KR20210122602A - Immunoglobulin A marker for hepatocellular carcinoma diagnosis and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 간세포암 진단용 혈청 IgA(immunoglobulin A) 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈청 IgA 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간세포암 진단용 조성물 및 혈청 IgA 수준 측정을 이용한 간세포암 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.The present invention relates to a serum IgA (immunoglobulin A) marker for diagnosing hepatocellular carcinoma and uses thereof, and more particularly, to a composition for diagnosing hepatocellular carcinoma comprising a substance for measuring serum IgA levels, and for diagnosing hepatocellular carcinoma using serum IgA level measurement It relates to information provision method.
간암의 전세계 암 관련 사망의 두 번째 원인이며, 이중 간세포암(hepatocellular carcinoma, HCC)이 간암의 85 ~ 90%를 차지한다. 간세포암의 발생 및 사망률은 여성에 비해 남성이 현저히 높으며, 특히 우리나라의 경우 40, 50대 남자의 주요 사망원인이다.Liver cancer is the second leading cause of cancer-related death worldwide, and hepatocellular carcinoma (HCC) accounts for 85-90% of liver cancers. The incidence and mortality of hepatocellular carcinoma are significantly higher in men than in women, and in Korea, it is the main cause of death in men in their 40s and 50s.
간세포암은 초기에는 증세가 나타나지 않고, 증세가 나타난 경우 이미 많이 진행된 것이다. 증세는 주로 피로감, 복부통증이나 때로 팽만감과 식욕부진이 나타난다. 특징적인 증세는 명치에서 응어리가 느껴지는 것으로 상당히 진행된 상태에서 나타난다. 또한, 간세포암은 예후가 나쁜 질병이기 때문에 예방과 조기발견이 중요하다. Hepatocellular carcinoma does not show symptoms in the early stages, and when symptoms appear, it is already advanced. Symptoms are mainly fatigue, abdominal pain, but sometimes bloating and loss of appetite. A characteristic symptom is that a lump is felt in the myeongchi, which appears in a fairly advanced state. In addition, hepatocellular carcinoma is a disease with a poor prognosis, so prevention and early detection are important.
종래의 기술에서, 간세포암에서 가장 흔하게 사용하는 종양표지자는 알파-페토프로테인(alpha-Fetoprotein; AFP)이다. AFP는 간세포가 형질전환되어 암세포로 전환되었을 때 비정상적으로 생성되는 당단백으로, 원발성 간암, 간염, 간경변과 태아성암 등의 발견과 치료경과 관찰에 이용된다. 대개 태아의 간이나 난황막에서 주로 만들어져 13주째에 최고치를 보이다가 이후에는 급격히 농도가 낮아져 정상의 성인에게서는 극히 낮은 농도(정상의 경우 7-10 ng/mL 이하)로만 존재하므로, 혈액 내부의 AFP 수준의 증가는 심각한 종양세포의 증가를 의미할 수 있다. 일반적으로 AFP가 20 ng/mL 이상으로 증가되어 있으면 간세포암으로 진단하나, AFP를 이용하는 진단은 민감도가 40% 정도로 낮은 단점이 있다. 즉, AFP 음성 간세포암이 전체 간세포암의 40% 이상 되기 때문에, 보다 정확하게 간세포암 진단율을 효과적으로 증가시킬 수 있는 추가적 마커가 필요한 실정이다.In the prior art, the most commonly used tumor marker in hepatocellular carcinoma is alpha-fetoprotein (AFP). AFP is a glycoprotein that is abnormally produced when hepatocytes are transformed and converted into cancer cells, and is used for the detection and treatment of primary liver cancer, hepatitis, cirrhosis, and fetal cancer. In most cases, it is produced mainly in the fetal liver or yolk sac and peaks at 13 weeks, then decreases sharply thereafter, and exists only in extremely low concentrations (normally 7-10 ng/mL or less) in normal adults. An increase in the level may indicate a significant increase in tumor cells. In general, if AFP is increased to 20 ng/mL or more, hepatocellular carcinoma is diagnosed, but the diagnosis using AFP has a disadvantage as low as 40% sensitivity. That is, since AFP-negative HCC accounts for more than 40% of all HCC, there is a need for additional markers that can more accurately and effectively increase the HCC diagnosis rate.
이에 본 발명자들은 간세포암을 보다 정확하게 진단할 수 있는 마커를 선별하기 위해 예의 노력한 결과, 간세포암 환자의 혈청 IgA 수준이 다른 간암에 비해 높은 것을 확인하였으며, 특히 간섬유화가 진행될수록 혈청 IgA 수준이 높아지는 것을 확인하였다. 또한, 기존 간암 마커인 AFP와 혈청 IgA 마커의 조합을 통해 간세포암 진단능이 향상된 것을 확인하였을 뿐만 아니라, AFP가 음성인 경우에도 혈청 IgA 수준 측정을 통해 보다 정확하게 간세포암을 측정할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors made intensive efforts to select a marker that can more accurately diagnose hepatocellular carcinoma, and as a result, it was confirmed that the serum IgA level of hepatocellular carcinoma patients was higher than that of other liver cancers. confirmed that. In addition, it was confirmed that hepatocellular carcinoma diagnostic ability was improved through the combination of the existing liver cancer marker AFP and serum IgA marker, and that hepatocellular carcinoma could be more accurately measured through serum IgA level measurement even when AFP was negative. , the present invention was completed.
본 발명의 목적은 혈액 또는 혈청 내 IgA 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간세포암 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.It is an object of the present invention to provide a composition for diagnosing hepatocellular carcinoma comprising a substance for measuring IgA levels in blood or serum.
