KR20210134241A - 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (sars-cov-2) 리보핵산 (rna)을 동정하는 방법 - Google Patents

중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (sars-cov-2) 리보핵산 (rna)을 동정하는 방법 Download PDF

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Abstract

생물학적 샘플에서 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)의 존재를 검출하는 방법은 다음의 단계: 생물학적 샘플을 용해하여 용해물을 형성하는 단계; 및 서열 번호 1, 서열 번호 5, 서열 번호 9, 서열 번호 13 및 서열 번호 17로 구성되는 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 정방향 프라이머; 서열 번호 2, 서열 번호 6, 서열 번호 10, 서열 번호 14 및 서열 번호 18로 구성되는 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 역방향 프라이머; 및 서열 번호 3, 서열 번호 7, 서열 번호 11, 서열 번호 15 및 서열 번호 19로 구성되는 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 서열 및 형광단을 갖는 분자 비콘의 존재 하에 용해물에서 표적 핵산 서열에 대하여 핵산 서열-기반(NASBA)의 증폭을 수행함으로써 증폭된 용해물을 생성하는 단계를 포함한다. 상기 증폭된 용해물은 여기 소스에 노출시킨다. 상기 여기 소스에 노출된 증폭된 용해물에서 형광단의 형광을 검출한다. 형광단의 형광을 검출하는 것에 대한 반응으로 생물학적 샘플에 SARS-CoV-2가 존재하는지를 결정한다.

Description

중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-COV-2) 리보핵산 (RNA)을 동정하는 방법{METHOD OF IDENTIFYING SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONA VIRUS 2 (SARS-COV-2) RIBONUCLEIC ACID (RNA)}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 4월 29일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/017,043호, 및 2020년 8월 10일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/063,731호에 대한 우선권을 주장하며, 2020년 9월 4일에 출원된 PCT 국제 특허 출원 PCT/US20/49394호의 일부 계속 출원이며, 이것은 2019년 9월 6일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/897,057호에 대한 우선권을 주장하며, 그 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로서 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 병원성 미생물의 동정 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 예를 들어, 특정 RNA 서열의 핵산 서열-기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA)을 통해 생물학적 샘플에서 병원성 미생물 및/또는 그것의 항생제 내성을 실시간으로 동정하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
Covid 19의 원인이 되는 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2)는 전세계 감염의 원인이 되며 현재는 유행병(pandemic)으로서 분류된다. Covid 19 이환율(morbidity)과 사망률(mortality)의 전체 범위는 알 수 없지만, 현재 전세계적으로 수백만명에 달하는 것으로 추정된다. SARS-CoV-2 바이러스의 확산을 줄이는 한가지 중요한 도구는 바이러스를 무의식적으로 전파하는 바이러스의 비-증상 보균자의 높은 유병률로 인한 신속하고 신뢰할 수 있는 테스트이다. 일부 기존의 분석법이 있지만, 이것들은 결과를 제공하는데 수일이 걸릴 수 있다. 결과가 오래 지연되면 추가적인 감염이 발생할 수 있다.
따라서, SARS-CoV-2의 동정 및 Covid-19의 후속 진단을 위한 병원체-관련 분석물(pathogen-associated analytes)의 존재를 검출하기 위해, 바람직하게는 최소한의 또는 전혀 샘플의 제조를 필요로 하지 않는 신속하고 민감한 방법이 여전히 요구된다.
발명의 요약
용해 용액(lysis solution) 및 Covid-19 검출 시스템의 양상이 제공되는 본 발명에 의하여 전술한 요구들이 상당히 충족되었다.
본 개시의 측면은 생물학적 샘플에서 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2: SARS-CoV-2)의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 다음의 단계들: 생물학적 샘플을 용해하여 용해물(lysate)을 형성하는 단계; 및 서열 번호 1, 서열 번호 5, 서열 번호 9, 서열 번호 13 및 서열 번호 17로 구성되는 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 정방향 프라이머(forward primer); 서열 번호 2, 서열 번호 6, 서열 번호 10, 서열 번호 14 및 서열 번호 18로 구성되는 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 역방향 프라이머(reverse primer); 및 서열 번호 3, 서열 번호 7, 서열 번호 11, 서열 번호 15 및 서열 번호 19로 구성되는 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 서열 및 형광단(fluorophore)을 갖는 분자 비콘(molecular beacon);의 존재 하에 상기 용해물에서 표적 핵산 서열에 대하여 핵산 서열-기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA)을 수행함으로써 증폭된 용해물을 생성하는 단계;를 포함한다. 상기 증폭된 용해물을 여기 소스(excitation source)에 노출시킨다. 상기 여기 소스에 노출된 증폭된 용해물에서 형광단의 형광을 검출한다. 형광단의 형광을 검출하는 것에 대한 응답으로(in response to) 생물학적 샘플에 SARS-CoV-2가 존재하는지 여부를 결정한다.
