수로 희석하고 EtOAc로 2회 추출하였다. 합한 유기상을 황산 나트륨상에서 건조시키고, 여과하고 감압하에서 증발시켰다.
단계 ii: 염화 리튬(3.97 g, 93.6 mmol, 3.0 eq.)을 DMSO/H2O(40/1.5 ㎖) 중의 디메틸 2-플루오로-2-프로프-2-이닐-프로판디오에이트(5.88 g, 31.3 mmol, 1.0 eq.)의 용액에 가하였다. 바이알을 밀봉하고 반응 혼합물을 110℃에서 1h 동안 가열하였다. 잔사를 수(300 ㎖)/NaCl의 포화된 수용액(200 ㎖)의 혼합물로 희석하고 EtOAc(2 x 500 ㎖)로 2회 추출하였다. 합한 유기상을 NaCl의 포화된 수용액으로 세척하였다. 유기상을 황산 나트륨상에서 건조시키고, 여과하고 감압하에서 증발시켰다. 조 샘플을 EtOAc/n-헵탄으로 용출시키면서 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.35. 중간체 51: 3-플루오로-2-메틸-헥스-5-인-2-올
Figure pct00076
메틸 2-플루오로펜트-4-이노에이트(200 ㎎, 1.5 mmol, 1.0 eq.)를 질소 분위기하에 실온에서 THF(3 ㎖)에 용해시켰다. 용액을 빙욕에서 냉각시키고 Et2O 중의 3.0 M 메틸마그네슘 브로마이드(1.5 ㎖, 4.5 mmol, 2.9 eq.)를 적가하였다. 5분 후에, 빙욕을 제거하고 용액을 실온에서 2h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 등명한 용액이 수득될 때까지 NH4Cl의 포화된 수용액으로 조심스럽게 급냉시켰다. 용액을 EtOAc로 희석하고 유기상을 분리시켰다. 수성상을 다시 DCM(2 x 50 ㎖)으로 추출하였다. 합한 유기상을 황산 나트륨상에서 건조시키고, 여과하고 감압하에서 증발시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.36. 중간체 52: 3급-부틸-(2-플루오로-1,1-디메틸-펜트-4-이녹시)-디메틸-실란
Figure pct00077
[3급-부틸(디메틸)실릴] 트리플루오로메탄설포네이트(13.5 g, 51.1 mmol, 2.5 eq.)를 DCM(110 ㎖) 중의 3-플루오로-2메틸-헥스-5-인-2-올(2.65 g, 20.4 mmol, 1.0 eq.) 및 피리딘(10 ㎖, 124 mmol, 6.0 eq.)의 빙냉 용액에 적가하였다. 10분 후에, 빙욕을 제거하고 용액을 실온에서 20h 동안 교반하였다. 용액을 수성 HCl(2 N)로 세척하고 이어서 포화된 NaHCO3 수용액으로 세척하였다. 유기상을 황산 나트륨상에서 건조시키고, 여과하고 감압하에서 증발시켰다. 조 샘플을 100:0 내지 94:6의 n-헵탄/DCM으로 용출시키면서 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.37. 중간체 53: 3급-부틸 N-[2-[5-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-4-플루오로-5-메틸-헥스-1-이닐]-5-메톡시-4-피리딜]카바메이트
Figure pct00078
밀봉된 튜브에서, 3급-부틸 N-(2-브로모-5-메톡시-4-피리딜)카바메이트(1.7 g, 5.6 mmol, 1.0 eq.), 3급-부틸-(2-플루오로-1,1-디메틸-펜트-4-이녹시)-디메틸-실란(1.4 g, 5.7 mmol, 1.0 eq.), 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 디클로라이드(400 ㎎, 0.6 mmol, 0.1 eq.) 및 구리(I) 요오다이드(230 ㎎, 1.1 mmol, 0.2 eq.)를 DMF(35 ㎖)에 현탁시켰다. 질소를 반응 혼합물을 통해 5분간 발포하고 TEA(11 ㎖, 78.9 mmol, 14.0 eq.)를 가하였다. 반응 혼합물을 100℃에서 3h 동안 가열하고 이어서 실온으로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 빙/수(400 ㎖)에 붓고 10분간 교반하였다. 수성상을 EtOAc(2 x 200 ㎖)로 2회 추출하였다. 합한 유기상을 포화된 NaCl 수용액으로 세척하였다. 유기상을 황산 나트륨상에서 건조시키고, 여과하고 감압하에서 증발시켰다. 조 샘플을 100:0 내지 0:100의 n-헵탄/DCM으로 용출시키면서 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.38. 중간체 54: 3급-부틸 N-[2-[3-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-2-플루오로-3-메틸-부틸]-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]카바메이트
Figure pct00079
O-디페닐포스피닐하이드록실아민(1.68 g, 7.1 mmol, 2.0 eq.)을 THF(60 ㎖)/수(30 ㎖) 중의 3급-부틸 N-[2-[5-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-4-플루오로-5-메틸-헥스-1-이닐]-5-메톡시-4-피리딜]카바메이트(1.67 g, 3.5 mmol, 1.0 eq.)의 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 20h 동안 교반하였다.
단계 ii: AcOH(120 ㎖)를 선행 용액에 가하고 이어서 80℃에서 4h 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 휘발성 물질을 감압하에 40℃에서 증발시켰다. 조 샘플을 95:5 내지 60:40의 n-헵탄/EtOAc로 용출시키면서 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.39. 중간체 56: 2-브로모-5-(트리듀테리오메톡시)피리딘
Figure pct00080
DMF(2000 ㎖) 중의 6-브로모피리딘-3-올(390 g, 2.4 mol, 1.0 eq.) 및 탄산 세슘(1107 g, 3.6 mol, 1.5 eq.)의 혼합물에 실온에서 15분에 걸쳐 요오도메탄-d3(155 ㎖, 2.52 mol, 1.08 eq.)를 적가하였다. 온도를 40℃에서 유지시키고 혼합물을 1h 동안 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 수(6000 ㎖) 및 Et2O(2000 ㎖)의 혼합물에 가하였다. 수성층을 Et2O(2000 ㎖ 및 1500 ㎖)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 염수(2 x 1500 ㎖)로 세척하였다. 유기층을 감압하에서 농축 건조시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.40. 중간체 57: 2-브로모-1-옥시도-5-(트리듀테리오메톡시)피리딘-1-이움
Figure pct00081
5 L 반응기에서 1,2-디클로로에탄(4 L) 중의 2-브로모-5-(트리듀테리오메톡시)피리딘(98.0%, 406 g, 2083 mmol, 1.0 eq.)의 용액에 3-클로로벤젠카보퍼옥소산(77.0%, 702 g, 3131 mmol, 1.5 eq.)을 한 번에 가하였다(흡열, 온도가 10℃로 떨어짐). 혼합물을 80℃로 가온하고 2h 동안 교반하였다. 혼합물을 35℃로 냉각시키고, 디에틸아민(345 ㎖, 3332 mmol, 1.5 eq.)을 가하여 급냉시키고, 감압하에서 농축 건조시켰다. 생성 조 물질에 수(2 L) 및 DCM(3 L)을 가하였다. 디에틸아민을 사용하여 pH를 10.6으로 조절하였다. 혼합물을 5분간 교반하였으며 층이 분리되었다. 수성층을 DCM(1 L)으로 추출하였다. 수성층에 고체 NaCl(600 g)을 가하고 용해시 DCM(1 L)으로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 2 N 수성 NaOH(400 ㎖)로 세척하고 농축 건조시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.41. 중간체 58: 2-브로모-5-메톡시-4-니트로피리딘
Figure pct00082
실험을 온도계가 구비된 2 리터 3목 환저 플라스크에서 병행하여 수행하였다. 플라스크의 유출구에 빈 트랩 병을 연결하고 이어서 2 M 수성 NaOH 용액에 연결하였다. 플라스크에 2-브로모-5-(트리듀테리오메톡시)피리딘-1-옥사이드(95.0%, 149 g, 683 mmol, 1.0 eq.)를 가하고 이어서 96% 농축된 황산(456 ㎖, 8204 mmol, 12.0 eq.)을 가하였다. 현탁액을 용액이 수득될 때까지 교반하였다. 용액을 90℃로 가온하고 여기에 90% 발연 질산(149 ㎖, 3213 mmol, 4.7 eq.)을, 온도를 110 내지 120℃로 유지시키면서 3h에 걸쳐 적가하였다. 완료시, 온도를 60℃로 낮아지게 두고 혼합물을 15분 동안 격렬하게 교반되는 냉수(4 L)에 적가하였다. 형성된 현탁액을 10℃에서 30분간 교반되게 하고, 이어서 여과하고 케이크를 수로 세척하였다. 케이크를 흡입하에 1h 동안 깔때기상에서 유지시키고 이어서 개방된 플레이트에서 공기-건조되게 하였다. 72h에 걸쳐 공기-건조 후에 생성물을 수득하였다.
1.42. 중간체 59: 2-브로모-5-(트리듀테리오메톡시)피리딘-4-아민
Figure pct00083
실온에서 96% EtOH(1000 ㎖) 및 수(350 ㎖)의 혼합물 중의 2-브로모-4-니트로-5-(트리듀테리오메톡시)피리딘(70.0%, 230 g, 682 mmol, 1.0 eq.) 및 염화 암모늄(40.0 g, 748 mmol, 1.1 eq.)의 현탁액에 분말 철(400 g, 7163 mmol, 10.5 eq.)을 한 번에 가하였다. 혼합물을 80℃로 가열하고 2h 동안 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 셀라이트 패트를 통해 여과하였다. 여액을 약 500 ㎖ 부피로 농축시켜 현탁액을 생성시켰다. 현탁액을 소결 깔때기를 통해 여과하였다. 케이크를 수(2 x 400 ㎖)로 세척하고 깔때기상에서 1h 동안 흡입하에 두었다. 셀라이트 패드를 3 x 400 ㎖의 DCM으로 세척하고 세척물을 농축 건조시켰다. 분말 및 DCM 추출물을 모으고 0-5% MeOH/DCM 구배로 용출시키면서 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.43. 중간체 60: 3급-부틸 N-[2-브로모-5-(트리듀테리오메톡시)-4-피리딜]카바메이트
Figure pct00084
5 L 반응기에서 DCM(1 L) 중의 디-3급-부틸 디카보네이트(74.0 g, 339 mmol, 13.0 eq.) 및 4-디메틸아미노피리딘(3.19 g, 26.1 mmol, 1.0 eq.)의 용액을 0℃로 냉각시켰다. 여기에 DCM(1 L) 중의 2-브로모-5-(트리듀테리오메톡시)피리딘-4-아민(96.0%, 56.0 g, 261 mmol, 10.0 eq.) 및 TEA(106 g, 1044 mmol, 40.0 eq.)의 용액을 가하였다. 혼합물을 21℃로 가온하고 16h 동안 교반 방치하였다. 포화된 수성 NaHCO3(2 L)를 가하여 반응을 급냉시켰다. 유기층을 분리시키고 증발시켰다. 잔사를 DCM에 용해시키고 실리카젤 패드(15 ㎝ 높이, 19 ㎝ 직경)에 로딩하였다. 15 L에 걸쳐 0-2% MeOH/DCM 구배로 용출하여 목적하는 생성물과 출발 물질의 혼합물을 제공하였다. 혼합물을 다시 동일한 반응에 참여시켰다: 5 L 반응기에서 DCM(1 L) 중의 디-3급-부틸 디카보네이트(32.4 g, 148 mmol, 5.67 eq.) 및 4-디메틸아미노피리딘(1.39 g, 11.4 mmol, 0.43 eq.)의 용액을 0℃로 냉각시켰다. 여기에 DCM(1 L) 중의 2-브로모-5-(트리듀테리오메톡시)피리딘-4-아민(50% 순도, 47 g, 114 mmol, 4.36 eq.) 및 TEA(46.2 g, 456 mmol, 17.4 eq.)의 용액을 1h에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 21℃로 가온하고 밤새 교반 방치하였다. 포화된 수성 NaHCO3(2 L)를 가하여 반응을 급냉시켰다. 유기층을 분리시키고 증발시켜 조 생성물을 제공하고, 이를 DCM에 용해시키고 실리카젤 패드(9 ㎝ 높이, 13 ㎝ 직경)에 로딩하였다. 10 L에 걸쳐 0-30% EtOAc/사이클로헥산 구배로 용출하여 목적하는 생성물을 수득하였다.
1.44. 중간체 61: 3급-부틸 N-[2-[5-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-5-메틸-헥스-1-이닐]-5-(트리듀테리오메톡시)-4-피리딜]카바메이트
Figure pct00085
DMF(100 ㎖) 중의 3급-부틸 N-[2-브로모-5-(트리듀테리오메톡시)-4-피리딜]카바메이트(6.44 g, 21.0 mmol, 1.0 eq.), 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 디클로라이드(1.48 g, 2.10 mmol, 0.1 eq.), 구리(I) 요오다이드(0.801 g, 4.21 mmol, 0.2 eq.) 및 TEA(41.0 ㎖, 294 mmol, 14.0 eq.)의 혼합물을 N2로 15분간 퍼징하였다. 혼합물에 DMF(10 ㎖) 중의 3급-부틸-(1,1-디메틸펜트-4-이녹시)-디메틸-실란(80.0% 순도, 7.14 g, 25.2 mmol, 1.2 eq.)의 용액을 가하고 10분간 퍼징을 계속하였다. 혼합물을 90℃로 가열하고 반응물을 16h 동안 교반 방치하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 포화된 NH4Cl(300 ㎖) 및 EtOAc(100 ㎖)를 첨가하여 급냉시켰다. 수성층을 EtOAc(50 ㎖)로 추출하였다. 유기 추출물을 포화된 수성 NH4Cl(100 ㎖) 및 염수(100 ㎖)로 세척하였다. 유기층을 농축시키고 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 75:25 사이클로헥산/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.45. 중간체 62: 3급-부틸 N-[2-[3-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-3-메틸-부틸]-6-(트리듀테리오메톡시)피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]카바메이트
Figure pct00086
실온에서 MeCN(30 ㎖) 중의 3급-부틸 N-[2-[5-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-5-메틸-헥스-1-이닐]-5-(트리듀테리오메톡시)-4-피리딜]카바메이트(3.46 g, 7.66 mmo, 1 eq.)의 현탁액에 O-(2,4-디니트로페닐)하이드록실아민(3.07 g, 15.4 mmol, 2.0 eq.)을 한 번에 가하였다. 혼합물을 50℃로 가열하고 24h 동안 교반하였다. 혼합물을 증발 건조시켰다. DMF(50 ㎖)를 잔사에 가하고 혼합물을 16h 동안 80℃에서 교반하였다. 포화된 수성 NaHCO3를 가하고 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 세척하고(포화된 수성 NH4Cl 및 염수), 건조시키고(Na2SO4), 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 80:20 EtOAc/사이클로헥산)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.46. 중간체 64: 1,1,1-트리듀테리오-2-(트리듀테리오메틸)헥스-5-인-2-올
Figure pct00087
5 L 반응기에서 실온에서 Et2O(1 L) 중의 마그네슘 금속(84.3 g, 3.47 mol, 3.5 eq.)의 현탁액에 작은 스푼의 요오드를 가하였다. 혼합물을 N2로 플러싱시켰다. 혼합물에, Et2O(1 L) 중의 트리듀테리오(요오도)메탄(430 g, 2.97 mol, 3.0 eq.)의 용액을 20분에 걸쳐 적가하였다(주의: 발열). 혼합물을 1h 동안 환류하에서 교반하고 이어서 -5℃로 냉각시켰다. Et2O(1 L) 중의 에틸 펜트-4-이노에이트(125 g, 0.991 mol, 1.0 eq.)의 용액을 20분에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 22℃로 가온하고 2h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화된 수성 NH4Cl(1 L)(주의: 발열) 및 H2O(1 L)의 첨가에 의해 급냉시켰다. 층이 분리되었다. 수성층을 Et2O(1 L)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.47. 중간체 65: 1,1-비스(트리듀테리오메틸)펜트-4-이녹시-3급-부틸-디메틸-실란
Figure pct00088
2 L 환저 플라스크에서 DCM(500 ㎖) 중의 1,1,1-트리듀테리오-2-(트리듀테리오메틸)헥스-5-인-2-올(38.0 g, 289 mmol, 1.0 eq.) 및 피리딘(107 ㎖, 1.33 mol, 4.2 eq.)의 용액을 빙욕에서 냉각시켰다. [3급-부틸(디메틸)실릴] 트리플루오로메탄설포네이트(123 g, 465 mmol, 1.5 eq.)를 30분에 걸쳐 적가하였다. 반응물을 주변 온도로 가온하고 16h 동안 교반 방치하였다. 혼합물을, DCM이 제거될 때까지 감압하에서 농축시켰다. Et2O(1.5 L)를 잔사에 가하고 생성 현탁액을 5분간 교반하였다. 현탁액을 여과하고 케이크를 Et2O(700 ㎖)로 세척하였다. 여액을 감압하에서 농축 건조시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.48. 중간체 67: 3급-부틸 N-[2-[3-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-4,4,4-트리듀테리오-3-(트리듀테리오메틸)부틸]-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]카바메이트
Figure pct00089
O-(2,4-디니트로페닐)하이드록실아민, CAS# 17508-17-7(5.08 g, 25.5 mmol, 2.0 eq.)을 실온에서 MeCN(60 ㎖) 중의 3급-부틸 N-[2-[5-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-6,6,6-트리듀테리오-5-(트리듀테리오메틸)헥스-1-이닐]-5-메톡시-4-피리딜]카바메이트(5.80 g, 12.8 mmol, 1.0 eq.)의 현탁액에 한 번에 가하였다. 생성 혼합물을 50℃로 가열하고 밤새 교반하였다. 혼합물을 증발 건조시켰다. DMF(100 ㎖)를 잔사에 가하고 생성 혼합물을 80℃에서 16h 동안 교반하였다. 포화된 수성 NaHCO3(300 ㎖) 및 EtOAc(200 ㎖)를 가하였다. 혼합물을 여과하였으며 여액을 구성하는 2개의 층이 분리되었다. 수성층을 EtOAc(100 ㎖)로 추가로 추출하였다. 유기층을 합하고, 세척하고(포화된 수성 NH4Cl 및 염수), 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 80:20 EtOAc/사이클로헥산)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.49. 중간체 66: 3급-부틸 N-[2-[5-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-6,6,6-트리듀테리오-5-(트리듀테리오메틸)헥스-1-이닐]-5-메톡시-4-피리딜]카바메이트
Figure pct00090
DMF(1.5 L) 중의 3급-부틸 N-(2-브로모-5-메톡시-4-피리딜)카바메이트(89.0 g, 294 mmol, 1.0 eq.), 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 디클로라이드(20.6 g, 29.4 mmol, 0.1 eq.), 구리(I) 요오다이드(11.2 g, 57.8 mmol, 0.2 eq.) 및 TEA(573 ㎖, 4.11 mol, 14.0 eq.)의 혼합물을 15분간 N2로 퍼징하였다. DMF(500 ㎖) 중의 1,1-비스(트리듀테리오메틸)펜트-4이녹시-3급-부틸-디메틸-실란(115 g, 323 mmol, 1.1 eq.)의 용액을 혼합물에 가하고 퍼징을 10분간 계속하였다. 혼합물을 90℃로 가열하고 반응물을 16h 동안 교반 방치하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 포화된 NH4Cl(3000 ㎖) 및 EtOAc(1500 ㎖)를 가하여 급냉시켰다. 수성층을 EtOAc(700 ㎖)로 추출하였다. 유기층을 합하고, 세척하고(포화된 수성 NH4Cl, 1 L 및 염수, 1L), 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 70:30 사이클로헥산/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.50. 중간체 68: 4-(5-아미노-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-2-일)-1,1,1-트리듀테리오-2-(트리듀테리오메틸)부탄-2-올
Figure pct00091
2 M 수성 HCl(15 ㎖)을 MeOH(15 ㎖) 및 THF(15 ㎖) 중의 3급-부틸 N-[2-[3-[3급-부틸(디메틸)실릴]옥시-4,4,4-트리듀테리오-3-(트리듀테리오메틸)부틸]-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]카바메이트(2.52 g, 5.2 mmol, 1.0 eq.)의 혼합물에 한 번에 가하였다. 생성 혼합물을 90℃로 가열하고 16h 동안 교반하였다. 6 M 수성 HCl(6 ㎖)을 가하고 생성 혼합물을 추가로 4h 동안 환류하에서 교반하였다. 혼합물을 농축시켜 MeOH 및 THF를 제거하였다. DCM(10 ㎖)을 가하고 pH를 2 M 수성 NaOH로 대략 8로 조절하였다. 2개의 층이 분리되었으며 이를 농축시켰다. 잔사를 MeCN(20 ㎖)에 현탁시켰다. 혼합물을 30분간 환류하에서 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 이어서 빙욕으로 냉각시켰다. 혼합물을 20분간 교반하고 여과하였다. 이렇게 수득된 고체를 흡입하에 깔때기상에서 건조시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
[표 II]
본 발명의 예시적인 화합물에 대한 중간체
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
Figure pct00099
Figure pct00100
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
Figure pct00104
Figure pct00105
Figure pct00106
Figure pct00107
Figure pct00108
Figure pct00109
Figure pct00110
Figure pct00111
Figure pct00112
Figure pct00113
Figure pct00114
Figure pct00115
Figure pct00116
Figure pct00117
Figure pct00118
Figure pct00119
Figure pct00120
Figure pct00121
실시예 2. 본 발명의 예시적인 화합물의 제조
2.1. 일반적인 방법 A: 아미드의 합성
Figure pct00122
DCM 중의 아민(1.0 eq.), HATU, CAS# 148893-10-1(1.2 eq.), 카복실산(1.2 eq.) 및 DIPEA(2.0 eq.)의 혼합물을 실온에서 16 내지 72h 동안 교반한다. 반응 혼합물을 수성 후처리한다. 2개의 상이 분리되며 유기층을 건조시키고 농축시킨다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 또는 예비 HPLC에 의해 정제한다.
