KR20210123349A

KR20210123349A - 뇌내 출혈 치료에 사용하기 위한 다능성 성체 전구 세포

Info

Publication number: KR20210123349A
Application number: KR1020217027874A
Authority: KR
Inventors: 로버트 메이스
Original assignee: 에이비티 홀딩 컴퍼니
Priority date: 2019-02-01
Filing date: 2020-01-30
Publication date: 2021-10-13
Also published as: IL284959A; CN113507934A; WO2020160274A1; EP3917545A1; JP2022523503A; MX2021008998A; AU2020216403A1; SG11202108278QA; US20200246390A1; CA3127793A1

Abstract

본원에 기재된 발명의 측면은 뇌내 출혈을 치료하기 위한 다능성 성체 전구 세포의 투여에 관한 것이다.

Description

뇌내 출혈 치료에 사용하기 위한 다능성 성체 전구 세포

본 발명은 뇌내 출혈 및 다능성 줄기 세포에 관한 것이다.

정부 자금

본원에 개시된 발명을 제조하는 데 정부 자금은 사용되지 않았다.

관련 출원

본 출원은 2019년 2월 1일에 출원된 동일한 제목의 미국 특허 출원 제16/265,373호의 우선권을 주장하며, 그 전문은 본원에 참조로 인용된다.

I

뇌내 출혈(Intracerebral hemorrhage; "ICH")은 뇌 실질(brain parenchyma)및 주변 수막 공간을 포함하는 두개내 둥근 천장 내의 임의의 출혈을 의미한다. ICH는 미국 및 전세계적으로 상당한 인구에 영향을 미치는 파괴적인 질환이다. (참조: 예를 들어, Caceres and Goldstein (2012): Emerg Med Clin North Am 30(3) 771-794.) 전세계적으로 자발적 ICH의 발생률은 연간 100,000명당 24.6이고, 미국에서 연간 약 40,000 내지 67,000건의 사례가 있다. 30일 사망률은 35% 내지 52% 범위이다. 전체 사망률의 대략 절반이 처음 24시간 내에 발생한다. 생존자의 20%만이 6개월에 완전한 기능 회복을 갖는다. 조기에 효과적인 치료가 매우 중요하다고 생각된다. (참조: 예를 들어, van Asch et al. (2010): The Lancet Neurology 9(2) 167-176; Aguilar and Freeman (2010): Semin Neurol 30(5) 555-64, Broderick et al. (2007): Stroke 38(6) 2001-2023; Elliott and Smith (2010): Anesthesia & Analgesia 110(5) 1419-1427; and Feigin et al. (2009): The Lancet Neurology 8(4) 355-369.)

실질내 출혈(Intraparenchymal bleed)은 종종 관통하는 두부 외상으로부터 발생한다. 그들은 또한 함몰된 두개골 골절(depressed skull fractures)로부터 발생할 수 있다. 추가 원인으로는 동맥류 파열(rupture of an aneurysm), 동정맥 기형(AVM; arteriovenous malformation), 종양내 출혈 및 가속-감속 외상(acceleration-deceleration trauma)을 포함한다. 55세 이상의 환자에서 아밀로이드 혈관병증(amyloid angiopathy)은 뇌내 출혈의 빈번한 원인이다. 대뇌 정맥동 혈전증(Cerebral venous sinus thrombosis)은 ICH의 아주 작은 부분을 차지한다

1차 ICH는 종종 기저 소혈관 질환의 징후이다. 첫째, 장기간의 고혈압(hypertension)은 고혈압성 혈관병증(hypertensive vascuvascathy)으로 이어지며, 소형-내지-중형 투과 혈관의 벽에서 미시적 퇴행성 변화(지질유리질증(lipohyoinosis))를 유발한다. 둘째로, 작은 연수막 및 피질 혈관의 벽에 아밀로이드-베타 펩티드(Aβ)의 침착을 특징으로 하는 대뇌 아밀로이드 혈관병증이 발생한다. 아밀로이드의 축적을 유도하는 메커니즘은 공지되어 있지 않지만, 결과는 잘 문서화되어 있고: 혈관벽의 퇴행성 변화는 평활근 세포의 손실, 벽 비후, 내강 협소화, 미세동맥류 형성 및 미세출혈을 특징으로 한다. (참조: 예를 들어, Fisher, CM. (1971): J Neuropathol Exp Neurol 30(3) 536-50; Vinters H. (1987): Stroke 18(2) 311-324; and Viswanathan et al. (2011): Annals of Neurology 70(6) 871-880.)

초기 혈관 파열 후, 혈종(hemagena)은 뇌 실질에 직접적인 기계적 손상을 일으킨다. 혈액 주위 부종(perihemagenomal edema)은 증상 발병으로부터 처음 3시간 내에 발생하며 10 내지 20일 사이에 최고조에 달한다. 다음으로, 혈액 및 혈장 생성물은 염증 반응, 응고 캐스케이드의 활성화, 및 헤모글로빈 분해로부터의 철 침착을 포함하는 2차 손상 과정을 매개한다. 마지막으로, 혈종은 처음 24시간 동안 환자의 38%까지 계속 확장될 수 있다. (참조: 예를 들어, Aronowski and Zhao (2011): Stroke 42(6): 781-6 and Brott et al. (1997): Stroke 28(1) 1-5.)

요약하면, ICH는 뇌로의 혈액의 누출 및 뇌 실질 내의 혈액의 축적으로부터 발생하는 뇌 손상 유형이다. 이는 동맥류의 파열, 뇌동맥의 손상(예: 천공) 또는 동정맥 기형(AVM)으로부터 발생할 수 있다. 그것은 치명적인 신경학적 손상이며, 전세계적으로 모든 뇌졸중 관련 손상의 약 20%, 일본 및 아시아에서는 거의 30%를 차지한다. 그것은 모든 뇌졸중 관련 손상의 가장 높은 치사율 및 최악의 장기적 결과를 가지며, ICH는 모든 뇌졸중 관련 사망의 거의 50%를 차지한다. 혈종 용적은 ICH 환자 결과의 독립적인 결정 요인이기 때문에, 조기 혈전 용해는 1차 임상 목표이다. 그러나, ICH 결과를 개선하는 FDA-승인 요법은 없다. 혈전을 제거하기 위한 응급 수술(가능하다면) 및 재활이 현재 치료의 유일한 표준이지만, 외과적 관리(surgical management)는 제한된 유용성을 가지며, 재활은 이를 예방하거나 고치기 보다는 손상에 대처하는 문제이다. 실제로, AHA/ASA의 가장 최근의 지침 및 ICH 환자에게 권장되는 유일한 치료는, 수술이 수행될 수 있는 경우, 혈전의 외과적 제거이다. 다른 권장되는 치료적 개입은 없다. (참조: 예를 들어, Hemphill III, J.C. et al. (2015): AHA/ASA Guideline, Stoke 46: 2032-2060.)

분명히, 생성되는 뇌 손상을 줄이고 고치기 위해 ICH 손상을 해결하는 방법이 크게 요구된다. 따라서, ICH의 경우 결과를 개선하기 위한 수단 및 방법을 제공하는 것이 본원에 개시된 발명의 구현예의 목적 중 하나이다.

지금까지, 줄기 세포는 ICH를 치료하는 데 유용하다고 생각되지 않았다. 상기 언급된 바와 같이, ICH 병태생리학은 뇌에서 적혈구의 존재 및 후속적 분해에 의해 구동되어 헤모글로빈 및 그의 신경독성 헴 분해 생성물을 방출하는 것으로 생각된다. 적혈구의 뇌로의 혈관외 유출은 기계적 조직 파괴, 부종 형성, 상승된 두개내압, 향상된 미세혈관 압축, 감소된 혈류 및 불량한 결과와 관련된 공간 점유 혈종/혈전을 생성하며, 이는 세포 요법에 의해 치료되는 경향이 없는 것처럼 보인다.

본원에 기재된 바와 같이, 놀랍게도 ICH를 치료하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 다능성 성체 줄기 세포의 투여가, 혈종 용적, 뇌 혈류/관류 결과 및 기능성 신경학적 평가의 측정에 의해 제시된 바와 같이, ICH 결과에 대해 예기치 못하게 놀랍게도 효과적인 치료적으로 유익한 것으로 밝혀졌다.

II

본 설명에 포함되는 많은 구현예 중 몇몇은 하기 번호가 매겨진 단락에 요약되어 있다. 번호가 매겨진 단락은 자체-참조이다. 특히, 이러한 단락에서 사용된 "상기 또는 하기 중 어느 하나에 따르는"이란 문구는 다른 단락들을 지칭한다. 상기 문구는 다음 단락에서 본원에 개시된 구현예가 단독으로 취해진 개별 단락에서 기재된 주제 및 조합하여 취해진 단락에 의해 기재된 주제를 모두 포함함을 의미한다. 이와 관련하여, 특히 단독으로 또는 조합하여 취해진 단락에 의해 다양한 측면 및 구현예를 기재하기 위해 다음 단락을 제시하는 것이 명백하게 출원인의 목적이다. 즉, 상기 단락은 개별적으로 그리고 서로 임의의 조합으로 포함되는 모든 구현예의 명시적인 서면 설명을 설정하고 제공하는 간결한 방법이다. 출원인은 구체적으로 단독으로 또는 그 안에 명시된 임의의 다른 값과의 임의의 조합으로 취해진 그 안에 명시된 임의의 값의 임의의 조합을 포함하여 다음 단락들 중 임의의 단락에서 설정된 임의의 주제를 단독으로 또는 다른 단락들 중 임의의 하나 이상의 임의의 다른 주제와 함께 언제든지 청구할 권리를 보유한다. 필요한 경우, 출원인은 구체적으로 본 출원에서 또는 본 출원의 이점을 갖는 임의의 후속 출원에서 완전히 명시된 본원의 모든 조합을 명시할 권리를 보유한다.

p1. 대상체에서 뇌내 출혈을 치료하는 방법으로서, 배아 줄기 세포가 아니고 배아 생식 세포도 아니고 생식 세포도 아니며, 적어도 2개의 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통 각각의 적어도 하나의 세포 유형으로 분화할 수 있고, 상기 대상체에 대해 동종이계 또는 이종인 다능성 성체 전구 세포를 뇌내 출혈의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.

p2. 대상체에서 뇌내 출혈을 치료하는 방법으로서, 배아 줄기 세포가 아니고 배아 생식 세포도 아니고 생식 세포도 아니며, 텔로머라제를 발현하고, 상기 대상체에 대해 동종이계 또는 이종인 다능성 성체 전구 세포를 뇌내 출혈의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.

p3. 대상체에서 뇌내 출혈을 치료하는 방법으로서, 배아 줄기 세포가 아니고 배아 생식 세포도 아니고 생식 세포도 아니며, oct4에 대해 양성이고, 상기 대상체에 대해 동종이계 또는 이종인 다능성 성체 전구 세포를 뇌내 출혈의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.

p4. 대상체에서 뇌내 출혈을 치료하는 방법으로서, 배아 줄기 세포가 아니고 배아 생식 세포도 아니고 생식 세포도 아니며, 사용 전에 배양에서 적어도 40 세포 배가(doublings)를 겪고, 상기 대상체에 대해 동종이계 또는 이종인 다능성 성체 전구 세포를 뇌내 출혈의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.

p5. 상기 및/또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 적어도 2개의 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통 각각의 적어도 하나의 세포 유형으로 분화할 수 있는 방법.

p6. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 텔로머라제를 발현하는 방법.

p7. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 oct4에 대해 양성인 방법.

p8. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 텔로머라제를 발현하고, oct4에 대해 양성인 방법.

p9. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 텔로머라제를 발현하고, 사용 전에 적어도 40 세포 배가를 겪는 방법.

p10. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 oct4를 발현하고, 사용 전에 적어도 40 세포 배가를 겪는 방법.

p11. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 텔로머라제를 발현하고, oct4에 대해 양성이며, 사용 전에 적어도 40개 세포 배가를 겪는 방법.

p12. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 임의의 하나 이상을 발현하는 방법.

p13. 상기 또는 하기 중 임의의 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 정상 핵형을 갖는 방법.

p14. 상기 또는 하기 중 임의의 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 종양형성성(tumogenic)이 아닌 방법.

p15. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 기형종(teratoma)을 형성하지 않는 방법.

p16. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 유전적으로 변경되지 않는 방법.

p17. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 유전적으로 변경되는 방법.

p18. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 상기 대상체에서 면역원성이 아닌 방법.

p19. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 각각의 내배엽, 외배엽, 및 중배엽 배아 계통의 적어도 하나의 세포 유형으로 분화할 수 있는 방법.

p20. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 포유류 세포인 방법.

p21. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 인간 세포인 방법.

p22. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 태반 조직, 제대 조직, 제대혈, 골수, 혈액, 비장 조직, 흉선 조직, 척수 조직, 지방 조직, 및 간 조직 중 어느 하나로부터 단리된 세포로부터 유도되는 방법.

p23. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 골수로부터 유도되는 방법.

p24. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.

p25. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체의 질량 1kg당 10⁴ 내지 10⁸개의 상기 세포의 하나 이상의 투여량이 사용되는 방법.

p26. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체의 질량 1kg당 10⁶ 내지 5×10⁷개의 상기 세포의 하나 이상의 투여량이 사용되는 방법.

p27. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 이외에, 하나 이상의 성장 인자, 분화 인자, 신호전달 인자, 및/또는 호밍(homing)을 증가시키는 인자가 동시에 사용되는 방법.

p28. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 항균제, 항진균제, 항바이러스제 또는 이들의 조합이 동시에 사용되는 방법.

p29. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 하나 이상의 다른 약제학적 활성제를 포함하는 제형에 존재하는 방법.

p30. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 비경구적으로 투여되는 방법.

p32. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 정맥내로 투여되는 방법.

p33. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 정위적으로 투여되는 방법.

p34. 상기 또는 하기 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 ICH 후 1, 5, 10, 15, 30, 40 또는 60분, 또는 ICH 후 60, 90, 120, 150 또는 180분, 또는 ICH 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12시간, 또는 ICH 후 12, 18, 24, 30, 36 또는 40시간, 또는 ICH 후 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일, 또는 ICH 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주, 또는 상기의 임의의 조합 및/또는 임의의 이후 시간 중 임의의 하나 이상으로 투여되는 방법.