따라서, 본원에서의 상세한 설명이 더 잘 이해될 수 있도록 그리고 본 기술에 대한 현재의 기여가 더 잘 인식될 수 있도록 본 발명의 특정 실시 형태가 다소 광범위하게 개괄되었다. 물론, 아래에 설명되고 본원에 첨부된 청구범위의 주제를 형성할 본 발명의 추가 실시 형태가 존재한다.
이와 관련하여, 본 발명의 적어도 하나의 실시 형태를 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 그 적용에서의 구성의 세부 사항 및 하기의 설명에 제시되거나 도면에 도시된 구성 요소의 배열에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 발명은 설명된 것들에 추가하여 실시 형태가 가능하고 다양한 방식으로 실시되고 수행될 수 있다. 또한, 본원에서 사용된 표현 및 용어 뿐만 아니라 요약은 설명의 목적을 위한 것이며 이를 제한하는 것으로서 간주되어서는 안됨을 이해해야 한다.
이와 같이, 당업자는 본 개시의 기초가 되는 개념이 본 발명의 다양한 목적을 수행하기 위한 다른 구조, 방법 및 시스템의 설계를 위한 기초로서 용이하게 이용될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 청구 범위가 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 한 이러한 등가 구성을 포함하는 것으로 간주되는 것이 중요하다.
도면의 간단한 설명
본 발명이 용이하게 이해될 수 있도록, 본 발명의 측면들은 첨부된 도면들의 예로서 도시되지만; 그러나, 주제는 개시된 측면들로 제한되지는 않는다.
도 1은 본 발명의 측면에 따른 개략적인 감염 검출 시스템을 도시한다.
본 발명의 측면에 따른 감염 검출 시스템의 특징은 도면을 참조하여 설명되며, 도면에서 유사한 참조 부호는 전체적으로 유사한 부분을 나타낸다.
상세한 설명
도 1은 본 발명의 측면에 따른 예시적인 SARS-CoV-2 감염 검출 시스템(10)의 개략도를 도시한다. SARS-CoV-2 감염 검출 시스템은 샘플을 처리하고 샘플에 하나 이상의 사전 결정된 병원체가 포함되어 있는지 여부를 결정하도록 구성된다. 본 발명의 실시 형태에 따른 SARS-CoV-2 감염 검출 시스템은 샘플링 장치(sampling device)(20), 용해 챔버(lysing chamber)(30), 필터(filter)(40), 계량기(meter)(50), 핵산 서열-기반 증폭(NASBA) 유체 네트워크(nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) fluidic network)(60), 및 기기(instrument)(70)를 포함한다. SARS-CoV-2 감염 검출 시스템은 또한 카트리지와 같은 샘플 프로세서(sample processor)(80)를 포함하며, 이것은 적어도 NASBA 유체 네트워크를 포함하고 용해 챔버, 필터 및 계량기의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 샘플 프로세서는 샘플링 장치에 연결되고 샘플링 장치 내에 포함된 샘플을 수용하고 처리하도록 구성된다. 상기 샘플 프로세서는 일회용일 수 있고 교체 가능할 수 있으며, 적어도 하나의 NASBA 분석법을 사용하여 수집된 샘플을 처리하도록 조정할 수 있다. SARS-CoV-2 감염 검출 시스템은 샘플을 처리하고 샘플에 하나 이상의 사전 결정된 병원체가 포함되어 있는지 여부를 예를 들어 1시간, 30분 또는 그 이하로 신속하게 결정할 수 있다. SARS-CoV-2 감염 검출 시스템은 샘플을 처리할 수 있으며, 샘플이 예를 들어 환자와 동일한 건물, 공간 등 내의 현장 진단(point-of-care)에서 사전 결정된 병원체를 하나 이상 포함하는지 여부를 결정할 수 있다. 따라서, SARS-CoV-2 감염 검출 시스템은 시간을 낭비하는 중간 처리, 보관 및/또는 샘플링 장치의 외부 운송에 대한 필요성을 제거한다. 본 발명의 측면에 따르면, 샘플 프로세싱 전체가 SARS-CoV-2 감염 검출 시스템의 다양한 구성 요소 내에서 발생할 수 있으므로, 그에 의해 샘플 수집 후 샘플에 대한 직접적인 사용자 개입의 필요성을 제거할 수 있다. 따라서 SARS-CoV-2 감염 검출 시스템은 기술이 부족한 사용자에 의해 사용될 수 있으며 다양한 환경(예를 들면, 가정, 병실 등)으로 쉽게 이동하여 적용할 수 있다. 결과적으로, 환자에서의 감염을 신속하게 감지하고 동정할 수 있는데, 이것은 환자의 예후(prognosis)를 향상시킬 수 있다.