방법 A의 예시적인 실시예, 화합물 1: 1-사이클로프로필-N-[2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-6-메톡시피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소피리딘-3-카복스아미드의 합성
Figure pct00123
DCM(16 ㎖) 중의 4-(5-아미노-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-2-일)-2-메틸-부탄-2-올(105 ㎎, 0.42 mmol, 1.0 eq.), 1-사이클로프로필-2-옥소-피리딘-3-카복실산(91 ㎎, 0.51 mmol, 1.2 eq.), HATU, CAS# 148893-10-1(192 ㎎, 0.51 mmol, 1.2 eq.) 및 DIPEA(0.15 ㎖, 0.84 mmol, 2.0 eq.)의 혼합물을 실온에서 16h 동안 교반하였다. 포화된 수성 NaHCO3(15 ㎖)를 혼합물에 가하고 생성 혼합물을 실온에서 10분간 교반하였다. 2개의 상이 분리되었으며 수성층을 추출하였다(DCM). 합한 유기층을 건조시키고(소수성 프릿을 통한 여과) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 0:100 DCM/90:5:0.5 DCM/MeOH/NH4OH에 의해 구성된 3원 혼합물)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
화합물 1: 1-사이클로프로필-N-[2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-6-메톡시피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소피리딘-3-카복스아미드의 대안의 합성
1-사이클로프로필-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카복실산(4.63 g, 25.8 mmol, 1.2 eq.), HATU, CAS# 148893-10-1(9.83 g, 25.8 mmol, 1.23 eq.) 및 DIPEA(7.5 ㎖, 43.1 mmol, 2.0 eq.)를 DCM(600 ㎖) 중의 4-(5-아미노-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-2-일)-2-메틸-부탄-2-올(5.37 g, 21.5 mmol, 1.0 eq.)의 혼합물에 가하였다. 혼합물을 실온에서 20h 동안 교반하였다. 포화된 수성 NaHCO3(300 ㎖)로 반응을 급냉시키고 생성 혼합물을 10분간 교반하였다. 2개의 층이 분리되었으며 수성층을 추출하였다(2 x 150 ㎖의 DCM). 유기층을 합하고, 건조시키고(상 분리기를 통한 여과) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 0:100 DCM/90:5:0.5 DCM/MeOH/NH4OH에 의해 구성된 3원 혼합물)에 의해 정제시켰다. 덜 순수한 분획으로부터 수득된 생성물을 2차 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 0:100 DCM/90:5:0.5 DCM/MeOH/NH4OH에 의해 구성된 3원 혼합물)하였다. 순도 >95%를 갖는 생성물을 함유하는 모든 분획을 합하고 농축시켰다. 이렇게 수득된 잔사를 고온 아세토니트릴로부터 재결정화시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
화합물 1: 1-사이클로프로필-N-[2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-6-메톡시피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소피리딘-3-카복스아미드의 대안의 합성
HATU, CAS# 148893-10-1(23.0 g, 59 mmol, 1.1 eq.)을 0℃에서 N2 하에 환저 플라스크에서 DCM(220 ㎖) 중의 4-(5-아미노-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-2-일)-2-메틸-부탄-2-올(14 g, 56 mmol, 1.0 eq.) 및 1-사이클로프로필-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카복실산(11 g, 59 mmol, 1.0 eq.)의 혼합물에 나누어 가하였다. DIPEA(15 g, 20 ㎖, 110 mmol, 2.0 eq.)를 가하고 반응 혼합물을 0℃에서 5분간 교반하고 이어서 반응 혼합물을 실온으로 가온되게 하고 1h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화된 NaHCO3 용액(250 ㎖)으로 급냉시키고 200 ㎖의 DCM으로 희석하였다. 생성 혼합물을 1h 동안 교반하였다. 존재하는 불용성 물질을 여과하였다. 고체를 200 ㎖의 수로 세척하고 감압하에서 건조시켰다. 여액 중에 함유된 유기 및 수성 상 분리 후에 경사분리하였다. 수성층을 DCM(1 x 200 ㎖ 및 1 x 100 ㎖)으로 추출하였다. 합한 유기층을 H2O(1 x 400 ㎖) 및 염수(1 x 400 ㎖)로 세척하고, 상 분리기상에서 여과하고 농축시켰다. 잔사를 200 ㎖의 EtOAc 및 200 ㎖의 포화된 NH4Cl 용액에 용해시켰다. 생성 혼합물을 15분간 교반하였다. 존재하는 불용성 물질을 여과하고, 2 x 200 ㎖의 수로 세척하고, 감압하에서 농축시켰다. 이렇게 수득된 고체 물질을 합하고 MeCN에 용해시켰다. 생성 혼합물을 95 내지 100℃로 가열하였다. 불용성 물질을 여과하고 여액을 0℃로 냉각시켰다. 침전물이 형성되고, 이를 여과하고 진공하에서 건조시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
2.2. 화합물 4: 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복스아미드의 합성
Figure pct00124
DCM(2 ㎖) 중의 2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실산(148 ㎎, 0.34 mmol, 1.0 eq.) 및 HATU, CAS# 148893-10-1(155 ㎎, 0.41 mmol, 1.2 eq.)의 혼합물을 실온에서 10분간 교반하였다. DIPEA(0.18 ㎖, 0.68 mmol, 2.0 eq.) 및 NH4Cl(54 ㎎, 1.0 mmol, 3.0 eq.)을 가하고 생성 혼합물을 실온에서 2h 동안 교반하였다. 수성 암모니아(1 ㎖)를 가하고 생성 혼합물을 1.5h 동안 교반하였다. 혼합물을 희석하고(DCM), 세척하고(포화된 수성 NH4Cl, 포화된 NaHCO3, 염수), 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 0:100의 DCM/90:4:1 DCM/MeOH/NH4OH에 의해 구성된 3원 혼합물)에 의해 정제시켰다. 이렇게 수득된 물질을 하기의 방식으로 추가로 정제하였다: 물질을 10:1 DCM/DMF(11 ㎖) 및 포화된 NaHCO3(15 ㎖)에 의해 구성된 혼합물에 용해시켰다. 2개의 상이 분리되었으며 침전물이 수성층 중에 형성되어 목적하는 생성물을 제공하였다.
2.3. 화합물 5: 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-N-메틸-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복스아미드의 합성
Figure pct00125
메틸아민(절대 EtOH 중의 33 중량% 용액, 1.0 ㎖) 중의 에틸 2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트(50 ㎎, 0.11 mmol, 1.0 eq.)의 혼합물을 60℃에서 16h 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 20:80의 DCM/90:4:1 DCM/MeOH/NH4OH에 의해 구성된 3원 혼합물)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
2.4. 일반적인 방법 L: 에스테르와 메틸아민과의 반응에 의한 아미드의 합성
Figure pct00126
절대 EtOH(0.06 내지 0.12 M) 중의 33 중량% 메틸아민 중의 에스테르 유도체(1.0 eq.)의 혼합물을 80℃에서 4-5h 동안 교반한다. 불완전한 전환의 경우에, 추가적인 절대 EtOH 중의 33 중량% 메틸아민을 가하고(초기량의 1/3) 혼합물을 60℃에서 추가로 16 내지 72h 동안 교반할 수 있다. 혼합물을 농축시키고 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공한다.
방법 L의 예시적인 실시예: 화합물 19: 5-[[6-(디플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]-2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)-N-메틸-피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복스아미드의 합성
Figure pct00127
절대 EtOH(3 ㎖) 중의 33 중량% 메틸아민 중의 에틸 5-[[6-(디플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]-2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트(100 ㎎, 0.22 mmol, 1.0 eq.)의 혼합물을 4h 동안 농축시키고 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 20:80의 DCM/90:4:1 DCM/MeOH/NH4OH에 의해 구성된 3원 혼합물)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
2.5. 화합물 12: N-메틸-2-(1-메틸-4-피페리딜)-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복스아미드의 합성
Figure pct00128
메틸아민(절대 EtOH 중의 33 중량% 용액, 3.0 ㎖) 중의 에틸 에틸 2-(1-메틸-4-피페리딜)-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트(90 ㎎, 0.189 mmol, 1.0 eq.)의 혼합물을 60℃에서 16h 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 95:5 내지 0:100의 DCM/90:9:0.5 DCM/MeOH/NH4OH에 의해 구성된 3원 혼합물)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
2.6. 일반적인 방법 M: 카복실산과 염화 암모늄과의 반응에 의한 1차 아미드의 합성
Figure pct00129
DCM 중의 HATU, CAS# 148893-10-1(1.2 eq.) 및 카복실산 유도체(1.0 eq.)의 혼합물을 실온에서 10분간 교반한다. DIPEA(2.0 eq.) 및 NH4Cl(3.0 eq.)을 가한다. 혼합물을 실온에서 2h 동안 교반한다. 용해도를 증가시키기 위해서, DMF를 가할 수 있으며 혼합물을 추가로 3 내지 4h 동안 교반한다. 수성 암모니아를 가하고 혼합물을 실온에서 16h 동안 교반한다. 반응물을 수성 후처리하고 후처리 후 수득된 조 물질을 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공한다.
방법 M의 예시적인 실시예, 화합물 11: 2-테트라하이드로피란-4-일-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복스아미드의 합성
Figure pct00130
DCM(2 ㎖) 중의 2-테트라하이드로피란-4-일-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실산(93 ㎎, 0.21 mmol, 1.0 eq.) 및 HATU, CAS# 148893-10-1(98 ㎎, 0.26 mmol, 1.2 eq.)의 혼합물을 실온에서 10분간 교반하였다. DIPEA(0.074 ㎖, 0.43 mmol, 2.0 eq.) 및 NH4Cl(34 ㎎, 0.64 mmol, 3.0 eq.)을 가하고 생성 혼합물을 실온에서 2h 동안 교반하였다. DMF(2 ㎖)를 가하고 생성 혼합물을 4h 동안 교반하였다. 수성 암모니아(2 ㎖)를 가하고 생성 혼합물을 실온에서 16h 동안 교반하였다. 혼합물을 희석하고(EtOAc), 세척하고(포화된 수성 NH4Cl, 포화된 NaHCO3 및 염수), 건조시키고(Na2SO4), 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 0:100의 DCM/90:4:1 DCM/MeOH/NH4OH에 의해 구성된 3원 혼합물)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
2.7. 화합물 10: 2-(1-메틸-4-피페리딜)-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복스아미드 포름산 염의 합성
Figure pct00131
DCM(2 ㎖) 중의 2-(1-메틸-4-피페리딜)-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실산(35 ㎎, 0.078 mmol, 1.0 eq.) 및 HATU, CAS# 148893-10-1(36 ㎎, 0.094 mmol, 1.2 eq.)의 혼합물을 실온에서 10분간 교반하였다. DIPEA(0.030 ㎖, 0.16 mmol, 2.0 eq.) 및 NH4Cl(13 ㎎, 0.24 mmol, 3.0 eq.)을 가하고 생성 혼합물을 실온에서 3h 동안 교반하였다. DMF(3 ㎖) 및 DIPEA(2.0 eq.)를 가하고 생성 혼합물을 50℃에서 16h 동안 교반하였다. 추가적인 HATU, CAS# 148893-10-1(0.3 eq.)을 가하고 혼합물을 80℃에서 3h 동안 교반하였다. 수성 암모니아(2 ㎖)를 가하고 혼합물을 16h 동안 교반하였다. 혼합물을 희석하고(EtOAc), 세척하고(포화된 수성 NH4Cl, 포화된 NaHCO3 및 염수), 건조시키고(Na2SO4), 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 20:80의 DCM/90:15:1.5 DCM/MeOH/NH4OH에 의해 구성된 3원 혼합물)에 의해 정제시켰다. 이렇게 수득된 물질을 예비 HPLC에 의해 추가로 정제하여 포름산 염으로서 목적하는 생성물을 제공하였다.
2.8. 화합물 4: 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복스아미드의 대안의 합성
Figure pct00132
에틸 2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)-5-[[6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카보닐]아미노]피라졸로[1,5-a]피리딘-6-카복실레이트(50 ㎎, 0.108 mmol, 1.0 eq.)를 MeOH(2 ㎖) 중의 7 N NH3에 용해시키고 60℃에서 16h 동안 교반하였다. 추가적인 MeOH(1 ㎖) 중의 7 N NH3를 가하고 혼합물을 50℃에서 4h 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 0:100의 DCM/90:4:1 DCM/MeOH/NH4OH에 의해 구성된 3원 혼합물)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
2.9. 화합물 22: 1-사이클로프로필-N-[2-(2-플루오로-3-하이드록시-3-메틸-부틸)-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소-피리딘-3-카복스아미드의 합성
Figure pct00133
4-(5-아미노-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-2-일)-3-플루오로-2-메틸-부탄-2-올(220 ㎎, 0.8 mmol, 1.0 eq.), 1-사이클로프로필-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카복실산(190 ㎎, 1.0 mmol, 1.25 eq.)을 DCM(20 ㎖)에 현탁시켰다. HATU(415 ㎎, 1 mmol, 1.3 eq.)에 이어서 DIPEA(430 ㎕, 2.47 mmol, 3.0 eq.)를 가하고 혼합물을 실온에서 2h 동안 교반하였다. 용액을 DCM으로 희석하고 NH4Cl의 포화된 수용액 및 NaHCO3의 포화된 수용액으로 연속해서 세척하였다. 유기상을 황산 나트륨상에서 건조시키고, 여과하고 감압하에서 농축시켰다. 조 샘플을 100:0 내지 94:6의 DCM/MeOH로 용출시키면서 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
2.10. 화합물 6: 1-사이클로프로필-N-[6-메톡시-2-(2-메틸설포닐에틸)피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소-피리딘-3-카복스아미드의 합성
Figure pct00134
HATU, CAS# 148893-10-1(1.6 g, 4.1 mmol, 1.1 eq.)을 0℃에서 DCM(100 ㎖) 중의 6-메톡시-2-(2-메틸설포닐에틸)피라졸로[1,5-a]피리딘-5-아민(991 ㎎, 3.68 mmol, 1.0 eq.) 및 1-사이클로프로필-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카복실산(750 ㎎, 4.06 mmol, 1.1 eq.)의 혼합물에 나누어 가하였다. DIPEA(1.3 ㎖, 7.5 mmol, 2.0 eq.)를 가하고 반응 혼합물을 실온에서 16h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM(150 ㎖)으로 희석하고 NaHCO3의 포화된 수용액에 이어서 NaCl의 포화된 수용액으로 세척하였다. 유기상을 황산 나트륨상에서 건조시키고, 여과하고 감압하에서 농축시켰다. 조 잔사를 100:0 내지 95:5의 DCM/MeOH로 용출시키면서 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
2.11. 화합물 25 및 26의 합성: 1-사이클로프로필-N-[2-(2-플루오로-3-하이드록시-3-메틸-부틸)-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소-피리딘-3-카복스아미드의 키랄 분리
Figure pct00135
129 ㎎의 1-사이클로프로필-N-[2-(2-플루오로-3-하이드록시-3-메틸-부틸)-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소-피리딘-3-카복스아미드를 키랄 분리시켜(컬럼: Chiralpak IA, 150 ㎜ x 4.6 ㎜, 5 ㎛; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 2 ㎖/분; 용출제: 50:50 이소프로판올/CO2) 1-사이클로프로필-N-[2-(2-플루오로-3-하이드록시-3-메틸-부틸)-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소-피리딘-3-카복스아미드의 거울상이성질체 A(첫 번째 용출) 및 거울상이성질체 B(두 번째 용출)를 제공한다.
2.12. 화합물 24: 1-사이클로프로필-N-[2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-6-(트리듀테리오메톡시)피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소피리딘-3-카복스아미드의 합성
Figure pct00136
DCM(6 ㎖) 중의 1-사이클로프로필-2-옥소-피리딘-3-카복실산(0.441 g, 2.46 mmol, 0.83 eq.) 및 DIPEA(450 uL)의 혼합물을 실온에서 30분간 교반하였다. 4-[5-아미노-6-(트리듀테리오메톡시)피라졸로[1,5-a]피리딘-2-일]-2-메틸-부탄-2-올(518 ㎎, 2.05 mmol, 1.0 eq.), HATU, CAS# 148893-10-1(1.01 g, 2.67 mmol, 1.3 eq.), DIPEA(0.61 ㎖, 3.58 mmol, 1.75 eq.) 및 DCM(6 ㎖)을 가하고 생성 혼합물을 실온에서 18h 동안 교반하였다. 혼합물을 포화된 수성 NaHCO3를 가하여 급냉시켰다. 수성층을 DCM으로 추출하였다. 합한 유기층을 포화된 수성 NH4Cl로 세척하고 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 96:4 DCM/MeOH)에 의해 정제하였다. 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축시켰다. 잔사를 MeCN에 용해시켰다. 혼합물을 환류하에서 30분간 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 이어서 빙욕으로 냉각시켰다. 혼합물을 15분간 교반하고 여과하였다. 수득된 고체를 소량의 MeCN으로 추가로 세척하여 목적하는 생성물을 수득하였다.