III

본원에 사용된 용어 "a" 및 "an"은 하나 및 하나 이상; 적어도 하나를 의미한다. 복수형이 본원에 사용되는 경우, 그것은 일반적으로 단수형을 포함한다.

"세포 은행"은 장래의 사용을 위해 성장 및 저장된 세포에 대한 산업 명명법(industry nomenclature)이다. 세포는 분취량으로 저장될 수 있다. 그들은 저장소로부터 직접 사용될 수 있거나 저장 후 확장될 수 있다. 이는 투여에 이용 가능한 "기성품(off the shelf)" 세포가 존재하기 때문에 편리하다. 세포는 이미 약제학적으로 허용되는 부형제에 저장될 수 있어서, 그들은 직접 투여될 수 있거나 또는 저장소로부터 방출될 때 적절한 부형제와 혼합될 수 있다. 세포는 동결될 수 있거나 또는 생존력을 보존하기 위한 형태로 저장될 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 세포가 본 출원에 기재된 효과를 달성하기 위해 강화된 효능을 위해 선택된 세포 은행이 생성된다. 저장소로부터 방출 후 및 투여 전에, 효능에 대해 세포를 다시 검정하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 본 출원에 기재되거나 당업계에 공지된 직접 또는 간접 검정 중 임의의 것을 사용하여 수행될 수 있다. 이어서, 목적하는 효능을 갖는 세포를 투여할 수 있다. 은행은 자가 세포(장기 공여자 또는 수용자로부터 유도됨)를 사용하여 제조될 수 있다. 또는 은행은 동종이계 사용을 위한 세포를 함유할 수 있다.

본원에 사용된 "공투여하다"는 2개 이상의 제제의 동시 또는 순차적 투여를 포함하여 서로 함께, 함께, 협력하여 투여하는 것을 의미한다.

본원에 사용된 "포함하는"은 다른 제한 없이 포함될 수 있는 것에 대한 임의의 자격 또는 배제 없이 필연적으로 지시 대상을 포함함을 의미한다. 예를 들어, "x 및 y를 포함하는 조성물"은 다른 성분이 조성물에 존재할 수 있는지에 상관없이 x 및 y를 함유하는 임의의 조성물을 포함한다. 마찬가지로, "x의 단계를 포함하는 방법"은 x가 방법의 유일한 단계인지 또는 단계 중 단지 하나인지와 관계없이, 얼마나 많은 다른 단계가 존재할 수 있는지, x가 그들에 비해 얼마나 간단하든 복잡하든 상관없이 x가 수행되는 임의의 방법을 포함한다. 어근 "포함하다"를 사용하는 "~로 구성된" 및 유사한 문구는 본원에서 "포함하는"의 동의어로 사용되고 동일한 의미를 갖는다.

본원에서 사용된 "~로 구성된"은 "포함하는"(상기 참조)의 동의어이다.

"조절된 세포 배양 배지"는 당업계에 익히 공지된 용어이고, 세포가 성장한 배지를 지칭한다. 본원에 사용된 상기 문구는 배지가 조절되는 특정 유형의 세포 성장에 효과적인 인자를 분비하기에 충분한 시간 동안 배지에서 세포가 성장함을 의미한다.

"감소하다" 및 "감소하는" 및 유사한 용어는 본원에서 일반적으로 다른 양, 값 또는 효과와 비교하여 양 또는 값 또는 효과가 감소하는 것을 의미하기 위해 사용된다. 예를 들어, ICH의 중증도를 감소시키는 것은 각각 ICH로 인한 이전 용적 또는 기능적 손상과 비교하는 것과 같이 혈종 용적을 감소시키고/시키거나 기능적 손상을 감소시키는 것을 의미할 수 있다.

본원에 사용된 "유효량"은 일반적으로 목적하는 국소 또는 전신 효과를 제공하는 양을 의미한다. 예를 들어, 유효량은 유익하거나 목적하는 임상 결과를 달성하기에 충분한 양이다. 예를 들어, ICH를 치료하기 위한 유효량은 혈종 용적을 감소시키고/시키거나 뇌 순환 및/또는 관류를 개선 및/또는 증가시키고/시키거나; 신경학적 및/또는 기능적 손상을 감소시키고/시키거나 운동 기능, 균형 등과 같은 기능을 개선시키는 양이다.

유효량은 단일 투여로 한 번에 모두 제공될 수 있거나 몇몇 투여로 유효량을 제공하는 분량으로 제공될 수 있다. 유효량으로 고려될 수 있는 양의 정확한 결정은 사이즈, 나이, 손상, 및/또는 치료 중인 질환 또는 손상, 및 손상이 발생되거나 질환이 시작된 이후의 시간의 양을 포함하는 각 대상체에 대한 개별 인자에 기초할 수 있다. 당업자는 당업계에서 일상적인 이들 고려 사항에 기초하여 주어진 대상체에 대한 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 본원에 사용된 "유효 투여량"은 "유효량"과 동일한 의미이다.

본원에 사용된 "유효 경로"는 일반적으로 목적하는 구획, 시스템 또는 위치에 제제의 전달을 제공하는 경로를 의미한다. 예를 들어, 유효 경로는 제제가 유익한 또는 목적하는 임상 결과를 달성하기에 충분한 제제의 양을 목적하는 작용 부위에 제공하기 위해 투여될 수 있는 경로이다.

본원에 사용된 "ICH"는 "뇌내 출혈"의 약어이며, 이와 동일한 의미를 갖는다.

본원에 사용된 "포함한다(includes)" 및 "포함하는(including)"은 제한적이지 않고, "포함한다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 매우 동일한 의미이다.

본원에 사용된 "증가하다" 및 "증가하는"은 (제로 또는 불활성 상태로부터) 유도하는 것을 포함하여 생물학적 사건 또는 특성과 같은 크기, 양, 강도 또는 정도에서 더 크게 만드는 것을 의미한다. 예를 들어, ICH를 치료하기 위한 유효량은, 예를 들어, 뇌 순환 및/또는 관류를 증가시키고/시키거나; 이전 ICH 이후 기능과 비교하는 것과 같이 운동 기능, 균형 등과 같은 기능을 개선시키는 양이다.

"뇌내 출혈 출혈"("ICH")은 뇌 조직, 뇌실, 또는 둘 다로의 두개내 출혈이다. ICH의 원인은 동맥류, 동정맥 기형, 뇌 종양 및 뇌 외상 중 임의의 하나 이상으로 인한 출혈 또는 이들의 결과로서의 출혈을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. ICH는 또한 "뇌 출혈"로서 지칭되기도 한다.

본원에 사용된 용어 "단리된"은 생체내 세포 또는 세포들과 관련된 하나 이상의 세포 또는 하나 이상의 세포 성분과 관련되지 않은 세포 또는 세포들을 지칭한다. "농축된 집단"은 생체내 또는 1차 배양에서 하나 이상의 다른 세포 유형에 비해 목적하는 세포의 수의 상대적 증가를 의미한다.

그러나, 본원에 사용된 용어 "단리된"은 줄기 세포만의 존재를 나타내지 않는다. 오히려, 용어 "단리된"은 세포가 그들의 천연 조직 환경으로부터 제거되고 정상 조직 환경과 비교하여 더 높은 농도로 존재함을 나타낸다. 따라서, "단리된" 세포 집단은 줄기 세포 이외에 세포 유형을 추가로 포함할 수 있으며, 추가의 조직 성분을 포함할 수 있다. 이는 또한, 예를 들어, 세포 배가의 관점에서 표현될 수 있다. 세포는 생체내 또는 그의 원래 조직 환경(예: 골수, 말초 혈액, 지방 조직 등)에서 그의 원래 수와 비교하여 풍부해지도록 시험관내 또는 생체외에서 10, 20, 30, 40 또는 그 이상의 배가를 겪을 수 있다.

"MAPC"는 "다능성 성체 전구 세포"의 약어이다. 그것은 배아 줄기 세포 또는 생식 세포가 아닌 세포를 지칭한다. MAPC는 다수의 대안적 설명으로 특성화될 수 있으며, 이들 각각은 그들이 발견되었을 때 세포에 대해 신규성을 부여했다. 따라서, 그들은 이들 설명 중 하나 이상에 의해 특성화될 수 있다. 첫째로, 그들은 유전적 조작, 형질전환되지 않고(종양형성성) 정상 핵형을 포함하여 배양에서 복제 용량을 확장시켰다. 이는 이러한 세포가 텔로머라제를 발현한다(즉, 텔로머라제 활성을 갖는다)는 것을 의미한다. 둘째로, 그들은 분화시 2개 또는 모두 3개의 배엽(즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽)과 같은 하나 이상의 배엽의 세포 자손을 생성할 수 있다. 셋째로, 그들이 배아 줄기 세포 또는 생식 세포가 아니지만, 그들은 이러한 원시 세포 유형의 마커를 발현하여 MAPC가 oct4, rex-1 및 rox-1 중 하나 이상을 발현할 수 있도록 할 수 있다. 그들은 또한 sox2를 발현할 수 있다. Rex-1은 oct4에 의해 제어되고, 이는 rex-1의 다운스트림 발현을 활성화시킨다. Rox-1 및 sox-2는 비-ES 세포에서 발현된다. 따라서, "MAPC"로 지정된 세포 유형은 그의 신규한 특성 중 일부를 통해 세포를 기재하는 대안적인 기본 특성에 의해 특성화될 수 있다.

MAPC에서 용어 "성체"는 비제한적이다. 이는 비배아 체세포, 예를 들어, 출생후를 지칭한다. MAPC는 생체내에서 기형종을 형성하지 않는다. 이 약어는 골수에서 단리된 다능성 세포를 기재하기 위해 미국 특허 제7,015,037호에 처음 사용되었다. 그러나, 다능성 마커 및/또는 분화 가능성을 갖는 세포가 후속적으로 발견되었고, 본 발명의 목적을 위해, 처음에 "MAPC"로 지정된 세포와 동등할 수 있다. MAPC 유형의 세포에 대한 필수적인 설명은 상기 발명의 요약에 제공된다.

MAPC는 MSC보다 더 원시적인 전구 세포 집단을 나타낸다(참조: Verfaillie, C.M., Trends Cell Biol 12:502-8 (2002); Jahagirdar, B.N., et al., Exp Hematol, 29:543-56 (2001); Reyes, M. and C.M. Verfaillie, Ann N Y Acad Sci, 938:231-233 (2001); Jiang, Y. et al., Exp Hematol, 30896-904 (2002); and Jiang, Y. et al., Nature, 418:41-9. (2002))

MAPC는 면역원성이 아닐 수 있다. MAPC는 면역억제제일 수 있다. MAPC는 특성을 개선시키기 위해 유전적으로 변경되거나 변경되지 않을 수 있다. MAPC는 보조 면역억제 치료를 사용하거나 사용하지 않고 사용되거나 사용되지 않을 수 있다. MAPC의 추가 측면이 본원에 기재되어 있다.

본원에 사용된 "~할 수 있다", 단어 "~할 수 있다"는 "임의로"와 동일한 의미이며, 기재되지 않은 경우에도, 본원에 사용된 바와 같이, "~할 수 있다"는 또한 "~하지 않을 수 있다"도 또한 포함한다. 즉, 어떤 것이 존재할 수 있다는 진술은 또한 그것이 아닐 수도 있음을 의미한다. 즉, 본원에 사용된 "~할 수 있다"는 명시적으로 "~하지 않을 수 있다"를 포함하고, 출원인은 이에 따라 주제를 청구할 권리를 보유한다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이, MAPC가 다른 제제와 함께 투여될 수 있다는 진술은 또한 MAPC가 임의의 다른 제제 없이 투여될 수 있음을 의미한다. EH 다른 예로서, 본원에서 사용된 바와 같이, MAPC가 유전적으로 조작될 수 있다는 진술은 또한 MAPC가 유전적으로 조작되지 않을 수 있음을 의미한다.

본원에서 사용된 MAPC와 관련하여, "다능성"은 분화시 3개의 1차 배엽: 내배엽, 중배엽 및 외배엽 중 하나 이상, 예를 들어, 2개 또는 모두 3개의 세포 계통을 일으키는 MAPC의 능력을 지칭한다.

"MultiStem®"은 미국 특허 제7,015,037호의 MAPC, 즉, 상기 기재된 바와 같은 비배아 줄기, 비생식 세포에 기초한 세포 제제의 상표명이다. "MultiStem®"은 본 특허 출원에 개시된 세포 배양 방법, 특히 저산소 및 고혈청에 따라 제조된다. "MultiStem®"은 매우 확장가능하고, 핵형이 정상이며 생체내에서 기형종을 형성하지 않는다. 그것은 하나 이상의 배엽의 세포 계통으로 분화할 수 있고, 텔로머라제, oct4, rex-1, rox-1 및 sox-2 중 하나 이상을 발현시킬 수 있다.