일부 실시 형태에서, SARS-CoV-2 감염 검출 시스템의 샘플링 장치는 질병 대책 센터(Centers for Disease Control: CDC) 권장 상업적 RNA 추출 키트(또는 이와 유사한 것)와 함께 사용될 수 있다. SARS-CoV-2 감염 검출 시스템의 샘플링 장치는 비인두 도말물(nasopharyngeal swabs), 타액(saliva), 가래(sputum), 혈액 (예를 들어: 전혈), 소변, 대변(fecal matter), 화농(purulence)/고름(pus) 등과 같은 샘플을 수집하도록 조정될 수 있다. 본원에서 사용된 전혈은 혈장, 혈소판 또는 병원체와 같은 성분이 제거되지 않은 환자로부터 직접 채취한 혈액을 의미한다. 샘플링 장치는 의료 장치(미도시됨)로부터 샘플을 수집할 수 있다. 예를 들어, 샘플링 장치는 의료 장치에서의 내부 공간(internal space) 또는 루멘(lumen)에 사전 결정되고/거나 연장된 기간 동안 노출되어 상기 공간 및/또는 루멘에서 형성될 수 있는 임의의 병원체의 샘플을 수집할 수 있다. 상기 의료 장치는 폴리 카테터(Foley catheter), 혈관 카테터(vascular catheter), 흡인 카테터(suction catheter), 기관지 내시경(bronchial scope), 배뇨관(urinary drain line), 호흡기 흡인 카테터(respiratory suction catheter), 기관지-폐포-세척용 카테터 등과 같이, 환자의 치료에 사용되는 외부 통신 장치일 수 있다. 샘플링 장치는 비인두 도말물, 타액, 가래, 소변, 대변, 화농/고름, 의심되는 감염 부위(예컨대, 수술용 드레싱, 상처 및/또는 삽입 부위) 등과 같은 샘플 소스(sample source)로부터 직접 샘플을 수집하도록 추가적으로 또는 대안적으로 조정할 수 있다. 샘플링 장치는 추가적으로 또는 대안적으로 샘플을 정맥 내(intravenously), 피하(subcutaneously) 또는 골 내(intraosseously)에서 수집하도록 조정할 수 있다. 상기 샘플링 장치는 일회용일 수 있고 교체 가능할 수 있다. 본 발명의 측면에 따르면, 샘플링 장치는 샘플 수집 튜브(sample collection tube)를 포함할 수 있다. 샘플 수집 튜브는 전혈 샘플을 포함하는 표준 혈액 수집 진공 튜브일 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 상기 샘플링 장치는 전혈 샘플을 포함하는 표준 주사기일 수 있다.
샘플의 소스에 따라, 시료를 용해하는 것이 선택적으로 수행된다. 예를 들어, 비인두 도말물 및/또는 타액과 같은 일부 샘플들은 용해가 필요하지 않을 수 있다. 용해가 수행되는 경우, 용해 챔버는 샘플을 수용하고 샘플을 용해물로 용해하도록 구성된 임의의 챔버일 수 있다. 용해 챔버는 샘플링 장치와 유체 연통(fluid communication) 할 수 있다. 본원에서 사용되는 유체 연통은 유체가 한 구조로부터 다른 구조로 이동할 수 있도록 하는 배관(tubing), 도관(conduits) 등과 같은 임의의 다수의 구조들을 통해 해당 구조가 유동적으로(fluidly) 연결되어 있음을 의미할 수 있다. 본 발명의 실시 형태에서, 샘플링 장치로부터 용해 챔버로의 샘플의 흐름(flow)은 기기에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 기기에 의해 제어되고/거나 구동될 수 있다. 본 개시의 전체에 걸쳐, 유체의 흐름, 예를 들어 샘플링 장치로부터 용해 챔버로의 샘플의 흐름을 제어하고/거나 구동하는 기기에 대한 참조가 이루어진다. 상기 기기는 유체 경로에 작동 가능하게 연결될 때 그리고 예를 들어 펌프, 밸브, 도관 등을 포함할 수 있는 임의의 수의 공지된 유체 제어 시스템을 통해 유체의 흐름을 제어하고/거나 구동할 수 있다. 또한, 상기 기기는 유체와 물리적으로 접촉하지 않고도 유체의 흐름을 제어하고/거나 구동할 수 있다. 이에 따라, 샘플 수집기 및/또는 샘플 프로세서는 상기 기기가 샘플을 오염시키지 않고 반복적으로 사용될 수 있는 동안 폐기되고 교체될 수 있다.