2.13. 화합물 23: 1-사이클로프로필-N-[6-메톡시-2-[4,4,4-트리듀테리오-3-하이드록시-3-(트리듀테리오메틸)부틸]피라졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-2-옥소-피리딘-3-카복스아미드의 합성
Figure pct00137
DCM(16 ㎖) 중의 1-사이클로프로필-2-옥소-피리딘-3-카복실산(1.27 g, 7.08 mmol, 1.3 eq.) 및 DIPEA(1.2 ㎖, 7.07 mmol, 1.3 eq.)의 혼합물을 실온에서 30분간 교반하였다. 4-(5-아미노-6-메톡시-피라졸로[1,5-a]피리딘-2-일)-1,1,1-트리듀테리오-2-(트리듀테리오메틸)부탄-2-올(1.42 g, 5.45 mmol, 1.0 eq.), HATU, CAS# 148893-10-1(2.69 g, 7.08 mmol, 1.3 eq.), DIPEA(1.6 ㎖, 9.4 mmol, 1.7 eq.) 및 DCM(16 ㎖)을 가하고 생성 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 포화된 수성 NaHCO3를 가하여 급냉시켰다. 수성층을 DCM으로 추출하였다. 합한 유기층을 포화된 수성 NH4Cl로 세척하고 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0 내지 90:10 DCM/MeOH)에 의해 정제하였다. 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축시켰다. 잔사를 MeCN에 용해시켰다. 혼합물을 환류하에서 30분간 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 이어서 빙욕으로 냉각시켰다. 혼합물을 1h 동안 교반하고 여과하였다. 수득된 고체를 소량의 MeCN으로 추가로 세척하여 목적하는 생성물을 수득하였다.
[표 III]
본 발명의 예시적인 화합물
Figure pct00138
Figure pct00139
Figure pct00140
Figure pct00141
Figure pct00142
Figure pct00143
Figure pct00144
Figure pct00145
Figure pct00146
Figure pct00147
Figure pct00148
[표 IV]
본 발명의 예시적인 화합물의 NMR 데이터
Figure pct00149
Figure pct00150
Figure pct00151
생물학적 실시예
실시예 3. 시험관내 분석
3.1. 인간 IRAK-4에 대한 인산화 IC50 측정
3.1.1. 분석 원리
Km ATP에서 IRAK4에 의한 기질 RIP140(서열번호 1)의 인산화를, 키나제 반응으로부터 형성된 ADP를 측정하는 발광 키나제 분석인 ADP-Glo 키나제 분석(Promega, Cat# V9103)으로 검출하였다. (Zegzouti et al., 2009) 두 번째 단계에서 키나제 반응이 종료되고 남아있는 모든 ATP가 고갈되었다. 최종 단계에서 ADP는 ATP로 전환되었으며 상기 새로 합성된 ATP를 발광 리더와 함께 루시페라제/루시페린 반응을 사용하여 측정하였다. 발광 신호는 키나제 활성, 특히 키나제 억제와 양성으로 상관되었으며, 발광 신호의 감소를 제공하였다.
3.1.2. 물질
반-자동 분석을 위해서, 수(3.8 ㎖) 및 DMSO(180 ㎕) 중에서 10 mM 스타우로스포린 모액 혼합물(20 ㎕)을 희석하여, 1% DMSO(키나제 반응에서 최종 희석 후 최종 농도)에서 10 μM 스타우로스포린 용액을 생성시킴으로써 양성 대조군(100% 억제)을 제조하였다.
자동 분석을 위해서, 10 mM 스타우로스포린 모액을 예비-희석하지 않았다. 10 mM 스타우로스포린을 음향 분배를 사용하여 분석 플레이트에 직접 스폿팅하고 DMSO로 보완하여 상기에서 언급한 바와 유사한 최종 농도를 생성시켰다.
반-자동 분석을 위해서, 수(3.8 ㎖) 및 DMSO(200 ㎕)를 혼합하여 키나제 반응에서 추가 희석 후에 1% DMSO의 최종 농도를 생성시킴으로써 음성 대조군(0% 억제)을 제조하였다. 자동 분석을 위해서 DMSO의 예비-희석을 수행하지 않았다. 100% DMSO를 분석 플레이트상에 직접 스폿팅하였다.
분석 완충액을, 125 mM TRIS pH 7.5 + 0.05% 트리톤 X-100 + 2.5 mM EGTA(5.27 ㎖)의 용액과 1M MgCl2(72　㎕), 1 M DTT(57.6 ㎕) 및 200 mM MnCl2(360 ㎕)를 혼합함으로써 최종(가장 희석된) 분석 농도의 5배에 상응하는 농도로 제조하였다.
효소-기질 혼합물(25 μM RIP140 및 0.125 ng/㎕ IRAK4의 수성 완충액)을, 반-자동 방법의 최종(가장 희석된) 분석 농도의 2.5배 및 자동 방법의 최종(가장 희석된) 분석 농도의 3배에 상응하는 농도로 제조하였다. 예를 들어, 반-자동 방법의 경우, 효소-기질 혼합물을, 수(3999 ㎕), 분석 완충액(1380 ㎕), 1 mM RIP140(138 ㎕ - 서열번호 1), 및 200 ng/㎖ IRAK4(3.45 ㎕ Carna Biosciences, 09 145)를 혼합하여 제조하였다.
반-자동 방법의 경우, ATP 혼합물을, 반-자동 방법의 최종(가장 희석된) 분석 농도의 2.5배 및 자동 방법의 최종(가장 희석된) 분석 농도의 1.5배에 상응하는 농도로 제조하였다. 예를 들어, 반-자동 방법의 경우, ATP 혼합물을, 수(4126 ㎕), 분석 완충액(1380 ㎕), 및 10 mM ATP(13.80 ㎕)를 혼합하여 제조하였다.
3.1.3. 방법
분석을 반-자동 또는 완전 자동 방식으로 수행하였다. ADP 검출을 위한 분석 부피 및 배양 시간은 사용되는 방법에 상응하게 상이하였다.
3.1.3.1. 반-자동 분석
화합물을 수 중 1/20 희석된, 2 mM 최고 농도에서 출발하여 100% DMSO 중에서 1/5 희석 단계로 10 포인트 용량 반응의 연속 희석물로서 제조하였다. 1 ㎕를 분석 플레이트에 건조하게 옮겼다.
각 분석 플레이트상에 32 웰의 각각의 대조군(양성 & 음성)을 가한 다음 2 ㎕의 효소-기질 혼합물을 가하였다.
분석 플레이트에 2 ㎕의 희석된 ATP(최종 농도 Km ATP)를 가하여 반응을 출발시켰다. 플레이트를 1000 rpm에서 수초간 원심분리시킨 다음 실온에서 120분 동안 배양하였다.
반응을 정지시키고 반응물에 5 ㎕ ADP-glo 시약(Promega, Cat# V9103)을 가하여 소비되지 않은 APT를 고갈시켰다. 플레이트를 1000 rpm에서 급속히 원심분리시키고 실온에서 완전한 ATP 고갈에 상응하는 40분 동안 배양하였다.
ADP를 다시 ATP로 전환시키고, 반응에 10 ㎕ 키나제 검출 시약(Promega, Cat# V9103)을 가함으로써 루시페라제 및 루시페린을 도입시켜 ATP를 검출하였다. 플레이트를 1000 rpm에서 수초간 원심분리시키고 실온에서 추가로 30분 동안 배양하였다.
발광 판독을 엔비젼(Envision) 발광 판독기(Perkin Elmer)상에서 수행하였다.
3.1.3.2. 자동 분석
자동 분석을 위해서, 화합물을 2 mM 최고 농도에서 출발하여 100% DMSO 중에서 1/5 희석 단계로 10 포인트 용량 반응의 연속 희석물로서 제조하였다.
후속적으로, 화합물을 분석 플레이트로 옮기고/옮기거나 DMSO에서 희석하여 30 nL의 최종 부피에 도달시키고 대조군을 가한다.
연속 희석에 대해서: 10 포인트 연속 희석, 1/5 희석 단계, 최종 최고 농도 1% DMSO 중의 20 μM.
각각의 플레이트에 32 웰의 각각의 대조군(양성 & 음성)을 가하였다.
플레이트를 HighRes 플랫폼으로 옮기고 하기의 단계를 실행하였다:
a) 1 ㎕의 희석된 효소/기질 혼합물을 각 웰에 분배하고,
b) 분석 플레이트에 2 ㎕의 희석된 ATP(최종 농도 Km ATP)를 가하여 반응을 출발시키고,
c) 플레이트를 300 g에서 10초간 원심분리시킨 다음 실온에서 120분간 배양하고,
d) 반응을 정지시키고 3 ㎕ ADP-Glo 시약을 가하여 소비되지 않은 ATP를 고갈시키고, 플레이트를 밀봉하고 실온에서 40분간 배양하고,
e) ADP를 ATP로 전환시키고 6 ㎕의 키나제 검출 시약을 반응에 가하여 루시페라제/루시페린을 도입시켜 ATP를 검출하고, 플레이트를 밀봉하고 실온에서 60분간 배양하고,
f) 발광 판독을 퍼킨 엔비젼 발광 판독기상에서 수행하였다.
3.1.4. 데이터 분석
발광 판독기상에서 수행된 판독에 따라 생성된 원 데이터로부터, 억제 백분율(PIN)을 하기 식을 사용하여 계산하였다:
Figure pct00152
상기에서 RLU는 상대적인 화학발광 광 단위(배경 공제된)이고 아래첨자 p 및 n은 각각 양성 및 음성 대조군의 각 플레이트 기반 평균을 지칭한다.
PIN 값을 농도-반응으로 플롯팅하고 IC50 값을 4-매개변수 비선형 회귀(s자) 곡선 적합을 적용시켜 유도하였다.
[표 V]
본 발명의 화합물의 시험관내 인간 IRAK-4 ADP-Glo IC50
Figure pct00153
Figure pct00154
3.2. 키나제 선택성 프로파일(광범위 패널)
본 분석의 목적은 억제시 바람직하지 못한 부작용(Dy and Adjei, 2013; Force and Kolaja, 2011)을 생성시킬 수도 있는 선택된 범위의 인간 키나제에 대한 본 발명 화합물의 활성 및 선택성을 측정하는 것이다.
인간 키나제의 억제를 Eurofins Cerep SA(Le Bois L'Ev
Figure pct00155
que, BP 30001, F- 86600 Celle-L
Figure pct00156
vescault)에서 방사선측정 키나제 분석으로 측정한다.
IC50을 측정하기 위해서, 화합물을 3배 연속 희석하면서 10 μM(최고 농도)에서 출발하여 10개 용량에서 시험한다. 잔여 효소 활성%(DMSO 대조군에 비해)의 용량-반응 곡선을 적합시켜 IC50 값을 유도한다.
3.3. NFκB-리포터 분석
3.3.1. 분석 원리
인터류킨-1 수용체 연관된 키나제(IRAK4) 활성은 활성화 NFκB-의존적인 신호전달을 촉발하는 LPS 및 IL-1β의 하류에서 중요한 역할을 하는 것으로 입증된 반면, IRAK4는 TNFα 매개된 반응에 필요하지 않은 것으로 나타났다(Davidson et al., 2006; Jain et al., 2014).
이 분석을 사용하여 THP1-Lucia NFκB 리포터 분석에서 IRAK4 의존적인(LPS 및 IL-1β) 및 비의존적인 촉발(TNFα)에 대한 본 발명 화합물의 IRAK4 선택성 및 효능을 평가하였다.
3.3.2. 분석 프로토콜
THP-1-Lucia NFκB 세포(Invivogen - 5, rue Jean Rodier 31400 Toulouse France - cat# thp1-nfkb)를, 각 주기가 일련의 해동/확대/시딩을 포함하는 분할 주기를 사용하여 공급자에 의해 권장되는 대로 배양하였다. 보고된 데이터를 3 내지 9 주기의 세포를 사용하여 생성시켰다. 실험 당일에 THP-1-Lucia NFκB 세포를 카운트하고 384 웰 플레이트에서 54 ㎕/웰을 피펫팅함으로써 배양 배지(RPMI 1640(Gibco, Cat#52400-025) + 10% FBS(Sigma, Cat# F7524-500ML) + 1% P/S(Gibco, Cat#15140-122))에 1,000,000 세포/㎖의 밀도로 시딩하였다. 그 후에, 6 ㎕의 10x 촉발제 용액을, '촉발제 없는 웰'(여기에 6 ㎕의 배양 배지만이 첨가되었다)을 제외하고, 각각 LPS, TNFα 및 IL-1β에 대해 2.5, 10 및 3 ng/㎖의 최종 농도로 모든 웰에 가하였다.
촉발제 첨가 후에, 화합물을 3배 희석 단계를 사용하여 8-포인트 농도 범위로 디지털 화합물 분배기로 가하고 최종 DMSO 농도를 모든 웰에서 0.2% DMSO로 정규화하였다.
37℃, 5% CO2에서 24h 배양 후에, 40 ㎕의 상등액을 웰당 수집하고 새로운 384 웰 플레이트로 옮기고 이어서 추후 사용시까지 -20℃에서 보관하였다.
판독을 위해서, 상등액 샘플을 빙상에서 해동하고 5 ㎕ 샘플을 각 웰에서 새로운 384-웰 플레이트로 옮겼다. 20 ㎕의 Quanti-Luc 용액(제조사에 의해 나타낸 바와 같은 25 ㎖ 멸균 수 중에 용해된 Quanti-Luc powder(Invivogen, Cat#rep-qlc1))을 각 웰에 가하고 그 후에 발광을 엔비젼 장치상에서 바로 측정하였다.
LPS/TNFα/IL-1β 유도된 NFκB-수용체 활성의 억제를 측정하기 위해서, 억제 백분율(PIN) 값을 대조용과 비교하여, 시험된 모든 농도에 대해 계산하였다.
자극되지 않은 샘플(촉발제 부재/비히클(0.2% DMSO))을 음성 대조군(100% 억제)으로서 사용하였다. 양성 대조군(0% 억제)으로서, 자극된 샘플(촉발제/비히클))을 사용하였다.
Figure pct00157
여기에서 RLU는 상대적인 광 단위(배경 공제된)이고 p 및 n은 각각 양성 및 음성 대조군의 평균을 지칭한다.
PIN 값을 농도-반응에 플롯팅하고 EC50 값을 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여, 4-매개변수 비선형 회귀(s자) 곡선 적합을 적용시켜 유도하였다. 분석을 하기의 제한으로 수행하였다: 상단은 120 미만이고 힐 기울기는 1과 같아야 한다. EC50 값은 오직 적어도 40% PIN에 도달하는 화합물에 대해서만 계산된다.
예를 들어, 본 분석에서 시험시 화합물 1은 LPS 구동된 NFκB-리포터 활성을 7.0(±0.1)의 평균 pEC50 값으로 억제하고 IL-1β 구동된 NFκB-리포터 활성을 7.0(±0.1)의 평균 pEC50 값으로 억제한 반면, TNFα 매개된 NFκB-리포터 활성에 대해서는 활성이 관찰되지 않았고, 이는 화합물 1의 IRAK4 선택성을 예시한다.
실시예 4. ADME 분석
4.1. 동역학적 용해도
DMSO 중의 시험 화합물의 10 mM 모액으로부터 출발하여, 3 mM의 DMSO 중의 두 번째 농도를 준비한다. 2개의 DMSO 농도를 모두, 2 ㎕의 화합물 용액에 200 ㎕의 완충제를 가함으로써 0.1 M 포스페이트 완충제 pH 7.4로 희석한다. 최종 화합물 농도는 100 & 30 μM이며, 최종 DMSO 농도는 1%이다. 측정을 중복해서 수행한다.
침전에 대한 양성 대조군으로서, 피렌을 각각의 96 웰 플레이트의 구석 지점에 가하며 이를 현미경상의 Z-축의 교정에 대한 참조점으로서 제공한다. 음성 대조군으로서, DMSO를 양성 대조용 웰 사이의 컬럼상의 12개 웰에 가한다.
분석 플레이트를 밀봉하고 230 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 1h 동안 배양한다.
이어서 플레이트를 니콘 현미경을 사용하여 백색광 현미경하에서 스캐닝하여, 농도당 침전물의 개별적인 사진(20x)을 생성시킨다.
침전물을 시각적으로 분석한다:
- 침전물이 100 μM 및 30 μM에서 관찰되는 경우, 생성되는 데이터는 <30 μM일 것이다.
- 침전물이 100 μM에서 관찰되지만 30 μM에서는 관찰되지 않는 경우, 생성되는 데이터는 >30 μM일 것이다.
- 침전물이 관찰되지 않는 경우(30 μM에서도 또는 100 μM에서도), 생성되는 데이터는 >100 μM일 것이다.
상기 프로토콜에 따라 측정된 용해도 값을 μM 및 ㎍/㎖로 보고한다.
4.2. 열역학적 용해도
불량한 용해도, 특히 불량한 열역학적 용해도는 위장관으로부터의 화합물의 흡수를 제한할 수 있으며, 이는 차례로 경구 생체이용률을 감소시킬 수 있다.
열역학적 용해도는, 과포화가 발생할 수 있는 준안정 용액의 용해도를 측정하고 화합물의 실제 용해도에 대한 과도한 추정을 제공하는 동역학적 용해도와 상반되게, 평형시 포화 용액으로서 화합물의 용해도를 조사한다.(Klein, 2010)
4.2.1. 열역학적 용해도 - 프로토콜 1
8 ㎖ 유리 바이알에서, 1 내지 2 ㎎의 화합물의 건조 물질을 가하고 적합한 완충제(섭식 상태의 모의 장액, FeSSIF, 또는 공복 상태의 모의 장액, FaSSIF, 또는 공복 상태의 모의 위액, FaSSGF, 또는 포스페이트 완충제 pH　7.4)와 함께 실온(완충제 pH 7.4의 경우) 또는 37℃(GI 액의 경우)에서 24h 동안 교반한다. 혼합물의 농도는 1 ㎎/㎖이다.
500 ㎕의 분량을 샘플링하고 10 000 rpm에서 10분간 원심분리하고 여과한다. 샘플을 DMSO(F100 및 F10) 중에서 중복해서 희석한다. 이어서, 내부 표준(와파린)을 함유하는 80/20 H2O/MeCN 중의 최종 희석(F100)을 LCMS-MS 분석에 사용한다.
표준 곡선을 건조 물질로부터 새로 제조된, DMSO 중의 200,000 ng/㎖ 모액으로부터 출발하여 작성한다. 이어서 DMSO 중의 15,000, 10,000, 2,500, 1,000, 200 및 75 ng/㎖의 연속 농도를 테칸(Tecan) 로봇을 사용하여 제조한다.
2개의 품질 대조용 샘플을 제조한다: 또한 200,000 ng/㎖의 DMSO 실행 모액으로부터 출발하여 DMSO 중의 10,000 ng/㎖ 하나 및 500 ng/㎖ 하나.
표준 곡선 및 품질 대조군을 80/20 H2O/MeCN(내부 표준과 함께) 중에서 F100 희석하고 LC/MS-MS(API4000 또는 API5500)상에서 분석한다.
샘플을 LC-MS 상에서 0.6 ㎖/분의 유량으로 분석한다. 이동상 A는 수 중 0.1% 포름산이고 이동상 B는 MeCN 중 0.1% 포름산이다. 샘플을 Agilent의 Pursuit C18 - 5 ㎛(2.0 x 20 ㎜)상에서 양성 또는 음성 이온 분무하에 실행한다.
표준 곡선의 피크 면적을 그래프에 플롯팅하고 2차 방정식의 선형 또는 다항식을 사용하여 시험 화합물의 미지의 농도를 계산한다.
4.2.2. 열역학적 용해도 - 프로토콜 2
8 ㎖ 유리 바이알에서, 1 내지 2 ㎎의 화합물의 건조 물질을 가하고 적합한 완충제(섭식 상태의 모의 장액, FeSSIF, 또는 공복 상태의 모의 장액, FaSSIF, 또는 공복 상태의 모의 위액, FaSSGF, 또는 포스페이트 완충제 pH　7.4)와 함께 실온(완충제 pH 7.4의 경우) 또는 37℃(GI 액의 경우)에서 24h 동안 교반하였다. 혼합물의 농도는 1 ㎎/㎖이었다.
1000 ㎕의 분량을 샘플링하고 10 000 rpm에서 10분간 원심분리하고 500 ㎕의 상등액을 캡티바 플레이트상에서 여과하였다. 샘플을 DMSO(F100 및 F10) 중에서 중복해서 희석하였다. 이어서, 내부 표준(와파린)을 함유하는 80/20 H2O/MeCN 중의 최종 희석(F100)을 LCMS-MS 분석에 사용하였다.