본 발명의 다른 목적은 상기 간세포암 진단용 조성물을 포함하는 간세포암 진단용 키트를 제공하는 데 있다. Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing hepatocellular carcinoma comprising the composition for diagnosing hepatocellular carcinoma.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 혈액 또는 혈청 내 IgA 수준을 측정을 이용한 간세포암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다. Another object of the present invention is to provide a method for providing information for diagnosing hepatocellular carcinoma using the measurement of the IgA level in the blood or serum.
상술한 목적을 달성하기 위해, In order to achieve the above object,
본 발명은 혈액 또는 혈청 내 IgA 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간세포암 진단용 조성물을 제공한다. The present invention provides a composition for diagnosing hepatocellular carcinoma comprising a substance for measuring IgA levels in blood or serum.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 혈액 또는 혈청 내 알파-페토프로테인(alpha-Fetoprotein; AFP) 수준을 측정하는 물질을 추가로 포함할 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, the composition may further include a substance for measuring the level of alpha-fetoprotein (AFP) in blood or serum.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 IgA 수준을 측정하는 물질은 IgA에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 포함할 수 있다. In another preferred embodiment of the present invention, the substance for measuring the IgA level may include an antibody that specifically binds to IgA, an interacting protein, a ligand, nanoparticles or an aptamer. have.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, The present invention to achieve another object,
상기 간세포암 진단용 조성물을 포함하는 간세포암 진단용 키트를 제공한다.It provides a kit for diagnosing hepatocellular carcinoma comprising the composition for diagnosing hepatocellular carcinoma.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, the kit is a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) kit, a DNA chip kit, an ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) kit, a protein chip kit, a rapid kit or MRM ( Multiple reaction monitoring) kit.
본 발명은 또 다른 목적을 달성하기 위해, The present invention to achieve another object,
(a) 환자의 혈액 또는 혈청에 존재하는 IgA 수준을 측정하는 단계; 및 (a) measuring the level of IgA present in the blood or serum of the patient; and
(b) 상기 IgA 수준을 정상대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 간세포암 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다. (b) provides an information providing method for diagnosing hepatocellular carcinoma comprising the step of comparing the IgA level with a normal control sample.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계는 혈액 또는 혈청 내 AFP 수준을 추가로 측정할 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, step (a) may further measure the AFP level in blood or serum.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계의 환자는 AFP 음성인 환자일 수 있다. In another preferred embodiment of the present invention, the patient in step (a) may be an AFP negative patient.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 AFP 음성인 환자는 혈액 또는 혈청 내 AFP 농도가 20 ng/mL 이하일 수 있다.In another preferred embodiment of the present invention, the AFP-negative patient may have an AFP concentration in blood or serum of 20 ng/mL or less.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 방법은 (c) 혈액 또는 혈청 내 IgA 수준이 정상 대조군에 비해 증가하면 간세포암인 것으로 진단하는 단계;를 포함할 수 있다.In another preferred embodiment of the present invention, the method may include (c) diagnosing hepatocellular carcinoma when the level of IgA in blood or serum increases compared to a normal control.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예 있어서, 상기 혈액 또는 혈청 내 IgA 수준이 200 mg/dL 이상, 바람직하게는 250 mg/dL 이상이면 간세포암인 것으로 진단할 수 있다.In another preferred embodiment of the present invention, if the IgA level in the blood or serum is 200 mg/dL or more, preferably 250 mg/dL or more, it can be diagnosed as hepatocellular carcinoma.
본 발명에서는 간세포암 환자의 혈청 IgA 수준이 다른 간암에 비해 높은 것을 확인하였으며, 특히 간섬유화가 진행될수록 혈청 IgA 수준이 높아지는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 현재 간세포암 진단에 사용되고 있는 종양표지자인 AFP가 음성인 경우에도 혈청 IgA 수준 측정을 통해 보다 정확하게 간세포암을 측정할 수 있는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 혈청 IgA를 간세포 진단용 마커로 사용할 경우 간세포암을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있다.In the present invention, it was confirmed that the serum IgA level of hepatocellular carcinoma patients was higher than that of other liver cancers. In particular, it was confirmed that the serum IgA level increased as the liver fibrosis progressed, and AFP, a tumor marker currently used for the diagnosis of hepatocellular carcinoma, was negative In the case of , it was confirmed that hepatocellular carcinoma could be more accurately measured by measuring the serum IgA level. Therefore, when the serum IgA of the present invention is used as a marker for diagnosing hepatocellular carcinoma, there is an effect of rapidly and accurately diagnosing and predicting hepatocellular carcinoma at an early stage.
도 1은 다양한 간 질환에 따른 혈청 내 IgA 수준을 확인한 데이터이다.
도 2는 간 질환에서 섬유화 단계에 따른 혈청 내 IgA 수준을 확인한 데이터이다.
도 3은 간세포암 발명원인에 따른 혈청 내 IgA 수준을 확인한 데이터이다.
도 4는 간세포암에서 AFP와 혈청 내 IgA 수준과의 상관관계를 나타낸 데이터이다.
도 5는 AFP 양성 및 음성에 따른 혈청 내 IgA 수준을 확인한 데이터이다.
도 6은 혈청 IgA의 간세포암 진단능을 확인하기 위한 ROC 곡선(Receiver Operating Characteristic Curve)을 나타낸 데이터이다.
도 7은 AFP 결과 및 혈청 내 IgA 수준 조합에 따른 간세포암 진단능을 확인하기 위한 ROC 곡선(Receiver Operating Characteristic Curve)을 나타낸 데이터이다.