상기 용해 챔버는 샘플 및 그 안에 포함된 병원체 세포를 용해하고 병원체 메신저 RNA를 추출하고 정제하기 위한 모든 물질을 포함할 수 있다(즉, 표적화된 mRNA를 용해시키고 핵산 증폭을 방해할 수 있는 억제제를 제거함). 예를 들어, 용해 챔버는 샘플을 용해물로 용해하도록 구성된 동결건조된(lyophilized) Acris 용해 화학 물질과 같은, 용해제를 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 용해 챔버는 샘플을 초음파로 또는 샘플을 동결시켜 물리적으로 용해시킬 수 있다.
도 1에 도시된 본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 용해 챔버는 복수의 챔버들, 예를 들어 제1 챔버 및 제2 챔버를 포함할 수 있다. 상기 제1 챔버는 동결건조된 Acris 용해 화학 물질과 같은 용해 화학 물질을 포함할 수 있다. 제1 챔버 내에 포함된 용해 화학 물질은 건조된 용해 시약을 갖는 시약 플러그(들)(reagent plug(s))의 형태일 수 있다. 제1 챔버는 샘플링 장치와 유체 연통할 수 있으며, 샘플링 장치로부터 샘플을 수용할 수 있다. 본 발명의 실시 형태에서, 기기는 샘플링 장치로부터 제1 챔버로의 샘플의 흐름을 제어하고/거나 구동할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 샘플은 중력, 모세관 흐름(capillary flow) 등을 통해 샘플링 장치로부터 제1 챔버로 이동될 수 있다. 제2 챔버는 희석제를 포함할 수 있고 제1 챔버와 유체 연통할 수 있다. 희석제는 용해물을 형성하기 위해 제2 챔버로부터 제1 챔버로 이동될 수 있다. 상기 기기는 제2 챔버로부터 제1 챔버로의 희석제의 흐름을 제어하고/거나 구동할 수 있다. 상기 제1 챔버에서 형성된 용해물은 용해제, 희석제 및 샘플을 포함할 수 있다. 희석제는 용해물을 제조하기 위해 샘플이 도착하기 전에 제1 챔버로 이동될 수 있다. 대안적으로, 희석제 및 샘플은 제1 챔버로 동시에 이동될 수 있다.
샘플 소스에 따라, 상기 용해물의 여과(filtering)는 선택적으로 수행된다. 예를 들어, 비인두 도말물, 타액 등은 여과가 필요하지 않을 수 있다. 반대로, 전혈을 여과하는 것은 테스트 결과를 향상시킬 수 있다. 여과가 수행되는 경우, 상기 필터는 용해 챔버와 유체 연통하며 용해물을 여과된 용해물로 여과하도록 구성된다. 상기 필터는 용해물(예를 들면, 헤모글로빈)로부터 크고 불투명한 구조체들을 걸러내면서 용해물 내의 표적 서열(예를 들면, 표적 병원체로부터의 유전 물질)이 후속 처리 및 분석을 위해 필터를 통과하도록 할 수 있다. 본 발명의 실시 형태에서, 상기 기기는 용해 챔버로부터 필터를 통과하는 용해물의 흐름을 제어하고/거나 구동하여 여과된 용해물을 형성할 수 있다.
계량기는 필터와 유체 연통하며 NASBA 분석을 위해 사전 결정된 양의 여과 된 용해물을 계량하도록 구성된다. 사전 결정된 양은 예를 들어 1 내지 3ml일 수 있다. 본 발명의 실시 형태에서, 상기 기기는 여과된 용해물의 사전 결정된 양을 수집하기 위해 필터로부터 그리고 계량기로의 여과된 용해물의 흐름을 제어하고/거나 구동할 수 있다.