"Oct-4"는 전사 인자(1)의 POU 계열의 구성원이다. 마우스 단백질이 먼저 동정되었고 Oct-3으로 분류되었다. 인간 동족체는 처음에 아미노산 수준에서 마우스 Oct-3 단백질과의 87% 상동성에 기초하여 Oct-3으로 분류되었다. 이어서, 2개의 인간 Oct-3 전사체가 동정되었고(참조: Takeda, et al. Nucleic Acids Research 20(17) 4613-20 (1992)), Oct-3A 및 3B, 이들은 동일한 유전자의 대체 스플라이스 생성물이다. Oct-3A가 동정되었고, 일부 그룹에 의해 Oct-4로, 다른 그룹에 의해 Oct-3/4으로 개명되었다. 또 다른 그룹은 oct 4를 대체 전사체로서 oct 4A 및 oct4B로 나누었다. 핵 단백질을 생성하는 A 전사체(즉, oct 4, oct3A, oct3/4)는 다능성과 관련되어 있고, 엑손 1의 일부에 국한된다. B 전사체는 수많은 세포 유형에서 세포질 단백질로서 발견되고 엑손 2-5뿐만 아니라 엑손 1의 나머지를 포함한다.

본원에 사용된 "임의로"는 "~할 수 있다"와 매우 동일한 의미이다. X가 본원에 사용된 A를 임의로 포함한다는 서술은 X가 A를 포함하는 경우 및 X가 A를 포함하지 않는 경우 둘 다를 포함한다.

"약제학적으로 허용되는 담체"는 본 발명에서 사용되는 세포에 대한 임의의 약제학적으로 허용되는 배지이다. 이러한 배지는 등장성, 세포 대사, pH 등을 보유할 수 있다. 이는 대상체에의 생체내 투여와 호환가능하며, 따라서 세포 전달 및 치료에 사용될 수 있다.

"전구 세포"는 그들의 말단 분화된 자손의 특성의 전부는 아니지만 일부를 갖는 줄기 세포의 분화 동안 생성된 세포이다. "심장 전구 세포"와 같은 정의된 전구 세포는 특이적 또는 말단 분화된 세포 유형이 아니라 계통에 전념된다. 약어 "MAPC"에 사용된 용어 "전구체"는 이들 세포를 특정 계통으로 제한하지 않는다.

본원에 사용된 용어 "감소하다"는 감소 뿐만 아니라 예방함을 의미한다. 치료의 맥락에서, "감소하다"는 하나 이상의 임상 증상을 예방 또는 개선하는 것이다. 임상 증상은, 치료하지 않고 방치할 경우, 대상체의 삶의 질(건강)에 부정적인 영향을 미치거나 미칠 수 있는 것(또는 그 이상)이다.

목적하는 수준의 효능을 갖는 세포를 "선택하는 것"은 세포를 동정(검정에 의해), 단리 및 확장함을 의미할 수 있다. 이는 세포가 단리된 부모 세포 집단보다 높은 효능을 갖는 집단을 생성할 수 있다. "부모" 세포 집단은 선택된 세포가 분할된 부모 세포를 지칭한다. "부모"는 실제 P1 → F1 관계(즉, 자손 세포)를 지칭한다. 따라서, 세포 X가 세포 X 및 Y의 혼합 집단으로부터 단리되고, 여기서 X는 발현자이고 Y는 그렇지 않은 경우, X의 단순한 단리물은 향상된 발현을 갖는 것으로 분류되지 않을 것이다. 그러나, X의 자손 세포가 더 높은 발현자이면, 자손 세포는 향상된 발현을 갖는 것으로 분류될 것이다.

본원에 사용된 "자가 재생"은 그들이 생성된 것들과 동일한 분화 가능성을 갖는 복제 딸 줄기 세포를 생성하는 능력을 지칭한다. 이러한 맥락에서 사용되는 유사한 용어는 "증식"이다.

본원에 사용된 "줄기 세포"는 자가 재생(즉, 동일한 분화 가능성을 갖는 자손)을 겪을 수 있고, 또한 분화 가능성이 더 제한된 자손 세포를 생성할 수 있는 세포를 의미한다.

본원에 사용된 "대상체"는 척추동물, 예를 들어, 인간과 같은 포유동물을 의미한다. 포유동물은 인간, 개, 고양이, 말, 소 및 돼지를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 용어 "치료적 유효량"은 대상체에서 임의의 유익한 치료 반응을 생성하도록 결정된 양을 지칭한다. 예를 들어, 치료 세포 또는 세포 관련 제제의 유효량은 환자의 생존성을 연장하고/하거나 명백한 임상 증상을 억제할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어의 의미 내에서 치료적으로 효과적인 치료는, 그들이 그 자체로 질환 결과를 개선하지 않더라도 대상체의 삶의 질을 개선하는 치료를 포함한다. 예를 들어, 치료적으로 효과적이다는 것은 출혈 용적을 감소시키고, 뇌혈류를 개선하고/하거나 ICH 추적과 같은 신경학적 및/또는 거동적 기능을 개선시킴을 의미할 수 있다. 이러한 치료적 유효량은 당업자에 의해 용이하게 확인된다.

"치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 본 발명과 관련하여 광범위하게 사용되고, 각각의 이러한 용어는 본질적으로 본원에 기재된 바와 같은 세포의 투여, 특히 요법을 방해하고/하거나 요법으로부터 생성되는 것들을 포함하여 결핍, 기능 장애, 질환 또는 기타 유해한 과정을 예방, 개선, 억제 또는 치료하는 것의 반드시 일부 또는 전부는 아니지만 하나 이상의 유익한 효과를 갖는 유리한 구현예를 의미한다. 예를 들어, 치료하는 것은 출혈 용적을 감소시키고, 뇌혈류를 개선하고/하거나 ICH 추적과 같은 신경학적 및/또는 거동적 기능을 개선시킴을 의미할 수 있다. 이러한 치료의 측면은 당업자에 의해 용이하게 확인된다.

본원에 사용된 "입증하다"는 확인함을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 세포가 목적하는 효능을 갖는 발현자임을 확인한다. 이는 그 세포를 합리적인 기대 효능으로 (치료, 뱅킹, 약물 스크리닝 등에) 사용할 수 있도록 하기 위한 것이다. 따라서, 입증하는 것은 원래 목적하는 활성을 갖는 것으로 발견된/확립된 세포가 실제로 그 활성을 유지하는지를 확인함을 의미한다. 따라서, 입증은 원래의 결정 및 후속 결정을 포함하는 2개의 이벤트 과정 중 입증 이벤트이다. 제2 이벤트는 본원에서 "입증"으로 지칭된다.

III
본원에 기재된 구현예의 다양한 특징 및 이점은 첨부되는 도면에 비추어 고려될 때 더 잘 이해됨에 따라 완전히 인식될 수 있다:
도 1a 및 도 1b: MULTISTEM® 세포는 콜라게나제 유도 ICH 후 혈종 용적을 감소시킨다
위약(PBS, n = 10) 또는 MultiStem®(n = 11)을 콜라게나제 유도 ICH 후 2시간에 마우스에 정맥내 투여하였다. 혈종 용적은 7T 소형 동물 MRI를 사용하여 MRI(T2W)에 의해 평가되었다. 3일째 및 7일째의 대표적인 관상 뇌 이미지가 제공된다:
도 1a는 혈종 용적에 대한 MultiStem® 세포의 극적인 이점을 도시한다.
도 1b는 21일 평가 기간에 걸친 모든 마우스로부터의 데이터를 도시한다.
데이터는 평균 +/- SEM으로 제시되고, 각 시점 내에서 스튜던츠 t-테스트(Student's t-test)에 의해 분석되었다. ^**p < 0.01 대 위약 처리된 ICH 마우스.
세부사항은 실시예 3에 제공된다.
도 2a 및 도 2b: MULTISTEM® 세포는 콜라게나제 유도 ICH 후 뇌 관류를 개선한다
위약(PBS, n = 10) 또는 MultiStem®(n = 11)을 콜라게나제 유도 ICH 후 2시간에 마우스에 정맥내 투여하였다. 뇌 관류는 7T 소형 동물 MRI를 사용하여 MRI(ASL;FAIR-RARE)에 의해 평가되었다.
도 2a- 대표적인 관상 뇌 이미지.
도 2b- 정량화된 관류 데이터.
데이터는 MultiStem®이 ICH 후 첫 주 동안 뇌 관류를 개선함을 나타낸다. 데이터는 평균 +/- SEM으로 제시되고, 각 시점 내에서 스튜던츠 t-테스트에 의해 분석되었다. ^*p < 0.05, ^**p < 0.01 대 위약 처리된 ICH 마우스.
세부사항은 실시예 4에 제공된다.
도 3a, 도 3b 및 도 3c: MULTISTEM® 세포는 콜라게나제 유도 ICH 후 운동 기능을 개선한다
위약(PBS, n = 10) 또는 MultiStem®(n=1)을 콜라게나제 유도 ICH 후 2시간에 마우스에 정맥내 투여하였다. 운동 기능의 신경학적 평가는 손상 후 7일째에 (또는 모의 수술된 마우스에서; n = 8) 평가되었다.
도 3a- 그립 강도 테스트 결과.
도 3b- 좁은 빔 작업 테스트 결과.
도 3c- 상승된 신체 스윙 작업 테스트 결과.
데이터는 평균 +/- SEM이고, 일원 ANOVA에 이어, 터키 사후 테스트(Tukey's post-hoc test)를 사용하여 비교하였다. ^* p < .05, ^**p < 0.01, ^*** p < 0.001, ns = 유의하지 않음.
세부사항은 실시예 5에 제공된다.

V

본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 측면은 출혈성 뇌졸중으로 공지된 뇌내 출혈성 출혈을 경험한 대상체에게 MAPC(본원에 정의된 바와 같음)의 투여에 관한 것이다. 이러한 환자는 뇌에서 혈전의 크기 및 위치가 수술이 가능한 경우, 외과적 혈전 제거 외에 치료 개입을 갖지 않는다.

본원에 기재된 본 발명의 측면은 뇌내 출혈을 앓고 있고/있거나 이의 치료를 필요로 하는 대상체에게 세포를 투여하여 뇌내 출혈을 예방, 개선, 억제 또는 치료하는 것의 반드시 일부 또는 전부는 아니지만 하나 이상의 유익한 효과를 갖도록 하기 위한 방법을 제공한다. 이에 따른 세포 및 방법은 이하 기재된 바와 같다.

본 발명의 구현예는 ICH 발병 후, 예를 들어, 아급성 시간 프레임(시간)으로 정맥내 경로를 통해 MultiStem® 세포의 투여를 제공한다. 투여는 효과적인 것으로 밝혀질 수 있는 다양한 경로 및 시간에 의해 수행될 수 있다.

임의의 특정 작용 기전에 제한되지 않고, MultiStem® 세포가 다른 전임상 및 임상 손상에서 급성 염증 반응을 조절한다는 점이 주시된다. ICH 치료에서 MultiStem®의 작용은 일부 측면에서 ICH 후에 발생하는 급성 염증 반응에 대한 MultiStem®의 유사한 작용에 의해 매개될 수 있다.

세포는 자연적으로 이러한 효과를 달성할 수 있다(즉, 유전적으로 또는 약제학적으로 변형되지 않음). 그러나, 세포는 또한 유효성을 증가시키고/시키거나 그들의 특성을 개선하기 위해 유전적으로 또는 약제학적으로 변형될 수 있다.

하나의 구현예에서, 세포는 배양에서 목적하는 수의 세포 배가를 겪었다. 예를 들어, 세포는 배양에서 적어도 10 내지 40 세포 배가, 예를 들어, 30 내지 35 세포 배가를 겪었고, 여기서 세포는 형질전환되지 않고 정상 핵형을 갖는다. 세포가 형질전환되거나 종양형성성이고, 그들을 주입에 사용하는 것이 바람직한 경우, 이러한 세포는 비활성화되어 종양으로의 세포 증식을 방지하는 치료에 의해 생체내에서 종양을 형성할 수 없게 될 수 있다. 이러한 치료는 당업계에 익히 공지되어 있다.

ES, EG 및 생식 세포에 특이적인 Oct4는 광범위한 분화 능력을 갖는 미분화 세포의 마커인 것으로 간주된다. Oct4는 또한 일반적으로 세포를 미분화 상태로 유지하는 역할을 하는 것으로 생각된다. Oct4는 전사 인자의 POU(Pit Oct Unc) 계열에 속하며, 프로모터 또는 인핸서 영역 내에서 "8량체 모티프"라 칭명되는 8량체 서열을 함유하는 유전자의 전사를 활성화할 수 있는 DNA 결합 단백질이다. Oct4는 난 실린더가 형성될 때까지 수정된 접합체의 절단 단계의 순간에서 발현된다. Oct4의 기능은 분화 유도 유전자(즉, FoxaD3, hCG)를 억제하고, 다능성을 촉진하는 유전자(FGF4, Utfl, Rexl)를 활성화시키는 것이다. 높은 이동성 그룹(HMG) 박스 전사 인자의 구성원인 Sox2는 Oct4와 협력하여 내부 세포 질량에서 발현되는 유전자의 전사를 활성화시킨다. 배아 줄기 세포에서 Oct4 발현이 특정 수준 사이에서 유지되는 것이 필수적이다. Oct4 발현 수준의 > 50%의 과발현 또는 하향조절은 각각 원시적 내배엽/중배엽 또는 영양외배엽의 형성과 함께 배아 줄기 세포 운명을 변경할 것이다. 생체내에서, Oct4 결핍 배아는 배반포 단계로 발달하지만, 내부 세포 질량 세포는 다능성이 아니다. 대신에, 그들은 배아외 영양막 계통에 따라 분화한다.