도 8은 비알코올성 지방간염(NASH) 환자와 간세포암 환자의 조직에서 IgA 생성 여부를 면역화학염색을 통해 확인한 데이터이다.
도 9는 간세포주를 이식한 이종이식 모델(Xenograft model)의 종양 및 비장에서 IgA 분비 형질세포의 비율을 확인한 데이터이다.1 is data confirming the level of IgA in the serum according to various liver diseases.
2 is data confirming the level of IgA in the serum according to the fibrosis stage in liver disease.
3 is data confirming the level of IgA in the serum according to the cause of the invention of hepatocellular carcinoma.
4 is data showing the correlation between AFP and serum IgA levels in hepatocellular carcinoma.
5 is data confirming the level of IgA in serum according to AFP positive and negative.
6 is data showing a Receiver Operating Characteristic Curve (ROC) for confirming the hepatocellular carcinoma diagnostic ability of serum IgA.
7 is a data showing a ROC curve (Receiver Operating Characteristic Curve) for confirming the hepatocellular carcinoma diagnostic ability according to the combination of AFP results and serum IgA level.
8 is data confirming whether IgA is produced in tissues of patients with nonalcoholic steatohepatitis (NASH) and hepatocellular carcinoma through immunochemical staining.
9 is data confirming the ratio of IgA-secreting plasma cells in the tumor and spleen of a xenograft model transplanted with a hepatocyte line.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 일관점에서, 혈액 또는 혈청 속 IgA 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간세포암 진단용 조성물에 관한 것이다. The present invention, from one point of view, relates to a composition for diagnosing hepatocellular carcinoma comprising a substance for measuring IgA levels in blood or serum.
본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 간세포암 발병 여부를 확인하는 것이다.As used herein, the term “diagnosis” refers to ascertaining the presence or characteristics of a pathological condition. For the purposes of the present invention, diagnosis is to determine whether hepatocellular carcinoma develops.
상기 간세포암은 알파-페토프로테인(alpha-Fetoprotein; AFP) 음성 간세포암일 수 있다. The hepatocellular carcinoma may be alpha-fetoprotein (AFP) negative hepatocellular carcinoma.
본 발명에 있어서, 상기 IgA 수준을 측정하는 물질은 IgA에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 포함할 수 있다. In the present invention, the substance for measuring the IgA level may include an antibody, an interacting protein, a ligand, nanoparticles, or an aptamer that specifically binds to IgA.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 간세포암 진단용 조성물을 포함하는 간세포암 진단용 키트에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a kit for diagnosing hepatocellular carcinoma comprising the composition for diagnosing hepatocellular carcinoma.
상기 키트는 당업계에 알려져 있는 통상의 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 키트는 예를 들면, 동결 건조 형태의 항체와 완충액, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있다. The kit may be prepared by a conventional manufacturing method known in the art. The kit may include, for example, a freeze-dried antibody, a buffer, a stabilizer, an inactive protein, and the like.
상기 키트는 검출가능한 표지를 더 포함할 수 있다. 용어 "검출가능한 표지"는 표지가 없는 동일한 종류의 분자들 중에서 표지를 포함하는 분자를 특이적으로 검출하도록 하는 원자 또는 분자를 의미한다. 상기 검출가능한 표지는 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자, 또는 압타머에 부착된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 방사종(radionuclide), 형광원(fluorophore), 효소(enzyme)를 포함할 수 있다. The kit may further include a detectable label. The term "detectable label" refers to an atom or molecule that allows for the specific detection of a molecule comprising a label among the same class of molecules without the label. The detectable label may be attached to an antibody that specifically binds to the protein or fragment thereof, an interacting protein, a ligand, a nanoparticle, or an aptamer. The detectable label may include a radioactive species (radionuclide), a fluorophore (fluorophore), and an enzyme (enzyme).
상기 키트는 당업계에 알려진 다양한 면역분석법 또는 면역염색법에 따라 이용될 수 있다. 상기 면역분석법 또는 면역염색법은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA, 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석, 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(multiple reaction monitoring)인 것일 수 있다. The kit may be used according to various immunoassays or immunostaining methods known in the art. The immunoassay or immunostaining method may include radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, ELISA, capture-ELISA, inhibition or competition assay, sandwich assay, flow cytometry, immunofluorescence staining and immunoaffinity purification. Preferably, the kit may be a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) kit, a DNA chip kit, an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kit, a protein chip kit, a rapid kit or MRM (multiple reaction monitoring). have.
본 발명은 또 다른 관점에서, In another aspect, the present invention
(a) 환자의 혈액 또는 혈청에 존재하는 IgA 수준을 측정하는 단계; 및 (a) measuring the level of IgA present in the blood or serum of the patient; and
(b) 상기 IgA 수준을 정상대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 간세포암 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.(b) relates to a method for providing information for diagnosing hepatocellular carcinoma, comprising comparing the IgA level with a normal control sample.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 환자는 AFP 음성인 환자일 수 있으며, 바람직하게, 상기 AFP 음성인 환자는 혈액 또는 혈청 내 AFP 농도가 20 ng/mL이하일 수 있다.In the present invention, the patient in step (a) may be an AFP-negative patient, and preferably, the AFP-negative patient may have an AFP concentration in blood or serum of 20 ng/mL or less.