표준 곡선을 건조 물질로부터 새로 제조된, DMSO 중의 40,000 ng/㎖ 모액으로부터 출발하여 작성하였다. 이어서 DMSO 중의 15,000, 11,000, 6,000, 2,500, 1,000, 375, 150 및 75 ng/㎖의 연속 농도를 제조하였다.
3개의 품질 대조용 샘플을 제조하였다: 또한 400,000 ng/㎖의 DMSO 실행 모액으로부터 출발하여 DMSO 중의 10,000, 1,500 및 200 ng/㎖ 중 하나.
표준 곡선 및 품질 대조군을 80/20 H2O/MeCN(내부 표준과 함께) 중에서 F100 희석하고 LC/MS-MS(API4000 또는 API5500)상에서 분석하였다.
샘플을 LC-MS 상에서 0.6 ㎖/분의 유량으로 분석하였다. 이동상 A는 수 중 0.1% 포름산이고 이동상 B는 90% MeCN 및 10% H2O 중 0.1% 포름산이었다. 샘플을 Agilent의 Pursuit C18 - 5 ㎛(2.0 x 20 ㎜)상에서 양성 또는 음성 이온 분무하에 실행하였다.
표준 곡선의 분석물/내부 표준 피크 면적의 비를 그래프에 플롯팅하고 2차 방정식의 선형 또는 다항식을 사용하여 시험 화합물의 미지의 농도를 계산하였다.
용해도 값을 ㎍/㎖로 보고하였다.
[표 VI]
본 발명의 예시적인 화합물의 열역학적 용해도
Figure pct00158
4.3. 혈장 단백질 결합 PPB(평형 투석)
실험 출발에 앞서, 투석 멤브레인(멤브레인 스트립, MW 컷오프 12-14kDa, HTDialysis, Cat.No.#1101)을 60분간 탈이온수에 적시고, 20% EtOH에 옮겨 밤새 둔다.
실험 당일에, DMSO 중의 화합물의 10 mM 모액을 DMSO에서 10 인자로 희석한다. 상기 용액을 새로 해동된 인간, 래트, 마우스 또는 개 혈장(BioReclamation INC)에서 5 μM의 최종 농도 및 0.5%의 최종 DMSO 농도로 추가 희석한다.
상기 용액으로부터, 50 ㎕의 분액을 취하고 회수 플레이트용으로 같은 부피의 PBS와 기질 합치시켰다. 그 후에 6 부피의 정지액을 회수 플레이트에 가하였다. 상기 회수 플레이트에 대해서, 배양을 수행하지 않는다.
평형 투석 장치(96-웰, 모델 HTD96b, HTDialysis, Cat.No.#1006)를 제조사의 설명에 따라 조립한다. 조립 직후에, 각각 100 ㎕ 부피의 혈장(화합물이 스파이크됨)을 웰의 한쪽 면에 놓고 또 다른 100 ㎕의 블랭크 PBS 완충제를 다른 쪽에 가한다. 각각의 화합물을 중복해서 시험한다. 아세부톨롤 및 니카르디핀은 낮은 및 매우 높은 결합 대조군으로서 사용되지만, 카페인이 마우스를 제외하고 아세부톨롤 대신에 낮은 결합제로서 사용된다. 이들 대조군에 대한 PPB 값이 과거 데이터에 의해 결정된 범위안에 있지 않으면, 분석이 검증되지 않는다.
플레이트를 230 rpm에서 진탕시키면서 37℃에서 4h 동안 배양한다.
그 후에, 50 ㎕의 분액을 웰의 각 측면에서 취하고 기질 합치시킨다(같은 부피의 스파이크 혈장과 블랭크 PBS 완충제 및 완충제 구획으로부터의 샘플과 블랭크 혈장과의 혼합물).
기질 합치된 샘플을 64 부피의 정지액(내부 표준으로서 와파린과 아세토니트릴)과 추가로 혼합한다. 간단한 혼합 및 원심분리(+4℃에서, 2400 rpm에서 15분간) 후에, 상등액을 여과하고 LC-MS/MS(시스템 API4000 또는 API5500)상에서의 분석을 위해 새로운 96-웰 플레이트로 옮긴다.
샘플을 LC/MS-MS상에서 0.6 ㎖/분의 유량으로 분석한다. 이동상 A는 수 중 0.1% 포름산이고 이동상 B는 MeCN 중 0.1% 포름산이다. 샘플을 Agilent의 Pursuit C18 - 5 ㎛(2.0 x 20 ㎜)상에서 양성 또는 음성 이온 분무하에 실행한다. 용매 구배는 1.2 분의 총 실행 시간을 가지며 구배 프로파일은 하기와 같다:
Figure pct00159
혈장(PPB) 중 결합된 백분율을 하기 식을 사용하여 결정한다:
Figure pct00160
Cplasma = 혈장 중 화합물의 피크 면적/혈장 중 IS의 피크 면적
Cbuffer = 완충제 중 화합물의 피크 면적/완충제 중 IS의 피크 면적
"농도"는 화합물과 내부 표준 피크 면적간의 비이다.
회수는 대조군이며, 이는 화합물이 플레이트에 비특이적인 결합을 갖지 않거나 이러한 조건에서 혈장에서 안정하지 않음을 확인하게 한다.
Figure pct00161
이때, PBS = 4h 후 PBS 구획 중 (화합물의 피크 면적/IS의 피크 면적의 비)
Plasma = 4h 후 혈장 구획 중 (화합물의 피크 면적/IS의 피크 면적의 비)
Recov = recovery = T0에서 웰 회수 중 화합물의 피크 면적/웰 회수 중 IS의 피크 면적의 비
PBS에 대한 최종 시험 농도 화합물의 용해도를 현미경에 의해 조사하여 침전물이 관찰되는 지의 여부를 나타낸다. 침전물이 관찰되면, PPB의 데이터는 발생하지 않는다.
4.4. 간 마이크로솜 안정성
DMSO 중의 화합물의 10 mM 모액을 DMSO에서 3배 희석한다. 이어서 상기 예비-희석된 화합물 용액을 100 mM 포스페이트 완충제(pH 7.4) 중에서 2 μM로 희석하고 37℃에서 예온한다. 상기 화합물 희석물을 300 rpm에서 진탕하에 37℃에서 마이크로솜/보조인자 혼합물과 F2 혼합한다.
최종 반응 조건은 하기와 같다: 100 ㎕ 배양 부피, 1 μM의 시험 화합물(n=2), 0.2% DMSO, 0.5 ㎎/㎖ 마이크로솜(Xeno-Tech), 0.6 U/㎖ 글루코스-6-포스페이트-데하이드로게나제(G6PDH, Roche, 10127671001), 3.3 mM mgCl2(Sigma, M2670), 3.3 mM 글루코스-6-포스페이트(Sigma, G-7879) 및 1.3 mM NADP+(Sigma, N-0505).
300 rpm 및 37℃에서 30분의 배양 후에, 600 ㎕의 정지액(내부 표준으로서 디클로페낙과 아세토니트릴)으로 반응을 정지시켰다. 0 시점을 위해서, 600 ㎕의 정지액을 화합물 희석물에 가한 후에 마이크로솜 혼합물을 가하였다.
상기 두 시점 모두의 샘플을 원심분리하고, 여과하고 LC-MS/MS에 의해 분석하였다.
샘플을 0.6 ㎖/분의 유량으로 LC/MS-MS상에서 분석한다. 이동상 A는 H2O 중 0.1% 포름산이고 이동상 B는 90% MeCN 및 10% H2O 중 0.1% 포름산이다. 샘플을 Agilent의 Pursuit C18 - 5 ㎛(2.0 x 20 ㎜)상에서 양성 또는 음성 이온 분무하에 실행한다. 용매 구배는 2.2 분의 총 실행 시간을 가지며 구배 프로파일은 하기와 같다:
Figure pct00162
장비 반응(피크 면적/IS 피크 면적)은 잔여 화합물의 백분율을 측정하기 위해서 0 시점 샘플(100%로서 간주됨)을 참조하였다.
베라파밀(1 μM) 및 와파린(1 μM)을 각각 불안정한 및 안정한 화합물로서 참조 화합물로 사용하였다. 이들 대조군에 대한 마이크로솜 안정성 값이 과거 데이터에 의해 측정된 범위내에 있지 않다면, 분석은 검증되지 않는다.
마이크로솜 안정성에 대한 데이터를 30분 배양 후 남아있는 화합물의 총량의 백분율로서 나타낸다.
100 mM 완충제 pH 7.4에 대한 최종 시험 농도의 화합물의 용해도를 현미경에 의해 검사하여 침전이 관찰되는 지의 여부를 나타낸다. 침전물이 관찰되면, 마이크로솜 안정성 데이터가 생성되지 않는다.
4.5. S9 세포하 분획에서 대사 안정성
본 분석의 목적은 S9 세포하 분획에서 시험관내 대사 안정성의 측정에 의한 알데히드 옥시다제에 의한 화합물 대사를 평가하는 것이다.
DMSO 중의 10 mM 화합물 모액을 먼저 DMSO에서 희석하여(40배) 250 μM 농도를 획득한다. 상기 화합물 용액을 수로 추가 희석하여(5배) 50 μM 화합물 실행 용액을 수득한다(1 μM의 화합물 최종 농도를 획득한다). 하이드랄라진(알데히드 옥시다제의 선택적인 억제제)을 수 중에서 5 mM로 제조한다(100 μM의 최종 농도를 수득한다). 10 ㎕의 간 S9 현탁액(인간, 래트, 마우스, 원숭이, BD GentestTM, 20 ㎎/㎖)을 37℃에서 86 ㎕의 50 mM 칼륨 포스페이트 완충제, pH 7.4에 가하여(2 ㎎ 단백질/㎖의 최종 농도) 배양 혼합물을 제조한다. 2 ㎕의 5 mM 하이드랄라진을, 선택적인 억제제, 또는 억제제 부재하 배양의 경우, 2 ㎕의 수를 첨가하면서 배양을 위해 가한다. 5분 예온 후에, 2 ㎕의 50 μM 시험 화합물을 배양 혼합물에 가하여 반응을 개시시킨다.
0, 3, 6, 12, 18 및 30분의 배양 후에, 분석 내부 표준으로서 10 ng/㎖의 와파린을 함유하는 1% AcOH 혼합물과 함께 150 ㎕의 MeCN/MeOH(2:1)로 반응(50 ㎕)을 종료시킨다. 샘플을 혼합하고, 원심분리하고, 상등액을 LC-MS/MS에 의해 분석한다.
샘플을 LC/MS-MS상에서 0.7 ㎖/분의 유량으로 분석한다. 이동상 A는 수 중 0.1% 포름산이고 이동상 B는 90% 아세토니트릴 및 10% 수 중의 0.1% 포름산이다.
프탈라진을 양성 대조군으로서 포함시킨다.
장비 반응(화합물 및 내부 표준의 피크 면적비)은 잔여 화합물의 백분율을 측정하기 위해서 0 시점 샘플(100%로서 간주됨)을 참조한다. 잔여 화합물 %의 플롯을 사용하여, 그래프패드 프리즘® 소프트웨어로 S9 배양에서 반감기 및 고유 클리어런스를 측정한다. 하기의 식을 사용하여 시험관내 고유 클리어런스(㎕/분/㎎)를 계산한다.
CLint(㎕/분/㎎) = 0.693/t1/2(분) * (배양 ㎖/단백질 ㎎) * 1000
시험 화합물은 S9에 의한 클리어런스가 하이드랄라진에 의해 억제되는 경우 알데히드 옥시다제의 기질로서 분류될 수 있다. 시험 화합물의 종 특이적인 클리어런스는 또한 알데히드 옥시다제에 의한 대사를 가리킬 수 있다.
4.6. 간세포에서 대사 안정성
본 분석의 목적은 상이한 종의 간세포(저온보존된)에서 화합물의 대사 안정성을 측정하는 것이다. 낮은 간세포 안정성은 불필요한 대사산물의 형성, 높은 클리어런스를 생성시킬 수 있으며, 따라서 바람직하지 않다.
모체의 감소는 LC-MS/MS 분석에 의해 남아있는 백분율을 측정함으로써 평가되었다.
DMSO 중의 시험 화합물의 10 mM 모액을 먼저 DMSO에서 3 mM로 희석하고, 이어서 변형된 Krebs-Henseleit 완충제(Sigma, K3753)에서 5 μM로 희석하였다. 상기 화합물 희석물을 느린 진탕하에 37℃에서 모아놓은 저온보존된 간세포(BioreclamationIVT)의 현탁액에 가하였다.
최종 반응 조건은 하기와 같았다: 1 μM의 시험 화합물, 0.03% DMSO, 50만개의 생육성 간세포/㎖, 및 75 ㎕ 배양 부피.
테스토스테론(1 μM) 및 7-하이드록시쿠마린(1 μM)을 각각 I상 및 II상 대사 반응 대조군으로서 사용하였다.
0, 10, 20, 45, 90, 120 및 180분의 배양 후에, 분석 내부 표준으로서 100 ng/㎖의 디클로페낙을 함유하는 225 ㎕의 MeCN:MeOH(2:1)로 반응을 종료시켰다. 샘플을 혼합하고, 원심분리하고, 상등액을 LC-MS/MS에 의해 분석하였다.
장비 반응(시험 화합물 및 내부 표준 피크 면적의 비)은 잔여 화합물의 백분율을 측정하기 위해서 0 시점 샘플(100%로서 간주됨)을 참조하였다.
잔여 화합물 백분율의 플롯을 사용하여 하기 식으로 간세포 배양시 고유 클리어런스를 측정하였다:
Figure pct00163
등급화된 Clint[L/h/㎏] = Clint[㎕/분/106 세포] * #(106) 세포/g 간 * (1/106)
등급화된 Clint 결합되지 않은[L/h/㎏] = Clint[L/h/㎏]/ Fu,inc
여기에서: fu,inc는 하기 식에 의한 마이크로솜 결합(fu, mic)으로부터 유도된, 간세포 결합과 같다:
Figure pct00164
[표 VII]
본 발명의 예시적인 화합물의 간세포 안정성
Figure pct00165
(마우스 간세포 안정성(90분째에 남아있는 퍼센트)/인간 간세포 안정성(90분째에 남아있는 퍼센트))
4.7. hERG 채널 시험
본 분석의 목적은 인간 배아 신장(HEK) 세포에서 발현되는 hERG 전류(IKr)에 대한 시험 화합물의 시험관내 영향을 측정(인간 세포주에서 안정하게 형질감염된 hERG 채널에 의해 매개되는 IKr-유사 칼륨 전류에 대한 시험 물질의 차단 프로파일의 평가)하는 것이며, 이는 심장 안전성과 연결된다.
시험 물질을 저온 교반에 의해 순수한 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시켜, 시험되는 최고 농도에 비해 333배 농축된 모액을 제공한다. 상기 모액을 사용하여 DMSO 중의 다른 모액을 제조한다. 각각의 모액을 사용하여 세포외 용액에서의 희석(0.1, 1, 10 및 100 μM)에 의해 시험된 최종 농도를 함유하는 용액을 제조한다. DMSO의 최종 농도는 0.3%를 초과하지 않아야 한다.
모든 제형을 유리 용기에서 제조한다.
최고 농도에서 약간의 유백광이 지속되는 경우, 50 μM(100 μM 대신에) 농도를 시험한다.
세포외 용액에서 희석된 DMSO(최종 시험 물질 용액에 사용된 상이한 농도에서)를 비히클로서 사용한다.
세포외 용액은 하기와 같이 구성된다(mM): K-글루코네이트: 4 mM/Na-글루코네이트: 145 mM/Mg-글루코네이트: 2 mM/Ca-글루코네이트: 3.5 mM/HEPES: 5 mM/글루코스: 5 mM/만니톨: 20 mM. pH를 NaOH로 7.40±0.05로 조절한다.
인간 배아 신장(HEK293) 세포를 hERG 클론(Creacell)으로 안정하게 형질감염시키고 5% CO2/95% 공기 배양기에서 37℃에서 유지시킨다. 연구에 사용된 세포를 대략 2 ㎖의 실험 챔버로 옮기고 이를 열전 장치(Harvard Apparatus: Type TC-344B)에 의해 35±0.5℃의 온도에서 유지시키고 도립 현미경(Olympus: Type IX-51 또는 Leica DMI3000 B)의 플랫폼 상에 올려놓는다. 세포를 하기와 같이(mM) 구성된 타이로드(Tyrode) 용액과 계속해서 초융합시킨다: NaCl: 145/KCl: 4/HEPES: 5/글루코스: 5/CaCl2: 1/MgCl2: 1.
hERG-형질감염된 세포의 이온 전류를 패치 클램프 기법의 전세포 배열을 사용하여 측정한다. 유리 피펫을 수직 풀러(Sutter Instruments: Type P30)에 의해 보로실리케이트 유리로부터 잡아당긴다. 피펫 팁 저항은 하기와 같이 구성된(mM) 내부 용액으로 충전시 대략 1.5 내지 3.5 MΩ이다: K-글루코네이트: 145: Mg-글루코네이트: 1/EGTA: 2/HEPES: 5/K2ATP: 2.
피펫을 패치-클램프 증폭기(Axon Instruments: Multiclamp 700B-1)의 투입 단계에 연결한다. 전문적인 Axon Instruments 소프트웨어(pClamp 9.2.0. 또는 pClamp 10.3.0.2)를 사용하여 자극, 데이터 기록 및 분석을 수행한다.
세포막의 파열(전-세포 모드에 진입) 후에, 세포를 하기의 프로토콜을 사용하여 10초마다 자극한다: -80 mV의 유지 전위에서 +10 mV까지 500 ms 펄스에 이어서 500 ms 펄스에서 -40 mV까지(이 동안 후미 전류가 측정된다).
일단 대조용 조건하에서 전류가 안정화되면, 시험 물질의 첨가 전(대조군) 및 후에 기록을 수행한다. 후미 전류에 대한 시험 물질의 영향을 정상 상태에 도달할 때까지 계속해서 모니터한다. 피크 후미 전류 진폭을 3개의 자극에 대해 평균한다.
하기의 매개변수를 측정한다.
- 세포 정전용량(pF).
- 피크 후미 전류 진폭(pA).
피크 후미 전류 측정을 세포 표면의 지수로서 세포 정전용량을 사용하여 정규화한다.
세포 정전용량 <80 pF, 액세스 저항 <20 MΩ 및 유지 전류 >-200 pA인 경우 세포는 유효한 것으로 간주될 것이다.
결과를 절대값으로서 및 대조군으로부터의 변화 백분율(후미 전류 억제의 백분율)로서 나타낸다.
시험 물질을 3개의 hERG-형질감염된 세포상에서 4개의 상승 농도로 연구한다.
후미 전류의 50%의 억제(IC50)를 유도하는 시험 물질의 농도를, 가능한 경우, 각각의 개별적인 농도-반응 곡선으로부터 측정한다. 식은 하기의 형태를 갖는다:
Figure pct00166
4.8. CYP 억제
본 분석의 목적은 시험 화합물의 억제 가능성을 측정하는 것이다. 약물-약물-상호작용에 대한 주된 관심은 시토크롬 P450 억제이다. 가역적인 CYP 억제는 인간 시토크롬 P450 동종효소 CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 및 3A4에 대한 특이적인 탐침 기질을 사용하여 인간 간 마이크로솜에서 측정되었다.
5 mM의 시험 화합물 모액을 메탄올 중에서 제조한다. 상기 모액을 메탄올 중에서 추가로 1:3 연속 희석하고 이어서 50 mM 칼륨 포스페이트 완충제 pH 7.4, 인간 간 마이크로솜(BD Gentest) 및 탐침 기질을 함유하는 혼합물에 가한다. 37℃에서 5분 예온 후에, 보조인자 혼합물(7.65 ㎎/㎖ 글루코스-6-포스페이트, 1.7 ㎎/㎖ NADP, 6 U/㎖의 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제)을 가하여 반응을 개시시켜, 0.137 내지 100 μM(2% MeOH) 범위의 시험 화합물의 7개의 최종 농도를 생성시킨다.