포유동물 스팔트 전사 인자인 Sall4는 Oct4의 업스트림 조절자이고, 따라서 발생학의 초기 단계 동안 Oct4의 적절한 수준을 유지하는 것이 중요하다. Sall4 수준이 특정 임계치 이하로 떨어지면, 영양외배엽 세포가 내부 세포 질량으로 이소적으로(ectopically) 확장될 것이다.

상기 세포는 넘버링된 구현예의 특성을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:

pb1. 단리 확장된 비배아 줄기, 비생식 세포로서, 상기 세포가 배양에서 적어도 10 내지 40 세포 배가를 겪고, 상기 세포가 oct4를 발현하고, 형질전환되지 않고, 정상 핵형을 갖는, 단리 확장된 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb2. 상기 항목 1에 있어서, 텔로머라제, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 하나 이상을 추가로 발현하는, 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb3. 상기 항목 1에 있어서, 적어도 2개의 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통의 적어도 하나의 세포 유형으로 분화할 수 있는, 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb4. 상기 항목 3에 있어서, 텔로머라제, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 하나 이상을 추가로 발현하는, 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb5. 상기 항목 3에 있어서, 각각의 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통의 적어도 하나의 세포 유형으로 분화할 수 있는, 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb6. 상기 항목 5에 있어서, 텔로머라제, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 하나 이상을 추가로 발현하는, 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb7. 비배아, 비생식 조직의 배양에 의해 수득된 단리 확장된 비배아 줄기, 비생식 세포로서, 상기 세포가 배양에서 적어도 40 세포 배가를 겪었으며, 상기 세포가 형질전환되지 않고 정상 핵형을 갖는, 단리 확장된 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb8. 상기 항목 7에 있어서, oct4, 텔로머라제, rex-1, rox-1 또는 sox-2 중 하나 이상을 발현하는, 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb9. 상기 항목 7에 있어서, 적어도 2개의 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통의 적어도 하나의 세포 유형으로 분화할 수 있는, 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb10. 상기 항목 9에 있어서, oct4, 텔로머라제, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 하나 이상을 발현하는, 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb11. 상기 항목 9에 있어서, 각각의 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통의 적어도 하나의 세포 유형으로 분화할 수 있는, 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb12. 상기 항목 11에 있어서, oct4, 텔로머라제, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 하나 이상을 발현하는, 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb13. 단리 확장된 비배아 줄기, 비생식 세포로서, 상기 세포가 배양에서 적어도 10 내지 40 세포 배가를 겪었으며, 상기 세포가 텔로머라제를 발현하고, 형질전환되지 않고 정상 핵형을 갖는, 단리 확장된 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb14. 상기 항목 13에 있어서, oct4, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 하나 이상을 추가로 발현하는, 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb15. 상기 항목 13에 있어서, 적어도 2개의 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통의 적어도 하나의 세포 유형으로 분화할 수 있는, 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb16. 상기 항목 15에 있어서, oct4, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 하나 이상을 추가로 발현하는, 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb17. 상기 항목 15에 있어서, 각각의 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통의 적어도 하나의 세포 유형으로 분화할 수 있는, 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb18. 상기 항목 17에 있어서, oct4, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 하나 이상을 추가로 발현하는, 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb19. 적어도 2개의 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통의 적어도 하나의 세포 유형으로 분화할 수 있는 단리 확장된 비배아 줄기, 비생식 세포로서, 상기 세포가 배양에서 적어도 10 내지 40 세포 배가를 겪은, 단리 확장된 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb20. 상기 항목 19에 있어서, oct4, 텔로머라제, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 하나 이상을 발현하는, 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb21. 상기 항목 19에 있어서, 각각의 내배엽, 외배엽, 및 중배엽 배아 계통의 적어도 하나의 세포 유형으로 분화할 수 있는, 비배아 줄기, 비생식 세포.

pb22. 상기 항목 21에 있어서, oct4, 텔로머라제, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 하나 이상을 발현하는, 비배아 줄기, 비생식 세포.

세포 선택

MAPC는 본원에 기재된 바와 같이 단리되고 확장된 상태로 사용될 수 있다. MAPC는 또한 유전 공학 기술을 사용하거나 사용하지 않고 사용 전에 특정 특성을 위해 선택될 수 있다.

목적하는 수준의 효능을 갖는 세포를 선택하는 것은 세포를 동정하고(검정에 의해), 단리하고 확장시킴을 의미할 수 있다. 이는 세포가 단리된 부모 세포 집단보다 더 높은 효능을 갖는 집단을 생성할 수 있다. "부모" 세포 집단은 선택된 세포가 분할된 부모 세포를 지칭한다. "부모"는 실제 P1 → F1 관계(즉, 자손 세포)를 지칭한다. 따라서, 세포 X가 세포 X 및 Y의 혼합 집단으로부터 단리되고, 여기서 X는 발현자이고 Y는 그렇지 않은 경우, X의 단순한 단리물은 향상된 발현을 갖는 것으로 분류하지 않을 것이다. 그러나, X의 자손 세포가 더 높은 발현자이면, 자손 세포는 향상된 발현을 갖는 것으로 분류할 것이다.

목적하는 효과를 달성하는 세포를 선택하는 것은 세포가 목적하는 효과를 달성하는지를 결정하는 검정을 모두 포함하고, 또한 이들 세포를 수득하는 것을 포함할 것이다. 세포는 효과가 외인성 도입유전자/DNA에 의해 달성되지 않는다는 점에서 목적하는 효과를 자연적으로 달성할 수 있다. 그러나, 효과적인 세포는 효과를 증가시키는 제제와 함께 배양되거나 이에 노출됨으로써 개선될 수 있다. 효과적인 세포가 선택되는 세포 집단은 검정을 수행하기 전에 효능을 갖는 것으로 공지되지 않을 수 있다. 상기 세포는 검정을 수행하기 전에 목적하는 효과를 달성하는 것으로 공지되지 않을 수 있다. 효과는 유전자 발현 및/또는 분비에 따라 좌우될 수 있기 때문에, 그 효과를 야기하는 하나 이상의 유전자에 기초하여 선택할 수도 있다.

선택은 조직 내의 세포로부터 이루어질 수 있다. 예를 들어, 이 경우, 세포는 목적하는 조직으로부터 단리되어, 배양에서 확장되고, 목적하는 효과를 달성하기 위해 선택되고, 선택된 세포는 추가로 확장된다.

선택은 또한 배양 중인 세포와 같이 생체외 세포로부터 이루어질 수도 있다. 이 경우, 배양 중 하나 이상의 세포는 목적하는 효과를 달성하기 위해 검정될 것이고, 목적하는 효과를 달성하는 수득된 세포는 추가로 확장될 수 있다.

세포는 또한 향상된 능력을 위해 선택되어 목적하는 효과를 달성할 수 있다. 이 경우, 향상된 세포가 수득된 세포 집단은 이미 목적하는 효과를 갖는다. 향상된 효과는 모집단에서보다 세포당 더 높은 평균 양을 의미한다.

향상된 세포가 선택되는 모집단은 실질적으로 동종(동일한 세포 유형)일 수 있다. 이러한 집단으로부터 이러한 향상된 세포를 수득하기 위한 한 가지 방법은 단일 세포 또는 세포 풀을 생성하고, 이러한 세포 또는 세포 풀을 검정하여 향상된(더 큰) 효과를 자연적으로 갖는 클론을 수득하고(효과를 유도하거나 증가시키는 조절제로 세포를 처리하는 것과 대조적으로), 이어서 자연적으로 향상된 세포를 확장시키는 것이다.

그러나, 세포는 효과를 유도하거나 증가시키는 하나 이상의 제제로 처리될 수 있다. 따라서, 실질적으로 균질한 집단은 효과를 향상시키기 위해 처리될 수 있다.

집단이 실질적으로 균질하지 않은 경우, 처리될 부모 세포 집단은 향상된 효과가 추구되는 목적하는 세포 유형을 적어도 100개, 더욱 바람직하게는 적어도 1,000개의 세포, 더욱 더 바람직하게는 적어도 10,000개의 세포를 함유하는 것이 바람직하다. 치료 후, 이러한 서브집단은 공지된 세포 선택 기술에 의해 이종 집단으로부터 회수될 수 있고, 필요에 따라 추가로 확장될 수 있다.

따라서, 목적하는 수준의 효과는 주어진 선행 집단의 수준보다 더 높은 수준일 수 있다. 예를 들어, 조직으로부터 1차 배양에 넣고, 구체적으로 효과를 생성하도록 설계되지 않은 배양 조건에 의해 확장 및 단리된 세포는 모집단을 제공할 수 있다. 이러한 모집단은 세포당 평균 효과를 향상시키기 위해 처리되거나 의도적인 치료 없이 더 큰 정도의 효과를 발현하는 집단 내의 세포 또는 세포들에 대해 스크리닝될 수 있다. 그런 다음, 이러한 세포를 확장하여 더 높은(목적하는) 발현을 갖는 집단을 제공할 수 있다.

사용 및 투여

일부 구현예에서, 세포는 요법의 유일한 활성제로서 사용된다. 본 발명의 일부 구현예에서, MAPC는 하나 이상의 다른 제제 및/또는 1차 치료 양식으로서 치료 양식과 함께 사용된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 세포는 보조 치료 양식으로서, 즉 또 다른 1차 치료 양식에 대한 보조제로서 사용된다. 일부 구현예에서, 세포는 보조 치료 양식의 유일한 활성제로서 사용된다. 다른 것들 중에서, 세포는 하나 이상의 다른 제제 또는 치료 양식과 함께 보조 치료 양식으로서 사용된다. 일부 구현예에서, 세포는 1차 및 보조 치료제 및/또는 양식으로서 모두 사용된다. 양 측면에서, 세포는 1차 및/또는 보조 양식에서 단독으로 사용될 수 있다. 그들은 또한 1차 또는 보조 양식에서 또는 둘 다에서 다른 치료제 또는 양식과 함께 사용될 수 있다.

상기 논의된 바와 같이, 치료제, 요법, 및/또는 치료 양식과 같은 1차 치료는 치료될 질환과 같은 1차 기능 장애를 표적으로 한다(즉, 이에 작용하도록 의도된다). 요법 및/또는 치료 양식과 같은 보조 치료는 1차 치료, 예를 들어, 치료제, 요법 및/또는 치료 양식과 조합하여 투여되어 질환과 같은 1차 기능 장애에 작용하고 1차 치료 효과를 보완하여 치료 섭생의 전반적인 효능을 증가시킬 수 있다. 제제, 요법, 및/또는 치료 양식과 같은 보조 치료는 또한 질환과 같은 1차 기능 장애의 합병증 및/또는 부작용 및/또는 치료, 예를 들어, 치료제, 요법 및/또는 치료 양식에 의해 유발된 것들에 작용하기 위해 투여될 수 있다. 임의의 이러한 용도와 관련하여, 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 1차 치료가 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 보조 치료와 함께 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, MAPC는 ICH 발병 전에 대상체에게 투여된다. 구현예에서, 세포는 ICH 및/또는 결과적인 기능 장애가 진행되는 동안 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 ICH 및/또는 결과적인 기능 장애가 확립된 후에 투여된다. MAPC는 ICH 또는 관련 기능 장애의 발달, 지속 및/또는 전파 중 임의 단계에서 또는 후퇴한 후에 투여될 수 있다.

세포는 ICH 전 또는 후 1, 5, 10, 15, 30, 45 또는 60분, 또는 ICH 전 또는 후 60, 90, 120, 150 또는 180분, 또는 ICH 전 또는 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12시간, 또는 ICH 후 12, 18, 24, 30, 36 또는 40시간, 또는 ICH 후 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일, 또는 ICH 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주, 또는 상기의 임의의 조합 및/또는 임의의 이후 시간 중 어느 하나 이상에 투여될 수 있다.

세포를 ICH 후 즉시 내지 60분, ICH 후 30 내지 90분, ICH 후 1 내지 6시간, ICH 후 5 내지 15시간, ICH 후 10 내지 20시간, ICH 후 15 내지 25시간, ICH 후 20 내지 40시간, ICH 후 1 내지 5일, ICH 후 1일 내지 1주, ICH 후 1 내지 2주, ICH 후 1 내지 수 주, ICH 후 수 주 내지 1개월, ICH 후 1개월 또는 수 개월, ICH 후 아무 때나 투여될 수 있다.

세포는 또한 ICH 전, ICH 전에 언제든지 또는 상기 두 단락에서 언급된 ICH 전 임의의 시간 또는 간격으로 투여될 수 있다.