종래의 기술에서, 간세포암에서 가장 흔하게 사용하는 종양 표지자인 AFP가 20 ng/mL 이상으로 증가되어 있으면 간세포암으로 진단하게 되나, 민감도가 40% 정도로 낮기 때문에, AFP 음성 간세포암이 전체 간세포암의 40% 이상인 것으로 볼 수 있다. 즉, 본 발명에서는 AFP 음성 개체를 대상으로 혈액 또는 혈청 내 IgA 수준을 측정하여 보다 정확하게 간세포암을 진단할 수 있다.In the prior art, if AFP, the most commonly used tumor marker for hepatocellular carcinoma, is increased to 20 ng/mL or more, it is diagnosed as hepatocellular carcinoma, but since the sensitivity is low about 40%, AFP-negative hepatocellular carcinoma is the It is considered to be more than 40%. That is, in the present invention, hepatocellular carcinoma can be more accurately diagnosed by measuring the level of IgA in blood or serum of an AFP-negative individual.
또한, 상기 방법은 (c) 혈액 또는 혈청 내 IgA 수준이 정상 대조군에 비해 증가하면 간세포암인 것으로 진단하는 단계;를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 혈액 또는 혈청 내 IgA 수준이 200 mg/dL 이상, 더 바람직하게는 250 mg/dL 이상이면 간세포암인 것으로 진단할 수 있다.In addition, the method may include (c) diagnosing hepatocellular carcinoma when the level of IgA in blood or serum increases compared to a normal control group. Preferably, when the IgA level in the blood or serum is 200 mg/dL or more, more preferably 250 mg/dL or more, it can be diagnosed as hepatocellular carcinoma.
상기 혈액 또는 혈청 내 IgA 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는, 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDITOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LCMS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.The blood or serum IgA level measurement or comparative analysis method includes protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDITOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry analysis, radioimmunoassay, radioimmunodiffusion method, octeroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, two-dimensional electrophoresis analysis, liquid chromatography-mass spectrometry ( liquid chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS), liquid chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry (LCMS/MS), Western blot, and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), but are not limited thereto.
상기 (b) 단계의 IgA 수준 비교는 진단의 정확도를 향상시키기 위해 통계적 방법 또는 알고리즘을 사용하여 분석할 수 있으며, 선형 또는 비선형 회귀 분석방법, 선행 또는 비선형 분류(classification) 분석방법, 로지스틱 회귀 분석방법(logistic regression), 분산분석(Analysis of Variance; ANOVA), 신경망 분석방법, 유전적 분석방법, 서포트 벡터 머신 분석방법, 계층 분석 또는 클러스터링 분석방법, 결정 트리를 이용한 계층 알고리즘 또는 커널 주성분(Kernel principal component) 분석방법, 마르코프 블랭킷(Markov Blanket) 분석방법, 회귀 특성 소거(recursive feature elimination) 또는 엔트로피-기본 회귀 특성 소거 분석방법, 전방 플로팅 서치(floating search) 또는 후방 플로팅 서치(floating search) 분석방법, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 분석방법을 이용할 수 있다. 본 발명에서는 바람직하게, 상기 통계적 방법은 로지스틱회귀(logistic regression) 분석 방법을 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The IgA level comparison in step (b) can be analyzed using a statistical method or algorithm to improve the accuracy of diagnosis, a linear or non-linear regression analysis method, a preceding or non-linear classification analysis method, a logistic regression analysis method (logistic regression), analysis of variance (ANOVA), neural network analysis method, genetic analysis method, support vector machine analysis method, hierarchical analysis or clustering analysis method, hierarchical algorithm using decision tree or kernel principal component ) analysis method, Markov Blanket analysis method, recursive feature elimination or entropy-basic regression feature elimination analysis method, forward floating search or backward floating search analysis method, and An analysis method selected from the group consisting of combinations thereof may be used. Preferably, in the present invention, the statistical method uses a logistic regression analysis method, but is not limited thereto.
본 발명의 구체적인 일구현에에서, 다양한 급만성 간 질환 및 간세포암 환자 중 혈청 IgA 수준을 확인한 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 간세포암에서 가장 높은 IgA 수준을 보이는 것을 확인하였다. In a specific embodiment of the present invention, as a result of checking the serum IgA level among patients with various acute and chronic liver diseases and hepatocellular carcinoma, as shown in FIG. 1 , it was confirmed that the highest IgA level was shown in hepatocellular carcinoma.
도 2에 나타난 바와 같이, 만성 간 질환 환자들의 혈청 IgA 수준을 간 조직 검사의 섬유화의 단계에 따라 나눠 분석한 결과, 섬유화가 진행될수록 혈청 IgA 수준이 높아지고 간세포암에서 가장 높은 것을 확인하였다. 즉, 혈청 IgA 수준은 간세포암뿐만 아니라 섬유화의 단계별 진단에도 적용할 수 있는 것을 확인하였다.As shown in FIG. 2 , as a result of analyzing the serum IgA levels of chronic liver disease patients according to the stage of fibrosis in the liver biopsy, it was confirmed that the serum IgA level increased as the fibrosis progressed and was highest in hepatocellular carcinoma. That is, it was confirmed that the serum IgA level can be applied to step-by-step diagnosis of fibrosis as well as hepatocellular carcinoma.
또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 간세포암 환자 중 원인에 따라서 혈청 IgA 수준을 비교한 결과, 비알코올성 지방간염에서 기인한 간세포암에서 다른 원인에 의한 간세포암보다 혈청 IgA 수준이 유의하게 높은 것을 확인하였다.In addition, as shown in FIG. 3 , as a result of comparing the serum IgA level according to the cause among HCC patients, it was confirmed that the serum IgA level was significantly higher in HCC due to nonalcoholic steatohepatitis than HCC due to other causes. did.