NASBA 유체 네트워크는 계량기와 유체 연통할 수 있고, 계량기로부터 사전 결정된 양의 여과된 용해물을 수용할 수 있다. 상기 NASBA 유체 네트워크는 사전 결정된 양의 여과된 용해물에 대해 mRNA 및/또는 DNA에 대해 사전 결정된 NASBA-기반 핵산 분석법을 수행하는데 필요한 모든 물질(예를 들어, 시약, 구조체 등)을 포함할 수 있다. NASBA 유체 네트워크는 각각 직접적으로 또는 간접적으로 계량기와 유체 연통하고 계량기로부터 여과된 용해물을 수용하도록 구성된 복수의 반응 튜브들을 포함할 수 있다. 본 발명의 실시 형태에서, 상기 기기는 계량기로부터 복수의 반응 튜브들 각각으로의 여과된 용해물의 흐름을 제어하고/거나 구동할 수 있다.
복수의 반응 튜브들 각각은 사전 결정된 병원체 표적 서열(예를 들어, 특정 유전자의 존재를 확인하기 위한 표적화된 mRNA)의 등온 증폭(isothermal amplification)을 위해 여과된 용해물을 처리하기 위한 모든 물질들을 포함할 수 있다. 복수의 반응 튜브들 각각에 포함될 수 있는 물질들의 구체적인 예시로는 용해 완충액, mRNA-의존성 DNA 중합효소, mRNA 프라이머, DNA 프라이머, 아미노산 등이 있다. 복수의 반응 튜브들 각각은 여과된 용해물 내의 병원체 표적 서열에 대해 NASBA 분석법을 수행하기 위한 효소, 프라이머 및 비콘(beacon)을 적어도 포함할 수 있다. 복수의 반응 튜브들 각각은 다음의 세가지 효소들 중 하나 이상을 포함 할 수 있다: 조류 골수아세포종 바이러스(Avian Myeloblastosis Virus: AMV) 역전사 효소, 리보뉴클레아제 H(Ribonuclease H: RNase H) 및 T7 RNA 중합효소. 복수의 반응 튜브들 각각은 둘 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함할 수 있다. 효소(들) 및 프라이머(들)은 사전 결정된 병원체 표적 서열에서 사전 결정된 유전자 서열을 증폭시킬 수 있다. 복수의 반응 튜브들 각각에 제공된 비콘은 사전 결정된 병원체 표적 서열에 부착되도록 구성될 수 있다. 상기 비콘은 사전 결정된 유전자 서열에 부착될 때 그리고 여기 소스(예를 들면, 레이저)에 의해 여기될 때 빛을 방출하는 형광단을 포함할 수 있다. 각각의 반응 튜브는 기기가 사전 결정된 병원체 표적 서열에 부착될 때 비콘으로부터 방출되는 빛을 검출할 수 있도록 적어도 하나의 창(window)을 포함할 수 있다. 각각의 반응 튜브는 다른 반응 튜브 각각에 제공된 비콘과는 상이한 비콘이 제공될 수 있다. 따라서, 상기 NASBA 유체 네트워크는 반응 튜브에 있는 만큼의 상이한 사전 결정된 병원체 표적 서열을 검출할 수 있다.
NASBA 유체 네트워크는 NASBA 희석제를 포함하는 챔버를 포함할 수 있다. 상기 챔버는 복수의 반응 튜브들 각각과 유체 연통할 수 있다. 본 발명의 실시 형태에서, 상기 기기는 챔버로부터 복수의 반응 튜브 각각으로의 희석제의 흐름을 제어하고/거나 구동할 수 있다. 챔버 내에 포함된 희석제는 여과된 용해물의 도입 전에 사전 결정된 기간(예를 들어, 5분)동안 복수의 반응 튜브들 각각에 유동적으로 연통될 수 있다. 사전 결정된 기간이 종료된 후, 여과된 용해물을 복수의 반응 튜브들 각각에 분배하여 NASBA 반응을 유도할 수 있으며, NASBA 반응의 결과를 상기 기기에 의해 분석할 수 있다.