상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 구현예는 1차 또는 보조 요법을 위한 세포 및 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 세포는 동종이계 대상체에게 투여된다(즉, 대상체에 대해 동종이계이다). 일부 구현예에서, 그들은 대상체에 대해 자가 조직이다. 일부 구현예에서, 그들은 대상체와 동계이다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체에 대해 이종이다. 동종이계, 자가, 동계 또는 이종이든 간에, 본 발명의 다양한 구현예에서, MAPC는 대상체에서 단지 약한 면역원성이거나 비면역원성이다. 구현예에서, MAPC는 조직 타이핑 및 매칭 없이 "보편적인" 공여자 세포로서 사용될 수 있는 동종이계 및/또는 이종 대상체에 투여될 때 일반적으로 불리한 면역 반응을 유발하지 않도록 충분히 낮은 면역원성 비면역원성이다.

또한, 이와 관련하여, 다양한 구현예에서 MAPC는 부가적인 면역억제제 치료 없이 투여될 수 있다. 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, MAPC는 또한 세포 은행에 저장 및 유지될 수 있고, 따라서 필요할 때 사용을 위해 이용 가능하게 유지될 수 있다.

이러한 모든 측면 및 기타 측면에서, 본 발명의 구현예는 하나의 구현예에서 인간을 포함하고, 다른 구현예에서, 비인간 영장류, 래트 및 마우스, 및 개, 돼지, 염소, 양, 말, 및 소를 포함하는 포유동물로부터 MAPC를 제공한다. 상기 기재된 바와 같은 포유동물로부터 제조된 MAPC는 본원에 기재된 본 발명의 방법 및 다른 측면 모두에 사용될 수 있다.

본 발명의 다양한 구현예에 따르는 MAPC는 골수, 말초 혈액, 제대혈, 혈액, 비장, 간, 근육, 뇌, 지방 조직, 태반 및 이하 논의된 기타를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 그들이 발견되는 이러한 포유동물의 다양한 구획 및 조직으로부터 단리될 수 있다. 일부 구현예에서 MAPC는 사용 전에 배양된다.

일부 구현예에서, MAPC는 골수로부터 단리된다. 이와 관련하여, 일부 특정 구현예에서, MAPC는 인간 골수에서 단리된다.

많은 구현예에서, MAPC는 유전적으로 조작되지 않는다.

일부 구현예에서, MAPC는 유전적으로 조작된다. MAPC는 당업계에 익히 공지된 것들과 같은 다양한 목적을 위해 유전적으로 조작될 수 있다. 예를 들어, 그들은 개선된 성장 특성을 갖고, 그들의 치료 효능을 개선시키고, 하나 이상의 외인성 유전자를 발현하여 유익한 물질을 생성하며, 그들의 면역학적 프로파일을 변경하도록 조작될 수 있다.

일부 구현예에서, 유전적으로 조작된 MAPC는 시험관내 배양에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 유전적으로 조작된 MAPC는 유전자도입 유기체로부터 생성된다.

제형

본원의 다른 곳에서 더 상세히 논의된 바와 같이, MAPC는 골수 세포와 같은 다양한 조직으로부터 제조될 수 있다.

많은 구현예에서, 대상체에게 투여하기 위한 MAPC의 순도는 약 100%이다. 다른 구현예에서, 그것은 95% 내지 100%이다. 일부 구현예에서, 그것은 85% 내지 95%이다. 특히 다른 세포와의 혼합물인 경우, MAPC의 백분율은 2%-5%, 3%-7%, 5%-10%, 7%-15%, 10%-15%, 10%-20%, 15%-20%, 20%-25%, 25%-30%, 30%-35%, 35%-40%, 40%-45%, 45%-50%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-95%일 수 있다.

일부 구현예에서, 투여를 위한 세포의 순도는 약 100%이다(실질적으로 균질하다). 다른 구현예에서, 그것은 95% 내지 100%이다. 일부 구현예에서, 그것은 85% 내지 95%이다. 특히, 다른 세포와의 혼합물인 경우, 백분율은 약 10%-15%, 15%-20%, 20%-25%, 25%-30%, 30%-35%, 35%-40%, 40%-45%, 45%-50%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-95%일 수 있다. 또는 단리/순도는 세포가 겪은 세포 배가의 관점에서, 예를 들어, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50 또는 그 이상의 세포 배가로 표현될 수 있다.

MAPC를 사용한 장애 또는 질환 등의 치료는 미분화 MAPC로 이루어질 수 있다. 치료는 또한 그들이 분화 경로에 전념하도록 처리된 MAPC로 이루어질 수 있다. 치료는 또한 제한된 분화 가능성을 갖는 덜 강력한 줄기 세포로 분화하도록 처리된 MAPC를 포함할 수 있다. 그것은 또한 말단 분화된 세포 유형으로 분화하도록 처리된 MAPC를 포함할 수 있다. MAPC의 최상의 유형 또는 혼합물은 그들의 특정 사용 상황에 의해 결정될 것이며, 이와 관련하여 MAPC의 효과적인 유형 또는 조합을 결정하는 것은 당업자에게 일상적인 설계의 문제일 것이다.

소정의 적용을 위해 MAPC를 투여하기 위한 제형의 선택은 다양한 인자에 좌우될 것이다. 이들 중 두드러진 것은 대상체의 종, 치료되는 뇌내 출혈의 특성, 대상체에서 이의 상태 및 분포, 투여되고 있는 다른 요법 및 제제의 특성, MAPC의 최적 투여 경로, 경로를 통한 MAPC의 생존력, 투여 섭생, 및 당업자에게 명백할 다른 인자일 것이다. 특히, 예를 들어, 적합한 담체 및 기타 첨가제의 선택은 정확한 투여 경로 및 특정 투여 형태의 특성에 의존할 것이다.

세포 생존은 MAPC를 사용한 요법의 효능의 중요한 결정인자일 수 있다. 이는 1차 및 보조 요법 모두에 대해서도 마찬가지이다. 표적 부위가 세포 시딩 및 세포 성장에 적합하지 않을 경우 또 다른 우려가 발생한다. 이는 치료적 MAPC가 있는 부위 및/또는 생착에 대한 접근을 방해할 수 있다. 구현예에서, 본 발명은 세포 생존율을 증가시키고/시키거나 시딩 및/또는 성장에 대한 장벽에 의해 제기된 문제를 극복하기 위한 수단의 사용을 포함한다.

조성물의 안정성, 무균성 및 등장성을 향상시키기 위해 다양한 첨가제, 예를 들어, 특히 항균성 방부제, 항산화제, 킬레이트제 및 완충제가 종종 포함될 것이다.

미생물의 작용 방지는, 예를 들어, 다양한 항균제 및 항진균제에 의해 보장될 수 있다.

약제학적으로 허용되는 방부제 또는 세포 안정화제를 사용하여 MAPC 조성물의 수명을 증가시킬 수 있다.

이러한 첨가제가 포함되면, MAPC의 생존력 또는 효능에 영향을 미치지 않을 조성물을 선택하는 것은 당업자의 이해 범위 내에 있다.

본원에 참고로 인용된 문헌["REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE," 17th edition, 1985]과 같은 표준 텍스트가 과도한 실험 없이 적절한 제제를 제조하기 위해 참고될 수 있다.

바람직한 구현예 중에는 국소, I.V. 주입 및 정위 주사용 용액을 포함하는 주사용 용액이 있다.

일부 구현예에서, MAPC는 단위 투여 주사 가능한 형태로 제형화된다.

당업자는 본 발명의 방법에서 투여될 조성물 중의 세포 및 임의의 첨가제, 비히클 및/또는 담체의 양을 쉽게 결정할 수 있다.

추가의 활성제

MAPC는 다른 약제학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 이러한 제제는 투여용 MAPC와 함께 제형화된다. 일부 구현예에서, MAPC 및 하나 이상의 제제는 별개의 제형으로 존재한다. 일부 구현예에서, MAPC 및/또는 하나 이상의 제제를 포함하는 조성물은 서로의 부가적 사용과 관련하여 제형화된다.

MAPC는 임의의 수의 코르티코스테로이드, 사이클로스포린 A, 사이클로스포린-유사 면역억제제, 사이클로포스파미드, 항-흉선세포 글로불린, 아자티오프린, FK-506, 및 마크롤라이드-유사 면역억제제의 임의의 조합과 같은 면역억제제를 포함하는 제형으로 투여될 수 있다.

이러한 제제는 또한 항생제, 항진균제, 및 항바이러스제를 포함하며, 몇 가지 예를 들면, 본 발명의 구현예에 따라 사용될 수 있는 다른 약리학적 활성 물질 및 조성물을 포함한다.

전형적인 항생제 및 항진균성 화합물은 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신, 암피실린, 젠타마이신, 카나마이신, 마이코페놀산, 날리딕스산, 네오마이신, 니스타틴, 파로모마이신, 폴리믹신, 푸로마이신, 리팜피신, 스펙티노마이신, 테트라사이클린, 틸로신, 제오신, 및 세팔로스포린, 아미노글리코사이드 및 에키노칸딘을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

MAPC는 또한 손상 부위; 즉, ICH로부터 생성되는 손상 부위로의 세포의 호밍(homing)을 향상시키는 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, MAPC는, 예를 들어, 기질 세포 유래 인자-1(SDF-1), 줄기 세포 인자(SCF), 안지오포이에틴-1, 태반 유래 성장 인자(PIGF), 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF), 및 내피 부착 분자의 발현을 자극하는 것과 같은 사이토카인과 같은 성장 인자 및 영양 신호절단 제제와 함께 투여될 수 있다.

그들은 MAPC와 함께 또는 MAPC가 투여된 후에 전처리로서 대상체에 투여되어 목적하는 부위로의 호밍을 촉진하고, 개선된 호밍 또는 다른 기전에 의해 개선된 치료 효과를 달성할 수 있다. 이러한 인자는 그들이 함께 투여되기에 적합한 제형으로 MAPC와 조합될 수 있다. 대안적으로, 이러한 인자는 개별적으로 제형화되고 투여될 수 있다.

다른 활성제 및 MAPC의 투여 순서, 제형, 투여량, 투여 빈도, 및 투여 경로는 일반적으로 특히 치료되는 ICH, 이의 중증도, 대상체, 투여되고 있는 다른 요법, 장애 또는 질환의 단계, 및 예후 인자에 따라 달라질 것이다. 다른 치료에 대해 확립된 일반적인 섭생은 MAPC 매개된 직접 또는 보조 요법에서 적절한 투여량을 결정하기 위한 프레임워크를 제공한다. 이들은 본원에 제공된 추가 정보와 함께, 당업자가 과도한 실험 없이 본 발명의 구현예에 따라 적절한 투여 절차를 결정할 수 있도록 할 것이다.

구현예에서, 세포는 뇌 손상 및/또는 기능장애 및/또는 본원에 기재된 장애 및/또는 질환을 포함하여 뇌 손상을 치료하기 위해 적합하게 제형화된다. 구현예에서, 제형은 비경구 투여에 효과적이다. 구현예에서, 제형은 I.V. 주입에 효과적이다. 구현예에서, 제형은 정위 주사에 효과적이다.

투여 경로

MAPC는 대상체에게 세포를 투여하는 데 사용될 수 있는 당업자에게 공지된 임의의 다양한 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다.

다양한 구현예에서, MAPC는 세포 치료제의 효과적인 전달을 위한 임의의 경로에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 국소 및/또는 전신 주사를 포함하는 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 세포는 그들이 치료하고자 하는 ICH의 부위 내 및/또는 그 부위에 근접하여 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 기능장애 부위에 근접하지 않는 위치에 주사에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 정맥내 주사와 같은 전신 주사에 의해 투여된다.

본 발명의 구현예에서 이와 관련하여 사용될 수 있는 방법 중에는, MAPC를 전신 주사에 의해 투여하는 방법이 있다. 정맥내 주사와 같은 전신 주사는 MAPC를 투여하기 위한 가장 간단하고 최소 침습적 경로 중 하나를 제공한다. 일부 경우에, 이러한 경로는 최적의 효과 및/또는 MAPC에 의한 표적 부위로의 호밍을 위한 높은 MAPC 투여량을 필요로 할 수 있다. 다양한 구현예에서, MAPC는 표적화 및/또는 국소 주사에 의해 투여되어 표적 부위에서 최적의 효과를 보장할 수 있다.

MAPC는 본 발명의 일부 구현예에서 주사기에 의해 피하 바늘을 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 다양한 구현예에서, MAPC는 카테터를 통해 대상체에게 투여된다. 다양한 구현예에서, MAPC는 외과적 이식에 의해 투여된다. 또한, 이와 관련하여, 본 발명의 다양한 구현예에서, MAPC는 관절경 절차를 사용하는 이식에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, MAPC는 정위 주사에 의해 대상체에게 투여된다.

투여

조성물은 특정 환자의 연령, 성별, 중량 및 상태와 같은 인자, 및 투여될 제형(예: 고체 대 액체)을 고려하여 의학 및 수의학적 분야의 숙련자에게 익히 공지된 기술에 의해 투여량으로 투여될 수 있다. 인간 또는 다른 포유동물을 위한 투여량은 본 개시내용, 본원에 인용된 문헌, 및 당업계의 지식으로부터 당업자에 의해 과도한 실험 없이 결정될 수 있다.