본 발명의 구체적인 다른 일구현예에서, 기존에 간세포암 진단 마커로 사용되는 알파-페토프로테인(alpha-Fetoprotein; AFP)와 혈청 IgA 수준과의 상관관계를 확인하고자 하였다. In another specific embodiment of the present invention, the correlation between alpha-Fetoprotein (AFP), which is previously used as a diagnostic marker for hepatocellular carcinoma, and serum IgA levels was to be confirmed.
실제로 임상에서 일반적으로 AFP의 컷오프 값(cut-off value)로 사용하는 20 ng/mL를 기준으로 AFP가 20 ng/mL보다 증가한 간세포암과 AFP가 20 ng/mL보다 낮은 간세포암의 혈청 IgA 값을 비교한 결과, 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, AFP 양성 및 음성인 간세포암에서 모두 유의하게 혈청 IgA 수준이 증가한 것을 확인하였다. 즉 IgA는 AFP가 음성인 간세포암에서도 종양 표지자로서 유용하게 적용가능 한 것을 확인하였다. In fact, based on 20 ng/mL, which is generally used as the cut-off value of AFP in clinical practice, serum IgA values of hepatocellular carcinoma with increased AFP greater than 20 ng/mL and hepatocellular carcinoma with AFP lower than 20 ng/mL As a result of comparing the results, as shown in FIGS. 4 and 5 , it was confirmed that the serum IgA level was significantly increased in both AFP-positive and negative HCC. That is, it was confirmed that IgA was usefully applicable as a tumor marker even in AFP-negative hepatocellular carcinoma.
또한, 혈청 내 IgA의 간세포암 진단능을 확인하기 위해 ROC 곡선(Receiver Operating Characteristic Curve)을 분석한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 AUROC는 0.70이며, 간세포암 진단 컷오프 값은 274mg/dL, 민감도와 특이도 모두 64%로 확인되었다. AFP 결과 및 혈청 내 IgA 수준 조합에 따른 간세포암 진단능을 확인하기 위해 ROC 곡선을 분석한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, AUROC는 0.70이며, 274mg/dL를 간세포암 진단의 컷오프로 할 때, 민감도와 특이도 모두 64%로 확인되었다. In addition, as a result of analyzing the ROC curve (Receiver Operating Characteristic Curve) to confirm the hepatocellular carcinoma diagnostic ability of IgA in the serum, as shown in FIG. 6 , the AUROC was 0.70, the hepatocellular carcinoma diagnostic cutoff value was 274 mg/dL, the sensitivity and All specificities were confirmed to be 64%. As a result of analyzing the ROC curve to confirm the hepatocellular carcinoma diagnostic ability according to the combination of AFP results and serum IgA level, as shown in Figure 7, AUROC is 0.70, and when 274 mg/dL is a cutoff for hepatocellular carcinoma diagnosis, Both sensitivity and specificity were confirmed to be 64%.
즉, 기존 마커인 AFP 단독에 비해 AFP와 혈청 내 IgA 수준을 조합하여 분석한 결과, 간세포암 진단능이 현저하게 증가한 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 혈청 IgA 마커는 AFP가 음성인 간세포암의 진단에도 임상적인 유용성이 있는 것을 확인하였다.That is, as a result of analyzing the combination of AFP and serum IgA levels compared to the existing marker AFP alone, it was confirmed that the hepatocellular carcinoma diagnostic ability was significantly increased. In addition, it was confirmed that the serum IgA marker of the present invention has clinical utility in the diagnosis of AFP-negative hepatocellular carcinoma.
본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서, 혈청 IgA 수준 상승이 실제로 간내 염증에 기인한 것인지 확인한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 간세포암에서는 종양의 기질에 IgA를 분비하는 형질세포와 IgA가 결합한 대식세포가 많이 침윤하고 있었으며, 침윤 정도가 높을수록 혈청 IgA 수준이 상승하는 소견이 관찰되었다. 즉, 간세포암 환자의 혈청 IgA 상승은 간세포암의 종양의 기질에 침윤한 IgA 분비 형질세포 및 IgA 결합 대식세포의 증가에 의한 것임을 확인하였다. In another specific embodiment of the present invention, as a result of confirming whether the increase in serum IgA level is actually due to intrahepatic inflammation, as shown in FIG. 8 , in hepatocellular carcinoma, plasma cells secreting IgA in the tumor matrix and IgA bind A lot of macrophages were infiltrating, and the higher the degree of invasion, the higher the serum IgA level was observed. That is, it was confirmed that the increase in serum IgA of hepatocellular carcinoma patients is due to the increase of IgA-secreting plasma cells and IgA-binding macrophages infiltrating the hepatocellular carcinoma tumor matrix.
또한, 간암 이종 마우스 모델에서 종양과 비장에서의 IgA 생성 형질세포 비율을 분석한 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 비장에서 보다 종양에서 IgA 양성 세포의 비율과 IgA 분비 형질세포의 비율이 높은 것을 확인하였다. 즉, 간세포암에서 혈청 IgA가 증가하는 이유를 간암 이종 마우스 모델에서도 확인하였다.In addition, as a result of analyzing the ratio of IgA-producing plasma cells in the tumor and spleen in the liver cancer xenogeneic mouse model, it was confirmed that the ratio of IgA-positive cells and the ratio of IgA-secreting plasma cells in the tumor was higher than in the spleen, as shown in FIG. 9 . . That is, the reason for the increase in serum IgA in hepatocellular carcinoma was also confirmed in the hepatocellular carcinoma xenogeneic mouse model.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.These examples are only for illustrating the present invention, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
간세포암 환자 혈청 내 Hepatocellular carcinoma patient serum IgAIgA 수준 확인 level check
1-1 : 다양한 간질환 및 간세포암 환자 혈청 내 1-1: In the serum of patients with various liver diseases and hepatocellular carcinoma IgAIgA 수준 확인 level check
본 발명에서는 다양한 간질환 및 간세포암 환자 혈청 내 IgA 수준을 확인하고자 하였다. In the present invention, it was attempted to determine the IgA level in the serum of patients with various liver diseases and hepatocellular carcinoma.