인간 간 마이크로솜에서 CYP 억제에 대한 분석 조건
Figure pct00167
보조인자 혼합 성분의 최종 농도는 하기와 같다: 1.56 ㎎/㎖ 글루코스-6-포스페이트, 0.34 ㎎/㎖ NADP, 1.2 U/㎖의 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제.
37℃에서 배양 후에, 반응을(50 ㎕의 분액) 내부 표준(2C9의 경우 와파린, 모든 다른 시험된 동형의 경우 디클로페낙)과 함께 150 ㎕ MeCN:MeOH(2:1) 용액으로 종결시킨다. 샘플을 원심분리하고 상등액 분획을 LC-MS/MS에 의해 분석한다.
장비 반응(시험 화합물 및 내부 표준 피크 면적의 비)은 탐침 대사에서 감소 백분율을 측정하기 위해서 용매 대조군(100%로서 간주됨)에 대한 반응을 참조하였다. 대조용 활성의 퍼센트 대 농도 플롯을 생성시키고 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 적합시켜 IC50을 생성시킨다.
4.9. MDCKII-MDR1 투과성
MDCKII-MDR1 세포는 P-당단백질(P-gp)을 암호화하는, 인간 다중-약물 내성(MDR1) 유전자를 과발현하는 Madin-Darby 개 신장 상피 세포이다. 세포를 네덜란드 암 연구소로부터 얻어 24-웰 밀리셀(Millicell)® 세포 배양 삽입 플레이트(Millipore, PSRP010R5)에서 3-4일 배양 후에 사용한다. 양방향 MDCKII-MDR1 투과성 분석을 하기에 기재하는 바와 같이 수행한다.
막을 통한 수송을 특이적인 P-gp 억제제, 엘라크리다의 존재 및 부재하에서 시험한다. 상기와 같은 실험 셋업은 수동 투과성(엘라크리다에 의한) 및 시험 화합물 수송(엘라크리다 부재)에 대한 P-gp의 영향의 측정을 가능하게 하였다.
MDCKII-MDR1 세포(3　x　105 세포/㎖; 1.2　x　105 세포/웰)를 24-웰 밀리셀 세포 배양 삽입 플레이트(Millipore, PSRP010R5) 상에서 DMEM + 1% Ala-Gln + 1% 항생제/항진균제 + 1% 불필수 아미노산 + 10% FBS로 이루어지는 도말 배지에 시딩한다. 세포를 CO2 배양기에서 3-4일간 방치한다. 배지를 시딩 후 24h째에 교환한다. 투과성 실험 당일에, 특이적인 P-gp 억제제, 엘라크리다의 존재하에서 시험되는 세포를 먼저, 1% DMSO 및 2 μM의 최종 농도의 엘라크리다를 함유하는 둘베코의 포스페이트 완충제 염수(D-PBS, pH 7.4)와 45분간 예비-배양한다.
시험 및 참조 화합물(암프레나비어 및 디클로페낙)을 엘라크리다(최종 농도: 2 μM)의 존재 또는 부재하에 둘베코의 포스페이트 완충제 염수(D-PBS, pH 7.4; Sigma, D8662) 중에서 제조하고 이를 밀리셀 세포 배양 플레이트 조립체의 정점(400 ㎕) 또는 기저측부(800 ㎕) 챔버에 1%의 최종 DMSO 농도와 함께 10 μM(암프레나비어의 경우에 0.5 μM)의 최종 농도로 가한다.
참조 화합물 암프레나비어는 높은 수동 투과성을 갖지만 Pgp의 기질이며, 디클로페낙은 매우 투과성이나 Pgp의 기질이 아니다.
100 μM 루시퍼 옐로우(Sigma, L0259)를, 루시퍼 옐로우 침투를 모니터링함으로써 세포 단층의 온전함을 평가하기 위해 모든 공여자 완충제 용액에 가한다. 루시퍼 옐로우는 세포주위 수송 경로에 대한 형광 마커이며 분석 중 모든 세포 단층의 긴밀한 접합 온전성을 확인하기 위한 내부 대조군으로서 사용된다.
150 rpm에서 궤도 진탕기상에서 진탕시키면서 37℃에서 1h 배양 후에, 정점 및 기저 챔버 모두로부터 분액을 취하고 96 웰 플레이트 중의 분석학적 내부 표준(10 ng/㎖ 와파린)을 함유하는 3 부피의 MeCN:H2O 용액(2:1)에 가한다. 샘플을 또한 공여자 용액으로부터 실험 시작시에 취하여 초기(Co) 농도를 획득한다.
샘플 중 화합물의 농도를 고성능 액체-크로마토그래피/질량 분광학(LC-MS/MS)에 의해 측정한다.
루시퍼 옐로우를 모든 수용 웰(기저측면 또는 정점면)로부터의 150 ㎕의 액체를 함유하는 96 웰 플레이트에서 Thermo Scientific Fluoroskan Ascent FL(여기 파장: 485 ㎚, 측정 파장: 530 ㎚)로 측정한다.
4.10. 전혈 분석
4.10.1. 생체외 인간 IFNα 및 TNFα 방출 억제(인간 전혈 분석)
분석의 목적은 생체외 인간 전혈 환경에서 활성화된 TLR/IRAK-4 경로에 대한 본 발명 화합물의 활성을 평가하는 것이다. 톨-형 수용체(TLR)는 병원체-연관된 분자 패턴(PAMP)이라 칭하는 광범위하게 다양한 미생물 분자를 인식하는 패턴 인식 수용체이다. 인간 TLR7 및 TLR8은 이미다조퀴놀린 화합물(예를 들어, CL097 - CAS n# 1026249-18-2) 및 천연 리간드로서 단일 가닥 RNA를 인식한다. TLR의 활성화는 TLR 작용물질-처리된 세포에 의해 다수의 사이토카인(예를 들어 IFNα, TNFα, IL-8, IL-6)의 생성을 유도하는 반면, IRAK4는 IFNα의 생성을 유도한다. 사이토카인 방출은 본 분석에서 판독결과로서 사용되며 시험된 화합물에 의한 TLR/IRAK-4 경로의 억제 수준에 대한 척도를 나타낸다. 완전한 유기체의 상황에서, TLR/IRAK-4 경로에 의존하지 않는 이들 사이토카인에 대한 다른 공급원, 예를 들어 대식세포(Fcγ 수용체의 활성화시(Yan et al., 2012)) 또는 T 세포(T 세포 수용체의 활성화시(Brehm et al., 2005))가 존재함에 유의해야 한다.
4.10.1.1. 실험 설계
정맥천자에 의해 건강한 자원자로부터 리튬 헤파린 튜브내로 채혈하고, 이어서 수회 서서히 뒤집어 응고를 방지하고 흔들리는 믹서 진탕기상에서 37℃에서 적어도 15분 동안 배양하였다. 이어서, 100 ㎕의 혈액을 폴리프로필렌 96-웰 미세플레이트에 분배하고 37℃에서 15분간 0.3% DMSO 또는 상이한 농도(30 내지 0.01 μM, 3배 희석하여 최종적으로 0.3% DMOS를 수득한다)의 시험 화합물과 중복해서 예비-배양하였다. 이러한 예비-배양 후에, 혈액을 37℃에서 3시간 30분간 CL097(수 중 1 ㎎/㎖ 용액으로부터 2 ㎍/㎖; InvivoGen, tlrl-c97)로 촉발시켰다. 마이크로튜브를 4℃에서 10분간 5000 x g에서 원심분리시키고 대략 40㎕의 혈장을 폴리스티렌 96-웰 플레이트에 수집하였다. 혈장을 새로, 촉발 후 30분 이내에 분석하거나, 또는 -80℃에서 동결시킬 수 있었다. 최종적으로 TNFα 및 IFNα의 정량분석을 제조사의 설명에 따라 TNFα 및 IFNα에 대한 AlphaLISA 키트를 사용하여 혈장 중에서 수행하고 Ensight(PerkinElmer)상에서 판독하였다.
4.10.1.2. 데이터 분석
x-축 상의 농도에 대해 y-축 상에 로그-로그 평균 흡광도를 플롯팅하여 표준 곡선을 생성시키고 4-매개변수 로지스틱 회귀(4PL)를 포인트를 통해 작성하였다. 각각의 혈액 샘플에 대해서, 샘플의 IFNα 농도를 적합으로부터 측정하였다. 이어서 데이터를 하기 식을 사용하여 각각의 반복에 대해서 억제 백분율(PIN)로서 나타내었다:
PIN샘플1 = (CL097 존재하의 평균 IFNα - IFNα 샘플1 )*100
(CL097 존재하의 평균 IFNα - 비히클 존재하의 평균 IFNα)
CL097 존재하의 평균 IFNα는 CL097에 의해 촉발된 반복 샘플의 평균 IFNα 농도이고; IFNα샘플1는 샘플 1의 IFNα 농도이고; 비히클 존재하의 평균 IFNα는 비히클로 처리된 반복 샘플의 평균 IFNα 농도이다.
각각의 혈액 샘플에 대해서, 샘플의 TNFα 농도를 적합으로부터 측정하였다. 이어서 데이터를 하기 식을 사용하여 각각의 반복에 대해서 억제 백분율(PIN)로서 나타내었다:
PIN샘플1 = (CL097 존재하의 평균 TNFα - TNFα 샘플1 )*100
(CL097 존재하의 평균 TNFα - 비히클 존재하의 평균 TNFα)
CL097 존재하의 평균 TNFα는 CL097에 의해 촉발된 반복 샘플의 평균 TNFα 농도이고; TNFα샘플1는 샘플 1의 TNFα 농도이고; 비히클 존재하의 평균 TNFα는 비히클로 처리된 반복 샘플의 평균 TNFα 농도이다.
pIC50 측정을 위한 곡선 적합을 평균 PIN±sem을 사용하여 생성시켰다. 그래프 및 pIC50 계산은 프리즘 5.03 소프트웨어(GraphPad)를 사용하여 유도되었다.
4.10.1.3. 결과
Figure pct00168
Figure pct00169
(인간 전혈 IC50에서 CL097 촉발된 IFNα 방출/인간 전혈 IC50에서 CL097 촉발된 TNFα 방출)
4.10.2. 생체외 마우스 TNFα 방출 억제(마우스 전혈 분석)
본 분석의 목적은 생체외 마우스 전혈 환경에서 활성화된 TLR/IRAK-4 경로에 대한 본 발명 화합물의 활성을 평가하는 것이다. 톨-형 수용체(TLR)는 병원체-연관된 분자 패턴(PAMP)이라 칭하는 광범위하게 다양한 미생물 분자를 인식하는 패턴 인식 수용체이다. 인간 TLR7 및 TLR8은 모두 이미다조퀴놀린 화합물(예를 들어, CL097) 및 천연 리간드로서 단일 가닥 RNA를 인식하는 반면, 설치류 TLR8은 활성화를 위해 올리고데옥시뉴클레오티드(예를 들어 폴리(dT))와 같은 추가적인 인자를 필요로 한다.
4.10.2.1. 실험 설계
Balb/cJ 암컷 마우스(7-8 주 된 것)를 Janvier Labs(France)로부터 수득한다.
방혈에 의해 수득한 혈액을 리튬 헤파리네이트 튜브에 수집하고(5개의 데이터 점에 대해서 대략 한 마리의 마우스) 이어서 흔들리는 믹서 진탕기상에서 37℃에서 적어도 15분 동안 배양한다. 모든 마우스로부터의 혈액을 50 ㎖ 폴리프로필렌 튜브에서 혼합한다. 이어서, 100 ㎕의 혈액을 2 ㎖-마이크로튜브에 분배하고 37℃에서 15분간 0.3% DMSO 또는 상이한 농도(10 내지 0.01 μM, DMSO 중에서 3배 희석)의 시험 화합물과 예비-배양한다. 이러한 예비-배양 후에, 혈액을 37℃에서 3.5h 동안 CL097(2 ㎍/㎖) 및 폴리(dT)(0.2 μM) 또는 비히클(증류수)로 촉발시킨다. 마이크로튜브를 4℃에서 10분간 5000g에서 원심분리시키고 대략 30㎕의 혈장을 폴리스티렌 96-웰 플레이트에 수집한다. 혈장을 새로 분석하거나, 또는 -80℃에서 동결시킬 수 있다. 최종적으로 TNFα의 정량분석을 2.5 ㎕의 희석되지 않은 혈장(중복) 및 제조사의 설명에 따라 마우스 TNFα alphaLISA 키트를 사용하여 수행한다. 판독(광학 밀도 = OD)을 Ensight(PerkinElmer)상에서 수행한다.
4.10.2.2. 데이터 분석
x-축 상의 농도에 대해 y-축 상에 로그-로그 평균 흡광도를 플롯팅하여 표준 곡선을 생성시키고 4 매개변수 로지스틱 회귀를 포인트를 통해 작성한다.
각각의 혈액 샘플에 대해서, 샘플의 TNFα 농도를 적합으로부터 측정한다. 이어서 데이터를 하기 식을 사용하여 각각의 반복에 대해서 억제 백분율(PIN)로서 나타내었다:
PIN샘플1 = (CL097 존재하의 평균 TNFα - TNFα 샘플1 )*100
(CL097 존재하의 평균 TNFα - 비히클 존재하의 평균 TNFα)
이때 CL097 존재하의 평균 TNFα는 CL097/폴리(dT)에 의해 촉발된 반복 샘플의 평균 TNFα 농도이고; TNFα샘플1는 샘플 1의 TNFα 농도이고; 비히클 존재하의 평균 TNFα는 비히클로 처리된 반복 샘플의 평균 TNFα 농도이다.
곡선 적합을 평균 PIN±sem을 사용하여 생성시킨다.
그래프 및 pIC50 계산은 프리즘 5.03 소프트웨어(GraphPad)로 수행한다. 데이터를 24개의 독립적인 실험으로 획득한 IC50(nM)의 평균으로서 나타낸다.
실시예 5. 생체내 분석
5.1. CIA 모델
5.1.1. 물질
완전 프로인트 항원보강제(CFA) 및 불완전 프로인트 항원보강제(IFA)를 Difco로부터 구입하였다. II형 소 콜라겐(CII), 리포폴리사카라이드(LPS), 및 엔브렐(Enbrel)을 각각 Chondrex(Isle d'Abeau, France); Sigma(P4252, Isle d'Abeau, France), Whyet(25 ㎎ 주사기, France) Acros Organics (Palo Alto, CA)로부터 수득하였다. 사용된 다른 모든 시약은 시약 등급의 것이었고 모든 용매는 분석 등급의 것이었다.
5.1.2. 동물
DBA1/J 마우스(수컷, 7-8주 된)를 Charles River Laboratories(프랑스 에큘리 소재)로부터 수득하였다. 마우스를 12시간 명/암 주기(07h00-19h00)로 유지시켰다. 온도를 22℃에서 유지시키고 먹이와 물을 자유롭게 제공하였다.
5.1.3. 콜라겐 유발된 관절염(CIA)
실험 하루 전날, CII 용액(2 ㎎/㎖)을 0.05 M AcOH로 제조하고 4℃에서 보관하였다. 면역화 직전에, 동 부피의 항원보강제(IFA) 및 CII를 빙수욕에서 예비-냉각시킨 유리병 중에서 균질화기에 의해 혼합하였다. 유화액이 형성되지 않은 경우 여분의 항원보강제 및 연장된 균질화가 필요할 수도 있다. 1일째에 0.2 ㎖의 유화액을 각 마우스의 꼬리 끝에 피내 주사하고, 두 번째 추가면역 피내 주사(CFA 0.1 ㎖ 염수 중의 2 ㎎/㎖의 CII 용액)를 9일째에 수행하였다. 상기 면역화 방법을 공개된 방법(Jou et al. 2005; Sims et al. 2004)으로부터 변형하였다.
5.1.4. 연구 설계
화합물의 치료학적 효과를 마우스 CIA 모델에서 시험하였다. 마우스를 균등한 그룹으로 무작위 분할하고 각 그룹은 10마리의 마우스를 함유하였다. 모든 마우스를 1일째에 면역시키고 21일째에 추가면역시켰다. 음성 대조군은 비히클(MC 0.5%)로 처리하고 양성 대조군은 엔브렐(10 ㎎/㎏, 3x 주, s.c.)로 처리하였다. 관심 화합물을 전형적으로는 3개의 용량으로 경구(p.o.)로 시험하였다. 32일째에, 그룹간 무작위화를 임상 점수에 대해 수행하였으며 동물을 47일까지 그의 그룹에 관하여 치료학적으로 처리하였다. 체중 및 임상 점수를 1주일에 2회 기록하였다.
5.1.5. 관절염의 임상 평가
관절염을 문헌[Khachigian 2006]; [Lin et al 2007]; [Nishida et al. 2004]의 방법에 따라 채점한다. 4개의 각 발의 팽창을 하기와 같은 관절염 점수로 평가한다: 0 - 증상 없음; 1 - 발목이나 손목과 같은 한 가지 관절 유형의 순하지만 뚜렷한 발적 및 팽창, 또는 병든 손가락 수와 상관없이, 개별 손가락으로 한정된 분명한 발적 및 팽창; 2 - 2가지 이상의 관절 유형의 보통의 발적 및 팽창; 3 - 손가락을 포함한 전체 발의 심한 발적 및 팽창; 4 - 다수의 관절이 관련된 최대로 염증이 발생한 사지(동물당 최대 누적 임상 관절염 점수 16)(Nishida et al. 2004).
5.1.5.1. 관절염 발병후 체중의 변화(%)
임상적으로, 체중 손실이 관절염과 관련된다(Argil
Figure pct00170
s & L
Figure pct00171
pez-Soriano 1998; Rall & Roubenoff 2004; Shelton et al. 2005; Walsmith et al. 2004). 따라서, 관절염 발병후 체중의 변화를 마우스 모델에서 치료제의 효과를 평가하기 위한 비-특이적인 종점으로서 사용할 수 있다. 관절염 발병후 체중의 변화(%)를 하기와 같이 계산하였다:
마우스: (체중(6주) - 체중(5주))/체중(5주) x 100%
5.1.5.2. 방사선학
X-선 사진을 각각의 개별적인 동물의 뒷다리로부터 촬영하였다. 무작위 맹검 인식 번호를 각각의 사진에 할당하고, 골 미란의 중증도를 하기와 같은 방사선학적 라르센 채점 시스템으로 2명의 독립적인 채점자에 의해 평가하였다: 0 - 온전한 골 윤곽 및 정상적인 관절 공간을 갖는 정상; 1 - 가벼운 골 미란을 보이는 외부 전이골 중 임의의 하나 또는 2개를 갖는 가벼운 이상; 2 - 골 미란을 보이는 외부 전이골 중 임의의 3 내지 5개를 갖는 뚜렷한 초기 이상; 3 - 뚜렷한 골 미란을 보이는 내부 전이골 중 임의의 하나 또는 2개뿐만 아니라 외부 전이골을 모두 갖는 중간 파괴성 이상; 4 - 뚜렷한 골 미란을 보이는 모든 전이골 및 완전하게 미란되어 부분적으로 보존된 일부 골 관절 윤곽을 남기는 내부 전이성 관절 중 적어도 하나를 갖는 심한 파괴성 이상; 5 - 골 윤곽 없는 절단성 이상. 이러한 채점 시스템은 하기 문헌으로부터의 변형이다: Bush et al. 2002; Jou et al. 2005; Salvemini et al. 2001; Sims et al. 2004.
5.1.5.3. 결과
각각의 판독결과로부터, 평균 및 sem을 계산한다. 온전한 또는 처리된 그룹 및 질병 비히클 그룹간의 통계학적 유의수준 차이를 일원 ANOVA(처리 그룹에 대해서)에 이어서 듄네트의 다중 비교 사후 검정을 사용하여 프리즘 소프트웨어로 평가한다: *: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.001 대 질병 비히클 그룹.