본 발명의 다양한 구현예에 따라 사용되기에 적합한 MAPC의 투여량은 다수의 인자에 좌우될 것이다. 그것은 상이한 상황에 대해 상당히 변할 수 있다. 1차 및 보조 요법을 위해 투여될 MAPC의 최적 투여량을 결정하는 파라미터는 일반적으로 다음 중 일부 또는 모두를 포함할 것이다: 치료되는 ICH 및 그의 단계; 대상체의 종, 그들의 건강, 성별, 나이, 체중, 및 대사율; 대상체의 면역능력; 투여 중인 다른 요법; 및 대상체의 병력 또는 유전자형으로부터 예상되는 잠재적 합병증. 상기 파라미터는 또한 MAPC가 동계, 자가, 동종이계 또는 이종인지의 여부; 그들의 효능(특정 활성); MAPC가 효과적이도록 표적화되어야 하는 부위 및/또는 분포; 및 MAPC에 대한 접근성 및/또는 MAPC의 생착과 같은 부위의 이러한 특성을 포함할 수 있다. 추가의 파라미터는 다른 인자(예: 성장 인자 및 사이토카인)의 MAPC와의 공투여를 포함한다. 주어진 상황에서 최적 투여량은 또한 세포가 제형화되는 방식, 그들이 투여되는 방식, 및 세포가 투여 후 표적 부위에서 국소화될 정도를 고려할 것이다. 마지막으로, 최적 투여의 결정은 최대 유리한 효과의 임계치 이하도 아니고 MAPC의 투여량과 관련된 해로운 효과가 증가된 투여량의 이점을 능가하는 임계치 이상도 아닌 유효 투여량을 반드시 제공할 것이다.

몇몇 구현예에 대한 MAPC의 최적 투여량은 자가 단핵 골수 이식용으로 사용되는 투여량의 범위 내에 있을 것이다. 그것은 크기(질량)의 차이 및 대사 인자를 고려한 동물 연구와 이식 요법과 같은 다른 세포 요법에 대해 확립된 용량 요건으로부터 외삽에 의해 추정될 수 있다.

구현예에서, 최적 투여량은 투여당 수용자 질량 kg당 10⁴ 내지 10⁹개 MAPC 세포 범위이다. 구현예에서, 투여당 최적 투여량은 10⁵ 내지 10⁸개 MAPC 세포/kg일 것이다. 구현예에서, 투여당 최적 투여량은 5×10⁵ 내지 5×10⁷개 MAPC 세포/kg일 것이다. 구현예에서, 투여당 최적 투여량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9×10⁶개 중 임의의 것 내지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9×10⁷개 중 임의의 것일 것이다.

참고로, 전술한 것 중 중간-고 투여량의 일부는 자가 단핵 골수 이식에 사용되는 핵형성 세포의 투여량과 유사하다. 중-저 투여량의 일부는 자가 단핵 골수 이식에 사용되는 CD3+ 세포/kg의 수와 유사하다.

단일 투여량은 한번에 전부, 부분적으로, 또는 일정 기간에 걸쳐 연속적으로 전달될 수 있음을 이해해야 한다. 전체 투여량은 또한 단일 위치로 전달될 수 있거나 여러 위치에 걸쳐 부분적으로 확산될 수 있다.

다양한 구현예에서, MAPC는 초기 투여량으로 투여될 수 있고, 이후 MAPC의 추가 투여에 의해 유지될 수 있다. MAPC는 초기에 한 방법으로 투여될 수 있고, 그 후 동일한 방법 또는 하나 이상의 상이한 방법에 의해 투여될 수 있다. 대상체의 MAPC 수준은 세포의 지속적인 투여에 의해 유지될 수 있다. 다양한 구현예는 정맥내 주사에 의해 MAPC를 초기에 또는 대상체에서 그들의 수준을 유지하기 위해 또는 둘 모두를 위해 투여한다. 다양한 구현예에서, 본원의 다른 곳에서 논의된 환자의 상태 및 기타 인자에 따라 다른 형태의 투여가 사용된다.

인간 대상체는 일반적으로 실험 동물보다 더 오래 치료되지만, 치료는 일반적으로 질환 과정의 길이 및 치료의 효과에 비례하는 길이를 갖는다는 것이 주시된다. 당업자는 인간에 대한 적절한 투여량을 결정하기 위해 인간 및/또는 동물, 예를 들어, 래트, 마우스, 비인간 영장류 등에서 수행된 다른 절차의 결과를 사용하는 데 이를 고려할 것이다. 이러한 고려 사항에 기초하고 본 개시 내용 및 종래 기술에 의해 제공된 지침을 고려하는 그러한 결정은 당업자가 과도한 실험 없이 그렇게 할 수 있도록 할 것이다.

초기 투여 및 추가 투여량 또는 순차적 투여에 적합한 섭생은 모두 동일하거나 가변적일 수 있다. 적절한 섭생은 본 개시내용, 본원에 인용된 문헌, 및 당업계의 지식으로부터 당업자에 의해 확인될 수 있다.

MAPC는, 예를 들어, 목적하는 치료 효과가 달성될 때까지 광범위한 시간 동안 많은 빈도로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, MAPC는 1일 미만의 기간 동안 투여된다. 다른 구현예에서, 그들은 2, 3, 4, 5, 또는 6일 동안 투여된다. 일부 구현예에서, MAPC는 수 주에 걸쳐 1주당 1회 이상 투여된다. 다른 구현예에서, 그들은 1 내지 수 개월 동안 수 주에 걸쳐 투여된다. 다양한 구현예에서, 그들은 수 개월에 걸쳐 투여될 수 있다. 다른 경우, 그들은 1년 이상의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료의 길이는 질환 과정의 길이, 적용되는 요법의 효과, 치료되는 대상체의 상태 및 반응에 비례할 것이다.

일부 구현예에서, MAPC는 목적하는 치료 효과가 달성되거나 투여가 더 이상 대상체에게 이익을 제공할 가능성이 없는 것으로 보일 때까지 1회, 2회, 3회, 또는 3회 이상 투여된다. 일부 구현예에서, MAPC는, 예를 들어, 정맥내 점적에 의해 일정 기간 동안 연속적으로 투여된다. MAPC의 투여는 짧은 기간 동안, 수일 동안, 수주 동안, 수 개월 동안, 수년 동안 또는 장기간 동안 수행될 수 있다.

구현예에서, 단일 볼러스가 투여된다. 구현예에서, 단일 볼러스의 2회 이상의 투여는 1일 이상의 시간 간격으로 투여된다. 구현예에서, 각 투여량은 수분 내지 수 시간의 일정 기간에 걸쳐 I.V. 주입에 의해 투여된다. 구현예에서, 세포의 단일 투여량은 정위 주사에 의해 투여된다. 구현예에서, 2개 이상의 투여량은 정위 주사에 의해 뇌의 동일하거나 상이한 영역에 투여된다. 이와 관련하여 뇌 손상을 치료하기 위한 볼러스, IV 및 정위 주사를 포함하는 구현예에서, 투여당 세포의 투여량은 투여당 수령자 질량 1kg당 10⁴ 내지 10⁹개의 MAPC 세포이다. 구현예에서, 투여량은 10⁵ 내지 10⁸개의 MAPC 세포/kg이다. 구현예에서, 투여량은 5×10⁵ 내지 5×10⁷개의 MAPC 세포/kg이다. 구현예에서, 투여량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9×10⁶개 내지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9×10⁷개 중 임의의 것이다.

MAPC의 단리 및 성장

MAPC 단리 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7,015,037호를 참조하고, 이러한 방법은 MAPC의 특성화(표현형)와 함께 본원에 참조로 인용된다. MAPC는 골수, 태반, 탯줄 및 제대혈, 근육, 뇌, 간, 척수, 혈액 또는 피부를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 공급원으로부터 단리될 수 있다. 따라서, 골수 흡인물, 뇌 또는 간 생검, 및 기타 장기를 수득할 수 있고, 이러한 세포에서 (예: 본원에 참조로 인용된 상기 참조된 출원에 개시된 것들과 같은 기능적 또는 형태학적 검정에 의해) 발현되는 (또는 발현되지 않는) 유전자에 의존하여 당업자가 이용 가능한 양성 또는 음성 선택 기술을 사용하여 세포를 단리시키는 것이 가능하다.

MAPC는 또한 이러한 방법을 위해 참조로 인용된 문헌[참조: Breyer et al., Experimental Hematology, 34:1596-1601 (2006) and Subramanian et al., Cellular Programming and Reprogramming: Methods and Protocols; S. Ding (ed.), Methods in Molecular Biology, 636:55-78 (2010)]에 기재된 변형된 방법에 의해 수득되었다.

미국 특허 제7,015,037호에 기재된 바와 같은 MAPC의 단리 및 성장

MAPC 단리 방법은, 예를 들어, 인간, 래트, 마우스, 개 및 돼지의 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제7,015,037호 및 PCT/US02/04652(WO 02/064748로서 공개됨)에 기재되어 있고, 이러한 방법은 본원에 개시된 MAPC의 특성화와 함께 단지 예시 및 비제한적인 예로서 본원에 참조로 인용된다.

MAPC는 초기에 골수에서 단리되었고, 이어서 뇌 및 근육을 포함하는 다른 조직으로부터 확립되었다(참조: Jiang, Y. et al. (2002): Nature 418: 41-49). MAPC는 골수, 태반, 탯줄 및 제대혈, 근육, 뇌, 간, 척수, 혈액, 지방 조직 및 피부를 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 공급원으로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, MAPC는 당업자에게 이용 가능한 표준 수단에 의해 수득될 수 있는 골수 흡인물로부터 유도될 수 있다(참조: 예를 들어, Muschler, G. F.et al. (1997) J Bone Joint Surg Am.;79(11):1699-709 and Batinic, D.et al. (1990): Bone Marrow Transplant 6(2): 103-7.).

미국 특허 제7,015,037호에 제시된 조건하의 인간 MAPC 표현형

22-25 세포 배가 후 수득된 인간 MAPC의 FACS에 의한 면역표현형 분석은 세포가 CD31, CD34, CD36, CD38, CD45, CD50, CD62e 및 -P, HLA-DR, Muc18, STRO-1, cKit, Tie/Tek를 발현하지 않고, 낮은 수준의 CD44, HLA-부류 I, 및 베타2-마이크로글로불린을 발현하지만, CD10, CD13, CD49b, CD49e, CDw90, Flk1(N > 10)을 발현한다는 것을 나타냈다.

일단 세포가 약 2×10³/cm²에서 재시딩된 배양물에서 > 40 배가를 겪으면, 표현형은 더 균일해졌고, 어떤 세포도 HLA 부류-I 또는 CD44(n = 6)를 발현하지 않았다. 세포가 더 높은 컨플루언스(confluence)에서 성장되었을 때, 그들은 높은 수준의 Mud18, CD44, HLA 부류 I, 및 베타2-마이크로글로불린을 발현했으며, 이는 MSC(N = 8)에 대해 기재된 표현형과 유사하다(Pittenger, 1999).

면역조직화학은 약 2×10³/cm²의 시딩 밀도에서 성장된 인간 MAPC가 EGF-R, TGF-R1 및 -2, BMP-R1A, PDGF-Rla 및 -B를 발현했고, MAPC의 작은 하위 집단(1 내지 10%)이 항-SSEA4 항체로 염색되었음을 나타냈다(Kannagi, R, 1983).

Clontech cDNA 검정을 사용하여, 22 및 26 세포 배가에 대해 약 2×10³ 세포/cm²의 시딩 밀도로 배양된 인간 MAPC의 발현된 유전자 프로파일이 결정되었다:

A. MAPC는 CD31, CD36, CD62E, CD62P, CD44-H, cKit, Tie, IL1, IL3, IL6, IL11, G CSF, GM-CSF, Epo, Flt3-L, 또는 CNTF의 수용체, 및 낮은 수준의 HLA-부류-I, CD44-E 및 Muc-18 mRNA를 발현하지 않았다.

B. MAPC는 사이토카인 BMP1, BMP5, VEGF, HGF, KGF, MCP1; 사이토카인 수용체 Flkl, EGF-R, PDGF-R1.알파, gp130, LIF-R, 액티빈-R1 및 -R2, TGFR-2, BMP-R1A; 접착 수용체 CD49c, CD49d, CD29; 및 CD10에 대한 mRNA를 발현했다.

C. MAPC는 hTRT 및 TRF1; POU 도메인 전사 인자 oct-4, sox-2(ES/EC의 미분화 상태를 유지하기 위해 oct-4가 필요함(Uwanogho, D. (1995): Mech Dev 49(1-2): 23-36); sox 11(신경 발달), sox 9(연골형성)(Lefebvre V. et al. (1998): Matrix Biol 16(9): 529-40); 호메오데오메인 전사 인자 Hox-a4 및 -a5(경추 및 흉부 골격 사양; 기도 기관의 생성)(Packer A I (2000): Dev Dyn 217(1): 62-74); Hox-a9(골수조혈)(Lawrence H. (1997): Blood 89(6): 1922-30); Dlx4(머리의 전뇌 및 말초 구조의 사양)(Akimenko M A (1994): J Neurosci (6): 3475-86), MSX1(배아 중배엽, 성인 심장 및 근육, 연골- 및 골형성)(Foerst-Potts L. (1997) Dev Dyn 209(1): 70-84); PDX1(췌장)(Offield M F et al. (1996): Development. 122(3): 983-95)에 대한 mRNA를 발현했다.