먼저, 11명의 건강한 그룹(Healthy donor), 19명의 약인성 간 손상 (Drug Induced Liver Injury, DILI) 환자, 11명의 자가면역 간염(Autoimmune Hepatitis, AIH) 환자, 56명의 만성 B형 간염(Chronic Hepatitis B, CHB), 32명의만성 C형 간염(Chronic Hepatitis C, CHC), 42명의 비알코올성 지방간염(Nonalcoholic steatohepatitis, NASH) 환자, 276명의 간세포암 (Hepatocellular Carcinoma, HCC) 환자들의 혈액을 채취한 다음, 혈액에서 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청 속에 포함된 IgA 농도는 ELISA(Invitrogen) 분석방법을 통해 측정하였다.First, 11 healthy donors, 19 drug-induced liver injury (DILI) patients, 11 autoimmune hepatitis (AIH) patients, 56 chronic hepatitis B patients , CHB), 32 chronic hepatitis C (CHC), 42 nonalcoholic steatohepatitis (NASH) patients, and 276 hepatocellular carcinoma (HCC) patients, Serum was isolated from blood. The concentration of IgA contained in the separated serum was measured by ELISA (Invitrogen) analysis method.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 다른 간 질환 환자 그룹보다 간세포암에서 높은 IgA 수준을 보이는 것을 확인하였다 (P < 0.001).As a result, as shown in FIG. 1 , it was confirmed that hepatocellular carcinoma showed higher IgA levels than other liver disease patient groups (P < 0.001).
1-2 : 섬유화 단계에 따른 혈청 1-2: Serum according to fibrosis stage IgAIgA 수준 확인 level check
또한, 만성 간 질환 환자들을 간 조직 검사의 섬유화 단계에 따라 0, 1, 2, 3, 4 단계로 분류하여 혈청 IgA 수준을 측정하였다. In addition, chronic liver disease patients were classified into 0, 1, 2, 3, and 4 stages according to the fibrosis stage of the liver biopsy, and serum IgA levels were measured.
만성 간질환, 즉, 만성 B형 간염, 만성 C형 간염, 자가면역간염, 비알콜성 지방간염 환자 중 조직검사 결과가 있는 환자를 섬유화 단계에 따라 다음과 같이 분류하였다. 저등급(0,1단계) 섬유화 51명, 고등급(2,3,4단계) 섬유화 47명 및 간세포암 276명에서 혈청 IgA를 측정하여 비교하였다. Among patients with chronic liver disease, ie, chronic hepatitis B, chronic hepatitis C, autoimmune hepatitis, and nonalcoholic steatohepatitis, patients with biopsy results were classified as follows according to the stage of fibrosis. Serum IgA was measured and compared in 51 patients with low-grade (
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 섬유화가 진행될수록 혈청 IgA 수준이 높은 것을 확인하였으며, 간세포암에서 가장 높은 혈청 IgA 수준을 보이는 것을 확인하였다 (P < 0.001). As a result, as shown in FIG. 2 , as fibrosis progressed, it was confirmed that the serum IgA level was higher, and it was confirmed that the hepatocellular carcinoma showed the highest serum IgA level (P < 0.001).
즉, 혈청 IgA 수준 측정은 간세포암뿐만 아니라 섬유화의 단계별 진단에도 적용가능한 것을 확인하였다.That is, it was confirmed that the measurement of serum IgA level was applicable not only to hepatocellular carcinoma but also to step-by-step diagnosis of fibrosis.
1-3 : 간세포암 원인에 따른 혈청 IgA 수준 확인1-3: Confirmation of serum IgA level according to the cause of hepatocellular carcinoma
간세포암 환자 중 발명 원인에 따른 혈청 IgA 수준을 확인하기 위해, B형 간염 기인 간세포암 환자(HBV), C형 간염 기인 간세포암 환자(HCV) 및 비알코올성 지방간염 기인 간세포암 환자의 혈청 IgA 수준을 확인하였다. To determine the serum IgA level according to the cause of the invention among HCC patients, the serum IgA level of patients with hepatocellular carcinoma due to hepatitis B (HBV), hepatocellular carcinoma due to hepatitis C (HCV), and hepatocellular carcinoma due to nonalcoholic steatohepatitis was confirmed.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 다른 원인에 기인한 간세포암보다 비알코올성 지방간염에서 기인한 간세포암에서 유의하게 높은 혈청 IgA 수준을 보이는 것을 확인하였다 (P < 0.01). As a result, as shown in FIG. 3 , it was confirmed that hepatocellular carcinoma caused by nonalcoholic steatohepatitis showed significantly higher serum IgA levels than hepatocellular carcinoma caused by other causes (P < 0.01).