SARS-CoV-2 감염 검출 시스템의 기기는 샘플 프로세서를 수용하고, 샘플 프로세서 내에서 샘플 처리의 애스펙트(aspects)를 개시하고/거나 제어하고, 처리된 샘플을 분석하도록 구성될 수 있다. 상기에서 상세하게 논의된 바와 같이, 상기 기기는 유체 흐름(예를 들어, 전혈 흐름, 희석제 흐름, 용해물 흐름, 여과된 용해물 흐름 등)을 제어하고/거나 구동할 수 있다. 또한, 상기 기기는 NASBA 분석 동안에 사전 결정된 병원체 표적 서열의 등온 증폭을 위해 필요한 사전 결정된 온도 범위 내에서 샘플 프로세서를 유지할 수 있는 히터 및/또는 열교환기를 포함할 수 있다. 사전 결정된 온도 범위는 섭씨 35-50도이다. 실시 형태에서, 사전 결정된 온도 범위는 섭씨 40-42도 이내일 수 있다.
본 발명의 실시 형태에서, 상기 기기는 시약을 사용하여 샘플에 대해 임의의 적합한 NASBA-기반 핵산 분석을 수행하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 상기 기기는 병원체 세포를 용해하고 병원체 메신저 RNA를 추출하고 정제하기 위한 임의의 단계들을 수행하도록 구성될 수 있다(즉, 표적화된 mRNA를 용해하고 핵산 증폭을 방해할 수 있는 억제제를 제거함). 또 다른 실시예에서, 기기는 특정 유전자의 존재를 확인하기 위해 표적화된 mRNA의 등온 증폭을 위한 추출 및 정제 단계로부터의 산출 용액(output solution)을 처리하기 위한 임의의 단계들을 수행하도록 구성될 수 있다.
본 개시의 다양한 실시 형태에 따르면, 항생제 내성과 관련된 병원성 미생물 및/또는 서열이 환자로부터 수득된 생물학적 샘플 내에서 검출된다. 본 개시의 목적을 위해, 생물학적 샘플은 비인두 도말물, 타액, 가래, 전혈, 혈청(serum), 혈장(plasma), 뇌척수액(cerebrospinal fluid: CSF), 소변, 관절액(synovial fluid), 모유(breast milk), 땀, 눈물, 타액, 정액(semen), 대변(feces), 질액(vaginal fluid) 또는 질 조직, 가래, 비인두 흡인물(nasopharyngeal aspirate) 또는 비인두도말물, 누액(lacrimal fluid), 점액(mucous) 또는 상피성 도말물(epithelial swab) (구강 도말물(buccal swab)) 및 조직(예를 들면, 조직 호모제네이트(tissue homogenates), 기관, 뼈, 치아 등)을 포함한다. 본 개시의 목적을 위해, 병원성 미생물은 예를 들어, 베타코로나바이러스 SARS-CoV-2 (Covid-19) 및/또는 코로나바이러스과(Coronaviridae)의 다른 바이러스 중 하나 이상을 포함한다. 보다 구체적으로, 병원성 유기체는 표 I에 열거된 것들을 포함할 수 있다. 보다 더 구체적으로, 병원성 유기체의 표적 서열은 표 I에 열거된 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 및 분자 비콘을 사용하여 검출할 수 있다.
[표 I]
Figure pat00001
표 I에 열거된 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 및 분자 비콘은 SARS-CoV-2 감염 검출 시스템(10)에서 사용하기에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 이들 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 분자 비콘은 NASBA 증폭 및 감지 시스템과 함께 사용하도록 최적화되었다.
감염 검출 시스템(10)에 사용하기에 적합한 용해 용액은 미생물 세포벽 및 세포막을 빠르게 용해시킨다. 특정 실시예에서, 용해 용액은 물리-기계적 세포 파괴(physio-mechanical cell disruption) 없이 실온에서 이러한 용해를 촉진시킬 수 있다. 또한, 용해 용액은 RNA에 대하여 양성(benign)이고 실온에서 안정할 수 있다. 적합한 용해 용액의 구체적인 예시는 표 II에 나와 있다:
[표 II]
Figure pat00002
다양한 그람 양성(gram positive), 그람 음성(gram negative) 및 진균 미생물(fungal microorganisms)을 용해하기 위하여 사용하기에 적합하다는 것이 표 II에 따른 용해 용액의 장점이다. 또한, 표 II에 따른 용해 용액의 장점은 실온에서 저장의 1년 이상의 생존 보관 수명(viable shelf life)을 갖는다는 것이다. 또한, 표 II에 따른 용해 용액의 장점은 섭씨 영하 20도(-20℃)에서 저장의 1년 이상의 생존 보관 수명을 갖는다는 것이다. 참고로, IGEPAL CA-630®은 IUPAC 명칭이 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올인 비이온성(nonionic)이며, 비변성 세제(non-denaturing detergent)이다.