상기 프로토콜에 따라 3, 10 및 30 ㎎/㎏ b.i.d.에서 시험시, 화합물 1은 임상 점수 및 골 미란 라르센 점수 모두에 대해 통계학적 유의수준의 효과를 나타내었다.
5.1.5.4. 정상 상태 PK
7일째에, 혈액 샘플을 하기의 시점에서 항-응고제로서 리튬 헤파린으로 후-안와 공동에서 채혈하였다: 투여전, 1, 3 및 6시간. 전혈 샘플을 원심분리하고 생성된 혈장 샘플을 분석시까지 -20℃에서 보관하였다. 각 시험 화합물의 혈장 농도를 LC-MS/MS 방법에 의해 측정하였으며, 여기에서 질량 분광계는 양의 전기분무 방식으로 작동하였다.
5.2. 이미퀴모드, TLR7/8 작용물질의 국소 적용에 의해 유발된 건선-형 표피 과형성의 쥐 모델
5.2.1. 물질
알다라(Aldara)® 5% 이미퀴모드 크림을 MEDA로부터 수득한다.
항-마우스 IL-12/IL-23 p40 FG 정제된 항체(C17.8)를 Affymetrix eBioscience(cat no. 16-7123-85)로부터 수득한다.
5.2.2. 동물
Balb/cJ 마우스(암컷, 18-20 g 체중)를 Janvier Labs(France)로부터 수득한다. 마우스를 12h 명/암 주기(07:00 - 19:00)로 유지시킨다. 온도를 22±2℃에서 유지시키고, 음식물 및 물을 자유롭게 제공한다.
5.2.3. 연구 설계
본 연구의 설계는 반 더 피츠 엘(Van der Fits L.) 등(van der Fits et al. 2009)으로부터 개정된 것이다.
첫 째날, 마우스를 이소플루란으로 가볍게 마취하에 2개의 귀 주변을 면도한다.
30 ㎎의 상업적으로 입수할 수 있는 이미퀴모드 크림(알다라 5% 크림)을 4일 연속해서(이는 1.5 ㎎의 활성 화합물 1일 용량으로 번역된다) 각 귀의 내부 및 외부 표면 모두에 적용한다. 대조용 동물은 동일한 양의 바셀린을 수용하였다.
1일부터 5일까지, 마우스에게, 이미퀴모드 적용(5일째에, 상기 마우스에게 안락사 2h 전에 오직 1회 투여한다) 전에, 메틸 셀룰로스 0.5% 중의 시험 화합물 10 또는 30 ㎎/㎏을 p.o., b.i.d. 투여한다.
양성 참조 그룹에서, 상기 동물은 1일로부터 1일 및 3일 전에 항-마우스 IL-12/IL-23 p40 항체 10 ㎎/㎏을 2회 복강내 주사로 수용한다.
5.2.4. 질병의 평가
양쪽 귀의 두께를 두께 게이지(미투토요(Mitutoyo), Absolute Digimatic, 547 321)로 매일 측정한다. 체중을 실험의 초기 및 희생시 평가한다. 5일째에, 최종 투여 2h 후, 마우스를 희생시킨다. 귓바퀴를 절단하여, 연골을 제외한다. 귓바퀴를 칭량하고 이어서 이를 유전자 발현을 평가하기 위해 1 ㎖의 RNAlater® 용액을 함유하는 바이알에, 또는 조직학의 경우 포르말린에 담근다.
그룹당 14마리의 동물이 존재한다. 결과를 평균±SEM으로서 나타내고 통계학적 분석을 이미퀴모드-비히클 그룹에 대해 일원 ANOVA에 이어서 듄네트의 사후 검정을 사용하여 수행한다.
5.2.5. 조직학
희생 후에, 귀를 수집하고 3.7% 포름알데히드에서 고정시킨 후에 파라핀에 포매시킨다. 2 ㎛ 두께의 절편을 절단하고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한다. 귀 표피 두께를, 20x 배율로 캡쳐된 귀당 6개의 상으로 상 분석(SisNcom 소프트웨어)에 의해 측정한다. 데이터를 평균±SEM으로서 나타내고 통계학적 분석을 이미퀴모드-비히클 그룹에 대해 일원 ANOVA에 이어서 듄네트의 사후 검정을 사용하여 수행한다.
5.2.6. 유전자 발현 분석
귀를 RNAlater® 용액으로부터 제거하고 프레셀리스(Precellys) 장치에서 1.4 ㎜ 세라믹 비드로 파괴후 트리졸(Trizol)®에 넣는다. 이어서 전체 RNA를 뉴클레오스핀(NucleoSpin)® RNA 키트를 사용하여 정제시킨다. cDNA를 제조하고 정량적인 PCR을 ViiA7 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)에서 SYBR 그린 기술을 사용하여 Qiagen으로부터의 유전자-특이적인 프라이머로 수행한다. 각 유전자(IL17A, IL1Β, IL22, LCN2, S100A8 및 S100A9)의 발현 수준을 사이클로필린 A 하우스키핑 유전자 발현 수준에 비교하여 계산한다. 데이터를 상대적인 양의 평균±SEM으로서 나타낸다(RQ= 2-ΔC T, 이때 ΔCT= CT 샘플 - CT 사이클로필린 A). 사용된 통계학적 검정은 이미퀴모드-비히클 그룹에 대한, 듄네트의 사후 검정과 함께 ANOVA 분산 분석이다.
5.3. IL-23의 피내 주사에 의해 유발된 건선-형 표피 과형성의 쥐 모델
5.3.1. 물질
마우스 재조합 IL-13, 무담체(cat no. 14-8231)가 e-Bioscience로부터 제공된다.
5.3.2. 동물
Balb/c 마우스(암컷, 18-20 g 체중)를 CERJ(France)로부터 수득한다. 마우스를 12h 명/암 주기(07:00 - 19:00)로 유지시킨다. 온도를 22℃에서 유지시키고, 음식물 및 물을 자유롭게 제공한다.
5.3.3. 연구 설계
본 연구의 설계는 Rizzo HL 등(Rizzo et al., 2011)으로부터 개정된 것이다.
첫 째날(D1), 마우스를 2개의 귀 주변에서 면도한다.
4 연속일(D1 내지 D4) 동안, 마우스는 이소플루란 흡입에 의해 유도된 마취하에 우측 귓바퀴에 마우스 재조합 IL-23(PBS/0.1% BSA 중의 1 ㎍/20 ㎕) 및 좌측 귓바퀴에 20 ㎕의 PBS/0.1% BSA의 1일 피내 용량을 수용한다.
D1부터 D5까지, 마우스에게, IL-23 주사 1h 전에, 시험 화합물(0.5% 메틸셀룰로스 중의 10, 30, 또는 100 ㎎/㎏, p.o. q.d.) 또는 비히클을 투여한다.
5.3.4. 질병의 평가
양쪽 귀의 두께를 자동 캘리퍼스로 매일 측정한다. 체중을 초기 및 희생시 평가한다. 5일째에, 최종 투여 2h 후, 마우스를 희생시킨다. 귓바퀴를 절단하여, 연골을 제외한다. 귓바퀴를 칭량하고 이어서 1 ㎖의 RNAlater® 용액을 함유하는 바이알에 또는 포름알데히드에 넣는다.
D4에서, 혈액 샘플을 또한 투여 직전(T0) 및 투여-후 1h, 3h, 6h째에 PK 프로파일링을 위해 후안와 공동으로부터 채혈한다.
그룹당 8마리의 마우스가 존재한다. 결과를 평균±SEM으로서 나타내고 통계학적 분석을 IL-23 비히클 그룹에 대해 일원 ANOVA에 이어서 듄네트의 사후 검정을 사용하여 수행한다.
5.3.5. 조직학
희생 후에, 귀를 수집하고 3.7% 포름알데히드에서 고정시킨 후에 파라핀에 포매시킨다. 2 ㎛ 두께의 절편을 절단하고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한다. 귀 표피 두께를, 20x 배율로 캡쳐된 귀당 6개의 상으로 상 분석(Sis'Ncom 소프트웨어)에 의해 측정한다. 데이터를 평균±SEM으로서 나타내고 통계학적 분석을 IL-23 비히클 그룹에 대해 일원 ANOVA에 이어서 듄네트의 사후 검정을 사용하여 수행한다.
5.3.6. 유전자 발현 분석
절반의 귀를 RNAlater® 용액으로부터 제거하고 프레셀리스 장치에서 1.4 ㎜ 세라믹 비드로 파괴후 트리졸®에 넣는다. 이어서 전체 RNA를 뉴클레오스핀® RNA 키트를 사용하여 정제시킨다. cDNA를 제조하고 정량적인 PCR을 ViiA7 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)에서 SYBR 그린 기술을 사용하여 Qiagen으로부터의 유전자-특이적인 프라이머로 수행한다. 각 유전자(IL17A, IL1Β, IL22, LCN2, S100A8 및 S100A9)의 발현 수준을 사이클로필린 A 하우스키핑 유전자 발현 수준에 비교하여 계산한다. 데이터를 상대적인 양의 평균±SEM으로서 나타낸다(RQ= 2-ΔC T, 이때 ΔCT= CT 샘플 - CT 사이클로필린 A). 사용된 통계학적 검정은 IL-23 비히클 그룹에 대한, 듄네트의 사후 검정과 함께 ANOVA 분산 분석이다.
5.4. PK/PD 모델: 특정한 TLR7/8 작용물질, CL097에 의해 유도된 TNFα 방출
본 분석의 목적은 본 발명의 화합물 투여시 생체내 IRAK-4 의존적인 사건의 억제와 상기 화합물의 순환 농도 수준간의 관계를 측정하는 것이다.
5.4.1. 물질
CL097(cat no. tlrl-c97) 및 폴리(dT)(cat no. tlrl-pt17)를 InvivoGen으로부터 수득한다.
AlphaLISA® 마우스 TNFα 키트를 Perkin-Elmer(cat no. AL505C)로부터 수득한다.
5.4.2. 동물
DBA/1J 마우스(수컷, 18-20 g 체중)를 Janvier Labs(France)로부터 수득한다. 마우스를 12h 명/암 주기(07:00 - 19:00)로 유지시킨다. 온도를 22±2℃에서 유지시키고, 음식물 및 물을 자유롭게 제공한다.
5.4.3. 연구 설계
마우스에게 경구 용량의 시험 화합물을 제공한다. 어떠한 투여도 받지 않은 온전한 동물 그룹을 t = 0 시점으로서 사용한다.
심장-내 샘플링(이소플루란 마취하에서)에 의해 수득된 2개의 혈액 샘플을 투여-후 30분, 1h, 3h, 8h 또는 24h째에 리튬 헤파리네이트 튜브에 수집한다. 하나는 약동학적(PK) 분석에 사용하고 두 번째는 약역학적(PD) 마커 정량분석에 사용한다.
5.4.4. 혈장 중 화합물 수준의 정량분석
전혈 샘플을 5000 rpm에서 10분간 원심분리하고 생성된 혈장 샘플을 분석시까지 -20℃에서 보관한다. 각 시험 화합물의 혈장 농도를 LC-MS/MS 방법에 의해 측정한다.
5.4.5. 약동학적 매개변수의 측정
약동학적 매개변수를 윈놀린(WinNonlin)®(파사이트(Pharsight)®, United States)을 사용하여 계산한다.
5.4.6. PD 마커의 정량분석
각각의 혈액 샘플을 37℃에서 2h 동안 CL097 및 폴리(dT)로 자극한다. 이어서 혈장을 수집하고 제조사의 설명에 따라 AlphaLISA에 의해 TNFα에 대해 분석한다.
그룹당 6마리의 마우스가 존재한다. 결과를 TNFα 농도(pg/㎖)로서 또는 t = 0 시점에 대한 억제 백분율(PIN)로서 나타낸다. 데이터를 평균±SEM으로서 나타내며 통계학적 분석을 상응하는 시점의 비히클 그룹에 대해 일원 ANOVA에 이어서 듄네트의 사후 검정을 사용하여 수행한다.
5.5. MC903의 국소 적용에 의해 유발된 아토피성 피부염의 쥐 예방학적 모델
5.5.1. 물질
메틸셀룰로스 0.5%(cat no. AX021233)를 VWR로부터 수득하였다. MC903(칼시포트리올, cat no. 2700/50)을 Tocris Bioscience로부터 수득하였다. 프로센스® 680(cat no. NEV10003)을 PerkinElmer로부터 수득하였다. RNAlater ®(cat no. AM7021)를 Ambion으로부터 수득하였다. 이말진(Imalgene)® 1000(Merial) 및 롬펀(Rompun)® 2%(Bayer)를 Centravet(cat no. IMA004-6827812 및 ROM001-6835444)로부터 수득하였다.
5.5.2. 동물
BALB/cN 마우스(암컷, 18-20 g 체중) 또는 CD1/Swiss 마우스(암컷, 24-26 g 체중)를 Janvier Labs(France)로부터 수득하였다. 마우스를 12h 명/암 주기(07:00 - 19:00)로 유지시켰다. 온도를 22±2℃에서 유지시키고, 음식물 및 물을 자유롭게 제공하였다.
5.5.3. 연구 설계
본 연구의 설계는 리 엠(Li M. 등)(Li et al. 2006)으로부터 개정되었다.
첫 째날(D1), 마우스를 이말진 및 롬펀(7.5%/2.5%; 0.1 ㎖/10 g)의 복강내 주사로 마취시키고 2개의 귀 주변을 면도하였다.
D1 현재, 20 ㎕ EtOH 또는 2 nmol의 MC903(20 ㎕ EtOH 중)을 5 연속일 동안 마우스의 양쪽의 귀에 국소 적용하였다.
D1부터 D8까지, 마우스에게 시험 화합물(0.5% 메틸셀룰로스 중 15 또는 30 ㎎/㎏ p.o., b.i.d.) 또는 덱사메타손(0.5% 메틸셀룰로스 중 5 ㎎/㎏ p.o., q.d.), 또는 비히클을 투여하였다.
5.5.4. 혈장 중 화합물 수준의 정량분석
각각의 시험 화합물의 혈장 농도를 LC-MS/MS 방법에 의해 측정하였으며, 여기에서 질량 분광계는 양 또는 음의 전기분무 모드로 작동하였다.
5.5.5. 약동학적 매개변수의 측정
약동학적 매개변수를 피닉스(Phoenix)® 윈놀린®(파사이트®, United States)을 사용하여 계산하였다.
5.5.6. 질병의 평가
양쪽 귀의 두께를, 연구의 개시시, 격일 및 희생시, 두께 게이지(미투토요, Absolute Digimatic, 547-321)를 사용하여 측정하였다(이소플루란 흡입에 의해 유도된 마취 후에).
체중을 연구의 개시시, 격일 및 희생시에 평가하였다.
D4에, 모든 그룹의 마우스는 프로센스® 680 탐침(0.8 nmol/10 g, IP)을 수용하였다. D5에, 마우스를 이말진 및 롬펀(7.5%/2.5%; 0.1 ㎖/10 g)의 복강내 주사로 마취시켰다. 과립구 침윤을 생체내 분자 영상화(브룩커 인-비보 엑스트림(Bruker In-Vivo Xtreme) 영상화 시스템, 여기 파장: 630 ㎚, 방출 파장: 700 ㎚, 획득 시간: 5초)를 사용하여 측정하였다.
D8에서, 최종 투여후 2h째에, 마우스를 희생시키고, 전혈을 EDTA-코팅된 튜브에 수집하고 혈장을 추가의 측정(순환 화합물 포함)을 위해 동결시켰다. 혈액 샘플을 또한 헤파린-코팅된 튜브에 수집하였다.
귓바퀴를 수집하고 칭량하였다. 한 쪽 귀를 종방향으로 양분하였다. 한 쪽 절반을 조직학을 위해서 4% 포름알데히드 완충제에 고정시키고; 다른 쪽 절반은 유전자 발현 평가를 위해 RNAlater®에 담궜다.
그룹당 8마리의 마우스가 존재하였다. 결과를 평균±SEM으로서 나타내고 통계학적 분석을, 귀 두께 및 중량의 경우 MC903 비히클 그룹에 대해, 체중의 경우 EtOH 비히클 그룹에 대해, 일원 ANOVA에 이어서 듄네트의 사후 검정을 사용하여 수행하였다.
5.5.6.1. 결과
각각의 판독결과로부터, 평균 및 sem을 계산하였다. 온전한 또는 처리된 그룹 및 질병 비히클 그룹간의 통계학적 유의수준 차이를 일원 ANOVA(처리 그룹에 대해서)에 이어서 듄네트의 다중 비교 사후 검정을 사용하여 프리즘 소프트웨어로 평가하였다: *: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.001 대 질병 비히클 그룹.
상기 프로토콜에 따라 10 ㎎/㎏ b.i.d.에서 시험시, 화합물 1은 D8에서의 귀 두께, 과립구 및 헬퍼 T 세포 침윤물에 대해 통계학적 유의수준의 효과를 나타내었다.
5.5.7. 조직학
희생시, 절반의 귀를 수집하고 파라핀 포매에 앞서 3.7% 포름알데히드 중에 고정시킨다. 4 ㎛ 두께 절편을 특이적인 세포 마커 항체: T 세포의 경우 CD3 및 호산구의 경우 EPX로 면역조직화학에 의해 면역염색한다. 마우스당 전체 절편으로부터 면역염색된 세포 면적을 상 분석(CaloPix 소프트웨어, TRIBVN Healthcare)에 의해 측정한다. 데이터를 평균±SEM으로 나타내고 통계학적 분석을 MC903 비히클 그룹에 대해, 일원 ANOVA에 이어서 듄네트의 사후 검정을 사용하여 수행한다.
5.5.8. 유전자 발현 분석
귀를 RNAlater® 용액으로부터 제거하고 베르틴 인스트루먼츠 프레셀리스® 균질화기에서 1.4 ㎜ 세라믹 비드로 파괴후 트리졸®에 넣는다. 이어서 전체 RNA를 페놀/클로로포름 프로토콜을 사용하여 추출하고 RNeasy® 96 QIAcube® HT 키트(Qiagen, Cat# 74171)를 사용하여 QIAcube로 정제한다. cDNA를 제조하고 정량적인 PCR을 ViiA7 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)에서 SYBR 그린 기술을 사용하여 Qiagen으로부터의 유전자-특이적인 프라이머로 수행한다. 각 유전자(IL4, IL5, IL13, TSLP, IL33, ST2, IL25, IL31, IFNγ, IL6, IL10, LCN2, S100A8, 및 S100A9)의 발현 수준을 HPRT, GAPDH 및 β-액틴 하우스키핑 유전자 발현 수준에 비교하여 계산한다. 데이터를 상대적인 양의 평균±SEM으로서 나타낸다(RQ= 2-ΔC T, 이때 ΔCT= CT 샘플 - 평균(CT HPRT, CT GAPDH 및 CT β-액틴)). 사용된 통계학적 검정은 EtOH/MC903 비히클 그룹에 대한, 듄네트의 사후 검정과 함께 ANOVA 분산 분석이다.
5.6. MC903의 국소 적용에 의해 유발된 아토피성 피부염의 쥐 치료학적 모델
5.6.1. 물질
메틸셀룰로스 0.5%(cat no. AX021233)를 VWR로부터 수득한다. MC903(칼시포트리올, cat no. 2700/50)을 Tocris Bioscience로부터 수득한다. 프로센스® 680(cat no. NEV10003)을 PerkinElmer로부터 수득한다. RNAlater ® (cat no. AM7021)를 Ambion으로부터 수득한다. 이말진® 1000(Merial) 및 롬펀® 2%(Bayer)를 Centravet(cat no. IMA004-6827812 및 ROM001-6835444)로부터 수득한다.
5.6.2 동물
BALB/cN 마우스(암컷, 18-20 g 체중) 또는 CD1/Swiss 마우스(암컷, 24-26 g 체중)를 Janvier Labs(France)로부터 수득한다. 마우스를 12h 명/암 주기(07:00 - 19:00)로 유지시킨다. 온도를 22±2℃에서 유지시키고, 음식물 및 물을 자유롭게 제공한다.