D. oct-4, LIF-R 및 hTRT mRNA의 존재는 RT-PCR에 의해 확인되었다.

E. 또한, RT-PCR은 rex-1 mRNA 및 rox-1 mRNA가 MAPC에서 발현되었음을 보여주었다.

Oct-4, rex-1 및 rox-1은 인간 및 뮤린 골수로부터 및 뮤린 간 및 뇌로부터 유도된 MAPC에서 발현되었다. 인간 MAPC는 LIF-R을 발현했고, SSEA-4로 양성 염색되었다. 마지막으로, oct-4, LIF-R, rex-1 및 rox-1 mRNA 수준은 30 세포 배가 이상으로 배양된 인간 MAPC에서 증가하는 것으로 밝혀졌고, 이는 표현형적으로 더 균질한 세포를 초래했다. 대조적으로, 고밀도에서 배양된 MAPC는 이들 마커의 발현을 상실했다. 이는 40 세포 배가 전 노화 및 연골모세포, 조골세포 및 지방세포 이외의 세포로의 분화의 손실과 관련되었다. 따라서, rex-1, rox-1 및 sox-2와 조합된 oct-4의 존재는 MAPC 배양에서 가장 원시 세포의 존재와 상관관계가 있었다.

MAPC의 배양

MAPC를 배양하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. (참조: 예를 들어, 미국 특허 제7,015,037호, 이는 MAPC를 배양하는 방법에 대해 본원에 참조로 인용된다.) MAPC를 배양하기 위한 밀도는 약 200 세포/cm² 내지 약 1500 세포/cm² 내지 약 2000 세포/cm²를 포함하여 약 100 세포/cm² 또는 약 150 세포/cm² 내지 약 10,000 세포/cm²로 다양할 수 있다. 밀도는 종마다 다를 수 있다. 또한, 최적 밀도는 세포의 배양 조건 및 공급원에 따라 달라질 수 있다. 배양 조건 및 세포의 주어진 세트에 대한 최적 밀도를 결정하는 것은 당업자의 기술 범위 내에 있다.

또한, 약 3 내지 5%를 포함하는, 약 10% 미만의 효과적인 대기 산소 농도는 배양 중 MAPC의 단리, 성장 및 분화 동안 언제든지 사용될 수 있다.

추가의 배양 방법

추가 실험에서, MAPC가 배양되는 밀도는 약 200 세포/cm² 내지 약 1500 세포/cm² 내지 약 2000 세포/cm²를 포함하여 약 100 세포/cm² 또는 약 150 세포/cm² 내지 약 10,000 세포/cm²로 다양할 수 있다. 밀도는 종마다 다를 수 있다. 또한, 최적 밀도는 세포의 배양 조건 및 공급원에 따라 달라질 수 있다. 배양 조건 및 세포의 주어진 세트에 대한 최적 밀도를 결정하는 것은 당업자의 기술 범위 내에 있다.

또한, 약 1 내지 5%, 특히 약 3 내지 5%를 포함하는, 약 10% 미만의 효과적인 대기 산소 농도는 배양 중 MAPC의 단리, 성장 및 분화 동안 언제든지 사용될 수 있다.

세포는 다양한 혈청 농도하에, 예를 들어, 약 2 내지 20%에서 배양될 수 있다. 태아 소 혈청이 사용될 수 있다. 더 높은 혈청은, 예를 들어, 약 15-20%의 낮은 산소 장력과 조합하여 사용될 수 있다. 세포는 배양 접시에 부착되기 전에 선택될 필요가 없다. 예를 들어, 피콜(Ficoll) 구배 후, 세포는 직접 플레이팅될 수 있고, 예를 들어 250,000 내지 500,000/cm²일 수 있다. 부착성 콜로니를 취하고, 가능하게 풀링하고 확장시킬 수 있다.

하나의 구현예에서, 실시예의 실험 절차에 사용된 높은 혈청(약 15 내지 20%) 및 낮은 산소(약 3 내지 5%) 조건이 세포 배양에 사용되었다. 구체적으로, 콜로니로부터 부착성 세포를 플레이팅하고, 18% 혈청 및 3% 산소(PDGF 및 EGF 포함)에서 약 1700-2300 세포/cm²의 밀도로 계대시켰다.

실시예

하기 실시예는 단지 예시로 제공되며, 본원에 개시된 본 발명의 많은 측면 및 구현예를 제한하거나 배타적이거나 고갈시키는 것은 아니다.

실시예 1 - MAPC의 제조

Atheatsys Inc. Cleveland의 인간 MultiStem® MAPC는 하기 기재된 실시예에 사용되었다. 이들은 골수 흡인물로부터 단리된 인간 골수 유도 MAPC이며, 건강한 공여자의 동의를 얻어 수득되고, 본질적으로 문헌[참조: Penn, MS et al., Circ Res 2012;110(2):304-11; Maziarz, RT et al., Biology of Blood and Marrow Transplantation 2012;18(2 Sup):S264-S265; 및 clinicaltrials.gov #NCT01436487, #NCT01240915 and #NCT01841632)]에 기재된 바와 같이 이전에 기재된 방법에 따라 처리되었다. 간단히 말해, MAPC는 5% CO₂의 가습된 분위기에서 낮은 산소 장력하에서 피브로넥틴-코팅된 플라스틱 조직 배양 플라스크에서 배양되었다. 세포는 MAPC 배양 배지(FBS(Atlas Biologicals, Fort Collins, CO), ITS 액체 배지 보충제[Sigma], MCDB[Sigma], 혈소판 유래 성장 인자(R&D Systems, Minneapolis, MN), 표피 성장 인자(R&D Systems), 덱사메타손([Sigma]), 페니실린/스트렙토마이신[Life Technologies Invitrogen], 2-포스포-L-아스코르브산[Sigma, St Louis, MO], 및 리놀레산-알부민(Sigma)이 보충된 저-글루코스 DMEM[Life Technologies Invitrogen])에서 배양되었다. 세포를 3 내지 4d마다 계대시키고, 트립신/EDTA(Life Technologies Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 수확하였다. 세포는 CD49c 및 CD90에 대해 양성이었고, MHC 부류 II 및 CD45에 대해 음성이었다. 이어서, 세포를 1ml(PlasmaLyte, 5% HSA 및 10% DMSO) 중 1 내지 10×10⁶의 농도로 액체 질소의 증기 상의 냉동 바이알에서 집단 배가 30 내지 35에서 동결시켰다. 사용 직전에, MAPC를 해동시키고, 그 후 직접 사용하였다.

실시예 2 - 래트에서 콜라게나제 ICH 유도

ICH의 마우스 콜라게나제 모델을 이전에 기재된 바와 같은 연구에 사용하였다(참조: Sukumari-Ramesh et al, J Neurotrauma 29(18):2798-804(2012)). 간략하게, 성체 수컷 C57B1/6J 마우스(8 내지 10주령)를 정위 프레임에 놓고, 브레그마에 대해 2.2mm 측면인 두정엽 피질 위에 0.5-mm 직경 버 구멍(burr hole)을 뚫었다. 0.5μl 식염수에 0.04μl의 박테리아 유형 IV 콜라게나제가 적재된 26-G 해밀톤 주사기를 두개골 표면으로부터 왼쪽 선조체로 직접 3mm 깊이로 낮추었다. 주사기를 450nl/분의 속도로 가압하고, 용액 환류 및 과도한 확산을 방지하기 위한 절차 후에 수분 동안 적소에 방치하였다. 주사기를 제거한 후, 뼈 왁스를 사용하여 버 홀을 폐쇄하고, 절개부를 외과적으로 스테이플링했고, 마우스를 정위 반사의 회복까지 따뜻하게 유지시켰다. 모든 연구의 경우, 한배 새끼를 사용하여 실험 가변성의 원인을 감소시켰다.

동물은 손상 후 정맥내(IV) 식염수(대조군; n = 10) 또는 MultiStem® 세포(n = 11)를 수용하도록 무작위화되었다.

세포 또는 식염수의 IV 투여는 출혈성 출혈 개시 2시간 후(콜라게나제 주입 2시간 후)에 제공되었다. 모든 세포 처리 동물은 1백만 개의 세포를 제공받았다.

혈종 용적 및 뇌 관류는 하기에 기재된 바와 같이, 손상 후 3주에 걸쳐 자기 공명 영상(MRI)에 의해 평가하였다.

악력 테스트, 좁은 빔 테스트, 및 상승된 신체 스윙 작업을 포함하는 신경거동 결과는 하기에 기재된 바와 같이 손상 후 7일째에 평가하였다.

실시예 3 - MAPC는 ICH 후 혈종 용적을 감소시킨다

MultiStem® 세포의 IV 투여는 손상 후 1일 만에 혈종 용적을 상당히 감소시켰다. 이 효과는 ICH 후 첫 주 동안 지속되었다. 가속화된 혈종 용해와 일치하였다. 마우스를 이소플루란(유도의 경우 3%, N₂/O₂의 2:1 혼합물에서 유지를 위해 1.5%)로 마취시키고, 12cm 자체 차폐 구배 세트(최대 45가우스/cm)가 장착된 수평 7 Tesla BioSpec MRI 분광계(Bruker Instruments)를 사용하여 이미지화했다. 무선 주파수 펄스는 동물 두개골의 중심선에 걸쳐 위치된 2-채널 브루커 직교 수신기 코일로부터 능동적으로 분리된 표준 송/수신 볼륨 코일(72-mm 내경)을 사용하여 적용되었다. 정위 이어 바를 사용하여 이미징 절차 동안 움직임을 최소화하였다. 마우스 온도를 재순환 수조에 의해 가열된 패드를 사용하여 37 ± 0.5℃로 유지시켰다. 3면 고속 저각 샷 서열을 사용하여 위치를 지정한 후, T2'-가중된 MRI 스캔을 사용하여 MR 연구를 수행하였다. 다음 파라미터를 사용하여 MRI를 획득하였다: T2^* 맵핑 서열(다중 에코를 갖는 2D 구배 에코 서열; TE· 5, 10, 15, 20, 25 및 30ms; TR· 3,000ms; FOV = 32mm; 1-mm 슬라이스 두께(IS 슬라이스]; 256×256 매트릭스; NEX = 2). 획득된 이미지는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 체적적으로 분할되었고, 혈종 용적이 계산되었다. T2^*W 이미지를 브루커(Bruker) 소프트웨어를 사용하여 추가로 처리하여 감수성 가중된 이미지(Sehgalet al, 2006)를 수득하고, 혈전 용적에 대한 분할 및 품질 제어 기준의 대안적인 방법을 제공하였다. 혈종 및 심실 용적 둘 다는 병변/심실을 함유하는 모든 MRI 섹션에서 불규칙한 관심 영역(ROI)을 그려서 결정되었으며, 합한 값(면적)은 슬라이스의 두께를 곱하여 용적을 계산하였다. 분석은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.

세포 처리된 동물은 치료 1일 이내에 혈종 용적의 통계적으로 유의한 감소(대략 4배 감소)를 나타냈다. 상기 감소는 적어도 처음 7일 동안 세포 처리된 동물 대 식염수 처리된 동물에서 통계적으로 유의하였다.

결과는 도 1에 도시되어 있다. 위약(PBS, n = 10) 또는 MultiStem®(n=11)은 콜라게나제 유도 ICH 후 2시간에 마우스에 정맥내 투여되었다. 혈종 용적은 7T 소형 동물 MRI를 사용하여 MRI(T2W)에 의해 평가되었다. 3일 및 7일째에 대한 대표적인 관상 뇌 이미지가 혈종 용적에 대한 MultiStem®의 극적인 이점을 나타내는 패널 A에 제공된다. 패널 B는 21일 평가 기간 동안 모든 마우스의 데이터를 묘사한다. 데이터는 평균 +/- SEM으로서 제시되고, 각 시점 내에서 스튜던츠 t-테스트에 의해 분석되었다. ^**p < 0.01 대 위약 처리 ICH 마우스.

실시예 4 - MAPC는 ICH 후 뇌 관류를 개선시킨다

MultiStem®은 ICH 후 1주 이상 동안 손상된 선조체 내부 및 주변의 뇌 관류를 개선했다. 마우스를 이소플루란(유도의 경우 3%, N2/O2의 2:1 혼합물에서 유지를 위해 1.5%)로 마취하고 12cm 자가 차폐 구배 세트(최대 45 가우스/cm)가 장착된 수평 7 Tesla BioSpec MRI 분광계(Bruker Instruments)를 사용하여 영상화했다. 무선 주파수 펄스는 동물 두개골의 중심선에 걸쳐 위치된 2-채널 브루커 직교 수신기 코일로부터 능동적으로 분리된 표준 송/수신 볼륨 코일(72-mm 내경)을 사용하여 적용되었다. 정위 이어 바를 사용하여 이미징 절차 동안 움직임을 최소화하였다. 마우스 온도를 재순환 수조에 의해 가열된 패드를 사용하여 37 ± 0.5℃로 유지시켰다. 3면 고속 저각 샷 시퀀스를 사용하여 위치를 지정한 후, T2 가중된 MRI 스캔을 사용하여 MR 연구를 수행하였다. 다음 파라미터를 사용하여 MRI를 획득하였다: T2-유체 감쇠 역전 복구 서열(RARE-IR, T1·2000; TR·10,000ms; TE·36ms; RARE 인자 = 8; FOV = 32mm; 256×256 매트릭스; 1-mm 슬라이스 두께; JS 슬라이스. 분석은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.

세포 처리된 동물의 혈류는 식염수 처리된 손상 동물과 비교할 때 치료 후 처음 7일 동안 통계적으로 유의하게 개선되었다. 이것은 MultiStem® 세포 생성물의 IV 주입이 출혈성 뇌졸중 발병 후 뇌의 혈류를 급격히 개선하여 더 적은 부종, 조직 손상 및 신경 회로의 파괴를 초래할 수 있음을 보여준다.