본 발명의 다수의 특징 및 이점은 상세한 설명으로부터 명백하며, 이에 따라 첨부된 청구 범위에 의해 본 발명의 진정한 사상 및 범위 내에 속하는 본 발명의 이러한 모든 특징 및 이점을 포괄하도록 의도된다. 또한, 다양한 수정 및 변형이 당업자에게 용이하게 발생할 것이기 때문에, 본 발명을 예시하고 설명하는 정확한 구성 및 작용으로 제한하는 것은 바람직하지 않으며, 이에 따라 모든 적절한 수정 및 등가물이 본 발명의 범위 내에 속할 수 있다.
<110> Teleflex Medical Incorporated Bouchard, Michael McDaniel, Lauren Bruzek, Steven Knapp, Chelsea Small, Jessica Wagner, Victoria Ulrich, Robert <120> METHOD OF IDENTIFYING SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONA VIRUS 2 (SARS-COV-2) RIBONUCLEIC ACID (RNA) <130> 44780.24642 <150> US 63/017,043 <151> 2020-04-29 <150> US 63/063,731 <151> 2020-08-10 <150> US 17/137,972 <151> 2020-12-30 <150> US 17/138,037 <151> 2020-12-30 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Coronavirus SARS-CoV-2 <400> 1 gaccccaaaa tcagcgaaat 20 <210> 2 <211> 49 <212> DNA <213> Coronavirus SARS-CoV-2 <400> 2 aattctaata cgactcacta tagggagaac tccattctgg ttactgcca 49 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Coronavirus SARS-CoV-2 <400> 3 agctcgcatt acgtttggtg gaccctcgag ct 32 <210> 4 <211> 72 <212> DNA <213> Coronavirus SARS-CoV-2 <400> 4 gaccccaaaa tcagcgaaat gcaccccgca ttacgtttgg tggaccctca gattcaactg 60 gcagtaacca ga 72 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Coronavirus SARS-CoV-2 <400> 5 aaaacgtact gccactaaag c 21 <210> 6 <211> 49 <212> DNA <213> Coronavirus SARS-CoV-2 <400> 6 aattctaata cgactcacta tagggagaat gtctgattag ttcctggtc 49 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Coronavirus SARS-CoV-2 <400> 7 agctcgcaga cgtggtccag aacaaacgag ct 32 <210> 8 <211> 100 <212> DNA <213> Coronavirus SARS-CoV-2 <400> 8 ttttggggac caggaactaa tcagacaagg aactgattac aaacattggc cgcaaattgc 60 acaatttgcc cccagcgctt cagcgttctt cggaatgtcg 100 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Coronavirus SARS-CoV-2 <400> 9 aatgtctggt aaaggccaac 20 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Coronavirus SARS-CoV-2 <400> 10 aattctaata cgactcacta tagggagaag cagtacgttt ttgccgaggc 50 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Coronavirus SARS-CoV-2 <400> 11 agctcgccaa actgtcacta agaaatcgag ct 32 <210> 12 <211> 93 <212> DNA <213> Coronavirus SARS-CoV-2 <400> 12 aatgtctggt aaaggccaac aacaacaagg ccaaactgtc actaagaaat ctgctgctga 60 ggcttctaag aagcctcggc aaaaacgtac tgc 93 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Coronavirus SARS-CoV-2 <400> 13 acaaagacgg catcatatgg g 21 <210> 14 <211> 49 <212> DNA <213> Coronavirus SARS-CoV-2 <400> 14 aattctaata cgactcacta tagggagaaa ttgcagcatt gttagcagg 49 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Coronavirus SARS-CoV-2 <400> 15 agctcggaat acaccaaaag aycacacgag ct 32 <210> 16 <211> 94 <212> DNA <213> Coronavirus SARS-CoV-2 <400> 16 acaaagacgg catcatatgg gttgcaactg agggagcctt gaatacacca aaagatcaca 60 ttggcacccg caatcctgct aacaatgctg caat 94 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Coronavirus SARS-CoV-2 <400> 17 gtacgttaat agttaatagc 20 <210> 18 <211> 49 <212> DNA <213> Coronavirus SARS-CoV-2 <400> 18 aattctaata cgactcacta tagggagaaa ttgcagcagt acgcacaca 49 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Coronavirus SARS-CoV-2 <400> 19 agctcgcttt cgtggtattc ttgctagtcg agct 34 <210> 20 <211> 107 <212> DNA <213> Coronavirus SARS-CoV-2 <400> 20 gtacgttaat agttaatagc gtacttcttt ttcttgcttt cgtggtattc ttgctagtta 60 cactagccat ccttactgcg cttcgattgt gtgcgtactg ctgcaat 107 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gttctgacct gaaggctctg 20 <210> 22 <211> 49 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 aattctaata cgactcacta tagggagaat ccttaaagtc aacgatatg 49 <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 agctcgctat tcagttgttg ctatcacgag ct 32 <210> 24 <211> 94 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 gttctgacct gaaggctctg cgcggacttg tggagacagc cgctcacctt ggctattcag 60 ttgttgctat caatcatatc gttgacttta agga 94

Claims (12)

  1. 생물학적 샘플에서 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2: SARS-CoV-2)의 존재를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 다음의 단계들:
    생물학적 샘플을 용해하여 용해물(lysate)을 형성하는 단계;
    하기:
    서열 번호 1, 서열 번호 5, 서열 번호 9, 서열 번호 13 및 서열 번호 17로 구성되는 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 정방향 프라이머(forward primer);
    서열 번호 2, 서열 번호 6, 서열 번호 10, 서열 번호 14 및 서열 번호 18로 구성되는 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 역방향 프라이머(reverse primer); 및
    서열 번호 3, 서열 번호 7, 서열 번호 11, 서열 번호 15 및 서열 번호 19로 구성되는 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 서열 및 형광단(fluorophore)을 갖는 분자 비콘(molecular beacon);
    의 존재 하에 상기 용해물에서 표적 핵산 서열에 대하여 핵산 서열-기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA)을 수행함으로써 증폭된 용해물을 생성하는 단계;
    상기 증폭된 용해물을 여기 소스(excitation source)에 노출시키는 단계;
    상기 여기 소스에 노출된 증폭된 용해물에서 형광단의 형광을 검출하는 단계; 및
    형광단의 형광을 검출하는 것에 대한 응답으로(in response to) 생물학적 샘플에 SARS-CoV-2가 존재하는지 여부를 결정하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    정방향 프라이머는 서열 번호 1로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 역방향 프라이머는 서열 번호 2로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 분자 비콘은 서열 번호 3으로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는, 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    정방향 프라이머는 서열 번호 5로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 역방향 프라이머는 서열 번호 6으로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 분자 비콘은 서열 번호 7로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    정방향 프라이머는 서열 번호 9로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 역방향 프라이머는 서열 번호 10으로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 분자 비콘은 서열 번호 11로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는, 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    정방향 프라이머는 서열 번호 13으로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 역방향 프라이머는 서열 번호 14로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 분자 비콘은 서열 번호 15로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는, 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    정방향 프라이머는 서열 번호 17로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 역방향 프라이머는 서열 번호 18로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 분자 비콘은 서열 번호 19로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는, 방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    용해 용액(lysis solution)을 생물학적 샘플에 첨가하여 용해물을 형성하는 단계를 더 포함하며, 상기 용해 용액은:
    2 mM 내지 16 mM의 쿠아니디늄 티오시아네이트(Quanidinium thiocyanate)/구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate);
    20 μM 내지 160 μM의 Tris HCL, pH 8.5;
    6 μM 내지 48 μM의 염화마그네슘;
    35 μM 내지 280 μM의 염화칼륨; 및
    0.1% v/v 내지 1.0% v/v의 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올;
    을 포함하는, 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    정방향 프라이머는 서열 번호 1로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 역방향 프라이머는 서열 번호 2로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 분자 비콘은 서열 번호 3으로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는, 방법.
  9. 청구항 7에 있어서,
    정방향 프라이머는 서열 번호 5로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 역방향 프라이머는 서열 번호 6으로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 분자 비콘은 서열 번호 7로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는, 방법.
  10. 청구항 7에 있어서,
    정방향 프라이머는 서열 번호 9로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 역방향 프라이머는 서열 번호 10으로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 분자 비콘은 서열 번호 11로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는, 방법.
  11. 청구항 7에 있어서,
    정방향 프라이머는 서열 번호 13으로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 역방향 프라이머는 서열 번호 14로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 분자 비콘은 서열 번호 15로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는, 방법.
  12. 청구항 7에 있어서,
    정방향 프라이머는 서열 번호 17로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 역방향 프라이머는 서열 번호 18로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 분자 비콘은 서열 번호 19로 구성되는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는, 방법.
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