5.6.3. 연구 설계
본 연구의 설계는 리 엠(Li M. 등)(Li et al. 2006)으로부터 개정된 것이다.
첫 째날(D1), 마우스를 이말진 및 롬펀(7.5%/2.5%; 0.1 ㎖/10 g)의 복강내 주사로 마취시키고 2개의 귀 주변을 면도한다.
D1 현재, 20 ㎕ EtOH 또는 2 nmol의 MC903(20 ㎕ EtOH 중)을 D9, D11 또는 D15(주말 동안은 제외)까지 마우스의 양쪽의 귀에 국소 적용한다.
D5부터 D10, D12 또는 D16까지, 마우스에게 시험 화합물(0.5% 메틸셀룰로스 중 15 또는 30 ㎎/㎏ p.o., b.i.d.) 또는 덱사메타손(0.5% 메틸셀룰로스 중 5 ㎎/㎏ p.o., q.d.), 또는 비히클을 투여한다.
5.6.4. 혈장 중 화합물 수준의 정량분석
각각의 시험 화합물의 혈장 농도를 LC-MS/MS 방법에 의해 측정하며, 여기에서 질량 분광계는 양 또는 음의 전기분무 모드로 작동한다.
5.6.5. 약동학적 매개변수의 측정
약동학적 매개변수를 피닉스® 윈놀린®(파사이트®, United States)을 사용하여 계산한다.
5.6.6. 질병의 평가
양쪽 귀의 두께를, MC903의 첫 번째 적용 전, 연구의 개시시, 1주일에 3회, 및 희생시, 두께 게이지(미투토요, Absolute Digimatic, 547-321)를 사용하여 측정한다(이소플루란 흡입에 의해 유도된 마취 후에).
체중을 연구의 개시시, 1주일에 3회, 및 희생시 평가한다.
D8, D10 또는 D11에, 모든 그룹의 마우스는 프로센스® 680 탐침(0.8 nmol/10 g, IP)을 수용한다. 다음날(D9, D11 또는 D12), 마우스를 이말진 및 롬펀(7.5%/2.5%; 0.1 ㎖/10 g)의 복강내 주사로 마취한다. 이어서 과립구 침윤을 생체내 분자 영상화(브룩커 인-비보 엑스트림 영상화 시스템, 여기 파장: 630 ㎚, 방출 파장: 700 ㎚, 획득 시간: 5초)를 사용하여 측정한다.
D10, D12 또는 D16에서, 최종 투여후 2h째에, 마우스를 희생시키고, 전혈을 EDTA-코팅된 튜브에 수집하고 혈장을 추가의 측정(순환 화합물 포함)을 위해 동결시킨다.
귓바퀴를 수집한다. 한 쪽 귀를 종방향으로 양분한다. 한 쪽 절반을 조직학을 위해서 4% 포름알데히드 완충제에 고정시키고; 다른 쪽 절반은 유전자 발현 평가를 위해 RNAlater®에 담근다.
그룹당 8마리의 마우스가 존재한다. 결과를 평균±SEM으로서 나타내고 통계학적 분석을, 귀 두께 및 중량의 경우 MC903 비히클 그룹에 대해, 체중의 경우 EtOH 비히클 그룹에 대해, 일원 ANOVA에 이어서 듄네트의 사후 검정을 사용하여 수행한다.
5.6.7. 조직학
희생시, 절반의 귀를 수집하고 파라핀 포매에 앞서 3.7% 포름알데히드 중에 고정시킨다. 4 ㎛ 두께 절편을 항-CD3 항체로 면역조직화학에 의해 면역염색한다. 마우스당 전체 절편으로부터 면역염색된 세포 면적을 상 분석(CaloPix 소프트웨어, TRIBVN Healthcare)에 의해 측정한다. 데이터를 평균±SEM으로 나타내고 통계학적 분석을 MC903 비히클 그룹에 대해, 일원 ANOVA에 이어서 듄네트의 사후 검정을 사용하여 수행한다.
5.6.8. 유전자 발현 분석
귀를 RNAlater® 용액으로부터 제거하고 베르틴 인스트루먼츠 프레셀리스® 균질화기에서 1.4 ㎜ 세라믹 비드로 파괴후 트리졸®에 넣는다. 이어서 전체 RNA를 페놀/클로로포름 프로토콜을 사용하여 추출하고 RNeasy® 96 QIAcube® HT 키트(Qiagen, Cat# 74171)를 사용하여 QIAcube로 정제한다. cDNA를 제조하고 정량적인 PCR을 ViiA7 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)에서 SYBR 그린 기술을 사용하여 Qiagen으로부터의 유전자-특이적인 프라이머로 수행한다. 각 관심 유전자(GOI = IL4, IL5, IL13, TSLP, IL33, ST2, IL25, IL31, IFNγ, IL6, IL10, LCN2, S100A8, 및 S100A9)의 발현 수준을 HPRT, GAPDH 및 β-액틴 하우스키핑 유전자 발현 수준에 비교하여 계산한다.
모든 qPCR 데이터를 정규화된 상대적인 양(NRQ = 2^(ΔCq GOI)/기하평균(2^(ΔCq HPRT), 2^(ΔCq GAPDH), 2^(ΔCq β-액틴))(이때 ΔCq = Cq　평균 - Cq 샘플)의 평균 ± SEM으로서 나타낸다. 사용된 통계 검정은 EtOH/MC903 비히클 그룹에 대한 듄네트의 사후 검정과 ANOVA 분산 분석이다.
5.7. 이미퀴모드의 표피 적용에 의해 유발된 전신 홍반성 루푸스의 쥐 모델
5.7.1. 물질
알다라® 5% 이미퀴모드 크림을 MEDA로부터 수득한다.
마우스 항-이중가닥 DNA 항체 ELISA 키트를 Alpha Diagnostic International(cat no. 5120)로부터 수득한다. 마우스 뇨 알부민 ELISA 키트를 Abcam(cat no. ab108792)으로부터 수득한다. 뇨 크레아티닌 분석 키트를 Abnova(cat no. KA4344)로부터 수득한다.
5.7.2. 동물
BALB/cJ 마우스(암컷, 18-20 g 체중)를 Janvier Labs(Frace)로부터 수득한다. 마우스를 12h 명/암 주기(07:00 - 19:00)로 유지시킨다. 온도를 22±2℃에서 유지시키고, 음식물 및 물을 자유롭게 제공한다.
5.7.3. 연구 설계
본 연구의 설계는 Yokogawa M. 등(Yokogawa et al. 2014)으로부터 개정된 것이다.
첫 째날(D1)에, 마우스의 오른쪽 귀 주변을 면도한다.
마우스는 12주 연속해서(D1 내지 D86) 우측 귓바퀴에 주당 3회 1.25 ㎎의 이미퀴모드의 표피 적용을 수용한다. 대조용 그룹은 동일한 양의 바셀린을 수용한다.
D1에서부터 D86까지, 마우스에게 시험 화합물(메틸셀룰로스 0.5% 중의 30 ㎎/㎏, p.o., q.d.) 또는 비히클(10 ㎖/㎏)을 투여한다.
5.7.4. 질병의 평가
귀의 두께를 자동 게이지(미투토요, Absolute Digimatic, 547-321)로 1주일에 1회 측정한다.
체중을 실험의 개시시 및 희생시까지 1주일에 1회 평가한다. 부검시, 비장 중량을 또한 측정한다. 마우스를 최종 투여 2h 후에 희생시킨다.
상이한 시점(예를 들어 D28, D56 및 D84)에서, 마우스를 개별적으로 대사 우리에 넣어 소변 분석을 수행하고 단백뇨(알부민 대 크레아티닌 비)를 평가한다.
상이한 시점(예를 들어 D28, D56 및 D86)에서, 혈청을 수집하여 항-이중 가닥-DNA IgG 수준을 평가한다.
D13에서, 혈액 샘플을 또한 투여 직전(T0) 및 투여-후 1h, 3h, 및 6h째에 PK 프로파일링을 위해 후-안와 공동으로부터 수집한다.
그룹당 8 내지 19마리의 마우스가 존재한다. 결과를 평균±SEM으로서 나타내고 통계학적 분석을 이미퀴모드 비히클 그룹에 대한, 일원 ANOVA에 이은 듄네트의 사후 검정을 사용하여 수행한다.
5.7.5. 혈장 중 화합물 수준의 정량분석
각 시험 화합물의 혈장 농도를 LC-MS/MS 방법에 의해 측정하며, 여기에서 질량 분광계가 양 또는 음의 전기분무 모드로 작동된다.
5.7.6. 약동학적 매개변수의 측정
약동학적 매개변수를 피닉스® 윈놀린®(파사이트®, United States)을 사용하여 계산한다.
5.7.7. 조직학
희생시, 좌측 신장을 수집하고 종방향으로 2 부분으로 절단한다. 한 부분은 3.7% 포름알데히드에 고정시킨 후에 파라핀에 포매한다. 4 ㎛ 두께의 절편을 준비하고 퍼요오드산-쉬프(PAS)로 염색하거나 CD3(T 세포), CD20(B 세포) 및 F4/80(대식세포)으로 면역염색한다.
5.7.7.1. 조직병리학
각 사구체에서, 메산지움증식, 모세관내 증식, 메산지움 기질 팽창 및 부분 경화증을 포함하는 4개의 상이한 판독결과를 0 내지 2의 규모로 등급화하고 이어서 평가한다. 각각의 신장에 대해서, 약 50개의 사구체를 채점하고 이어서 평균하여 하나의 사구체 병변 점수를 제공한다(Yokogawa et al. 2014). 데이터를 평균±SEM으로서 나타내고 통계학적 분석을 이미퀴모드 비히클 그룹에 대한, 크루스칼 왈리스 검정에 이은 듄스 사후 검정을 사용하여 수행한다.
5.7.7.2. 세포 정량분석
각각의 세포 유형에 대해서, 면역조직화학 분석을 전체 조직 절편상에서 x20의 배율로 상 분석(CaloPix 소프트웨어, TRIBVN Healthcare)을 사용하여 수행한다. 데이터를 평균±SEM으로서 나타내고 통계학적 분석을 이미퀴모드 비히클 그룹에 대한, 일원 ANOVA에 이은 듄네트 사후 검정을 사용하여 수행한다.
5.7.7.3. 유전자 발현 분석
희생시, 좌측 신장의 두 번째 부분을 1.4 ㎜ 세라믹 비드를 함유하는 튜브에 넣고 베르틴 장비 프레셀리스® 균질화기로 1% DTT RLT 용해 완충제(Qiagen, cat no. 79216)에서 파괴시킨다. 이어서 전체 RNA를 RNeasy® 96 QIAcube® HT 키트(Qiagen, cat no. 74171)를 사용하여 QIAcube로 정제시킨다. cDNA를 제조하고 정량적인 PCR을 ViiA7 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)에서 SYBR 그린 기술을 사용하여 Qiagen으로부터의 유전자-특이적인 프라이머로 수행한다. 각 관심 유전자(GOI = CD3, CD68, CD20, OAS1, Mx1, IFIT1, CXCL11 및 Usp18)의 발현 수준을 사이클로필린, GAPDH 및 β-액틴 하우스키핑 유전자 발현 수준에 비교하여 계산한다.
희생시, 비장의 1/3을 1.4 ㎜ 세라믹 비드를 함유하는 튜브에 넣고 베르틴 장비 프레셀리스® 균질화기로 트리졸®에서 파괴시킨다. 전체 RNA를 페놀/클로로포름 과정을 사용하여 추출하고 이어서 RNeasy® 96 QIAcube® HT 키트(Qiagen, cat no. 74171)를 사용하여 QIAcube로 정제시킨다. cDNA를 제조하고 정량적인 PCR을 ViiA7 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)에서 SYBR 그린 기술을 사용하여 Qiagen으로부터의 유전자-특이적인 프라이머로 수행한다. 각 관심 유전자의 발현 수준(GOI = CD20, IRF7, OAS1, Mx1, IFIT1, CXCL11, Usp18, BCL6, CXCL13, CXCR5, MAF, ICOSL, PDCD1, SH2D1a)을 사이클로필린, GAPDH 및 β-액틴 하우스키핑 유전자 발현 수준에 비교하여 계산한다.
모든 qPCR 데이터를 정규화된 상대적인 양(NRQ = 2^(ΔCq GOI)/기하평균(2^(ΔCq HPRT), 2^(ΔCq GAPDH), 2^(ΔCq β-액틴))(이때 ΔCq = Cq　평균 - Cq 샘플)의 평균 ± SEM으로서 나타낸다. 사용된 통계학적 검정은 이미퀴모드 비히클 그룹에 대한, 듄네트의 사후 검정과 함께 ANOVA 분산 분석이다.
5.8. MRL/MpJ-Faslpr/J 마우스에서 전신 홍반성 루푸스(SLE) 모델
본 연구의 목적은 전신 홍반성 루푸스(SLE)의 치료에서 본 발명의 시험 화합물의 활성을 평가하는 것이다.
5.8.1. 물질
시험 화합물을 암실에서 건조 물질로서 보관하고 비히클 용액(수성 메틸 셀룰로스 5%) 중에서 자기 교반을 사용하여 현탁액으로서 매주 제형화한다. 생성 현탁액을 빛을 차단하여 자기 교반하에서 보관한다.
5.8.2. 동물
MRL/MpJ 마우스(암컷, 20-주 된 것) 및 MRL/MpJ-Faslpr/J 마우스(암컷, 8-주 된 것)를 Jackson laboratory(USA)로부터 수득한다. 마우스는 첫 번째 처리시에 28주이다.
5.8.3. 연구 설계
27주째(0 연구일)에 질병을 나타내는 마우스를 무작위 분류하고 각 그룹에 동물 체중을 칭량한다.
무작위 분류 후 동물이 28주 될 때 처리를 개시하고 동물을 39주째 희생시킬 때까지 계속한다.
동물을 매일 현저한 임상 징후, 이환율 및 사망률에 대해 관찰한다.
본 발명의 시험 화합물의 활성을 체중, 단백뇨 수준, 부검시 조직 중량(신장, 비장 및 림프절); 항-dsDNA Ab, Ig, 사이토카인/케모카인 및 유전자 발현 수준; 및 조직병리학 및 면역조직화학에 기반하여 평가한다.
연구를 하기의 그룹(15 마우스/그룹)상에서 수행한다:
Figure pct00172
*BID 투여는 대략 10-12h 간격으로 발생하고 - QD 투여는 대략 24h 간격으로 발생한다. 투여되는 시험 화합물 용량을 동물의 가장 최근 체중에 기반하여 ㎎/㎏으로 매일 계산한다.
5.8.4. 종점
단백뇨 점수를 비색측정 알부스틱스(Albustix) 시험 스트립(Siemens cat#　2872A)을 사용하여 신선한 뇨 샘플로부터, 28일째에 시작하여 39주까지 1주일에 1회 모든 동물에 대해 기록한다.
생성되는 점수를, 샘플링으로부터 1 내지 2분 이내에 색상을 코드 등급에 합치시켜 획득하여, 하기의 종점을 제공한다:
알부스틱스 시험 스트립상에 소변을 포획하고 1 내지 2분 후에 병의 색상 코드에 합치시킴으로써 점수를 측정한다.
0 = 없음
1 = 1 내지 30 ㎎/㎗
2 = 31 내지 99 ㎎/㎗
3 = 100 내지 299 ㎎/㎗
4 = 300 내지 1999 ㎎/㎗
5 = >2000 ㎎/㎗
체중을 28주 내지 39주간 모든 동물에 대해 1주일에 1회 기록한다.
모든 동물을 혈액 ds DNA Ab 및 Ig에 대해서 27, 33 및 38주째에 마취하에서 채혈한다.
29주째에 하기의 시점에서 시험 화합물 처리된 동물 그룹에서 PK 분석을 위해 채혈한다: 투여 전 0h, 0.25h, 1h 및 6h.
항-dsDNA, Ab, Ig, 사이토카인/케모카인 및 유전자 발현 수준; 및 조직병리학 및 면역조직화학 분석
부검시 조직 중량(신장, 비장 및 림프절); 항-dsDNA Ab(ELISA(Alpha Diagnostics Cat. # 5120), Ig(Luminex BBP, EMD Millipore Cat. # Mouse MGAMMAG-300K), 사이토카인/케모카인(ELISA) 및 유전자 발현; 및 조직병리학 및 면역조직화학.
5.8.5. 통계학적 분석
개별적인 동물 원 데이터에 기반하여, 각 그룹에 대한 평균을 측정하고 질병 대조군으로부터의 변화 퍼센트를 계산한다. 처리 그룹을 측정된(매개변수) 데이터의 경우 듄네트의 사후 검정 분석과 함께 일원 분산 분석(1-원 ANOVA) 또는 채점된(비-매개변수) 데이터의 경우 듄의 사후 검정 분석과 함께 크루스칼-왈리스 검정을 사용하여 질병 대조군에 비교한다.
데이터를 1) 중간에 죽은 동물을 포함한 모든 동물로서 및 2) 연구 종료시까지 생존한 동물만(생존 동물)으로서 기록한다. 통계학적 분석을 프리즘 6.0d 소프트웨어(GraphPad)를 사용하여 수행한다.
모든 시험에 대한 유의수준을 p<0.05로 설정하고, p 값을 소수점 셋째 자리로 반올림한다. 억제 퍼센트를 하기 식을 사용하여 계산한다:
변화 백분율 = (평균[처리된] - 평균[질병 대조군])/(0 - 평균[질병 대조군]) x 100
5.9. IL-23의 과발현에 의해 유발된 건선성 관절염의 쥐 모델
5.9.1. 물질
마우스 IL-23 증대된 에피솜 발현 벡터(EEV)를 System Biosciences(cat no. EEV651A-1)로부터 수득한다. 링거액 정제를 Sigma-Aldrich(cat no. 96724-100TAB)로부터 수득한다. 마우스 IL-23 콴티킨(Quantikine) ELISA 키트를 R&D Systems(cat no. M2300)로부터 수득한다. 프로센스(ProSense)® 680 및 오스테오센스(OsteoSense)® 750EX를 PerkinElmer(cat no. NEV10003 및 NEV10053EX)로부터 수득한다. RNAlater®를 Ambion(cat no. AM7021)으로부터 수득한다. 이말진® 1000(Merial) 및 롬펀® 2%(Bayer)를 Centravet(cat no. IMA004-6827812 및 ROM001-6835444)로부터 수득한다.
5.9.2. 동물
B10.RIII 마우스(수컷, 8주 된 것)를 Charles River(France)로부터 수득한다. 마우스를 12h 명/암 주기(07:00 - 19:00)로 유지시킨다. 온도를 22±2℃에서 유지시키고, 음식물 및 물을 자유롭게 제공한다.
5.9.3. 연구 설계
본 연구의 설계는 셜록(Sherlock) JP 등(Sherlock et al. 2012)으로부터 개정된 것이다.
첫째날(D1)에, 마우스는 링거 또는 링거 중의 IL-23 EEV의 꼬리 정맥내로의 유체역학적 주사를 겪는다(3 ㎍/2.1 ㎖, 4-6초의 기간에 걸쳐 IV 주입됨).
D5 현재, 1주일에 2회, 마우스를 실험의 종료시까지 임상 증상에 대해 채점한다.
D5에서, 하악하 정맥에서 천자에 의해 채혈하여 혈청 IL-23 농도를 평가한다.
D9에서, 모든 그룹으로부터의 마우스는 프로센스® 680 탐침(0.8 nmol/10 g,IP)을 수용한다. D10에서, 마우스를 이말진 및 롬펀(7.5%/2.5%; 0.1 ㎖/10 g)의 복강내 주사로 마취시킨다. 이어서 과립구 침윤을 생체내 분자 영상화(Bruker In-Vivo Xtreme imaging system, 여기 파장: 630 ㎚, 방출 파장: 700 ㎚, 획득 시간: 5초)를 사용하여 측정한다.