종양표지자인 알파-페토프로테인(AFP)과 혈청 IgA 수준과의 상관관계 확인Confirmation of correlation between tumor marker alpha-fetoprotein (AFP) and serum IgA levels
2-1 : AFP 및 혈청 IgA 수준의 상관관계 확인2-1: Confirmation of correlation between AFP and serum IgA levels
본 발명에서는 혈청 IgA 수준이 기존 혈청 마커인 AFP와 어떤 상관관계가 있는지 확인하고자 하였다.In the present invention, it was attempted to determine how the serum IgA level correlates with the existing serum marker AFP.
183명의 간세포암 환자에서 AFP와 발굴된 마커인 IgA의 값을 모두 측정하였으며, 스피어만 상관관계(Spearman correlation) 방법으로 그 연관성을 조사하였다. The values of both AFP and the discovered marker IgA were measured in 183 HCC patients, and the correlation was investigated by the Spearman correlation method.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, P=0.28, r=0.08로 AFP 및 혈청 IgA 사이의 유의한 연관성을 확인하지 못하였다. As a result, as shown in FIG. 4 , a significant association between AFP and serum IgA was not confirmed with P=0.28 and r=0.08.
2-2 : AFP 양성 및 AFP 음성에서의 혈청 2-2: Serum in AFP positive and AFP negative IgAIgA 수준 확인 level check
또한, 실제로 임상에서 일반적으로 AFP의 컷오프 값으로 사용하는 20 ng/mL를 기준으로 AFP가 20보다 증가한 간세포암 그룹과 AFP가 20 ng/mL보다 낮은 간세포암 그룹의 IgA 값을 비교한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 두 그룹에서 모두 유의하게 IgA 값이 증가하였으나, AFP 값은 통계적으로 유의하게 차이가 나지 않은 것을 확인하였다. In addition, as a result of comparing the IgA values of the hepatocellular carcinoma group in which AFP increased to more than 20 and the hepatocellular carcinoma group in which AFP was lower than 20 ng/mL based on 20 ng/mL, which is generally used as the cut-off value of AFP in clinical practice, As shown in Fig. 5, IgA values were significantly increased in both groups, but it was confirmed that there was no statistically significant difference in AFP values.
2-3 : AFP 결과 및 혈청 내 IgA 수준 조합에 따른 간세포암 진단능 확인2-3 : Confirmation of hepatocellular carcinoma diagnostic ability according to the combination of AFP results and serum IgA level
간세포암 예측 마커로서의 혈청 IgA 수준의 ROC 곡선(Receiver Operating Characteristic Curve)을 분석하였다. The ROC curve (Receiver Operating Characteristic Curve) of serum IgA level as a predictive marker for hepatocellular carcinoma was analyzed.
ROC 곡선 (Receiver Operating Characteristic curve)란 양성율과 위양성율을 각각 x, y축으로 놓은 그래프로서 어떤 지점을 진단기준(cutoff)로 설정할지 결정하기 쉽게 시각화한 것이다. ROC 곡선의 밑면적(the Area Under a ROC Curve; AUC; AUROC)이 1에 가까울수록(즉, 왼쪽 상단 꼭지점에 다가갈수록) 진단 바이오마커로서 좋은 성능을 보인다고 할 수 있다. 간세포암이 없는 만성 간질환 환자 98명과 간세포암으로 진단된 환자 276명의 IgA값을 가지고 ROC 곡선을 그려보았다. The ROC curve (Receiver Operating Characteristic curve) is a graph in which the positive rate and the false positive rate are plotted on the x and y axes, respectively, and visualized for easy determination of which point to set as a diagnostic cutoff. The closer the Area Under a ROC Curve (AUC; AUROC) to 1 (that is, closer to the upper left vertex), the better the performance as a diagnostic biomarker. ROC curves were drawn with the IgA values of 98 patients with chronic liver disease without hepatocellular carcinoma and 276 patients diagnosed with hepatocellular carcinoma.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 혈청 IgA 수준 단독 측정의 경우 AUROC는 0.70이며, 간세포암 진단의 컷오프 값은 274mg/dL, 민감도와 특이도 모두 64%로 확인되었다. As a result, as shown in FIG. 6 , it was confirmed that the AUROC was 0.70 when the serum IgA level was measured alone, the cut-off value of the hepatocellular carcinoma diagnosis was 274 mg/dL, and the sensitivity and specificity were both 64%.
또한, 도 7에 나타난 바와 같이, AFP가 20 ng/mL보다 증가한 간세포암 및 혈청 IgA 수준을 결합한 경우에는 AUROC는 0.71, AFP가 20 ng/mL보다 낮은 간세포암 및 혈청 IgA 수준을 결합한 경우에는 AUROC는 0.69로, 두 그룹 모두 AUROC값이 유사하게 측정되는 것을 확인하였다. In addition, as shown in FIG. 7 , AUROC was 0.71 when AFP was combined with an increase in hepatocellular carcinoma and serum IgA levels greater than 20 ng/mL, and AFP was lower than 20 ng/mL when combined with hepatocellular carcinoma and serum IgA levels AUROC is 0.69, confirming that both groups had similar AUROC values.
즉, AFP가 음성인 경우에도 혈청 IgA 수준 측정을 통해 간세포암인 것으로 진단할 수 있으므로, 혈청 IgA 수준은 AFP가 음성인 간세포암에서도 종양 표지자로서 유용성이 있는 것을 확인하였다.That is, even when AFP is negative, it can be diagnosed as hepatocellular carcinoma by measuring the serum IgA level, so it was confirmed that the serum IgA level is useful as a tumor marker even in AFP-negative hepatocellular carcinoma.