결과는 도 2에 도시되어 있다. 위약(PBS, n = 10) 또는 MultiStem®(n=11)을 콜라게나제 유도 ICH 후 2시간에 마우스에 정맥내 투여하였다. 뇌 관류는 7T 소형 동물 MRI를 사용하여 MRI(ASL; FAIR-RARE)에 의해 평가되었다. 대표적인 관상 뇌 이미지는 패널 B에 제시된 정량화된 데이터를 갖는 패널 A에 제공된다. 데이터는 MultiStem®이 ICH 후 첫 주 동안 뇌 관류를 개선함을 나타낸다. 데이터는 평균 +/- SEM으로 표시되며, 각 시점 내에서 스튜던츠 t-테스트로 분석되었다. ^* p < 0.05, ^** p < 0.01 대 위약 처리 ICH 마우스.

실시예 5 - MAPC는 ICH 후 기능적 결핍을 감소시키고 성능을 개선시킨다

경색 용적 감소에서 관찰된 변화 및 향상된 뇌 관류는 악력 테스트에서 운동 성능의 기능적 개선, 빔을 가로지르는 시간 감소, 표준화된 좌/우 스윙 비율에 의해 반영되었다.

거동 검사

매달린 와이어 검사

악력은 2개의 수직 지지체 사이에서 당겨진 50-cm 스트링으로 구성된 장치 상에 마우스를 위치시킴으로써 평가되었다. 마우스는 다음과 같이 평가되었다: 0: 탈락; 1: 2개의 앞발로 스트링에 매달림; 2: 1과 동일하지만 스트링에 오르려고 시도함; 3: 2개의 앞발과 한쪽 또는 앙쪽 뒷다리로 스트링에 매달림; 4: 앞발로 스트링에 매달리고, 꼬리는 스트링 주위를 감쌈; 5: 탈출. 각 시점에서 각 동물에 대해 3회 연속 시도 중 가장 높은 판독치를 취했다.

좁은 빔워크

운동 협응은 3일 연속으로 고정 좁은 빔(6mm 폭, 1m 길이) 상에서 평가하였다. 처음 2일은 훈련으로 구성되었으며, 빔에 대한 성능은 빔을 횡단하는 데 필요한 시간을 측정하여 3일째에 정량화되었다. 각 마우스는 맹검 조사자에 의해 3회 테스트하였고, 평균을 기록하였다.

상승된 신체 스윙 테스트

동물을 꼬리 기저부로부터 1cm에 유지시키고, 평평한 표면 위 1 내지 5cm에 매달았다. 각 매달림마다 하나의 스윙을 기록하였다. 스윙은 신체 정중선으로부터 > 10도 편향 또는 수직축 주위의 회전으로서 정의되었다. 마우스를 매달린 곳 사이의 표면에 위치시키고, 측면 선호도가 관찰되지 않도록 가시적으로 재배치한 다음 다시 매달았다. 평가자는 손과 서 있는 위치를 변화시키고, 테스트 영역은 스윙 방향이 편향되는 것을 피하기 위해 시각적 신호가 결여되었다. 20개의 스윙을 시도당 기록하였고, 측면 선호도는 한 측면/총 스윙에 대한 스윙으로서 계산되었다.

이러한 데이터는 출혈성 뇌졸중 발병 후 MultiStem®을 사용한 급성 치료가 식염수만 처리된 동물과 비교하여 동물에게 투여된 3가지 테스트에 걸쳐 입증된 바와 같이 운동 및 신경학적 이점에서 현저한 유의한 개선을 유도한다는 것을 시사한다.

결과는 도 3에 제시되어 있다. 위약(PBS, n=10) 또는 MultiStem®(n=11)을 콜라게나아제 유도 ICH 후 2시간째에 마우스에 정맥내 투여했다. 운동 기능의 신경학적 평가는 손상 후 7일째에 (또는 모의 수술 마우스에서, n=8) 평가되었다. (A) 악력 테스트. (B) 좁은 빔 작업. (C) 상승된 신체 스윙 작업. 데이터는 평균 +/- SEM이며 일원 ANOVA에 이어 터키 사후 테스트를 사용하여 비교되었다. ^*p < .05, ^**p < 0.01, ^*** p < 0.001, ns = 유의하지 않음.

상기 기재된 결과는, 특히 혈전의 위치 및 크기가 자체로 수술에 적합한 환자의 외과적 배출 이외에 출혈성 뇌졸중을 앓고 있는 환자에게 현재 승인된 치료가 없다는 사실에 비추어, 놀랍도록 우수하다. 승인된 약물 또는 요법은 존재하지 않는다.

실험 요법을 평가하는 가장 최근의 전임상 논문은 Dhandapani 그룹에 의해 2018년 9월에 발표되었고, 아데노신 모노포스페이트 키나제 알파-1(AMPKal)의 억제를 통한 혈종 용적을 감소시키는 데 초점을 맞춘다(Vaibhav, 2018). 이 논문에서, 동일한 유형의 MRI 결과 및 운동 및 신경학적 종점이 이 출원에서와 같이 평가되었다.

MultiStem® 세포의 투여는 본 출원에 제시된 결과와 비교할 때 혈종 감소 및 혈류 결과에서 일관되게 더 좋으며, 운동 결과에서 더 좋지 않더라도 양호하다. 이들은 ICH 치료 연구에서 볼 수 있는 최상의 결과이다.

상기 설명 및 실시예는 그들이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 이해될 바와 같이, 본원에 개시된 발명에 의해 포함되는 많은 측면 및 구현예를 포괄하는 것이 아니라 예시적인 것이다.

상기 개시내용에 언급된 모든 간행물은 그 전체, 특히 그들이 구체적으로 인용된 주제와 가장 관련된 부분이 참조로 본 개시내용에 포함된다.

Claims

대상체에서 뇌내 출혈을 치료하는 방법으로서, 배아 줄기 세포가 아니고 배아 생식 세포도 아니고 생식 세포도 아니며, 적어도 2개의 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통 각각의 적어도 하나의 세포 유형으로 분화할 수 있고, 상기 대상체에 대해 동종이계 또는 이종인 다능성 성체 전구 세포를 뇌내 출혈의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
대상체에서 뇌내 출혈을 치료하는 방법으로서, 배아 줄기 세포가 아니고 배아 생식 세포도 아니고 생식 세포도 아니며, 텔로머라제를 발현하고, 상기 대상체에 대해 동종이계 또는 이종인 다능성 성체 전구 세포를 뇌내 출혈의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
대상체에서 뇌내 출혈을 치료하는 방법으로서, 배아 줄기 세포가 아니고 배아 생식 세포도 아니고 생식 세포도 아니며, oct3/4에 대해 양성이고, 상기 대상체에 대해 동종이계 또는 이종인 다능성 성체 전구 세포를 뇌내 출혈의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
대상체에서 뇌내 출혈을 치료하는 방법으로서, 배아 줄기 세포가 아니고 배아 생식 세포도 아니고 생식 세포도 아니며, 사용 전에 배양에서 적어도 40 세포 배가를 겪고, 상기 대상체에 대해 동종이계 또는 이종인 다능성 성체 전구 세포를 뇌내 출혈의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 적어도 2개의 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통 각각의 적어도 하나의 세포 유형으로 분화할 수 있는 것인 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 세포가 텔로머라제를 발현하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 세포가 사용 전에 배양에서 적어도 40 배가를 겪는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포가 텔로머라제를 발현하고 oct3/4에 대해 양성인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포가 텔로머라제를 발현하고, 사용 전에 배양에서 적어도 40 배가를 겪는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포가 oct3/4에 대해 양성이고, 사용 전에 배양에서 적어도 40 배가를 겪는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포가 텔로머라제를 발현하고, oct3/4에 대해 양성이며, 사용 전에 배양에서 적어도 40 배가를 겪는 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 정상 핵형을 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 종양형성성이 아닌 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 상기 대상체에서 면역원성이 아닌 것인 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 내배엽, 외배엽, 및 중배엽 배아 계통 각각의 적어도 하나의 세포 유형으로 분화할 수 있는 것인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 포유류 세포인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 인간 세포인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 태반 조직, 탯줄 조직, 제대혈, 골수, 혈액, 비장 조직, 흉선 조직, 척수 조직, 지방 조직, 및 간 조직 중 임의의 하나로부터 단리된 세포로부터 유래되는 것인 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 골수로부터 유래되는 것인 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 질량 1kg당 10⁴ 내지 10⁸개의 상기 세포의 하나 이상의 투여량이 사용되는 것인 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 질량 1kg당 10⁶ 내지 5×10⁷개의 상기 세포의 하나 이상의 투여량이 사용되는 것인 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항균제, 항진균제, 항바이러스제 또는 이들의 조합이 동시에 사용되는 것인 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 하나 이상의 다른 약제학적 활성제를 포함하는 제형에 존재하는 것인 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 비경구 방법, 정맥내 방법 또는 정위 방법에 의해 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 정맥내 방법에 의해 투여되는 것인 방법. 대상체에서 뇌내 출혈을 치료하는 방법으로서, 배아 줄기 세포가 아니고 배아 생식 세포도 아니고 생식 세포도 아니며, 적어도 2개의 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통 각각의 적어도 하나의 세포 유형으로 분화할 수 있고, 상기 대상체에 대해 동종이계 또는 이종인 다능성 성체 전구 세포를 뇌내 출혈의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 면역억제제 치료가 상기 세포의 투여에 보조적으로 투여되지 않는 것인 방법.
대상체에서 뇌내 출혈을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 세포의 용도로서, 상기 세포가 배아 줄기 세포가 아니고 배아 생식 세포도 아니고 생식 세포도 아니며, 적어도 2개의 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통 각각의 적어도 하나의 세포 유형으로 분화할 수 있고, 상기 대상체에 대해 동종이계 또는 이종인 다능성 성체 전구 세포인 용도.
대상체에서 뇌내 출혈을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 세포의 용도로서, 상기 세포가 배아 줄기 세포가 아니고 배아 생식 세포도 아니고 생식 세포도 아니며, 텔로머라제를 발현하고, 상기 대상체에 대해 동종이계 또는 이종인 다능성 성체 전구 세포인 용도.
대상체에서 뇌내 출혈을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 세포의 용도로서, 상기 세포가 배아 줄기 세포가 아니고 배아 생식 세포도 아니고 생식 세포도 아니며, oct3/4에 대해 양성이고, 상기 대상체에 대해 동종이계 또는 이종인 다능성 성체 전구 세포인 용도.
대상체에서 뇌내 출혈을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 세포의 용도로서, 상기 세포가 배아 줄기 세포가 아니고 배아 생식 세포도 아니고 생식 세포도 아니며, 사용 전에 배양에서 적어도 40 세포 배가를 겪고, 상기 대상체에 대해 동종이계 또는 이종인 다능성 성체 전구 세포인 용도.
제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 적어도 2개의 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통 각각의 적어도 하나의 세포 유형으로 분화할 수 있는 것인 용도.
제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 세포가 텔로머라제를 발현하는 것인 용도.
제30항에 있어서, 상기 세포가 사용 전에 배양에서 적어도 40 배가를 겪는 것인 용도.
제28항에 있어서, 상기 세포가 텔로머라제를 발현하고, oct3/4에 대해 양성인 용도.
제28항에 있어서, 상기 세포가 텔로머라제를 발현하고, 사용 전에 배양에서 적어도 40 배가를 겪는 것인 용도.
제28항에 있어서, 상기 세포가 oct3/4에 대해 양성이고, 사용 전에 배양에서 적어도 40 배가를 겪는 것인 용도.
제28항에 있어서, 상기 세포가 텔로머라제를 발현하고, oct3/4에 대해 양성이며, 사용 전에 배양에서 적어도 40 배가를 겪는 것인 용도.
제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 정상 핵형을 갖는 것인 용도.
제28항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 종양형성성이 아닌 것인 용도.
제28항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 상기 대상체에서 면역원성이 아닌 것인 용도.
제28항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 내배엽, 외배엽, 및 중배엽 배아 계통 각각의 적어도 하나의 세포 유형으로 분화할 수 있는 것인 용도.
제28항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 포유류 세포인 용도.
제28항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 인간 세포인 용도.
제28항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 태반 조직, 탯줄 조직, 제대혈, 골수, 혈액, 비장 조직, 흉선 조직, 척수 조직, 지방 조직, 및 간 조직 중 임의의 하나로부터 단리된 세포로부터 유래되는 것인 용도.
제28항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 골수로부터 유래되는 것인 용도.
제28항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
제28항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 질량 1kg당 10⁴ 내지 10⁸개의 상기 세포의 하나 이상의 투여량이 사용되는 것인 용도.
제28항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 질량 1kg당 10⁶ 내지 5×10⁷개의 상기 세포의 하나 이상의 투여량이 사용되는 것인 용도.
제28항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 항균제, 항진균제, 항바이러스제 또는 이들의 조합이 동시에 사용되는 것인 용도.
제28항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 하나 이상의 다른 약제학적 활성제를 포함하는 제형에 존재하는 것인 용도.
제28항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 비경구 방법, 정맥내 방법 또는 정위 방법에 의해 투여되는 것인 용도.
제28항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 정맥내 방법에 의해 투여되는 것인 용도.
제28항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제가 보조 면역억제제의 사용 없이 사용하기 위한 것인 용도.