D11에서, 프로센스® 680 분자 영상화 및 채점에 따라 무작위화를 수행한다.
D12 현재, 마우스에게 시험 화합물(30 ㎎/㎏, p.o., b.i.d. 메틸셀룰로스 0.5% 중의) 또는 비히클을 투여한다.
D19에서, 혈액을 T0, 최종 투여후 T1h, T3h 및 T6h 시간에서 샘플링한다. 혈장을 분리시키고 생물분석시까지 20℃에서 유지시킨다.
D36에서, 모든 그룹으로부터의 마우스를 화합물의 최종 투여 2h 후에 희생시킨다. 하기를 수집한다:
좌측 뒷다리의 부착부(피부 없음) 주변의 발뒤꿈치를 프리셀리스 튜브에서 즉시 급속 동결시킨다. 손가락을 RNAlater®를 함유하는 튜브에 수집한다. 우측 뒷다리는 조직학 평가를 위해 4% 포름알데히드 완충제에 즉시 고정시킨다. X-선 측정을 고정 후 48h 째에 수행한다.
한 쪽 귀를 전사물 분석을 위해 RNAlater®를 함유하는 튜브에 수집한다.
전체 혈액을 혈청 혈액 튜브에 수집하고 8 내지 10회 서서히 뒤집어 혼합한다. 응고후, 혈액 샘플을 1800xg에서 10분 원심분리시킨다. 원심분리후, 혈청을 -80℃에서 보관한다.
결장의 일부(1 ㎝ 원위 결장)를 전사물 분석을 위해 프리셀리스 튜브에서 즉시 급속 동결시킨다. 또 다른 일부(1 ㎝ 원위 결장)를 추가의 조직학 분석을 위해 4% 포름알데히드 완충제에 즉시 고정시킨다.
5.9.4. 질병의 평가
체중을 상기 연구의 개시시, 이어서 1주일에 2회 및 희생시 평가한다.
매주 2회, 염증의 임상적 징후를 채점한다: 정상적인 발의 경우 0; 한 손가락이 부은 경우 1; 2개 이상의 손가락이 부은 경우 2; 전체 발이 부인 경우 3. 전체 사지의 점수를 합하여 총점을 생성시킨다.
D23에서, 모든 그룹으로부터의 마우스는 프로센스® 680 탐침(0.8 nmol/10 g, IP)을 수용한다. D24에서, 마우스를 이말진 및 롬펀(7.5%/2.5%; 0.1 ㎖/10 g)의 복강내 주사로 마취시킨다. 이어서 과립구 침윤을 생체내 분자 영상화(Bruker In-Vivo Xtreme imaging system, 여기 파장: 630 ㎚, 방출 파장: 700 ㎚, 획득 시간: 5초)를 사용하여 측정한다.
D32에서, 모든 그룹으로부터의 마우스는 프로센스® 680 탐침(0.8 nmol/10 g, IP) 및 오스테오센스® 750EX 탐침(0.8 nmol/10 g, IP)을 수용한다. D33에서, 마우스를 이말진 및 롬펀(7.5%/2.5%; 0.1 ㎖/10 g)의 복강내 주사로 마취시킨다. 과립구 침윤 및 골 리모델링을 생체내 분자 영상화(Bruker In-Vivo Xtreme imaging system; 프로센스® 680 탐침의 경우 여기 파장: 630 ㎚, 방출 파장: 700 ㎚, 획득 시간: 5초; 오스테오센스® 750EX 탐침의 경우 여기 파장: 720 ㎚, 방출 파장: 790 ㎚, 획득 시간: 5초)를 사용하여 측정한다.
그룹당 10마리의 마우스가 존재한다. 결과를 평균±SEM으로서 나타내고 통계학적 분석을, 채점 및 영상화 분석의 경우 병든 비히클 그룹에 대해, 체중의 경우 모의 비히클 그룹에 대해, 일원 ANOVA에 이어서 듄네트의 사후 검정을 사용하여 수행한다.
5.10. 쥐 경피성 만성 이식편 대 숙주병(cGvHD)
5.10.1. 일반적인 개요
이러한 cGvHD 모델에서, B10.D2(H-2d) 공여자 마우스(약간의 HLA 오합치)로부터의 골수세포 및 비장세포의 동종이계 이식에 의해 BALB/c(H-2d) 마우스에서 섬유증을 유도한다. 수용자 마우스는 빠르게 진행하는 미만성 피부 전신 경화증이 있는 환자를 닮은 염증-구동된 피부 및 폐 섬유증을 나타낸다(Zerr et al., 2012).
처리는 경피성 cGvHD의 첫 번째 임상 징후가 개시된 후에만 제공된다.
5.10.2. 연구 그룹
각각 8마리 마우스의 하기의 그룹이 본 연구에 사용되었다
- 동계 이식, 위약-처리 대조군:
동계 골수 및 비장세포 이식(BALB/c(H-2d) → BALB/c(H-2d)). 이식 후 21일에서부터 56일까지 0.5% 메틸 셀룰로스 용매의 적용.
- 비히클-처리된 섬유증 그룹:
동종이계 골수 및 비장세포 이식(B10.D2(H-2d) → BALB/c(H-2d)). 이식 후 21일에서부터 56일까지 0.5% 메틸 셀룰로스 용매의 적용.
- 동종이계 이식에 의해 유도된 섬유증의 치료전 수준을 평가하기 위한 대조군:
동종이계 골수 및 비장세포 이식(B10.D2(H-2d) → BALB/c(H-2d)). 다른 그룹에서 처리 개시 전, 21일째에 희생
- 처리 그룹:
동종이계 골수 및 비장세포 이식(B10.D2(H-2d) → BALB/c(H-2d)). 이식 후 21일에서부터 56일까지 0.5% 메틸셀룰로스 중의 본 발명의 시험 화합물 10 ㎎/㎏ po bid 적용.
- 양성 대조군:
동종이계 골수 및 비장세포 이식(B10.D2(H-2d) → BALB/c(H-2d)). 이식 후 21일에서부터 56일까지 닌테다닙 50 ㎎/㎏ qd 적용.
5.10.3. 정상 상태 PK:
D20에서, 시험 화합물 수용 그룹에 대해서, 혈액 샘플을 하기의 시점에서, 즉 항응고제 Li-헤파린 투여-전, 1, 3 및 6h째에, 시점당 2마리의 동물로부터 꼬리 정맥에서 채혈하였다.
혈액 샘플을 얼음상에서 보관하고 혈액 샘플링 후 1h 이내에 +4℃에서 10분간 대략 3500 x g에서 원심분리시키고; 혈장을 표지된 폴리프로필렌 튜브로 옮겨 -20℃에서 보관하였다.
5.10.4. 샘플링 및 분석
동물을 최종 용량-후 2h(Tmax + 1)째에 희생시키고, 피부(3 ㎜ 천공 생검), 폐, 비장 및 혈액에 대한 샘플을 조직학 및 유전자 발현 분석을 위해 수집하였다.
5.10.5. 주요 판독결과
피부에 대한 항-섬유증 효과를 피부 두께의 측정, 병변 콜라겐의 정량분석 및 근섬유아세포 염색에 의해 분석하였다.
피부 섬유증에 대해 양성 효과의 경우에, 폐 섬유증에 대한 효과를 애쉬크로프트(Ashcroft) 채점, 하이드록시프롤린 함량 및 SirCol 염색을 사용하는 콜라겐으로 덮인 면적의 정량분석에 의해 분석하였다.
5.10.5.1. 결과
개별적인 동물 원 데이터에 기반하여, 각 그룹에 대한 평균을 측정하고 질병 대조군으로부터의 변화 퍼센트를 계산하였다. 처리 그룹을 측정된(매개변수) 데이터의 경우 듄네트의 사후 검정 분석과 함께 일원 분산 분석(1-원 ANOVA) 또는 채점된(비-매개변수) 데이터의 경우 듄의 사후 검정 분석과 함께 크루스칼-왈리스 검정을 사용하여 질병 대조군에 비교하였다.
상기 프로토콜에 따라 10 ㎎/㎏ b.i.d.으로 시험시, 화합물 1은 피부(하이드록시프롤린) 및 폐 섬유증(애쉬크로프트, SirCol)에 대해 통계학적 유의수준의 효과를 나타내었다.
5.11. MIA 래트 통증 모델
5.11.1. 분석 원리
모노-요오도아세테이트(MIA) 모델은 래트의 OA에서 관절 파괴의 모델링에 대해서 반 데어 크란(van der Kraan et al., 1989)에 의해 확립된 표준 모델이 되었다.
설치류에서 MIA의 관절-내 주사는, 분석되고 정량화될 수 있는 OA-유사 병변 및 기능적 손상을 재현한다. MIA는 글리세르알데히드-3-포스파타제의 억제제로, 세포의 해당과정을 방해하여 결국 세포사를 초래한다(van der Kraan et al., 1989).
피쳐 등(Pitcher et al. 2016)에 의해 기재된 MIA 통증 마우스 모델을 사용하여 MIA의 관절내 주사에 의한 촉각 이질통에 대한 시험 화합물의 효과를 평가하여 연골 세포사를 유발하여 연골 변성 및 골 골극의 출현과 같은 후속적인 연골하 골 변형을 유도한다(Janusz et al., 2001).
MIA는, MIA 투여량을 변경시켜 등급화할 수 있는 재현가능하고 강력하며 신속한 통증 유사 표현형을 생성시키기 때문에 특히 통증을 치료하기 위한 약리학적 제제의 효능을 시험하는데 가장 자주 사용되는 것이다.
5.11.2. 동물
수컷 스프래그 다우리(250 - 300 g)를 22±1℃ 및 빛-조절되는 환경(7 am 내지 8 pm에 빛)에서 음식물과 물에 자유롭게 접근시키면서 수용하였다.
5.11.3. 프로토콜
일나트륨 요오도아세테이트(MIA) 25 ul 80 ㎎/㎖ 용액을 좌측 무릎 관절에 주사하여 통증에 대한 염증 과민성을 유도하였다. 동물은 MIA 후 3일 이내에 염증 반응을 나타내었다.
시험 화합물을 3일째(D3)에 출발하여 일 기준으로 처리 그룹에게 투여하고 D28의 종점일까지 계속하였다.
3일째에, 체중-부하 측정을 수행하고 동물의 순위를 매기고 처리 그룹으로 무작위 분류하였다.
시험일에, 투여전 이질통을 투여 전에 평가하고 투여된 화합물의 효과를 투여 후 2시간째에 평가하였다.
시험 화합물을 처리 그룹에 따라(일부는 MIA 후 3-7일째에 투여되었고, 일부는 MIA 후 24-28일째에 투여되었다) 일 기준으로 투여하고, 투여 후 2시간째에 체중-부하 측정을 수행하였다.
음성 대조군(n=6)에게는 비히클(메틸셀룰로스, MC 0.5%)을 매일 경구 투여하고, 양성 대조군(n=10)에게는 셀레콕시브(50 ㎎/㎏)를 매일 경구 투여하며, 시험 화합물 그룹(n=10)에게는 MIA 후 3-7일간(염증 단계) 0.5% MC/솔루톨을 매일 경구 투여하였다.
음성 대조군(n=6)에게는 비히클(메틸셀룰로스, MC 0.5%)을 매일 경구 투여하고, 양성 대조군(n=10)에게는 프레가발린(30 ㎎/㎏)를 매일 경구 투여하며, 시험 화합물 그룹(n=10)에게는 MIA 후 24-28일간(신경병 단계) 0.5% MC/솔루톨을 매일 경구 투여하였다.
5.11.4. 정상 상태 PPK
정상 상태 PK 혈액 샘플링을 모든 그룹에 대해서, 최종 처리후 희생시에, 하기의 시점: T0(투여 전, n=2), T0.25h(n=3), T2h(n=3) 및 T6h(n=2)에서 처리된 2개의 그룹상에서 수행하였다.
혈액을 얼음상에서 Li-헤파린 튜브에 샘플링하고 이어서 +4℃에서 원심분리하고 생성되는 혈장을 생물분석시까지 -20℃에서 동결시켰다.
5.11.5. 촉각 이질통 - 체중-부하 결핍 시험
동물의 선천적(기준선으로 지칭된다) 촉각 이질통 수준을 평가하기 위해 체중 부하 결핍 시험 시험 접근법이 사용되었다. 시험 결과에서 거짓 과민성을 피하기 위해 마우스는 모든 기준선 시험에 앞서 충분한 적응 기간과 2가지 처리 과정을 겪었다. 또한, 기준선 체중 부하 결핍은 수술 최대 2일 전에 발생하였다.
각각의 시험에서, 손상의 동측 뒷발(좌측)을 각각의 마우스에 대해서 시험하였다.
5.11.1. 데이터 분석
각각의 판독결과에 대해서, 평균 및 sem을 계산한다. 온전한 또는 처리된 그룹 및 MIA 비히클 그룹간의 통계학적 유의수준 차이를 이원 ANOVA(처리 그룹에 대해서)에 이어서 듄네트의 다중 비교 사후 검정을 사용하여 프리즘 소프트웨어로 평가한다: *: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.001 대 MIA 비히클 그룹.
5.11.2. 결과
매일 5 ㎎/㎏ 경구 화합물 1은 체중 부하시 투여 후 5-7일째에 염증 반응을 현저하게 역전시켰다.
매일 30 ㎎/㎏ 경구 화합물 1은 또한 체중 부하시 투여 후 3-7일째에 염증 반응을 현저하게 역전시켰다.
매일 5 ㎎/㎏ 및 30 ㎎/㎏ 경구 화합물 1은 체중 부하시 투여 후 26-28일째에 염증 반응을 현저하게 역전시켰다.
최종 소견
당해 분야의 숙련가는 상기 설명이 사실상 예시적이고 설명적이며, 본 발명과 그의 바람직한 구현예를 예시하고자 함을 알 것이다. 통상적인 실험을 통해서, 숙련가는 본 발명의 진의로부터 이탈됨 없이 수행될 수 있는 명백한 변형 및 변화를 인식할 것이다. 첨부된 청구의 범위 내에 있는 모든 상기와 같은 변형들을 포함시키고자 한다. 따라서, 본 발명을 상기 설명에 의해서가 아닌, 하기의 청구의 범위 및 그의 등가물들에 의해서 한정하고자 한다.
본 명세서에 인용된, 비제한적으로 특허 및 특허 출원을 포함한 모든 공보는, 각각의 개별적인 공보가 마치 완전히 개시된 것처럼 본 발명에 참고로 인용됨을 구체적이고 개별적으로 가리키는 바와 같이 본 발명에 참고로 인용된다.
다양한 화합물의 차별적인 세포 침투 능력과 같은 인자가 시험관 내 생화학에서 화합물의 활성과 세포 분석 간의 불일치에 기여할 수도 있음은 물론이다.
본 출원에 제공되고 나타낸 바와 같은 본 발명 화합물의 화학 명칭 중 적어도 일부는 상업적으로 입수할 수 있는 화학물질 명명 소프트웨어 프로그램의 사용에 의해 자동화된 토대로 발생될 수 있으며 독립적으로 입증되지는 않았다. 이러한 기능을 수행하는 전형적인 프로그램은 Open Eye Scientific Software, Inc.에 의해 판매되는 렉시켐(Lexichem) 명명 도구 및 MDL, Inc.에 의해 판매되는 오토놈(Autonom) 소프트웨어 도구를 포함한다. 상기 나타낸 화학물질 명칭 및 도시된 구조가 상이한 경우에, 상기 도시된 구조는 억제될 것이다.
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Figure pct00180
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Claims (15)

  1. 하기 화학식 I에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 용매화물, 또는 용매화물의 염, 또는 그의 대사산물:
    화학식 I
    Figure pct00181

    상기 식에서
    R1은
    a) 하나 이상의 독립적으로 선택된 -OH, -CN, C1-4　알콕시, 할로, 또는 -S(=O)2-C1-4　알킬로 치환된 C2-6 알킬, 또는
    b) 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 S, N 또는 O 원자를 포함하는 6원 헤테로사이클로알킬(헤테로사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, 할로 또는 C1-4　알킬로 치환되고, 알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 할로로 치환된다)이고;
    R2는
    a) C1-4　알콕시(알콕시는 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로 또는 -OH로 치환된다),
    b) -O-C3-4　사이클로알킬(사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로 또는 -OH로 치환된다), 또는
    c) -C(=O)NR3aR3b이고;
    Cy는 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 R4 치환체로 치환된, 1 또는 2개의 N 원자를 포함하는 6원 헤테로아릴이고;
    각각의 R3a 및 R3b는
    a) H,
    b) C1-4　알킬(알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, -CN, C1-4　알콕시, 또는 C3-7　사이클로알킬로 치환되고, 사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로로 치환된다),
    c) C3-6　사이클로알킬(사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4 알킬, C1-4　알콕시, 또는 할로로 치환된다), 또는
    d) 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 N, S 또는 O 원자를 포함하는 4-6원 헤테로사이클로알킬(헤테로사이클로알킬은 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 옥소, -OH, -CN, C1-4 알킬, C1-4　알콕시, 또는 할로로 치환된다)
    중에서 독립적으로 선택되거나; 또는
    R3a 및 R3b는 이들이 부착된 N 원자와 함께 4-6원 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬을 형성하고;
    각각의 R4 는 독립적으로
    a) 옥소,
    b) -OH,
    c) -CN,
    d) 할로,
    e) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C1-4 알킬,
    f) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C1-4　알콕시, 또는
    g) 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, -OH, 또는 -CN으로 치환된 C3-7　사이클로알킬이고;
    R5는 H, 할로, -CH3 또는 -CF3 중에서 선택된다.
  2. 제1항에 있어서,
    R1이 하나 이상의 독립적으로 선택된 -OH, -CN, -OCH3, F, Cl, 또는 -S(=O)2CH3로 치환된 C2-6 알킬인 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항에 있어서,
    R1이 테트라하이드로피라닐, 디옥사닐, 모폴리닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 티오모폴리닐, 또는 1,4-옥사티아닐인 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제1항에 있어서,
    하기 화학식 IIa 또는 IIb에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염:
    화학식 IIa
    Figure pct00182

    화학식 IIb
    Figure pct00183
    .
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    R2가 -OCH3, 또는 -OCH2CH3이고, 이들이 각각 비치환되거나 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로 또는 -OH로 치환되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    R2가 -C(=O)NR3aR3b인 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염.
  7. 제6항에 있어서,
    R3a가 H, -CH3, -CH2-CH3, 또는 -CH(CH3)2인 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    R3b가 H, -CH3, -CH2-CH3, 또는 -CH(CH3)2인 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염.
  9. 제1항에 있어서,
    하기 화학식 IIIa, IIIb, IIIc, IVa, IVb 또는 IVc에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염:
    화학식 IIIa
    Figure pct00184

    화학식 IIIb
    Figure pct00185

    화학식 IIIc
    Figure pct00186

    화학식 IVa
    Figure pct00187

    화학식 IVb
    Figure pct00188

    화학식 IVc
    Figure pct00189
    .
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    Cy가 피리디닐 또는 피라지닐이고, 이들이 각각 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 R4 치환체로 치환되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염.
  11. 제10항에 있어서,
    각각의 R4가 옥소, -OH, -CN, F, Cl, -CH3, -CH2-CH3, -CH(CH3)2, -CF3, -CHF3, -CH2CF3, -CH2CN, -CH2OH, -CH2CH2-CN, -O-CH2-CH3, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 F 또는 -CN으로 치환된 사이클로프로필, 1 또는 2개의 독립적으로 선택된 F, -OH 또는 -CN으로 치환된 사이클로부틸 중에서 독립적으로 선택되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    추가의 치료제를 또한 포함하는 약학 조성물.
  14. 약제에 사용하기 위한 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 염, 또는 제12항 또는 제13항에 따른 약학 조성물.
  15. 염증성 질병, 자가면역 질병, 통증, 섬유증 및/또는 증식성 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 염, 또는 제12항 또는 제13항에 따른 약학 조성물.
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