간세포암 조직의 면역화학염색Immunochemical staining of hepatocellular carcinoma tissue
본 발명에서는 혈청 IgA 수준 상승이 실제로 간내 염증에 기인한 것인지를 확인하기 위하여 비알코올성 지방간염 환자의 조직과 간세포암 환자의 조직에서 면역화학염색을 통해 IgA에 양성을 보이는 세포를 관찰하였으며, 환자 조직의 면역화학염색은 은평성모병원 병리과에 의뢰하여 진행하였다.In the present invention, in order to determine whether the increase in serum IgA level is actually due to intrahepatic inflammation, IgA-positive cells were observed in the tissues of patients with nonalcoholic steatohepatitis and hepatocellular carcinoma through immunochemical staining, and the patient tissues Immunochemical staining was performed by requesting the pathology department of Eunpyeong St. Mary's Hospital.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 비알코올성 지방간염 환자 및 간세포암 환자 모두 IgA를 분비하는 형질세포와 IgA가 결합한 간 내 대식세포에서 IgA 양성 소견을 보이는 것을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 8 , it was confirmed that both nonalcoholic steatohepatitis patients and hepatocellular carcinoma patients showed IgA-positive findings in plasma cells secreting IgA and macrophages in the liver to which IgA was bound.
특히 간세포암에서는 종양의 기질에 IgA를 분비하는 형질세포와 IgA가 결합한 대식세포가 많이 침윤하고 있었으며, 침윤 정도가 높을수록 혈청 IgA 값이 상승하는 소견이 관찰되었다. In particular, in hepatocellular carcinoma, IgA-secreting plasma cells and IgA-bound macrophages were infiltrating the tumor matrix, and the higher the invasion, the higher the serum IgA value was observed.
즉, 간세포암 환자의 혈청 IgA 상승은 간세포암의 종양의 기질에 침윤한 IgA 분비 형질세포 및 IgA 결합 대식세포의 증가에 의한 것임을 확인하였다. That is, it was confirmed that the increase in serum IgA of hepatocellular carcinoma patients is due to the increase of IgA-secreting plasma cells and IgA-binding macrophages infiltrating the hepatocellular carcinoma tumor matrix.
간암 이종 마우스 모델에서의 Liver cancer in a xenogeneic mouse model IgAIgA 생성 확인 Confirm creation
본 발명에서는 간암 이종 마우스 모델에서도 IgA 생성이 증가하는지 확인하기 위해, 마우스의 옆구리에 마우스 간암 세포주인 Hepa1-6를 주입하여 간암 이종 모델(Xenograft model)을 확립하였다. In the present invention, in order to check whether IgA production is increased even in the liver cancer xenograft mouse model, a hepa1-6 mouse liver cancer cell line was injected into the flank of the mouse to establish a liver cancer xenograft model.
실험용 C57BL/6 마우스 10마리에 마우스 간세포암 세포주인 hepa1-6를 2.5×106 개의 세포를 옆구리에 주입하여 간암 이종 마우스 모델을 확립하였다. 그 후, 3주 뒤에 마우스의 비장과 이식한 종양을 분리하여 각 샘플의 IgA와 IgA 분비 형질세포의 비율을 형광 염색을 통한 유세포분석으로 비교, 분석하였다. The experimental C57BL / 6 mouse mouse hepatoma cell line hepa1-6 to 10 × 10 6 cells injected with 2.5 flanks established the two kinds of liver cancer mouse model. Then, three weeks later, the mouse spleen and the transplanted tumor were separated, and the ratio of IgA and IgA-secreting plasma cells in each sample was compared and analyzed by flow cytometry through fluorescence staining.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 비장에서 보다 종양에서 IgA 양성 세포의 비율과 IgA 분비 형질세포의 비율이 높은 것을 확인하였다. 즉, 간세포암에서 혈청 IgA가 증가하는 이유를 간암 이종 마우스 모델에서도 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 9 , it was confirmed that the ratio of IgA-positive cells and the ratio of IgA-secreting plasma cells was higher in the tumor than in the spleen. That is, the reason for the increase in serum IgA in hepatocellular carcinoma was also confirmed in the hepatocellular carcinoma xenogeneic mouse model.
Claims (10)
A composition for diagnosing hepatocellular carcinoma comprising a substance for measuring IgA levels in blood or serum.
The composition for diagnosing hepatocellular carcinoma according to claim 1, wherein the composition further comprises a substance for measuring the level of alpha-fetoprotein (AFP) in blood or serum.
The composition for diagnosing hepatocellular carcinoma according to claim 1, wherein the hepatocellular carcinoma is AFP-negative hepatocellular carcinoma.
The composition for diagnosing hepatocellular carcinoma according to claim 1, wherein the substance for measuring the IgA level is an antibody, an interacting protein, a ligand, nanoparticles, or an aptamer that specifically binds to IgA.
A kit for diagnosing hepatocellular carcinoma comprising the composition for diagnosing hepatocellular carcinoma according to any one of claims 1 to 4.
(b) 상기 IgA 수준을 정상대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 간세포암 진단을 위한 정보제공 방법.
(a) measuring the level of IgA present in the blood or serum of the patient; and
(B) Information providing method for diagnosing hepatocellular carcinoma comprising the step of comparing the IgA level with a normal control sample.
The method of claim 6, wherein the patient in step (a) is an AFP-negative patient.
The method of claim 7, wherein the AFP-negative patient has an AFP concentration of 20 ng/mL or less in blood or serum.
The method of claim 6, wherein the information providing method for diagnosing hepatocellular carcinoma comprises diagnosing hepatocellular carcinoma when blood or serum IgA levels increase compared to normal controls.
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |